ES2224119T3

ES2224119T3 - Purificacion de proteinas dependientes de vitamina k por cromatografia sobre membrana.

Info

Publication number: ES2224119T3
Application number: ES95903324T
Authority: ES
Inventors: Djuro Josic; Ales Strancar
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2014-12-07
Also published as: HU222084B1; DE4342132C1; IL111925A0; CN1137292A; IL111925A; UA44261C2; CZ291708B6; PT733104E; PL314801A1; EP0733104B1; AU1242595A; CZ167096A3; DK0733104T3; DE69434001T2; WO1995016030A1; US20020045240A1; HUT76881A; ZA949820B; DE69434001D1; HU9601594D0

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE AGENTES QUE CONTIENEN COMPONENTES DE PLASMA DEPENDIENTES DE VITAMINA K CON VIRUS INACTIVADOS ASI COMO PROTEINA C, PROTEINA S, FACTORES II, VII, IX Y/O X ASI COMO COMBINACIONES DE LOS MISMOS, COMO, POR EJEMPLO, PREPARACIONES PPSB, EN DONDE UNA FUENTE QUE CONTIENE ESTOS COMPONENTES SE SOMETE A PROCEDIMIENTOS DE SEPARACION ADECUADOS, ESPECIALMENTE UTILIZANDO METODOS DE MEMBRANA CROMATOGRAFICA.

Description

Purificación de proteínas dependientes de la vitamina K por cromatografía sobre membrana.

El tema sujeto de la presente invención es un proceso para preparar agentes que contienen factores IX y/o X desactivados de virus procedentes de una fuente que contiene estos componentes.

Los componentes del plasma dependientes de la vitamina K tales como la proteína C, la proteína S, los factores II, VII, IX y X, son constituyentes que están presentes en el plasma sanguíneo y que juegan un papel importante en la patofisiología de la cascada de coagulación de sangre. Estos factores son empleados como medicamentos en la terapia de pacientes que presentan síntomas causados por una deficiencia respectiva en estos factores.

Hoy día, no se dispones de plasma sanguíneo en cualquier cantidad deseada como fuente de una recuperación comercial de los factores. Por tanto, por razones tanto éticas como económicas la meta de cualquier fraccionamiento y aislamiento de los factores IX y/o X debe ser asegurar un rendimiento tan elevado como sea posible para cada factor por sí solo, por un lado, y, por otro lado, al mismo tiempo también debe permitir un aislamiento de cada uno de los otros factores. El objetivo de la invención es proporcionar un proceso capaz de alcanzar dicha meta.

El objetivo expuesto es alcanzado mediante el proceso de acuerdo con la invención que comprende las características establecidas en la reivindicación 1.

En el proceso de acuerdo con la invención, el uso de cromatografía de membrana juega un papel importante. Josic y col., en Journal of Chromatography, 632 (1993), 1-10, describen la adecuabilidad de la cromatografía de afinidad de heparina para aislar proteínas de plasma a partir de la cascada de coagulación de la sangre. Se describe el aislamiento de antitrombina III y la separación del factor IX y del factor X después de una separación preliminar mediante cromatografía aniónica. La cromatografía de intercambio aniónico para una separación preliminar del factor IX y del factor X es llevada a cabo mediante HPLC preparativa. El enriquecimiento de las muestras que contienen el factor IX y el factor X se lleva a cabo de acuerdo con H. G. J. Brummelhuis, en J. M. Curling (Editor), "Methods of Plasma Protein Fractionation", Academia Press, London, Orlando, 1980, pág. 117.

La cromatografía de membrana de alta eficacia de las proteínas de membrana de suero y de plasma ya era conocida por Josic y col., Journal of Chromatography, 590 (1992), 59-76. La separación de las proteínas de membrana de suero y de plasma se ha descrito aquí. Por ejemplo, se separaron proteínas de membrana de plasma procedente de tejidos de hígado y de riñón.

Sorprendentemente, se ha demostrado que los ingredientes de plasma dependiente de la vitamina K valiosos, los factores IX y X, pueden ser obtenidos con una elevada pureza y un alto rendimiento mediante el proceso descrito aquí a continuación.

