ES2229481T3 - Metodo para la eliminacion de virus a partir de soluciones de proteinas mediante nanofiltracion. - Google Patents
Metodo para la eliminacion de virus a partir de soluciones de proteinas mediante nanofiltracion.Info
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Abstract
Procedimiento para eliminar virus, en particular virus pequeños sin envuelta, de un producto derivado de plasma, tal como Concentrado de Complejo de Protrombina. El procedimiento comprende una prefiltración para eliminar proteínas contaminantes de alto peso molecular, seguido de nanofiltración a través de una membrana con un tamaño medio de poros de 15 nm. El procedimiento es capaz de retirar > 5,1 log del parvovirus canino y > 6,0 log del virus de la Hepatitis A.
Description
Método para la eliminación de virus a partir de
soluciones de proteína mediante nanofiltración.
La presente invención se refiere a métodos para
mejorar la seguridad vírica de las soluciones de proteína,
particularmente de productos derivados de la sangre. Más
específicamente, la invención da a conocer un método para eliminar
los virus, en particular, virus pequeños sin envoltura, a partir de
un producto derivado de plasma, tal como la Protrombina Compleja
Concentrada (PCC).
Las proteínas del plasma que dependen de la
vitamina K, tales como factores de coagulación II, VII, IX y X, y
Proteínas C y S, desempeñan un papel importante en el campo de la
coagulación. Se han utilizado estos factores aislados de plasma
desde principios de los años setenta para tratar pacientes que
sufren una deficiencia congénita de las proteínas mencionadas
anteriormente (por ejemplo, Hemofilia B) y pacientes que sufren una
deficiencia adquirida (por ejemplo, la terapia cumarina
desequilibrada). Se conoce también el producto que contiene las
proteínas terapéuticas que dependen de la vitamina K, como la
Protrombina Compleja Concentrada (PCC).
Los métodos ampliamente utilizados para mejorar
la seguridad vírica de los productos sanguíneos son métodos
químicos, tales como el método del detergente disolvente, y el
tratamiento por calor tal como la pasteurización o el tratamiento de
secado por calor. Estos métodos son muy eficaces para la eliminación
o la desactivación de los virus con envoltura, tales como Virus de
la Hepatitis B (HBV), Virus de la Hepatitis C (HCV) y Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (HIV). Sin embargo, estos métodos son menos
eficaces para los virus sin envoltura.
De modo convencional, se trata la PCC, que está
en proceso, con productos químicos virúcidas (por ejemplo, 0,3% de
TNBP y 1,0% de Tween 80) para desactivar los virus. Los virus
desactivados mediante tal tratamiento son virus con envoltura tales
como Virus de la Hepatitis B, Virus de la Hepatitis C y Virus de la
Inmunodeficiencia Humana.
Desde el punto de vista de las autoridades
regulatorias, existe una creciente demanda para prevenir la
transmisión mediante productos sanguíneos de los virus sin
envoltura, tales como Virus de la Hepatitis A (HAV) y Parvovirus B19
Humano (HPV). Estos virus muestran típicamente una resistencia
química y al calor y tienen un tamaño pequeño de 25 y 20 nm,
respectivamente. Los métodos existentes de la desactivación vírica
no han sido ampliamente exitosos en la desactivación de Virus de la
Hepatitis A y especialmente en Parvovirus B19 Humano.
Se ha aplicado con éxito la nanofiltración (15
nm) como técnica de eliminación del virus, para proteínas altamente
purificadas con un peso molecular inferior a 150 kD (WO 96/00237,
Pharmacia). Sin embargo, los intentos de utilizar la nanofiltración
para eliminar Virus de la Hepatitis A y Parvovirus B19 de una
solución, tal como concentrado de complejo de Protrombina,
continuaron sin éxito.
