JPH02800A

JPH02800A - モノクローナル抗体の精製方法

Info

Publication number: JPH02800A
Application number: JP63310998A
Authority: JP
Inventors: That T Ngo; ザット・テイー・ンゴ
Original assignee: BIOPROBE INTERNATL Inc; Bioprobe International Inc
Current assignee: BIOPROBE INTERNATL Inc; Bioprobe International Inc
Priority date: 1987-12-30
Filing date: 1988-12-08
Publication date: 1990-01-05
Also published as: US4801687A; EP0323027A3; EP0323027A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、モノクローナル抗体の精製のための方法に
関する。より特別な面の一つとして、この発明は、補乳
動物に由来する免疫グロブリンの精製に関する。

哺乳動物に由来するモノクローナル抗体、とりわけマウ
スモノクローナル抗体の調製技術の発見に伴って、その
ようなモノクローナル抗体の精製に対する要求が高まっ
てきた。従来、この目的に使用されてきた精製技術は、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを
含有する混合物を適当なカラムに流して混合物から抗体
を選択的に吸着させ、その後吸着した抗体を精製した形
態でカラムから溶出させるものである。しかしながら、
カラムの特異性の欠如のために、得ることのできる単離
抗体の収量および純度は限られたものである。

例えば、免疫グロブリン精製のための従来の方法は、免
疫グロブリンに対する吸着剤の比較的低い特異性に苦労
している。そのような方法の１つにおいて、異なった哺
乳動物種の血清免疫グロブリンの種々の分画を、ｐＨ７
以上でプロティンＡ−セファロース（登録商標）吸着剤
に吸着させ、ｐ＋ｚ、ｓないしｐＨ６，５の範囲のｐＨ
値で溶出させた［Ｒ，ＬＩｎｄｍａｒｋｌに、Ｔｈｏｒ
ｅｎ−ＴｏｌｌｉｎｇおよびＪ、５ｊｏｑｕｉｓｔ、　
　ｒ免疫グロブリンのプロティンＡへの結合および哺乳
動物血清中における免疫グロブリンレベルＪ　、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　ＩｍＩｆｌｕｎｏｌｏｇｌｃａｌＭｅ
ｔｈｏｄｓ、　８２：　ｌ　　（１９８３）コ。マウス
　ＩｇＧのプロティンＡ−セファロース（登録商標）へ
の結合がｐＨ感受性であり、リン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ８，０）　　０．１Ｍを使用して最適吸着が起こる
ことが知られている［　Ｐ、Ｌ、ＥｙＳＳ、Ｊ、Ｐｒｏ
ｗｓｅおよびＣ，Ｒ，Ｊｅｎｋｉｎｓ　　ｒプロティン
Ａ−セファ０−スを使用したマウス血清からの純粋１ｇ
Ｇ１、Ｉｇｃ２゜および　ＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンの
単離」１■ｕｎｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　、　１５：　４
２９　　（１９７ｇ）　］。

最近、特別に調製した緩衝液を用いて種々の免疫グロブ
リンの回収量を増加させる努力がなされている［「マウ
スモノクローナルＩｇＧ１　、アファイゲル（Ａｌ’ｌ
’１−Ｇｅｔ　、登録商標）プロティンＡを用いた精製
Ｊ　、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１１７２　、Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ、　Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｃｈｅ
ｎ＋１ｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　５Ｒ１ｅｈ＋ａｏｎ
ｄ、　Ｃａ１ｌｌ’ｏｒｎｌａ　（１９８４）　］。

免疫グロブリンの収量がより多い精製方法を提供するこ
とが望まれてきた。

したがってこの発明の目的は、モノクローナル抗体、と
りわけ哺乳動物から得た免疫グロブリンの精製に対する
改良法を提供することにある。

この発明の別の目的は、追加の精製工程を必要としない
方法を提供することである。

この発明のさらに別の目的は、モノクローナルまたはポ
リクローナル抗体の収量の改善をそれらの吸着において
実現した、迅速、簡便、かつ経済的な方法を提供するこ
とである。

