DE102005038012A1 - Neuartiges Virusreduktionsverfahren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Infektiosität von Viren im Herstellungsprozess von Biologika, wobei chemische und/oder physikalische Methoden, die als solche keine oder nur minimale Virusaktivierungskapazität besitzen, mit der Anwendung mechanischer Scherkräfte kombiniert werden.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Infektiosität von Viren im Herstellungsprozess von Biologika, wobei chemische und/oder physikalische Methoden die als solche keine oder nur minimale Virusinaktivierungskapazität besitzen mit der Anwendung mechanischer Scherkräften kombiniert werden.
• Die Virussicherheit von Biologika beruht auf einem multifaktoriellen Ansatz mit (1) Auswahl des Ausgangsmaterials mit keinem oder minimalem Gehalt an infektiösen Viren, (2) Testung von Produktintermediaten und (3) Herstellungsprozess mit Verfahrensschritten, die Viren inaktivieren und/oder entfernen. Biologika sind, oder enthalten, therapeutische Proteine (aktive Bestandteile) die, z.B. aus Blut bzw. Plasma, Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten tierischen oder menschlichen Ursprungs, aus in vitro Kulturen von Zellen tierischen oder menschlichen Ursprungs oder aus in vivo Kulturen von Zellen oder Organen und Geweben tierischen und menschlichen Ursprungs gewonnen worden sind.
• Viele Verfahrensschritte mit hoher Kapazität Viren zu inaktivieren und/oder zu entfernen sind bekannt, so z.B. Virusinaktivierung durch erhöhte Temperatur oder durch Chemikalien, die insbesondere die Lipidhülle von Viren zerstören. Die Pasteurisierung (Hitzebehandlung in einer (stabilisierten) Lösung bei üblicherweise 60°C über 10 Stunden; Chandra et al. Effectiveness of alternative treatments for reducing potential viral contamination from plasma-derived products – Thrombosis Research 2002;105:391–400), die Dampfbehandlung (Kreil et al., West Nile virus and the safety of plasma derivatives: verification of high safety margins, and the validity of predictions based on model virus data, Transfusion 43, 2003, 1023–1028) sowie die Trockenerhitzung (Roberts and Hart, Comparison of the inactivation of canine and bovine parvovirus by freeze drying and dry-heat treatment in two high purity factor VIII concentrates, Biologicals 28, 2000, 185–188) führt zu einer wirksamen Inaktivierung von Viren. Das Solvent/Detergens (SD)-Verfahren (Horowitz et al., Inactivation of viruses in labile blood derivatives. Disruption of lipid-enveloped viruses by tri(n-butyl)phosphate/detergent combinations. Transfusion 25, 1985, 516–522) sowie die Behandlung von Produkt-Intermediaten mit Caprylat (Lebing et al., Properties of a new intravenous immunoglobulin produced by virus inactivation with caprylate and column chromatography, Vox Sanguinis 84, 2003, 193–201) führt zu einer wirksamen Inaktivierung von umhüllten Viren. Daneben kommen weitere Verfahren wie Bestrahlung (UV-C oder Gammabestrahlung) oder der Einsatz von nukleinsäureinterkalierenden Substanzen zum Einsatz. Neben diesen Beispielen von Verfahren zur Virusinaktivierung finden Maßnahmen Anwendung, die Viren entfernen, so z.B. Filtration. Hierbei werden Viren entsprechend ihrer Größe durch kleinporige Filtermaterialien zurückgehalten und Plasmaproteine im Filtrat gesammelt.
• Da Virusreduktionsverfahren von den physikochemischen Eigenschaften von Viren beeinflußt werden, so ist z.B. das SD-Verfahren nur gegenüber umhüllten Viren und Bestrahlung besonders gegenüber Viren mit einzelsträngiger Nukleinsäure wirksam, werden entsprechend den Richtlinien der Behörden (z.B. CPMP/BWP/269/95) häufig 2 Verfahrensschritte zur Virusreduktion im Herstellungsverfahren von Biologika integriert um ein breites Spektrum an Viren wie umhüllte und nicht-umhüllte Viren zu inaktivieren und/oder zu entfernen. So ist z.B. die Kombination SD-Verfahren und Trockenerhitzung ein weit verbreitetes Verfahren bei Plasmaderivaten (Dichtelmüller et al., Improvement of virus safety of a S/D-treated factor VIII concentrate by additional dry heat treatment at 100 degrees C, Biologicals 24, 1996, 125–30). Die Kombination SD-Verfahren und Virusfiltration ist ebenfalls eine Möglichkeit um ein breites Spektrum an Viren zu inaktivieren und zu entfernen (EP1161958A).
