WO2006015704A1 - Verfahren zur hitzebehandlung fibrinogenhaltiger pharmazeutischer zubereitungen - Google Patents

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WO2006015704A1
WO2006015704A1 PCT/EP2005/008014 EP2005008014W WO2006015704A1 WO 2006015704 A1 WO2006015704 A1 WO 2006015704A1 EP 2005008014 W EP2005008014 W EP 2005008014W WO 2006015704 A1 WO2006015704 A1 WO 2006015704A1
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fibrinogen
stabilizers
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heat treatment
compounds
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PCT/EP2005/008014
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Hubert Metzner
Thomas Nowak
Eckhard Schüler
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Zlb Behring Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Definitions

  • the invention relates to a method for heat treatment of fibrinogen-containing preparations, in addition to conventional stabilizers, one or more ammonium "and / or amino compounds, as well as fibrinogen pharmaceutical preparations, the inventive method was used for their preparation and their use.
  • the invention further relates to fibrinogen pharmaceutical preparations the NH 4 + X ' and / or R-CH 2 -NH 3 + X " and / or R-CH 2 -NH 2 compounds and their use.
  • fibrinogen which plays a key role in blood clotting.
  • the soluble fibrinogen contained in the blood plasma is converted in the presence of thrombin into the fibril-forming, insoluble fibrin and thus protects the body against high blood losses in wounds. If there is a lack of fibrinogen, the blood clotting does not work properly. It is possible to compensate for the deficiency by administering fibrinogen isolated from, for example, human blood plasma.
  • Fibrinogen is also of great importance as a component of fibrin adhesives, such adhesives being used, for example, for sealing sutures during surgical interventions or for haemostasis in parenchymatous organs.
  • fibrinogen is of great importance in clinical use. As with all proteins derived from blood plasma, the administration of fibrinogen-containing pharmaceutical preparations also poses a theoretical risk of infection due to the pathogenic agents potentially present in the donor plasma, such as, for example, hepatitis or AIDS viruses. In order to achieve the highest possible viral safety, various measures for the inactivation of infectious agents have been introduced.
  • One of these possibilities, which is also used in the production of fibrinogen-containing pharmaceutical preparations is the heating in aqueous solution, also known as pasteurization. Although such heat treatments cause an effective inactivation of the infectious agents, but at the same time cause a yield loss in the production of therapeutic proteins, since they are often thermally unstable.
  • fibrinogen is a very heat-sensitive protein, which already manifests itself by the fact that one can defibrinate blood plasma already by heating to 56 ° C (3 min) and heat precipitation of fibrinogen for depletion of fibrinogen in the isolation of coagulation factors is used ( see, for example, EP 0 018 561 and EP 0 637 451). Therefore, a heat treatment of fibrinogen-containing aqueous solutions, which should lead to a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation, is only possible in the presence of suitable stabilizers which protect fibrinogen from thermal inactivation associated with aggregate formation. In the known stabilizers, which counteract a loss of therapeutic efficacy, are mostly carbohydrates, carboxylic acids (especially amino acids), divalent metal salts or mixtures thereof.
  • EP 0 137 428 describes a process for the pasteurization of plasma or concentrates of blood clotting factors II, VII 1 IX and X in aqueous liquids in the presence of calcium ions and a chelating agent, optionally in combination with an amino acid, a saccharide or sugar alcohol.
  • EP 1 153 608 is a therapeutic protein preparation which does not contain antithrombin III and which is protected by the addition of stabilizers against loss of effect or denaturation during the pasteurization, the subject of the invention.
  • the stabilizers used herein are one or more saccharides in combination with one or more amino acids.
  • EP 0 683 678 describes pasteurizations of protein-containing compositions from blood or blood plasma in the presence of di- or trialkyl phosphates for the improved inactivation of viruses.
  • As stabilizers sucrose, sorbitol or short-chain amino acids are proposed.
  • EP 0 035 204 e.g. the pasteurization of thermally sensitive, therapeutically active proteins in aqueous solutions in the presence of polyols, e.g. Sugars or reduced sugars optionally together with amino acids as stabilizers.
  • polyols e.g. Sugars or reduced sugars optionally together with amino acids as stabilizers.
  • European application 0 436 712 proposes a method of pasteurizing protein mixtures containing mainly fibrinogen in the presence of a monosaccharide (e.g., glucose) and a sugar alcohol (e.g., sorbitol).
  • a monosaccharide e.g., glucose
  • a sugar alcohol e.g., sorbitol
  • EP 0 103 196 describes a pasteurization process for human fibrinogen in the presence of carbohydrates (eg sucrose), amino acids (eg glycine) and calcium ions as stabilizers.
  • carbohydrates eg sucrose
  • amino acids eg glycine
  • calcium ions as stabilizers.
  • German Offenlegungsschrift 3813464 or US Pat. No. 5,116,950 describes the heat treatment of aqueous fibrinogen solutions comprising a sugar component, an amino acid and a magnesium salt.
  • European Patent Application 0 124 506 describes the use of ammonium sulfate at concentrations above 0.5 M in a method of inactivating viruses by heat treatment in preparations containing blood products.
  • the ammonium sulfate is preferably present at concentrations of 2 to 4 molar and is then removed from the preparation.
  • the invention is based on the assumption that the inactivation of pathogens can be inhibited by proteins in the preparation and this can be overcome by high ammonium sulfate concentrations, while maintaining the biological activity.
  • factor XIII is a structurally and functionally completely different protein than fibrinogen, although both are isolated from blood Both can play an important role in blood clotting.
  • Fibrinogen is a non-enzymatically active protein that forms a three-dimensional network upon activation by thrombin, as compared to other factors involved in blood coagulation.
  • factor XIII is a globular proenzyme, a so-called transglutaminase, which in its activated form covalently crosslinks the fibrin fibrils formed from fibrinogen by an enzymatic reaction.
  • factor XIII can be separated off by heat precipitation of fibrinogen, since factor XIII, in contrast to fibrinogen, does not tend to aggregate and thus remains in the heat precipitation supernatant.
  • DE 199 23 027 also describes a process for inactivating and / or eliminating enveloped or unencapsulated viruses from a plasma protein solution by adding an ammonium salt, in which a chromatographically pre-purified plasma protein solution at an ammonium salt concentration of 30 to 39% by weight is used. % of an incubation and pasteurized after separation of the precipitates and removal of the ammonium salt to a residual content of less than 0.5 mol / l for several hours at about 60 0 C and then processed into a therapeutically useful plasma protein preparation.
  • fibrinogen-containing pharmaceutical compositions Because of the broad therapeutic application of fibrinogen-containing pharmaceutical compositions, there is a great need for methods that can reduce aggregate formation and improve quality while maintaining or increasing virus safety. In particular, since fibrinogen is predominantly obtained from human blood plasma, it is desirable to achieve the highest possible yield of high quality fibrinogen in order to ensure maximum utilization of existing blood donations.
  • Carbohydrates and amino acids must be added in very high concentrations in order to stabilize fibrinogen sufficiently.
  • the aim of the present invention is also to obtain a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation with high virus safety.
  • An object of the present invention is thus a method for reducing the aggregate formation in the heat treatment of fibrinogen-containing solutions, wherein the solutions in addition to conventional fibrinogen stabilizers one or more carboxyl-free compounds of the formulas R-NH 3 + X ' and / or R-NH 2 in in an amount of 0.001 to 0.5 moles per liter of solution (0.001-0.5 M).
  • the radical R is an H or an alkyl, aryl or a mixed alkyl / aryl radical, where the alkyl and / or aryl radicals may be substituted by halogen, amino or hydroxyl groups.
  • the alkyl radical comprises acyclic and cyclic hydrocarbons which may be linked by one or more single and / or double bonds. Branched chain hydrocarbons are also suitable.
  • the aryl radical is an aromatic compound containing one or more aromatic ring structures.
  • the radical R may also consist of mixed aryl and alkyl moieties.
  • the alkyl and / or aryl radicals may be substituted by one or more different functional groups, including heterocyclic compounds are included.
  • Possible functional groups are, for example, OH groups, NR 2 groups (where R is as defined above), CONH 2 groups (acid amides) or SO 3 groups. Exempted from the term substitution in the context of the present invention are substitutions with COOH groups, which lead to the formation of carboxylic acids. Carboxylic acids such as amino acids are known as stabilizers in pasteurizations of fibrinogen in the art. Reference may be made, for example, to the already mentioned EP 0 035 204, EP 103 196 and US 5,116,950. Preferably, between the radical R and the NH 2 group is still a CH 2 group. Preferred functional groups in the case where R ⁇ H are the NH 2 and OH groups, and preferred are compounds such as ethanolamine.
  • R is identical to hydrogen, i.
  • Particularly preferred are ammonium compounds containing the NH / ion (ammonium ion).
  • the charge balance is provided by a corresponding anion (X ' ).
  • X ' a corresponding anion
  • anions are sulfates, acetates, chlorides, phosphates, nitrates.
  • sulfate, acetate and chloride ions are particularly preferable.
  • ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate and / or ammonium acetate are particularly preferable.
  • the concentration of R-NH 3 + X ' and / or R-NH 2 compounds in the fibrinogen-containing solution at the time of heat treatment must be below 0.5M. If the concentrations are too high, no advantageous improvement in the reduction of aggregate formation can be detected. On the contrary, depending on the particular compound, even increased aggregation of fibrinogen may result.
  • the R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compounds are present in a concentration of 1 to 150 mmol per liter of stabilized fibrinogen-containing solution which is subjected to a heat treatment. 60 millimoles per stabilized fibrinogen-containing solution liter.
  • the most suitable concentrations are to be adjusted of the particular compound and can easily by comparative tests, as shown in the examples, be determined by the skilled artisan.
  • the R-NH 3 + X "and / or R-NH 2 compounds may be added immediately before or at a prior time of heat treatment.
  • heat treatment is meant a heating of the fibrinogen-containing solution to above 30 ° C.
  • Heat treatments can occur, for example, in the preparation of fibrinogen-containing pharmaceutical preparations, for example in the dissolution of added substances for precipitation or purification steps or in the dissolution of fibrinogen precipitates.
