ES2182202T5 - Preparacion de inmunoglobulinas para inyeccion intravenosa apta para ser almacenada a temperatura ambiente. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UNA PREPARACION DE INMUNOGLOBULINA PARA INYECCION INTRAVENOSA, QUE COMPRENDE LOS SIGUIENTES PASOS: FRACCIONAR UNA SOLUCION QUE CONTIENE INMUNOGLOBULINA CON ENTRE UN 4 Y UN 10 % EN PESO DE GLICOL DE POLIETILENO QUE TIENE UN PESO MOLECULAR DE ENTRE 1,000 Y 10,000, CON UN VALOR DE PH DE ENTRE 4.5 Y 6.5, UNA FUERZA IONICA DE ENTRE 0.0001 Y 0.1 M Y UNA TEMPERATURA DE ENTRE 0 Y 4°C PARA RECUPERAR UNA FRACCION SOBRENADANTE CON UN PH DE ENTRE 3.5 Y 5.0.
Description
Preparación de inmunoglobulinas para inyección
intravenosa apta para ser almacenada a temperatura ambiente.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de una preparación de
inmunoglobulina para inyección intravenosa, que comprende las etapas
siguientes:
fraccionar una solución que contiene
inmunoglobulina con 4 a 10% p/v de polietilenglicol que presenta un
peso molecular de 1.000 a 10.000 a un valor de pH de 4,5 a 6,5, una
fuerza iónica de 0,0001 a 0,1 M y una temperatura de 0 a 4ºC para
recuperar una fracción de sobrenadante; y
concentrar la fracción de sobrenadante a un pH
de 3,5 a 5,0 por ultrafiltración.
Entre las \gamma-globulinas
que constituyen componentes proteicos plasmáticos, se ha utilizado
una preparación de inmunoglobulinas que comprende IgG para evitar y
tratar diversas enfermedades infeccciosas. Esta IgG es inestable en
forma de solución. Se sabe que como resultado de la agregación de
las inmunoglobulinas, es decir, como resultado de la
desnaturalización de las inmunoglobulinas durante la operación de
fraccionamiento, que da lugar a la formación de un polímero o un
dímero de la inmunoglobulina, ésta muestra un aumento apreciable en
la propiedad de fijación del complemento, que se denomima actividad
anticomplementaria, que conduce a: a) la disminución de la
concentración del complemento sérico después de la administración
intravenosa a un organismos humano o b) efectos secundarios
importantes tales como el choque anafiláctico. De acuerdo con esto,
la inmunoglobulina se ha formulado no como una preparación líquida,
sino como una preparación sólida, particularmente, en forma
liofilizada. Sin embargo, la preparación seca presenta el problema
de que no puede administrarse fácilmente, a causa de la necesidad
de disolverla en agua destilada para inyección o cosa parecida
después de utilizarla.
Por otra parte, la preparación líquida no
requiere ninguna disolución en agua destilada para la inyección o
cosa parecida, y puede administrarse fácilmente comparándola con la
preparación seca. Tal como se ha descrito anteriormente, sin
embargo, adolece de inconvenientes tales como la menor estabilidad
de la inmunoglobulina. De acuerdo con esto, ha habido
convencionalmente un intento para desarrollar una composición
líquida inmunoglobulínica para inyección intravenosa que posea una
estabilidad incluso en forma de solución.
Por ejemplo, el documento
JP-A-63-192724 (el
término "JP-A" tal como se utiliza en la
presente memoria significa una "solicitud de patente Japonesa
publicada no examinada" (patente U.S. 4.876.088, EP 278422)) da a
conocer una composición inmunoglobulínica líquida para inyección
intravenosa que muestra estabilidad incluso en forma de solución,
presentando dicha composición una conductividad baja y un pH de 5,5
0,2 y conteniendo sorbitol como estabilizador.
El documento
JP-A-58-43914
(patentes U.S. 4.396.608 y 4.499.073, EP 73371) da a conocer que con
objeto de obtener una composición inmunoglobulínica que esté
sustancialmente libre de un agregado de inmunoglobulinas y posea un
contenido monomérico de inmunoglobulina sérica que exceda el 90%
aproximadamente, se ajusta una solución de la inmunoglobulina
sérica para que tenga una fuerza iónica menor que 0,001
aproximadamente y un pH de 3,5 a 5,0.
El documento
JP-A-9-124507 (EP
764447) da a conocer una etapa de disminución de la fuerza iónica a
un pH de entre 3,5 y 5,0 con objeto de disminuir la actividad
anticomplementaria después de una etapa de inactivación vírica,
mediante el tratamiento de la inmunoglobulina por
tri-(n-butil) fosfato (TNBP).
El documento
JP-A-7-238036 (EP
702960) da a conocer que para la mejoría de la estabilidad, la
agregación de la inmunoglobulina, en otras palabras, un aumento no
solamente de un polímero, sino también de un dímero de aquélla, es
suprimido por el tratamiento ácido o el almacenamiento a temperatura
ambiente.
El documento
JP-W-59-501546 (el
término "JP-W" tal como se utiliza en la
presente memoria significa una "solicitud de patente
internacional Japonesa publicada no examinada", WO
84-891) da a conocer el tratamiento mediante
ultrafiltración de una preparación de inmunoglobulina a pH entre 5 y
5,6 en presencia del 0,05% al 2% peso/vol de polietilenglicol
(PEG).
Sin embargo, considerando incluso los efectos de
las etapas de la exposición anterior, existe todavía margen para
mejorar la estabilidad de almacenamiento de una preparación de
inmunoglobulinas, especialmente, la estabilidad de almacenamiento
de una preparación de inmuglobulina en forma de una solución.
El documento
JP-A-63-8340
(patentes U.S. 4.762.714 y 4.948.877, EP 240856) da a conocer un
procedimiento para preparar inmunoglobulinas séricas libres
sustancialmente de un virus adquirido, que comprende la obtención
del suero inmunoglobulínico a partir de una fuente de plasma humano
mediante el procedimiento de fraccionamiento en etanol frío a un pH
de 5,4 aproximadamente o más bajo y el almacenamiento de la
inmunoglobulina sérica a un pH de 4,25 aproximadamente o más bajo
durante por lo menos de tres días aproximadamente, o conservándolo
a un pH de 6,8 aproximadamente o inferior y a una temperatura de por
lo menos 45ºC, de forma que no contenga sustancialmente un
retrovirus infeccioso. Sin embargo, la invención anteriormente
descrita tiene como objetivo la inactivación de un retrovirus. No
se ha informado de que la preparación de inmunoglobulinas así
obtenida muestre una mejoría en el problema de la agregación de la
inmunoglobina.
El documento WO 95-3826 da a
conocer la preparación de inmunoglobulina que comprende 0,1 g/l o
menos de surfactante no iónico como estabilizante para el
mantenimiento del estado de solución, estando sustancialmente libre
de albúmina. Sin embargo, la albúmina contaminada no puede
detectarse, según el documento WO 95-3826, cuando
se encuentra en una cantidad del 1% o menos como proporción
relativa, a causa de la sensibilidad del procedimiento de medida que
se da a conocer en dicha patente.