En una primera etapa, las fuentes que contienen los respectivos componentes de plasma dependientes de la vitamina K, fuentes que son empleadas preferiblemente a partir de plasma sanguíneo en estado fresco o congelado, son sometidas a una extracción en fase sólida sobre materiales de intercambio aniónico. El material de intercambio aniónico puede emplearse en la forma de material particulado, dispuesto en membranas o en la forma de discos compactos. Se prefiere la extracción en fase sólida sobre polisacáridos que han sido modificados con grupos básicos y que, opcionalmente, han sido reticulados. Más específicamente; se pueden usar materiales tales como polisacáridos modificados con grupos dietilaminoetilo (DEAE) o con aminas cuaternarias. De este modo, por ejemplo, se pueden emplear materiales tales como el Sephadex® P 50. Más particularmente, se usan materiales de separación modificados con DEAE para la separación del factor IX. En la extracción en fase sólida, la fuente que ha de ser extraída se mezcla con el material que está presente en estado sólido.

La extracción en fase sólida se lleva a cabo en condiciones de baja fuerza iónica. Después de las etapas de lavado, que se llevan a cabo de forma opcional, el efluente es recogido y a continuación puede ser sometido a otras etapas de procesado.

De este modo, con el objetivo de separar factor IX, la muestra es filtrada preferiblemente a través de una membrana modificada de forma apropiada. A continuación, opcionalmente, se puede seguir utilizando el filtrado por ejemplo para la producción de albúmina.

Las proteínas unidas a la membrana o al respectivo material en fase sólida, el factor IX y el factor X, son posteriormente eluidos de la fase sólida en condiciones de una elevada fuerza iónica. Si se usan membranas modificadas con aminas cuaternarias o con DEAE, su múltiple utilidad constituye una ventaja frente a la extracción en fase sólida usando los materiales de extracción en fase sólida mencionados anteriormente, especialmente los materiales particulados.

El material adsorbido sobre la fase sólida es desorbido a continuación del material vehículo mediante la acción de disoluciones que tengan una mayor fuerza iónica. Entonces se adaptará la fuerza iónica de la fracción a las condiciones requeridas para llevar a cabo las posteriores etapas de separación utilizando medidas adecuadas tales como dilución o ultrafiltración o diafiltración o adición de agentes que aumenten la fuerza iónica.

Esto puede ir seguido por una cromatografía de membrana de intercambio de aniones o por una cromatografía de membrana de afinidad usando sustancias inmovilizadas que tengan un peso molecular alto o bajo que presenten una elevada afinidad por los factores IX y/o X.

Como materiales de intercambio aniónico, más particularmente, también deben ser tomadas en consideración aquí membranas modificadas con grupos dietilaminoetilo o con aminas cuaternarias, respectivamente. Las sustancias que presentan una elevada afinidad por los factores IX y/o X pueden ser ligandos de inmunoafinidad. Los ligandos de inmunoafinidad a considerar son anticuerpos dirigidos contra los factores que se van a aislar. Por tanto, para el aislamiento del factor IX, se pueden usar membranas que porten los anticuerpos inmovilizados respectivos contra el factor IX. Las sustancias que no son retenidas por la membrana de intercambio aniónico o por la membrana de inmunoafinidad son eliminadas por lavado, opcionalmente son recogidas y se continúa con su procesado.

Los ligandos típicos de membrana para la cromatografía hidrófoba presentan algunos cambios graduales en la hidrofobicidad. Incluyen, por ejemplo, compuestos alifáticos acíclicos o alicíclicos que tienen, por ejemplo cadenas alquilo C_{1}-C_{18} o compuestos aromáticos que también pueden haber sido modificados con ligandos polares próticos o con ligandos polares apróticos tales como los grupos ciano. Como ligandos hidrófobos adecuados para la cromatografía de interacción hidrófoba deben ser considerados especialmente los grupos propilo, butilo y fenilo mediante los cuales se ha modificado el material vehículo, y ligandos similares que presenten algún cambio gradual en la hidrofobicidad. El cambio gradual en la hidrofobicidad también puede ser llevado a cabo mediante grupos polares. De este modo, más particularmente, los grupos 2-hidroxiaminoalquilo, tales como los grupos 2-hidroxiaminopropilo, son adecuados como ligandos hidrófobos para el aislamiento del factor IX.

