ES2288892T3 - Un metodo para la inactivacion de virus. - Google Patents

Abstract

Un método para inactivar los virus presentes en una preparación biológica líquida que comprende las etapas de: (a) tratar la preparación biológica líquida con una combinación de solvente-detergente, a una concentración y bajo condiciones que son suficientes para inactivar los virus recubiertos por lípidos; (b) eliminar los reactivos de solvente-detergente de la preparación líquida pasando la preparación líquida obtenida en (a) sobre un relleno cromatográfico compuesto de bolitas de sílice cuyo volumen de poro se rellena con polímero acrílico hidrofóbico entrecruzado tridimensionalmente; (c) pasar el producto líquido de la etapa (b) a través de un filtro que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 70 nm.

Description

Un método para la inactivación de virus.

Campo del invento

El presente invento trata de un método para eliminar e inactivar virus de las preparaciones biológicas.

Antecedentes del invento

Las preparaciones líquidas derivadas biológicamente, tales como las preparaciones de sangre y plasma, se emplean como materiales de partida a partir de los cuales pueden purificarse una pluralidad de compuestos útiles biológicamente. Ejemplos de tales compuestos incluyen inmunoglobulina, factor VIII, albúmina, \alpha-1 anti-tripsina, factor IX, factor XI, PPSB, fibrinógeno y trombina (protrombina). Además, varios productos biológicos como hormonas, factores de crecimiento, enzimas y ligandos se aislan a partir de preparaciones biológicas obtenidas de cultivos celulares.

Las células empleadas en la producción de estos materiales útiles pueden ser células silvestres de varias fuentes animales o, alternativamente, células procariotas o eucariotas fabricadas por ingeniería genética. Cuando los materiales biológicos obtenidos a partir de estas preparaciones líquidas se vayan a administrar a humanos con fines terapéuticos, en particular por administración intravenosa, la esterilidad de la preparación es de interés principal. De este modo, se invierten grandes esfuerzos en inactivar virus, tales como los virus de la hepatitis y virus del VIH, que pudieran estar presentes en estas preparaciones.

Los virus recubiertos por lípidos se inactivan de forma eficaz mediante tratamiento con solventes y detergentes no iónicos biocompatibles. Los métodos para inactivar virus mediante aplicaciones de solvente-detergente se describen, por ejemplo, en el documento EP 0131740. Sin embargo, los virus no recubiertos por lípidos no pueden inactivarse por tratamientos de solvente-detergente, de modo que para su inactivación se tienen que usar otras metodologías de inactivación. Éstas incluyen la aplicación de calor (pasteurización), la aplicación de irradiación tal como una radiación de luz ultravioleta corta (UVC) o gamma, así como la eliminación por medios físicos, p. ej., la filtración de la preparación a través de poros de filtro muy estrechos, como para eliminar virus por exclusión de tamaño (nanofiltración).

Noreen et al (Biologicals, 26:321-329, 1998) examinan el uso de los filtros de 35 nm de las fibras huecas de membrana Memberg Microporous (Planova) para reducir las cargas potenciales, tanto de virus con envoltura como sin envoltura, antes del tratamiento con solvente-detergente en una solución del 7% de IVIg. En el estudio anterior, la nanofiltración se validó para eliminar una variedad de virus con envoltura y sin envoltura que fluctuaban en tamaño entre 70 nm y 18 nm, incluyendo: virus Sindbis, virus 40 de simio (SV40), virus de la diarrea viríca bovina (BVDV), calicivirus felino, virus de la encefalomiocarditis (EMC), virus de la hepatitis A (VHA), parvovirus bovino (BPV) y parvovirus porcino (PPV). El estudio mostró una reducción completa (hasta el límite de detección del ensayo) de todos los virus mayores de 35 nm. De forma interesante, incluso se eliminaron virus menores como EMC y VHA, al menos parcialmente, mediante este método de filtración.

