WO2007017242A2 - Neuartiges virusreduktionsverfahren basierend auf detergentien und scherkräften - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method for reducing the infectivity of viruses in the production process of biologics, wherein chemical and / or physical methods which as such have no or only minimal virus inactivation capacity combined with the application of mechanical shear forces.
- Biologics are, or include, therapeutic proteins (active ingredients), e.g. from blood or plasma, urine or other biological fluids of animal or human origin, from in vitro cultures of cells of animal or human origin or from in vivo cultures of cells or organs and tissues of animal and human origin.
- Pasteurization heat treatment in a (stabilized) solution at usually 60 ° C.
- the solvent / detergent (SD) method (Horowitz et al., Inactivation of viruses in labile blood derivatives., Disruption of lipid-enveloped viruses by tri (n-butyl) phosphate / detergent combinations., Transfusion 25, 1985, 516-522). and treatment of product intermediates with caprylate (Lebing et al., Properties of a novel intravenous immunoglobulin produced by virus inactivation with caprylate and column chromatography, Vox Sanguinis 84, 2003, 193-201) results in effective inactivation of enveloped viruses.
- other methods such as irradiation (UV-C or gamma irradiation) or the use of nucleic acid-intercalating substances are used.
- measures are used to remove viruses, such as filtration. In this case, viruses are retained according to their size by small-pored filter materials and collected plasma proteins in the filtrate.
- virus reduction methods are influenced by the physicochemical properties of viruses, eg the SD method is only effective against enveloped viruses and irradiation especially against viruses with single-stranded nucleic acid, according to the guidelines of the authorities (eg CPMP / BWP / 269/95) frequently 2 Procedural steps for virus reduction integrated in the production process of biologicals to inactivate and / or remove a wide range of viruses such as enveloped and non-enveloped viruses.
- the combination SD method and dry heating is a widely used method in plasma derivatives (Dichtelmüller et al., Improvement of virus safety of an S / D-treated factor VIII concentrate by additional dry heat treatment at 100 degrees C, Biologicals 24, 1996 , 125-30).
- the combination SD method and virus filtration is also a way to inactivate and remove a wide range of viruses (EP1161958A).
- viruses The reliable removal of viruses depends on the properties of the viruses and the active components of the biologics. Since many plasma protein molecules are similar in size to small viruses, virus removal by filtration on these plasma proteins is not possible because the proteins are also retained by the filter. That's why it's small (compared to viruses)
- solubilizers should be avoided in biologics in order to have as little as possible toxic reagent in the product intermediate, which then consuming to or to induce no reaction of the solubilizer with substances of the product intermediates.
- amphiphilic substances such as nonionic, cationic, anionic and amphoteric surfactants and phospholipids, alcohols, fatty acids, chaotropic substances such as urea, thiocyanate, guanidinium hydrochloride, chelating agents such as EDTA, high ionic strength such as high concentrations of cations eg Na + , Ca 2+ , NH 4 + and anions such as Cl " and SO 4 2" , more alkaline, preferably pH 8.0-13.0 and acidic, preferably pH 1.5-5.5, pH and increased temperature, preferably 30 - 80 may inactivate 0 C, particularly preferably 30-60 0 C.
- amphiphilic substances such as nonionic, cationic, anionic and amphoteric surfactants and phospholipids, alcohols, fatty acids, chaotropic substances such as urea, thiocyanate, guanidinium hydrochloride, chelating agents such as EDTA, high ionic strength such
- the pore size in relation to the virus diameter in a range of 0.3 to 4.0, preferably 0.5 to 3, most preferably 0.5 to 2.0 (mean pore diameter / mean virus diameter) should be.
- Viruses inactivated by the method described can still be detected by NAT / PCR (Nucleic Acid Amplification Technique / Polymerase Chain Reaction). The destabilization and application of the shear forces can occur virtually simultaneously or sequentially.
- amphiphilic substances in particular surfactants, used in concentrations of at most 2.0% (wt / vol), in particular 0.001 to 1, 0%.
- concentrations of amphiphilic substances depends very much on their structure. However, the person skilled in the art, knowing the present invention, can determine the exact concentration by simple experiments at various concentrations.
- virus reduction factor of at least 1 logio, preferably 2 logio, more preferably at least 3 logio.
- Bovine viral diarrhea virus (BVDV), a enveloped virus of the family Flaviviridae, having a diameter of about 40 to 60 nm, was suspended in physiological saline (0.9% (w / v) NaCl pH 7.2). To this virus-added solution was added Tween 80 stock solution (final concentration of Tween 80 was 0.02%). The samples were filtered through a 75 nm nominal pore size virus filter (Planova75N, Asahi-Kasei) according to the manufacturer's instructions.
