JPS5928395B2 - エラスタ−ゼの精製法 - Google Patents
エラスタ−ゼの精製法Info
- Publication number
- JPS5928395B2 JPS5928395B2 JP19834381A JP19834381A JPS5928395B2 JP S5928395 B2 JPS5928395 B2 JP S5928395B2 JP 19834381 A JP19834381 A JP 19834381A JP 19834381 A JP19834381 A JP 19834381A JP S5928395 B2 JPS5928395 B2 JP S5928395B2
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- JP
- Japan
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- elastase
- antibody
- solution
- insoluble
- activity
- Prior art date
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はエラスターゼの精製方法に関する。
エラスターゼは生体内に広く見出され、特に豚の膵臓中
にその含有量は高い。
にその含有量は高い。
またエラスターゼは血管等の結合組織に存在する不溶性
価タンパク質であるエラスチンを分解する唯一の酵素で
あり、動脈硬化の発症進展及び組織障害に関与すると考
えられ、近年注目されている。
価タンパク質であるエラスチンを分解する唯一の酵素で
あり、動脈硬化の発症進展及び組織障害に関与すると考
えられ、近年注目されている。
エラスターゼの精製法としては従来硫安分画の後、得ら
れるオイグロプリン画分をさらに結晶化する方法、陽イ
オン交換体及び陰イオン交換体を用いたイオン交換クロ
マト等があるが、これらの方法はエラスターゼと夾雑蛋
白との分離、除去が困難であり特異性に欠け、また時間
、労力を要するという欠点を有し、工業的に適した方法
とは思われない。
れるオイグロプリン画分をさらに結晶化する方法、陽イ
オン交換体及び陰イオン交換体を用いたイオン交換クロ
マト等があるが、これらの方法はエラスターゼと夾雑蛋
白との分離、除去が困難であり特異性に欠け、また時間
、労力を要するという欠点を有し、工業的に適した方法
とは思われない。
本発明は抗原−抗体反応の特異性を利用することにより
、従来方法における欠点を回避、克服し、高純度のエラ
スターゼを高収率に取得するエラスターゼの精製法に関
する。
、従来方法における欠点を回避、克服し、高純度のエラ
スターゼを高収率に取得するエラスターゼの精製法に関
する。
本発明においてはまず目的とする純度のエラスターゼを
動物に免疫することによって得た抗体を不溶性担体と化
学的に共有結合させて、不溶型エラスターゼ抗体を調製
する。
動物に免疫することによって得た抗体を不溶性担体と化
学的に共有結合させて、不溶型エラスターゼ抗体を調製
する。
担体としては不活性であり、疎であり、不溶性である担
体、例えばアガロース、デキストラン、ポリアクリルア
ミド、ガラスピーズ等を用いることができ、先の抗体と
は公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型エラスタ
ーゼ抗体を調製する。
体、例えばアガロース、デキストラン、ポリアクリルア
ミド、ガラスピーズ等を用いることができ、先の抗体と
は公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型エラスタ
ーゼ抗体を調製する。
このような不溶型エラスターゼ抗体に粗製エラスターゼ
溶液を適用することにより、上記抗体にエラスターゼを
特異的に吸着せしめたのち、その吸着物を洗浄すること
により不純物を完全に除去し、ついでアルカリ溶液によ
りエラスターゼを溶離することによって高純度なエラス
ターゼを高収率で得ることができるものである。
溶液を適用することにより、上記抗体にエラスターゼを
特異的に吸着せしめたのち、その吸着物を洗浄すること
により不純物を完全に除去し、ついでアルカリ溶液によ
りエラスターゼを溶離することによって高純度なエラス
ターゼを高収率で得ることができるものである。
本発明によって得られるエラスターゼの純度は原料とし
て用いる粗製エラスターゼ溶液の純度の良し悪しに関係
なく用いた不溶型エラスターゼ抗体の特異性に依存する
。
て用いる粗製エラスターゼ溶液の純度の良し悪しに関係
なく用いた不溶型エラスターゼ抗体の特異性に依存する
。
なお、エラスターゼはアルカリ性側では安定であり、本
発明に用いる溶出液例えば０．２ ＭＮ ａ ２ Ｃ０
３溶液（ｐＨｉ １．０−１１．５ ）中では２５℃、
３時間処理後も９７％以上の活性を残存することが明ら
かになった。
発明に用いる溶出液例えば０．２ ＭＮ ａ ２ Ｃ０
３溶液（ｐＨｉ １．０−１１．５ ）中では２５℃、
３時間処理後も９７％以上の活性を残存することが明ら
かになった。
また、本発明で用いるアルカリ性溶液は不溶性担体−抗
体結合に何ら影響を与えず、ｐＨ８付近の適当な緩衝液
で再生することにより半永久的にくり返し使用が可能で
あり、その吸着容量、活性回収率及び純度に変化はない
。
体結合に何ら影響を与えず、ｐＨ８付近の適当な緩衝液
で再生することにより半永久的にくり返し使用が可能で
あり、その吸着容量、活性回収率及び純度に変化はない
。
さらには、その溶離剤は安価でその後の脱塩及び廃乗が
非常に容易である。
非常に容易である。
以上の点より不溶型エラスターゼ抗体による溶離剤とし