Estos estudios resultaron en el uso de la nanofiltración para eliminar los virus de las preparaciones biológicas. Sin embargo, en los casos en los que era deseable combinar tanto la inactivación viral por el método del solvente-detergente (para inactivar los virus recubiertos por lípidos), así como la eliminación por nanofiltración (para la exclusión por tamaño y de ahí la eliminación de los virus no recubiertos por lípidos), se descubrió que la etapa de nanofiltración tenía que seguir con la aplicación del solvente-detergente, particularmente cuando el solvente-detergente iba a eliminarse mediante extracción de aceite y resina de fase reversa C-18. La razón para esto fue que tras la extracción del solvente-detergente siempre quedan trazas de pequeñas gotitas de aceite así como residuos de solvente-detergente, las cuales se unen a la parte hidrofílica de la resina. Además, algunas de las proteínas purificadas a partir de la preparación biológica pueden modificarse durante el procedimiento de purificación y las proteínas alteradas pueden formar dímeros y polímeros que cambian la hidrofobicidad de la proteína alterada. Estas trazas de gotitas de aceite, agregados de dímeros de proteína y la mezcla de residuos de aceite y proteína tienden a bloquear los pequeños poros del nanofiltro, aumentando así considerablemente el tiempo de filtración, precisando el reemplazo frecuente de filtros caros y disminuyendo, generalmente, el rendimiento del producto.

Los residuos de gotitas de aceite (contaminantes), que tienden a bloquear los nanofiltros, se eliminaron empleando un mecanismo cromatográfico de exclusión molecular o bien mediante cromatografía hidrofóbica. Sin embargo, ninguno de los métodos convencionales para eliminar el solvente-detergente ha abordado el tema de la dimerización o agregación causada por el solvente detergente, y este problema aún perdura. La eliminación de los solventes-detergentes de las preparaciones biológicas líquidas, tales como las preparaciones de inmunoglobulina, se lleva a cabo generalmente empleando cromatografía sobre gel. Las patentes de EE.UU. 5.094.960 y 5.648.472 tratan de la eliminación del solvente-detergente de las preparaciones de inmunoglobulina sin emplear cromatografía sobre gel de fase reversa (hidrofóbica).

Se han concedido otras dos patentes a procedimientos que indican que la eliminación del solvente detergente afecta a la estabilidad de un producto IVIg líquido (patente de EE.UU. 5.094.960, patente de EE.UU. 4.789.545 y patente de EE.UU. 5.648.472). G. Werner y P. Selosse (patente de EE.UU. 5.648.472) describen un procedimiento para preparar soluciones adecuadas de inmunoglobulina, inactivadas para virus con cubierta, para la aplicación intravenosa, el cual comprende tratar la inmunoglobulina con TnBP y/o Tritón X100, seguido de una extracción empleando aceite vegetal compatible biológicamente, donde el TnBP y/o Tritón X100 y el aceite vegetal se eliminan subsiguientemente por extracción en fase sólida sobre materiales hidrofóbicos. Esto indicó que la combinación de extracción con aceite vegetal de IVIg seguida por cromatografía a través de una columna hidrofóbica produce una solución líquida de inmunoglobulinas muy estable, incluso a temperatura elevada. Esta patente reivindicó que la preparación de IVIg se realiza de acuerdo con dos patentes previas:

Bonomo, 1992 (patente de EE.UU. 5.094.960), enseña el empleo de la extracción en fase sólida y el relleno a granel de C-18 de Waters, Inc. como resina preferida. Woods, 1986 (patente de EE.UU. 4.789.545) caracteriza la eliminación del solvente detergente mediante aceites naturales, sin embargo, los productos obtenidos por este método dieron como resultado una preparación de inmunoglobulinas intravenosas inestable.

Guerrier et al. (Journal of Chromatography B 664:119-125, 1995) describen un sorbente específico para eliminar las mezclas de solvente-detergente de los fluidos biológicos inactivados para virus. Los sorbentes HyperD para eliminar el solvente-detergente (SDR, del inglés solvent-detergent removal) se suministraron por Biosepra (Ceroy-Saint-Christophe, Francia). Este relleno cromatográfico se fabricó con bolitas de sílice en las que el volumen de poro se rellenó con un polímero acrílico hidrofóbico entrecruzado tridimensionalmente.