• Die zuverlässige Entfernung von Viren ist abhängig von den Eigenschaften der Viren und den aktiven Bestandteilen der Biologika. Da viele Plasmaproteinmoleküle eine ähnliche Größe wie kleine Viren besitzen, ist eine Virusentfernung durch Filtration bei diesen Plasmaproteinen nicht möglich, da die Proteine ebenfalls durch den Filter zurückgehalten werden. Deshalb lassen sich kleine (verglichen mit Viren) Proteinmoleküle relativ einfach von Viren durch Filtration trennen, nicht jedoch größere Proteinmoleküle, die denselben oder sogar größeren Durchmesser haben wie kleine Viren.
• In der Patentschrift EP 0 727 226 B1 / US 6,391,657 B1 wurde beschrieben, dass der Durchmesser von Viren durch Bindung an Antikörper vergrößert werden kann um so eine Trennung von Viren und größeren Proteinmolekülen durch Filtration zu erreichen. Die Zugabe von Antikörpern, um Viren zu komplexieren, ist jedoch nicht immer möglich, da (1) Antikörper den weiteren Produktionsprozess von Biologika stören können oder (2) nicht im Produkt enthalten sein sollen oder (3) Antikörper gegen Viren, auch "new emerging viruses", nicht in ausreichender Qualität und Menge vorhanden sind um dem Herstellungsprozess von Biologika zugesetzt zu werden.
• Wie erwähnt ist das SD-Verfahren sehr wirksam gegen umhüllte Viren. Es konnte gezeigt werden, dass das Detergens (z.B. Tween 80) allein jedoch nur zu einer vernachlässigbaren Virusinaktivierung führt (Horowitz, B. – Curr Stud Hematol Blond Transfus 1989;56:83–96), so dass ein Lösungsvermittler wie TNBP (Tris-N-Butyl-Phosphat) für eine wirksame Virusinaktivierung zwingend notwendig ist. Grundsätzlich sollten jedoch bei Biologika Lösungsvermittler vermieden werden, um so wenig wie möglich toxisches Reagens im Produktintermediat zu haben, das dann aufwendig zu entfernen ist, oder um keine Reaktion des Lösungsvermittlers mit Substanzen des Produktintermediates zu induzieren.
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die alleinige Zugabe eines Detergens ohne Lösungsvermittler in einer Konzentration, die als solche Viren nicht inaktiviert, zu einer deutlich erhöhten Reduktion der Virusinfektiosität nach Virusfiltration führt, sogar bei Filtern mit einer Porengröße, die die Größe der Viren sogar überschreiten kann.
• Es konnte gezeigt werden, dass chemische oder physikalische Methoden, die zu einer Destabilisierung der Virusstruktur führen, zu einer erhöhten Virusreduktion führten, wenn Scherkräfte auf die derart destabilisierten Viren einwirken. Dieses Ergebnis tritt auch bei Konzentrationen oder Intensitäten auf, die allein zu keiner oder nur geringen Virusinaktivierung führen. Beispiele für diese Methoden zur Destabilisierung von Viren sind amphiphile Substanzen wie nicht-ionische, kationische, anionische und amphotere Tenside und Phospholipide, Alkohole, Fettsäuren, chaotrope Substanzen wie Urea, Thiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Chelatbildner wie EDTA, hohe Ionenstärke wie hohe Konzentrationen von Kationen z.B. Na⁺, Ca²⁺, NH₄ ⁺ und Anionen wie Cl^- und SO₄ ^2-, alkalischer, bevorzugterweise pH 8,0–13,0 und sauer, bevorzugterweise pH 1,5–5,5, pH-Wert und erhöhte Temperatur, bevorzugterweise 30–80°C, besonders bevorzugterweise 30–60°C. Scherkräfte, die Viren in Gegenwart von destabilisierenden Agentien oder Verfahren inaktivieren können, treten z. B. bei Filtration (Tiefenfilter, Sterilfilter und Virus-/Nanofilter) und Chromatographie (Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Membranchromatographie), aber auch den bekannten Homogenisationsverfahren, wie z.B. Ultraschall oder mechanischen Homogenisatoren wie UltraTurrax^® (IKA Werke, Janke & Kunkel GmbH & Co KG, Stauten, Deutschland), Nochdruckhomogenisatoren oder Kugelmühlen und Ähnlichen auf. Bei der Verwendung von Filtern hat sich gezeigt, dass die Porengrösse im Bezug auf den Virusdurchmesser bevorzugterweise sich in einem Bereich von 0,5 bis 3,0 (mittlerer Porendurchmesser/mittlerer Virusdurchmesser) sein sollte. Durch das beschriebene Verfahren inaktivierte Viren lassen sich noch durch NAT/PCR (Nucleic Acid Amplification Technique/Polymerase Chain Reaction) nachweisen. Die Destabiliserung und Anwendung der Scherkräfte können praktisch zeitgleich oder sequentiell erfolgen.