この発明の他の目的および利点は、以下の詳細な開示か
ら明らかになるであろう。

この発明は、免疫グロブリンのようなモノクローナルお
よびポリクローナル抗体の精製法を提供する。この方法
は、従来実現可能であったものよりも収率が高いことを
特徴とする。この方法は、免疫グロブリンを含有する媒
質を、一価のカチオンと多塩基性アニオンの組合わせの
形態である疎水性相互作用促進塩（１ｎｔｅｒａｃｔｉ
ｏｎ−ｐｒｏｒａｏｔｉｎｇｓａｌｔ）を約０．６Ｍな
いし１．７５Ｍ含有し、か−）ｐＨ値が約７．５ないし
１０の範囲にある緩衝溶液と撹拌して緩衝免疫グロブリ
ン媒質を得る工程と、得られた緩衝免疫グロブリン媒質
を固定化したプロティンＡ吸告剤と接触させて緩衝免疫
グロブリン媒質中に存在する免疫グロブリンを固定化プ
ロティンＡｅ着剤に吸むさせる工程と、免疫グロブリン
を吸着した固定化プロティンＡ吸着剤を緩衝溶液を用い
て洗浄する工程と、免疫グロブリンを吸着した固定化プ
ロティンＡ吸着剤をｐＨ値が約３ないし６の範囲にある
緩衝溶液と接触させて固定化プロティンＡ吸着剤から吸
着した免疫グロブリンを除去する工程と、実質的に純粋
な形態にある除去された免疫グロブリンを回収する工程
とを含む。この発明の方法に従って得られた免疫グロブ
リンの収量は、従来得られることができた収量よりも約
２０％ないし９０％以上増加した。

この発明の方法は、モノクローナルおよびポリクローナ
ルの両者を含む種々のタイプの免疫グロブリンの精製に
有用である。この方法は、　ＩｇＧ、、ＩｇＧ２−１　
ＩｇＧ２ｂ−その他のような多くの　ＩｇＧサブクラス
に適用することも可能である。この発明の方法を用いて
、マウス、アレチネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシお
よびヒトを含む多（の種類のホストからの抗体を精製す
ることができる。一般にこの方法は、プロティンＡが適
度の親和性を有するものであれば、いかなる免疫グロブ
リンに対しても適用することができる。免疫グロブリン
は、正常もしくは免疫された哺乳動物の血清、哺乳動物
の血漿、腹水、ハイプリドーマ、組織培養液、または他
の抗体源から得ることができる。

この発明の方法は、吸着剤として固定化したプロティン
Ａを使用する。プロティンＡが、精製した可溶状態また
はプロティンＡを含有するホルマリン固定化黄色ブドウ
球菌として、種々の免疫グロブリン、主として哺乳動物
種からの　ＩｇＧと相互作用することが知られてはいる
が、不溶化した状態以外でのプロティンＡの使用は、例
えば、架橋アガロースに固定化されたプロティンＡの利
用はど実用的ではない。不溶化された形態にあるプロテ
ィンＡは、カラムにおいて都合よ（使用することができ
、それはこの精製法の実行を容易にする。

多くの好適な固定化プロティンＡ吸着剤が市販されてい
る。化学的に安定なアミド結合によって架橋アガロース
ビーズに結合した精製プロティンＡを、アファイゲル（
登録商標）プロティンＡとして旧ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｒｌｃｈｍｏｎｄ。

Ｃａｔ　Ｂｏｒｎｉａ）から人手することができる。プ
ロティンＡアガロースもまた、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌ！ｎｇａＩｌｅｑ　Ｃａ１ｉ
ｆ’ｏｒｎｉａ）から入手することができる。この製品
は、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（登録商標）　４Ｂ
に結合した純粋プロティンＡとして記述されている。同
様の製品であるプロティンＡセファロース（登録商標）
ＣＬ−４Ｂもまた、Ｐｈａｒａ＋ａｃｌａ　Ｆｉｎｅ　
Ｃｈｅｏ＋１ｃａｌｓ　（Ｕｐｐｓａｌａ　ＳＳｗｅｄ
ｅｎ）から入手可能である。プロティンＡ−ウルトラゲ
ル（登録商標）はＲｅａｃｔｌｒｓ　ＩＢＦ　（フラン
ス）から入手することができる。これは、異なった補乳
劾物に由来する異なった免疫グロブリンＧと相互作用す
ることができる生体特異的（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆ　ｉｅ
　）アフィニティクロマトグラフィ吸収剤として記述さ
れており、電気泳動で精製したプロティンＡをグルタル
アルデヒド−活性化ゲルに固定することによって調製さ
れている。数珠状の架橋アガロースに共有結合したプロ
ティンＡもまた、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、から人手可能である。