El documento
JP-A-63-183539
(patente U.S. 5.132.406, EP 246579) da a conocer un procedimiento
para la producción de preparaciones de inmunoglobulina para
inyección intravenosa, que comprende una combinación de una etapa
de tratamiento térmico, una etapa de recuperación de una fracción de
sobrenadante mediante un tratamiento de fraccionamiento con 4 a 10%
de PEG, y una etapa de recuperación de una fracción de precipitación
mediante un tratamiento de fraccionamiento con 10 a 15% de PEG.
Tal como se ha descrito anteriormente, la
inmunoglobulina es esencialmente una proteína inestable, de forma
que su estabilidad después de la preparación de una composición
líquida constituye una de las grandes preocupaciones.
Un objetivo de la presente invención es la
superación de este problema y proveer por tanto un procedimiento
para la producción de una preparación de inmunoglobulinas que posea
una buena estabilidad de almacenamiento incluso en forma de
solución.
Este y otros objetivos de la presente invención
se han alcanzado mediante:
(1) un procedimiento para producir una
preparación de inmunoglobulinas para inyección intravenosa, que
comprende las etapas de:
fraccionamiento de una solución acuosa que
contenga inmunoglobulina con 4 a 10% peso/vol de polietilenglicol
de peso molecular entre 1.000 a 10.000, con un pH de entre 4,5 a 6,5
y una fuerza iónica de entre 0,0001 a 0,1 M y una temperatura de
entre 0 a 4ºC, para recuperar una fracción de sobrenadante que
contiene la inmunoglobulina; y
concentración de la fracción del sobrenadante a
un pH de entre 3,5 a 5,0 mediante ultrafiltración; y
(2) un procedimiento para producir la
preparación de inmunoglobulinas para inyección intravenosa según el
apartado (1) anterior, que comprende una por lo menos, y
preferentemente todas las etapas de llevar a cabo un tratamiento de
inactivación vírica, recuperando una fracción no absorbida mediante
un tratamiento de intercambio aniónico, realizando un tratamiento
de filtración con una membrana porosa de un tamaño promedio de poro
de entre 1 a 100 nm, y recuperando una fracción no absorbida
mediante un tratamiento de contacto utilizando sílice coloidal.
Una preparación de inmunoglobulinas para
inyección intravenosa que se prepara mediante el procedimiento de
producción anteriormente descrito (1) o (2), particularmente una
preparación líquida inmunoglobulínica para inyección intravenosa es
una preparación de inmunoglobulina para inyección intravenosa que
contiene una molécula completa tipo inmunoglobulina no modificada
químicamente (sin modificación química), con un pH de entre 5 y 6 y
una conductividad eléctrica de 1 mmho o menos (calculada a 8ºC), en
la que la preparación puede conservarse a temperatura ambiente
durante un año por lo menos después de su producción y puede
mantener una actividad anticomplemento con 20 unidades o menos y un
contenido dimérico de la inmunoglobulina del 7% o menos de forma
constante durante el almacenamiento.
Se utiliza como material de partida una fracción
que contiene inmunoglobulina. Esta fracción no está particularmente
limitada, en la medida en que se origina a partir del suero humano y
contiene una fracción inmunoglobulínica. Ejemplos específicos de
tal fracción que contiene inmunoglobulina incluyen la Fracción II +
III y la Fracción II obtenibles mediante el fraccionamiento
etanólico de Cohn (E.J. Cohn et al., J. Am. Chem. Soc., 68,
459 (1946), y fracciones equivalentes conteniendo inmunoglobulinas.
El material de partida puede contener impurezas, tales como
anticuerpos de grupos sanguíneos humanos, calicrerína,
precalicreína, IgM, polímeros de IgG, etc.
La fracción de partida que contiene
inmunoglobulina se trata con una baja concentración de PEG,
recuperándose el sobrenadante líquido.
El material de partida se suspende en primer
lugar en un solvente acuoso apropiado. En este momento se utiliza
un solvente acuoso de por lo menos dos veces el volumen,
preferentemente, por lo menos 5 veces el volumen de dicha fracción
. El solvente acuoso puede contener cloruro sódico, fosfato sódico,
fosfato potásico, ácido acético, acetato sódico, ácido cítrico,
citrato sódico, etc.
Además, preferentemente, el pH oscila entre 4,5
y 6,5, y la fuerza iónica es del orden de 0,0001 a 0,1 M para el
solvente acuoso que contiene la inmunoglobulina.
La suspensión resultante se trata con PEG de
peso molecular entre 1.000 a 10.000, y preferentemente comprendido
entre 2.000 a 6.000. El tratamiento puede llevarse a cabo, por
ejemplo, mezclando la suspensión y el PEG mientras se agita,
habitualmente a una temperatura de entre 0º y 4ºC durante un tiempo
comprendido entre 30 minutos y 6 horas. Las condiciones de
tratamiento recomendadas son: una concentración proteica de entre 1
a 20% peso/vol, preferentemente de 5 a 15% peso/vol; una
concentración de PEG de entre 4 y 10% peso/vol, preferentemente de
entre 4 y 8% peso/vol; un pH de entre 4,5 y 6,5, preferentemente de
entre 5 y 6; y una fuerza iónica de entre 0,0001 y 0,1 M,
preferentemente de entre 0,0001 y 0,01M.
La mezcla se somete entonces, por ejemplo, a
centrifugación entre 6.000 y 8.000 rpm durante 10 a 30 minutos para
recuperar el sobrenadante líquido.
En esta etapa, la fracción de sobrenadante
obtenida en el tratamiento anterior (a), se concentra a un pH de
entre 3,5 a 5,0 (preferentemente a pH entre 4 a 4,5).
Específicamente, el tratamiento de contración se lleva a cabo
utilizando una membrana de ultrafiltración con un valor
discriminatorio de 100.000 aproximadamente. Este tratamiento puede
realizarse bajo una presión de entre 1 a 10 kg/m^{2}.
Este procedimiento comprende la disolución de
una fracción que contiene inmunoglobulinas en un solvente acuoso y
la puesta en contacto de la solución con un intercambiador aniónico
para recuperar la fracción no adsorbida. El tratamiento con un
intercambiador aniónico es particularmente efectiva para eliminar
polímeros IgM y/o IgG.
El intercambiador aniónico que va a utilizarse
comprende grupos de intercambio aniónico unidos a un transportador
insoluble. El intercambiador aniónico incluye un tipo
dietilaminoetilo (DEAE), un tipo aminoetilo cuaternario (QAE),
etc., y el transportador insoluble incluye agarosa, celulosa,
dextrano, poliacrilamida, etc. Pueden unirse de una forma conocida
en la técnica.