Compendio del invento

El invento presente se basa en el hallazgo de que un método para inactivar los virus presentes en las preparaciones biológicas, que comprende primero tratar la preparación con solvente-detergente tras lo que el solvente-detergente se extrae mediante el empleo de aceite vegetal, en una combinación con/sin extracción en fase sólida (empleando específicamente C-18 a granel, según se recomienda en la patente de EE.UU. 5.648.472), dio como resultado una preparación líquida de inmunoglobulina que era muy difícil de pasar a través del Filtro de Planova^{TM} de 35 nm. De este modo, se hizo evidente que tal procedimiento era inadecuado para la inactivación eficaz de los virus.

De acuerdo con el invento presente, se descubrió sorprendentemente que la combinación de tratamiento con solvente-detergente seguido por cromatografía empleando SDR HyperD de Biosepra facilitaba el paso de IVIg a una velocidad de flujo elevada a través de los Filtros de Planova de 35 nm y daba como resultado una preparación líquida exenta de virus activos, en tanto que mostraba un rendimiento muy alto. De acuerdo con el invento presente, además se encontró que el problema de dimerización de las inmunoglobulinas puede resolverse parcialmente reduciendo el pH hasta 4,0 antes de la etapa de nanofiltración.

De este modo, el invento presente trata de un método para inactivar los virus presentes en una preparación líquida, que comprende las etapas de:

a)

poner en contacto la preparación biológica líquida con una combinación de solvente-detergente a concentraciones y bajo condiciones que son suficientes para inactivar los virus recubiertos por lípidos;

b)

eliminar las trazas de solvente-detergente de la preparación líquida pasando la preparación líquida obtenida en (a) sobre un relleno cromatográfico compuesto por bolitas de sílice cuyo volumen de poro se rellena con polímero acrílico hidrofóbico entrecruzado tridimensionalmente; y

c)

pasar el producto líquido de la etapa (b) a través de un filtro que tiene un tamaño de poro que fluctúa entre aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 70 nm.

Opcionalmente, después de la etapa (a) viene una etapa de extracción del solvente-detergente mediante una composición hidrofóbica tal como aceite, por ejemplo, un aceite vegetal biológicamente compatible. La eliminación del relleno cromatográfico en la etapa (b) también es, por tanto, útil en la eliminación de las trazas de aceite e impurezas asociadas con el aceite.

El término "virus inactivados" se refiere tanto a la situación en la que los virus se mantienen en la solución, pero lo hacen inviables (por ejemplo, disolviendo su cubierta lipídica), como a la eliminación física de los virus de la preparación líquida (por ejemplo, por exclusión por tamaño). De este modo, en el contexto del invento, este término se refiere tanto a la destrucción viral como a la eliminación viral.

El término "preparación biológica líquida" se refiere a cualquier tipo de preparación líquida obtenida a partir de una fuente biológica. Esto incluye típicamente las preparaciones obtenidas a partir de fluidos como sangre, plasma y orina, así como líquidos obtenidos a partir de cultivos celulares que contienen sustancias biológicas secretadas por las células dentro de la preparación o que contienen sustancias que estaban presentes originalmente dentro de las células y que se liberaron a la preparación líquida debido a diversas manipulaciones tales como el lisado de las células.

El método de la inactivación viral, de acuerdo con el invento, puede emplearse para una pluralidad de usos, tales como: el aislamiento de varias proteínas, incluidas las inmunoglobulinas, factor VIII, albúmina, \alpha1 anti-tripsina, factor IX, factor XI, PPSB, fibrinógeno y trombina (protrombina) y otras; el aislamiento de proteínas fabricadas por ingeniería genética a partir de cultivos celulares; el aislamiento de hormonas, factores de crecimiento, enzimas, factores de coagulación, receptores y otros copolímeros activos biológicamente y similares.