固定化プロティンＡはまた、この発明と同一の譲受は人
に譲渡された米国特許４，５８２．８７５号に開示され
た技術を用いて得ることができる。この米国特許の開示
は、参考としてここに組込まれている。この特許は、一
般に、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン
−４−スルホネート（ＦＭＰ）を用いた水酸基含有重合
体担体の活性化を開示している。そのような活性化重合
体はＢＩｏＰｒｏｂｅ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉＯｒｔａｌ
、Ｉｎｃ、　（ＴｕｓｔｉｎｑＣａｌｉｒｏｒｎｉａ）
から市販されている。アビラド−ゲル（商標）　　ＰＭ
Ｐ−活性化親水性ゲルは、Ｎ−アクリロイル−２−アミ
ノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
のＰＭＰ−活性化重合体である（トリスアクリルＣＦ　
２０００、Ｒｅａｃｔｉｆｓ　ＩＢＦ。

フランス）。アビラド−ゲルＦ（商標）　　ＰＭＰ−活
性化親水性ゲルは、ＰＭＰ−活性化された、ＣＳＨ。

およびＯ原子のみからなる親水性ビニルアルコール重合
体である（Ｐｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ　、　Ｅ、Ｍｅ
ｒｃｋ　ｓＤａｒｍｓｔａｄｔ　５Ｇｅｒｒａａｎｙ　
）　ｏ両方とも固定化プロティンＡを得るために使用す
ることができる。

この発明の方法における第１工程は、ｐＨ値が約７．５
ないし１０の範囲にある緩衝液と約０．８Ｍないし１．
７５Ｍの濃度の一価カチオンおよび多塩基性アニオンの
組合わせとを必要とする。所望のｐＨを得るために、ど
のような緩衝液でも使用することができる。例えば、グ
リシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはトリス緩衝液を使
用することができる。緩衝液の濃度は、約０．０１Ｍな
いし０．２５Ｍの範囲にあるべきである。

一価カチオンがカリウムイオンであり、多塩基性アニオ
ンがリン酸イオンである場合には、カリウムイオンおよ
びリン酸イオンは、リン酸三カリウム（Ｋ３　ＰＯ４）
　、リン酸水素二カリウム（Ｋ２　ＨＰＯ４）またはリ
ン酸二水素カリウム（Ｋ）１２ｐｏ４）のいずれかの形
態のリン酸カリウムを使用することによって得ることが
できる。これは、媒質のｌ）Ｈが存在する種々のリン酸
イオンの割合を制御するためである。カリウムイオンと
リン酸イオンの濃度は、約０．６Ｍないし１．７５Ｍの
範囲にあるべきである。約１．０Ｍないし　１，５Ｍの
濃度が特に満足のいくものであるこ−とが見出されてい
る。

この発明において使用される高い濃度で充分な溶解度を
有する、一価カチオンと多塩基性アニオンの他の組合わ
せは、約１．ＯＭないし１．５Ｍの濃度のリン酸アンモ
ニウム、約１．０Ｍないし　１．５Ｍの濃度の硫酸アン
モニウムおよび約１．０Ｍないし１．２５Ｍの濃度の硫
酸ナトリウムを含む。他の組合わせも、使用する濃度で
塩を沈澱しない限りは用いることができる。

