JPH03501974A - 血漿蛋白質のクロマトグラフィーによる分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血漿蛋白質のクロマトグラフィーによる分離本発明は、一段階で、非常に高い精 製率を達成することのできる技術を利用する陰イオン交換クロマトグラフィーに よる人又は動物の血漿分画蛋白質特に第■因子、フィブリノーゲン及びホン　ビ レブランド因子の分離に関する。

治療目的のための血液蛋白質の収得には、高純度で且つ汚染物、特に他の蛋白質 又は抗体のような異種由来の物質のまった（含有されない生成物を得ることがで きる精製技術の利用を必要とする。

例えば血友病Ａの治療において、極めて高純度の第■因子の濃縮物を自由入手し 得ることが不可欠である。実際に、患者は第■因子の濃縮物を多数回繰り返し注 射され、その際同時に望ましくない免疫応答を惹起するフィブリノーゲン及び免 疫グロブリンの相当な量を与えられる。このゆえに精製不十分な第■因子を繰り 返し注射することは、血液群の相異による典型的な輸血事故及び免疫グロブリン の存在のための典型的な輸血事故を避けるために、同じ群の血漿濃縮物でのみ行 われることができる。

第■因子濃縮物は、たいてい寒冷沈降された人の血漿分画から調製される。通常 工業的規模の人血漿処理センターから得られる第■因子の濃縮物の純度は、たい ていＩＩＵ／ｍｇ程度であり、一般に１０〜２０　Ｉ　Ｕ／ｍｇの範囲を越える ものではない。従来の製造技術では、フィブリノーゲン、フィブロネクチン及び 免疫グロブリンのような蛋白質汚染物を排除する目的で沈殿段階が利用されるが 、これはしばしば非常に不適切である。これらの技術では、低温（１０℃）での 沈殿もしくは蛋白質沈殿剤の添加を利用し、あるいは両者を組み合わすことがで きる。蛋白質沈殿剤としては、ＰＥＧ　にューマンら（Ｎｅｗｍａｎ　ｅｔ　ｉ ｆ）　、ブリティッシュ　ジャーナル　オフヘマトロジ−（Ｂｒ、Ｊ、　Ｂｘｅ ｍａｊｏｌ、）　、２１．　１−２０゜１９７１；／’オら（Ｈａｏ　ｃｌ　ａ ｌ　）　、メソッズ　オフ　プラズマ　プロティン　フラクショネーション、ア カデミツク　プレス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌｉｓｍａ　ＰｒｏｔｅｉｎＦ ｒａＣｔｉｏｎｘｔｉｏｎ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）　１９８０．ＰＰ。

５７−７４）、　ポリビニルピロリドン〔カシラス（Ｃｓｓｉｌｌａｇ）とシモ ネテ４　（ＳｉｍｏｎｅＮｉ　）　、ブリティッシュ　ジャーナル　オフ　ヘマ トロジー、５０．６６５−６７２．１９８２）、デキストラン、フィコル（Ｆｉ ｃｏｌｌ）　、パーコル（Ｐｓｒｃｏｌｌ）、ヒドロキシエチル化されたデンプ ン及び第■因子沈殿剤として提案されてきたアルブミン（ファルジア（Ｆｘｒｔ ｕｇｉａ）ら、　ＴｈｒｏｍｂＢａｅｍｏｓ＋ａｓ、５１，３３８−３４２．１ ９８４）のような親水性ポリマーが挙げられる。また、トレル（Ｔｈｏｒｅｌｌ 　）やブロームバック（Ｂｌδｍｂａｃｋ）により推賞されたグリシン及び塩化 ナトリウムの使用も同様に適用でき、いく人かの著者（Ｎｇら、　Ｔｈｒｏｍｂ ｏｓｅｓ　Ｒｅｓ、、４２゜８２５−８３４．１９８６）は、３つの沈殿剤、す なわちＰＥＧ、グリシン及び塩化ナトリウムを組み合わせて１０〜１６１Ｕ／ｍ ｇの比活性を有する第■因子濃縮物を得るのに成功した。