De acuerdo con una realización preferida del invento, la preparación biológica líquida tiene el propósito de aislar inmunoglobulinas, las cuales deben purificarse de ésta, y se obtiene al resuspender Pasta II a partir del fraccionamiento del plasma en agua, ajustando el pH de la preparación y ultrafiltrando y diafiltrando los productos resultantes mediante filtros de membrana, hasta proporcionar una concentración deseada de proteína.

La combinación de solvente-detergente empleada para desactivar los virus de cubierta lipídica puede ser cualquier combinación de solvente-detergente conocida en la técnica, tal como TnBP y Tritón X-100; Tween 80 y colato sódico y otras. La concentración de los solventes-detergentes debería ser la empleada normalmente en la técnica, por ejemplo, > 0,1% de TnBP y > 0,1% de Tritón X-100. Típicamente, las condiciones bajo las cuales el solvente-detergente inactiva los virus consisten en 10-100 mg/ml de solvente-detergente a un nivel de pH que fluctúa entre 5-8 y a una temperatura que fluctúa entre 2-37ºC durante 30 min hasta 24 horas. Sin embargo, otras combinaciones de solvente-detergente y otras condiciones adecuadas serán aparentes para cualquier persona experta en la técnica.

Después de realizar el tratamiento con solvente-detergente, la mayor parte del solvente-detergente se elimina mediante el uso de una resina SDR (de eliminación de solvente-detergente), la cual es un relleno cromatográfico hecho de bolitas de sílice en las que el volumen del poro se rellena con un polímero acrílico hidrofóbico entrecruzado tridimensionalmente. Un ejemplo de tal SDR es la resina HyperD suministrada por Biosepra.

La preparación resultante se pasa entonces a través de un nanofiltro que tiene un tamaño de poro inferior a 70 nm, preferiblemente entre 15 y 50 nm. El tamaño de poro exacto debería determinarse de acuerdo con la proteína que debe mantenerse en la preparación líquida y el tamaño de los virus que deben eliminarse mediante exclusión por
tamaño.

El método del invento presente presenta las ventajas siguientes con respecto a otros métodos de inactivación de virus en los que la etapa de nanofiltración precede al tratamiento con un solvente detergente:

(1)

La cantidad de virus que se adhieren a los poros del filtro es menor (dado que algunos de los virus se eliminaron mediante el tratamiento con el solvente detergente), de modo que el recambio de los filtros, que es una parte costosa de la operación, disminuye.

(2)

El periodo de tiempo del procedimiento disminuye, dado que la preparación líquida, después de tratarse con el solvente-detergente y de la extracción con SDR, pasa mucho más rápidamente a través del nanofiltro que si esta etapa de nanofiltración se hubiese llevado a cabo como primera etapa del método.

(3)

El bloqueo de los filtros durante la producción dio como resultado normalmente una disminución significativa del rendimiento. El rendimiento del invento presente es de aproximadamente 97-100%.

(4)

El relleno hidrofóbico de la resina SDR disminuye la concentración de dímeros en la solución de inmunoglobulina. Una vez que la inmunoglobulina se empobrece de sus dímeros, los niveles bajos de pH reducen la velocidad de formación de dímero nuevo al cargar las moléculas con carga negativa adicional que hace entonces que se repelan entre sí.

El problema de la dimerización cuando la preparación es una preparación de inmunoglobulina se resuelve parcialmente reduciendo el nivel de pH hasta un pH inferior a 5.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Muestra la velocidad de bloqueo del nanofiltro, presentando la reducción de la velocidad de flujo como una función del filtrado acumulado que pasa por el nanofiltro. En este experimento se emplean dos fuentes de soluciones de inmunoglobulina de 45 mg/ml: una solución de IVIg en la que el solvente detergente se elimina mediante extracción con aceite seguido por cromatografía sobre C-18 y una solución de IVIg en la que el solvente detergente se elimina mediante SDR solo; y