Un precipitado que contiene inmunoglobulinas se
disuelve en un solvente acuoso apropiado con un pH de entre 5 a 7,
preferentemente de entre pH 5,5 a 7 y escasa fuerza iónica,
preferentemente de entre 0,0001 a 0,1 M. El solvente acuoso puede
contener los solutos tal como se describe en el Procedimiento (a)
anterior. La concentración proteica de la solución resultante
oscila preferentemente entre el 1 y el 15% peso/vol, y más
preferentemente entre el 3 y el 10% peso/vol.
La solución inmunoglobulínica se pone entonces
en contacto con un intercambiador aniónico equilibrado con el mismo
solvente acuoso que se utilizó antes, en un sistema por lotes o en
un sistema continuo. Por ejemplo, el tratamiento tipo lote puede
llevarse a cabo mezclando la solución inmunoglobulínica con un
intercambiador aniónico en una cantidad de entre 10 a 100 ml por ml
aproximadamente del intercambiador aniónico, agitando la mezcla
entre 0 a 4ºC durante 0,5 a 2 horas aproximadamente, y centrifugando
la mezcla entre 6.000 y 8.000 rpm durante 10 a 30 minutos para
reecuparar el líquido sobrenadante. El tratamiento continuo puede
ser llevado a cabo haciendo pasar la solución de inmunoglobulina a
través de una columna de un intercambiador aniónico a una velocidad
de entre 10 a 100 ml por ml aproximadamente del intercambiador
aniónico y recuperando la fracción no adsorbida.
En la presente invención, el Procedimiento
anterior (c) puede omitirse si el caso lo requiere. Sin embargo, el
Procedimiento (c) se lleva preferentemente a cabo cuando un polímero
IgM ó IgG se encuentran como contaminantes.
La preparación de inmunoglobulina según la
presente invención, incluye una preparación a partir de la cual se
han eliminado partículas finas que pueden servir como núcleo para la
formación de materia extraña insoluble. Ejemplos de procedimientos
de eliminación incluyen los de filtración a través de una membrana
porosa (por ejemplo, en forma de hilo hueco o de una lámina).
Respecto al material de la membrana porosa capaz
de utilizarse en la presente invención, no se impone ninguna
limitación particular. Se prefiere la celulosa regenerada. Ejemplos
de la forma de la membrana incluyen un hilo hueco y una lámina,
prefiriéndose el hilo hueco. Por ejemplo, el hilo hueco poroso
fabricado con celulosa regenerada se prepara preferentemente a
partir de una solución cupricelulósica de amonio mediante el
procedimiento de separación microfásico [American Chemical
Society, 9:197-228 (1985)].
El tamaño promedio del poro de la membrana
porosa es de 1 a 100 nm, preferentemente de 10 a 75 nm, más
preferentemente de 10 a 50 nm, y muy preferentemente de 35 \pm 2
nm. Su grosor es preferentemente de 35 \pm 3,5 \mum. La membrana
posee preferentemente una estructura multilamelar. Cuando la
membrana porosa está en forma de un hilo hueco, su diámetro interno
es preferentemente de 330 \pm 30 \mum.
Cuando la membrana porosa es en forma de un hilo
hueco, se utiliza preferentemente en modo de un módulo. El módulo
se componente de una membrana de hilo hueco poroso que tiene
preferentemente un área membranosa de 0,001 a 1,0 m^{2}, un
contenedor que va a rellenarse con la membrana, y un adherente para
integrarlos.
El tratamiento de filtración a través de la
membrana porosa se lleva a cabo, por ejemplo, de la manera
siguiente:
Se disuelve en primer lugar una fracción de
inmunoglobulina en un solvente acuoso apropiado. se prefiere que el
medio acuoso tenga un pH de 4 a 7 (más preferentemente de 5 a 6) y
una fuerza iónica escasa (más preferentemente de 0,0001 a 0,1 M).
Ejemplos de medio acuoso incluyen una solución acuosa de cloruro
sódico, agua destilada para inyección y un tampón de acetato, etc.
Se prefiere que la solución inmunoglobulínica preparada de este modo
tenga una concentración proteica de 1 a 15% peso/vol (más
preferentemente 3 a 10% peso/vol) y un pH de 4 a 7 (más
preferentemente de 5 a 6).
La solución de inmunoglobulina preparada de este
modo puede contener un aditivo farmacéuticamente aceptable (por
ejemplo, un transportador, excipiente, diluyente), un estabilizador
y/o un componente farmacéuticamente necesario que se utilice en los
preparados farmacéuticos dentro de límites que no perjudiquen el
objeto de la presente invención.
Ejemplos de estabilizadores incluyen
monosacáridos (por ejemplo, glucosa), disacáridos (por ejemplo,
sacarosa, maltosa), alcoholes azucarados (por ejemplo, manitol,
sorbitol), sales neutras (por ejemplo, cloruro sódico) aminoácidos
(por ejemplo, glicina) y surfactantes no iónicos (por ejemplo,
polietilenglicol, el copolímero
polioxietilen-polioxipropileno ("Pluronic",
denominación comercial), éster de ácidos grasos y polioxietilen
sorbitano (denominación comercial, "Tween"). El estabilizador
se añade preferentemente en una cantidad del 1 al 10% peso/vol.
La solución anteriormente descrita que contiene
las inmunoglobulinas se filtra a través de una membrana porosa. La
presión de filtración o fuerza en este momento es de 0,098 a 0,98
bar (0,1 a 1 kgf/cm^{2}, preferentemente de 0,098 a 0,490 bar
(0,1 a 0,5 kgf/cm^{2}), más preferentemente de 0,098 a 0,294 bar
(0,1 a 0,3 kgf/cm^{2}). La temperatura del tratamiento es
preferentemente de 4 a 50ºC.
Ejemplos del modo del tratamiento de la
filtración incluyen el procedimiento de filtración de flujo cruzado
(tipo de circulación) en el que la filtración se realiza mientras se
proporciona una tasa de filtraje a un líquido, y el procedimiento
de filtración de final abolido (tipo no circulatorio) en el que la
filtración se lleva a cabo sin proporcionar dicha tasa de filtraje.
Se adopta preferentemente el procedimiento de filtración de flujo
cruzado mediante aire a presión.
El tratamiento de filtración puede llevarse a
cabo varias veces. Previamente al tratamiento de filtración
anterior, la solución que contiene la inmunoglobulina puede ser
sometida a otro tratamiento de filtración.
La preparación de inmunoglobulinas preparada de
este modo constituye una preparación a partir de la cual se han
eliminado finas partículas de un tamaño promedio no menor de 100 nm,
no menor, preferentemente, de 75 nm, no menor más preferentemente
de 35 nm y/o partículas finas solubles con un peso molecular más
grande que el de la inmunoglobulina (150.000 aproximadamente),
pudiendo ambos tipos de partícula llegar a constituir un núcleo
para formar materia extraña insoluble, de forma que, si incluso la
preparación de inmunoglobulina en forma de solución se conserva a
25ºC durante 30 días por lo menos bajo agitación, o a 37ºC durante
39 días como mínimo, no provoca la agregación de la
inmunoglobulina, es decir, la generación de materia extraña
insoluble, y exhibe una buena estabilidad de almacenamiento. Es
decir, no se observa virtualmente materia extraña insoluble.