てアルカリ性溶液を用いるエラスターゼの精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。
てアルカリ性溶液を用いるエラスターゼの精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。
次に、実施例を挙げて本発明を説明するが本発明はこれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例 １
豚膵臓原末１００９を冷水１０１００Ｏに懸濁し、約２
時間撹拌抽出し５０００回転１０分間遠沈してエラスタ
ーゼ抽出液を得た。
時間撹拌抽出し５０００回転１０分間遠沈してエラスタ
ーゼ抽出液を得た。
この抽出液を抗エラスターゼ抗体を固定化したセファロ
ース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ４ Ｂカラム（５００
ｒＩｌｌ）に流下し、吸着させた後０．１５ＭＮａＣ１
！を含む０．１ ＭＴｒ ｉ ｓＨＣ１１緩衝液ｐＨ７
，５で洗浄後０、２ Ｍ Ｎ ａ ２ ＣＯｓ溶液で溶
出し、これをセファデックスＧ−２５により脱塩後、凍
結乾燥する。
ース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ４ Ｂカラム（５００
ｒＩｌｌ）に流下し、吸着させた後０．１５ＭＮａＣ１
！を含む０．１ ＭＴｒ ｉ ｓＨＣ１１緩衝液ｐＨ７
，５で洗浄後０、２ Ｍ Ｎ ａ ２ ＣＯｓ溶液で溶
出し、これをセファデックスＧ−２５により脱塩後、凍
結乾燥する。
この処理なよりエラスターゼ比活性は１１５００単位／
９、又活性回収率は９６．５％であった。
９、又活性回収率は９６．５％であった。
実施例 ２
豚膵臓原末１００９から実施例１と同様の操作によって
得た抽出液を抗エラスターゼ抗体を固定化したセファロ
ース４Ｂカラム（５００ｍｌ）に流下し、吸着させた後
０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＩＪン酸塩緩衝液、
ｐＨ８，０で洗浄後０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
、Ｉ）Ｈｌｌ、５により溶出し、これをセファデックス
（５ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５により脱塩後、凍結
乾燥する。
得た抽出液を抗エラスターゼ抗体を固定化したセファロ
ース４Ｂカラム（５００ｍｌ）に流下し、吸着させた後
０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＩＪン酸塩緩衝液、
ｐＨ８，０で洗浄後０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
、Ｉ）Ｈｌｌ、５により溶出し、これをセファデックス
（５ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５により脱塩後、凍結
乾燥する。
この処理によってエラスターゼ比活性は１１０００単位
／９、又活性回収率は８６．０％であった。
／９、又活性回収率は８６．０％であった。
実施例 ３
豚生膵臓５００９をミンチ、水１５００ｍｌを加え自己
消化させて抽出する。
消化させて抽出する。
この抽出液を濾過して濾液を得た。
この抽出液を抗エラスターゼ抗体を固定化したセファロ
ース４Ｂカラム（５００ｍｌ）に流下し、吸着させた後
、０．１５ＭＮａＣＡを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、
ｐ Ｈ８，０で洗浄後、０．２ＭＮａ２ Ｃ０３溶液で
溶出し、これをセファデックスＧ−２５により脱塩後凍
結乾燥する。
ース４Ｂカラム（５００ｍｌ）に流下し、吸着させた後
、０．１５ＭＮａＣＡを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、
ｐ Ｈ８，０で洗浄後、０．２ＭＮａ２ Ｃ０３溶液で
溶出し、これをセファデックスＧ−２５により脱塩後凍
結乾燥する。
この処理によりエラスターゼ比活性は１ｏｏｏ。
単位／９又活性回収率は８４．０％であった。
実施例 ４
粗製エラスターゼ溶液２００ｍ１を抗エラスターゼ抗体
を固定チ賎たガラスピーズのカラム（２００ｍｌ）に流
下し、拘着させた後、０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐ Ｈ７，５で洗浄後、
０．２ ＭＮ ａ２ Ｃ０３溶液で溶出し、これをセフ
ァデックスＧ−２５により脱塩後凍結乾燥する。
を固定チ賎たガラスピーズのカラム（２００ｍｌ）に流
下し、拘着させた後、０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐ Ｈ７，５で洗浄後、
０．２ ＭＮ ａ２ Ｃ０３溶液で溶出し、これをセフ
ァデックスＧ−２５により脱塩後凍結乾燥する。
この処理によりエラスターゼ比活性は１１０００単位／
、９、又活性回収率は８．７％であった。
、９、又活性回収率は８．７％であった。
抗体作製例
白色家兎に対し、抗原である精製エラスターゼをアジュ
バントとともに免疫注射し、数回の追加免疫の後全採血
し、抗エラスターゼ抗血清を得る。
バントとともに免疫注射し、数回の追加免疫の後全採血
し、抗エラスターゼ抗血清を得る。
この抗血清を１／３飽和硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロー
スにより、抗エラスターゼ抗体を精製する。
スにより、抗エラスターゼ抗体を精製する。