Figura 2. Muestra el efecto de la eliminación del solvente en el tiempo acumulado de filtración a través de un nanofiltro de 35N; a temperatura elevada (37ºC) la velocidad de flujo para eliminar el solvente detergente es algo mayor en ambos métodos.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada del invento Ejemplo 1 Inactivación de virus en una preparación de inmunoglobulinas

La Pasta II preparada a partir de plasma mediante el método de fraccionamiento de Cohn se resuspendió en agua durante 18 horas; el pH se ajustó a 4,6 mediante la adición de HCl. La solución resuspendida se ultrafiltró/diafiltró empleando filtros de membrana de Filtron de 30.000 K para dar una concentración de proteína de 90 mg/ml. El pH se ajustó a 5,3 y se añadió a la solución 0,3% de TnBP y 1% de Tritón X-100. La suspensión resultante se incubó a 6ºC durante 4 horas. La suspensión se dividió entonces en dos sub-procedimientos. Una suspensión se extrajo primero con aceite de ricino seguida por cromatografía sobre resina a granel C-18 de Waters y la segunda muestra se sometió (sin extracción previa con aceite) a cromatografía sobre una resina SDR hyperD de Biosepra.

Trescientos ml de cada una de las soluciones se filtraron entonces a través de un filtro de acetato de celulosa de
0,2 \mu. Entonces, ambas soluciones se sometieron a ensayo para determinar su capacidad de pasar por un filtro Planova de 35N. La prueba se diseñó según se indica en la Fig. 1.

300-350 ml de solución proteica se colocaron en un contenedor presurizado. La presión se suministró mediante un gran reservorio de gas de nitrógeno a presión. Este reservorio se llenó a medida que se necesitó a partir de una botella de nitrógeno. Aumentando la presión en el contenedor presurizado la solución proteica iba pasando a través de un set de prefiltros de 0,2 \mu, 0,1 \mu, seguido por un prefiltro Planova de 75N.

El Planova de 35N se conectó al final del set de filtros, el cual estaba también conectado con una aguja de presión. La presión se conservó constante, a 10 PSI en el filtro de 35N y a 11-12 PSI en el filtro de 75N. Por tanto, bajo esta presión constante, si ocurriese un bloqueo parcial del filtro, la velocidad de flujo de la solución proteica a través del filtro disminuría rápidamente. Las presiones antes de los dos filtros Planova (75N y 35N) se monitorizaron durante la filtración completa. La velocidad de flujo, sin embargo, se promedió para cada 50 ml de solución que atravesaba el filtro de 35N. El filtrado se paró cuando la velocidad de flujo promedio alcanzó un nivel inferior que el 50% de la velocidad de flujo inicial. Este tipo de umbral representa la velocidad a la que el 50% de los poros del filtro están bloqueados. Como puede verse a partir de la Fig. 1, la velocidad para este tipo de solución es de alguna manera lineal, mientras que la medición después de este umbral es algo errónea.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Efecto de la resina C-18 como procedimiento de eliminación del SD sobre las velocidades de flujo y presiones durante la nanofiltración en el Ejemplo 1

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Efecto de la resina SDR como procedimiento de eliminación del SD sobre las velocidades de flujo y presiones durante la nanofiltración en el Experimento 1

2

\vskip1.000000\baselineskip

Como se muestra en las Tablas 1 y 2 las velocidades de flujo iniciales fueron menores cuando se empleó la resina
C-18 (0,9 frente a 1,16 ml/min). Además, la velocidad de flujo disminuyó más rápido, y como consecuencia el volumen de filtración fue menor, cuando se empleó la resina C-18 en comparación con la SDR.

Como puede verse en la Fig. 2 y en las Tablas 3-4 la cantidad de filtrado acumulado hasta que se alcanza el umbral del 50% es al menos dos veces más rápido y el volumen es dos veces mayor en el producto que se sometió a cromatografía por SDR que en el producto donde el S/D se eliminó mediante extracción con aceite seguido por cromatografía C-18.