La Protrombina Compleja Concentrada es un
producto de pureza más bien baja que contiene varias proteínas
(estimado en 20 a 30 aproximadamente) con un peso molecular de hasta
20000 kD aproximadamente. Los componentes terapéuticos en la
Protrombina Compleja Concentrada tienen un peso molecular de
solamente 70 kD aproximadamente. Se ha descubierto que la
Protrombina Compleja Concentrada no puede pasar a través de un
nanofiltro con un tamaño de poro de 15 nm por la presencia de estos
contaminantes en el mismo que son proteínas de alto peso molecular.
Se bloquea, de modo eficaz, el paso de las proteínas terapéuticas a
través del nanofiltro mediante la obturación de la membrana por
proteínas de alto peso molecular. La filtración de 35 nm es factible
solamente para la Protrombina Compleja Concentrada, pero este tipo
de filtración no elimina el Virus de la Hepatitis A ni el Parvovirus
B19 Humano (J. Römisch y otros, Beitr.
Infusions-ther. Transfusionsmed. Basel, Karger,
1996, Vol. 33, 220-224). Ver también M.
Burnouf-Radoserisch y otros, Vox Sang.
67:132-138 (1994) y M. Poulle y otros, Blood
Coagulation and Fibrinolysis 5:543-549 (1994)).
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer un método que solucione este problema.
Un objetivo de la invención es dar a conocer un
método para la eliminación o la desactivación de virus pequeños,
tales como, en particular, virus sin envoltura como el HAV y los
parvovirus, a partir de una mezcla compleja, particularmente
productos derivados de plasma, tal como la Protrombina Compleja
Concentrada.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer un método eficaz para eliminar virus pequeños,
particularmente los virus sin envoltura, mediante la nanofiltración
de un suero sanguíneo o una mezcla derivada de plasma que contiene
uno o más miembros del grupo que consiste en factores de coagulación
II, VII, IX y X y Proteínas C y S, juntamente con proteínas de peso
molecular más alto que tienen un peso molecular a partir de 200 kD
aproximadamente, más particularmente, un peso molecular de 400 kD
aproximadamente a 20000 kD aproximadamente.
La invención consigue los objetivos citados
anteriormente proporcionando un método en el que una mezcla
compleja, particularmente la Protrombina Compleja Concentrada, se
somete a un pretratamiento que mejora las propiedades de filtración
de la solución de proteínas. Típicamente, el pretratamiento
comprende una filtración, tal como la filtración a través de una
membrana de 150 kD en un método de flujo tangencial a una presión
transmembrana de menos de 0,5 bares. Después del pretratamiento, se
puede filtrar la PCC a través de un nanofiltro de 15 nm.
Más específicamente, la presente invención da a
conocer un método para la eliminación de los virus, en particular
virus sin envoltura, de una solución de proteína, que comprende
someter dicha mezcla a un pretratamiento que elimina las proteínas
grandes, y someter el producto resultante a una nanofiltración que
elimina los virus. Mediante la aplicación del método de la presente
invención a una solución de proteínas que puede ser contaminada con
virus (sin envoltura), se puede asegurar que el producto obtenido se
encuentra sustancialmente libre de dichos virus. Por consiguiente,
se puede reformular el objeto de la presente invención como un
método para someter soluciones de proteínas a un tratamiento o un
proceso que asegura su libertad sustancial de los virus (sin
envoltura).
La solución de proteína es preferentemente una
solución de proteína derivada de la sangre, particularmente una
solución de proteína que contiene una o varias proteínas
seleccionadas del grupo que consiste en factores de coagulación II,
VII, IX, X, Proteína C, Proteína S, albúmina, antitrombina III,
plasminógeno, cofactor II de heparina, inhibidor
alfa-1-proteinasa, inhibidor C1,
transferrina, proteína unida a la vitamina D e inmunoglobulina G. En
la realización más preferente de la invención, dicha solución de
proteína es la Protrombina Compleja Concentrada.
