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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen und Inaktivieren
von Viren aus biologischen Präparaten.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Biologisch
erhaltende Flüssigkeitspräparate wie
Blut- und Plasmapräparate
werden als Rohmarterialien verwendet, aus denen eine Vielzahl von
biologisch nützlichen
Verbindungen gereinigt werden kann. Beispiele von solchen Verbindung
schließen
Immunglobulin, Faktor VIII, Albumin, α 1-Anti-Trypsin, Faktor IX,
Faktor XI, PPSB, Fibrinogen und Thrombin (Prothrombin) ein. Zusätzlich werden
verschiedene biologische Produkte wie Hormone, Wachstumsfaktoren,
Enzyme und Liganden aus den biologischen Präparaten, die von Zellkulturen
erhalten werden, isoliert.
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Die
Zellen, die in der Produktion dieser nützlichen Materialien verwendet
werden, können
entweder Wildtyp-Zellen von verschiedenen tierischen Quellen oder
alternativ gentechnisch manipulierte prokaryontische oder eukaryontische
Zellen sein. Wenn die biologischen Materialien, die von diesen Flüssigkeitspräparaten
erhalten werden, zu therapeutischen Zwecken an Menschen verabreicht
werden sollen, insbesondere durch intravenöse Verabreichung, ist die Sterilität des Präparats ein
Hauptbedenken. Daher werden große
Bemühungen
in der Inaktivierung von Viren wie Hepatitis-Viren und HIV-Viren
unternommen, die in diesen Präparaten
vorhanden sein können.
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Lipidumhüllte Viren
werden durch Behandlung mit nicht-ionischen, biologisch verträglichen
Lösungsmitteln
und Detergenzien wirksam inaktiviert. Verfahren für eine Virusinaktivierung
durch Lösungsmittel-Detergens-Anwendungen
sind zum Beispiel in
EP 0131740 beschrieben.
Nicht-lipidumhüllte
Viren können
jedoch durch Lösungsmittel-Detergens-Behandlungen
nicht inaktiviert werden, daher müssen andere Inaktivierungs-Methodiken
für ihre
Inaktivierung verwendet werden. Diese schließen die Anwendung von Hitze
(Pasteurisierung), die Anwendung einer Bestrahlung wie kurzwelliges
ultraviolettes Licht (UVC) oder Gamma-Bestrahlung sowie Eliminieren
durch physikalische Mittel, z.B. die Filtration des Präparats durch
sehr enge Filterporen, um Viren durch Größenausschluss (Nanofiltration)
zu entfernen, ein.
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Noreen
et al., (Biologicals, 26:321-329 1998) untersuchen die Verwendung
der 35 nm-Memberg Microporous Membran-Hohlfaser(Planova)-Filter,
um potenzielle Belastungen sowohl von nicht-umhüllten als auch von umhüllten Viren
vor der Lösungsmittel-Detergens-Behandlung
in einer 7% IVIg-Lösung
zu reduzieren. In der obigen Untersuchung wurde die Nanofiltration
für das
Entfernen einer Vielzahl von umhüllten
und nicht-umhüllten
Viren mit einer Größe im Bereich
der von 70 nm bis 18 nm, einschließlich: Sindbis-Virus, Affenvirus
40 (SV40), Virus der viralen Diarrhoe des Rindes (BVDV), Katzen-Calicivirus,
Encephalomyocarditis-Virus (EMC), Hepatitis A-Virus (HAV), Rinder-Parvovirus
(BPV) und Schweine-Parvovirus (PPV), für gültig erklärt. Die Untersuchung zeigte
eine vollständige
Reduktion (bis zur Grenze des Nachweistests) von allen Viren, die
größer als
35 nm sind. Interessanterweise wurden sogar kleinere Viren wie EMC
und HAV zumindest teilweise durch dieses Verfahren der Filtration
entfernt.
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Diese
Untersuchungen führten
zur Verwendung der Nanofiltration für das Entfernen von Viren aus
biologischen Präparaten.
In Fällen,
wo es erwünscht
war, sowohl eine Virusinaktivierung durch das Lösungsmittel-Detergens-Verfahren
(um lipidumhüllte
Viren zu inaktivieren) sowie eine Nanofiltrations-Eliminierung (zum Größenausschluss
und daher Entfernen von nicht-lipidumhüllten Viren) zu kombinieren,
wurde jedoch entdeckt, dass der Nanofiltrationsschritt der Lösungsmittel-Detergens-Anwendung
vorangehen musste, insbesondere, wenn das Lösungsmittel-Detergens durch Ölextraktion
und C-18-Umkehrphasenharz entfernt werden musste. Der Grund dafür war, dass
es nach der Extraktion des Lösungsmittel-Detergens
immer Spuren von kleinen Öltröpfchen sowie
Reste von Lösungsmittel-Detergens
gab, die an den hydrophilen Teil des Harzes banden. Darüber hinaus
können
manche der Proteine, die von dem biologischen Präparat gereinigt werden, während des
Reinigungsvorgangs modifiziert werden, und die veränderten
Proteine können
Dimere und Polymere bilden, die sich in der Hydrophobie des veränderten
Proteins ändern.
