SU1363569A1 - Способ получени очищенного белка а золотистого стафилококка - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повышение выхода продукта биологической активности белка А и его чистоты. Из нормальных сывороточных иммуноглобулинов класса G готовят аффинный сорбент. Пропускают белоксодержащее сырье через колонку с сорбентом. Полученный раствор собирают фракциями и контролируют активность белка А. Выход активности белка А увеличивается на 23%. Полученный белок А более гомогенен и свободен от стафилококковых токсинов. 2 з. п. ф-лы.

Description

1

получению

Изобретение относитс  бактериальных препаратов.

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода, биологической активности белка А и чистоты.

Пример 1. Золотистый стафилококк А-676 культивируют в реакторе дл  выращивани  бактерийных культур на пептонно-дрожже- вой питательной среде. Продолжительность выращивани  12 ч при 38-40°С, перемешивание со скоростью 300-500 об/мин и продувание стерильного воздуха через питательную среду в количестве 30 м /мин.

Культуру прогревают по окончании выращивани  непосредственно в реакторе при 80°С 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и освобождают от микробной массы центрофугированием при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочный слой контролируют на активность белка А в реакции непр мой гамагглютинации с эритроцитами, нагруженными IgG человека. Дл  выведени  белка А используют надоса- дочную жидкость (сырье) с титром не ниже чем 1:2560 в РИГА. До использовани  в операци х очистки сырье хран т при -20°С.

Приготовление аффинного сорбента. Выделение IgG из сыворотки свиней. Свиную сыворотку, полученную на м сокомбинате в день убо  животных, в тот же день используют дл  выделени  IgG. К 500 мл сыворотки добавл ют 500 мл дистиллированной воды и при посто нном перемешивании 666 мл насыщенного раствора (NH4)2S04. Через 18-20 ч выстаивани  при комнатной температуре смесь центрифугируют, надоса- док удал ют, осадок раствор ют в 150 мл 0,15 М раствора хлорида натри  и диализуют в течение 48 ч против 5 смен 0,02 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0±0,1 (по 5 л на каждую смену). Получают свободный от сернокислого аммони  раствор суммарной глобулиновой фракции в объеме 200-250 мл.

Этот раствор со скоростью 500 мл/ч пропускают через колонку с молселектом ДЕАЕ А-50 (диаметром 5 см при высоте сло  гел  95 см), предварительно уравновешенную 0,02 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0±0,1). Этот же буфер пропускают через колонку после вхождени  раствора белка в гель, фракцию белка, элюирующуюс  в данном буфере, собирают. Получают 3-3,5 г IgG в объеме 800-1100 мл буфера.

Приготовление иммуносорбента дл  очистки IgG от антител к стафилококковым антигенам.

2 л А-белоксодержащего сырь  пропускают через колонку с аффинным сорбентом, при этом получают 2 л жидкости, свободной от белка А, но содержащей прочие экстра- целлюл рные белки стафилококка. Жидкость концентрируют на  чейке ФМ-02 с фильтром Рипор-4 до объема 50 мл, диализуют против 2 л 0,1 М раствора фосфата натри  двузамещенного и полученный концентрат белков иммобилизуют на 50 мл гел  CNBr-активированной агарозы, использу  все рабочие растворы в полном объеме. Готовый иммуносорбент упаковывают в хроматогра- фическую колонку диаметром 3 см и высотой 10 см.

Приготовление иммобилизованного ово- мукоида.

1 г коммерческого овомукоида раствор ют в 50 мл 0,1 М раствора Na2HP04 и иммобилизуют на 50 мл CNBr-активированной агарозы. Готовый сорбент упаковывают в колонку диаметром 3 см и высотой 10 см.

Очистка IgG свиньи на иммуносорбенте и иммобилизованном ингибиторе протеаз.

Раствор IgG свиньи со скоростью 100 мл/ч при 4°С пропускают последовательно через колонки с иммобилизованными экстра- целлюл рными белками стафилококка и иммобилизованным овомукоидом, предварительно уравновешива  колонки 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,2±0,2) на 0,15 М растворе хлорида натри  (ЗФР). Затем полученный раствор IgG концентрируют до объема 100 мл на  чейке ФМ-02 с фильтром Рипор-3.

Иммобилизаци  IgG свиньи на CNBr-активированной агарозе.