Generalmente, las proteínas grandes, que se deben
eliminar mediante el pretratamiento, tendrán un peso molecular
superior a 150 kD aproximadamente, más particularmente un peso
molecular desde 400 kD aproximadamente hasta 20000 kD
aproximadamente. Generalmente, las proteínas grandes están
seleccionadas del grupo que consiste en fibrinógeno, fibronectina,
inmunoglobulina M, factores de coagulación VIII, XIII, factor de von
Willebrand y sus formas multiméricas, inhibidor de
inter-alfa-(tripsina),
alfa-2-macroglobulina, proteína de
complemento C1q, proteína de complemento C4, apolipoproteína (a),
apolipoproteína B-100 y ferritina.
En una realización particularmente preferente de
la invención, el pretratamiento comprende una filtración de membrana
a través de una membrana que tiene un valor de corte entre 100 y 250
kD aproximadamente, preferentemente de 150 kD aproximadamente. Es
preferente que se lleve a cabo la filtración de membrana en un modo
de filtración de flujo tangencial a una presión transmembrana
inferior a 0,5 bares, y que durante la filtración se añada un tampón
al retentado y que se detenga el proceso de filtración cuando la
cantidad del filtrado es de 4 a 6 veces aproximadamente la cantidad
del material de partida.
Generalmente, se llevará a cabo la nanofiltración
en un nanofiltro que tiene un valor de corte entre 10 y 30 nm
aproximadamente, preferentemente de 15 nm aproximadamente, en un
modo de filtración final ("dead end"). Preferentemente, el
nanofiltrato resultante (es decir, el filtrado obtenido en la
nanofiltración) se concentra directamente mediante diafiltración o
ultrafiltración, preferentemente en un cartucho de hemodiálisis.
Los virus que se deben eliminar, si están
presentes, son generalmente virus sin envoltura, particularmente
virus sin envoltura que tienen un diámetro de 20 nm o más, tales
como, particularmente, Virus de la Hepatitis A, parvovirus tales
como Parvovirus B19 Humano y Parvovirus Canino, y Virus
Encefalomiocarditis.
El método puede incluir una desactivación del
virus, preferentemente antes de dicho pretratamiento, calentando la
solución de proteína con detergentes tales como detergentes iónicos
y/o no iónicos en presencia de compuestos de fosfato de dialquilo o
trialquilo tales como fosfato de
tri-n-butilo. Adicionalmente, se
puede liofilizar la solución de proteína obtenida.
Adicionalmente, la presente invención da a
conocer un producto, más particularmente la Protrombina Compleja
Concentrada, que es sustancialmente libre de virus (sin envoltura) y
que se obtiene con el método de la presente invención.
El objeto de la invención, que comprende una
combinación de una prefiltración seguida por una nanofiltración, es
aplicable a cada proteína terapéutica presente en una solución con
un compuesto complejo. Se podría derivar tal solución de proteína de
un plasma sanguíneo, tejido corporal, extractos de fermentación u
otros materiales de fuente biológica. Tal como se ha comentado
anteriormente, el material de partida preferente de la presente
invención es la PCC.
Los contaminantes de alto peso molecular que se
eliminan típicamente mediante la etapa de prefiltración tienen un
peso molecular de, por lo menos, 150 kD. En el caso de una solución
de proteína derivada de la sangre, la prefiltración elimina
particularmente proteínas tales como: fibrinógeno, fibronectina,
inmunoglobulina M, factor de coagulación VIII, factor de coagulación
XIII, factor de von Willebrand y sus formas multiméricas, inhibidor
inter-alfa (= inhibidor
inter-alfa-tripsina),
alfa-2-macroglobulina, complemento
de proteína C1q, complemento de proteína C4, apolipoproteína (a),
apolipoproteína B-100 y ferritina.
La utilización de la nanofiltración está limitada
a proteínas terapéuticas que tienen un peso molecular de hasta 150
kD. En el caso de las soluciones de proteína derivadas de la sangre,
la nanofiltración está limitada a proteínas tales como factores de
coagulación II, VII, IX y X, proteína S, proteína C, albúmina,
antitrombina III, plasminógeno, cofactor II de heparina, inhibidor
alfa-1-proteinasa, inhibidor C1,
transferrina, proteína unida a la vitamina D e inmunoglobulina
G.
