DD280174A1 - Verfahren zur beseitigung von immunglobulinaggregaten in immunglobulinpraeparaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung offenbart ein Verfahren zur Beseitigung von Immunglobulinaggregaten aus Immunglobulinpraeparaten durch biospezifische Bindung derselben an das Protein C1q, das an siliziumdioxidhaltige feste Phasen mittels Silanhaftmitteln und homo- oder heterobifunktionellen Reagenzien immobilisiert ist, wobei die so gebundenen Immunglobulinaggregate durch Abtrennung der festen Phase separiert werden und die feste Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien regeneriert wird. Die Erfindung findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der selektiven Beseitigung von Immunglobulinaggregaten aus Immunglobulinpräparaten (Gammaglobulin) unter wiederholtem und reproduzierbarem Einsatz eines beschichteten Trägers. Das Verfahren ist anwendbar in der pharmazeutischen Industrie sowie der Medizin.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es wurde eine Reihe verschiedener Immunglobulinpräparate entwickelt, die sowohl zur Prophylaxe von bestimmten viralen und toxischen Erkrankungen (Poliomyelitis, Masern, Röteln, Hepatitis, Tetanus) als auch zur Substitution von Antikörpermangelzuständen sowie zur Therapie bei schweren bakteriellen Allgemeininfekten mit oder ohne Störung der humoralen Immunabwehr eingesetzt werden. Der Einsatz dieser Präparate ist unter Berücksichtigung der gegebenen klinischen Situation kritisch abzuwägen, da alle diese Präparate - bedingt durch den Herstellungsprozeß - mit Vor- und Nachteilen behaftet

Mit Abstand am verbreitetsten ist noch immer das nach dem klassischen Cohnschen Alkoholfällungsverfahren gewonnene Standard-Gammaglobulin. Dieses Präparat zeichnet sich durch die native Struktur und Funktion der IgG-lmmunglobuline aus, die sich in der normalen biologischen Halbwertszeit, einer erhalten gebliebenen Fähigkeit der Komplementaktivierung und Opsonierung ausdrückt. Allerdings sind in diesen Präparaten auch polymere Immunglobulinaggregate enthalten, die auch in Abwesenheit von Antigenen das Komplementsystem spontan aktivieren, so daß es - insbesondere bei immundefizienten Patienten - zu lebensbedrohlichen anaphylaktoiden Reaktionen kommen kann. Deshalb dürfen derartige Präparate nicht intravenös appliziert werden, so daß sie z.T. nicht in therapeutisch adäquater Dosierung eingesetzt werden können und nur langsam aus dem Muskeldepot resorbiert werden.

Deshalb ist man auf i. v. applizierbare Immunglobulinpräparate angewiesen, die nahezu keine Komplementaktivierung auslösen können. Hierzu wurden verschiedene Methoden und Verfahren entwickelt, die jedoch alle mit Nachteilen behaftet sind. Hierbei wurden im wesentlichen folgende Wege beschriften:

- enzymatisch^ Abspaltung des Fc-Teils des IgG-Moleküls mittels Pepsin oder Plasmin,

- chemische Modifizierung des IgG-Moleküls, so daß die IgG-Aggregate die Fähigkeit verlieren, spontan Komplement zu aktivieren,

- selektive Entfernung der gebildeten Aggregate durch Ausfällung mit Polyäthylenglykol, Behandlung mit Adsorbentien oder schonende Säurebehandlung,

- Verhinderung oder Einschränkung dei Bildung von IgG-Aggregaten während der Lagerung durch Zusatz von Albumin. Alle diese Verfahren führen zu einer mehr oder weniger starken Beeinflussung oder Veränderung der Struktur und Funktion von Immunglobulinen, so daß die Wirksamkeit vermindert ist. So sind zwar die proteolytisch gespaltenen Fragmente gut verträglich, jedoch sind ihre immunologischen Effektorfunktionen, wie Aktivierung des klassischen Weges des Komplementsystepis, Stimulierung der Phagozytose sowie ihre biologische Halbwertszeit auf Grund des Fehlens des Fc-Teils stark reduziert. Ganz analog werden verschiedene biologische Effektorfunktionen durch chemische Modifizierung des IgG (ß-Propiolakton, Alkylierung) modifiziert oder gar vollständig unterdrückt. Hingegen besteht bei nicht modifizierten, nativen Immunglobulinen immer die Gefahr der spontanen Aggregation während des Herstellungsprozesses und der Lagerung, zumal die bisher eingesetzten Agenzien weder zu einer quantitativen noch selektiven Ausfällung der Immunglobulinaggregate führten.