フィブリノーゲンの除去が不十分な第■：Ｃ因子−ホン　ビレブランド因子複合 体を含む高分子量の分画を回収することを目的とする技術である立体排除クロマ トグラフィー　（ｓｔｅｒｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｈｒｏｍＮｏｇｒｘｐ ｂｙ　）又はゲルか過ちまた利用されてきた。この技術は、比活性が３０１Ｕ／ ｍｇまでで且つ（比活性を約３〜５ＩＵ／ｍｇに低下させる）安定剤としてアル ブミンを加えることが必要な生成物を低産出速度で生成する。この技術は、ある 期間にわたって工業用ゲル濾過カラムの分解能力を維持することが困難であるの で、大規模生産への適応には、多くの問題がある。

第■因子の濃縮物もまた、低分子量の蛋白質汚染物を取り込む様に構成された多 孔性シリコン二酸化物の微小球と接触させる生産プログラムに組み入れることで 生産されてきた〔マルゴリスら（Ｍａｒｇｏｌｉｇ　ｅｌ　ａｌ）　、　Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、、４６，３４１−３４８．１９８４）　。この生成物の比活性は、Ｉ ＩＵ／ｍｇと比較的に小さい。

最近、非常に高純度の第■因子濃縮物を調製する新しい技術が現れてきている。

例えば、ハイランド（Ｂｙｌａｎｄ）及びトラベノール（Ｔｒａｖ＋ｎｏｌ）の 両社は、免疫親和力クロマトグラフィー法〔チンマーマン（２ｉｍｍｅｒｍａｎ 　）とフルチャー　（Ｆｕｌｃｈｅｔ　）　、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ 、、５ｕｐｐ１．■。

Ｐ、５８．１９８７．ベーントルプ（Ｂｅｒｎ！ａｒｐ）とエルシン（Ｎｉｌｓ ｓｏｎ　）　、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、、　５ｕｐｐ１．■、Ｐ、６ ０゜１９８７、レビンら（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｊ　ａｌ）　、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ ｉｓＲｓｓ、、５ｕｐｐｌ、■、１９８７）を用いて得られた濃縮物を提案した 。これらの技術は、クロマトグラフィー用の媒体上に固定された抗第■：Ｃ因子 もしくは抗ホン　ビレブランド因子抗体を用いて第■因子を精製するものである 。これら技術は性能がよいが、抗体もしくはホン　とって望ましくない化学物質 を除去する目的の超か過段階の追加が要求され、それにより第■因子の生物学的 活性が害される場合があり得る。第■因子の比活性は、生産途中に１０００〜３ ０００ＩＵ／ｍｇにも達する場合があるが、その不安定性のため凍結乾燥段階前 にアルブミンのような安定剤の添加が必要であり、その結果、第■因子の比活性 は３〜５１Ｕ／ｍｇに減少する。免疫親和力による精製の主な欠点は、それでも なお残留抗体が存在することである。つまり鼠由来のこれら残留抗体は、人体組 織とは性質を異にするこれら蛋白質に対する免疫応答の発生を患者に誘導し得る 。

イオン交換クロマトグラフィーもまた利用されてきたが、操作手順が複雑で、収 率が低いので、これら技術は研究室での利用に限られている。

ジエー、ジエー０モルゲンターラ−（Ｊ、　Ｊ。

Ｍｏｒｇｅｌｈａｌｅｒ）による報告（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｂａｅｍｏｓｉａｓ。

ＨｕＮｇａｒｔ　、４７　（２）、１２４−１２７　（１９８２））は、例えば ポリエチレングリコール沈殿物を用い、改良したセファローズ樹脂を通過させる ことによる第■：Ｃ因子の精製を論じている。しかしながら、収率又は試験され た違った技術の再現性の表示はない。

従って、工業的規模で適用でき、動物由来の抗体のような異種由来の蛋白質を完 全に含有しない極めて高純度の生成物を与えることのできる蛋白質濃縮物、特に 第■因子を得る新しい方法を得ることが絶対的に必要である。

