CS224345B1 - Způsob isolace monoklonálních protilátek elektrodesorpcí ve stejnosměrném elektrickém poli - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu isolace monoklonálních protilátek elektródesorpcí z imobilizováného antigenu ve stejnosměrném elektrickém poli.· Protilátky sloužící diagnostickým účelům se v některých případech mohou používat bez čištění, tj. jako séra případně jako ascitické tekutiny produkčních zvířat. Pro přesné imunochemické mikroanalysy, pro léčebné účely nebo pro účely isolace antigen- ních substancí pomocí imobilizováných protilátek je třeba vyrobit preparáty protilátek, v nichž je obsah balastních bílkovin potlačen na minimum. Potlačení obsahu balastních bílkovin v preparátech protilátek se dosud dosahuje několika způsoby. Nespecifickými metodami,jako je vysolování nebo chromatografie na DEAE- -celulose,se získává méně čistý imunoglobulin, v němž vedle žádané protilátky převažují imunoglobuliny jiné povahy. V takto získaných preparátech mohou být ve stopových množstvích přítomny proteolytické enzymy pocházející z výchozí tělní tekutiny;·těmito enzymy jsou protilátky během skladování postupně degradovány. Dále jsou používány způsoby založené na principu afinitní chromatografie. Imobilizovanou složkou může být např. stafylokokový protein A, na nějž se váží téměř všechny imunoglobuliny. Z afinitního sorbentů vytěsněný preparát je poměrně čistý imunoglobulin. Tento postup však nerozlišuje mezi aktivní protilátkou a nespecifickým imunoglobulinem. Aktivní protilátka ae účinně isoluje pomocí k ní příslušného komplementárního antigenu v imobilizované formě. Způáoby využívající imobilizovaných antigenů poskytují prepařáty zbavené všech příměsí a jsou vhodné jak pro náročné analytické účely,

Description

Vynález se týká způsobu isolace monoklonálních protilátek elektródesorpcí z imobilizováného antigenu ve stejnosměrném elektrickém poli.·

Protilátky sloužící diagnostickým účelům se v některých případech mohou používat bez čištění, tj. jako séra případně jako ascitické tekutiny produkčních zvířat. Pro přesné imunochemické mikroanalysy, pro léčebné účely nebo pro účely isolace antigenních substancí pomocí imobilizováných protilátek je třeba vyrobit preparáty protilátek, v nichž je obsah balastních bílkovin potlačen na minimum. Potlačení obsahu balastních bílkovin v preparátech protilátek se dosud dosahuje několika způsoby. Nespecifickými metodami,jako je vysolování nebo chromatografie na DEAE-celulose,se získává méně čistý imunoglobulin, v němž vedle žádané protilátky převažují imunoglobuliny jiné povahy. V takto získaných preparátech mohou být ve stopových množstvích přítomny proteolytické enzymy pocházející z výchozí tělní tekutiny;·těmito enzymy jsou protilátky během skladování postupně degradovány.

Dále jsou používány způsoby založené na principu afinitní chromatografie. Imobilizovanou složkou může být např. stafylokokový protein A, na nějž se váží téměř všechny imunoglobuliny.

Z afinitního sorbentů vytěsněný preparát je poměrně čistý imunoglobulin. Tento postup však nerozlišuje mezi aktivní protilátkou a nespecifickým imunoglobulinem.

Aktivní protilátka ae účinně isoluje pomocí k ní příslušného komplementárního antigenu v imobilizované formě. Způáoby využívající imobilizovaných antigenů poskytují prepařáty zbavené všech příměsí a jsou vhodné jak pro náročné analytické účely,

- 2 224 345 tak pro účely preparativní, kde jinak příměsi citelně snižují kapacitu sorbentu s zmobilizovanou protilátkouj a tím nepříznivě ovlivňují ekonomiku preparačního postupu. Adsorbovanou protilátku je třeba z zmobilizovaného antigenu uvolnit. Nejšetrnější způsob je vytěsnění protilátky nízkomolekulárním haptenem. Tento způsob se dá však použít pouze u protilátek proti syntetickým strukturám, kde lze hapten syntetizovat a nemá význam u protilátek nejčastěji připravovaných a v průmyslu používaných, tj. u protilátek proti přírodním antigenům. Kromě toho představuje odstraněni haptenu z vazebných míst protilátky další nezbytnou operaci.