El pretratamiento y la siguiente nanofiltración
de PCC funcionan preferentemente de la manera siguiente:
- A.
- la primera etapa consiste en la filtración de PCC a través de una membrana de 150 kD en un modo de flujo tangencial a una presión transmembrana inferior a 0,5 bares. Se recoge el filtrado que pasa a través del prefiltro. Durante la filtración, se añade continuamente el tampón al retentado. La cantidad del tampón añadido es igual a la cantidad del filtrado obtenido. Luego, en la última etapa de este proceso de filtración, se detiene la adición del tampón. Después de que se haya finalizado el proceso de la prefiltración, la cantidad del filtrado es preferentemente de 4 a 6 veces la cantidad del material de partida.
- Durante esta prefiltración, se eliminan de la solución de PCC las proteínas de alto peso molecular en un rango de peso de molecular de 400 kD o más. Se ha descubierto que un prefiltro similar con membranas de 300 kD no es adecuado para la eliminación esencial de estos componentes de alto peso molecular.
- B.
- La segunda etapa consiste en la filtración de la PCC prefiltrada a través de un nanofiltro de 15 nm en un modo de filtración final ("dead end"). Durante este proceso, el filtrado de 15 nm, es decir, el flujo que pasó a través del prefiltro, se concentra directamente utilizando cartuchos de hemodiálisis para traer los factores de coagulación a su concentración deseada. El método de filtración final ("dead end") es preferente para impedir una dilución adicional del producto y para impedir que las características del producto cambien, por ejemplo, que el producto llegue a ser turbio.
Los filtros utilizados para la prefiltración
están disponibles en Pall-Filtron (filtros de unión
baja de proteínas Omega de 150 kD). El nanofiltro de 15 nm está
disponible en Asahi Chemical Corp. Ltd (Tokio, Japón). Los cartuchos
de hemodiálisis adecuados están disponibles en varios fabricantes,
por ejemplo, en Fresenius (HF 80).
Se ha estudiado la eficacia del método para
eliminar virus sin envoltura alterando la solución con una cantidad
conocida de un virus modelo. Para este estudio, se han utilizado el
Parvovirus Canino (utilizado como modelo para el Parvovirus B19
Humano) y el Virus de la Hepatitis A. Se han realizado estos
estudios en una escala de 0,2% de la escala de producción. La
nanofiltración de PCC es capaz de eliminar los virus pequeños sin
envoltura en una dimensión de 5,0 a 6,0 en una escala logarítmica de
10.
La composición bioquímica de la PCC nanofiltrada
solamente se altera, de modo ligero, cuando se compara con la PCC no
filtrada. El nivel de los factores de coagulación y la concentración
de los excipientes de la PCC nanofiltrada secada en frío es similar
a los de la PCC no filtrada secada en frío. Los ensayos in
vivo e in vitro demostraron que la nanofiltración no tuvo
efectos adversos en la calidad y las características del
producto.
La invención se describirá más detalladamente
mediante los siguientes ejemplos.
El presente ejemplo describe un experimento
realizado con 1000 ml de Protrombina Compleja Concentrada derivada
de la producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja
Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha sometido,
previamente a la prefiltración, a una secuencia de etapas que
implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico,
desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de
tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso)
de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y
concentración.
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición
química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH
7,0.
Fabricante: Filtron; Tipo A: 200 kD de membrana
de pantalla de canales de polietileno (PEAS); Área superficial
efectiva: 0,07 m^{2}.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de
NaCl, pH 7,0.
Se ha concentrado la Protrombina Compleja
Concentrada de 1000 ml a 250 ml aproximadamente utilizando el
prefiltro tipo A. A continuación, se ha dejado el volumen del
retentado a un nivel constante de 250 ml mediante la adición
continua del tampón de filtración. Después de la adición de 1000 ml
aproximadamente de tampón de filtración, se detuvo dicha adición y
se continuó la concentración. Al final del proceso se han obtenido
2000 ml aproximadamente de Protrombina Compleja Concentrada
prefiltrada.