抗エラスターゼ抗体固定化セファロース４Ｂの調製例
ＣＮＢｒ活性化セファロース４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）１００（９を
１ ｍＭＨＣｌｌにて洗浄膨潤を行ない０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭＮａｌＨＣＯ３緩衝液、ｐ Ｈ８，３
中で１．５９の抗エラスターゼ抗体と結合させ、室部で
２時間撹拌し、未反応の活性基をＩＭのエタノールアミ
ンｐ Ｈｓ、 ｏでブロッキング（２時間）する。
ｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）１００（９を
１ ｍＭＨＣｌｌにて洗浄膨潤を行ない０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭＮａｌＨＣＯ３緩衝液、ｐ Ｈ８，３
中で１．５９の抗エラスターゼ抗体と結合させ、室部で
２時間撹拌し、未反応の活性基をＩＭのエタノールアミ
ンｐ Ｈｓ、 ｏでブロッキング（２時間）する。
次に上記のＮ ａ ＨＣＯｓ緩衝液によりブロッキング
試薬を洗浄し、抗エラスターゼ抗体固定化セファロース
４Ｂとする。
試薬を洗浄し、抗エラスターゼ抗体固定化セファロース
４Ｂとする。
この担体は０．１５ＭＮａＣ７を含む０．１Ｍリン酸塩
緩衝液ｐ ｎｓ、 ｏで充分洗浄することにより再使用
が可能である。
緩衝液ｐ ｎｓ、 ｏで充分洗浄することにより再使用
が可能である。
エラスターゼ活性測定法
ｓｕｃ Ａｌａ３−ＰＮＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ（Ｌ
−ａＡａｎｉｎｅ）３−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ
）を基質としてＢｉｅｔｈらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１１．３５０−３５７．１９７
４）に基づいて試料を０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
、（ｐＨ８，０）２、５ ｍｌに加え基質１２５ｍＭ
５ｕｃ−Ａｌａ３−ＰＮＡのＮ−ｍｅｔｈｙｌ−２ｐｙ
ｒｒｏｌｉｄｏｎｅ溶液２０μｌを加えて２５℃）’４
１０ｎｍの吸光度増加（ΔＡ４１０／ｍ１ｎ）を２−３
分間測定した。
−ａＡａｎｉｎｅ）３−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ
）を基質としてＢｉｅｔｈらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１１．３５０−３５７．１９７
４）に基づいて試料を０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
、（ｐＨ８，０）２、５ ｍｌに加え基質１２５ｍＭ
５ｕｃ−Ａｌａ３−ＰＮＡのＮ−ｍｅｔｈｙｌ−２ｐｙ
ｒｒｏｌｉｄｏｎｅ溶液２０μｌを加えて２５℃）’４
１０ｎｍの吸光度増加（ΔＡ４１０／ｍ１ｎ）を２−３
分間測定した。
エラスターゼ活性は１分間当たり１ＭモルのＰ−ｎｉｔ
ｒｏａｎｉｌｉｎｅを遊離する酵素量をＩＵｎｉｔとし
た。
ｒｏａｎｉｌｉｎｅを遊離する酵素量をＩＵｎｉｔとし
た。
なお、Ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅの分子吸光係数は
、１Ｍ Ｅ ＝８８００を用いた。
、１Ｍ Ｅ ＝８８００を用いた。
１０ｎｍ
Claims (1)
- １ 不溶型エラスターゼ抗体にて粗製エラスターゼ溶液
を処理して上記抗体にエラスターゼを特異的に吸着せし
め、その吸着物を洗浄したのち、溶離剤としてｐＨ１０
以上のアルカリ性溶液を用いてエラスターゼを溶離する
ことを特徴とするエラスターゼの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19834381A JPS5928395B2 (ja) | 1981-12-11 | 1981-12-11 | エラスタ−ゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19834381A JPS5928395B2 (ja) | 1981-12-11 | 1981-12-11 | エラスタ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58101692A JPS58101692A (ja) | 1983-06-16 |
| JPS5928395B2 true JPS5928395B2 (ja) | 1984-07-12 |
Family
ID=16389537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19834381A Expired JPS5928395B2 (ja) | 1981-12-11 | 1981-12-11 | エラスタ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5928395B2 (ja) |
-
1981
- 1981-12-11 JP JP19834381A patent/JPS5928395B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58101692A (ja) | 1983-06-16 |
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