Diese Spuren von Öltröpfchen, Protein-Dimer-Aggregaten
und das Gemisch von Öl-
und Proteinresten tendieren dazu, die kleinen Öffnungen des Nanofilters zu
blockieren, was dadurch die Zeit der Filtration beträchtlich
verlängert,
das häufige
Ersetzen von teuren Filtern erfordert und im Allgemeinen den Ertrag
des Produkts verringert.
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Die
Reste der Öltröpfchen (Kontaminationen),
die dazu tendieren, die Nanofilter zu blockieren, wurden durch Verwenden
entweder eines Chromatographie-Mechanismus des molekularen Ausschlusses
oder durch hydrophobe Chromatographie entfernt. Dennoch hat bis
jetzt keine der konventionellen Verfahren zum Entfernen des Lösungsmittel-Detergens
das Thema der Dimerisierung oder Aggregation, die durch das Lösungsmittel-Detergens
verursacht wird, angesprochen, und dieses Problem bleibt noch bestehen.
Das Entfernen der Lösungsmittel-Detergenzien
aus biologischen Flüssigkeitspräparaten
wie Immunglobulin-Präparaten
wird im Allgemeinen durch Verwenden einer Gel-Chromatographie ausgeführt.
US 5,094,960 und
US 5,648,472 betreffen das
Entfernen eines Lösungsmittel-Detergens
aus Immunglobulin-Präparaten
ohne die Verwendung der Umkehrphasen (hydrophoben) Gel-Chromatographie.
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Zwei
andere Patente sind für
Vorgehensweisen erteilt worden, die darauf hinweisen, dass die Entfernung
von Lösungsmittel-Detergens
die Stabilität
eines flüssigen
IVIg-Produkts beeinflusst (
US
5094960 ,
US4789545 und
US5648472 ). G. Werner und
P. Selosse (
US5648472 )
beschreiben einen Vorgang zum Herstellen von Immunglobulin-Lösungen,
bei den Viren mit Hüllen
inaktiviert sind, die für
eine intravenöse
Anwendung geeignet sind, umfassend das Behandeln des Immunglobulins
mit TnBP und/oder Triton X-100, gefolgt von einer Extraktion unter
Verwendung eines biologisch verträglichen Pflanzenöls, wenn
TnBP und/oder Triton X-100 und das Pflanzenöl danach durch Festphasen-Extraktion
auf hydrophoben Materialen entfernt werden. Dies wies darauf hin,
dass die Kombination einer Pflanzenöl-Extraktion von IVIg, gefolgt
von einer Chromatographie durch eine hydrophobe Säule, sogar
bei einer erhöhten
Temperatur eine sehr stabile flüssige
Lösung von
Immunglobulinen produziert. Dieses Patent beanspruchte, dass ein
IVIg-Präparat in Übereinstimmung
mit zwei früheren
Patenten hergestellt wird: Bonomo, 1992, (
US 5094960 ) lehrt die Verwendung einer
Festphasen-Extraktion
und Bulk C-18-Packung von Waters, Inc. als ein bevorzugtes Harz.
Woods 1986 (
US, 4789545 ) zeigt
das Entfernen eines Lösungsmittel-Detergens
durch natürlich
vorkommende Öle,
die durch dieses Verfahren erhaltenen Produkte resultierten jedoch
in einem unstabilen Präparat
von intravenösen
Immunglobulinen.
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Guerrier
et al. (Journal of Chromatography B 664:119-125 (1995)) beschreiben
ein spezifisches Sorptionsmittel, das Lösungsmittel-Detergens-Gemische aus Virus-inaktivierten
biologischen Flüssigkeiten
entfernen soll. Die Lösungsmittel-Detergens-Entfernungs(SDR)-HyperD-Sorptionsmittel
wurden durch Biosepra (Ceroy-Saint-Christophe, Frankreich) geliefert.