La recuperación del factor IX en el filtrado
utilizando el prefiltro tipo A fue de 73% aproximadamente. El flujo
promedio del filtrado para el prefiltro tipo A durante el proceso
fue de 9 litros por hora por m^{2}. Se ha llevado a cabo esta
etapa a una presión prácticamente no transmembrana.
Este ejemplo describe un experimento realizado
con 1000 ml de Protrombina Compleja Concentrada derivada de la
producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja
Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha pasado,
previamente a la prefiltración, a través de una serie de
tratamientos que implican la utilización de cromatografía de
intercambio iónico, desactivación química del virus con 0,3%
(peso/peso) de fosfato de
Tri-n-butilto (TNBP) y 1%
(peso/peso) de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y
concentración.
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición
química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH
7,0.
Fabricante: Filtron; Tipo B: 300 kD de membrana
de pantalla de canales de polietersulfona (PES); Área superficial
efectiva: 0,07 m^{2}.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de
NaCl, pH 7,0.
Se ha concentrado la Protrombina Compleja
Concentrada de 1000 ml a 250 ml aproximadamente utilizando el
prefiltro tipo B mencionado anteriormente. A continuación, se ha
dejado el volumen del retentado a un nivel constante de 250 ml
mediante la adición continua del tampón de filtración. Después de la
adición de 1000 ml aproximadamente de tampón de filtración, se
detuvo dicha adición y se continuó la concentración. Al final del
proceso, se han obtenido 2000 ml aproximadamente de Protrombina
Compleja Concentrada prefiltrada. Se ha realizado esta etapa a una
presión prácticamente no transmembrana.
La recuperación del factor IX en el filtrado
utilizando el prefiltro tipo B fue de 66%. El flujo promedio del
filtrado para el prefiltro tipo B durante el proceso fue de 26
litros por hora y por m^{2} de área.
Este ejemplo describe un experimento realizado
con Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada derivada del
Ejemplo 1.
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo:
15 nm;
Material: fibras huecas de celulosa regenerada
con cupramonio;
Área superficial efectiva: 0,03 m^{2}, Tipo de
filtración: final ("dead end");
Configuración: un filtro simple.
Se ha pasado un volumen total de 2000 ml de
Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada a través del nanofiltro
en un modo de filtración final ("dead end") a una presión
transmembrana constante de 0,5 bares (recomendaciones del
fabricante). Durante el experimento, el flujo del filtrado disminuyó
de 14 a 10 litros por hora por m^{2}. La recuperación del factor
IX en el nanofiltro fue de 79% en comparación con la Protrombina
Compleja Concentrada prefiltrada.
Este ejemplo describe un experimento realizado
con Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada derivada del
Ejemplo 2.
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo:
15 nm;
Material: fibras huecas de celulosa regenerada
con cupramonio;
Área superficial efectiva: 0,03 m^{2}, Tipo de
filtración: final ("dead end");
Configuración: un filtro simple.
De los 2000 ml disponibles de Protrombina
Compleja Concentrada prefiltrada, se ha podido pasar solamente 1000
ml aproximadamente del producto por el nanofiltro en un modo de
filtración final ("dead end") a una presión transmembrana
constante de 0,5 bares (recomendaciones del fabricante). El flujo
del filtrado disminuye durante el experimento de 14 a 4 litros por
hora por m^{2}. Esto indica una obturación en el nanofiltro. La
recuperación del factor IX en el nanofiltro fue solamente de 35%
debida a la finalización prematura del procedimiento de la
filtración.
Se han realizado cuatro experimentos idénticos
con 1000 ml de Protrombina Compleja Concentrada derivada de la
producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja
Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha sometido,
previamente a la prefiltración, a una serie de tratamientos que
implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico,
desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de
Tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso)
de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y finalmente
concentración.
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición
química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 150 mmol/l de NaCl; pH
7,0.
Fabricante: Filtron; Tipo A: 200 kD de membrana
de pantalla de canales de polietersulfona (PES); Área superficial
efectiva: 0,07 m^{2}.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de
NaCl, pH 7,0.