Además, puede utilizarse un procedimiento
conocido, con objeto de purificar ulteriormente la inmunoglobulina.
Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento de tratamiento en el
que se utiliza un compuesto diamino inmovilizado (para eliminar la
calicreína o la precalicreína), y otro procedimiento de tratamiento
en el que se utiliza una sustancia inmovilizada del grupo sanguíneo
humano (para eliminar los anticuerpos de éste) (véanse los
documentos
JP-A-9-176045,
patente U.S: 5.132.406, EP 246579).
Según la presente invención, el Procedimiento
(d) puede omitirse si el caso lo requiere.
Existe un procedimiento para recuperar una
fracción no adsorbida mediante un tratamiento de contacto con sílice
coloidal. Esta etapa reduce la cantidad de albúmina sérica en la
preparación de inmunoglobulina.
Ejemplos del sílice coloidal utilizados como
adsorbentes incluyen el gel de sílice, anhídrido silícico ligero,
tierra de diatomeas, arcilla ácida, bentonita, caolín y aluminato
silicato de magnesio. Preferentemente, se utilizan anhídrido
silícico ligero ("Aerosil", denominación comercial; producto de
Nippon Aerosil Co., Ltd. y "Delipid", denominación comercial;
producto de Zeta Inc.)
La inmunoglobulina purificada se disuelve en un
solvente acuoso apropiado. Se prefiere que el medio acuoso tenga un
pH de 4 a 7 (más preferentemente de 5 a 6) y una escasa fuerza
iónica (más preferentemente 0,0001 a 0,1 M). Ejemplos del medio
acuoso incluyen los citados anteriormente en el tratamiento con el
intercambiador aniónico. Se prefiere que la solución de
inmunoglobulina así preparada tenga una concentración proteica de 1
a 15% peso/vol (más preferentemente de 3 a 10% peso/vol) y un pH de
4 a 7 (más preferentemente un pH de 5 a 6).
La solución de inmunoglobulina preparada de este
modo puede contener un aditivo farmacéuticamente aceptable (por
ejemplo, un transportador, excipiente, diluyente), un estabilizador
y/o un componente farmacéuticamente necesario que se utilice
habitualmente en los preparados farmacéuticos dentro de límites que
no perjudiquen el objeto de la presente invención.
Ejemplos del estabilizador incluyen
monosacáridos (por ejemplo, glucosa), disacáridos (por ejemplo,
sacarosa, maltosa), alcoholes azucarados (por ejemplo, manitol,
sorbitol), sales neutras (por ejemplo, cloruro sódico) aminoácidos
(por ejemplo, glicina) y surfactantes no iónicos (por ejemplo,
polietilenglicol, el copolímero
polioxietilen-polioxipropileno ("Pluronic",
denominación comercial), éster de ácidos grasos y polioxietilen
sorbitano (denominación comercial, "Tween"). El estabilizador
se añade preferentemente en una cantidad del 1 al 10% peso/vol.
Entonces, la solución de inmuglobulina se somete
a un tratamiento de contacto con el adsorbente antes descrito.
Respecto a las condiciones de tratamiento que se van a utilizar, el
adsorbente se emplea en una cantidad de 1 a 30 g/litro cuando la
concentración de la inmunoglobulina es de 1 a 100 g /litro (más
preferentemente de 10 a 100 g/litro). Este tratamiento puede
llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un procedimiento por lotes o
uno de columna. Entre estos, se prefiere el procedimiento por lotes.
En éste, se llevan a cabo la mezcla y la agitación bajo
condiciones, por ejemplo, a una temperatura 5 a 25ºC entre 5 minutos
y 1 hora aproximadamente. Entonces, puede recuperarse el
sobrenadante (fracción no adsorbida) mediante, por ejemplo,
filtración o centrifugación.
La preparación de la inmunoglobulina, a partir
de la cual se ha eliminado la albúmina sérica, contiene un
contaminante de ésta en una cantidad no mayor de 10 \mug,
preferentemente no mayor de 5\mu, por 50 mg de inmunoglobulina.
Específicamente, cuando la preparación de inmunoglobulina está en
forma de una solución que contiene 5% peso/vol de inmunoglobulina,
contiene un contaminante de albúmina sérica en una cantidad no
mayor de 10 \mug/ml, preferentemente no mayor de 5 \mug/ml. La
preparación de inmunoglobulina que tiene tales propiedades muestra
una estabilidad de almacenamiento más excelente que la convencional.
Por ejemplo, incluso después de almacenamiento a 25ºC durante 30
días por lo menos bajo agitación, o incluso a 37ºC durante 39 días,
la preparación de inmunoglobulinas en forma de solución está libre
de materia extraña insoluble. Es decir, no se observa visualmente
materia extraña insoluble. Pueden utilizarse procedimientos
conocidos en la técnica como ensayos de albúmina sérica, en la
preparación de inmunoglobulina. Ejemplos incluyen el método ELISA,
el método de Mancini y la
nefelometría.
nefelometría.
En la presente invención, el Procedimiento (e)
puede omitirse si el caso lo requiere. Sin embargo, el Procedimiento
(e) se lleva a cabo preferentemente cuando la albúmina sérica puede
encontrarse como contaminante.
Según este procedimiento, una fracción que
contiene inmunoglobulina se calienta en presencia de un
estabilizador, bajo condiciones tales en que las impurezas, por
ejemplo, virus HB, virus del SIDA, etc, se inactivan completamente,
minimizando mientras la reducción de las actividades de los
anticuerpos de la inmunoglobulina. El tratamiento térmico se
realiza en un estado seco con un contenido acuoso del 3% o menos (es
decir, tratamiento de calor seco) o en un estado de disolución en
forma de una solución acuosa (es decir, tratamiento de calor
húmedo).
El estabilizador que puede utilizarse en el
tratamiento de calor seco o húmedo incluye preferentemente
disacáridos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, etc) y alcoholes
azucarados (por ejemplo, sorbitol, manitol, etc).
Una cantidad recomendada del estabilizador que
va a añadirse es del orden de 0,5 a 5% peso/vol, y preferentemente
de entre 1 a 3% peso/vol, en el tratamiento de calor seco, o del 10%
peso/vol o más, y preferentemente de entre 10 a 50% peso/vol, en el
tratamiento de calor húmedo.
Es deseable que la concentración proteica de la
fracción que contiene la inmunoglobulina que va a tratarse mediante
el calor, se ajuste entre el 1 y el 10% peso/vol, y preferentemente
entre el 3 y el 7% peso/vol, para el tratamiento de calor seco, y
entre el 0,1 y el 30% peso/vol y preferentemente entre el 5 y el 20%
peso/vol, para el tratamiento térmico húmedo.