  • this is a heat treatment used to inactivate potentially present infectious agents such as viruses, also known as pasteurization.
  • Known pasteurization conditions for fibrinogen-containing solutions are preferably at 55-65 0 C for 10 to 15 hours.
  • Suitable pasteurization conditions are conditions in which the temperature and duration of the heat treatment are sufficient to inactivate viruses as much as possible, ie more than 4 log 10 steps.
  • the pasteurization conditions can also be adapted to the composition of the stabilizers.
  • a reduction of conventional stabilizers may optionally allow a reduction of the temperature and / or duration of the heat treatment with a constant virus inactivation.
  • Suitable conditions for the In a particular case, pasteurization can easily be determined by a person skilled in the art by addition of test viruses and determination of the reduction factor according to known methods.
  • An aqueous solution containing fibrinogen is a liquid composition containing at least fibrinogen and water.
  • fibrinogen may be present in a mixture with other proteins, in partially purified or purified form.
  • fibrinogen is preferably to be understood as meaning human fibrinogen which can be purified, for example, from a mixture obtained from human blood which contains fibrinogen.
  • a mixture obtained from human blood which contains fibrinogen For example, whole blood, blood plasma, plasma fractions or plasma precipitates are to be understood by the term "blood-derived mixture.”
  • Fibrinogen is preferably obtained from human plasma, plasma fractions, cryoprecipitate or an 8% ethanol precipitate according to Cohn Human fibrinogen can also be obtained from the milk of transgenic animals, see, for example, US 5,639,940, and fibrinogen obtained by recombinant expression from cell culture, see, for example, US 6,037,457, is also included Fermentation supernatants or fractions produced therefrom may also be present.French-technologically produced fibrinogen may also contain potentially infectious agents which must be inactivated by pasteurization, if appropriate also by heat treatment during purification Inogen isolated from a mixture obtained from animal blood containing fibrinogen, preferably from
  • the amount of fibrinogen in the fibrinogen-containing solution prior to the addition of stabilizers is between 0.1 and 10% (0.1 to 10 g / 100 ml solution), more preferably between 1 and 5% (1 to 5 g / 100 ml solution).
  • the process for the heat treatment of a fibrinogen-containing solution takes place in an aqueous solution whose pH is in the range from 5 to 9. Preference is given to pH values between 6 and 8.
  • the two compounds R-NH 3 + X " and R-NH 2 are present in equilibrium in an aqueous solution, and the pH can shift the equilibrium to different degrees in favor of a particular compound in which the R-NH 2 compounds are more than 50% protonated.
  • the usual stabilizers can be added individually or in various combinations before the heat treatment
  • the usual stabilizers are carbohydrates, carboxylic acids, divalent metal ions or mixtures thereof
  • the carbohydrates include sugars such as preferably mono, di and oligosaccharides and sugar alcohols Examples of sugars are galactose, mannose, sucrose, maltose, Lactose or rhamnose Examples of sugar alcohols are mannitol, sorbitol or xylitol.
  • the divalent metal ions are, for example, calcium or magnesium ions, which are preferably present as inorganic salts.
  • the carboxylic acids preferably include amino acids, in particular glycine, but also possible are acidic, basic or other neutral, for example aromatic, amino acids, for example glutamic acid, aspartic acid, ⁇ -, ⁇ -, ⁇ -aminobutyric acid, lysine, arginine, histidine, phenylalanine , Tyrosine, tryptophan, alanine, proline, serine, cysteine and other amino acids or their salts and derivatives.
  • auxiliary stabilizers are meant compounds which inhibit fibrinolysis, e.g. the ⁇ -aminocaproic acid, p-aminomethylbenzoic acid or its salts or derivatives. Salts of carboxylic acids (in particular having 3 to 10 hydrocarbon atoms) should also be regarded as auxiliary stabilizers.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention comprises the combination of conventional stabilizers such as sucrose, glycine, calcium chloride or mixtures thereof.
  • Another preferred embodiment of the present invention contains the combination of the usual stabilizers sucrose and calcium chloride.
  • the fibrinogen-containing solution also contains salts such as sodium chloride.
  • an additional buffer substance may also be contained. Possible known buffer substances are tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (Tris), 4- (2-hydroxyethyl) -piperazine-1-ethane-sulphonic acid (HEPES), 3-morpholino-propanesulphonic acid (MOPS) or other physiological buffer systems.
  • Tris tris- (hydroxymethyl) -aminomethane
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -piperazine-1-ethane-sulphonic acid
  • MOPS 3-morpholino-propanesulphonic acid
  • Carbohydrates are preferably present in an amount of above 10%, more preferably from 500 to 1500 g per liter of fibrinogen-containing solution (before addition of
  • Stabilizers are used, more preferably amounts of 800-1000 g per liter of fibrinogen-containing solution (before the addition of stabilizers).
  • amino acids may preferably be added in amounts between 0 and 2 moles per liter of fibrinogen-containing solution (before the addition of stabilizers).
  • Salts containing divalent metal ions can preferably be used in amounts of from 0 to 5 g per liter of fibrinogen-containing solution (before the addition of stabilizers), more preferably from 50 to 1000 mg per liter of fibrinogen-containing solution (before the addition of stabilizers). Since the added stabilizers cause an increase in volume, the stabilizers are present in the stabilized fibrinogen-containing solution during the heat treatment in a correspondingly lower final concentration.
  • R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compounds in the heat treatment of fibrinogen-containing solutions advantageously allows a reduced use of conventional stabilizers, for example stabilizers such as glycine can be dispensed with completely.
  • R-NH 3 + X ' and / or R-NH 2 compounds makes it possible to reduce the increase of fibrinogen aggregates during the heat treatment.
  • the increase in aggregate is reduced by at least 10% compared to the control batch (without addition of R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compounds), more preferably the aggregate increase is reduced by more than 30% Aggregate increase can be determined as described in the examples.
  • the biological activity of fibrinogen determined according to Clauss (A. Clauss, Acta Haematol 17: 237-246 (1957)) on a coagulation machine such as the Behring Coagulation Timer (Dade Behring), in a heat treatment under the invention
  • a coagulation machine such as the Behring Coagulation Timer (Dade Behring)
  • the invention thus provides a process for the heat treatment of fibrinogen-containing lyophilisates, in which the fibrinogen-containing solution before lyophilization in addition to conventional excipients one or more R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compounds in a concentration below 0.5 moles per liter , where R and X "corresponding to the previous definitions.
  • preferred is the residual water content of the lyophilisate with> 0.1% (w / w).
  • Other conventional excipients for lyophilization include sugar, sugar alcohols, amino acids, carboxylic acids, inorganic salts, buffer substances , Complexing agents, surface-active compounds or mixtures thereof.
  • the method according to the invention may be a step within a method for producing a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation.
  • Possible methods for the isolation and purification of fibrinogen-containing pharmaceutical preparations are well known in the art.
  • Another object of the invention are thus fibrinogen-containing pharmaceutical preparations which have been prepared by a process which includes one or more inventive method for heat treatment of a fibrinogen-containing solution or / and a fibrinogen-containing lyophilisate.
  • the R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compound in the course of the further process after the heat treatment, in whole or in part by conventional techniques and known purification methods from the fibrinogen-containing solution or the dissolved fibrinogen-containing lyophilisate Any remaining high molecular weight constituents which may still be present during the heat treatment may optionally be removed by known purification steps, For example, as described in EP 01031996, remaining aggregates may be removed by precursor precipitation (eg 0.25-1.5 M glycine).
  • the fibrinogen-containing solution may optionally be prepared by conventional techniques until a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation for therapeutic or diagnostic application.
  • R-NH 3 + X ' and / or R-NH 2 compound are pharmaceutically acceptable compounds, it may also be advantageous to leave these compounds completely or partly in the finished fibrinogen-containing pharmaceutical preparation.
  • Pharmaceutically acceptable compounds are to be understood as meaning compounds which do not lead to any apparent or serious disadvantageous or toxic side effects or intolerance reactions in the patient in the concentration used.
  • lyophilized fibrinogen-containing pharmaceutical preparations containing pharmaceutically acceptable R-NH 3 + X ' and / or R-NH 2 compounds
  • the pharmaceutical preparation When stored in liquid form, it may also be advantageous for fibrinogen if the pharmaceutical preparation contains one or more R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compounds
  • the ammonium and / or or amino compounds significantly reduce aggregate formation during heat treatment, which can also occur during storage, especially in the case of medical end products in which depletion of occurring aggregates through purification steps can no longer take place, the increased occurrence of aggregates is undesirable
  • Patients also cause side effects, which is why regulators often limit aggregate levels because R-NH 3 + X " and / or R-NH 2 compounds cause aggregate formation even during heat treatments reduce, there is the possibility of a liquid storage of fibrinogen pharmaceutical preparations at least for a certain time, even at room temperature or higher temperatures, which can be improved, for example, the application properties in emergency situations.
  • fibrin adhesives When using fibrin adhesives, it is particularly advantageous if fibrinogen is present in liquid form. Reconstitution to make the adhesive ready for use would take a relatively long time, especially as fibrinogen is present in high concentrations.
  • Another object of the invention is therefore also a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation which, for storage, among other customary auxiliaries, one or more NH 4 + X " and / or R-CH 2 -NH 3 + and / or R-CH 2 - NH 2 contains compounds in a concentration of less than 0.5 mol per liter, preferably concentrations of from 1 to 480 mmol per liter of fibrinogen particularly preferred are 1 to 300 mmol per liter fibrinogen restroomr pharmaceutical preparation, particularly preferred are 1 to 150 mmol per liter fibrinogen restroomr pharmaceutical preparation and most particularly preferred are 2 to 100 mmol per liter fibrinogen restroomr pharmaceutical preparation.
  • the concentration must be adapted to the particular compound and its physiological compatibility.
  • R and X " correspond to the previous definitions, with the additional proviso that the resulting compounds are physiologically tolerated and can not be expected to cause any disadvantageous side effects in
  • adjuvants depend on the intended use.
  • other additives known to those skilled in the art are advised as for use as fibrin glue.
  • certain additives for a planned intermediate storage as lyophilisate or in the frozen state.