Diese chromatographische Packung wurde aus Silica-Perlen gemacht,
in denen das Porenvolumen mit einem dreidimensional vernetzten,
hydrophoben Acrylpolymer gefüllt
war.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf dem Ergebnis, dass ein Verfahren
zum Inaktivieren von Viren, die in biologischen Präparaten
vorhanden sind, umfassend zuerst Behandeln des Präparats durch
ein Lösungsmittel-Detergens,
wonach das Lösungsmittel-Detergens
durch die Verwendung von Pflanzenöl in einer Kombination mit/ohne
Festphasen-Extraktion (spezifisch unter Verwendung von Bulk C18,
wie durch
US 5,648,472 empfohlen)
extrahiert wird, in einem Immunglobulin-Flüssigkeitspräparat resultierte,
das sehr schwer durch den 35 nm-Planova
TM-Filter
durchzuleiten war. Daher wurde erkannt, dass solch eine Vorgehensweise
für die
effiziente Inaktivierung von Viren unpassend war.
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise entdeckt,
dass die Kombination einer Lösungsmittel-Detergens-Behandlung,
gefolgt von einer Chromatographie, die SDRHyperD von Biosepra anwendete,
das Durchleiten des IVIg in einer hohen Durchflussrate durch 35
nm-Planova-Filter ermöglichte
und in einem Flüssigkeitspräparat resultierte,
dem aktive Viren fehlten, während
es einen sehr hohen Ertrag zeigte. In Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung wurde weiterhin gefunden, dass das Problem der Dimerisierung
von Immunglobulinen durch Reduzieren des pH-Werts auf 4,0 vor dem
Nanofiltrationsschritt teilweise gelöst werden kann.
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Daher
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Inaktivierung
von Viren, die in einem Flüssigkeitspräparat vorhanden
sind, umfassend die Schritte von:
- (a) Inkontaktbringen
des biologischen Flüssigkeitspräparats mit
einer Lösungsmittel-Detergens-Kombination
in Konzentrationen und unter Bedingungen, die ausreichend sind,
um lipidumhüllte
Viren zu inaktivieren;
- (b) Entfernen von Lösungsmittel-Detergens-Spuren
aus dem Flüssigkeitspräparat mittels Überleiten
des in (a) erhaltenen Flüssigkeitspräparats auf
eine chromatographische Packung, die aus Silica-Perlen zusammengesetzt
ist, deren Porenvolumen mit einem dreidimensional vernetzten hydrophoben
Acrylpolymer gefüllt
ist; und
- (c) Durchleiten des flüssigen
Produkts von Schritt (b) durch einen Filter, der eine Porengröße im Bereich von
etwa 15 nm bis ungefähr
70 nm hat.
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Optionell
kommt nach dem Schritt (a) ein Schritt einer Extraktion des Lösungsmittel-Detergens
durch eine hydrophobe Zusammensetzung wie Öl, zum Beispiel ein biologisch
verträgliches
Pflanzenöl.
Das Entfernen der chromatographischen Packung im Schritt (b) ist
daher auch nützlich
in der Eliminierung der Öl-Spuren und
von mit Öl
in Beziehung stehenden Verunreinigungen.
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Der
Begriff „Inaktivieren
von Viren" bezeichnet
sowohl die Situation, in der Viren in der Lösung behalten werden, aber
nicht-lebensfähig
gemacht werden (zum Beispiel durch Auflösen ihrer Lipidhülle), als
auch die physikalische Entfernung der Viren aus dem Flüssigkeitspräparat (zum
Beispiel durch Größenausschluss). Daher
bezeichnet dieser Begriff im Zusammenhang mit der Erfindung sowohl
eine Viren-Zerstörung als
auch die Viren-Entfernung.
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Der
Begriff „biologisches
Flüssigkeitspräparat" bezeichnet jeden
Typ eines Flüssigkeitspräparats,
der aus einer biologischen Quelle erhalten wurde. Dies schließt typischerweise
Präparate,
die aus Körperflüssigkeiten
wie Blut, Plasma und Urin erhalten werden, sowie Flüssigkeiten
ein, die aus Zellkulturen erhalten werden, die biologische Substanzen
enthalten, die durch die Zellen in das Präparat sezerniert werden, oder
Substanzen enthalten, die ursprünglich
in den Zellen vorhanden waren und aufgrund von verschiedenen Manipulationen
wie dem Lysieren der Zellen an das Flüssigkeitspräparat freigesetzt wurden.
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Das
Verfahren der Virusinaktivierung in Übereinstimmung mit der Erfindung
kann für
eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, wie: die Isolierung
von verschiedenen Proteinen, einschließlich Immunglobulinen, Faktor
VIII, Albumin, α 1-Anti-Trypsin, Faktor
IX, Faktor XI, PPSB, Fibrinogen und Thrombin (Prothrombin) und anderen;
die Isolierung von gentechnisch manipulierten Proteinen aus Zellkulturen,
die Isolierung von Hormonen, Wachstumsfaktoren, Enzymen, Gerinnungsfaktoren,
Rezeptoren und anderen biologisch aktiven Copolymeren und dergleichen.