En el caso del tratamiento térmico seco, después
de que se añade un estabilizador a la fracción de inmunoglobulina,
si se desea, seguido por esterilización por filtración, el contenido
acuoso de la fracción se ajusta al 3% o menos, y preferentemente al
1% o menos, mediante, por ejemplo, liofilización. Esta puede
llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura de entre 20º a
40ºC, durante un tiempo de entre 24 a 96 horas aproximadamente
in vacuo (casi al vacío, una presión de 0,5 mmHg). Entonces,
se calienta la fracción a una temperatura de entre 50º y 70ºC, y
preferentemente a 60ºC aproximadamente, durante 10 a 200 horas y
preferentemente durante 50 a 100 horas aproximadamente. La
estabilidad de la inmunoglobulina durante el calentamiento puede
asegurarse llevando a cabo el tratamiento térmico en una atmósfera
de un gas inerte, tal como nitrógeno, argón, helio, etc.
En el caso del tratamiento térmico húmedo,
después de que la solución acuosa de la fracción que contiene la
inmunoglobulina se ajuste a un pH entre 4,5 a 6,5 y preferentemente
entre 5 y 6, la solución se calienta a 50º a 70ºC, y
preferentemente a 60ºC aproximadamente, durante 10 minutos a 20
horas, y preferentemente durante 10 horas aproximadamente.
Si el procedimiento del tratamiento térmico es
el tratamiento térmico seco, se lleva preferentemente a cabo en la
etapa final del procedimiento. Por otra parte, si es el tratamiento
térmico húmedo, se lleva a cabo preferentemente para el material de
partida.
Además, puede realizarse una etapa ulterior de
inactivación vírica utilizando un procedimiento detergente solvente
con un fosfato trialquílico. El grado de purificación de la
composición que contiene la inmunoglobulina cuando contacta con el
fosfato trialquílico de la presente invención, no está
particularmente limitado, pero puede utilizarse tal composición
purificada a un cierto nivel. Entonces, el contacto con el fosfato
trialquílico puede llevarse a cabo en la etapa de aislamiento o en
la etapa de purificación para la inmunoglobulina.
Aunque no están particularmente limitados,
ejemplos apropiados de fosfato trialquílico para utilizarse en la
presente invención incluyen tri-(n-butil) fosfato,
tri-(terc-butil) fosfato,
tri-(n-hexil) fosfato,
tri-(2-etilhexil) fosfato,
tri-(n-decil) fosfato y análogos. Un fosfato
trialquílico particularmente preferido es el
tri-(n-butil) fosfato (al que se aludirá como
"TNPB" en lo sucesivo). Puede utilizarse asimismo una mezcla de
dos o más trialquil fosfatos.
El fosfato trialquílico de la presente invención
puede utilizarse en una cantidad de entre 0,01 y 10% (peso/vol),
preferentemente entre 0,1 y 3% (peso/vol), basado en solución acuosa
de inmunoglobulina.
El contacto con el fosfato trialquílico se lleva
a cabo a una temperatura de entre 0º y 60ºC (preferentemente entre
20º y 40ºC) durante 30 minutos o más (preferentemente entre 1 y 30
horas, más preferentemente entre 3 y 10 horas) y a un pH de entre 6
y 8 aproximadamente.
El fosfato trialquílico puede utilizarse solo o
con un agente superficial activo. Preferentemente, el fosfato
trialquílico puede utilizarse en combinación con un agente
superficial activo. Éste puede añadirse a la composición que
contiene la inmunoglobulina en una etapa opcional, antes, durante o
después de que la composición se pusiera en contacto con el fosfato
trialquílico. La función del agente superficial activo es promover
el contacto de los virus en la composición que contiene la
inmunoglobulina, con el fosfato trialquílico.
Ejemplos que ilustran el agente superficial
activo incluyen derivados polioxietilénicos de ácidos grasos y
ésteres parciales de anhídridos de sorbitol tal como Tween 80, Tween
20 y polisorbato 80 y agentes de enjuague (o aclarado) solubles en
aceites no iónicos tales como el triton X100 (alquilfenol
oxietilado). También son útiles los agentes iónicos dipolares que
son detergentes iónicos dipolares sintéticos conocidos como
desoxicolato sódico y sulfobetaína, tales como
N-dodecil-N,
N-dimetil-2-amonio-1-etano
sulfonato y sus homólogos, y detergentes no iónicos tales como
octil-\beta, D-glucopiranósido y
análogos.
Cuando se utiliza el agente superficial activo,
su cantidad no es crítica, pero puede ser del orden de entre el
0,001% y el 10% aproximadamente, preferentemente entre el 0,01% y el
3%.
El tratamiento con fosfato trialquílico es
especialmente útil para la inactivación de virus revestidos con una
envuelta, tal como el virus de la hepatitis B, el virus de la
hepatitis no A no B, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV),
el virus de la estomatitis vesicular, el virus sindbis y
análogos.
En el tratamiento con el detergente solvente, la
inmunoglobulina se encontrará en una cantidad entre el 0,1 y el 30%
peso/vol aproximadamente, preferentemente entre el 1 y el 20%
peso/vol.
Utilizando el procedimiento anteriormente
descrito para la obtención de una preparación de inmunoglobulina
para inyección intravenosa según la presente invención, puede
obtenerse una preparación de inmunoglobulinas para inyección
intravenosa. En una forma de realización preferida, puede obtenerse
una composición líquida de inmunoglobulina molecular completa sin
modificaciones químicas (preparación) que puede administrarse
intravenosamente, ajustando la solución acuosa de una
inmunoglobulina molecular completa y sin modificaciones químicas,
hasta obtener una concentración de 1 a 10% (peso/vol) (más
preferentemente de 3 a 7% peso/vol), mediante el procedimiento
convencional, ajustando la solución resultante para que contenga un
estabilizador, sorbitol por ejemplo, en una cantidad de entre 1 a
20% peso/vol (más preferentemente entre 2 y 10% peso/vol), a un pH
de entre 5 a 6 (más preferentemente de 5,5 \pm 0,2) y con una
baja conductividad (más preferentemente una conductividad no
superior a 1 mmho, más preferentemente no superior a 0,6 mmho, cada
una calculada en términos de 8ºC) mediante procedimientos
conocidos, y sometiendo entonces la solución resultante a una
filtración esterilizante, vertiéndola en porciones y similares
basadas en la técnica habitual de formulación.
A partir de la preparación formada de esta
manera, puede producirse una preparación líquida inmunoglobulínica
para inyección intravenosa que contiene inmunoglobulina molecular
completa sin modificaciones químicas, tiene un pH entre 5 y 6 (más
preferentemente de 5,5 \pm 0,2 aproximadamente) y una
conductividad no superior a 1 mmho (más preferentemente no superior
a 0,6 mmho, cada una calculada en términos de 8ºC) que puede
almacenarse a temperatura ambiente, posee una actividad
anticomplemento no superior a 20 unidades y posee un contenido del
dímero de la inmunoglobulina no mayor del 7%.