  • the usual auxiliaries are monovalent metal salts (for example sodium or potassium chloride), divalent metal salts (for example magnesium or calcium chloride), amino acids (for example glycine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, histidine, lysine, isoleucine, cysteine), Carbohydrates (e.g., glucose, sucrose, trehalose, lactose, cellulose, starch, sorbitol, mannitol, and glycosaminoglycans), detergents (e.g., poloxamers or polysorbates), urea, guanidine, inhibitors such as fibrinolysis or fibrinogenolysis inhibitors (e.g., aprotinin, antiplasmins such as alpha-2 Antiplasmin, alpha-2-macroglobulin, alpha-1-antiplasmin, plasminogen activator-inhibitors (PAI), thrombin-activatable-fibri
  • Another object of the invention is the use of a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation which has been prepared by a process which contains the inventive method for heat treatment of fibrinogen-containing solutions and / or fibrinogen-containing lyophilisates.
  • the invention likewise relates to the use of a fibrinogen-containing pharmaceutical preparation which, in addition to customary excipients, contains one or more NH 4 + X " , R-CH 2 -NH 3 + X ' and / or R-CH 2 -NH 2 compounds in pharmaceutically acceptable form contains.
  • fibrinogen-containing pharmaceutical preparations according to the invention can be advantageously used for all known uses of fibrinogen. It is possible to use both as a therapeutic agent and as a component of a diagnostic agent.
  • the medical application preferably relates to humans, but also in veterinary medicine applications are included.
  • the fibrinogen-containing pharmaceutical preparation according to the invention is suitable for the therapy of fibrinogen deficiency states.
  • the fibrinogen-containing pharmaceutical preparation according to the invention is preferably injected intravenously into the patient, in order to compensate for corresponding deficiencies of fibrinogen. Dosages are based on the height of the occurring defect.
  • Fibrinogen plays an important role in fibrin therapy as an important component of so-called fibrin glue.
  • a fibrin glue simulates the last step in blood coagulation by the formation of stabilized fibrin when fibrinogen is combined with thrombin and other components such as calcium and factor XIII.
  • fibrin sealants are used for the closure and fixation of skin wounds (including skin grafts).
  • sutures e.g., at the duodenal stump
  • fibrin sealants are used for the closure and fixation of skin wounds (including skin grafts).
  • sutures e.g., at the duodenal stump
  • fibrin sealants are used for the closure and fixation of skin wounds (including skin grafts).
  • sutures e.g., at the duodenal stump
  • fibrin sealants are used for the sealing of a plastic Duraersatzes and for cavity sealing and for bonding the Pleuracopy for the palliative treatment of pleural effusions.
  • gluing the fibrin glue can also be used advantageously in connective tissues such as bones, cartilage and tendons.
  • the fibrinogen-containing pharmaceutical preparations according to the invention can also be used as a component for producing a fibrin matrix be used.
  • a carrier material can be used inter alia for the slow release of active ingredients, such as growth factors (eg with osteoinductive proteins as a matrix for bone and / or cartilage regeneration), antibiotics, anti-inflammatory additives and / or wound-healing-promoting additives.
  • active ingredients such as growth factors (eg with osteoinductive proteins as a matrix for bone and / or cartilage regeneration), antibiotics, anti-inflammatory additives and / or wound-healing-promoting additives.
  • the carrier may also consist of a mixture of fibrin with other materials.
  • a fibrin matrix finds extensive uses in biotechnology, for example as a carrier material and culture medium for cells and tissue in tissue engineering or for wrapping implants such as biosensors.
  • a fibrinogen-containing solution was added per liter with 80 ml of an aluminum hydroxide solution and stirred. Subsequently, the aluminum hydroxide was separated by centrifugation and discarded.
  • the fibrinogen admission solution was diluted with physiological NaCl solution to an optical density at 280-320 nm (OD28 0 - 3 2 0 ) of about 50.
  • the fibrinogen-containing solution thus obtained hereinafter also referred to as fibrinogen-containing starting solution, was admixed with different types and amounts of stabilizers, as shown in Table 1. The quantities are based on 1 liter of the fibrinogen-containing starting solution (added stabilizers per liter of fibrinogen-containing starting solution).
  • the fibrinogen-containing solution was stirred until complete dissolution of the stabilizers at 30 0 C.
  • the pH was adjusted to pH 7.5 with a 2M sodium hydroxide solution.
  • the volume increase carried out by adding the stabilizers is shown in Table 1.
  • the stabilized fibrinogen-containing solutions (batches) for 10 h at 6O 0 C were incubated.
  • Table 1 also shows the results of SEC-HPLC analysis to determine aggregate formation.
  • SEC-HPLC is a size exclusion chromatography that separates fibrinogen and aggregates according to their molecular weight. High molecular weight fractions such as aggregates elute even before the main fibrinogen peak and are found in the elution profile as peaks 1 and 2 again. The sum of the areas under Peak 1 and Peak 2 of the samples before and after the heat treatment was determined and calculated as a percentage of the peaks 1-3. The value of SEC Peak 1 + 2 after the heat treatment was decreased by the value before pasteurization started (usually between 10 and 20%) and the values obtained therefrom are shown as the result in Table 1 under ⁇ (peak 1 + 2). They reflect the increase in aggregates during pasteurization. The higher this value, the more aggregates have formed during pasteurization.
  • a corresponding HPLC system with a SEC column (TSK Gel G 4000 SWXL, 7.5 x 300 mm from TOSO HAAS) was used.
  • the separation of the proteins and aggregates was carried out at a flow rate of 0.5 ml / min in a suitable running buffer (15 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.05% NaN 3 pH 7.0) at room temperature.
  • the detection of the proteins or aggregates took place at 280 nm.
  • Table 1 pasteurization at 6O 0 C for 10 hours
  • a fibrinogen-containing starting solution prepared according to Example 1, was admixed with the stabilizers according to Table 2 and maintained a pH of 7.5 until complete solution at about 30 0 C stirred. Subsequently, the stabilized fibrinogen-containing solution was pasteurized at 61 ° C. for 10 hours. The aggregate content was determined before and after pasteurization by SEC-HPLC as described in Example 1 and the determined aggregate increase is shown in Table 2.
  • a fibrinogen-containing starting solution prepared according to Example 1, was admixed with the stabilizers according to Table 3 and, while maintaining a pH of 7.5 until complete solution at about 30 0 C stirred.

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Verminderung der Aggregatbildung bei der Hitzebehand­lung von fibrinogenhaltigen wässrigen Lösungen beschrieben, bei dem der fibrino­genhaltigen Lösung neben üblichen Fibrinogenstabilisatoren eine oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln N-H3+ X' und/oder R-NH2, in de­nen R Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder ein gemischter Alkyl-/Arylrest ist, der mit Hydroxyl-, Halogen- oder Aminogruppen substituiert sein kann, und X' ein Anion ist, in einer Menge von 1 bis 500 mM zugesetzt wird.

Description

Verfahren zur Hitzebehandlung fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitungen
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Präparationen, die neben üblichen Stabilisatoren eine oder mehrere Ammonium-" und/oder Aminoverbindungen enthalten, sowie fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitungen, zu deren Herstellung das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt wurde und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitungen die NH4 + X' und/oder R-CH2-NH3 + X" und/oder R- CH2-NH2 Verbindungen enthalten und deren Verwendung.
Viele verschiedene therapeutisch wertvolle Proteine können aus humanem Blutplasma gewonnen werden. Eines dieser Proteine ist Fibrinogen, das eine Schlüsselrolle bei der Blutgerinnung einnimmt. Bei der Blutgerinnung wird das im Blutplasma enthaltene lösliche Fibrinogen in Anwesenheit von Thrombin in das fibrillenbildende, unlösliche Fibrin umgewandelt und schützt den Körper damit vor hohen Blutverlusten bei Verwundungen. Fehlt es an Fibrinogen, so funktioniert die Blutgerinnung nicht korrekt. Man kann den Mangel ausgleichen, indem man Fibrinogen, isoliert aus z.B. menschlichem Blutplasma, verabreicht. Große Bedeutung kommt Fibrinogen auch als Komponente von Fibrinklebern zu, wobei derartige Kleber z.B. zum Abdichten von Nähten bei chirurgischen Eingriffen oder zur Haemostase bei parenchymatösen Organen verwendet werden. Wegen seines Beitrages zur Blutstillung und Wundheilung hat Fibrinogen eine große Bedeutung in der klinischen Anwendung. Wie bei allen aus Blutplasma gewonnenen Proteinen birgt auch die Verabreichung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen ein theoretisches Infektionsrisiko aufgrund der im Spenderplasma potentiell vorhandenen pathogenen Agenzien, wie beispielsweise Hepatitis oder AIDS Viren. Um eine möglichst hohe Virussicherheit zu erreichen, sind verschiedene Maßnahmen zur Inaktivierung infektiöser Agenzien eingeführt worden. Eine dieser Möglichkeiten, die auch bei der Herstellung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen Anwendung findet, ist die Erhitzung in wässriger Lösung, auch als Pasteurisierung bekannt. Derartige Hitzebehandlungen bewirken zwar eine effektive Inaktivierung der infektiösen Agenzien, bedingen aber gleichzeitig einen Ausbeuteverlust bei der Herstellung der therapeutischen Proteine, da diese häufig thermisch instabil sind. Insbesondere beim Fibrinogen handelt es sich um ein sehr hitzeempfindliches Protein, was sich schon dadurch äußert, dass man Blutplasma bereits durch Erhitzen auf 56°C (3 min) defibrinieren kann und Hitzefällung von Fibrinogen zur Abreicherung von Fibrinogen bei der Isolation von Gerinnungsfaktoren genutzt wird (siehe z.B. die EP 0 018 561 und EP 0 637 451 ). Eine Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen, wässrigen Lösungen, die zu einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung führen soll, ist deshalb überhaupt nur möglich in Gegenwart von geeigneten Stabilisatoren, die Fibrinogen vor einer thermischen Inaktivierung verbunden mit Aggregatbildung schützen. Bei den bekannten Stabilisatoren, die einem Verlust an therapeutischer Wirksamkeit entgegenwirken, handelt es sich zumeist um Kohlenhydrate, Carbonsäuren (insbesondere Aminosäuren), zweiwertige Metallsalze oder Mischungen davon.
