JP2002034556A

JP2002034556A - ウイルスの不活化方法

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Publication number: JP2002034556A
Application number: JP2001160562A
Authority: JP
Inventors: Israel Nur; イスラエル・ヌル; Liliana Bar; リリアナ・バル
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Priority date: 2000-06-05
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2002-02-05
Anticipated expiration: 2021-05-29
Also published as: EP1161958B1; ES2288892T3; JP4808864B2; IL136552A0; US6468733B2; US20020009707A1; ATE364406T1; DE60128861T2; IL136552A; EP1161958A1; DE60128861D1

Abstract

(57)【要約】【課題】生物学的な液状調製物のウイルスの不活化法
の提供。【解決手段】最初に、包膜ウイルスが、溶媒−洗剤処
理によって除去され、次いで、溶媒−洗剤が、一定のシ
リコンビーズからなる樹脂によって除去され、そして最
後に、調製物がナノフィルトレーションにかけられる、
生物学的な調製物からのウイルスの不活化及び除去方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物調製物からの
ウイルスの除去および不活化方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液および血漿調製物のような生物学的
に誘導される液状調製物が、原料として使用され、これ
から多数の生物学的に有用な化合物が精製できる。その
ような化合物の例は、免疫グロブリン、ＶＩＩＩ因子、
アルブミン、α１抗トリプシン、ＩＸ因子、ＸＩ因子、
ＰＰＳＢ、フィブリノーゲンおよびトロンビン（プロト
ロンビン）を含む。さらに、種々の生物学的産物、例え
ばホルモン、成長因子、酵素およびリガンドが、細胞培
養から得られる生物調製物から単離されている。

【０００３】これらの有用な物質の生産に使用される細
胞は、種々の動物起源からの野生型細胞か、あるいはま
た、遺伝的に工作された原核もしくは真核細胞のいずれ
かであってもよい。これらの液状調製物から得られる生
物学的物質は、治療目的のために、特に静脈内投与によ
ってヒトに投与される場合には、調製物の無菌性が主た
る関心事である。かくして、多くの努力は、これらの調
製物中に存在しているかもしれないウイルス、例えば肝
炎ウイルスおよびＨＩＶウイルスの不活化に注ぎ込まれ
ている。

【０００４】脂質コートされたウイルスは、非イオン性
の生物学的適合性溶媒および洗剤を用いる処理によって
効果的に不活化される。溶媒−洗剤施用によるウイルス
の不活化方法は、例えば、欧州特許第０１３１７４０号
において記述されている。しかしながら、脂質コートさ
れていないウイルスは、溶媒−洗剤処理によって不活化
することができず、かくして、他の不活化方法が、それ
らの不活化のために使用されねばならない。これらは、
加熱（パスツーリゼーション）、短波長紫外線（ＵＶ
Ｃ）のような照射またはγ線放射の施用、ならびに物理
的手段による除去、例えばサイズ排除によりウイルスを
除去するような非常に狭いフィルター孔を通しての調製
物のナノ濾過（ナノフィルトレーション（ｎａｎｏｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ））を含む。

【０００５】Ｎｏｒｅｅｎら（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓ，２６：３２１−３２９（１９９８））は、７％ＩＶ
Ｉｇ溶液における溶媒洗剤処理の前に、Ｍｅｍｂｅｒｇ
ミクロ多孔膜中空糸（Ｐｌａｎｏｖａ）３５ｎｍフィル
ターを使用して、両非包膜および包膜ウイルスの潜在的
な混入を低下させる試験を行った。上記研究では、ナノ
フィルトレーションは、シンドビスウイルス、シミアン
ウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシのウイルス性下痢ウイ
ルス（ＢＶＤＶ）、ネコ・カリシウイルス、脳心筋炎ウ
イルス（ＥＭＣ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ウシ
・パルボウイルス（ＢＰＶ）およびブタ・パルボウイル
ス（ＰＰＶ）：を含むサイズが７０ｎｍ〜１８ｎｍにわ
たる種々のエンベロープおよび非エンベロープウイルス
の除去のために有効であった。この研究は、３５ｎｍよ
り大きいすべてのウイルスの完全な減少（検出アッセイ
限界までの）を示した。興味あることに、ＥＭＣおよび
ＨＡＶのような比較的小さいウイルスさえもが、この濾
過方法によって少なくとも部分的に除去された。