La siguiente etapa comprende un fraccionamiento adicional de los componentes del plasma adsorbidos mediante elución paso a paso hasta que se produzca un cambio en la fuerza iónica y/o en el valor de pH con sistemas de disolventes de mayor fuerza iónica, con sistemas de disolventes que tengan diferentes polaridades o con sistemas de disolventes que inviertan la afinidad entre el ligando de inmunoafinidad y el sustrato. Entonces se pueden adoptar los procedimientos mencionados anteriormente para ajustar la fuerza iónica de la fracción que es eluida de la membrana a las condiciones de una mayor purificación.

La Reivindicación 5 comprende una cromatografía de membrana de afinidad. Se entiende que la cromatografía de membrana de afinidad dentro del alcanza del proceso de acuerdo con la invención también incluye cromatografía hidrófoba. Los ligandos apropiados ya han sido caracterizados aquí anteriormente.

La cromatografía de membrana de afinidad dentro del alcance del proceso de acuerdo con la presente invención también se refiere a procedimientos cromatográficos en los que se usan membranas modificadas con ligandos de inmunoafinidad. Aquí, más específicamente, se usan anticuerpos monoclonales contra los factores IX y/o X, anticuerpos monoclonales que han sido inmovilizados sobre la membrana.

Las operaciones de la separación cromatográfica de los factores IX y/o X en la muestra pueden ser llevadas a cabo, por un lado, mediante el uso de materiales sustrato modificados con grupos de intercambio iónico, especialmente intercambiadores aniónicos, o, por otro lado, mediante el uso de materiales modificados con ligandos de inmunoafinidad.

En un modo muy ventajoso dichos materiales cromatográficos se disponen en membranas. Preferiblemente, las membranas consisten en un material sustrato tal como celulosa modificada o una fibra sintética. Más específicamente, son adecuados tanto membranas como discos compactos fabricados con metacrilatos porosos de poliglicidilo y/u otros polímeros hidrófilos porosos que presenten una estructura similar, tales como un poliestireno hidrofilizado.

Una membrana adecuada para la separación consiste en un apilamiento de películas delgadas porosas hechas de celulosa de fibras sintéticas en el primer caso, mientras que en el segundo caso consiste en discos compactos hechos de vehículos de gel de sílice o de polímero. Los materiales sustrato de dichas membranas de discos han sido proporcionados con los grupos intercambiadores de aniones o con los ligandos de inmunoafinidad apropiados. Los grupos de intercambio iónico, más particularmente, pueden ser grupos de intercambio aniónico tales como compuestos de amonio cuaternario o grupos dietilaminoetilo (DEAE). Los intercambiadores catiónicos, básicamente, pueden ser intercambiadores catiónicos débil o fuertemente ácidos tales como materiales modificados con grupos de ácido sulfónico o de ácido fosfórico.

Los grupos de intercambio iónico pueden o no haber sido unidos a la fibra del material sustrato a través de un así llamado espaciador. Los materiales provistos con espaciadores también se denominan materiales tentáculo. Los espaciadores y los ligandos adecuados han sido especificados en el documento DE 42 04 694. Un resto glucosoamino, por ejemplo, también puede servir como espaciador. Los grupos de intercambio aniónico tales como los DEAE o los compuestos de amonio cuaternario también pueden ser unidos a las membranas hechas de metacrilato poroso de poliglicidilo o de otros materiales mencionados. Los grupos de intercambio aniónico son unidos bien directamente al material que forma la membrana o bien a través de un espaciador, por ejemplo, un resto de glucosoamina.

En otra realización del proceso de acuerdo con la invención, se usa una cromatografía de membrana de afinidad que utiliza sustancias de bajo o de alto peso molecular inmovilizadas que tienen una elevada afinidad por los factores IX y/o X, que preferiblemente son de origen humano o de murina.