- BVDV Bovine viral diarrhea virus
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Infektiosität von Viren im Herstellungsprozess von Biologika, wobei chemische und/oder physikalische Methoden die als solche keine oder nur minimale Virusinaktivierungskapazität besitzen mit der Anwendung mechanischer Scherkräften kombiniert werden.
Description
ZLB BEHRING GMBH 2005_M005_A109
Pfe/kp
Neuartiges Virusreduktionsverfahren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Infektiosität von Viren im Herstellungsprozess von Biologika, wobei chemische und/oder physikalische Methoden die als solche keine oder nur minimale Virusinaktivierungskapazität besitzen mit der Anwendung mechanischer Scherkräften kombiniert werden.
Die Virussicherheit von Biologika beruht auf einem multifaktoriellen Ansatz mit (1) Auswahl des Ausgangsmaterials mit keinem oder minimalem Gehalt an infektiösen Viren, (2) Testung von Produktintermediaten und (3) Herstellungsprozess mit Verfahrensschritten, die Viren inaktivieren und/oder entfernen. Biologika sind, oder enthalten, therapeutische Proteine (aktive Bestandteile) die, z.B. aus Blut bzw. Plasma, Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten tierischen oder menschlichen Ursprungs, aus in vitro Kulturen von Zellen tierischen oder menschlichen Ursprungs oder aus in vivo Kulturen von Zellen oder Organen und Geweben tierischen und menschlichen Ursprungs gewonnen worden sind.
Viele Verfahrensschritte mit hoher Kapazität Viren zu inaktivieren und/oder zu entfernen sind bekannt, so z.B. Virusinaktivierung durch erhöhte Temperatur oder durch Chemikalien, die insbesondere die Lipidhülle von Viren zerstören. Die Pasteurisierung (Hitzebehandlung in einer (stabilisierten) Lösung bei üblicherweise 600C über 10 Stunden; Chandra et al. Effectiveness of alternative treatments for reducing potential viral contamination from plasma-derived products - Thrombosis Research 2002;105:391-400), die Dampfbehandlung (Kreil et al., West Nile virus and
the safety of plasma derivatives: verification of high safety margins, and the validity of predictions based on model virus data, Transfusion 43, 2003, 1023 - 1028) sowie die Trockenerhitzung (Roberts and Hart, Comparison of the inactivation of canine and bovine parvovirus by freeze drying and dry-heat treatment in two high purity factor VIII concentrates, Biologicals 28, 2000, 185 - 188) führt zu einer wirksamen Inaktivierung von Viren. Das Solvent/Detergens (SD)-Verfahren (Horowitz et al., Inactivation of viruses in labile blood derivatives. Disruption of lipid-enveloped viruses by tri(n- butyl)phosphate/detergent combinations. Transfusion 25, 1985, 516-522) sowie die Behandlung von Produkt-Intermediaten mit Caprylat (Lebing et al., Properties of a new intravenous immunoglobulin produced by virus inactivation with caprylate and column chromatography, Vox Sanguinis 84, 2003, 193 - 201) führt zu einer wirksamen Inaktivierung von umhüllten Viren. Daneben kommen weitere Verfahren wie Bestrahlung (UV-C oder Gammabestrahlung) oder der Einsatz von nukleinsäure- interkalierenden Substanzen zum Einsatz. Neben diesen Beispielen von Verfahren zur Virusinaktivierung finden Maßnahmen Anwendung, die Viren entfernen, so z.B. Filtration. Hierbei werden Viren entsprechend ihrer Größe durch kleinporige Filtermaterialien zurückgehalten und Plasmaproteine im Filtrat gesammelt.
Da Virusreduktionsverfahren von den physikochemischen Eigenschaften von Viren beeinflußt werden, so ist z.B. das SD-Verfahren nur gegenüber umhüllten Viren und Bestrahlung besonders gegenüber Viren mit einzelsträngiger Nukleinsäure wirksam, werden entsprechend den Richtlinien der Behörden (z.B. CPMP/BWP/269/95) häufig 2 Verfahrensschritte zur Virusreduktion im Herstellungsverfahren von Biologika integriert um ein breites Spektrum an Viren wie umhüllte und nicht-umhüllte Viren zu inaktivieren und/oder zu entfernen. So ist z.B. die Kombination SD-Verfahren und Trockenerhitzung ein weit verbreitetes Verfahren bei Plasmaderivaten (Dichtelmüller et al., Improvement of virus safety of a S/D-treated factor VIII concentrate by additional dry heat treatment at 100 degrees C, Biologicals 24, 1996,125-30). Die Kombination
SD-Verfahren und Virusfiltration ist ebenfalls eine Möglichkeit um ein breites Spektrum an Viren zu inaktivieren und zu entfernen (EP1161958A).