Se ha concentrado la Protrombina Compleja
Concentrada por etapas sobre el prefiltro tipo A. Las etapas
utilizadas, expresadas como porcentaje del volumen de partida,
fueron: de 100 a 50%, de 50 a 40%, de 40 a 30% y de 30 a 20%.
Después de cada etapa de concentración, se ha mantenido el volumen
constante mediante la adición del tampón de filtración (250 ml
aproximadamente por etapa). Se ha aplicado la concentración
solamente cuando el retentado se concentró a 20% aproximadamente del
volumen de partida. Al final del proceso, se han obtenido 3000 ml
aproximadamente de filtrado. Se ha realizado esta etapa de
filtración a una presión prácticamente no transmembrana.
La recuperación promedia del factor IX en el
filtrado utilizando el prefiltro tipo A fue de 94%. El flujo del
filtrado durante el proceso disminuye de 20 a 7 litros por hora por
m^{2}.
Este ejemplo describe un experimento realizado
con un combinado de cuatro Protrombinas Complejas Concentradas
prefiltradas (12 litros aproximadamente) derivadas del Ejemplo
5.
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo:
15 nm;
Área superficial efectiva: 0,03 m^{2}; Tipo de
filtración: final ("dead end");
Configuración: dos nanofiltros conectados en
serie.
Durante la nanofiltración, el flujo del filtrado
disminuye linealmente de 16 a 11 litros por m^{2} por hora. La
recuperación del factor IX fue de 96%.
Este ejemplo describe un experimento realizado
con la Protrombina Compleja Concentrada nanofiltrada derivada del
Ejemplo 6.
Fabricante: Fresenius, Bad Homburg, Alemania;
Tipo: Hemoflow HF 80; Área superficial efectiva: 1,8 m^{2};
Configuración: un cartucho simple de Hemodiálisis.
Composición: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, pH
7,0.
Durante las etapas descritas en los Ejemplos 5 y
6, se ha diluido la PCC de cuatro a cinco veces aproximadamente. Se
ha concentrado esta Protrombina Compleja Concentrada nanofiltrada
diluida utilizando un cartucho de hemodiálisis de fibra hueca.
Después de la concentración, se ha utilizado el mismo cartucho de
hemodiálisis para disminuir la proporción iónica de la solución
mediante diálisis frente al tampón de la diálisis hasta conseguir
una proporción iónica de 16 mS por cm. La recuperación del factor IX
en esta etapa fue de 92%.
Se han realizado cuatro experimentos idénticos
con 18 litros de Protrombina Compleja Concentrada derivada de una
producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja
Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha tratado,
previamente a la prefiltración, con una serie de etapas que implican
la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación
química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de
tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso)
de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y finalmente
concentración.
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición
química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH
7,0.
Fabricante: Filtron; Tipo A: 200 kD de membrana
de pantalla de canales de poliétersulfona (PES); Área superficial
efectiva: 3,6 m^{2}; Modo de flujo: tangencial.
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo:
15 nm; Área superficial efectiva: 1 m^{2}, Modo de flujo: final
("dead end"); Configuración: dos sistemas en paralelo de dos
filtros Planova de 1 m^{2} conectados en serie.
Fabricante: Fresenius, Bad Homburg, Alemania,
Hemoflow HF 80; Área superficial efectiva: 1,8 m^{2};
Configuración: dos cartuchos de hemodiálisis montados en
paralelo.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de
NaCl, pH 7,0.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, pH 7,0.