【０００６】これらの研究は、生物学的調製物からのウ
イルスの除去のためのナノフィルトレーションの使用を
もたらした。しかしながら、溶媒−洗剤法（脂質コート
されたウイルスの不活化のための）、ならびにナノフィ
ルトレーション除去（サイズ排除、したがって脂質コー
トされていないウイルスの除去のための）による両ウイ
ルス不活化を組み合わせることが望ましい場合には、ナ
ノフィルトレーション段階は、特に溶媒−洗剤が、油抽
出およびＣ−１８逆相樹脂によって除去されるべきであ
る溶媒−洗剤利用を進行させねばならないことが発見さ
れた。この理由は、溶媒−洗剤の抽出後には、小油滴の
痕跡物、ならびに樹脂の親水性部分に結合している溶媒
−洗剤の残渣が常に存在するからであった。さらにま
た、生物学的調製物から精製される若干のタンパク質
は、精製工程の間に改変されることがあり、そして改変
されたタンパク質は、改変されたタンパク質の疎水性が
変化するダイマーおよびポリマーを形成する可能性があ
る。これらの油滴の痕跡物、タンパク質ダイマーの凝集
体および油とタンパク質残渣の混合物は、ナノフィルタ
ーの小さい孔をふさぎ、その結果、濾過の時間を増加
し、高価なフィルターの高頻度の交換を必要とし、そし
て一般に、生産物の収率を減少させがちである。

【０００７】ナノフィルターを詰まらせる傾向にある油
滴の残渣（汚染物）は、分子排除のクロマトグラフィー
メカニズムか、または疎水性クロマトグラフィーのいず
れかを使用することによって除去された。しかしなが
ら、溶媒洗剤の除去のための慣用法のどれも、溶媒洗剤
によって惹起されるダイマー形成もしくは凝集の問題の
処理に、未まだ、向けられておらず、そしてこの問題
は、未まだ、残されたままである。生物学的な液状調製
物、例えば免疫グロブリン調製物からの溶媒−洗剤の除
去は、一般に、ゲルクロマトグラフィーを使用すること
によって実施される。米国特許第５，０９４，９６０号
および同第５，６４８，４７２号は、ゲル逆相（疎水
性）クロマトグラフィーを使用しない、免疫グロブリン
調製物からの溶媒−洗剤の除去に関する。

【０００８】２つの他の特許は、溶媒洗剤の除去が、液
状ＩＶＩｇ生産物の安定性に影響することを指摘してい
る方法に与えられた（米国特許第５，０９４，９６０
号、同第４，７８９，５４５号および同第５，６４８，
４７２号）。Ｇ．ＷｅｒｎｅｒａｎｄＰ．Ｓｅｌｏｓ
ｓｅ（米国特許第５，６４８，４７２号）は、ＴｎＢＰ
および／またはＴｒｉｔｏｎＸ１００による免疫グロブ
リンの処理と、それに続く生物学的に適合しうる植物油
を用いる抽出を含み、この場合、ＴｎＢＰおよび／また
はＴｒｉｔｏｎＸ１００および植物油が、続いて、疎水
性材料における固相抽出によって除去される、静脈内適
用に適するエンベロープ・ウイルスを不活化された免疫
グロブリン液を調製する方法を記している。これは、Ｉ
ＶＩｇの植物油抽出と、それに続く疎水性カラムを通す
クロマトグラフィーの組み合わせが、高い温度において
さえも、免疫グロブリンの非常に安定な液状溶液を生産
することを示した。この特許は、ＩＶＩｇ調製物が、２
つの先行特許にしたがって調製されることを特許請求し
ている：Ｂｏｎｏｍｏ，１９９２（米国特許第５，０９
４，９６０号）は、固相抽出および好適な樹脂としての
ＷａｔｅｒｓＩｎｃ．製ＢｕｌｋＣ−１８充填物の
使用を教示している。Ｗｏｏｄｓ，１９８６（米国特許
第４，７８９，５４５号）は、天然に存在する油による
溶媒洗剤の除去を特徴とするが、この方法によって得ら
れる生産物は、静脈内免疫グロブリンの不安定な調製物
をもたらした。

【０００９】Ｇｕｅｒｒｉｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ６６４：１１９
−１２５（１９９５））は、ウイルスを不活化された生
物液から溶媒−洗剤混合物を除去することを意図する特
定の吸着剤（ｓｏｒｂｅｎｔ）を記述している。溶媒−
洗剤除去性（ＳＤＲ）ＨｙｐｅｒＤ吸着剤は、Ｂｉｏｓ
ｅｐｒａ（Ｃｅｒｏｙ−Ｓａｉｎｔ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐ
ｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって供給されている。このク
ロマトグラフィー充填物は、細孔容積が、３次元架橋さ
れた疎水性アクリル酸ポリマーにより満たされたシリカ
ビーズから作成された。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、最初に、溶
媒−洗剤によって調製物を処理し、この後、溶媒−洗剤
を、植物油の使用による抽出を、固相抽出（具体的に
は、米国特許第５，６４８，４７２号により推奨されて
いるようなＢｕｌｋＣ１８を用いる）と組み合わせ、ま
たは組み合わすことなく行うことを含む、生物調製物中
に存在するウイルスの不活化方法が、Ｐｌａｎｏｖａ^TM
Ｆｉｌｔｅｒ３５ｎｍを通過させることが非常に困難で
あった免疫グロブリン液状調製物をもたらすという発見
に基づいている。かくして、そのような操作はウイルス
の有効な不活化のために不適当であるということが、明
確に理解された。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、驚くべ
きことに、溶媒−洗剤処理と、それに続くＢｉｏｓｅｐ
ｒａ製ＳＤＲＨｙｐｅｒＤを利用するクロマトグラフ
ィーの組み合わせが、高い流速においてＩＶＩｇのＰｌ
ａｎｏｖａＦｉｌｔｅｒ３５ｎｍの通過を可能にし、
そして非常に高い収率を特徴としながら、活性ウイルス
を欠く液状調製物をもたらすことが発見された。本発明
によれば、さらに、免疫グロブリンのダイマー形成の問
題は、ナノフィルトレーション段階前にｐＨを４．０に
低下させることによって部分的に解決できることが見い
出された。

【００１２】かくして、本発明は、（ｉ）生物学的な液状調製物を、脂質コートされたウイ
ルスを不活化するのに十分である濃度および条件下で溶
媒−洗剤組み合わせ物と接触させ；（ｉｉ）（ａ）において得られた液状調製物を、細孔容
積が３次元架橋された疎水性アクリル酸ポリマーで充填
されているシリカビーズからなるクロマトグラフィー充
填物上を通過させることによって、その液状調製物から
溶媒−洗剤痕跡物を除去し；そして（ｉｉｉ）段階（ｂ）の液状生産物を、孔径範囲約１５
ｎｍ〜約７０ｎｍをもつフィルターを通過させる：段階を含んでなる液状調製物中に存在するウイルスの不
活化方法に関する。

【００１３】段階（ａ）の後、油のような疎水性組成
物、例えば生物学的に適合しうる植物油による溶媒−洗
剤の抽出の段階が場合によって存在してもよい。かくし
て、また、段階（ｂ）にけるクロマトグラフィー充填物
の除去は、油痕跡物および油関連不純物の除去において
有用である。

【００１４】用語「ウイルスを不活化する」は、ウイル
スが、溶液中に維持されているが、生存不可能にされて
いる（例えば、それらの脂質コートを溶解することによ
って）状況、ならびに液状調製物からのウイルスの物理
的除去（例えば、サイズ排除によって）の両方を指す。
かくして、本発明の文脈上、この用語は、ウイルス破壊
およびウイルス除去の両方を指す。

【００１５】用語「生物学的な液状調製物（ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌｌｉｑｕｉｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ）」は、生物起源から得られたすべての種類の液状調
製物を指す。これは、典型的には、体液、例えば血液、
血漿および尿から得られた調製物、ならびに調製物中に
細胞によって分泌された生物学的な物質を含有するか、
または本来、細胞内に存在していて、種々の操作、例え
ば細胞の溶解により液状調製物に放出された物質を含有
する、細胞培養物から得られる液体を含む。