Las sustancias que poseen afinidad por los factores IX y/o X son inmovilizadas sobre el vehículo por medio de grupos químicamente activos. Es preferible que el grupo activo no ataque directamente al material vehículo, sino que ataque al extremo de un espaciador. La inmovilización de las sustancias que presentan afinidad por los factores se lleva a cabo enlazando los mismos a grupos activos tales como tosilo, tresilo, hidracida y otras. Los procedimientos apropiados se han obtenido en T. M. Phillips, "Affinity Chromatography", en "Chromatography" (E. Heftmann, Ed.), 5ª Edición, Elsevier, Ámsterdam 1992.

Los anticuerpos también pueden ser adsorbidos preliminarmente sobre membranas que porten ligandos de proteína A o de proteína G. La elución de los anticuerpos (sangrado de la columna) se puede evitar mediante un reticulado covalente posterior de la columna. Para reticular los anticuerpos con las membranas de proteína A o de proteína G, se puede emplear un proceso similar al que usa vehículos sueltos. La ventaja de inmovilizar sobre proteína A o sobre proteína G consiste en que los anticuerpos son inmovilizados exclusivamente sobre el segmento constante de la molécula (F_{G}). Por lo tanto, la porción de unión del antígeno (F_{ab}) permanece libre y no es inhibida en su interacción con los respectivos factores.

La desactivación de virus se realiza tratando la fracción obtenida después de una purificación cromatográfica con detergentes tales como tensioactivos iónicos y/o no iónicos, por ejemplo en presencia de compuestos de fosfato di o trialquilado, tales como, por ejemplo, fosfato de tri-n-butilo, de acuerdo con el método descrito en el documento EP 0 131 740 A1. Básicamente, la desactivación de virus también se puede llevar a cabo antes de la primera etapa cromatográfica. Se prefiere que se use Triton® X-100 Tween/TNBP (fosfato de tri-n-butilo) para la desactivación de virus. También se obtienen buenos resultados con clorato de sodio/TNBP. Preferiblemente, se usan cantidades de hasta el 15% en peso detergente.

Sin embargo, la desactivación de virus también se puede realizar mediante un tratamiento térmico. En este procedimiento, después de una primera cromatografía de membrana, los componentes del plasma dependientes de la vitamina K, así como de la vitamina C y de la proteína S, son sometidos a una etapa de pasteurización. En la solicitud de patente alemana P 43 18 435.9 se propone un proceso apropiado. En ella, se ponen en contacto fracciones enriquecidas con factor VIII con fosfatos de di y trialquilo, y, opcionalmente, con agentes humectantes en presencia de estabilizantes tales como azúcares, aminoácidos, cationes divalentes y/o heparina y, al mismo tiempo o posteriormente, son tratadas a temperaturas moderadamente elevadas dentro del intervalo entre 55ºC y 70ºC durante un periodo de tiempo de entre 5 horas y 30 horas. Si se desea, también se puede llevar a cabo una filtración para eliminar los virus.

Puede ser ventajoso combinar los dos métodos de desactivación de virus, el tratamiento con detergentes y con calor así como la filtración.

En el aislamiento del factor IX, la etapa de pasteurización se lleva a cabo preferiblemente justo después de la reivindicación 5. Esta puede ir seguida de otra cromatografía de membrana para eliminar los productos químicos usados en dicha etapa. Se prefiere que los estabilizantes sean eliminados mediante el uso de una membrana modificada con DEAE o con compuestos de amonio cuaternario posicionados sobre la superficie del material vehículo cromatográfico a través de un espaciador. También es posible posicionar los correspondientes ligandos sobre la superficie del material vehículo cromatográfico sin usar un espaciador.

Bajo las condiciones elegidas, los estabilizantes no son retardados por este material intercambiador de aniones, mientras que los factores son adsorbidos sobre el material cromatográfico.