30 г коммерческой CNBr-активированной агарозы (производства Института химиии АН ЭССР) промывают на фильтре Шотта 5 л воды, затем гель перенос т в пластмассовый сосуд емкостью 0,5 л и добавл ют к нему 50 мл 0,1 М двузамещенного фосфата натри  и 100 мл раствора очищенного IgG свиньи, компоненты быстро перемешивают и инкубируют при м гком перемешивании 2 ч при 18-22°С и 16 ч при 4°С. После этого гель перенос т на фильтр Шотта, промывают 2 л 0,1 М двузамещенного фосфата натри  и 2 ч инкубируют с 200 мл 0,5 М раствора г.пицина. Затем гель промывают 2 л ЗФР, 2 л 1 М раствора хлорида натри , 2 л 0,1 М глицинового буферного раствора (рН 3,0). Указанный цикл промьпвок повтор ют еще 2 раза и гель перенос т в колонку диаметром 4 см и промывают 5 л ЗФР на свободном протоке.

Затем колонку промывают 1 л ЗФР с мертиолатом в конечной концентрации 1:10000 и хран т с этим раствором до использовани  при 4°С.

Очистка белка А.

А-белоксодержащее сырье, имеющее титр белка А 1:5120 в РИГА, осветл ют на асбестовой пластине типа Ф и при 4°С пропускают через колонку с аффинным сорбентом, приготовленным из IgG свиньи, очищенным иммуносорбцией от антител к белкам стафилококка и от протеаз. Скорость процесса поддерживают на уровне 1500 мл/ч. Вытекающий раствор собирают фракци ми по 1 л и контролируют в РНГП на активность белка А. Выход фракции вытекающего раствора с титром белка А 1:320 (1/16 исходного титра) наблюдают после прохождени  через колонку 24 л сырь  и после этого пропускание сырь  прекращают. Аффинный сорбент промывают 10 л 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,2 ±0,2) на 0,3 М растворе NaCl при скорости 2 л/ч.

Затем через колонку пропускают 0,1 н. НС1-ГЛИЦИНОВЫЙ буфер (рН 3,0) при скорости 200 мл/ч, элюцию белка регистрируют ультрафиолетовым асорбциометром при длине волны 280 нм. По выхождении пика белка сбор вытекающего раствора прекращают и белоксодержащую фракцию нейтрализуют 0,5 н. NaOH при посто нном перемешивании раствора под контролем рН-метра до рН 7,2±0,2. Получают 42,8 мл раствора белка, содержащего 214 мг очищенного белка А с титром в РИГА 1:2560000.

Полученный продукт дает отрицательную реакцию на присутствие стафилококковых токсинов в РИГА с антительным эритроци- тарным диагностикумом при их титре в исходном материале 1:2560.

Электрофоретически в 7%-ном полиак- риламидном геле в продукте очистки определ етс  одна узка  зона белка, соответствующа  белку А по подвижности в электрическом поле. По сравнению с известным белком, полученным из того же исходного сырь , имеютс  существенные преимущества: выход активности белка А увеличен на 23%, удельна  активность возросла более чем на 25%, полученный белок А более гомогенен, о чем свидетельствует мала  ширина фракции при электрофорезе в полиакриамидном геле. Полученный по предлагаемому способу белок А свободен от стафилококковых токсинов.

Пример 2. Выделение белка А производ т в точном соответствии с примером 1 с тем

отличаем, что сырье пропускают через аффинный сорбент до выхода фракции вытекающего раствора с активностью белка А в титре 1:2560 (1/2 исходного титра), расходу  при этом 59 л сырь . В результате более высокой степени насыщени  сорбента почти вдвое увеличивают выход массы и активности белка А в одном цикле при таких же параметрах качества, как в примере 1. Потери, наблюдаемые на стадии пропускани  через аффинный сорбент, обратимы, так как остаточные количества белка А в вытекающем растворе (27% по активности) могут быть выделены в последующих циклах хроматографии. Выход активности по отношению к сорбированному количеству равен 93%. Таким образом, необратимые потери активности в ходе очистки равны 7%. В известном способе при той же степени насыщени  аффинного сорбента (до выхода фракции вытекающего раствора с титром белка А 1:2560) потери выше на 24%. Предлагаемый способ обеспечивает очистку от стафилококковых токсинов.