Die zuverlässige Entfernung von Viren ist abhängig von den Eigenschaften der Viren und den aktiven Bestandteilen der Biologika. Da viele Plasmaproteinmoleküle eine ähnliche Größe wie kleine Viren besitzen, ist eine Virusentfernung durch Filtration bei diesen Plasmaproteinen nicht möglich, da die Proteine ebenfalls durch den Filter zurückgehalten werden. Deshalb lassen sich kleine (verglichen mit Viren)
Proteinmoleküle relativ einfach von Viren durch Filtration trennen, nicht jedoch größere Proteinmoleküle, die denselben oder sogar größeren Durchmesser haben wie kleine
Viren.
In der Patentschrift EP 0 727 226 B1 / US 6,391 ,657 B1 wurde beschrieben, dass der Durchmesser von Viren durch Bindung an Antikörper vergrößert werden kann um so eine Trennung von Viren und größeren Proteinmolekülen durch Filtration zu erreichen. Die Zugabe von Antikörpern, um Viren zu komplexieren, ist jedoch nicht immer möglich, da (1) Antikörper den weiteren Produktionsprozess von Biologika stören können oder (2) nicht im Produkt enthalten sein sollen oder (3) Antikörper gegen Viren, auch "new emerging viruses", nicht in ausreichender Qualität und Menge vorhanden sind um dem Herstellungsprozess von Biologika zugesetzt zu werden.
Wie erwähnt ist das SD-Verfahren sehr wirksam gegen umhüllte Viren. Es konnte gezeigt werden, dass das Detergens (z.B. Tween 80) allein jedoch nur zu einer vernachlässigbaren Virusinaktivierung führt (Horowitz, B. - Curr Stud Hematol Blood Transfus 1989;56:83-96), so dass ein Lösungsvermittler wie TNBP (Tris-N-Butyl- Phosphat) für eine wirksame Virusinaktivierung zwingend notwendig ist. Grundsätzlich sollten jedoch bei Biologika Lösungsvermittler vermieden werden, um so wenig wie möglich toxisches Reagens im Produktintermediat zu haben, das dann aufwendig zu
entfernen ist, oder um keine Reaktion des Lösungsvermittlers mit Substanzen des Produktintermediates zu induzieren.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die alleinige Zugabe eines Detergens ohne Lösungsvermittler in einer Konzentration, die als solche Viren nicht inaktiviert, zu einer deutlich erhöhten Reduktion der Virusinfektiosität nach Virusfiltration führt, sogar bei Filtern mit einer Porengröße, die die Größe der Viren sogar überschreiten kann.
Es konnte gezeigt werden, dass chemische oder physikalische Methoden, die zu einer Destabilisierung der Virusstruktur führen, zu einer erhöhten Virusreduktion führten, wenn Scherkräfte auf die derart destabilisierten Viren einwirken. Dieses Ergebnis tritt auch bei Konzentrationen oder Intensitäten auf, die allein zu keiner oder nur geringen Virusinaktivierung führen. Beispiele für diese Methoden zur Destabilisierung von Viren sind amphiphile Substanzen wie nicht-ionische, kationische, anionische und amphotere Tenside und Phospholipide, Alkohole, Fettsäuren, chaotrope Substanzen wie Urea, Thiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Chelatbildner wie EDTA, hohe lonenstärke wie hohe Konzentrationen von Kationen z.B. Na+, Ca2+, NH4 + und Anionen wie Cl" und SO4 2", alkalischer, bevorzugterweise pH 8,0 - 13,0 und sauer, bevorzugterweise pH 1 ,5 - 5,5, pH-Wert und erhöhte Temperatur, bevorzugterweise 30 - 80 0C, besonders bevorzugterweise 30-60 0C. Scherkräfte, die Viren in Gegenwart von destabilisierenden Agentien oder Verfahren inaktivieren können, treten z. B. bei Filtration (Tiefenfilter, Sterilfilter und Virus-/Nanofilter) und Chromatographie (Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie, Hydrophobe Interaktionschroma- tographie , Affinitätschromatographie, Membranchromatographie), aber auch den bekannten Homogenisationsverfahren, wie z.B. Ultraschall oder mechanischen Homogenisatoren wie UltraTurrax® (IKA Werke, Janke & Kunkel GmbH & Co KG, Staufen, Deutschland), Hochdruckhomogenisatoren oder Kugelmühlen und Ähnlichen auf. Bei der Verwendung von Filtern hat sich gezeigt, dass die Porengrösse im Bezug
auf den Virusdurchmesser in einem Bereich von 0,3 bis 4,0, bevorzugterweise 0,5 bis 3, ganz bevorzugterweise 0,5 bis 2,0 (mittlerer Porendurchmesser / mittlerer Virusdurchmesser) sein sollte. Durch das beschriebene Verfahren inaktivierte Viren lassen sich noch durch NAT/PCR (Nucleic Acid Amplification Technique/ Polymerase Chain Reaction) nachweisen. Die Destabiliserung und Anwendung der Scherkräfte können praktisch zeitgleich oder sequentiell erfolgen.