そこで本発明者は、使用する樹脂を適切に選択し、工程の複雑さを増して精製蛋 白質の活性を低下させる超濾過のような次工程を不要とするために適切に計画さ れる条件下で単一のクロマトグラフィーカラムを用いて所望の蛋白質を分離する ことができる陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製方法を開発した。

即ち、本発明は、血漿蛋白質、特に第■因子、フィブリノーゲン、フィブロネク チン及びホン　ビレブランド因子の分離方法に関し、該方法は、人血漿の寒冷沈 降物（ｃｒ７ｏｐｒｅｃｉｐｉｔａＨ）の可溶性分画を相対的に適度のイオン特 性を有し、疎水性相互作用の出現を許しである種の蛋白質を吸着せず他を固定す る陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー処理に供し、次に固定蛋白質を緩 衝液のイオン強度の増大により溶離することを特徴とする。

本発明方法は、例えば豚のような動物由来の血漿にも適用でき、これは、人由来 の第■因子による治療ができない、阻害血清（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｓｃｒｕ ｍ）を有する血友病患者を含む特別な場合に用いられ得る。

従って、前精製処理されていても良い寒冷沈降された血漿の分画を出発分画とし て使用することができる。この前処理は、例えばアルミナゲルでの沈殿及び／又 はそのような分画処理における従来技術に従った低温での沈殿から成ることがで きる。

クロマトグラフィーによる分離を異なる樹脂で試験したところ、フラクトゲルＴ 　Ｓ　Ｋ　（Ｆｒａｃｔｇ＋Ｉ　Ｔ　Ｓ　Ｋ）のようなビニルポリマーゲルに固 定されたＤＥＡＥグループを使用することによって最も満足すべき結果が得られ ることがわかった。このタイプの樹脂は、フラクトゲルＴＳＫ−ＤＥＡＥ６５０ 　（Ｍ）（メルク）の商標名で入手される。このクロマトグラフィー用の媒体は 、ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６８，ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂファ ーストフロー（ファーマシア）　、ＤＥＡＥ−セファローズ４ＢもしくはＤＥＡ Ｅ−トリサクリルＬＳ（ＩＢＦ）のような試験された他のゲルによって得られる 結果よりもはるかに良い結果を与えた。

フラクトゲル−ＴＳＫ−ＤＥＡＥ　（Ｍ）と類似のゲルの使用は、ワイ、カトウ ら（Ｙ、　Ｋｓｌｏ　！ｔ　！！　）　［ジャーナル　オフ　クロマトグラフ４ −　（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ［ｏ　）、２４５．１９８２．１９３−２１１）により 提唱され、該ゲルは非常に大きいサイズの蛋白質の工業規模のクロマトグラフィ ーによる分離の媒体に推賞されている。このゲルの保持−溶離容量は、イオン交 換容量の低さ及び孔サイズの大きさに基づく。

従って本発明者は、このタイプのゲルが、第■因子とホン　ビレブランド因子と の間で形成される非常に大きいサイズの複合体を選択的に吸着することができる ことを示した。さらに、緩衝液の充填及び溶離の選択を通して、本発明者は、ポ リビニル媒体上での大きいサイズの複合体の延長された保持のために形成される わずかな疎水性結合を利用した。このゲルにより得られる利点は、これまで注目 されていなかったものである。

例えば寒冷沈降物の前精製された溶液のような第■因子を含む血漿分画を処理す る樹脂の使用によって、適当な緩衝液条件下で、極めて高純度で、単一グループ の血漿濃縮物のものに同化されることができる品質の第■因子濃縮物を、５０Ｉ Ｕ／回程度の濃度（１００１Ｕ／ｍｇ以上の比活性）で、超濾過段階を行う必要 がなく、しかも蛋白質型安定剤の添加の必要がないのは勿論高い安定性を有する ものとして得る。また同様のクロマトグラフィーによって、治療目的及び試薬と しての使用における要求条件を満たす物理化学的パラメーターに合致する、フィ ブリノーゲン、フィブロネクチン及びホン　ビレブランド因子に富んだ分画も得 ることができる。その上、フィブリノーゲンは、ヨーロッパ特許出願箱８８　４ ０１９６１．３に従ってさらに濃縮され、生物を的接着剤として使用され得る。