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In Übereinstimmung
mit einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das biologische Flüssigkeitspräparat für die Isolierung von Immunglobulinen
gedacht, die daraus gereinigt werden sollen, und wird durch Resuspendieren
der Paste II von der Plasma-Fraktionierung in Wasser, Einstellen
des pH-Wert des Präparats
und Ultrafiltrieren und Diafiltrieren der resultierenden Produkte
durch Verwenden von Membranfiltern, um eine erwünschte Proteinkonzentration
zu ergeben, erhalten.
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Die
Lösungsmittel-Detergens-Kombination,
die verwendet wird, um lipidumhüllte
Viren zu inaktiveren, kann jede Lösungsmittel-Detergens-Kombination
sein, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie TnBP und Triton X-100;
Tween 80 und Natriumcholat und andere. Die Konzentration der Lösungsmittel-Detergenzien
sollte jene sein, die üblicherweise
auf dem Fachgebiet verwendet werden, zum Beispiel > 0,1% TnBP und > 0,1% Triton X-100.
Typischerweise bestehen die Bedingungen, unter denen das Lösungsmittel-Detergens
die Viren inaktiviert, aus 10-100 mg/ml Lösungsmittel-Detergens bei einem
pH-Wert im Bereich von 5-8 und einer Temperatur im Bereich von 2-37°C für 30 min
bis 24 Stunden. Andere Lösungsmittel-Detergens-Kombinationen und
geeignete Bedingungen werden jedoch für jeden Fachmann offensichtlich
sein.
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Nach
dem Durchmachen einer Lösungsmittel-Detergens-Behandlung
wird die Masse des Lösungsmittel-Detergens
durch die Verwendung eines SDR-Harzes (Lösungsmittel-Detergens-Entfernung)
entfernt, das eine chromatographische Packung ist, die aus Silica-Perlen
gemacht ist, in denen das Porenvolumen mit einem dreidimensional
vernetzten hydrophoben Acrylpolymer gefüllt ist. Ein Beispiel eines
solchen SDR ist das HyperD-Material, vertrieben durch Biosepra.
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Das
resultierende Präparat
wird dann durch einen Nanofilter geleitet, der eine Porengröße von weniger
als 70 nm hat, vorzugsweise zwischen 15 und 50 nm. Die genaue Größe der Pore
sollte in Übereinstimmung
mit dem Protein, das in dem Flüssigkeitspräparat beibehalten
werden muss, und der Größe der Viren bestimmt
werden, die durch Größenausschluss
eliminiert werden sollen.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Vorteile
gegenüber
anderen Verfahren der Inaktivierung von Viren, in denen der Nanofiltrationsschritt
der Behandlung mit einem Lösungsmittel-Detergens
vorangeht:
- (1) Die Menge der Viren, die an
die Poren des Filters adhärieren,
ist kleiner (da einige der Viren durch die Lösungsmittel-Detergens-Behandlung
eliminiert werden), sodass das Ersetzen von Filtern, was ein teurer Teil
der Durchführung
ist, verringert wird.
- (2) Der Zeitablauf der Vorgehensweise ist verkürzt, da
das Flüssigkeitspräparat, nachdem
es mit dem Lösungsmittel-Detergens
und der SDR-Extraktion
behandelt wurde, viel schneller durch den Nanofilter durchgeleitet
wird, als wenn dieser Nanofiltrationsschritt als der erste Schritt
des Verfahrens ausgeführt
worden wäre.
- (3) Ein Blockieren der Filter während der Produktion resultierte
normalerweise in einem signifikanten Abfall des Ertrags. Der Ertrag
der vorliegenden Erfindung ist etwa 97-100%.
- (4) Das hydrophobe Füllen
des SDR-Harzes senkt die Dimer-Konzentration
in der Immunglobulin-Lösung. Sobald
das Immunglobulin an seinen Dimeren verarmt ist, reduzieren die
niedrigen pH-Werte die Rate einer neuen Dimer-Bildung durch das Beladen der Moleküle mit einer
zusätzlichen
negativen Ladung, die sie von einander abstößt.
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Das
Dimerisierungs-Problem wird, wenn das Präparat ein Immunglobulin-Präparat ist,
teilweise durch Senken des pH-Werts auf einen pH-Wert unter 5 gelöst.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1:
zeigt die Rate der Nanofilter-Blockierung durch Darstellen der Reduktion
der Durchflussrate als eine Funktion des akkumulierten Filtrats,
das durch den Nanofilter läuft.