Bevorzugterweise werden amphiphile Substanzen, insbesondere Tenside, eingesetzt in Konzentrationen von höchstens 2,0 % (Gew/Vol), insbesondere 0,001 bis 1 ,0%. Die bevorzugte Konzentration der amphiphilen Substanzen hängt dabei ganz wesentlich von ihrer Struktur ab. Der Fachmann kann allerdings in Kenntnis der vorliegenden Erfindung die genaue Konzentration durch einfache Versuche bei verschiedenen Konzentrationen ermitteln.
Im Vergleich von Infektiositätsdaten und NAT/PCR-Daten wird gezeigt, dass Infektiosität durch das beschriebene Verfahren stärker reduziert wird als virale Nukleinsäuren. Verdaus von Aliquots des Ausgangsmaterials mit DNase bei DNA Viren bzw. RNase bei RNA Viren und anschließende NAT/PCR belegen, dass das beschriebene Verfahren Viruspartikel zerstört und somit zu einer deutlichen Reduktion der Infektiosität im Filtrat führt.
Deutlich im Sinne dieser Anmeldung bedeutet eine Erhöhung des Virusreduktionsfaktor von mindestens 1 logio, bevorzugterweise 2 logio, besonders bevorzugterweise mindestens 3 logio.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, in keiner Weise dagegen einschränken.
Beispiel:
Bovines virales Diarrhoevirus (BVDV), ein umhülltes Virus der Familie Flaviviridae, mit einem Durchmesser von etwa 40 bis 60 nm wurde in physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % (Gew/ VoI) NaCI pH 7,2) suspendiert. Zu dieser virusversetzten Lösung wurde Tween 80-Stammlösung gegeben (Endkonzentration von Tween 80 betrug 0,02%). Die Proben wurden durch einen Virusfilter mit einer nominellen Porengröße von 75 nm (Planova75N, Asahi-Kasei) entsprechend den Herstellerangaben filtriert. Die Ergebnisse (Tabellei ) zeigen, dass BVDV nicht signifikant durch den Filter zurückgehalten wird; die Zugabe von Tween 80 in einer Konzentration die keine Virusinaktivierung verursacht (vgl. Standkontrolle) führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Infektiosität im Filtrat.
Tabelle 1 : Erhöhte Virusreduktion durch Filtration nach Zugabe von Polysorbat 80
Claims
1. Verfahren zur Reduktion der Infektiosität von Viren im Herstellungsprozess von Biologika, dadurch gekennzeichnet dass die Biologika
1 ) chemischen und/oder physikalischen Methoden, die als solche keine oder nur minimale Virusinaktivierungskapazität besitzen, unterworfen werden, und
2) diese so vorbehandelten Biologika mechanischen Scherkräften ausgesetzt werden, die zu einer deutlichen Virusinaktivierung führen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass die Biologika
1) mit soviel Tensid versetzt werden, dass eine Endkonzentration von höchstens 2% (GewA/ol) erreicht wird, und
2) diese so vorbehandelten Biologika einer Filtration durch ein Filter mit einer Porengrösse, die in etwa der Virengröße entspricht, ausgesetzt werden.
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| TROCCOLI N ET AL: "Removal of Viruses from Human Intravenous Immune Globulin by 35nm Nanofiltration" BIOLOGICALS, ACADEMIC PRESS LTD., LONDON, GB, Bd. 26, 1998, Seiten 321-329, XP002989005 ISSN: 1045-1056 * |
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