La expresión "inmunoglobulina de tipo
molecular completo y no modificada químicamente" tal como se
utiliza en la presente memoria, significa una inmunoglobulina que
posee las siguientes propiedades:
(i) permanece intacta (natural) sin sufrir
ninguna modificación artificial o cambio. Por tanto, no contiene
fragmentos de inmunoglobulina, tales como Fab, F(ab')_{2},
Fc, etc.
(ii) ni muestra reducción del título de
anticuerpos ni del espectro de éstos, cuando se compara con la
inmunoglobulina intacta,
(iii) su actividad anticomplemento (actividad de
fijación del complemento) es suficientemente más baja que las 20
unidades (valor CH50) que se contemplan como seguras basándose en el
Estándar de Preparaciones Biológicas del Japón según la
Notificación No. 159 (octubre 1985) publicada por el Ministerio de
Biestar Público del Japón. (Una unidad en términos de CH50 se
define como la cantidad de complemento necesaria para hemolizar la
mitad de la cantidad de 5 x 10^{8} células de hematíes
sensibilizados, en 7,5 ml de una mezcla reactiva que posee una
cierta fuerza iónica y valor de pH, y una cierta cantidad de iones
Ca++ y Mg++ bajo la reacción de 60 minutos a 37ºC).
Cuando se considera un intervalo de seguridad
del contenido del dímero de la inmunoglobulina, respecto a una
preparación para inyección intravenosa que comprende inmunoglobulina
molecular completa sin modificaciones químicas, el contenido del
dímero inmunoglobulínico se fija en un 7% o inferior,
preferentemente en un 6% o inferior, y más preferentemente en un 4%
o inferior.
La preparación descrita posee inmunoglobulina no
inactivada sustancialmente, ni contiene un polímero IgG ni un
contaminante, posee buena solubilidad y una acción anticomplemento
suficientemente escasa que puede cumplir los estándares de la
preparación biológica cuando un virus es inactivado, por ejemplo,
mediante el tratamiento
térmico.
térmico.
La preparación de inmunoglobulina descrita puede
utilizase como tal o puede diluirse con un solvente apropiado (por
ejemplo, agua destilada para inyección, solución salina fisiológica,
solución de glucosa) cuando consiste en una preparación líquida.
Cuando es una preparación seca, por otra parte, la solución de
inmunoglobulina anteriormente mencionada, se liofiliza. Se disuelve
en un solvente apropiado (por ejemplo, agua destilada para
inyección) cuando se utiliza.
- 1.
- hipogammaglobulinemia y agammaglobulinemia
- 2.
- enfermedades inflamatorias graves
- 3.
- púrpura trombocitopénica secundaria
- 4.
- fase aguda de la enfermedad de Kawasaki.
La preparación farmacéutica descrita se utiliza
mediante infusión gota a gota intravenosa o directamente mediante
inyección intravenosa. Cuando se utiliza mediante inyección
intravenosa directa, es deseable que se lleva a cabo la inyección de
forma extremadamente lenta.
En general, se utiliza en una cantidad de entre
2.500 a 5.000 mg como dosis unitaria de la inmunoglobulina G humana
para adultos, o en una cantidad de entre 100 a 150 mg/kilo de peso
corporal como dosis unitaria de la inmunoglobulina G humana para
niños. Estos intervalos de dosis son cambiados opcionalmente,
dependiendo de la edad y de los síntomas.
Cuando se utiliza en la púrpura trombocitopénica
secundaria, se administra en una dosis de generalmente entre 200 y
400 mg/kg de peso corporal al día como inmunoglobulina humana G. El
intervalo de la dosis se cambia opcionalmente, dependiendo de la
edad y de los síntomas.
\newpage
Cuando se utiliza en la enfermedad de Kawasaki,
se administra generalmente durante 5 días a una dosis de 400 mg/kg
de peso corporal al día como inmunoglobulina humana G. El intervalo
de la dosis se cambia opcionalmente, dependiendo de la edad y de los
síntomas.
Según la presente invención, la producción de
inmunoglobulina y la estabilidad de la que se conserva a temperatura
ambiente, pueden mejorarse. Ulteriormente, puede inhibirse la
producción de materiales extraños insolubles eliminando la albúmina
contaminada y extrayendo las finas partículas alrededor de las
cuales se forman aquéllos. Por tanto, la presente invención puede
proporcionar una preparación, particularmente una preparación
líquida, que posea una estabilidad mejorada de la inmunoglobulina
en estado de solución.
La presente invención se describirá más
específicamente en lo sucesivo mediante ejemplos y ensayos. Deberá
sin embargo tenerse en cuenta que la presente invención no está
limitada a o por ellos.
A 1 kg de las fracciones II + III de Cohn
obtenidas a partir del plasma humano mediante el procedimiento del
etanol en frío, se añadieron 10 litros de agua, seguido por la
extracción de IgG. Después de que se añadieran 50 g de sorbitol por
100 ml del sobrenadante resultante y de que se ajustara su pH a 5,5,
la mezcla resultante se calentó hasta 60ºC durante 10 horas.
Entonces, la mezcla reactiva se ajustó a un pH de 5,5 y se diluyó
tres veces con agua fría para inyección. Al líquido diluído, se
añadió polietilenglicol (peso molecular medio: 4.000) para dar una
concentración final de 8% peso/vol. La mezcla resultante se
centrifugó a 2ºC para obtener un sobrenadante. El sobrenadante
recuperado de esta forma se ajustó a pH 4, concentrándose entonces
la solución respecto al agua para la inyección con una membrana de
ultrafiltración con un valor discriminatorio de peso molecular
100.000 (Pericon 2 Biomax, fabricado por Millipore). A la solución
resultante ajustada a un pH de entre 5 y 7, se añadió
DEAE-Sephadex equilibrado con agua para inyección (2
ml por 50 ml aproximadamente de la solución). Bajo una temperatura
de 0 a 4ºC, la mezcla resultante se sometió a un tratamiento de
contacto durante una hora aproximadamente. Después del tratamiento,
se eliminó DEAE-Sephadex mediante filtración, para
recuperar un filtrado (solución de IgG).
La solución de IgG recuperada de este modo se
diluyó en una solución al 5% peso/vol con agua para inyección,
ajustándose su pH a 5,5 aproximadamente con acetato sódico. Se
añadió entonces a ella sorbitol para dar lugar a una concentración
final del 5%. La solución acuosa así obtenida (conductividad: 1 mmho
aproximadamente) se esterilizó mediante filtración para obtener una
preparación de inmunoglobulina para administración intravenosa.
La solución que contenía 5% peso/vol de la
inmunoglobulina preparada en el Ejemplo 1, se hizo pasar a través
de un filtro anhidro portador de sílice (Zeta Plus Delipid,
fabricado por Quno Corp.) para recuperar la fracción no absorbida.
Éste se esterilizó posteriormente mediante filtración para obtener
una preparación líquida de inmunoglobulina para inyección
intravenosa.
Se encontró que la cantidad de albúmina
contaminada en la solución así obtenida, que contenía
inmunoglobulina al 5% peso/vol, fue de 5 \mug/ml cuando se
determinó mediante el procedimiento de Mancini.