Zwei Quellen von 45 mg/ml-Immunglobulin-Lösungen werden in diesem Experiment
verwendet: eine IVIg-Lösung,
in der das Lösungsmittel-Detergens durch Öl-Extraktion,
gefolgt von einer Chromatographie auf C-18 entfernt wurde, und eine
IVIg-Lösung,
in der das Lösungsmittel-Detergens
durch SDR alleine entfernt wurde; und
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2:
zeigt die Wirkung der Lösungsmittel-Entfernung
auf die akkumulierte Filtrationszeit durch einen 35N-Nanofilter;
bei einer erhöhten
Temperatur (37°C)
ist die Durchflussrate für
die Lösungsmittel-Detergens-Entfernung
in beiden Verfahren etwas schneller.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Beispiel 1: Inaktivierung von Viren in
einem Immunglobulin-Präparat
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Die
Paste II, die vom Plasma durch das Cohn-Fraktionierungsverfahren
hergestellt wurde, wurde für 18
Stunden in Wasser resuspendiert; der pH-Wert wurde durch die Zugabe
von HCl auf 4,6 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde durch Verwenden
von 30000 K-Filtron-Membranfiltern ultrafiltriert/diafiltriert,
um eine Proteinkonzentration von 90 mg/ml zu ergeben. Der pH-Wert
wurde auf 5,3 eingestellt, und 0,3% TnBP und 1% Triton X-100 wurden
zu der Lösung
zugegeben. Die resultierende Suspension wurde für 4 Stunden bei 6°C inkubiert.
Die Suspension wurde dann in zwei Unter-Vorgehensweisen geteilt.
Eine Suspension wurde zuerst durch Rizinusöl extrahiert, gefolgt von einer
Chromatographie auf einem Bulk C-18-Harz von Waters, und die zweite Probe
machte (ohne vorherige Öl-Extraktion)
eine Chromatographie auf einem Biosepra SDR Hyper D-Harz durch.
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300
ml von jeder der Lösungen
wurden dann durch einen 0,2 μ-Celluloseacetat-Filter
gefiltert. Beide Lösungen
wurden dann auf ihre Fähigkeit,
einen 35N-Planova-Filter zu passieren, getestet. Das Testen wurde gestaltet,
wie in 1 angezeigt.
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300-350
ml Proteinlösung
werden in einen Druckbehälter
platziert. Der Druck wird durch ein großes Reservoir von Stickstoffgas
unter Druck geliefert. Dieses Reservoir wurde aus einem Stickstoff-Zylinder
befüllt, wie
es nötig
war. Durch Steigern des Drucks in dem Druckbehälter floss die Proteinlösung durch
eine Reihe von Vorfiltern von 0,2 μ, 0,1 μ, gefolgt von einem Planova-Vorfilter
von 75N.
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Der
Planova 35N war am Ende der Filterreihe angeschlossen, die auch
mit einer Druckmessgerät
verbunden war. Der Druck wurde auf dem 35N-Filter konstant bei 10
PSI und auf dem 75N-Filter bei 11-12 PSI gehalten. Wenn eine teilweise
Blockade des Filters erfolgte, sinkt daher bei diesem konstanten
Druck die Durchflussrate der Proteinlösung durch den Filter rapide.
Die Drücke
vor den zwei Planova-Filtern (75N und 35N) wurden während der
gesamten Filtration überwacht.