In der französischen Patentschrift 2279419 wird ein Verfahren zur Entfernung von Immunglobulinagpregaten aus Gammaglobulinpräparaten unter Nutzung der biospezifischen Bindung an Rheumafaktoren und das Protein C 1q in flüssiger und fester Phase beschrieben.

Hierbei werden die zu entfernenden Immunglobulinaggregate entweder durch die Zugabe von Rheumafaktoren oder C1 q zur Präzipitation gebracht oder nach vorheriger Immobilisierung derselben an Sepharose gebunden. Im ersteren Fall werden die präzipitierten Immunglobulinaggregate durch Zentrifugation entfernt. Neben diesem für technologische Verfahren umständlichen Schritt besteht als entscheidender Nachteil die Gefahr der Kontamination der zu applizierenden Immunglobulinpräparate durch Rheumafaktoren bzw. C 1q, die zu erheblichen Nebenwirkungen derartiger Präparate führen wurden. Bei Bindung von Rheumafaktoren oder C 1q an Sepharose werden zwar diese Nachteile weitgehend umgangen, allerdings ist der verwendete Träger wiederum mit einer Reihe von Nachteilen verknüpft. So werden Polysaccharide wie Sepharose leicht mikrobiell angegriffen und abgebaut. Weiterhin sind sie nur bis 40°C stabil und können somit nur schwer sterilisiert werden.

Die chemische Stabilität von an Sepharos»e gebundenen Proteinen ist in vielen Fällen nicht ausreichend, so daß bei Elution insbesondere unter Verwendung von chsütropischen Ionen wie Ammoniumthiocyanat oder pH-Werten unter 4 bzw. über 9 eine Kontamination des Immunglobulinpräparates mit dem gebundenen Protein auftreten kann, die zu den bereits erwähnten Nebenreaktionen Anlaß geben kann. Alle diese Nachteile schließen ebenso wie die beschriebene Anwendung von Ammoniumthiocyana. zur Abspaltung der Aggregate als denaturierendes Agens die Wiederverwendbarkeit der Matrix aus, so daß bei Nutzung dieses Verfahrens erhebliche Kosten entstehen würden.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, Immunglobulinaggregate selektiv, einfach und schonend aus Immunglobulinprdparaten zu entfernen. Die Träger seilen sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, Immunglobulinaggregate aus Immunglobulinpräparaten an eine feste Phase (Träger) biospezifisch üu binden, wobei die feste Phase wiederverwendbar sein soll.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Protein C 1q - eine Untereinheit der ersten Komplementkomponenle - an siliziumdioxidhaltige Träger, vorzugsweise poröses Glas oder flächenförmige Glasfaserfilter, über Silanhaftmittel kovalent gebunden wird und dieses trägergebundene C 1q zur Bindung und Entfernung der Immunglobulinaggregate eingesetzt wird, wobei die an das C 1q gebundenen Immunglobulinaggregate aus den Immunglobulinpräparaten durch Abtrennung der festen Phase separiert werden und die foste Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien funktionell regeneriert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das im menschlichen und tierischen Blut vorkommende und für die Bindung von Immunkomplexen und deren physiologische Eliminierung verantwortliche Protein C 1q an siliziumdioxidhaltige Träger mit hinreichend großer Oberfläche und Porösität auf an sich bekannte vorherige chemische Oberflächenmodifizierung des Trägers mit SilanhaK.nitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien gebunden wird und dieses trägergebundene C1q für die In-vitro-Entfernung der Immunglobulinaggregate aus Immunglobiilinpräparaten eingesetzt wird und danach die so gebundenen Aggregate durch nicht denaturierende Medien wieder abgespalten werden, so daß die mit C 1q beladene Matrix erneut eingesetzt werden kann.

Der Träger hat eine unterschiedliche geometrische Form, wobei kugelförmige oder faserförmige Träger mit oder ohne Zusätzen, die auch durch Packung, Sinterung oder Verwendung eines Bindemittels zu übergeordneten Strukturen wie Filtern, Fritten und dgl. mit definierter Durchlässigkeit angeordnet sein können, besonders geeignet sind. Die siliziumdioxidhaltigen Materialien sind im wesentlichen poröse Gläser (s. hierzu: F.Janowski, W.Heyer: Poröse Gläser. Dt. Verlag für Grundstoffindustrie, Leipzig 1982), die bekanntlich problemlos sterilisiert und steril gehalten werden können, wobei deren Partikelgröße, Struktur und Porösität genau festgelegt wird. Besonders vorteilhaft sind ideal sphärische Partikel (DD-WP C03B2595548, DD-WP BO U2694382, DD-WP BOIJ 2694390) mit Partikelgrößen zwischen 1-1000Mm und Porenweiten von 0,05-100μπι, wobei sich die Porenweite und die zur Verfügung stehende Fläche, die die Kapazität des Trägers entscheidend beeinflußt, reziprok proportional verhalten. Die ideal sphärische Form der Matrix hat einen entscheidenden Einfluß auf die schonenden Bedingungen des Verfahrens, da die auf die Proteine einwirkenden Scherkräfte drastisch reduziert sind. Des weiteri.n zeichnen sich die ideal sphärischen und abriebfesten Glaspartikel durch ihre Erosionsbeständigkeit, ihre günstigen hydrodynamischen Eigenschaften, ihre Variationsbreite der Textur und somit auch der Durchflußeigenschaften sowie durch die Abwesenheit toxischer Bestandteile aus.