上で指摘したように、吸着剤がカラムに好適に使用され
、精製される免疫グロブリンとの接触を容易にする。不
純な免疫グロブリンを含有する媒質をカラムに適用する
前に、ベツド容積の数倍の、約０．８Ｍないし１．７５
Ｍの濃度範囲の一価カチオンおよび多塩基性アニオンの
組合わせを含有する緩衝液を用いてカラムを平街化する
。これにより、環境が、免疫グロブリンのカラムへの結
合に対して最適となることが補償される。免疫血清また
は他の免疫グロブリン源のような精製される免疫グロブ
リンを含有する媒質を、一価カチオンおよび多塩基性ア
ニオンの組合わせを有する緩衝液と混合する。次いで、
得られた混合物をカラムに流し、カラムに免疫グロブリ
ンを吸着させる。その後、カラムに強く吸着していない
不純物をカラムから溶出させるために、追加の、一価カ
チオンおよび多塩基性アニオンの組合わせを含有する緩
衝液を用いてカラムを洗浄する。一方、免疫グロブリン
は、カラムに強く吸着している。これは、一価カチオン
および多塩基性アニオンの組合わせを有する緩衝液が存
在する結果、吸着剤の免疫グロブリンに対する親和性が
強められたためである。同じ緩衝溶液を用いた洗浄によ
る不要の不純物の除去に続いて、酸性ｐＨ，即ち、約３
．０ないし６．０の範囲のｐＨの緩衝液によってカラム
から精製した免疫グロブリンを溶出させる。ｐＨｅ、ｏ
で、免疫グロブリンの一部、主に　ＩｇＧ、分画が溶出
される。ａｌｌが下がったときに、１ｇＧ２−およびＩ
ｇＧ２ｂ分画を含む免疫グロブリンの残りが溶出する。

免疫グロブリンはｐＨａ、ｏ緩衝液を用いて溶出させる
こともでき、この液は全ての免疫グロブリンを溶出させ
るのに有効である。しかしながら、所望であれば、免疫
グロブリンの分画をｐｉ　ｅ、ｏで溶出させることがで
きる。所望であれば、ｐＨ８，０ないしｐＨａ、ｏの範
囲でｐＨを下げることにより、他の種々の分画を溶出さ
せることができる。ｐＨを段階的に下げることにより、
所望する特定の免疫グロブリンを含有する精製された免
疫グロブリンの分画を単離することが可能である。溶出
には、どのような緩衝液でも使用することができる。例
えば、酢酸−酢酸塩緩衝液がこの目的に使用し得る。約
Ｑ、ＱＬＭないし０．２５Ｍの濃度範囲の緩衝液を使用
することができる。約０．０５Ｍないし０．１０Ｍの緩
衝液濃度が特に好ましい。

単離した免疫グロブリンまたはその分画は、従来得るこ
とができた収率よりも９０％も高い収率で回収すること
ができる。従来利用されている最も洗練された技術を用
いて得られた収率でさえ、２０ないし３０％も改善する
ことが可能である。

この発明は、以下の実施例を参照することによってより
理解されるであろう。以下の実施例は説明を目的とする
ものであり、いかなる意味においても、特許請求の範囲
に定義されたこの発明の範囲を限定するものと解釈され
るものではない。

実施例１固定化プロティンＡ（プロティンＡアビラドゲル（商標
）　、ＢＩｏＰｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｌｏｎａｔ
ｌ、Ｉｎｃ、、ＴｕｓｔｌｎＳＣａｌｉｆ’ｏｒｎｉａ
）　　１ｍＪを３ａ１！のカラムに入れた。そのカラム
を、Ｋ２ＨＰＯ４１，２Ｍを含有する０、０２５Ｍグリ
シン緩衝液１０１Ｌｉ！を用いて平衡化した。９Ｈ値は
、ｐｔｔ　ｇ、ｏからｐＨＩＱ、ｏまで変化する。

正常マウス血清（Ｇｒａｎｉｔｅ　Ｄ１ａｇｎＯ８ｔｉ
ｅＳ　。

ＢｕｒｌｉｎｇｔｏｎＳＮｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ
）　　ｌ＠Ｊを緩衝液１−で希釈し、カラムに流した。

次いで、５−１０ＩＬＩ！の緩衝液を用いてカラムを洗
浄した。カラム上に吸着した免疫グロブリンを、５−の
０．１Ｍ酢酸、酢酸ナトリウム緩衝液（ａｌｌ　３．５
）を用いて溶出した。