Los estabilizantes, que en general consisten en sustancias de bajo peso molecular, también pueden ser eliminados mediante ultra o diafiltración. A continuación las fracciones resultantes acumuladas con los factores IX y/o X son concentradas, si así se desea. Los métodos de concentración que se ofrecen son procedimientos que incluyen la eliminación del disolvente, normalmente agua, en condiciones suaves. Incluyen, más específicamente, procedimientos en los que se elimina el disolvente a presión reducida, tal como, por ejemplo, liofilización (secado en congelación) o secado por atomización.

La utilización de cromatografía de membrana en el proceso de acuerdo con la invención, más particularmente, implica la ventaja de que la separación cromatográfica puede ser llevada a cabo considerablemente más rápido. Además, las membranas que se van a utilizar pueden ser reutilizadas multitud de veces. Por el contrario, si se usa el material de fase sólida de acuerdo con la técnica anterior, este material no puede ser reutilizado, sino que ya habrá de ser retirado después de ser usado una vez.

El proceso de acuerdo con la invención es ilustrado en más detalle mediante el aislamiento del factor IX.

Ejemplo 1

Se somete plasma sanguíneo congelado a una extracción en fase sólida con Sephadex® P 50. Después de la elución de la sustancia adsorbida sobre la fase sólida, la fracción resultante es ajustada para tener una fuerza iónica que se corresponde con de 10 a 20 mM de citrato de sodio a pH 7,4, y es sometida a una cromatografía de membrana en un DEAE QuickDisk (diámetro de 25 mm, espesor de 3 mm). La presión es aproximadamente 3 bares. A continuación, se lleva a cabo la cromatografía con un caudal de 5 ml/min. La fracción reunida contiene una mezcla de factor II y factor VII y puede ser sometida a procesado adicional. El pico que eluye a continuación de la columna contiene una mezcla del factor IX y del factor X. Se lleva a cabo la cromatografía de membrana empleando un gradiente que cambia desde dicha disolución tampón inicial hasta una disolución tampón que comprende 1 M de NaCl así como entre 10 y 20 mM de citrato de sodio de pH 7,4 como disolución tampón B. Si se va a usar un intercambiador aniónico fuerte que tiene una elevada ocupación superficial de ligandos, se alcanzará una mayor capacidad. Algún factor limitante viene dado por la selectividad del material. El curso del gradiente de elución dependerá del grado de ocupación superficial de ligandos sobre el vehículo.

La mezcla que comprende el factor IX y el factor X es sometida a continuación a una cromatografía adicional. La capacidad de carga del material cromatográfico de membrana empleado es igual o superior a la del material en forma de partículas, ambos en base a la cantidad de material.

Ejemplo 2

La fracción recuperada de acuerdo con el Ejemplo 1 y que contiene el factor IX/X es tratada como en Journal of Chromatography, 632 (1993), 1-10. La fracción que contiene el factor IX/X tal como se obtiene de acuerdo con el Ejemplo 1 es sometida a una cromatografía de membrana de afinidad de heparina sobre un disco compacto. Después de la aplicación de una disolución tampón que tiene baja fuerza iónica, el material es enjuagado con una disolución tampón que tiene una fuerza iónica de aproximadamente 500 mOsm. A continuación, el factor IX es eluido usando un gradiente que comienza a aproximadamente 500 mOsm y que aumenta hasta aproximadamente 1.000 mOsm. El factor IX eluido de este modo tiene una elevada pureza. La tasa de recuperación de factor IX, comenzando desde la primera etapa de procesado, es aproximadamente del 87%.

Claims

1. Un proceso para preparar agentes que contienen factores IX y/o X desactivados de virus, en el que se somete una fuente de estos componentes a las siguientes etapas de procesado:

a): Extracción en fase sólida de las fuentes que contienen los componentes que van a ser separados sobre materiales intercambiadores de aniones, sobre membranas y/o sobre discos compactos en condiciones de baja fuerza iónica, eliminación del efluente resultante;

b): Elución del material adsorbido sobre la fase sólida;

c): Cromatografía de membrana de intercambio aniónico o cromatografía de membrana de afinidad con sustancias inmovilizadas de alto o de bajo peso molecular que poseen una elevada afinidad por los factores IX y/o X;