【００１６】ウイルス不活化の方法は、本発明によれ
ば、多数の実用、例えば：免疫グロブリン、ＶＩＩＩ因
子、アルブミン、α１抗トリプシン、ＩＸ因子、ＸＩ因
子、ＰＰＳＢ、フィブリノーゲン、およびトロンビン
（プロトロンビン）およびその他を含む、種々のタンパ
ク質の単離；細胞培養物からの遺伝的に工作されたタン
パク質の単離；ホルモン、成長因子、酵素、凝血因子、
レセプターおよびその他の生物学的に活性なコポリマー
等の単離、のために使用されてもよい。

【００１７】本発明の好適な実施態様によれば、生物学
的な液状調製物は、精製されるべきものとしての免疫グ
ロブリンを単離することが意図されており、そして該調
製物は血漿分画からのペーストＩＩ（ＰａｓｔｅＩ
Ｉ）を水中に再懸濁し、その調製物のｐＨを調整し、そ
して限外濾過し、そして得られる生産物を、所望のタン
パク質濃度を得るためにメンブランフィルターを使用し
てダイアフィルトレーションすることによって得られ
る。

【００１８】脂質コートされたウイルスを不活化させる
べく使用される溶媒−洗剤組み合わせ物は、ＴｎＢＰと
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｔｗｅｅｎ８０とコール酸ナ
トリウム、およびその他のような当該技術分野において
既知のいかなる溶媒−洗剤組み合わせ物であってもよ
い。溶媒洗剤の濃度は、当該技術分野において通常使用
される濃度、例えば、＞０．１％ＴｎＢＰと＞０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００であるべきである。典型的に
は、溶媒−洗剤がウイルスを不活化する条件は、ｐＨレ
ベル範囲５〜８における溶媒洗剤１０〜１００ｍｇ／ｍ
ｌ、および温度範囲２〜３７℃において３０分〜２４時
間からなる。しかしながら、他の溶媒洗剤組み合わせ物
および適当な条件が、当該技術分野において熟達したす
べての人にとって明らかであろう。

【００１９】溶媒−洗剤処理を遂行した後、溶媒−洗剤
の大部分は、ＳＤＲ樹脂（溶媒−洗剤除去）の使用によ
って除去されるが、これは、細孔容積が、３次元架橋さ
れた疎水性アクリル酸ポリマーにより充填されているシ
リカビーズからなるクロマトグラフィー充填物である。
そのようなＳＤＲの例は、Ｂｉｏｓｅｐｒａによって供
給されるＨｙｐｅｒＤ樹脂である。

【００２０】次いで、得られる調製物は、孔径７０ｎｍ
未満、好ましくは１５〜５０ｎｍをもつナノフィルター
を通過させられる。正確な孔径は、液状調製物中に維持
されねばならないタンパク質、およびサイズ排除によっ
て除去されねばならないウイルスのサイズにしたがって
決定されるべきである。

【００２１】本発明の方法は、ナノフィルトレーション
段階が、溶媒洗剤による処理に先行する他のウイルス不
活化方法を超える次の長所をもつ：（１）フィルターの細孔に付着するウイルス量は、比較
的小さく（若干のウイルスが溶媒−洗剤処理によって除
去されるので）、その結果、操作の費用のかかる部分で
あるフィルターの交換が減少される。

【００２２】（２）液状調製物は、溶媒−洗剤およびＳ
ＤＲ抽出（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）により処理された後
では、このナノフィルトレーション段階が方法の第１段
階として実施されたよりもはるかに素早くナノフィルタ
ーを通過するので、操作の時間経過が減少される。

【００２３】（３）生産の間のフィルターの目詰まり
は、通常、収率における有意な減少をもたらした。本発
明の収率は、約９７〜１００％である。

【００２４】（４）ＳＤＲ樹脂の疎水性充填は、免疫グ
ロブリン溶液におけるダイマーの濃度を減少させる。免
疫グロブリンが、そのダイマーを一旦枯渇されると、低
いｐＨレベルが分子にさらなる負電荷を付与し、これ
が、次に互いに反発することによって、新しいダイマー
形成の割合を低下する。