Se utilizó un módulo de hilo hueco poroso
(Bemberg Microporus Membrane; al que en lo sucesivo se hará alusión
como "BMM") (denominación comercial: Planova 35), adquirido en
Asahi Chemical Industry, que es producido modulando el hilo hueco
poroso (BMM) que posee un tamaño promedio de poro de 35 \pm 2 nm,
un área membranosa de 0,001 a 1,0 m^{2}, un diámetro interno del
hilo hueco de 330 \pm 30 \mum, un grosor de membrana de 35 \pm
3,5 \mum y una estructura de capa múltiple de 150 capas o más,
obtenida a partir de celulosa regenerada por cupramonio como
material. Este módulo BMM se integra, utilizando un adhesivo de
poliuretano, con el interior de un contenedor plástico fabricado
con policarbonato, el cual puede esterilizarse, empaquetándose en el
módulo el agua destilada para inyección. La seguridad de cada uno
de los materiales que forman Planova se ha confirmado mediante
procedimientos respectivos establecidos por la Farmacopea Japonesa
(según las descripciones respecto a BMM).
La solución que contiene 5% peso/vol de
inmunoglobulina preparada en el Ejemplo 1, se esterilizó mediante
filtración (filtración mediante un filtro de membrana con un tamaño
de poro de 0,2 \mum), sometiéndose entonces a 1 a 5 horas de un
tratamiento de filtración en membrana con el módulo Planova 35 a
5ºC, bajo una presión de filtración de 0,196 bar (0,2 kgf/cm^{2};
filtración de final abolido que utiliza la presión de aire).
Después de enfriar, el tratamiento de esterilización se llevó otra
vez a cabo para preparar una preparación líquida de inmunoglobulina
para utilizarla en inyección.
La solución conteniendo 5% peso/vol de
inmunoglobulina, preparada en el Ejemplo 1, se hizo pasar a través
de un filtro A1 de escasa porosidad (Zeta Plus LA90, fabricado por
Quno Corp.) y un filtro anhidro portador de sílice (Zeta Plus
Delipid, fabricado por Quno Corp.) para recuperar la fracción no
absorbida. Esta se esterilizó posteriormente mediante filtración
para obtener una preparación líquida de inmunoglobulina para
inyección intravenosa.
La solución conteniendo 5% peso/vol de
inmunoglobulina, preparada en el Ejemplo 1, se hizo pasar a través
de un filtro A1 de escasa porosidad (Zeta Plus LA90, fabricado por
Quno Corp.) y un filtro anhidro portador de sílice (Zeta Plus
Delipid, fabricado por Quno Corp.) para recuperar la fracción no
absorbida. Después de llevar a cabo el tratamiento BMM según el
procedimiento del Ejemplo 3, ésta se esterilizó posteriormente
mediante filtración para obtener una preparación líquida de
inmunoglobulina para inyección intravenosa.
Se preparó una preparación líquida de
inmunoglobulina para inyección intravenosa de la misma forma que se
describe en el Ejemplo 1, excepto porque el tratamiento de
inactivación vírica se realizó poniendo la fracción durante 6 horas
en contacto con 0,3% peso/vol de TNBP
(tri-n-butil fosfato) y 1% peso/vol
de monoéster del ácido oleico sorbitano polioxietileno (Tween 80) a
pH 7 y a 30ºC, en vez de llevar a cabo un tratamiento térmico en
estado líquido durante 10 horas a un pH de 5,5 y a 60ºC.
Se preparó una preparación en polvo de
inmunoglobulina para inyección intravenosa de la misma forma que se
describe en el Ejemplo 1, excepto porque la liofilización se llevó a
cabo ajustando el pH de la fracción entre 6,4 y 7,2, mezclando
entonces la fracción con cloruro sódico al 0,6%, manitol al 2% y
albúmina al 1%, en vez de preparar la preparación líquida ajustando
a un pH de 5,5 y mezclando con sorbitol.
Se preparó una preparación en polvo de
inmunoglobulina para inyección intravenosa de la misma forma que se
describe en el Ejemplo 1, excepto porque mientras en la primera
etapa se llevó a cabo a un pH de 5,5 y a 60ºC un tratamiento
térmico en estado líquido durante 10 horas, y la preparación líquida
se obtuvo ajustando el pH a 5,5 y mezclando con sorbitol en la
etapa de preparación en el Ejemplo 1, en el Ejemplo 8 el tratamiento
térmico en estado líquido de la primera etapa no se llevó a cabo,
pero en vez de esto, se llevó a cabo la liofilización en la etapa
final, ajustando el pH de la solución entre 6,4 y 7,2, mezclando
entonces la preparación con cloruro sódico al 0,6%, manitol al 2% y
albúmina al 1%, después de lo cual, se llevó a cabo un tratamiento
térmico a 60ºC durante
72 horas.
72 horas.
Ejemplo 1 de
prueba
Se examinaron las propiedades de las
preparaciones de inmunoglobulina para inyección intravenosa,
preparadas en los Ejemplos 1 a 8. La preparación en polvo se
examinó después de disolverla en agua para inyección.
Se observó turbidez de la preparación líquida,
lo cual es de interés en relación con el aspecto.
Además, se midió la absorbancia a 600 nm para
evaluar la apariencia como turbidez.
El contenido en polímeros de la inmunoglobulina
basado en el peso total de ésta en la preparación líquida, se
determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Medido según Capat y Mayer, Experimental
Immunochemistry, 225 (1961) y Nishioka & Okada,
Men-eki no Seikagaku (Biochemistry in
Immunology), Vol 103, Kyoritsu Shuppan (1971). Es decir, se
añadió una muestra a 100 unidades de complemento, tomándose como
título del anticomplemento, la medida en la disminución en las
unidades del complemento.
Medido según el procedimiento del ensayo de la
inhibición de la hemaglutinación (Rosen, L., Virology,
13, 139 (1961)), y expresado como una unidad internacional
(IU/100 mg).
La conductividad eléctrica se midió con un
aparato para medir la conductividad, CD-35 modelo
MII (M & S Instrument Co).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las preparaciones líquidas para inyección
intravenosa preparadas en los Ejemplos a 1 a 6 mostraron las
propiedades siguientes:
- pH: 5,5
- Conductividad eléctrica: 1 mmho o menos (valor calculado a 8ºC)
- Contenido dimérico: 7% peso/vol o menor
- Contenido polimérico: 0,1% peso/vol o menor
- Título de anticomplemento: 20 unidades/ml o menos
- Razón osmótica: 1 aproximadamente (razón a solución salina isotónica).
- Apariencia: incolora a amarillo hipocrómico transparente
- Título de anticuerpos del sarampión: 40 IU (unidades internacionales) o más.
- Turbidez: 0,01 o menos.
Después de conservar la preparación líquida
según la presente invención (Ejemplo 5) a 37ºC durante 40 días, las
propiedades fueron similares a las anteriores al almacenamiento
(inmediatamente después de la preparación). De acuerdo con esto, la
preparación según la presente invención se considera que es estable
por lo menos un año cuando se almacena a temperatura ambiente.