• Bevorzugterweise werden amphiphile Substanzen, insbesondere Tenside, eingesetzt in Konzentrationen von höchstens 2,0 % (Gew/Vol), insbesondere 0,001 bis 1,0%,. Die bevorzugte Konzentration der amphiphilen Substanzen hängt dabei ganz wesentlich von ihrer Struktur ab. Der Fachmann kann allerdings in Kenntnis der vorliegenden Erfindung die genaue Konzentration durch einfache Versuche bei verschiedenen Konzentrationen ermitteln.
• Im Vergleich von Infektiositätsdaten und NAT/PCR-Daten wird gezeigt, dass Infektiosität durch das beschriebene Verfahren stärker reduziert wird als virale Nukleinsäuren. Verdaus von Aliquots des Ausgangsmaterials mit DNase bei DNA Viren bzw. RNase bei RNA Viren und anschließende NAT/PCR belegen, dass das beschriebene Verfahren Viruspartikel zerstört und somit zu einer deutlichen Reduktion der Infektiosität im Filtrat führt.
• Deutlich im Sinne dieser Anmeldung bedeutet eine Erhöhung des Virusreduktionsfaktor von mindestens 1 log₁₀ bevorzugterweise 2 log₁₀, besonders bevorzugterweise mindestens 3 log₁₀.
• Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, in keiner Weise dagegen einschränken.
• Bovines virales Diarrhoevirus (BVDV), ein umhülltes Virus der Familie Flaviviridae, mit einem Durchmesser von etwa 40 bis 60 nm wurde physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % (Gew/Vol) NaCl pH 7,2) suspendiert. Zu dieser virusversetzten Lösung wurde Tween 80-Stammlösung gegeben (Endkonzentration von Tween 80 betrug 0,02%). Die Proben wurden durch einen Virusfilter mit einer nominellen Porengröße von 75 nm (Planova75N, Asahi-Kasei) entsprechend den Herstellerangaben filtriert. Die Ergebnisse (Tabelle 1) zeigen, dass BVDV nicht signifikant durch den Filter zurückgehalten wird; die Zugabe von Tween 80 in einer Konzentration die keine Virusinaktivierung verursacht (vgl. Standkontrolle) führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Infektiosität im Filtrat.
• Tabelle 1: Erhöhte Virusreduktion durch Filtration nach Zugabe von Polysorbat 80

  

Claims (2)

1. Verfahren zur Reduktion der Infektiosität von Viren im Herstellungsprozess von Biologika, dadurch gekennzeichnet dass die Biologika 1) chemischen und/oder physikalischen Methoden die als solche keine oder nur minimale Virusinaktivierungskapazität besitzen unterworfen werden, und 2) diese so vorbehandelten Biologika mechanischen Scherkräften ausgesetzt werden, die zu einer deutlichen Virusinaktivierung führen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die Biologika 1) mit soviel Tensid versetzt werden, dass eine Endkonzentration von höchstens 2% (Gew/Vol) erreicht wird, und 2) diese so vorbehandelten Biologika einer Filtration durch ein Filter mit einer Porengrösse, die in etwa der Virengröße entspricht, ausgesetzt werden.