得られた免疫グロブリンの収率は、ｐＨ８，０ないしｐ
Ｈ１０，０のｐＨ範囲において８０％ないし　１００％
であり、ｐＨ値に伴って収率が増加する。これに比べる
と、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＸＳｐＨ９，０）を使
用した場合には、わずか２０％の収率であった。

実施例２固定化プロティンＡ（アファイゲル（登録商標）プロテ
ィンＡ　５Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
ＳＲｌｃｈｍｏｎｄ。

Ｃａ１ｌｒｏｒｎｉａ）　　Ｉ−を３１のカラムに入れ
た。

１．２Ｍ　Ｋ２１１ＰＯ４を含仔する０、０２５Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ９，１）　　１０−を用いてカラムを
平衡化した。

正常マウス血清（Ｐｅｌ−Ｐｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ、Ｒｏｇｅｒｓ。

Ａｒｋａｎｓａｓ）　　ｌ＠Ｉを緩衝液１−で希釈し、
カラムに流した。次いで、５−１０ｄの緩衝液を世いて
カラムを洗浄した。血清試料中に含有される免疫グロブ
リンは、５−の０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐｉｆ　３．５）を用いてカラムから溶出させた。

収量は１３．８ｍｇであった。この収量は、市販の緩衝
溶液（アファイゲル（登録商、ｆｉ）プロティンＡＭＡ
ＰＳ！衝液、Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　Ｒ１ｃｈＩＩｌｏｎｄＣａｌｉｆ’ｏｒｎ１ａ　
）を用いて得られたものより２０％高い。

実施例３固定化プロティンＡ（プロティンＡアビラドゲル（商標
）　、ＢｉｏＰｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎｃ。

Ｔｕｓｔｌｎ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎ１ａ）　　１ｗＪを
３１のカラムに入れた。このカラムを、■ローの　０．
０２５Ｍグリシン、０．０２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，１）を用いて平衡化した。この緩衝液は、
第１表に示す異なる濃度のＫＪＰＯ４を含有する。正常
マウス血清（Ｐｅｌ−Ｐｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ、Ｒｏｇｅｒｓ、　Ａｒｋａｎｓａｓ）ｌａｌｔを緩
衝液１ｔ１７で希釈し、カラムに流した。次いで、緩衝
ｍ５−１０１を用いてカラムを洗浄した。

カラム上に吸着した免疫グロブリンを、５−の０．１Ｍ
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，５）を用いて溶
出させた。得られた免疫グロブリンの収量を第１表に示
した。

第　　１表０・６　　　　　　　　　　　　１１．００．８　　　
　　　　　　　　１３．１！・０　　　　　　　　　　
　１３．５１・２　　　　　　　　　　　１４．５に２
ＨＰＯ４の濃度がさらに高いと、免疫グロブリンが沈澱
する。

実施例４固定化プロティンＡ（プロティンＡアビラドゲル（商標
）　、ＢｉｏＰｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎｃ。

Ｔｕｓｔｌｎ、Ｃａ１ｉｆ’ｏｒｎｌａ）　　ｌ−を３
ａ１！のカラムに入れた。二〇カラムを、１０−の　０
．１Ｍグリシン、０．１Ｍホウ酸ナトリウム、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，１）を用いて平衡化
した。この緩衝液は、第２表に示す異なった濃度のに２
１１ＰＯ４含有する。腹水からのラットに鎖に対するマ
ウスモノクローナル抗体！−を緩衝液ｌ−で希釈し、カ
ラムに流した。腹水は以下のようにして得た。完全なフ
ロインドアジュバントで乳化した精製ラットに鎖を注射
することにより、ＢＡＬＢ／　Ｃマウスを免疫した。免
疫したマウスから肺臓を無菌的に摘出し、ピンセットで
細かく刻んだ。５０％ポリエチレングリコールを用いて
、マウスミエローマＲＧ１１−１５細胞を免疫したマウ
スの肺臓細胞と融合させた。ＩＩＡＴ培地における選別
および抗体を分泌するハイプリドーマクローンのスクリ
ーニングの後、５００ラドのγ線を照射したＢＡＬＢ／
　Ｃマウスの腹腔内にハイプリドーマ細胞を注入した。