Die Durchflussrate wurde jedoch für alle 50 ml der Lösung, die
den 35N-Filter passierte, gemittelt. Die Filtration wurde gestoppt,
wenn die mittlere Durchflussrate einen Spiegel erreichte, der niedriger
als 50% der anfänglichen
Durchflussrate war. Diese Art von Grenzwert repräsentiert die Rate, bei der
50% der Filteröffnungen
blockiert sind. Wie aus
1 gesehen werden kann, ist die
Rate für
diese Art von Lösung
einigermaßen
linear, wohingegen die Messung nach diesem Grenzwert einigermaßen fehlerhaft
ist. Tabelle 1 Wirkung des C-18-Harzes als die SD-Entfernungs-Vorgehensweise
auf die Durchflussraten und Drücke
während
der Nanofiltration in Beispiel 1
| Messung | Druck (psi)
vor dem Filter | Durchflussrate | Filtrationsvolumen |
| | 75N | 35N | (ml/min) | (ml) |
| 1 | 12.5 | 10 | 0.91 | 50 |
| 2 | 12.5 | 10 | 0.6 | 50 |
| 3 | 12 | 10 | 0.44 | 50 |
Tabelle 2 Wirkung des SDR-Harzes als die SD-Entfernungs-Vorgehensweise
auf die Durchflussraten und Drücke
während
der Nanofiltration in Beispiel 1
| Messung | Druck (psi)
vor dem Filter | Durchfluss
rate | Filtrations
volumen |
| | 75N | 35N | (ml/min) | (ml) |
| 1 | 11.5 | 10 | 1.16 | 50 |
| 2 | 12 | 10.3 | 1.06 | 50 |
| 3 | 12 | 10.5 | 0.92 | 50 |
| 4 | 12 | 10.8 | 0.87 | 50 |
| 5 | 12 | 10.8 | 0.89 | 50 |
| 6 | 12.5 | 11 | 0.8 | 50 |
| 7 | 12 | 11 | 0.72 | 50 |
| 8 | 12.5 | 10.9 | | 50 |
| 9 | 12.5 | 10.9 | 0.71 | 50 |
| 10 | 11 | 12.5 | 0.56 | 50 |
| 11 | 12 | 11 | 0.57 | 46 |
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Wie
in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, waren die anfänglichen Durchflussraten niedriger,
wenn das C-18-Harz verwendet wurde (0,9 gegenüber 1,16 ml/min). Darüber hinaus
sank die Durchflussrate schneller, und als eine Folge wurde das
Filtrationsvolumen niedriger, wenn das C-18-Harz im Vergleich zu
SDR verwendet wurde.
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Wie
in 2 und den Tabellen 3-4 gesehen werden kann, ist
die Menge der Filtrat-Akkumulierung, bis der 50%-Grenzwert erreicht
ist, mindestens zweimal schneller, und das Volumen ist zweimal höher im Produkt, das
eine Chromatographie durch SDR durchgemacht hat, als im Produkt,
wo das S/D durch Öl-Extraktion,
gefolgt von einer C-18-Chromatographie entfernt wurde.
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Dies
ist auf die Entfernung von Dimeren, Polymeren und Aggregaten aus
der IgG-Lösung
durch die SDR-Säulen-Chromatographie,
zurückzuführen.
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In
einem Experiment für
Labor-Größe wurden
verschiedene Bedingungen für
den SD-Schritt untersucht: der pH-Wert, die S/D-Konzentrationen,
die Temperatur und Inkubationszeit-Dauer wurden untersucht, und
die Proben wurden in SDR-Säulen einer
Chromatographie unterzogen. Das Folgende (Tabelle 3) zeigt die gemittelten
Werte von vier Wiederholungen der Prozentsätze von Monomeren, Dimeren
und Aggregaten in IgG-Proben vor und nach SDR unter den verschiedenen
Bedingungen.
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Die
Ergebnisse zeigen einen signifikanten Abfall von Dimeren und ein
sehr geringes Ansteigen von Aggregaten (Polymeren) nach der SDR-Säule. Der
Anstieg in Aggregaten (Polymeren) erfolgt mit dem Standardfehler
oder dem analytischen Test, unabhängig von den verwendeten SD-Bedingungen. Tabelle 3 Wirkung von unterschiedlichen S/D-Bedingungen
auf die Molekulargewichts-Verteilung
von IgG-Lösungen nach
der SDR-Chromatographie
| Versuchsbedingungen | | Vor
S/D-Zugabe und SDR | Nach
4,5 h S/D-Inkubation
und SDR |
| Produktionsergebnisse | Monomere
Dimere
Polymere | 95.45
3.76
0.04 | 99.27
0.64
0.09 |
| Produktionsbedingungen | Monomere
Dimere
Polymere | 96.17
3.78
0.04 | 99.25
0.61
0.15 |
| Hoher
pH-Wert | Monomere
Dimere
Polymere | 95.58
4.39
0.04 | 99.21
0.69
014 |
| Niedriger
pH-Wert | Monomere
Dimere
Polymere | 96.77
3.20
0.03 | 99.24
0.69
0.08 |
| Hohe
S/D-Konzentration | Monomere
Dimere
Polymere | 96.17
3.78
0.04 | 99.28
0.62
0.21 |
| Hohe
Temperatur | Monomere
Dimere
Polymere | 96.17
3.78
0.04 | 99.23
0.68
0.10 |
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Beispiel 2: Flüssigkeitspräparate, wo S/D entfernt wurde
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Dieselbe
Proben-Herstellungsvorgehensweise wie in Beispiel Nr. 1 wurde verwendet,
aber dieses Mal wurde die Probe, von der das Lösungsmittel-Detergens (S/D)
entfernt wurde, durch Öl-Extraktion
und Säulenchromatographie
aus einer vollständigen
Produktions-Charge zurückgewonnen.
