JPS58101692A - エラスタ−ゼの精製法 - Google Patents
エラスタ−ゼの精製法Info
- Publication number
- JPS58101692A JPS58101692A JP19834381A JP19834381A JPS58101692A JP S58101692 A JPS58101692 A JP S58101692A JP 19834381 A JP19834381 A JP 19834381A JP 19834381 A JP19834381 A JP 19834381A JP S58101692 A JPS58101692 A JP S58101692A
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- JP
- Japan
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- elastase
- antibody
- solution
- insoluble
- alkaline solution
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はエラスターゼの精製方法に関する。
エラスターゼは生体内に広く見出され、特に豚の膵臓中
にその含有′ｉｉは高い。
にその含有′ｉｉは高い。
またエラスターゼは血管等の結合組織に存在する不溶性
峡タンパク質であるエラスチンを分解する唯一の酵素で
あり、動脈硬化のヴら症進展及び組織障害に関与すると
考えられ、近年注目されている。
峡タンパク質であるエラスチンを分解する唯一の酵素で
あり、動脈硬化のヴら症進展及び組織障害に関与すると
考えられ、近年注目されている。
エラスターゼの精製法としては従来硫安分画の後、得ら
れるオイク′ロブリ／Ｉ！！ＩＩ分をさらに結晶化する
方法、陽イオン交換体及び陰イオン交換体ケ用いたイオ
ン交換クロマト等があるが、こｉ］らの方法はエラスタ
ーゼと夾雑蛋白との分離、除来が困姉であり％異性に欠
け、また時間、労ノ〕ヲ要するという欠点を有し、王朶
的Ｖｔ適した方法とは思われない。
れるオイク′ロブリ／Ｉ！！ＩＩ分をさらに結晶化する
方法、陽イオン交換体及び陰イオン交換体ケ用いたイオ
ン交換クロマト等があるが、こｉ］らの方法はエラスタ
ーゼと夾雑蛋白との分離、除来が困姉であり％異性に欠
け、また時間、労ノ〕ヲ要するという欠点を有し、王朶
的Ｖｔ適した方法とは思われない。
本発明は抗原−抗体反応の喘異性を利用することにより
、従来方法における欠点を回避、克服し、高純度のエラ
スターゼを高収率に取得するエラスターゼの精製法に関
する。
、従来方法における欠点を回避、克服し、高純度のエラ
スターゼを高収率に取得するエラスターゼの精製法に関
する。
本発明においては１ず目的とする純度のエラスターゼを
動物に免疫することによって得た抗体？不溶性担体と化
学的に共有結合させて、不溶型エラスターゼ抗体を調製
する。
動物に免疫することによって得た抗体？不溶性担体と化
学的に共有結合させて、不溶型エラスターゼ抗体を調製
する。
担体と１７では不活性であり、疎であり、不溶性でおる
担体、例えばアガロース、デキストラン、ポリアクリル
アミド、ガラスピーズ鳴音用いることができ、先の抗体
とは公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型エラス
ターゼ抗体を１製する。
担体、例えばアガロース、デキストラン、ポリアクリル
アミド、ガラスピーズ鳴音用いることができ、先の抗体
とは公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型エラス
ターゼ抗体を１製する。
このような不溶型エラスターゼ抗体に粗製エラスターゼ
滴液をゴ橿用することにより、上記抗体にエラスターゼ
を特異的に吸着せしめたのち、その吸着物を洗浄するこ
とにより不純物を完全に除去し、ついでアルカリ溶液に
よりエラスターゼ比活性することによって高純度なエラ