Esto se debe a la eliminación de dímeros, polímeros y agregados de la solución de IgG por la cromatografía en columna SDR.

En un experimento de laboratorio a escala se estudiaron diferentes condiciones para la etapa del SD: se controlaron el pH, las concentraciones de S/D, la temperatura y el tiempo de incubación y las muestras se cromatografiaron en columnas de SDR. La siguiente Tabla 3 muestra los valores promedio de cuatro réplicas de los porcentajes de monómeros, dímeros y agregados de las muestras de IgG antes y después de SDR en las diferentes condiciones.

Los resultados muestran una disminución significativa de los dímeros y un aumento ligerísimo de los agregados (polímeros) tras la columna de SDR. El aumento de agregados (polímeros) está con el error estándar del ensayo analítico, independientemente de las condiciones de SD empleadas.

TABLA 3 Efecto de las diferentes condiciones de S/D sobre la distribución de peso molecular de las soluciones de IgG después de la cromatografía SDR

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Preparaciones líquidas donde se eliminó el S/D

Se empleó el mismo procedimiento de preparación de muestra que en el Ejemplo nº 1, pero esta vez la muestra de la que se eliminó el solvente-detergente (S/D) por extracción con aceite y cromatografía en columna se recuperó de un lote de producción completo. Las muestras de las que se eliminó el S/D mediante cromatografía sobre SDR también se recuperaron a partir del mismo lote, pero en una etapa más temprana (después de inactivar el S/D) y la cromatografía se realizó a una escala menor. Para acelerar el procedimiento de filtración la temperatura de ambas soluciones se elevó a 37ºC y ambas se ajustaron a 45 mg/ml de proteína.

TABLA 4 Efecto de la resina C-18 como procedimiento de eliminación del SD sobre las velocidades de flujo y presiones durante la nanofiltración en el Experimento 2

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Efecto de la resina SDR como procedimiento de eliminación del SD sobre las velocidades de flujo y presiones durante la nanofiltración en el Experimento 2

5

Ejemplo 3 Efecto de la nanofiltración

El material se preparó como en el Ejemplo 2. Uno se sometió a ensayo para la eliminación viral mediante el uso del filtro Planova 35N. 45 mg/ml de solución de IgG a pH 4,0 se pinchó con VIH-1, PRV, BVDV, VHA o MVM. Para obtener una concentración final de más de 10^{7}-10^{9} ufc/ml todos los virus se sedimentaron por ultra-centrifugación y se resuspendieron en agua o tampón sin suero en un volumen pequeño.

Dado el pH 4,0 \pm 0,1 del material de partida y la condición de filtración (37 \pm 1ºC), el estudio del potencial efecto virucidal de esta solución se evaluó a 35 \pm 1ºC sobre BVDV, previo al estudio de nanofiltración con el filtro Planova. Los resultados obtenidos durante los experimentos mostraron un nivel de inactivación muy bajo (1,01 log) tras 8 horas de incubación en el material de partida a pH = 4,0. Los mismos resultados se obtuvieron con MVM y VHA. Por otro lado, en las mismas condiciones, HIV y PRV después de 6 horas de incubación mostraron un factor de reducción de 5,03 y 5,22 log, respectivamente.

Los experimentos de pinchado se llevaron a cabo por duplicado de acuerdo con las condiciones de reducción progresiva. Debido al bloqueo temprano del filtro de 75N, que ocurrió durante la filtración de virus grandes, se estableció un set especial de tres filtros reemplazables de Planova 75N, 0,1 y 0,2 \muM (Fig. 1). La presión del filtro 35N se ajustó de forma constante a 0,7 bar. El filtrado se recogió y los virus residuales se ultracentrifugaron para una recuperación viral máxima.