Insbesondere unter dem Aspekt technologischer Verfahren sind flächenförmige Träger oder Patronen mit Kommaterial oder Membranen aus porösem Glas mit übergeordneten Strukturen bzw. flächenförmige Träger, die als Filter in geeigneten Filtrationssystemen eingesetzt werden, hervorzuheben. Hier zeichnen sind besonders Glasfasern enthaltende Filtermaterialien auf Grund ihrer mechanischen Festigkeit aus. Die nicht denaturierenden Medien für die Abspaltung der gebundenen Immunglobulinaggregate setzen sich aus gepufferten Lösungen hoher lonenstärke zusammen, wobei insbesondere 0,5-3 m NaCI-Lösungen geeignet sind. Auf Haltbarkeit, Handhabung und Wiederverwendung des C1 q-beladenden Trägers wirkt sich besonders vorteilhaft aus, daß siliziumdioxidhaltige Träger keine Quell- oder Schrumpferscheinungen bei Änderung des lonenmiliüus zeigen.

Die Oberflächenmodifizierung der siliziumdioxidhdltigen Träger zum Zwecke der Schaffung von Bedingungen für das Eingehen kovalenter Bindungen mit dem Protein C1 q erfolgt durch sogenannte Silanhaftmittel wie

OR

x - (CH ) -Si-OR) , "^ OR

wobei R Alkylreste und χ Amino-, Epoxy-, Diazo-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, lsothiocyono-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen sind, und durch Umsetzen der verbleibenden funktioneilen Gruppe auf an sich bekannte Art und Weise mit homo- oder heterofunktionellen Reagenzien oder direkte Umsetzung mit den reaktiven Gruppen des Proteins.

Die so mit dem Protein C1 q beladene Matrix wird dann zur Bindung und Entfernung der Immunglobulinaggregate eingesetzt, wobei die Matrix sowohl im batch-Verfahren als auci: im Durchflußverfahren genutzt werden kann. Nach Ablauf der Reaktion und Entfernung der Matrix von den zu behandelnden Immunglobulinpräparaten werden die gebundenen Immunglobulinaggregate durch geeignete nicht denaturierende Medien wie 1 m NaCI-Lösung abgespalten, so daß das kovalent gebundene C1 q für einen erneuten Einsatz zur Verfügung steht.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die physiologische Funktion des Proteins C1 q für die selektive und schonende Bindung und damit Entfernung von Immunglobulinaggregaten aus Immunglobulinpräparaten, so daß die Wirksamkeit dieser Präparate nicht beeinflußt, jedoch die Verträglichkeit entscheidend verbessert wird.

Ausführungsbeispiele

Im folgenden wird die Erfindung durch einige Beispiele erläutert.

Beispiel 1:

Poröse Glaskugeln mit einer Porenweite von 1350Ä werden nach Kochen mit 30%iger Salpetersäure und neutralem Waschen mit einer 2%igen Lösung des Silanhaftmittels NB1114 (Aminopropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) in Äthanol/ Wasser (1:1), pH 3,5, für 4h bei 6O⁰C und 6h bei 12O⁰C aktiviert. Nach Waschen mit Äthanol/Wasser sowie mehrmaligem Waschen mit PBS-Puffer, pH 7,4, wird das so funktionalisierte Glas mit 2%igem Glutardialdehyd in 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, für 2h bei 37^CC inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer wird das aktivierte Glas mit C1 q (500MgZmI) in PBS-Puffer, pH 7,4, der 1OmM EDTA enthält, versetzt und 4h bei37^cC inkubiert. Nach weiteren Waschvorgängen werden die noch freien Aldehydgruppen mit 1 m Äthanolaminlösung blockiert. Nach wiederholtem Waschen mit 0,01 m Phosphat-Puffer, pH 7,4,0,05 m NaCI, wird diese mit C1 q beladene Matrix zur Bindung der Immunglobulinaggregate eingesetzt. Hierzu wird das so mit C1 q beladene poröse Glas mit dem entsprechenden Immunglobulinpräparat im batch-Verfahren versetzt und 4 h bei Raumtemperatur oder 37^CC inkubiert. Nach Entfernung des Trägers durch Dekantieren oder Zentrifugieren wird dieser im folgenden mit 0,01 m Phosphat-Puffer,

pH 7,4, 0,05m NaCI, gewaschen und anschließend mit 2m NaCI in PBS-Puffer, pH 7,4, regeneriert.