Die Proben, in denen S/D durch Chromatographie auf SDR entfernt
wurde, wurden auch aus derselben Charge, aber zu einem früheren Stadium
(nach der S/D-Inaktivierung) wiedergewonnen, und die Chromatographie
wurde in einem kleineren Rahmen durchgeführt. Um den Filtrationsvorgang
zu beschleunigen, wurde die Temperatur von beiden Lösungen auf
37°C erhöht, und
beide wurden auf 45 mg/ml Protein eingestellt. Tabelle 4 Wirkung des C-18-Harzes als die SD-Entfernungs-Vorgehensweise
auf die Durchflussraten und Drücke
während
der Nanofiltration in Experiment 2
| Messung | Druck (psi)
vor dem Filter | Durchflussrate | Filtrationsvolumen |
| | 75N | 35N | (ml/min) | (ml) |
| 1 | 11 | 10 | 0.73 | 50 |
| 2 | 11 | 10 | 0.74 | 50 |
| 3 | 12 | 10 | 0.62 | 50 |
| 4 | 12 | 10 | 0.55 | 50 |
| 5 | 12 | 10 | 0.49 | 50 |
| 6 | 11.5 | 10 | 0.42 | 50 |
| 7 | 11 | 10 | 0.36 | 50 |
Tabelle 5 Wirkung des SDR-Harzes als die SD-Entfernungsvorgehensweise
auf die Durchflussraten und Drücke
während
der Nanofiltration in Experiment 2
| Messung | Druck (psi)
vor dem Filter | Durchfluss
rate | Filtrations
volumen |
| | 75N | 35N | (ml/min) | (ml) |
| 1 | 11.5 | 10 | 1.25 | 50 |
| 2 | 11 | 10 | 1.08 | 50 |
| 3 | 11 | 10 | 1.00 | 50 |
| 4 | 11.5 | 10 | 0.96 | 50 |
| 5 | 11.5 | 10 | 0.89 | 50 |
| 6 | 11.5 | 10 | 0.84 | 50 |
| 7 | 11.5 | 10 | 0.83 | 50 |
| 8 | 11.5 | 10 | 0.78 | 50 |
| 9 | 12 | 10 | 0.74 | 50 |
| 10 | 11.5 | 10 | 0.66 | 50 |
| 11 | 11.5 | 10 | 0.6 | 17 |
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Beispiel 3: Wirkung der Nanofiltration
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Das
Material wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Eines wurde auf die
Viren-Entfernung
durch die Verwendung eines 35N-Planova-Filters getestet. 45 mg/ml
IgG-Lösung wurde
mit HIV-1, PRV, BVDV, HAV oder MVM bei einem pH-Wert von 4,0 versetzt.
Um eine Endkonzentration von mehr als 107-109 PbE/ml zu erhalten, wurden alle Viren durch
Ultrazentrifugation sedimentiert und in Wasser oder serumfreiem
Puffer in einem kleinen Volumen resuspendiert.
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Aufgrund
des pH-Werts von 4,0±0,1
des Ausgangsmaterials und der Bedingung der Filtration (37±C1°C) wurde
die Untersuchung einer potenziellen viruziden Wirkung dieser Lösung bei
35±1°C auf BVDV vor
der Untersuchung der Nanofiltration mit dem Planova-Filter bewertet.
Die Ergebnisse, die während
der Experimente erhalten wurden, zeigten einen sehr niedrigen Inaktivierungsgrad
(1,01 log) im Ausgangsmaterial nach 8 Stunden der Inkubation bei
pH = 4,0. Dieselben Ergebnisse wurden mit MVM und HAV erhalten.
Auf der anderen Seite zeigten HIV und PRV unter derselben Bedingung
nach 6 Stunden der Inkubation einen 5,03 beziehungsweise 5,22 log-Reduzierungsfaktor.
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Die
Versetzungs-Experimente wurden gemäß den Verkleinerungs-Bedingungen in doppelter
Ausführung
ausgeführt.
Aufgrund der frühen
Blockierung des 75N-Filters, die während der Filtration von großen Viren erfolgte,
wurde eine spezielle Reihe von drei austauschbaren 0,1 und 0,2 μm-Planova
75N-Filtern eingesetzt (1). Der Druck beim 35N-Filter
wurde konstant auf 0,7 bar eingestellt. Das Filtrat wurde gewonnen,
und die Restviren wurden für
eine maximale Viren-Gewinnung
ultrazentrifugiert.