Die EP 0 137 428 beschreibt ein Verfahren zur Pasteurisierung von Plasma oder Konzentraten der Blutgerinnungsfaktoren II, VII1 IX und X in wässrigen Flüssigkeiten in Gegenwart von Calciumionen und einem Chelat-Bildner, gegebenenfalls in Kombination mit einer Aminosäure, einem Saccharid oder Zuckeralkohol. Bei der EP 1 153 608 ist ein therapeutisches Proteinpräparat, das kein Antithrombin III enthält und das durch Zusatz von Stabilisatoren vor Wirkungsverlust oder Denaturierung bei der Pasteurisierung geschützt wird, Gegenstand der Erfindung. Bei den hier verwendeten Stabilisatoren handelt es sich um ein oder mehrere Saccharide in Kombination mit einer oder mehreren Aminosäuren.
Die EP 0 683 678 beschreibt Pasteurisierungen von Protein enthaltenden Zusammensetzungen aus Blut oder Blutplasma in Gegenwart von Di- oder Trialkylphosphaten zur verbesserten Inaktivierung von Viren. Als Stabilisatoren werden Saccharose, Sorbitol oder kurzkettige Aminosäuren vorgeschlagen.
In der EP 0 035 204 (oder US 4,440,679) ist z.B. die Pasteurisierung von thermisch sensitiven, therapeutisch aktiven Proteinen in wässrigen Lösungen in Gegenwart von Polyolen wie z.B. Zuckern oder reduzierten Zuckern gegebenenfalls zusammen mit Aminosäuren als Stabilisatoren beschrieben.
In der europäischen Anmeldung 0 436 712 wird ein Verfahren zur Pasteurisierung von Proteinmischungen, die hauptsächlich Fibrinogen enthalten, in Gegenwart eines Monosaccharides (z.B. Glucose) und eines Zuckeralkohols (z.B. Sorbitol) vorgeschlagen.
Die Nationale Schottische Blutbank (RD 244027) berichtet von der Hitzebehandlung von Fibrinogen in Gegenwart von Sorbitol und gegebenenfalls in Gegenwart von Glycin.
Die EP 0 103 196 beschreibt ein Pasteurisierungsverfahren für humanes Fibrinogen in Anwesenheit von Kohlenhydraten (z.B. Saccharose), Aminosäuren (z.B. Glycin) und Calcium Ionen als Stabilisatoren. Die deutsche Offenlegungsschrift 3813464 (oder US 5,116,950) beschreibt die Wärmebehandlung wässriger Fibrinogen-Lösungen enthaltend eine Zucker- Komponente, eine Aminosäure sowie ein Magnesium-Salz.
Die europäische Patentanmeldung 0 124 506 beschreibt den Einsatz von Ammoniumsulfat in Konzentrationen über 0,5 M in einem Verfahren zur Inaktivierung von Viren durch Wärmebehandlung in Präparationen, die Blutprodukte enthalten. Das Ammoniumsulfat liegt vorzugsweise bei Konzentrationen von 2 bis 4 molar vor und wird anschließend aus der Präparation entfernt. Die Erfindung beruht auf der Vermutung, dass die Inaktivierung von Krankheitserregern durch Proteine in der Präparation gehemmt sein kann und dies durch hohe Ammoniumsulfatkonzentrationen, unter Beibehaltung der biologischen Aktivität, überwunden werden kann. Für das spezielle Protein Fibrinogen werden allerdings keine Daten gezeigt und ein solches Verfahren zur Wärmebehandlung von Fibrinogen in wässriger Lösung wäre auch gänzlich ungeeignet, da es bei solch hohen Ammoniumsulfatkonzentrationen zu einer starken Aggregation von Fibrinogen kommen und die Fibrinogenlösung bereits Ausfällungen bilden würde. Eine entsprechende Wärmebehandlung in einem heterogenen System ist jedoch generell nicht wünschenswert, da dies die Durchführbarkeit und die Reproduzierbarkeit negativ beinträchtigt.
Von einem anderen aus humanem Plasma zu gewinnenden Protein - dem gereinigten Faktor XIII - ist aus der EP 0 637 451 bekannt, dass bei Erhitzung zum Zwecke der Virusinaktivierung auf übliche Stabilisatoren vollständig verzichtet werden kann oder diese zumindest auf unter 10% reduziert werden können. Dieses Patent erwähnt, dass die zu erhitzende Lösung ferner weniger als 0,5 M Ammoniumsulfat enthalten kann. Es wird allerdings nicht dargelegt, ob Ammoniumsulfat in Konzentrationen unterhalb von 0,5 M überhaupt einen stabilisierenden Effekt während der Pasteurisierung auf F XIII haben könnte. Darüber hinaus handelt es sich bei Faktor XIII um ein strukturell und funktional völlig anderes Protein als Fibrinogen, auch wenn beide aus Blut isoliert werden können und beide eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung spielen. Bei Fibrinogen handelt es sich im Vergleich zu anderen an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren um ein nicht-enzymatisch aktives Protein, das nach Aktivierung durch Thrombin ein dreidimensionales Netzwerk bildet. Demgegenüber ist Faktor XIII ein globuläres Proenzym, eine so genannte Transglutaminase, die in ihrer aktivierten Form die aus Fibrinogen gebildeten Fibrin-Fibrillen durch eine enzymatische Reaktion kovalent vernetzt.
Zudem ist aus der EP 0 637 451 bekannt, dass Faktor XIII durch eine Hitzefällung von Fibrinogen abgetrennt werden kann, da Faktor XIII im Gegensatz zu Fibrinogen nicht zur Aggregatbildung neigt und somit im Hitzefällungsüberstand verbleibt. In der EP 0 637 451 wird empfohlen, Fibrinogen vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Pasteurisierung von Faktor XIII durch kurzzeitiges Erhitzen (etwa einige Minuten bei 560C bis 600C) zu denaturieren und als Präzipitat abzutrennen. Aufgrund völlig anderer Eigenschaften wie z.B. Aggregatbildungs- und Fällungseigenschaften beider Proteine, lassen sich Stabilisationsverfahren nicht übertragen.
Schließlich ist auch aus der DE 199 23 027 ein Verfahren zur Inaktivierung und/oder Eliminierung von umhüllten oder nicht-umhüllten Viren aus einer Plasmaproteinlösung durch Zusatz eines Ammoniumsalzes beschrieben, bei dem man eine chromatographisch vorgereinigte Plasmaproteinlösung bei einer Ammoniumsalzkonzentration von 30 bis 39 Gew.-% einer Inkubation unterwirft und nach Abtrennung der Ausfällungen und Entfernung des Ammoniumsalzes bis auf einen Restgehalt von weniger als 0,5 mol/l mehrere Stunden bei etwa 600C pasteurisiert und sie dann zu einer therapeutisch einsetzbaren Plasmaproteinzubereitung verarbeitet.
All den für Fibrinogen beschriebenen Verfahren, bei den zur Inaktivierung von Viren eine Wärmebehandlung eingesetzt wird, ist gemeinsam, dass trotz der verwendeten Stabilisatoren ein noch immer deutlicher Protein- oder Aktivitätsverlust bei der Hitzebehandlung oder den nachfolgenden Schritten nicht verhindert werden konnte. Ein Grund für diesen Verlust liegt u.a. darin, dass die Hitzebehandlungen zu strukturellen Änderungen führen können und sich dies beim Fibrinogen in der Bildung von Aggregaten äußern kann. Die Bildung von Proteinaggregaten führt direkt, aber auch indirekt zu einem Verlust an Protein bzw. Aktivität z.B. durch Ausfällungen. Die Virusinaktivierung geht also nachteilig einher mit einem Verlust an Fibrinogen. Die üblichen im Stand der Technik bekannten Stabilisatoren können dem nur ungenügend entgegenwirken. Es ist jedoch im höchsten Maße wünschenswert, die Aggregatbildung so weit wie möglich zu verringern, da die Aggregatbildung zu einem Verlust an Ausbeute führen kann. Wegen des breiten therapeutischen Anwendungsgebietes von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen besteht ein hoher Bedarf an Verfahren, mit denen die Aggregatbildung vermindert und die Qualität bei gleich bleibend hoher oder gesteigerter Virussicherheit verbessert werden kann. Insbesondere da Fibrinogen zum überwiegenden Teil aus humanem Blutplasma gewonnen wird, ist es wünschenswert, eine möglichst hohe Ausbeute an Fibrinogen hoher Qualität zu erreichen um eine maximale Ausnutzung vorhandener Blutspenden zu gewährleisten.
Überraschenderweise konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass durch Einsatz von Ammonium- oder Amino-Verbindungen zusätzlich zu den üblichen Stabilisatoren eine Aggregatbildung bei Hitzebehandlungen signifikant reduziert werden kann.
Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Pasteurisierung von Fibrinogen haben zudem den Nachteil, dass die üblichen Stabilisatoren wie
Kohlenhydrate und Aminosäuren in sehr hohen Konzentrationen zugesetzt werden müssen, um Fibrinogen im ausreichenden Maße zu stabilisieren. Könnten diese
Konzentrationen abgesenkt werden, wären positive Effekte auf die
Abreicherungsfaktoren verschiedener Viren zu erwarten. Überraschenderweise konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass durch Zusatz von Ammonium- oder Amino-Verbindungen der Zusatz üblicher Stabilisatoren wie Zucker und Aminosäuren, unter gleichbleibender oder sogar verringerter Proteinaggregation, reduziert werden kann. Da die verwendeten Ammonium- Verbindungen die Virusinaktivierungskinetik in dem verwendeten Konzentrationsbereich nicht signifikant beeinflussen, führt dies aufgrund der Reduktion der anderen Stabilisatoren zu einer verbesserten Virusabreicherung.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren bereit zu stellen, das bei einer Hitzebehandlung eine Verminderung der Aggregatbildung in fibrinogenhaltigen Lösungen erlaubt und damit die Herstellung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung mit hoher Qualität ermöglicht. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es außerdem, eine fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung mit hoher Virussicherheit zu erhalten.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Verminderung der Aggregatbildung bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lösungen, bei dem man den Lösungen neben üblichen Fibrinogenstabilisatoren eine oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln R-NH3 + X' und/oder R-NH2 in einer Menge von 0,001 bis 0,5 Mol pro Liter Lösung (0,001 - 0,5 M) zusetzt.