Пример 3. Выделение белка А провод т, как в примере 1, с тем отличием, что дл  изготовлени  аффинного сорбента примен ют IgG человека, который выдел ют, очищают от антител к стафилококковым белкам и иммобилизуют на CNBr-активированной ага- розе в точном соответствии с примером 1, использу  такие же объемы реагентов и концентрации раствора.

Через колонку с аффинным сорбентом пропускают 12 л исходного сырь  с активностью белка А 1:5120 в РИГА. Элюированный глициновым буферным раствором (рН 3,0) белок А нейтрализуют. Получают 43 мл раствора белка А с активностью в титре 1:1280000 в РПГА при концентрации белка 2,57 мг/мл. Выход активности и удельна  активность конечного продукта на 20% выше, чем в известном способе. Предлагаемый способ дает высокогомогенный белок А, свободный от стафилококковых токсинов.

В пор дке экспериментального обосновани  эффективности предлагаемых технических решений выполн ют способы выделени  белка А с различными вариантами сорбентов и разными температурами прогревани  сырь . Аффинный сорбент из неочищенных от противостафилококковых антител IgG свиньи, белка и человека не обеспечивает получени  высокогомогенного белка А без примеси токсинов.

При изготовлении аффинного сорбента из IgG свиньи, очищенного только от антител к стафилококковым антигенам, достигают

некоторое повышение выхода активности, улучшение гомогенности целевого продукта и очистку от токсинов.

Введение операции очистки IgG дл  аффинного сорбента от протеолитических ферментов дает эффект существенного улучшени  гомогенности, повышени  биологической активности и выхода целевого продукта по активности.

Максимальный эффект по выходу, гомогенности и очистке от токсинов дает применение аффинного сорбента из IgG, предварительного очищенного от антител к стафилококку и протеолитических ферментов , в сочетании с прогреванием исходного сырь  в интервале температур 80-90° С.

Меньшие температуры (70°С) и более высокие (90°С) не обеспечивают оптимального эффекта.

Представленные материалы показывают, что максимального выхода белка А по массе достигают при использовании IgG высокореагирующих видов (человека, свиньи) дл  приготовлени  аффинного сорбента. Применение дл  этих целей IgG низкореагирующего вида, IgG быка, дает минимальную

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получени  очищенного белка А золотистого стафилококка, включающий приготовление аффинного сорбента путем иммобилизации иммуноглобу.гашов класса G млекопитающих на нерастворимом корпускул рном носителе, контактирование исходного сырь  с аффинным сорбентом, промывку сорбента от примесей и элюцию белка А, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода продукта, биологической активности белка А и чистоты, аффинный сорбент готов т из нормальных сывороточных IgG свиньи или человека, причем перед иммобилизацией IgG его очищают от антител к экстрацеллюл рным антигенам стафилококка и от протеолитических ферментов, далее

производительность и низкий выход белка А по причине низкого сродства к Fc-фрагменту.

Применение предлагаемого способа создает следующие преимущества: более чем на 20% повышаетс  выход биологической активности белка А за счет снижени  необратимых потерь; целевой продукт имеет более высокие параметры качества - более высокую уде.лоьную биологическую активность (примерно на 25%) и высокую гомогенность; в очищенном белке А полностью отсутствуют стафилококковые токсины; применение IgG высокореагирующих с белком А видов обеспечивает высокопроизводительную технологию его получени .

Получение белка А более высокой активности, гомогенности с контролируемым отсутствием стафилококковых токсинов открывает возможности дл  более достоверного изучени  его активности in vivo и дл  конструировани  лечебных препаратов на его основе.

Дл  осуществлени  предлагаемого способа требуютс  дополнительные материалы и трудозатраты.

перед контактированием с аффинным сорбентом исходное сырье прогревают при 80 - 90°С 30 мин.

2.Способ по П.1, отличающийс  тем, что дл  очистки IgG от антител к экстрацеллюл рным антигенам стафилококка используют иммуносорбент с иммобилизованными концентрированными растворимыми компонентами культуры штамма-продуцента, предварительно очищенными от белка А.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийс  тем, что дл  очистки IgG от протеолитических ферментов используют аффинный сорбент с иммобилизованным овомукоидом.