d): Fraccionamiento de los componentes individuales mediante elución paso a paso cambiando la fuerza iónica, la polaridad y/o el valor de pH;

e): Elución de las sustancias unidas al material de afinidad en condiciones que inviertan el enlace de afinidad, seguida de la concentración del eluato, opcionalmente, reduciendo la cantidad del agente usado para la elución desde el material de afinidad,

en el que la etapa de desactivación de virus se lleva a cabo tratando una fracción obtenida antes de la primera etapa cromatográfica o después de una purificación cromatográfica con detergentes tales como detergentes iónicos y/o no iónicos en presencia de compuestos de fosfato de di o trialquilo, tales como el fosfato de tri-n-butilo.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que el efluente de la etapa a) es suministrado a procedimientos de procesado adicionales para la recuperación de otros materiales.

3. El proceso de la reivindicación 1, en el que el ajuste de la fuerza iónica y/o del valor de pH de la fracción que contiene el eluato a la condición de la siguiente etapa de purificación tiene lugar después de la etapa b) de la reivindicación 1.

4. El proceso de la reivindicación 1, en el que se realiza una cromatografía de afinidad de membrana después de la etapa d).

5. El proceso de la reivindicación 1, en el que se recoge el eluato, que contiene los productos que todavía no han sido eliminados, y opcionalmente su fraccionamiento adicional repitiendo, en el que se usan materiales de afinidad de cromatografía de afinidad de membrana apropiados.

6. El proceso de la reivindicación 1, en el que se realiza un tratamiento térmico para desactivar los virus.

7. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fuente que contiene los factores IX y/o X es plasma sanguíneo en condiciones frescas o congelado.

8. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que la extracción en fase sólida se efectúa por medio de un polisacárido reticulado modificado con grupos básicos, tal como el Sephadex®, o por medio de membranas intercambiadoras de aniones apropiadamente modificadas.

9. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cromatografía de membrana es llevada a cabo usando membranas que han sido modificadas con DEAE o con aminas cuaternarias, o usando membranas que han sido modificadas con ligandos de afinidad de bajo o de alto peso molecular capaces de unirse específicamente a los componentes del plasma deseados (cromatografía de afinidad de membrana).

10. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la cromatografía de afinidad es una cromatografía de afinidad de membrana de heparina, una cromatografía de inmunoafinidad de membrana con anticuerpos inmovilizados contra la sustancia que va a ser aislada, o una cromatografía de afinidad de membrana que usa membranas con ligandos hidrófobos.

11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los ligandos hidrófobos para modificar el vehículo cromatográfico son grupos 2-hidroxiaminoalquilo tales como el 2-hidroxiaminopropilo y/o ligandos hidrófobos tales como los grupos propilo, butilo, fenilo y otros ligandos similares que presentan algún cambio gradual en la hidrofobicidad.

12. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el ajuste de la fuerza iónica después de las etapas cromatográficas se efectúa mediante procesos de dilución o de desalinización tales como la diafiltración o la ultrafiltración, o mediante la adición de agentes que aumentan la fuerza iónica.

13. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la desactivación de virus se efectúa calentando la fracción a entre 55ºC y 70ºC durante un periodo de entre 5 y 30 horas en presencia de estabilizantes tales como azúcar, aminoácidos, cationes divalentes y/o heparina.

14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que se eliminan los estabilizantes mediante procedimientos de desalinización tales como la diafiltración o la ultrafiltración, mediante cromatografía de afinidad de heparina, o mediante cromatografía de intercambio aniónico, o sobre vehículos modificados con DEAE o con compuestos de amonio cuaternario, o vehículos modificados con ligandos hidrófobos.

15. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el material de cromatografía es un material particulado embebido en membranas y/o discos compactos hechos de los materiales respectivos.

16. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las fracciones obtenidas son concentradas mediante liofilización o mediante secado por atomización.

17. El proceso de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el grupo intercambiador de aniones ha sido unido a la fibra del material sustrato a través de espaciadores tales como restos de glucosamina para formar el así llamado material tentáculo.