スターゼ全高収率で得ることができるものである。
滴液をゴ橿用することにより、上記抗体にエラスターゼ
を特異的に吸着せしめたのち、その吸着物を洗浄するこ
とにより不純物を完全に除去し、ついでアルカリ溶液に
よりエラスターゼ比活性することによって高純度なエラ
スターゼ全高収率で得ることができるものである。
本発明によって得られるエラスターゼの純度は原料とし
て用いる粗製エラスターゼ溶液の純度の良し悪しに関係
なく用いた不溶型エラスターゼ抗体の特異性に依存する
。
て用いる粗製エラスターゼ溶液の純度の良し悪しに関係
なく用いた不溶型エラスターゼ抗体の特異性に依存する
。
なお、エラスターゼはアルカリ性側では安定であり、本
発明に用いる溶出液例えば０．２ＭＮａｔＣＯ５溶１
（ＰＨ１１，０−１１，５）中では２５℃、３時間処理
後も９７％以上の活性を残存すなことが明らかになり１
（。
発明に用いる溶出液例えば０．２ＭＮａｔＣＯ５溶１
（ＰＨ１１，０−１１，５）中では２５℃、３時間処理
後も９７％以上の活性を残存すなことが明らかになり１
（。
また、本発明で用いるアルカリ性溶液は不溶性１１Ａ体
−抗体結合に何ら影Ｗを与えず、ＰＨ８（３〕 付近の適当な緩衝液で再生することにより半永久的にく
り返し使用が可能であり、その吸着容重、活性回収率及
び純度に変化はない。
−抗体結合に何ら影Ｗを与えず、ＰＨ８（３〕 付近の適当な緩衝液で再生することにより半永久的にく
り返し使用が可能であり、その吸着容重、活性回収率及
び純度に変化はない。
さらには、その溶離剤は安価でその後の脱塩及び廃棄が
非常に容易である。
非常に容易である。
以上の点より不溶型エラスターゼ抗体による溶離剤とし
てアルカリ性溶液を用いるエラスターゼの精製法は従来
方法に比して非常に優れ′Ｃいるといえる。
てアルカリ性溶液を用いるエラスターゼの精製法は従来
方法に比して非常に優れ′Ｃいるといえる。
次に、実施例を挙げて本発明全説明するが本発明はこれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例１
豚膵臓原末Ｉ ＬＩ ０９’を冷水１０００ ｍｌＫ懸
濁し、約２時間攪拌抽出し５０００回転１０分間達沈し
てエラスターセ抽出液を得た。
濁し、約２時間攪拌抽出し５０００回転１０分間達沈し
てエラスターセ抽出液を得た。
この抽出液全抗エラスターゼ抗体を固定化したセファｏ
−ス（５ｅｐｈａｒｏａｅ） ４ Ｂカラム（５００ｍ
ｌ ）に流下し、吸着させたｉ（１，１５Ｍ（４） −２５によジ脱＃ｉ後、凍結乾燥する。
−ス（５ｅｐｈａｒｏａｅ） ４ Ｂカラム（５００ｍ
ｌ ）に流下し、吸着させたｉ（１，１５Ｍ（４） −２５によジ脱＃ｉ後、凍結乾燥する。
この処理によりエラスターゼ比活性は１１５００単位／
９、又活性回収率Ｆｉ９６．５％であった。
９、又活性回収率Ｆｉ９６．５％であった。
実施例２
豚膵臓原末１００９から実施例１と同様の操作によって
得た抽出液會抗エラスクーゼ抗体を固定化したセファロ
ース４ＢカラムＣ５００ｍ１）に流下し、吸着させたＧ
Ｏ，１５ＭＮａＣ４５含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、
ＰＨ８，０で洗浄後０．１Ｍグリシン−Ｎ ａ ＯＨ緩
衝液、ＰＨ１１，５により溶出し、これをセファデック
ス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ −２５ｉｃより脱塩後
、凍結乾燥する。
得た抽出液會抗エラスクーゼ抗体を固定化したセファロ
ース４ＢカラムＣ５００ｍ１）に流下し、吸着させたＧ
Ｏ，１５ＭＮａＣ４５含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、
ＰＨ８，０で洗浄後０．１Ｍグリシン−Ｎ ａ ＯＨ緩
衝液、ＰＨ１１，５により溶出し、これをセファデック
ス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ −２５ｉｃより脱塩後
、凍結乾燥する。
この処理によってエラスターゼ比活性は１１０旧）単位