本発明に従った方法は、次のように実施される。前精製され、例えばフィブリノ ーゲン、第■因子、フィブロネクチン及びホン　ビレブランド因子等の寒冷沈降 物の主要な蛋白質を含有する血漿分画を前記したような陰イオン交換樹脂に通す 。第■因子、ホン　ビレブランド因子（初期材料の量に依存して全てもしくは相 当な部分）及びフィブロネクチンは、樹脂に吸着するが、フィブリノーゲンは非 吸着蛋白質の炉液中に存在する。

緩衝液のイオン強度の最初の増大によって、フィブロネクチン及び相当部分のホ ン　ビレブランド因子は溶離する。

緩衝液のイオン強度の次の増大によって、第■因子はホン　ビレブランド因子の 少量の存在のもとに溶離され、直接凍結乾燥されることができ、それに安定剤を 加えることもしくはそれを超？濾過段階に供することを必要としない。

使用する緩衝液は、約２〜４　ｇ　／　Ｉ！の割合のリジンと約８〜ｌ１ｇ／Ａ ’の割合のグリシンとを含むことが好ましい。他のアミノ酸を使用したとき、も しくはこれら２つのアミノ酸の一方のみを使用したときは、列置満足すべき結果 は得られない。

緩衝液のイオン強度は、塩化ナトリウムを加えて増大させる。事実、適度にイオ ン性で且つわずかな疎水性の上記単一の樹脂の使用は、この塩を用いて第■因子 が溶離される前にホン　ビレブランド因子を脱着することを可能とし、従って超 が過によってその後に回収しなければならない塩化カルシウムを使用して第■因 子とホンビレブランド因子を分離する必要はない。

ウィルスの不活性化処理は、勿論本発明方法のいずれかの段階においても公知技 術の使用により行われることができる。化学的ウィルス不活性化剤を使用する場 合には、この不活性化は、血漿分画が樹脂を通過する直前に行うのが適当である 。この方法において、クロマトグラフィ一段階は、不活性化剤を能率的に除去す るのに役立つ。

ヨーロッパ特許出願箱０１３１　７４０号に提唱されたような溶媒−洗浄剤によ る不活性化技術を用いることにより好結果が得られた。

第■因子を製造するためには、クロマトグラフィ一段階を第■因子を含有するい かなる蛋白質分画に対しても行うことができる。この様な蛋白質分画としては、 例えばヨーロッパ特許出願箱８６　１０４２９７　６号に提唱されたような第■ 因子濃縮物の従来製造方法に従って、アルミナゲルで処理され、必要ならばさら に低温での沈殿により生じた、前精製され寒冷沈降された血漿分画が挙げられる 。

初期分画中の第■：Ｃ因子の比活性は、０．１１Ｕ／ｍｇ程度の低さでも良い。

本発明に従って、単一の陰イオン交換クロマトグラフィ一段階により得られる精 製係数は、４００〜７００倍程度である。この段階での収率は、７５〜９０％の 間にある。

得られる第■因子濃縮物は、極めて高純度で、蛋白質の１００１　Ｕ／ｍｇより 大きい比活性を有する。フィブリノーゲン及び免疫グロブリンＧはなく、フィブ ロネクチンは相当低減されている。この生成物は、人血液群抗体′を含有しない か、或いは含有したとしても極めて小さな割合である。よって、この生成物は、 血液群により選択されない血漿を初期物質として使用するときでさえも、ヨーロ ッパ薬局方の推薦する標準に従って単一グループ質の濃縮物にたとえることがで きる。従って、定期的な注射を繰り返す必要のある治療、特に血友病Ａの治療に 非常に有利に使用できる。また、極めて高純度の第■因子を必要とする試験もし くは分析における試薬としても使用できる。

このクロマトグラフィーによって分離される他の分画も、また含有する蛋白質の ために興味を起こさせるものである。これらの蛋白質は、すなわち、一方では最 初のか液中に回収されるフィブリノーゲン、他方では緩衝液のイオン強度の最初 の増大により溶離されるフィブロネクチンとホン　ビレブランド因子である。