得られた腹水を低速度遠心によって浄化し、固定化プロ
ティンＡを用いて精製した。モノクローナル抗体をカラ
ムに流した後、５−１０−の同じ緩衝液でカラムを洗浄
した。固定化プロティンＡ上に吸着した免疫グロブリン
を５−の０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３
，５）を用いて溶出させた。得られた免疫グロブリンの
収量を第２表に示す。比較のために、ＭＡＰＳ緩衝液お
よび２Ｍ　ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水を
用いて得られた免疫グロブリンの収量も第２表に示す。

第２表リン酸カリウム（Ｍ’）免疫グロブリン収量　　（ｍｇ）０．５０．７５１．０１．２５１．５０実施例５固定化プロティンＡ（プロティンＡアビラドゲル（商標
）　、ＢｉｏＰｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎｃ。

ＴｕｓｔｉｎＳＣａｌｉｆｏｒｎｉａ）　　ｌ−を３−
のカラムに入れた。このカラムを、ｌ　、　ＯＨＫ２１
１ＰＯ４を含有する１０−の０．０５Ｍ　トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン緩衝液（トリス緩衝液、ｐ
ｎ　８．５）で平衡化した。腹水からのマウスモノクロ
ーナル抗体ｌＩＬ＃を緩衝Ｓｔ−で希釈し、カラムに流
した。次いで、カラムを緩衝液５−１０−で洗浄した。

カラムに吸着された免疫グロブリンを、５−の０．１Ｍ
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋　３．５）で溶出
させた。

得られた免疫グロブリンの収量は２．９ａ＋ｇであった
。

実施例６使用した緩衝液が、１．５Ｍのに２ＨＰＯ４を含有する
０、２５Ｍグリシン、０．１Ｍ　）リス緩衝液（ｐｌ＋
　８．９）である以外は実施例５の手順に従った。得ら
れた免疫グロブリンの収量は４．４９ｍｇであった。

実施例７固定化プロティンＡ（プロティンＡアビラドゲル（商標
）　、ＢｉｏＰｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎｃ、、Ｔｕ５ｔｉｎ、　Ｃａ１ｉｆ’ｏｒｎｉａ
）　　Ｌ−を３−のカラムに入れた。このカラムを、１
０−の０．１Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）ア・ミノ
メタン緩衝液で平衡化した。

この緩衝液は、第３表に示すようにｐｌ＋の値を変化さ
せ、第３表に示す異なった濃度の疎水性相互作用促進塩
を含有する。ヒト免疫グロブリン溶液３−と上述の緩衝
混合液６−をよく混合し、カラムに流した。次いで、カ
ラムを緩衝液１０−で洗浄した。１０−の０．１Ｍ酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，５）を用いて、カラ
ムから結合した免疫グロブリンを溶出させた。溶出溶液
の２８０ｎｍｌ：：おける吸光度を１１＃１定すること
により、溶出液中の免疫グロブリンの量を決定した。結
果を第３表に示す。

リン酸アンモニウム硫酸アンモニウム硫酸ナトリウムリン酸アンモニウム硫酸ナトリウムこの発明は、免疫グロブリン精製のための迅速かつ簡便
な改良法を提供する。この発明の方法を実施することに
より、免疫グロブリンの収量が従来の方法より２０ない
し９０％以上改良される。

この発明の前述の記載は、説明のための特に好ましい態
様に関するものである。しかしながら、この発明の範囲
および精神から離れることなく、特定の方法および材料
において多くの変形および変更が可能であることは、当
業者にとって明らかであろう。例えば、吸着処理はバッ
チ式で、もしくは他の緩衝溶液において行なうことがで
きる。

特許請求の範囲において、この発明の正しい精神および
範囲の内にあるすべての等価物、変形および変更を網羅
することが出願人の意思である。

出願人代理人　　弁理士　鈴江武彦２２、ｌ１８．８２３．６２８．４２２．１２０．５２３．０３５．２２２．１２１．７３４．８１９．１１３．１１９．８２７．３１９．１１６．７２４．０