Bei dem Rest R handelt es sich um ein H- oder einen Alkyl-, Aryl- oder einen gemischten Alkyl-/Arylrest, wobei die Alkyl- und/oder Arylreste durch Halogen, Amino- oder Hydoxylgruppen substituiert sein können. Der Alkylrest umfasst acyclische sowie cyclische Kohlenwasserstoffe, die durch ein oder mehrere Einfach- und/oder Doppelbindungen verbunden sein können. Verzweigtkettige Kohlenwasserstoffe sind ebenfalls geeignet. Bei dem Arylrest handelt es sich um eine aromatische Verbindung, die eine oder mehrere aromatische Ringstrukturen enthält. Der Rest R kann auch aus gemischten Aryl und Alkylanteilen bestehen. Die Alkyl- und/oder Arylreste können mit ein oder mehreren verschiedenen funktionellen Gruppen substituiert sein, wobei auch heterocyclische Verbindungen umfasst sind. Mögliche funktionelle Gruppen sind beispielsweise OH-Gruppen, NR2-Gruppen (wobei R der obigen Definition entspricht), CONH2-Gruppen (Säureamide) oder Sθ3-Gruppen. Ausgenommen unter dem Begriff Substituierung im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substituierungen mit COOH-Gruppen, die zu Bildung von Carbonsäuren führen. Carbonsäuren wie z.B. Aminosäuren sind als Stabilisatoren bei Pasteurisierungen von Fibrinogen im Stand der Technik bekannt. Verwiesen sei hierzu beispielsweise auf die bereits erwähnten EP 0 035 204, EP 103 196 und US 5,116,950. Bevorzugt befindet sich zwischen dem Rest R und der NH2-Gruppe noch eine CH2-Gruppe. Bevorzugte funktionelle Gruppen in dem Falle, dass R ≠ H ist, sind die NH2- und OH-Gruppen und bevorzugt sind Verbindungen wie z.B. Ethanolamin.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist R identisch mit Wasserstoff, d.h. insbesondere bevorzugt sind Ammoniumverbindungen, die das NH/ Ion (Ammoniumion) enthalten.
Liegen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in ihrer protonierten Form mit einer positiven Ladung vor, so wird der Ladungsausgleich durch ein entsprechendes Anion (X') geschaffen. Mögliche bevorzugte Beispiele für Anionen sind Sulfate, Acetate, Chloride, Phosphate, Nitrate. Vorteilhaft im Sinne dieser Erfindung einzusetzen und damit insbesondere bevorzugt sind Sulfat-, Acetat- und Chlorid-Ionen. Demnach sind in der vorliegenden Erfindung als R-NH3 + X" Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und/oder Ammoniumacetat besonders bevorzugt.
Die Konzentration der R-NH3 + X' und/oder R-NH2 Verbindungen in der fibrinogenhaltigen Lösung zum Zeitpunkt der Hitzebehandlung muss unterhalb von 0,5 M liegen. Bei zu hohen Konzentrationen ist keine vorteilhafte Verbesserung der Verminderung der Aggregatbildung mehr festzustellen. Im Gegenteil kann, in Abhängigkeit von der jeweiligen Verbindung, sogar eine verstärkte Aggregation von Fibrinogen resultieren. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen in einer Konzentration von 1 bis 150 mMol pro Liter stabilisierter fibrinogenhaltiger Lösung, die einer Hitzebehandlung unterzogen wird, vor. Insbesondere bevorzugt sind Mengen von 2 - 60 mMol pro Liter stabilisierter, fibrinogenhaltiger Lösung. Die am besten geeigneten Konzentrationen sind der jeweiligen Verbindung anzupassen und können leicht durch Vergleichsversuche, wie sie auch in den Beispielen gezeigt sind, vom Fachmann festgestellt werden. Die R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen können direkt vor der Hitzebehandlung oder zu einem früheren Zeitpunkt zugesetzt werden.
Unter Hitzebehandlung ist eine Erwärmung der fibrinogenhaltigen Lösung auf über 300C zu verstehen. Hitzebehandlungen können beispielsweise bei der Herstellung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen auftreten z.B. beim Lösen von zugesetzten Substanzen für Fällungs- oder Reinigungsschritte oder beim Einlösen von Fibrinogen-Niederschlägen. Vorzugsweise handelt es sich hierbei aber um eine Hitzebehandlung, die zur Inaktivierung von potentiell vorhandenen infektiösen Agenzien wie beispielsweise Viren eingesetzt wird, auch bekannt als Pasteurisierung. Bekannte Pasteurisierungsbedingungen für fibrinogenhaltige Lösungen liegen vorzugsweise bei 55-650C für 10 bis 15 Stunden. Eine wässrige Lösung, die für z.B. etwa 10 Stunden bei 6O0C gehalten wurde, gilt nach dem Stand des heutigen Wissens als frei von vermehrungsfähigen Hepatitisviren. Höhere Temperaturen (z.B. 80 oder 100°C) für kürzere Zeiten oder tiefere Temperaturen (z.B. 5O0C) für längere Zeiten können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Pasteurisierungsbedingungen sind Bedingungen, bei denen die Temperatur und Dauer der Hitzebehandlung ausreichend sind, vorhandene Viren weitestgehend, d.h. mehr als 4 Log10-Stufen, zu inaktivieren. Die Pasteurisierungsbedingungen können beispielsweise auch angepasst werden an die Zusammensetzung der Stabilisatoren. Eine Reduktion von üblichen Stabilisatoren kann gegebenenfalls eine Reduktion der Temperatur und/oder Dauer der Hitzebehandlung bei gleich bleibender Virusinaktivierung ermöglichen. Geeignete Bedingungen für die Pasteurisierung können im Einzelfall leicht vom Fachmann durch Zusetzen von Testviren und Bestimmung des Reduktionsfaktors nach bekannten Methoden festgelegt werden.
Bei einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung handelt es sich um eine flüssige Zusammensetzung, die mindestens Fibrinogen und Wasser enthält. Dabei kann Fibrinogen im Gemisch mit anderen Proteinen, in teilgereinigter oder aufgereinigter Form vorliegen.
Unter dem Begriff Fibrinogen ist vorzugsweise humanes Fibrinogen zu verstehen, das z.B. aus einer aus humanem Blut gewonnenen Mischung, die Fibrinogen enthält, aufgereinigt werden kann. Unter dem Begriff „aus Blut gewonnene Mischung" sind beispielsweise Gesamtblut, Blutplasma, Plasmafraktionen oder Plasmapräzipitate zu verstehen. Bevorzugt wird Fibrinogen aus humanem Plasma, Plasmafraktionen, Cryopräzipitat oder einer 8% Ethanol Fällung nach Cohn gewonnen. Fibrinogen kann sowohl aus gepoolten Plasmaspenden als auch aus Einzelspenden isoliert sein. Humanes Fibrinogen kann auch aus der Milch transgener Tiere gewonnen werden, siehe beispielsweise US 5,639,940. Auch Fibrinogen, das durch rekombinante Expression aus Zellkultur gewonnen wird, siehe beispielsweise US 6,037,457, ist umfasst. So ist es möglich, Fibrinogen aus den entsprechenden Fermentationsüberständen oder daraus hergestellten Fraktionen zu isolieren. Auch bei gentechnologisch hergestelltem Fibrinogen können potentiell infektiöse Agenzien vorliegen, die durch eine Pasteurisierung inaktiviert werden müssen, gegebenenfalls auch durch eine Hitzebehandlung während der Reinigung . Umfasst ist auch Fibrinogen isoliert aus einer aus tierischem Blut gewonnen Mischung, die Fibrinogen enthält, vorzugsweise von Tieren wie Säugetieren (z.B. Schwein, Pferd, Rind, Ziege und Schaf). Bei der Fraktionierung, Präzipitation und/oder chromatographischen Reinigung treten jeweils wässrige Lösungen auf, die Fibrinogen enthalten und unter den Begriff fibrinogenhaltige Lösung fallen. Derartige Verfahren zur Gewinnung von Fibrinogen sind im Stand der Technik bekannt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Fibrinogenmenge in der fibrinogenhaltigen Lösung vor dem Zusatz von Stabilisatoren zwischen 0,1 und 10 % (0,1 bis 10 g / 100 ml Lösung), insbesondere bevorzugt zwischen 1 und 5 % (1 bis 5 g / 100 ml Lösung).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform findet das Verfahren zur Hitzebehandlung einer fibrinogenhaltigen Lösung in einer wässrigen Lösung statt, deren pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 liegt. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 6 und 8.
Die beiden Verbindungen R-NH3 + X" und R-NH2 liegen in einer wässrigen Lösung in einem Gleichgewicht vor. Durch den pH-Wert kann das Gleichgewicht unterschiedlich stark zu Gunsten jeweils einer Verbindung verschoben werden. Insbesondere bevorzugt ist ein pH-Wert, bei dem die R-NH2 Verbindungen zu mehr als 50% protoniert vorliegen.
Die R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zusammen mit üblichen Stabilisatoren eingesetzt. Ein völliger Verzicht auf übliche Stabilisatoren ist nicht möglich. Die üblichen Stabilisatoren können einzeln oder in verschiedenen Kombinationen vor der Hitzebehandlung zugesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den üblichen Stabilisatoren um Kohlenhydrate, Carbonsäuren, zweiwertige Metallionen oder Mischungen davon. Zu den Kohlenhydraten zählen Zucker wie vorzugsweise Mono, Di und Oligosaccharide sowie Zuckeralkohole. Beispiele für Zucker sind Galaktose, Mannose, Saccharose, Maltose, Laktose oder Rhamnose. Beispiele für Zuckeralkohole sind Mannit, Sorbit oder Xylit.