Se han filtrado 18 litros aproximadamente de
Protrombina Compleja Concentrada sobre el prefiltro con una presión
transmembrana de 0,3 bares. Previamente a la prefiltración, se ha
recirculado el producto iniciando con una presión transmembrana de
0,7 bares. Cada cinco minutos, se ha disminuido la presión
transmembrana de 0,1 bares hasta llegar a una presión transmembrana
final de funcionamiento de 0,3 bares. En esta fase de recirculación,
se ha formado una capa de gel en la membrana que impidió "la
producción" de las proteínas de alto peso molecular. Esto resultó
en 60 litros aproximadamente de nanofiltrado prefiltrado que se pasó
posteriormente sobre dos sistemas paralelos de dos nanofiltros
conectados en serie. Se ha concentrado el filtrado derivado de la
nanofiltración en línea 4 a 6 veces con dos cartuchos de
Hemodiálisis montados en paralelo. A continuación, se ha reducido la
proporción iónica a 16 mS/cm mediante diálisis frente al tampón de
diálisis utilizando los mismos cartuchos de hemodiálisis. La
recuperación del factor IX para estos cuatro experimentos a gran
escala fue de 72% aproximadamente en comparación con el material de
partida.
Se han realizado tres experimentos idénticos con
20 litros de Protrombina Compleja Concentrada derivada de una
producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja
Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha tratado,
previamente a la prefiltración, con una serie de etapas que implican
la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación
química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de
tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso)
de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y finalmente la
concentración.
Contenido en proteína: 15-25 mg
por ml; Composición química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500
mmol/l de NaCl; pH 7,0.
Fabricante: Filtron; Tipo C: membrana de pantalla
de canales de polietersulfona (PES) 150 kD; Área superficial
efectiva: 3,6 m^{2}; Modo de flujo: tangencial.
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo:
15 nm; Área superficial efectiva: 1 m^{2}, Modo de flujo: final
("dead end"); Configuración: un sistema de dos filtros Planova
de 1 m^{2} conectados en serie.
Fabricante: Fresenius, Bad Homburg, Alemania,
Hemoflow HF 80; Área superficial efectiva: 1,8 m^{2};
Configuración: dos cartuchos de hemodiálisis montados en
paralelo.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de
NaCl, pH 7,0.
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, pH 7,0.
Se han filtrado 20 litros aproximadamente de
Protrombina Compleja Concentrada sobre el prefiltro tal como se ha
descrito en el Ejemplo 8. Esto resultó en 60 litros aproximadamente
de nanofiltrado prefiltrado que se pasó posteriormente sobre dos
nanofiltros conectados en serie. Se ha concentrado el filtrado
derivado de la nanofiltración en línea 4 a 6 veces mediante dos
cartuchos de hemodiálisis montados en paralelo. A continuación, se
ha reducido la proporción iónica a 16 mS/cm mediante diálisis frente
al tampón de diálisis utilizando los mismos cartuchos de
hemodiálisis. La recuperación del factor IX para estos tres
experimentos a gran escala fue de 50-70%
aproximadamente en comparación con el material de partida.
Se ha estudiado la capacidad de la nanofiltración
en eliminar el virus alterando la Protrombina Compleja Concentrada
prefiltrada con virus revelantes tales como el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (HIV) y el Virus de la Hepatitis A (HAV), y
virus modelo tales como el Virus de la Diarrea Vírica Bovina (BVDV),
Virus pseudo Rabia (PSR), Virus Encefalomiocarditis (EMC), y
Parvovirus Canino (CPV). EMC, HAV y CPV son virus que pertenecen a
la clase de virus sin envoltura. EMC, HAV y CPV tienen un diámetro
de 20 a 25 nm. CPV está considerado ser un virus modelo del
Parvovirus B19 Humano.
Se han realizado estos estudios de alteración en
una escala de 100 ml (que es 0,2% aproximadamente de la escala
industrial) de Protrombina Compleja Concentrada derivada del Ejemplo
1. Se ha pasado el material alterado con los virus mencionados
anteriormente sobre dos filtros Planova 15N conectados en serie,
cada uno de ellos con un área superficial de 0,003 m^{2}. Se ha
determinado la cantidad del virus en el material prefiltrado y en la
Protrombina Compleja Concentrada nanofiltrada. La eliminación del
virus se expresa como un factor de reducción logarítmico (en
log-métrico de 10).
Se presentan los resultados de los estudios en la
tabla 1.