Claims

【特許請求の範囲】

（１）免疫グロブリンを含有する媒質と、一価のカチオンおよび多塩基性アニオンの組合わせを約
０．６Ｍないし１．７５Ｍ含有し、かつｐＨ値が約７．
５ないし１０の範囲にある緩衝溶液とを混合して緩衝免
疫グロブリン媒質を得る工程と、前記緩衝免疫グロブリン媒質を固定化プロテインＡ吸着
剤と接触させ、前記緩衝免疫グロブリン媒質中に存在す
る免疫グロブリンを前記固定化プロテインＡ吸着剤に吸
着させる工程と、免疫グロブリンを吸着した固定化プロテインＡ吸着剤を
前記緩衝溶液を用いて洗浄する工程と、免疫グロブリン
を吸着した前記固定化プロテインＡ吸着剤をｐＨ値が約
３ないし６の範囲にある緩衝溶液と接触させて固定化プ
ロテインＡ吸着剤から吸着した免疫グロブリンを除去す
る工程と、実質的に純粋な形態にある除去された免疫グ
ロブリンを回収する工程と、を有する免疫グロブリンの精製方法。
（２）前記緩衝免疫グロブリン媒質と前記固定化プロテ
インＡ吸着剤との接触を、前記固定化プロテインＡ吸着
剤のカラムにおいて行なう請求項１に記載の方法。
（３）前記の免疫グロブリンを含有する媒質が、正常哺
乳動物の血清である請求項１に記載の方法。
（４）前記の免疫グロブリンを含有する媒質が、免疫し
た哺乳動物の血清である請求項１に記載の方法。
（５）前記媒質が哺乳動物の血漿である請求項１に記載
の方法。
（６）前記媒質が哺乳動物の腹水である請求項１に記載
の方法。
（７）前記媒質がハイプリドーマから得られたものであ
る請求項１に記載の方法。
（８）前記媒質が組織培養液である請求項１に記載の方
法。
（９）前記のｐＨ値が約７．５ないし１０の範囲にある
緩衝溶液が、グリシン緩衝液である請求項１に記載の方
法。
（１０）前記のｐＨ値が約７．５ないし１０の範囲にあ
る緩衝溶液が、ホウ酸緩衝液である請求項１に記載の方
法。
（１１）前記のｐＨ値が約７．５ないし１０の範囲にあ
る緩衝溶液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液である請求項１に記載の方法。
（１２）前記のｐＨ値が約７．５ないし１０の範囲にあ
る緩衝溶液の濃度が、約０．０１Ｍないし０．２５Ｍの
範囲にある請求項１に記載の方法。
（１３）前記固定化プロテインＡ吸着剤が、架橋アガロ
ースに化学的に結合したプロテインＡである請求項１に
記載の方法。
（１４）前記固定化プロテインＡ吸着剤が、２−フルオ
ロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネー
トで活性化した水酸基含有重合体担体に化学的に結合し
ている請求項１に記載の方法。
（１５）前記のｐＨ値が約３ないし６の範囲にある緩衝
溶液が酢酸−酢酸塩緩衝液である請求項１に記載の方法
。
（１６）前記のｐＨ値が約３ないし６の範囲にある緩衝
溶液の濃度が、約０．０１Ｍないし０．２５Ｍの範囲に
ある請求項１に記載の方法。
（１７）前記緩衝溶液が、カリウムイオンおよびリン酸
イオンを約１．０Ｍないし１．５Ｍの濃度で含有する請
求項１に記載の方法。
（１８）前記緩衝溶液が、アンモニウムイオンおよびリ
ン酸イオンを約１．０Ｍないし１．５Ｍの濃度で含有す
る請求項１に記載の方法。
（１９）前記緩衝溶液が、アンモニウムイオンおよび硫
酸イオンを約１．０Ｍないし１．５Ｍの濃度で含有する
請求項１に記載の方法。
（２０）前記緩衝溶液が、ナトリウムイオンおよび硫酸
イオンを約１．０Ｍないし１．２５Ｍの濃度で含有する
請求項１に記載の方法。