Die Bestimmung der Immunglobulinaggregate erfolgte mit einem C1 q-Festphasen-Enzymimmunoassay, die Bestimmung der Eiweißkonzentration durch Messung der Extinkten bei 280nm

Tabelle 1 zeigt einige charakteristische Ergebnisse derartiger Versuche.

Tabelle 1:

aggr. IgGlpg/ml)

Immunglobulinpräpsrat

vor Behandlung 480 100

nach Behandlung 148 31

Beispiel 2:

Wie in Beispiel 1 beschrieben wird C1 q an poröses Glas gebunden. Diese Matrix wird mehrfach zur Entfernung von Immunglobulinaggregaten eingesetzt. Nach Bindung und Entfernung der Immunglobulinaggregate entsprechend Beispiel 1 wird die Matrix mit 2m NaCI-Lösung in PBS-Puffer, pH 7,0, regeneriert und erneut mit dem bereits behandelten Immunglobulinpräparat in Kontakt gebracht, so daß die verbliebenen Immunglobulinaggregate entfernt werden. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von zwei charakteristischen Versuchen.

Tabelle 2:	aggr.	IgG (pg/ml)	(°/	Ό)
	860 250 120	860 320 150	100 29 14	100 37 17
Immunglobulinpräparat vor Behandlung nach I.Behandlung nach 2. Behandlung

Beispiel 3:

Glasfaserfilter werden wie in Beispiel 1 beschrieben funktionalisiert, aktiviert und mit C1 q beladen. Diese Filter werden in geeignete Filtrationssysteme (Sartorius GmbH, Göttingen, BRD) eingepaßt, so daß die zu behandelnden Immunglobulinpräparate während des Filtrationsvorganges (z. B. Sterilfiltration) mit der C1 q-Matrix in Kontakt kommen und die Immunglobulinaggregate entfernt werden. Die Regeneration des mit C1 q beladenen Glasfaserfilters erfolgt danach analog Beispiel 1 und 2 mit

2m NaCI-Lösung in PBS-Puffer, pH 7,0.

Tabelle 3 zeigt ein charakteristisches Experiment unter zweimaligem einsatz der C1 q-Matrix.

Tabelle 3:

aggr. IgG (pg/ml)

Immunglobulinpräparat

vor Behandlung 520 100

nach I.Behandlung 370 71

nach 2. Behandlung 200 38

Claims (12)

1. Verfahren zur Entfernung von Immunglobulinaggregaten aus Immunglobulinpräparaten auf der Grundlage biospezifischer Wechselwirkungen an feste Phasen, gekennzeichnet dadurch, dal;> als feste Phase siliziumdioxidhaltige Materialien verwendet werden, die nach vorheriger, an sich bekannter chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaftmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien oder direkt mit dem Protein C1q beladen werden und daß nach Bindung der Immunglobulinaggregatean dasCiq der festen Phi. .e durch Inkubation micdem Immunglobulinpräparat und Abtrennung dor festen Phase eine Regenerierung der festen Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien und Wiederverwendung der festen Phase erfolgt.

2. Verfahren zur Entfernung von Immunglobulinaggregaten aus Immunglobulinpräparaten nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die siliziumdioxidhaltigen Materialien Formkörper aus Glas oder glasähnlichen Materialien sind.

3. Verfallen nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper als Kugeln vorliegen.

4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper als Fasern vorliegen.

5. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Kugeln porös sind und eine Porenweite von 0,05-100pm aufweisen.

6. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Kugeln eine Teilchengröße von 1 bis 1000Mm aufweisen.

7. Verfahren nach Punkt 2-6, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper durch Packung, Sinterung oder durch Verwendung eines Bindemittels zu übergeordneten Strukturen mit definierter Durchlässigkeit geformt sind.

8. Verfahren nach Punkt 4 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die übergeordneten Strukturen eine vorwiegend flächenförmige Ausdehnung wie Filter, Fritten, Hohlzylinder aufweisen.

9. Verfahren nach Punkt 4 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Fasern als Vliese oder Gewebe vorliegen.

10. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß die übergeordneten Strukturen vorwiegend Kolonnenpackungen sind.

11. Verfahren nach Punkt 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenmodifizierung des Glases durch Silanhaftmittel und homo- oder heterobifunktionelle Reagenzien erfolgt.

12. Verfahren nach Punkt 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht denaturierenden Medien gepufferte Lösungen hoher lo:ienstärke sind.