La siguiente tabla se atribuye al factor de reducción del título viral de virus modelos como consecuencia de la nanofiltración a través de 35N y a las condiciones mencionadas anteriormente, p. ej., incubación a 35 \pm 1ºC y
pH = 4,0 y al uso de prefiltros.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Reducción logarítmica del título de virus de varios modelos de virus pinchados

6

Esta etapa específica ni reduce la concentración de proteína ni cambia las características de la inmunoglobulina, p. ej., se habían conservado la función Fc, la actividad anti-complementaria (ACA) y la integridad de la molécula según se analizó mediante HPLC.

Ejemplo 4 Nanofiltración tras eliminar el S/D en una preparación de fibrinógeno

Un crioprecipitado resuspendido a pH 7,5 después de adsorción con Alhidrogel para agotar las proteasas dependientes de vitamina K se sometió a inactivación viral empleando una mezcla de solvente/detergente (S/D) de 1% de TnBP y 1% de Tritón X-100. La mezcla se incubó a 30ºC durante 4 h. Entonces la mezcla de S/D se eliminó bien mediante aceite de castor seguido de cromatografía sobre una resina a granel C-18 de Waters o de una cromatografía sobre una resina SDR hyperD de Biosepra sin extracción previa con aceite. Ambas muestras se filtraron entonces a través del mismo procedimiento de filtración que el del Ejemplo 1 y se monitorizaron las velocidades de flujo cada
10 ml. Los resultados se presentan en las Tablas 7 y 8.

TABLA 7 Efecto de la resina C-18 como procedimiento de eliminación del SD sobre las velocidades de flujo y presiones durante la nanofiltración en el Ejemplo 4

7

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Efecto de la resina SDR como procedimiento de eliminación del SD sobre las velocidades de flujo y presiones durante la nanofiltración en el Experimento 4

8

Como se muestra en las Tablas 7 y 8, incluso aunque las velocidades iniciales de flujo fueron similares en ambas resinas, la velocidad de flujo disminuyó más rápido cuando se empleó la combinación de extracción con aceite (C-18) y, en consecuencia, el volumen de filtración fue menor cuando se empleó la resina C-18 (35 ml) en comparación con el volumen de filtración cuando se empleó SDR (65 ml).

Claims (11)

1. Un método para inactivar los virus presentes en una preparación biológica líquida que comprende las etapas de:

(a)

tratar la preparación biológica líquida con una combinación de solvente-detergente, a una concentración y bajo condiciones que son suficientes para inactivar los virus recubiertos por lípidos;

(b)

eliminar los reactivos de solvente-detergente de la preparación líquida pasando la preparación líquida obtenida en (a) sobre un relleno cromatográfico compuesto de bolitas de sílice cuyo volumen de poro se rellena con polímero acrílico hidrofóbico entrecruzado tridimensionalmente;

(c)

pasar el producto líquido de la etapa (b) a través de un filtro que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 70 nm.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el relleno cromatográfico es SDRHyperD (Biosepra).

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que tras la etapa (a) viene una etapa (a1) que comprende:

(a1)

extraer la combinación de solvente-detergente mediante un resto hidrofóbico,

4. El método de la reivindicación 3, en el que el resto hidrofóbico es un aceite vegetal biológicamente compatible.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la combinación de solvente-detergente contiene al menos uno de los agentes seleccionados del grupo que consiste en: TnBP, Tritón X-100, Tween 80 y colato sódico.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la preparación líquida se obtiene a partir de plasma humano.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la preparación líquida se origina a partir de un precipitado de plasma humano.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el precipitado es un crioprecipitado.

9. El método de las reivindicaciones 7 u 8, en el que el precipitado contiene inmunoglobulinas.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la preparación líquida es una preparación obtenida por un método que comprende:

(a)

obtener un precipitado que contiene inmunoglobulina a partir de plasma;

(b)

resuspender dicho precipitado en agua;

(c)

ajustar el pH de la preparación obtenida en la etapa (b); y

(d)

ultrafiltrar/diafiltrar la preparación obtenida en la etapa (c) empleando filtros de membrana para propocionar una concentración de proteína deseada.

11. El método de la reivindicación 10, donde el pH de la etapa (c) se ajusta a un pH inferior a 5.