Bei den zweiwertigen Metallionen handelt es sich zum Beispiel um Calcium- oder Magnesiumionen, die bevorzugt als anorganische Salze vorliegen. Zu den Carbonsäuren zählen vorzugsweise Aminosäuren, wie insbesondere Glycin, möglich sind aber auch saure, basische, oder andere neutrale, z.B. aromatische Aminosäuren, wie beispielsweise Glutaminsäure, Asparaginsäure, α-, ß-, γ-Aminobuttersäure, Lysin, Arginin, Histidin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Alanin, Prolin, Serin, Cystein sowie weitere Aminosäuren oder deren Salze und Derivate.
Zu üblichen Stabilisatoren zählen aber auch Peptide oder so genannte HilfsStabilisatoren. Darunter sind Verbindungen zu verstehen, die eine Fibrinolyse hemmen wie z.B. die ε-Aminocapronsäure, p-Aminomethylbenzoesäure oder ihre Salze oder Derivate. Auch Salze von Carbonsäuren (insbesondere mit 3 bis 10 Kohlenwasserstoffatomen) sind als HilfsStabilisatoren anzusehen.
Eine insbesondere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kombination von üblichen Stabilisatoren wie Saccharose, Glycin, Calciumchlorid oder Mischungen davon.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kombination der üblichen Stabilisatoren Saccharose und Calciumchlorid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die fibrinogenhaltige Lösung auch Salze wie beispielsweise Natriumchlorid. Gegebenenfalls kann auch eine zusätzliche Puffersubstanz enthalten sein. Mögliche bekannte Puffersubstanzen sind Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 4-(2- Hydroxyäthyl)-piperazin-1 -äthan-sulfonsäure (HEPES), 3-Morpholino- propansulfonsäure (MOPS) oder andere physiologische Puffersysteme.
Kohlenhydrate werden vorzugsweise in einer Menge von oberhalb 10%, besonders bevorzugt von 500 bis 1500 g pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von
Stabilisatoren) eingesetzt, insbesondere bevorzugt sind Mengen von 800-1000 g pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren). Aminosäuren können bevorzugt in Mengen zwischen 0 und 2 Mol pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren) zugegeben werden. Salze enthaltend zweiwertige Metallionen können vorzugsweise in Mengen von 0 bis 5 g pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren) eingesetzt werden, insbesondere bevorzugt sind 50 bis 1000 mg pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren). Da die zugesetzten Stabilisatoren eine Volumenzunahme verursachen, liegen die Stabilisatoren in der stabilisierten fibrinogenhaltigen Lösung während der Hitzebehandlung in einer entsprechend niedrigeren Endkonzentration vor.
Ein Zusatz von R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lösungen, ermöglicht vorteilhafterweise einen reduzierten Einsatz von üblichen Stabilisatoren. So kann z.B. auf Stabilisatoren wie Glycin auch vollständig verzichtet werden.
Durch den erfindungsgemäßen Zusatz von R-NH3 + X' und/oder R-NH2 Verbindungen ist es möglich, den Anstieg von Fibrinogenaggregaten während der Hitzebehandlung zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Aggregatanstieg im Vergleich zum Kontrollansatz (ohne Zusatz von R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen) um mindestens 10% reduziert, insbesondere bevorzugt wird der Aggregatanstieg um mehr als 30% reduziert. Der Aggregatanstieg kann wie in den Beispielen beschrieben bestimmt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Aktivität von Fibrinogen, bestimmt nach Clauss (A. Clauss; Acta Haematol 17: 237-246 (1957)) an einem Gerinnungsautomaten wie dem Behring Coagulation Timer (Dade Behring), bei einer Hitzebehandlung unter dem erfindungsgemäßen Zusatz von R- NH3 + X' und/oder R-NH2 Verbindungen und anschließender Aufarbeitung durch (fraktionierte) Fällung zu mehr als 50% und insbesondere bevorzugt zu mehr als 65% wieder gefunden. Weiterhin ist es überraschenderweise möglich, fibrinogenhaltige Präparate auch in fester Form zu erhitzen (Trockenerhitzung) und den positiven Effekt von NH4 + X" und/oder R-NH3+ X' und/oder R-NH2 Verbindungen zu nutzen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist damit ein Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lyophilisaten, bei dem die fibrinogenhaltige Lösung vor Lyophilisation neben üblichen Hilfsstoffen ein oder mehrere R-NH3 + X" und/oder R- NH2 Verbindungen in einer Konzentration unterhalb 0,5 Mol pro Liter enthält, wobei R und X" den bisherigen Definitionen entsprechen. Bevorzugt liegt der Restwassergehalt des Lyophilisates bei >0,1% (w/w). Mögliche übliche Hilfsstoffe für die Lyophilisation sind z.B. Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren, Carbonsäuren, anorganische Salze, Puffersubstanzen, Komplexbildner, oberflächenaktive Verbindungen oder Mischungen davon.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Schritt innerhalb eines Verfahrens zur Herstellung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung sein. Mögliche Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind also fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitungen, die nach einem Verfahren hergestellt wurden, das ein oder mehrere erfindungsgemäße Verfahren zur Hitzebehandlung einer fibrinogenhaltigen Lösung oder/und eines fibrinogenhaltigen Lyophilisates beinhaltet. Für die Herstellung der fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung können die R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindung im Verlauf des weiteren Verfahrens nach der Hitzebehandlung ganz oder teilweise durch konventionelle Techniken und bekannte Reinigungsverfahren aus der fibrinogenhaltigen Lösung oder dem gelösten fibrinogenhaltigen Lyophilisat entfernt werden. Bei der Hitzebehandlung noch auftretende restliche hochmolekulare Bestandteile lassen sich gegebenenfalls durch bekannte Reinigungsschritte entfernen. So können beispielsweise, wie in der EP 0 103 196 beschrieben, auftretende restliche Aggregate durch eine Vorfällung (z.B. 0,25 bis 1 ,5 M Glycin) abgetrennt werden und das verbleibende Fibrinogen anschließend durch Erhöhung der Konzentration des Fällungsmittels (z.B. 2,2 M Glycin) ausgefällt werden, so dass es von vorhandenen Stabilisatoren einschließlich der R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen, abgetrennt wird. Die fibrinogenhaltige Lösung kann gegebenenfalls nach konventionellen Techniken bis zum Erhalt einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung zur therapeutischen oder diagnostischen Anwendung aufgereinigt werden.
Handelt es sich bei den R-NH3 + X' und/oder R-NH2 Verbindung um pharmazeutisch verträgliche Verbindungen, so kann es auch vorteilhaft sein, diese Verbindungen vollständig oder zum Teil in der fertigen fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung zu belassen. Unter pharmazeutisch verträglichen Verbindungen sind Verbindungen zu verstehen, die in den verwendeten Konzentration zu keinen ersichtlichen oder gravierenden nachteiligen oder toxischen Nebenwirkungen oder Unverträglichkeitsreaktionen beim Patienten führen.
Im Falle von lyophilisierten fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen, die pharmazeutisch verträgliche R-NH3 + X' und/oder R-NH2 Verbindungen enthalten, kann es auch von besonderen Vorteil sein, erst die fertige fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung in Form eines Lyophilisates zu erhitzen, um potentiell infektiöse Agentien zu inaktivieren.
Bei der Lagerung in flüssiger Form kann es für Fibrinogen ebenfalls von Vorteil sein, wenn die pharmazeutische Zubereitung ein oder mehrere R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen enthält. Wie bereits ausführlich beschrieben, können die Ammonium- und/oder Aminoverbindungen die Aggregatbildung bei Hitzebehandlung, die auch bei einer Lagerung auftreten kann, signifikant vermindern. Gerade bei medizinischen Endprodukten, bei denen keine Abreicherung von auftretenden Aggregaten durch Reinigungsschritte mehr erfolgen kann, ist das vermehrte Auftreten von Aggregaten unerwünscht. Aggregate können bei intravenöser Gabe im Patienten zu Nebenwirkungen führen, ein Grund, warum auch Zulassungsbehörden den Aggregatgehalt häufig begrenzen. Da R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen die Aggregatbildung auch bei Hitzebehandlungen vermindern, besteht die Möglichkeit einer Flüssiglagerung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen zumindest für eine bestimmte Zeit, auch bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen, womit sich z.B. die Anwendungseigenschaften in Notfallsituationen verbessern lassen. Auch auf längeren Versandwegen, wo tiefe Temperaturen nicht durchgehend gewährleistet werden können, ist es von Vorteil, wenn die Stabilität auch bei höheren Temperaturen gesichert ist. Eine stabile Lagerung von Fibrinogen ohne signifikante Aggregatbildung in Lösungen erleichtert also in vielerlei Hinsicht die Herstellung, den Gebrauch, Transport und die Verabreichung am Patienten, da die sofortige Einsatzmöglichkeit des Wirkstoffes am Patienten möglich ist und sich somit der zeitliche Aufwand der Rekonstitution lyophilisierter Zubereitungen bzw. das Auftauen und Erwärmen eingefrorener Zubereitungen erübrigt. Aber auch bei einer Lagerung als Lyophilisat oder im gefrorenen Zustand ist es von Vorteil, wenn das rekonstituierte bzw. aufgetaute Fibrinogen noch länger eine verminderte Aggregatbildung aufweist. Dies zeigt sich beispielsweise in Situationen, wo für Operationen vorsorglich Material rekonstituiert wurde, dann aber aus medizinischen Erwägungen heraus der Einsatz nicht notwendig wurde. Dieses Material müsste bei nur kurzfristiger Stabilität verworfen werden und könnte nicht mehr zu einem späteren Zeitpunkt zum Einsatz kommen. Bei Verwendung von Fibrinklebern ist es insbesondere von Vorteil, wenn Fibrinogen in flüssiger Form vorliegt. Ein Rekonstituieren, um den Kleber einsatzbereit zu machen, würde relativ viel Zeit benötigen, zumal Fibrinogen in hohen Konzentrationen vorliegt.