【００２５】調製物が免疫グロブリン調製物である場合
のダイマー形成問題は、ｐＨレベルをｐＨ５以下に低下
することによって部分的に解決される。

【００２６】

【実施例】実施例１：免疫グロブリン調製物中のウイル
スの不活化Ｃｏｈｎ分画法によって血漿から調製されたペーストＩ
Ｉが、１８時間水中に再懸濁された；ｐＨは、ＨＣｌの
添加によって４．６に調整された。得られる溶液は、３
０，０００ＫＦｉｌｔｒｏｎメンブランフィルターを
用いて限外濾過／ダイアフィルトレーション処理され
て、タンパク質濃度９０ｍｇ／ｍｌを得た。ｐＨが５．
３に調整され、そして０．３％ＴｎＢＰおよび１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００がその溶液に添加された。得られた
懸濁液は、６℃で４時間インキュベートされた。次い
で、懸濁液は、２つのサブプロセスに分けてかけられ
た。１つの懸濁液は、最初に、トウゴマ油によって抽出
され、続いてＷａｔｅｒｓ製ＢｕｌｋＣ−１８樹脂に
おいてクロマトグラフィーにかけられ、そして第２のサ
ンプルは、ＢｉｏｓｅｐｒａＳＤＲＨｙｐｅｒＤ樹脂
によるクロマトグラフィーにかけられた（前以ての油抽
出なしに）。

【００２７】次いで、各溶液３００ｍｌが、０．２μ酢
酸セルロースフィルターを通して濾過された。次いで、
両溶液が、３５ＮＰｌａｎｏｖａフィルターを通過する
その性能について試験された。試験は図１に示したよう
に計画された。

【００２８】タンパク質溶液３００〜３５０ｍｌが加圧
容器に入れられた。圧力は、加圧窒素ガスの大貯蔵器に
よって供給された。この貯蔵器は、窒素シリンダーから
必要に応じて充填された。加圧容器内の圧力を増加させ
ることによって、タンパク質溶液は、０．２μプレフィ
ルターのセットと、それに続く７５ＮのＰｌａｎｏｖａ
プレフィルターを通して流出した。

【００２９】Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎは、フィルターセッ
トの末端に接続され、これは、また圧力ゲージに接続さ
れた。圧力は、３５Ｎフィルターでは１０ＰＳＩに、そ
して７５Ｎフィルターでは１１〜１２ＰＳＩにおいて一
定に保たれた。したがって、この一定圧力下で、フィル
ターの部分的目詰まりがあれば、フィルターを通しての
タンパク質溶液の流速は急速に減少する。２種のＰｌａ
ｎｏｖａフィルター（７５Ｎおよび３５Ｎ）前の圧力
が、全濾過の間モニターされた。しかしながら、流速
は、３５Ｎフィルターを通過する５０ｍｌ毎について平
均化された。濾過は、平均流速が初発流速の５０％以下
のレベルに達した時に停止された。この種の閾値は、フ
ィルター細孔の５０％がふさがれた速度を表す。図１か
ら分かるように、この閾値後の測定はいくらか誤差が多
いけれども、この種類の溶液についての速度は、ほぼ直
線である。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【表２】

【００３２】表１および２に示されるように、初発流速
は、Ｃ−１８樹脂を用いる場合に、より低かった（０．
９対１．１６ｍｌ／ｍｉｎ）。さらにまた、流速は、よ
り速やかに減少し、その結果、濾過容量は、ＳＤＲと比
べてＣ−１８樹脂を用いる場合は、より低かった。

【００３３】図２および表３〜４において分かるよう
に、Ｓ／Ｄが、油抽出と、それに続くＣ−１８クロマト
グラフィー処理によって除去された場合の生産物より
も、ＳＤＲによってクロマトグラフィー処理された生産
物において、５０％閾値に達するまでの濾過物の堆積量
は、少なくとも２倍早く、そして容量は２倍高かった。

【００３４】これは、ＳＤＲカラムクロマトグラフィー
によってＩｇＧ溶液からダイマー、ポリマーおよび凝集
体が除去されたためである。

【００３５】実験室規模の実験では、ＳＤ段階について
の種々の条件が検討された：ｐＨ、Ｓ／Ｄ濃度、温度お
よびインキュベーション時間の長さが検討され、そして
サンプルがＳＤＲカラムにおいてクロマトグラフィー処
理された。次（表３）は、種々の条件におけるＳＤＲ前
後において、ＩｇＧサンプル中のモノマー、ダイマーお
よび凝集体のパーセンテージの４並列試行の平均値を示
す。