Obecně použitelné způsoby vytěsnění jsou: změna pH elučního pufru, změna iontové síly elučního pufru, změna teploty elučního pufru, přídavek chaotropních činidel nebo detergentů do elučního pufru, případně kombinace uvedených metod. Společnou nevýhodou užívaných způsobů uvolňování protilátek je, že po odstranění disociačního agens nebo po neutralizaci ztratí část protilátky rozpustnost, čímž dochází k citelným ztrátám, které mohou činit až 50 %.

Je znám též způsob elektrodesorpce protilátek z zmobilizovaného antigenu stejnosměrným elektrickým polem v homogenním elektrolytu. Elektrodesorpce nevyžaduje přídavku žádného disociačního agens a zpravidla se dá provést v nedenaturujících podmínkách. Nevýhodou tohoto postupu je pomalé uvolňování protilátek ve velmi zředěném stavu.

Uvedené nevýhody dosud používaných způsobů odstraňuje způsob isolace monoklonálních protilátek podle tohoto vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že adsorbované protilátky na zmobilizovaném antigenu se desorbují v izotachoforetickém systému elektrolytů. Izotachoforetický systém elektrolytů se skládá z vedoucího elektrolytu, jenž obsahuje vedoucí ion s efektivní pohyblivostí vyšší_z než je efektivní pohyblivost protilátky, a protiion s ionogenní skupinou, jejíž pKa je v rozsahu 4,5 až 9,5 a z koncového elektrolytu, který obsahuje koncový ion s efektivní pohyblivostí nižší než je efektivní pohyblivost desorbované- proti- 3

224 34S lótiQ^ a libovolný protilon. Koncentrace vedoucího iontu je v rozmezí 0,001 až 0,05 molA a koncentrace koncového iontu 0,001 až 0,1 mol A* Adsorbované protilátky se z imobilizováného antigenu uvolňují do roztoku působením stejnosměrného elektrického pole intensity 5 až 500 V/cm v izotachoforetickém systému elektrolytů.

* Výhodou způsobu podle vynálezu je rychlé uvolňování protilá tek z imobilizováného antigenu v nedestruktivních a nedenaturujících podmínkách a možnost získání roztoků čistých protilátek v koncentracích až několika hmotnostních %, kde koncentraci desorbované protilátky lze řídit koncentrací vedoucího iontu ve vedoucím elektrolytu.

Vynález a jeho výhody jsou blíže vysvětleny pomocí dále uve děných příkladů jeho provedení.

Příklad 1

Imunoglobulin získaný z myší ascitické tekutiny/obsahující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu. preparativní zonovou elektroforesou ve škrobovém bloku při pH 8,6 v 50 mmolA diethylbarbituratovém pufru /diethylbarbiturót sodný - kyselina diethylbarbiturová/j byl rozpuštěn v 0,15 molA chloridu sodném na koncentraci 0,28 hmotnostních %. Odděleně. byl připraven vedoucí elektrolyt o pH 5,9 sestávající z 0,01 molA hydroxidu sodného a 0,0? molA kyseliny 2-/N-morfolino/ethansulfonové a koncový elektrolyt sestávající z 0,01 molA kyseliny 6-aminokapronové adjustované kyselinou chlorovodíkovou na pH. 5,2.0,5 ml roztoku imunoglobulinu bylo smíseno s 5 ml vedoucího elektrolytu a k výslednému roztoku bylo přidáno 100 mg afinitního sorbentu připraveného z 15 mg prasečího transferinu a 85 mg jemně granulovaného polyethylenglykoltereftalátu polymerací pomocí glutaraldehydu. Po 20 min. průběhu adsorpce protilátek za míchání byla tekutina odstraněna a afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl promyt 20 ml vedoucího elektrolytu. Promytý afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl umístěn na rozhraní mezi vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt. Na tento systém bylo zavedeno; stejnosměrné elektrické póly, anoda do koncového elektrolytu, katoda do vedoucího elektrolytu. De224 345

- 4 sorpce probíhala při intensitě pole od 8 do 80 V/cm 60 min. při teplotě vrstvy sorbentu 2O$a25°C. Z prostoru mezi vrstvou sorbentu a katodou bylo získáno 25jul 1% roztoku protilátky o pH 5,3. Po zředění na 0,5 ml a úpravě pH na 7,0 zůstal roztok protilátky zce la čirý. Vazebná aktivita protilátky zůstala zachována, jak bylo ověřeno imunoprecipitačníni testem.

Příklad 2.