以下実施例により本発明を説明するが、本発明は斯かる実施例に限定されない。

出発物質として、ナトリウム含有ヘパリン（２Ｕ／ｍ１２）水溶液中に再懸濁さ れ、０．６〜１．１１Ｕ／ｍｇの比活性を有する第■因子を含む人間血漿の寒冷 沈降物を使用する。

懸濁液のｐＨを、０．１Ｍ酢酸を用いて７〜７．１に調整する。

この寒冷沈降物の懸濁液をアルミナゲル及び寒冷沈降で処理することにより精製 する。水酸化アルミニウムを、常温で５分間撹拌下懸濁液に（寒冷沈降物１ｋｇ 当り２％１４〜１６℃に冷却する。所望の温度に達するとすぐに、１４〜１６℃ で遠心を行って懸濁液を取り出して濾過で除菌する。

この前精製された溶液をツイーン−ＴＮＢＰの存在下にヨーロッパ特許出願第０ １３１７４０号に記載された方法に従い、溶媒−洗浄剤を用いてウィルスの不活 性処理に供する。

クロマトグラフィーカラムをフラクトゲルＴＳＫ−ＤＥＡＥ６５０　（Ｍ）（メ ルク）樹脂を使用して調製する。

寒冷沈降物のｋｇ当り０．５リツトルのフラクトゲルを与える。カラムを５倍容 量のＯ，ＬＭ　ＮａＣｆ溶液で洗浄し、その後クエン酸三ナトリウム（２，９４ ｇ／／）、塩化カルシウム（１ｍＭ）、塩化ナトリウム（０，１１Ｍ）、グリシ ン（９ｇ／Ｉ）及びリシン（３ｇ／Ａ’）を含む緩衝液でバランスさせる。

Ａ）で述べたようにして前精製された寒冷沈降物溶液をカラムに充填する。

次に澄液及び溶出液を収集して、その蛋白質含量を２８０　ｎｍにおける吸収の 測定により測定する（以下０、Ｄ、という）。

最初のか液は、カラムに吸着されない蛋白質のピークを示し、事実上フィブリノ ーゲンに一致する（実施例３参照）。

このピークを通過した後、０．Ｄ、が基線値に戻った時に、カラムを同様の緩衝 液で溶離してイオン強度を測定した。イオン強度は、最終濃度が０．１５Ｍとな るようにＮａＣｌを加えることにより最初は増大した。この緩衝液は、ホン　ビ レブランド因子とフィブロネクチンのバルクを含む蛋白質ピークを脱着させる（ 実施例４参照）。

このピークを通過した後、Ｏ，Ｄ、が基線値に戻った時に、緩衝液のイオン強度 は最終濃度０．２ＭとなるＮａＣｌの添加によりさらに増加される。

これらの条件下に第■因子は、３０〜４０１Ｕ／ｍ１２程度の濃度で溶離される 。

実施例２：第■因子濃縮物の調製 実施例１で述べたクロマトグラフィ一工程を使用して得られる第■因子溶液は、 十分に純粋で、容器に直接入れられるほどに濃縮されて凍結乾燥され得るもので 、いかなる超か過段階を付加する必要もない。

必要に応じて、現行の法的規制に従って容器当りの比活性を調製するのと同様の 溶離用緩衝液で希釈することにより濃度を調整することができる。

得られた溶液の平均組成は、次の通りである：蛋白質（ｇ／／）　０．１６〜０ ．２５第■：Ｃ因子（ＩＵ／ｒｒｃｌ）　３０〜４５第■：Ｃ因子の比活性（Ｉ Ｕ／ｍｇ）　１２０〜２５０フィブリノーゲン（ｇ＃’）　＜０．　１ホン　ビ レブランド因子：　Ａｇ　（Ｕ／ｍＱ）　１１〜２３ホン　ビレブランド因子： 　ＲＣＯ（Ｕ／ｍＱ）１０〜２０ 第■因子：Ａｇ（Ｕ／脱）　３５〜６０Ｉ　ｇＧ　（ｍｇ／ｍＱ）　（比濁法） 　＜０．０１１天然及び免疫の抗Ａ抗体　０〜２ フイブロネクチン（ｍｇ／ｊ’）　１５〜４０凍結乾燥後、生成物は透明で瞬間 的に溶解するものである。第■：Ｃ因子の量は常温で２４時間以上安定である。