Da sich Ammonium- und Aminoverbindung auch für die Lagerung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen als vorteilhaft erweisen, können sie auch einer pharmazeutischen Zubereitung zugesetzt werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung, die für die Lagerung, neben anderen üblichen Hilfsstoffen, ein oder mehrere NH4 + X" und/oder R-CH2-NH3 + und/oder R-CH2-NH2 Verbindungen in einer Konzentration von unterhalb 0,5 Mol pro Liter enthält. Bevorzugt sind Konzentrationen von 1 bis 480 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung, besondere bevorzugt sind 1 bis 300 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung, insbesondere bevorzugt sind 1 bis 150 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung und ganz besonders bevorzugt sind 2 bis 100 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung. Die Konzentration ist der jeweiligen Verbindung und ihrer physiologischen Verträglichkeit anzupassen. R und X" entsprechen den bisherigen Definitionen unter der zusätzlichen Vorrausetzung, dass die resultierenden Verbindungen physiologisch verträglich sind, und in den eingesetzten Konzentrationen keine nachteiligen Nebenwirkungen erwarten lassen. Besonders bevorzugte Verbindungen sind auch in diesem Fall Ammoniumverbindung. Insbesondere bevorzugt sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumacetat.
Die üblichen Hilfsstoffe richten sich nach der geplanten Verwendung. Für eine intravenöse Verabreichung von Fibrinogen sind andere dem Fachmann bekannte Zusätze angeraten wie für einen Einsatz als Fibrinkleber. Zu berücksichtigen sind auch bestimmte Zusätze bei einer geplanten Zwischenlagerung als Lyophilisat oder im gefrorenen Zustand. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die üblichen Hilfsstoffe einwertige Metallsalze (beispielsweise Natrium- oder Kaliumchlorid), zweiwertige Metallsalze (beispielsweise Magnesium- oder Calciumchlorid), Aminosäuren (beispielsweise Glycin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Lysin, Isoleucin, Cystein), Kohlenhydrate (beispielsweise Glucose, Saccharose, Trehalose, Laktose, Cellulose, Stärke, Sorbitol, Mannitol und Glykosaminoglykane), Detergenzien (beispielsweise Poloxamere oder Polysorbate), Harnstoff, Guanidin, Inhibitoren wie Fibrinolyse- oder Fibrinogenolyseinhibitoren (beispielsweise Aprotinin, Antiplasmine, wie Alpha-2- Antiplasmin, Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antiplasmin, Plasminogenaktivator- inhibitoren (PAI), Thrombin-aktivierbarer-Fibrinolyse-lnhibitor (TAFI), Epsilonaminocapronsäure, C1 -Inhibitor und Antithrombin), Plasmaproteine (z.B. FXIII, Fibronektin), Antioxidantien (beispielsweise Ascorbinsäure), Puffer- Substanzen (z.B. Aminosäuren wie Arginin, Puffersysteme wie Citrat, Phosphat, Acetat, Succinat, Glycylglycin, Carbonat und Bicarbonat) oder Mischungen davon. Der pH-Wert liegt zwischen 5 und 9, bevorzugt zwischen 6 und 8.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung, die nach einem Verfahren hergestellt wurde, das das erfindungsgemäße Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lösungen oder/und fibrinogenhaltigen Lyophilisaten enthält.
Ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung, die neben üblichen Hilfsstoffen eine oder mehrere NH4 + X", R-CH2-NH3 + X' und/oder R-CH2-NH2 Verbindungen in pharmazeutisch verträglicher Form enthält.
Mögliche Verwendungen sind dem Fachmann bekannt und die erfindungsgemäßen fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen können für alle bekannten Verwendungen von Fibrinogen vorteilhaft eingesetzt werden. Dabei ist eine Verwendung sowohl als Therapeutikum als auch als Komponente eines Diagnostikums möglich. Die medizinische Anwendung bezieht sich vorzugsweise auf den Menschen, aber auch in der Tiermedizin sind Anwendungen umfasst. Generell ist die erfindungsgemäße fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung für die Therapie von Fibrinogenmangelzuständen geeignet. Zu diesen Mangelzuständen kann es beispielsweise bei großflächigen Wunden, bei starken Blutungen, bei großflächigen Verbrennungen, krankhafter Aktivierung der Blutgerinnung (Verbrauchskoagulopathie auch DIC (disseminated intravascular coagulation) genannt), durch Medikamente oder schwere Lebererkrankungen (z.B. bei Synthesestörung durch Leberparenchymschaden) kommen. Neben den beschriebenen erworbenen Hypofibrinogenämien (vermindertes Fibrinogen im Blut) bzw. Afibrinogenämien (fehlendes oder hochgradig vermindertes Fibrinogen im Blut) gibt es in seltenen Fällen auch eine angeborene Afibrinogenämie bzw. Hypofibrinogenämie, die durch fehlende oder verminderte Fibrinogensynthese in der Leber verursacht sein kann. Bei Hypofibrinogenämien bzw. Afibrinogenämien wird die erfindungsgemäße fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung dem Patienten vorzugsweise intravenös injiziert, um entsprechende Mangelzustände an Fibrinogen zu kompensieren. Dosierungen orientieren sich an der Höhe des auftretenden Mangels.
Eine hohe Bedeutung kommt Fibrinogen bei der Fibrintherapie als wichtige Komponente so genannter Fibrinkleber zu. Ein Fibrinkleber simuliert den letzten Schritt der Blutgerinnung, indem es bei Kombination von Fibrinogen mit Thrombin und weiteren Komponenten wie Calcium und Faktor XIII zur Bildung von stabilisiertem Fibrin kommt.
In der Medizin gibt es vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für Fibrinkleber, die weitreichend bekannt sind (siehe z.B. Sierra, Journal of Biomaterials Applications 7 (1993) 309-352; Martinowitz & Spotnitz, Thrombosis and Haemostasis 78 (1997) 661-666; Radosevich et al. Vox Sanguinis 72 (1997) 133-143). Wichtig zu nennen sind die Wundheilung, der Wundverschluss, Abdichten von Nähten und die Blutstillung. Die örtliche intraoperative Blutstillung ist insbesondere an parenchymatösen Organen sowie im kardiovaskulären Bereich von Bedeutung. Selbst starke Blutungen nach schweren Leber- oder Milzverletzungen sind so zu stillen. Auch für den Verschluss und die Fixierung von Hautwunden (einschließlich Hauttransplantaten), für die Abdichtung von Nähten (z.B. am Duodenalstumpf) werden Fibrinkleber eingesetzt. Beispielhaft genannt sei auch die Verwendung bei der Abdichtung eines plastischen Duraersatzes und zur Hohlraumversiegelung sowie zur Verklebung der Pleurablätter zur Palliativbehandlung von Pleuraergüssen. Zum Kleben können die Fibrinkleber auch vorteilhaft bei Bindegeweben wie Knochen, Knorpel und Sehnen eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen können aber auch als eine Komponente zur Herstellung einer Fibrin-Matrix verwendet werden. Ein solches Trägermaterial kann u.a. zur langsamen Freisetzung von Wirkstoffen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren (z.B. mit osteoinduktiven Proteinen als Matrix für Knochen- und/oder Knorpelregeneration), Antibiotika, entzündungshemmende Zusätze und/oder wundheilungsfördernde Zusätze verwendet werden. Der Träger kann auch aus einer Mischung von Fibrin mit anderen Materialien bestehen.
Eine Fibrin-Matrix findet darüber hinaus weitreichende Verwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, wie beispielsweise als Trägermaterial und Kulturmedium für Zellen und Gewebe im Tissue Engineering oder zum Umhüllen von Implantaten wie beispielsweise Biosensoren.
Weiterhin soll die Erfindung durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die jedoch in keiner Weise einschränkende Wirkung haben sollen.
Beispiel 1:
Eine fibrinogenhaltige Lösung wurde pro Liter mit 80 ml einer Aluminiumhydroxid- Lösung versetzt und gerührt. Anschließend wurde das Aluminiumhydroxid durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Die fibrinogenhaltige Lösung wurde mit physiologischer NaCI Lösung auf eine optische Dichte bei 280-320 nm (OD280-320) von ca. 50 verdünnt. Die so erhaltene fibrinogenhaltige Lösung, im Folgenden auch als fibrinogenhaltige Ausgangslösung bezeichnet, wurde mit unterschiedlichen Arten und Mengen von Stabilisatoren, wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, versetzt. Die Mengenangaben beziehen sich dabei auf 1 Liter der fibrinogenhaltigen Ausgangslösung (zugesetzte Stabilisatoren pro Liter fibrinogenhaltiger Ausgangslösung). Die fibrinogenhaltige Lösung wurde bis zur vollständigen Lösung der Stabilisatoren bei 300C gerührt. Der pH-Wert wurde mit einer 2 M Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7,5 eingestellt. Die durch Zugabe der Stabilisatoren erfolgte Volumenzunahme ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Für die anschließende Hitzebehandlung wurden die stabilisierten fibrinogenhaltigen Lösungen (Ansätze) für 10 h bei 6O0C inkubiert.
Vor und nach dieser Pasteurisierung wurde eine Probe zur Analyse der Aggregatbildung mittels Größenausschlußchromatographie (SEC-HPLC, siehe weiter unten) entnommen.
Nach Abkühlen und Verdünnung auf das vierfache Volumen mit Verdünnungslösung (3,5 g/L NaCI; 6 g/L tri-Natriumcitrat-dihydrat in Wasser) wurden pro Liter pasteurisierter fibrinogenhaltiger Lösung 90 g Glycin (Ansatz 1 und 2) bzw. 90 g zuzüglich der Glycin-Menge, die notwendig war, um die gesamte in Ansätzen 1 und 2 enthaltene Glycin Konzentration zu erreichen, (Ansätze 3 und 4) unter Rühren zugesetzt. Das entstandene Präzipitat wurde mittels Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und verworfen. Die Hauptfällung erfolgte durch langsame Zugabe von weiterem Glycin, um insgesamt eine Konzentration von 175 g/L zu erreichen. Der fibrinogenreiche Niederschlag wurde isoliert und zur Ausbeutebestimmung in einem definierten Puffervolumen gelöst. Die Fibrinogenbestimmung nach Clauss (A. Clauss; Acta Haematol 17: 237-246 (1957)) erfolgte an einem Gerinnungsautomaten (Behring Coagulation Timer). Tabelle 1 zeigt in Spalte 4 die so ermittelte, verbleibende Ausbeute an biologisch aktiven Fibrinogen in Prozent bezogen auf die Fibrinogenmenge vor der Hitzebehandlung.