-
Die
folgende Tabelle wird dem Virus-Titer-Reduzierungsfaktor von Modell-Viren als eine Folge
der Nanofiltration durch 35N und den Bedingungen, die oben erwähnt wurden,
z.B. Inkubation bei 35±1°C und pH
= 4,0, und der Verwendung von Vorfiltern zugeschrieben. Tabelle 6 Virus-Titer-log-Reduzierung von verschiedenen
zugesetzten Modell-Viren
| Virus-Name | Modell
für ... | Reduzierungsfaktor (log10) | Virus-Typ |
| Menschliches
Immunschwäche-Virus Typ 1 (HIV-1) | HIV-1
und andere Lentiviren | > 5.25 (> 5.18, > 5.31) | Umhüllte RNA |
| Pseudotollwut-Virus (PRV) | Hepatitis
B | > 5.58 | Umhüllte DNA |
| Minute-Virus
der Mäuse (MVM) | Parvovirus
B-19 | 1.71
(1.91, 1.51 | Nicht
umhüllte
DNA |
| Virus
der viralen-Diarrhoe
des Rindes (BVDV) | Hepatitis
C | 4.62
(4.91, 4.34) | Umhüllte RNA
Nicht
umhüllte |
| Hepatitis
A (HAV) | Hepatitis
A | > 8.68 | RNA |
-
Dieser
spezifische Schritt reduziert weder die Protein-Konzentration noch ändert er
die Charakteristika des Immunglobulins, z.B. sind die die Fc-Funktion,
die anti-Komplementär-Aktivität (ACA)
und die Integrität des
Moleküls,
getestet durch HPLC, erhalten geblieben.
-
Beispiel 4: Nanofiltration nach S/D-Entfernung
in einem Fibrinogen-Präparat
-
Ein
resuspendiertes Kryopräzipitat
wurde nach einer Alhydrogel-Adsorption, um Vitamin K-abhängige Proteasen
zu entfernen, bei einem pH-Wert von 7,5 einer Virusinaktivierung
unter Verwendung eines Lösungsmittel-Detergens(S/D)-Gemisches von 1%
TnBP und 1% Triton X-100 unterzogen. Das Gemisch wurde bei 30°C für 4 h inkubiert.
Dann wurde das S/D-Gemisch entweder durch Rizinusöl, gefolgt
von einer Chromatographie auf einem Bulk C-18-Harz von Waters oder
einer Chromatographie auf einem Biosepra-SDRHyperD-Harz ohne vorherige Öl-Extraktion entfernt.
Beide Proben wurden dann durch denselben Filtrations-Vorgang wie
im Beispiel 1 gefiltert, und die Durchflussraten wurden alle 10
ml überwacht.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7 und 8 dargestellt. Tabelle 7 Wirkung des C-18-Harzes als die SD-Entfernungs-Vorgehensweise
auf die Durchflussraten und die Drücke während der Nanofiltration im
Beispiel 4
| Messung | Druck (psi)
vor dem Filter | Durchflussrate | Filtrationsvolumen |
| | 75N | 35N | (ml/min) | (ml) |
| 1 | 12.5 | 10 | 5 | 10 |
| 2 | 12.5 | 10 | 4.0 | 10 |
| 3 | 12.5 | 10 | 3.4 | 10 |
| 4 | 12 | 10 | 2.3 | 5 |
Tabelle 8 Wirkung des SDR-Harzes als die SD-Entfernungs-Vorgehensweise
auf die Durchflussraten und die Drücke während der Nanofiltration im
Beispiel 4
| Messung | Druck (psi)
vor dem Filter | Durchflussrate | Filtrationsvolumen |
| | 75N | 35N | (ml/min) | (ml) |
| 1 | 11.5 | 10 | 4.9 | 10 |
| 2 | 12 | 10 | 4.8 | 10 |
| 3 | 12 | 10 | 4.7 | 10 |
| 4 | 12 | 10 | 4.8 | 10 |
| 5 | 12 | 10 | 4.1 | 10 |
| 6 | 12.5 | 11 | 2.4 | 10 |
| 7 | 12 | 11 | 2.0 | 5 |
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Wie
in den Tabellen 7 und 8 gezeigt, sanken, obwohl die anfänglichen
Durchflussraten bei beiden Harzen ähnlich waren, die Durchflussraten
schneller, wenn die Kombination von Öl-Extraktion (C-18) verwendet wurde,
und folglich war das Filtrationsvolumen, wenn das C-18-Harz verwendet
wurde (35 ml), im Vergleich zu dem Filtrationsvolumen, wenn SDR
verwendet wurde (65 ml), niedriger.