／９、又活性回収率は８６．０％であった。
／９、又活性回収率は８６．０％であった。
実施例３
豚生Ｋｆ臓５ （ｌ ０９をミンチ、水１５００ｄを加
え自己消化させて抽出する。この抽出液を濾過して謔液
倉得た。
え自己消化させて抽出する。この抽出液を濾過して謔液
倉得た。
この抽出液會抗エラスターゼ抗ｎｔ固定化したセファロ
ース４Ｂカラム（５００ｔｎｌ ）に流下し、吸ｓｇせ
た後、０．１５ Ｍ ＮａＣ，ｅｋ含む帆ＩＭリン醜塩
緩衝液、１）Ｈ８，Ｏで洗浄体、０゜２ＭＮａ、Ｃ０ｇ
浴液で浴出し、これをセファテックスＧ−２５により脱
＃ｉ後凍結乾燥する。
ース４Ｂカラム（５００ｔｎｌ ）に流下し、吸ｓｇせ
た後、０．１５ Ｍ ＮａＣ，ｅｋ含む帆ＩＭリン醜塩
緩衝液、１）Ｈ８，Ｏで洗浄体、０゜２ＭＮａ、Ｃ０ｇ
浴液で浴出し、これをセファテックスＧ−２５により脱
＃ｉ後凍結乾燥する。
この処理によりエラスターゼ比活性は１００００単位／
ｇ又活性回収率は８４．０％であった。
ｇ又活性回収率は８４．０％であった。
実施例４
粗製エラスターゼ溶液２００−を抗エラスターゼ抗体を
固定化したガラスピーズのカラム（２００ｍＡ）に流下
し、吸着させた後、０．１５ＭＮａＣ−６’に含む０．
１ Ｍ Ｔｒｉａ−ＨＣ，ｅ緩衝液、ＰＨ７，５で洗浄
捗、０．２ Ｍ Ｎａ、 ＣＯ，溶液で溶出し、これを
セファテックスＧ−２５により脱環後凍結乾燥する。
固定化したガラスピーズのカラム（２００ｍＡ）に流下
し、吸着させた後、０．１５ＭＮａＣ−６’に含む０．
１ Ｍ Ｔｒｉａ−ＨＣ，ｅ緩衝液、ＰＨ７，５で洗浄
捗、０．２ Ｍ Ｎａ、 ＣＯ，溶液で溶出し、これを
セファテックスＧ−２５により脱環後凍結乾燥する。
この処理によりエラスターゼ比活性は１１０００単位／
ノ、又活性回収率は８７．０％でおった。
ノ、又活性回収率は８７．０％でおった。
抗体作製例
白色家兎に対し、抗原である精製エラスターゼをアジ−
バンドとともに免疫注射し、数回の追加免疫の後全採血
し、抗エラスターゼ抗血涜？得る。
バンドとともに免疫注射し、数回の追加免疫の後全採血
し、抗エラスターゼ抗血涜？得る。
この抗血清を１／３飽和硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロー
スにより、抗エラスターセ抗体を精製する。
スにより、抗エラスターセ抗体を精製する。
抗エラスターゼ抗体固定化セファロース４Ｂの調製例Ｃ
ＮＢ ｒ活性化セファロース４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製） １００９
ｔ” １ｍＭＨＣＡにて洗浄膨ｆＩ４１行ない０．５
Ｍ ＮａＣ６’に含む０．１ＭＮａＨＣＯ，緩衝液、
ＰＨ８，３中で１．５９の抗エラスターゼ抗体と結合さ
せ、室温で２時間攪拌し、未反応の活性基ｔ−ＩＭのエ
タノールアミンＰ）１８．０でブロッキング（２時間）
する。
ＮＢ ｒ活性化セファロース４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製） １００９
ｔ” １ｍＭＨＣＡにて洗浄膨ｆＩ４１行ない０．５
Ｍ ＮａＣ６’に含む０．１ＭＮａＨＣＯ，緩衝液、
ＰＨ８，３中で１．５９の抗エラスターゼ抗体と結合さ
せ、室温で２時間攪拌し、未反応の活性基ｔ−ＩＭのエ
タノールアミンＰ）１８．０でブロッキング（２時間）
する。
次ＶＣ上記のＮａＨＣＯ，緩衝液によりプロノキングカ
；薬を洗浄し、抗エラスターゼ抗体固定化セファロース
４Ｂとする。
；薬を洗浄し、抗エラスターゼ抗体固定化セファロース
４Ｂとする。
この担体は０，１５ Ｍ ＮａＣＡ’を含む０．１Ｍリ
ンＩＩＩＩ塩緩衝液ＰＩＩ８．Ｏで充分洗浄することに
より再使用が可能である。
ンＩＩＩＩ塩緩衝液ＰＩＩ８．Ｏで充分洗浄することに
より再使用が可能である。
エラスターゼ活性測定法
ｓｕｅ −Ａｅａｌ −ＦＮＡ （５ｕｃｃｉｎｙ＃
−（Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ ）１−Ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉ
Ａｉｄｅ ） ｋ基質としてＢｉａｔｈらの方法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ 、 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１ 、３５０−
３５７．１９７４）に基づいて試料を０．２ Ｍ Ｔｒ
ｉ８−ＨｃｉｓｖＪＭ、（ＰＨ８，０）２．５ｒｎｔに
加え基質１２５ ｍ Ｍ ｓｕｅ −Ａｈａ。
−（Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ ）１−Ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉ
Ａｉｄｅ ） ｋ基質としてＢｉａｔｈらの方法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ 、 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１ 、３５０−
３５７．１９７４）に基づいて試料を０．２ Ｍ Ｔｒ
ｉ８−ＨｃｉｓｖＪＭ、（ＰＨ８，０）２．５ｒｎｔに
加え基質１２５ ｍ Ｍ ｓｕｅ −Ａｈａ。
−ＰＮＡのＮ −ｍｅｔｈｙ−＃ −２−ｐｙｒｒｏ＃
１ｄｏｎｅ溶液２０μ、８を加えて２５℃下４１０ ｎ
ｍの吸光度増加（ΔＡ ４１０／ｍ１ｎ） ｋ ２−３
分間測定した。
１ｄｏｎｅ溶液２０μ、８を加えて２５℃下４１０ ｎ
ｍの吸光度増加（ΔＡ ４１０／ｍ１ｎ） ｋ ２−３
分間測定した。
エラスターゼ活性は１分間当たり１ＭモルのＰ−ｎｌｔ
ｒｏａｎｉＡｉｎｅ ｋ遊離する酵素Ｊｉｍ’ ｋ Ｉ
Ｕｎｉｔとした。
ｒｏａｎｉＡｉｎｅ ｋ遊離する酵素Ｊｉｍ’ ｋ Ｉ
Ｕｎｉｔとした。
なお、Ｐ −ｎ１ｔｒｏａｎｉ＃ｉｎｅの分子吸光係数
は、１Ｍ Ｅ ＝ ８８００ ′？を用いた。
は、１Ｍ Ｅ ＝ ８８００ ′？を用いた。
１０ｎｍ
Claims (1)
- １、 不溶型エラスターゼ抗体にて羽１％！５！エラス
ターセ溶液全処理して上記抗体にエラスターゼ倉％異的
に吸着ゼしぬ、その吸着物全洗浄したのち、溶離剤とし
てアルカリ性溶液を用いてエラスターゼを溶ｌｌ＃する
ことｔ％徴とするエラスターゼの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19834381A JPS5928395B2 (ja) | 1981-12-11 | 1981-12-11 | エラスタ−ゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19834381A JPS5928395B2 (ja) | 1981-12-11 | 1981-12-11 | エラスタ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58101692A true JPS58101692A (ja) | 1983-06-16 |
| JPS5928395B2 JPS5928395B2 (ja) | 1984-07-12 |
Family
ID=16389537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19834381A Expired JPS5928395B2 (ja) | 1981-12-11 | 1981-12-11 | エラスタ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5928395B2 (ja) |
-
1981
- 1981-12-11 JP JP19834381A patent/JPS5928395B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5928395B2 (ja) | 1984-07-12 |
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