人への注射は、より純度の低い生成物で得られたのと同等の第■：Ｃ因子の回収 率を示す。同様に、半減期は他の生成物のものとほぼ等しい。

この濃縮物は、高い治療的価値の生成物であり、血友病Ａの治療に要求される繰 り返した注射に特に適している。

実施例３：フィブリノーゲン濃縮物の精製実施例１に記載のＤＥＡＥ−フラクト ゲルによるクロマドグラフィーの最初の炉液は、主にフィブリノーゲンを含むが 、アルブミン、免疫グロブリン及びウィルス不活性剤（ツイーン及びＴＮＢＰ） をも含む。

フィブリノーゲンは、この溶液を更にヘパリン−セファローズ樹脂カラムによる クロマトグラフィ一段階にがけることにより精製される。

このクロマトグラフィ一段階は、０．０６ＭＮａＣｌに調整された前記と同様の 緩衝液中で行われる。

従って２つのクロマトグラフィ一段階の間の透析を妨げることを可能にさせる。

最初のクロマトグラフィ一段階での３戸液は、第２カラムに注入される前に希釈 され、ｐＨ６，５で２８０　ｍ０５ｍの浸透圧が得られる。２番目の炉液には、 アルブミン、免疫クロプリン、ツイーン及びＴＮＢＰが含有されることがわかる 。フィブリノーゲンは、カラムに吸着される。

炉液の０．Ｄ、が基準レベルに戻った時に、カラムをイオン強度が最終濃度０． １６ＭとなるＮａＣ１の添加により増大した後に同様の緩衝液で溶離する。

収得されるフィブリノ−′ゲン分画は、その後濃縮されて、カセット系で透析さ れる。濃縮された生成物は容器に入れられて、凍結乾燥される。

この濃縮されたフィブリノーゲンは、ヨーロッパ薬局方で定められた品質水準に 適合する。

更に、ヨーロッパ特許出願第８８　４０１９６１．３号に従う生物学的接着剤の 調製の基質として役立つこと実施例１に記載の、ＮａＣＡ’の０．１５Ｍの存在 下でＤＥＡＥ−フラクトゲル使用のクロマトグラフィーにより得られる溶離され た分画は、ホン　ビレブランド因子とフィブロネクチンの含有量が相当高められ ている。これは、いくらかの量のツイーン及びＴＮＢＰを含有する。

この分画をクロマトグラフィー用塩基性緩衝液（クエン酸三ナトリウム、塩化カ ルシウム、リジン、グリシン、ｐＨ７、浸透圧モル濃度１８ｍＯｓｍ）で浸透圧 モル濃度３８５〜３９０ｍ０５ｍに希釈される。

その後、前記と同様の緩衝液で調節し、最終濃度０．１１ＭとなるＮａＣノを含 むＤＥＡＥ−フラクトゲルの第２カラムに注入してｐＨ７で３８７　ｍ０５ｍに 調整する。

これらの条件下、ツイーン及びＴＮＢＰは極めて効果的に除去される。

最初の溶液はすでに非常に高濃度のホン　ビレブランド因子を含有するので、該 因子は第１カラムを通過するときよりもはるかに大きい度合いでカラムに固定さ れる。

カラムに固定される容量は、少なくとも１６０　ＵＡｇ／ＩＴＩＱ（ホン　ビレ ブランド因子の抗原ユニット）もしくは１００ＲＣＯ／ｍ１２（リストセチン助 因子ユニット）である。