In Tabelle 1 sind auch die Ergebnisse der SEC-HPLC Analyse zur Feststellung der Aggregatbildung gezeigt. Bei der SEC-HPLC handelt es sich um eine Size Exclusion Chromatography, die Fibrinogen und Aggregate entsprechend ihres Molekulargewichtes auftrennt. Hochmolekulare Anteile wie Aggregate eluieren noch vor dem Fibrinogen-Hauptpeak und finden sich im Elutionsprofil als Peak 1 und 2 wieder. Die Summe der Flächen unter Peak 1 und Peak 2 der Proben vor und nach der Hitzebehandlung wurde bestimmt und als Prozentanteil der Peaks 1-3 berechnet. Der Wert von SEC Peak 1+2 nach der Hitzebehandlung wurde um den Wert vor Beginn der Pasteurisierung (liegt normalerweise zwischen 10 und 20%) verringert und die hieraus ermittelten Werte sind als Ergebnis in Tabelle 1 unter δ (Peak 1+2) gezeigt. Sie geben den Anstieg an Aggregaten während der Pasteurisierung wieder. Je höher dieser Wert liegt, umso mehr Aggregate haben sich während der Pasteurisierung gebildet.
Für die Durchführung wurde ein entsprechendes HPLC-System mit einer SEC- Säule (TSK Gel G 4000 SWXL, 7,5 x 300 mm von TOSO HAAS) verwendet. Die Auftrennung der Proteine und Aggregate erfolgte bei einer Flussrate von 0,5 ml/min in einem geeigneten Laufpuffer (15O mM NaCI, 2O mM Tris, 0,05% NaN3 pH 7,0) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine bzw. Aggregate erfolgte bei 280 nm. Tabelle 1 : Pasteurisierung bei 6O0C für 10 Stunden
Figure imgf000024_0001
Das Ergebnis zeigt, dass durch Zusatz von Ammoniumsulfat ((NH4J2SO4) die Aggregatbildung signifikant reduziert werden kann (um 15 % bzw. 27 %) und eine erhöhte Fibrinogen-Ausbeute zu erzielen ist (vergleiche Ansatz 2 mit 1 bzw. Ansatz 4 mit 3). Außerdem ist ersichtlich, dass die Menge an Saccharose und Glycin im Vergleich zum Standardansatz (Ansatz 1) reduziert werden kann und trotzdem noch reduzierte Aggregatbildung beobachtet wird (vergleiche Ansatz 4 mit Ansatz 1). Dies ist zusätzlich von Vorteil, da die verminderte Menge an Saccharose und Glycin mit einer verbesserten Virusinaktivierung einhergeht.
Beispiel 2:
Eine fibrinogenhaltige Ausgangslösung, hergestellt entsprechend Beispiel 1 , wurde mit den Stabilisatoren entsprechend Tabelle 2 versetzt und unter Beibehaltung eines pH-Wertes von 7,5 bis zur vollständigen Lösung bei ca. 300C gerührt. Anschließend wurde die stabilisierte fibrinogenhaltige Lösung für 10 Stunden bei 610C pasteurisiert. Der Aggregatgehalt wurde vor und nach Pasteurisierung durch SEC-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt und der ermittelte Aggregatanstieg wird in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: Pasteurisierung bei 610C für 10 Stunden
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Das Ergebnis zeigt, dass nicht nur Ammoniumsulfat ((NH4J2SO4) sondern auch Ammoniumacetat (NH4Ac) und Ammoniumchlorid (NH4CI) die Aggregatbildung signifikant reduzieren können. Das beste Ergebnis zeigt hierbei der Zusatz von 30 mMol NH4CI (Ansatz 7), bei dem im Vergleich zum Kontrollansatz (Ansatz 1) der Aggregatanstieg um 76% reduziert werden konnte (während der Hitzebehandlung also nur ca. % der Aggregate wie im Kontrollansatz gebildet werden). Aber selbst der Zusatz so geringer Mengen wie 3,75 mMol (NH4)2SO4 (Ansatz 2) vermag den Aggregatanstieg noch um 16 % zu reduzieren.
Gezeigt ist ebenfalls, dass nicht nur Ammoniumsalze, sondern auch Aminoverbindungen wie Ethanolamin sich reduzierend auf die Aggregatbildung (um 57% weniger Aggregate gebildet) bei einer Pasteurisierung auswirken.
Die Zusätze des Typs R-NH3 + X" reduzieren die Aggregatbildung bereits sehr gut, wenn sie in geringen Mengen (ca. 3 bis 60 mMol pro Liter fibrinogenhaltige Ausgangslösung) zugesetzt werden. Dabei müssen höhere Konzentrationen nicht zwangsweise vorteilhaft sein, wie beim Vergleich von Ansatz 4 und 5 oder Ansatz 11 und 12 feststellbar ist.
Die für die jeweilige Ammoniumverbindung optimale Konzentration neben bestimmten üblichen Stabilisatoren, kann von dem Fachmann leicht durch entsprechende vergleichende Versuche herausgefunden werden.
Der Versuch zeigt auch, dass auf den üblichen Stabilisator Glycin vollständig verzichtet werden kann (vergleiche Ansatz 10 und Ansatz 3).
Beispiel 3:
Eine fibrinogenhaltige Ausgangslösung, hergestellt entsprechend Beispiel 1 , wurde mit den Stabilisatoren entsprechend Tabelle 3 versetzt und unter Beibehaltung eines pH-Wertes von 7,5 bis zur vollständigen Lösung bei ca. 300C gerührt.
Anschließend wurde die stabilisierte fibrinogenhaltige Lösung für 10 Stunden bei
600C pasteurisiert. Der Aggregatgehalt wurde vor und nach Pasteurisierung durch
SEC-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt und in Tabelle 3 als Aggregatanstieg aufgeführt.
Tabelle 3: Pasteurisierung bei 600C für 10 Stunden
Figure imgf000027_0001
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Figure imgf000029_0001
Das Ergebnis zeigt, dass die Zusätze des Typs R-NH3 + X" auch bei unterschiedlicher Zusammensetzung und Menge der üblichen Stabilisatoren die Aggregatbildung wesentlich reduzieren.
Beispiel 4:
Eine fibrinogenhaltige Ausgangslösung, hergestellt entsprechend Beispiel 1 , wurde mit den Stabilisatoren entsprechend Tabelle 4 versetzt und unter Beibehaltung eines pH-Wertes von 7,5 bis zur vollständigen Lösung bei ca. 300C gerührt. Anschließend wurde die stabilisierte fibrinogenhaltige Lösung für 11 Stunden bei 610C pasteurisiert. Der Aggregatgehalt wurde vor und nach Pasteurisierung durch SEC-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt und in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4: Pasteurisierung bei 610C für 11 Stunden
Figure imgf000030_0001
Das Ergebnis zeigt, dass auch unter verschärften Pasteurisierungsbedingungen (610C für 11 Stunden anstelle von 600C für 10 Stunden) der Aggregatgehalt durch Zusätze des Typs R-NH3 + X' deutlich (um 11% bzw. 27%) reduziert werden kann (vergleiche Ansatz 2 mit 1 und Ansatz 4 mit 3).

Claims

Ansprüche:Verfahren zur Hitzebehandlung fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitungen
1. Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lyophilisaten, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung vor der Lyophilisation neben üblichen Hilfsstoffen ein oder mehrere R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen in einer Konzentration unterhalb 0,5 Mol/l zugesetzt werden, wobei R ein Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder gemischtem Alkyl-/Arylrest ist und die Alkyl- und/oder Arylreste mit Halogen, Hydroxyl- oder Aminogruppen substituiert sein können und X" ein Anion ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung Ammoniumsalze (NH4 +) zugesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung ein oder mehrere Amine zugesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung Ammoniumsalze zugesetzt werden, die als Anionen (X") Sulfat-, Chlorid- oder Acetat-Ionen enthalten.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die R R-NH3 + X" und -NH2 Verbindungen neben üblichen Stabilisatoren bis zu einer Konzentration von 1 bis 150 mMol pro Liter der fibrinogenhaltigen Lösung zugesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als übliche Stabilisatoren Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren, zweiwertige Metall-Ionen oder Mischungen davon zugesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als übliche Stabilisatoren Saccharose, Glycin, Calciumchlorid oder Mischungen davon der fibrinogenhaltigen Lösung zugesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als übliche Stabilisatoren Saccharose und Calciumchlorid der fibrinogenhaltigen Lösung zugesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als R-NH3 + X" und/oder R-NH2 Verbindungen Ammonium chlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und/oder Ethanolamin zugesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hitzebehandlung eine Erwärmung auf 30°C bis 1000C bedeutet.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aggregatbildung während der Hitzebehandlung vermindert wird.
12. Verfahren zur Verminderung der Aggregatbildung bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung neben üblichen Fibrinogenstabilisatoren ein oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln R-NH3 + X" und/oder R- NH2 , in denen R Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder ein gemischter Alkyl- /Arylrest ist, der mit Hydroxyl-, Halogen oder Aminogruppen substituiert sein kann und X' ein Anion ist, in einer Menge von 1 bis 500 mM/l zugesetzt werden.
13. Fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche hergestellt ist.
14. Fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie neben üblichen Hilfsstoffen, eine oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln NH4 + X", R-CH2-NH3 + X' und/oder R-CH2-NH2 in einer Konzentration unterhalb 0,5 Mol/l enthält, wobei R ein Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder gemischter Alkyl-/Arylrest ist und die Alkyl- und/oder Arylreste mit Halogen, Hydroxyl- oder Aminogruppen substituiert sein können und X" ein Anion ist und die Verbindung physiologisch verträglich ist.
15. Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 13 oder 14 als Therapeutikum oder Diagnostikum.
16. Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 13 oder 14 als Komponente eines Fibrinklebers.
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