Imunoblobulin získaný z myší ascitické tekutiny^obsahující protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu_fbyl rozpuštěn v 0,15 mo.1/1 chloridu sodném na koncentraci 0,28 hmotnostních %. Odděleně byl připraven vedoucí elektrolyt sestávající z 0,02 mol/1 hydroxidu sodného a 0,06 mol/1 kyseliny 2-/N-morfolino/ ethansulfonové a koncový elektrolyt sestávající z 0,02 mol/1 kyseliny 6-aminokapronové adjustované kyselinou chlorovodíkovou na pH 5,2. 0,5 ml roztoku imunoglobulinu bylo smíseno s 5 ml vedoucího elektrolytu a k výslednému roztoku bylo přidáno 100 mg afinitního sorbentu připraveného z 15 mg prasečího transferinu a 85 mg jemně granulovaného polyethylenglykoltereftalátu polymerací pomocí glutaraldehydu. Po 20 minutách průběhu adsorpce protilátek za míchání byla tekutina odstraněna a afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl promyt 20 ml vedoucího elektrolytu. Promytý afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl umístěn na rozhraní mezi vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt.

Na tento systém bylo zavedeno stejnosměrné elektrické pole, anoda do koncového elektrolytu, katoda do vedoucího elektrolytu. Desorpee probíhala při intenzitě pole 8flj^80 V/cm 60 minut při teploté vrstvy sorbentu 2O4Í25°G. Z prostoru mezi vrstvou sorbentu a katodou bylo získáno 25JU1 2% roztoku, protilátky o pH 5,0. Po zředění na 0,5 ml a úpravě pH na 7,0 zůstal roztok protilátky čirý. Vazebná aktivita protilátky zůstala zachována, jak bylo ověřeno imunoprecipitačním testem.

Příklad 3

Imunoglobulin získaný z myší ascitické tekutinyjobsahující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti lidskému transferinu^byl rozpuštěn v 0,12 mol/1 chloridu sodném na koncentraci 1,0 hmotnostní %. Odděleně byl připraven vedoucí elektrolyt

-5224 345 o pR 5,2 sestávající z 0,01 mol/1 hydroxidu draselného adjustovaného kyselinou octovou na žádané pR a koncový elektrolytsestávající z 0,01 mol/1 ^-alaninu adjustováného kyselinou octovou na pH 5,1. lOO^il roztoku imunoglobulinu bylo smíseno s 5 ml vedoucího elektrolytu a k výslednému roztoku bylo přidáno 100 mg «finitního sorbentu připraveného z 15 mg lidského transferinu a 85 mg jemně granulovaného polyethylenglykoltereftalátu polymerací pomocí glutaraldehydu. Po 15 min. průběhu adsorpce protilátek za míchání byla tekutina odstraněna a afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl promyt 15 ml vedoucího elektrolytu. Promytý afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl umístěn na rozhraní mezi vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt. Na tento systém bylo zavedeno stejnesměrné elektrické pole, anoda do koncového elektrolytu, katoda do vedoucího elektrolytu. Desorpce probíhala po dobu 40 minut při intensitě, pole ód 5 do 50 V/cm při teplotě vrstvy sorbentu 18|ř20^oC. Z prostoru mezi vrstvou sorbentu a katodou bylo získáno 25./11 1,2% roztoku protilátky o pH 5,0. Po zředění na 0,5 ml a úpravě pH ha 7,0 zůstal roztok protilátky zcela čirý. Vazebná aktivita protilátky zůstala zachována, jak bylo ověřeno imunoprecipitačním testem.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   224 34S

   1. Způsob isolace monoklonálních protilátek elektrodesorpcí v stejnosměrném elektrickém polij vyznačující se tím, že proti látky adsorbované na imobilizováném antigenu se desorbují v isotachoforetickém systému elektrolytů skládajícím se z vedoucího elektrolytu, jenž obsahuje vedoucí ion v množství 0,001 až 0,05 molA s efektivní pohyblivostí vyšším než je efektivní pohyblivost protilátky, a protiion s ionogenní skupinou, jejíž pK_a je v rozsahu 4,5 až 9,5, a z koncového elektrolytu, který obsahuje koncový ion v množství 0,001 až 0,1 molA, jehož efektivní pohyblivost je nižší než efektivní pohyblivost. desorbované protilátky, a libovolný protiion.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že adsorbované proti látky se desorbují z antigenu imobilisovaného na rigidních částicích nosiče neprostupných pro elektrolyt, s výhodou na částicích z polymerů na bázi diolů a dikarboxylových kyselin, například polyetylenglykoltereftalátu.