【００３６】結果は、ＳＤＲカラム後には、ダイマーの
有意な減少および凝集体（ポリマー）の増加は極めてわ
ずかであることを示している。凝集体（ポリマー）の増
加は、使用されたＳＤ条件とは独立の、標準誤差もしく
は分析アッセイによるものである。

【００３７】

【表３】

【００３８】実施例２：Ｓ／Ｄが除去された液状調製物実施例１と同じサンプル調製操作が使用されたが、この
実施例では、溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）が油抽出およびカラム
クロマトグラフィーによって除去されたサンプルは、完
全生産バッチから回収された。また、Ｓ／ＤがＳＤＲに
おけるクロマトグラフィーによって除去されたサンプル
も、同じバッチから回収されたが早期段階（Ｓ／Ｄ不活
化後の）で回収され、そしてクロマトグラフィーは、よ
り小スケールで実施された。濾過工程を促進するため
に、両溶液の温度は３０℃まで上昇され、そして両方と
も、４５ｍｇ／ｍｌのタンパク質に調整された。

【００３９】

【表４】

【００４０】

【表５】

【００４１】実施例３：ナノフィルトレーションの効果材料は、実施例２と同様に調製された。１つは、３５Ｎ
Ｐｌａｎｏｖａフィルターの使用によるウイルス除去に
関して試験された。ｐＨ４．０におけるＩｇＧ溶液４５
ｍｇ／ｍｌが、ＨＩＶ−１，ＰＲＶ，ＢＶＤＶ，ＨＡＶ
もしくはＭＶＭによりスパイク（ｓｐｉｋｅ）された。
１０⁷〜１０⁹ＰＦＵ／ｍｌ以上の最終濃度を得るため
に、すべてのウイルスは超遠心によって沈降され、そし
て少量の水もしくは血清不含バッファー中に再懸濁され
た。

【００４２】出発材料のｐＨ４．０±０．１および濾過
条件（３７±１℃）のために、この溶液の潜在的殺ウイ
ルス効果の検討が、Ｐｌａｎｏｖａフィルターによるナ
ノフィルトレーションの研究前に、ＢＶＤＶに関して３
５±１℃において評価された。実験中に得られた結果
は、ｐＨ＝４．０における出発材料において、インキュ
ベーション８時間後に非常に低い不活化レベル（１．０
１ｌｏｇ）を示した。同じ結果が、ＭＶＭおよびＨＡ
Ｖによっても得られた。他方、同じ条件において、イン
キュベーション６時間後のＨＩＶおよびＰＲＶは、それ
ぞれ５．０３および５．２２ｌｏｇ低下ファクターを
示した。

【００４３】スパイキング実験は、規模を縮小した条件
にしたがって２並列で実施された。大きいウイルスの濾
過中に生じた７５Ｎフィルターの早期目詰まりのため
に、３種の置換可能なＰｌａｎｏｖａ７５Ｎ、０．１お
よび０．２μＭフィルターの特定のセットが設置された
（図１）。３５Ｎフィルターにおける圧力は、一定に
０．７ｂａｒに調整された。濾液が収集され、そして残
留ウイルスが、最大のウイルス回収率のために超遠心さ
れた。

【００４４】次の表は、３５Ｎを通し、そして上記条
件、例えば３５±１℃およびｐＨ＝４．０におけるイン
キュベーションにおけるナノフィルトレーション、およ
びプレフィルターの使用の結果として、モデル・ウイル
スのウイルスタイター低下ファクターに関するものであ
る。

【００４５】

【表６】

【００４６】この特定の段階は、タンパク質濃度を低下
させないだけでなく、また免疫グロブリンの特性、例え
ばＦｃ機能、抗補体活性（ＡＣＡ）を変化させず、そし
てＨＰＬＣによって試験されるように分子の完全な形は
維持されていた。

【００４７】実施例４：フィブリノーゲン調製物におけ
るＳ／Ｄ除去後のナノフィルトレーションビタミンＫ依存性プロテアーゼを枯渇するためのＡｌｈ
ｙｄｒｏｇｅｌ吸着後、ｐＨ７．５において再懸濁され
た凍結沈降物が、１％ＴｎＢＰおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００の溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）混合物を用いるウイ
ルス不活化にかけられた。混合液は３０℃で４時間イン
キュベートされた。次いで、Ｓ／Ｄ混合物が、ひまし油
と、それに続くＷａｔｅｒｓ製ＢｕｌｋＣ−１８樹脂に
おけるクロマトグラフィーによって除去されるか、また
は前以ての油抽出なしにＢｉｏｓｐｒａ製ＳＤＲｈｙ
ｐｅｒＤ樹脂におけるクロマトグラフィーによって除去
された。次いで、両サンプルは、実施例１におけると同
じ濾過工程を通して濾過され、そして１０ｍｌ毎に流速
がモニターされた。結果が、表６および７に示される。