Estos datos muestran que la nanofiltración es
capaz de reducir la carga del virus de la Protrombina Compleja
Concentrada prefiltrada con un factor de 10^{5} - 10^{7} para
virus con un tamaño de 20 a 25 nm y más.
Claims (18)
1. Método para eliminar virus de una mezcla
compleja que contiene proteína derivada de la sangre, cuya mezcla
comprende:
- i.
- Proteínas del grupo que consiste en los factores de coagulación II, VII, IX, X, Proteína C, Proteína S, albúmina, antitrombina III, plasminógeno, cofactor II de heparina, inhibidor alfa-1-proteinasa, inhibidor C1, transferrina, proteína unida a la vitamina D e inmunoglobina G, y
- ii.
- Proteínas del grupo que consiste en fibrinógeno, fibronectina, inmunoglobina M, factores de coagulación VIII, XIII, factor von Willebrand y sus formas multiméricas, inhibidor inter-alfa-(tripsina), alfa-2-macroglobulina, proteínas de complemento C1q, proteína de complemento C4, apolipoproteína (a), apolipoproteína B-100 y ferritina;
- comprendiendo dicho método
- (a)
- someter la mezcla del complejo a un pretratamiento que elimina proteínas del grupo (ii), comprendiendo dicho pretratamiento una filtración de membrana a través de una membrana que tiene un valor de corte entre 100 y 250 kD, y
- (b)
- someter la mezcla resultante a una nanofiltración que elimina los virus, llevándose a cabo dicha nanofiltración sobre un nanofiltro que tiene un valor de corte entre 10 y 30 nm.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (i) que tienen
un peso molecular hasta 150 kD aproximadamente.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que
la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (ii) que tienen
un peso molecular superior a 150 kD aproximadamente.
4. Método, según la reivindicación 1, en el que
la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (ii) que tienen
un peso molecular superior a 200 kD aproximadamente.
5. Método, según la reivindicación 1, en el que
la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (ii) que tienen
un peso molecular de 400 kD aproximadamente a 20000 kD
aproximadamente.
6. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicha solución de proteína contiene proteínas de plasma sanguíneo
que dependen de la vitamina K.
7. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicha solución de proteína es Protrombina Compleja Concentrada.
8. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicho pretratamiento comprende una filtración de membrana a través
de una membrana que tiene un valor de corte de 150 kD
aproximadamente.
9. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicho pretratamiento comprende una filtración de membrana que se
lleva a cabo en un modo de filtración de flujo tangencial a una
presión transmembrana de menos de 0,5 bares.
10. Método, según la reivindicación 9, en el que
durante la filtración se añade un tampón al retentado y se detiene
el proceso de filtración cuando la cantidad del filtrado es de 4 a 6
veces la cantidad del material de partida.
11. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicha nanofiltración se lleva a cabo en un nanofiltro que tiene un
valor de corte de 15 nm aproximadamente.
12. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicha nanofiltración se lleva a cabo en un modo de filtración final
("dead end").
13. Método, según la reivindicación 1, en el que
el nanofiltrado se concentra mediante diafiltración o
ultrafiltración, preferentemente en un cartucho de hemodiálisis.
14. Método, según la reivindicación 1, en el que
dichos virus son virus sin envoltura.
15. Método, según la reivindicación 1, en el que
dichos virus son virus sin envoltura que tienen un diámetro de 20 nm
o más.
16. Método, según la reivindicación 1, en el que
dichos virus son virus sin envoltura seleccionados del grupo que
consiste en Virus de la Hepatitis A, parvovirus tales como
Parvovirus B19 Humano y Parvovirus Canino, y Virus
Encefalomiocarditis.
17. Método, según la reivindicación 1, en el que
se incluye, adicionalmente, una desactivación del virus,
preferentemente previa a dicho pretratamiento, mediante el
tratamiento de la solución de proteína con detergentes tales como
detergentes iónicos y/o no iónicos en presencia de compuestos de
fosfato de di- o trialquilo tales como fosfato de
tri-n-butilo.
18. Método, según la reivindicación 1, en el que
se liofiliza la solución de proteína obtenida.
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