ホン　ビレブランド因子を含有する分画は、緩衝液への最終濃度０．１５Ｍとな る量のＮａＣ７の添加により溶離される。

溶離されたホン　ビレブランド因子は、十分に濃縮されており、超濾過の追加を 必要としない。従って、そのまま容器に入れられ、凍結乾燥される。

得られる濃縮物は、非常に高純度で１００ＵＲＣＯ／ｍｇを越える比活性を有す る。なおいくらかのフィブロネクチンを含んでいるが、これはその活性に害を与 えない。

実施例５：フィブロネクチン濃縮物の調製フィブロネクチン濃縮物もまた実施例 ４と同様の最初の溶出液から調製され得る。

ホン　ビレブランド因子及びフィブロネクチンは事実それらの分子量の違いによ って分離され得る。セファクリルＳ−４００（Ｒ）（ファーマシア）のカラムの ゲル濾過を使用して、例えばホン　ビレブランド因子を含む高分子量の最初の分 画が分離され、直接容器に入れられて凍結乾燥することができる。フィブロネク チンを含む分画は、引続いて分離される。

国際調査報告 国際調査報告　ＦＲ８９０００５０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　血漿寒冷沈降物の可溶性分画を、非常に大きいサイズの分子の保持が可能で 疎水性相互作用の発現を助力する、適度なイオン性の陰イオン交換樹脂でのクロ マトグラフィーの単一段階に供すること、及び各々の蛋白質を溶離緩衝液のイオ ン強度の増加により選択的に回収することを特徴とする人もしくは動物血漿蛋白 質の分離方法。 ２　最初の分画が第ＶＩＩＩ因子、ホンビレブランド因子、フィブリノーゲン及 びフィブロネクチンを含有する血漿寒冷沈降物であることを特徴とする請求項１ に記載の方法。 ３　最初の分画中の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の比活性が０．１ＩＵ／ｍｇ以上である ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４　最初の分画が −水酸化アルミニウムによる処理 −１４〜１６℃への冷却 −遠心分離して上澄みを収得 を含む前精製処理されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載 の方法。 ５　ａ）寒冷沈降物の可溶性分画を、第ＶＩＩＩ因子、大部分のホンビレブラン ド因子及びフィブロネクチンを吸着しフィブリノーゲンを溶出液へ通過させる、 ビニルポリマー型ゲルに固定されたＤＥＡＥグループを含む樹脂に通す過程、 ｂ）最初に緩衝液のイオン強度を増大させてフィブロネクチン及び大部分のホン ビレブランド因子を溶離させる過程、および ｃ）緩衝液のイオン強度をさらに増大させて第ＶＩＩＩ因子を溶離する過程 を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。 ６　緩衝液がリジン及びグリシンを含有することを特徴とする請求項５に記載の 方法。 ７　緩衝液が２〜４ｇ／ｌのリジン及び８〜１１ｇ／ｌのグリシンを含有するこ とを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８　緩衝液のイオン強度を塩化ナトリウムを使用して増大させることを特徴とす る請求項５乃至７のいずれかに記載の方法。 ９　塩化ナトリウム濃度が段階ａ）のときに０．１１Ｍ、段階ｂ）のときに０． １５Ｍ及び段階ｃ）のときに０．２５Ｍであることを特徴とする請求項８に記載 の方法。 １０　ウイルス不活性化処理が血漿分画をクロマトグラフィー分離段階に供す直 前に血漿分画において化学不活性化剤の存在下に行われることを特徴とする請求 項１乃至９のいずれかに記載の方法。 １１　１００ＩＵ／ｍｇ以上の比活性で、単一グループの濃縮物とみなすことが できる品質を有する請求項２乃至１０のいずれかに記載の方法により得られるこ とを特徴とする第ＶＩＩＩ因子の濃縮物。 １２　請求項５に記載の方法の段階ａ）の溶出液からなることを特徴とし、ヘパ リン−セファローズ樹脂による追加のクロマトグラフィー段階により精製された フィブロネクチン濃縮物。 １３　請求項５に記載の方法の段階ｂ）の溶出液からなることを特徴とし、段階 ａ）と同様の樹脂による追加のクロマトグラフィー段階及び０．１５ＭＮＡＣｌ に調製された同様の緩衝液による溶離によって精製されたホンビレブランド因子 濃縮物。 １４　請求項５に記載の方法の段階ｂ）の溶出液からなることを特徴とし、追加 のゲルろ過段階により精製されたフィブロネクチン濃縮物。