【００４８】

【表７】

【００４９】

【表８】

【００５０】表６および７において示されるように、た
とえ、初発流速が両樹脂において類似していても、流速
は、油抽出（Ｃ−１８）の組み合わせを用いた場合は、
より速やかに減少し、その結果、濾過容量は、ＳＤＲを
用いた場合の濾過容量（６５ｍｌ）と比較するとＣ−１
８樹脂を用いた場合には、より低かった（３５ｍｌ）。

【図面の簡単な説明】

【図１】ナノフィルターを通過する堆積濾過物の関数と
して、流速の低下を表すことによって、ナノフィルター
ブロッキングの比率を示すグラフである。２つの起源の
免疫グロブリン溶液４５ｍｇ／ｍｌが、この実験では使
用された（すなわち、溶媒洗剤が、油抽出と、それに続
くＣ−１８でのクロマトグラフィーによって除去された
ＩＶＩｇ溶液と、溶媒洗剤が、ＳＤＲのみによって除去
されたＩＶＩｇ溶液である。）

【図２】３５Ｎナノフィルターを通過する堆積濾過物の
濾過時間に及ぼす溶媒除去の効果を示すグラフである。
昇温（３７℃）した場合、流速は、溶媒洗剤除去のため
の両方法において若干早くなる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リリアナ・バルイスラエル・76247レホボト・メヌチヤベナチヤラ49／13 Ｆターム(参考） 4B065 AA95X BA30 BD13 BD18 BD25 BD29 BD31 BD40 CA45 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）生物学的な液状調製物を、脂質コ
ートされたウイルスを不活化するのに十分である濃度お
よび条件下で、溶媒−洗剤組み合わせ物により処理し；（ｉｉ）（ａ）において得られた液状調製物を、細孔容
積が３次元架橋された疎水性アクリル酸ポリマーで充填
されているシリカビーズからなるクロマトグラフィー充
填物を通過させることによって、その液状調製物から溶
媒−洗剤試薬を除去し；そして（ｉｉｉ）段階（ｂ）の液状生産物を、孔径約１５ｎｍ
〜約７０ｎｍをもつフィルターを通過させる：段階を含んでなる生物学的な液状調製物中に存在するウ
イルスの不活化方法。
【請求項２】クロマトグラフィー充填物が、ＳＤＲ
ＨｙｐｅｒＤ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）である、請求項１記
載の方法。
【請求項３】段階（ａ）の後に、（ａ１）溶媒−洗剤
組み合わせ物を疎水性成分によって抽出することを含ん
でなる段階（ａ１）が存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】疎水性成分が生物学的に適合しうる植物
油である、請求項３記載の方法。
【請求項５】溶媒−洗剤組み合わせ物が、ＴｎＢＰ；
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｔｗｅｅｎ８０およびコール
酸ナトリウムからなる群から選ばれる薬剤の少なくとも
１種を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】液状調製物がヒト血漿から得られる、請
求項１記載の方法。
【請求項７】液状調製物がヒト血漿の沈降物から生じ
る、請求項１記載の方法。
【請求項８】沈降物が寒冷沈降物である、請求項９記
載の方法。
【請求項９】沈降物が免疫グロブリンを含有する、請
求項９記載の方法。
【請求項１０】液状調製物が、（ｉ）血漿から免疫グロブリン含有沈降物を得て；（ｉｉ）該沈降物を水中に再懸濁し；（ｉｉｉ）段階（ｂ）において得られた沈降物のｐＨを
調整し；そして（ｉｖ）段階（ｃ）において得られる沈降物を、メンブ
ランフィルターを用いて限外濾過／透析濾過して、所望
のタンパク質濃度を得ること：を含んでなる方法によって得られる調製物である、請求
項１記載の方法。
【請求項１１】段階（ｃ）のｐＨがｐＨ５以下に調整
される、請求項７記載の方法。