Las preparaciones líquidas para inyección
intravenosa preparadas en los Ejemplos 7 y 8 mostraron las
propiedades siguientes:
- pH: 6,4 a 7,2
- Contenido dimérico: 7% peso/peso o menos
- Contenido polimérico: 0,1% peso/vol o menor
- Título de anticomplemento: 20 unidades/ml o menos
- Razón osmótica: 1 aproximadamente (razón a solución salina isotónica).
- Apariencia: amarillo hipocrómico transparente o ligeramente turbia.
- Título de anticuerpos del sarampión: 40 IU (unidades internacionales) o más.
Se preparó una preparación líquida de
inmunoglobulina de la misma forma que en el Ejemplo 1, excepto
porque el pH de la preparación final se ajustó a un pH de 4,25 en
vez de a un pH de 5,5.
Ejemplo 2 de
prueba
Las propiedades de la preparación líquida de
inmunoglobulina para inyección intravenosa preparadas en el Ejemplo
9 se examinaron de la misma forma que en el Ejemplo 1 de Prueba.
Estas propiedades fueron:
- pH: 4,25
- Conductividad eléctrica: 1 a 2 mmho o menos (valor calculado a 8ºC)
- Contenido dimérico: 7% peso/peso o menor
- Contenido polimérico: 0,1% peso/peso o menor
- Título de anticomplemento: 20 unidades/ml o menos
- Razón osmótica: 1 aproximadamente (razón a solución salina isotónica).
- Apariencia: incolora y transparente
- Título de anticuerpos del sarampión: 40 IU (unidades internacionales) o más.
- Turbidez: 0,01 o menos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se preparó una preparación líquida de
inmunoglobulina de la misma forma que en el Ejemplo 1, excepto
porque el pH de la preparación final se ajustó a un pH de 5,2 en
vez de a un pH de 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 de
prueba
Las propiedades de la preparación líquida de
inmunoglobulina para inyección intravenosa preparadas en el Ejemplo
10 se examinaron de la misma forma que en el Ejemplo 1 de Prueba.
(Lotes A-F) Estas propiedades fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
- pH: 5,2
- Conductividad eléctrica: 1 mmho (valor calculado a 8ºC)
- Contenido dimérico: 7% peso/peso o menor
- Contenido polimérico: 0,1% peso/peso o menor
- Título de anticomplemento: 20 unidades/ml o menos
- Razón osmótica: 1 aproximadamente (razón a solución salina isotónica).
- Apariencia: incolora a transparente
- Título de anticuerpos del sarampión: 40 IU (unidades internacionales) o más.
- Turbidez: 0,01 o menos.
Después de conservar la preparación líquida
según la presente invención (Ejemplo 10) a 30ºC durante 6 meses,
las propiedades fueron similares a las anteriores al almacenamiento
(inmediatamente después de la preparación).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las sustancias que contaminaban
la preparación líquida de la presente invención (Ejemplo 10). Los
procedimientos de medición fueron los siguientes:
Albúmina sérica humana:
- Método turbidimétrico
\vskip1.000000\baselineskip
MCP-1 (proteína -1 quimiotáctica
de los monocitos humanos):
- Método ELISA
\vskip1.000000\baselineskip
Componente -3 del complemento humano activado
(C3a):
- Método radioactivo utilizando ^{125}I-arginina
\vskip1.000000\baselineskip
Polietilenglicol (PEG):
- Colorimetría utilizando bario y yoduro (Microchemical Journal, 20: 190-192 (1957)) o cromatografía de impregnación en gel.
Los resultados se muestran en la tabla 1
siguiente.
Los resultados representados en la Tabla 1
describen una preparación de inmunoglobulina para inyección
intravenosa que es estable en el estado de solución durante por lo
menos un año a temperatura ambiente, y contiene como máximo 5
microgramos (\mug) por ml de HSA (albúmina sérica humana), como
máximo 16 picogramos (pg) por ml de MCP-1
(proteína-1 quimiotáctica de los monocitos humanos),
como máximo 3 microgramos (\mug) por ml de C3a
(componente-3 del complemento humano activado) y
como máximo 1 mg por dl de polietilenglicol.
Claims (25)
1. Procedimiento para la producción de una
preparación de inmunoglobulina para inyección intravenosa, que
comprende las etapas siguientes:
fraccionamiento de una solución que contiene
inmunoglobulina con 4 al 10% peso/vol de polietilenglicol de peso
molecular comprendido entre 1.000 y 10.000, con un valor de pH
comprendido entre 4,5 y 6,5, una fuerza iónica comprendida entre
0,0001 y 0,1 M y una temperatura comprendida entre 0 y 4ºC, para
recuperar una fracción de sobrenadante; y
concentración de la fracción del sobrenadante a
un pH comprendido entre 3,5 a 5,0 mediante ultrafiltración.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además una etapa de tratamiento de inactivación
vírica.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
que comprende además una etapa de recuperación de una fracción no
absorbida mediante un tratamiento con un intercambiador
aniónico.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un tratamiento de
filtración utilizando una membrana porosa con un tamaño medio de
poro comprendido entre 1 y 100 nm.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una etapa de
recuperación de una fracción no absorbida después de un tratamiento
de contacto utilizando sílice coloidal.
6. Procedimiento para la producción de una
preparación de inmunoglobulina para inyección intravenosa, que
comprende las etapas siguientes:
a) sometimiento de una fracción que comprende la
inmunoglobulina a un tratamiento de inactivación vírica;
b) fraccionamiento de una solución que contiene
inmunoglobulina con un 4 al 10% peso/vol de polietilenglicol de peso
molecular comprendido entre 1.000 y 10.000, con un valor de pH
comprendido entre 4,5 y 6,5, una fuerza iónica comprendida entre
0,0001 y 0,1 M y una temperatura comprendida entre 0 a 4ºC, para
recuperar una fracción del sobrenadante;
c) realización de un tratamiento de
concentración de la fracción del sobrenadante, a un valor de pH
comprendido entre 3,5 y 5,0 mediante ultrafiltración;
d) recuperación de una fracción no absorbida
mediante un tratamiento con un intercambiador aniónico;
(e) llevar a cabo un tratamiento de contacto
utilizando sílice coloidal; y
(f) recuperación de la fracción no absorbida
mediante un tratamiento de filtración utilizando una membrana porosa
que posee un tamaño medio del poro comprendido entre 1 y 100 nm.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el fraccionamiento se lleva a cabo
a un pH comprendido entre 5 y 6 y con una fuerza iónica comprendida
entre 0,0001 y 0,01 M.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración se lleva a cabo a
un pH comprendido entre 4 y 4,5.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la ultrafiltración se lleva a cabo
utilizando una membrana de ultrafiltración con un valor
discriminatorio del peso molecular de aproximadamente 100.000.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 9, en el que la inactivación vírica comprende
el tratamiento térmico en forma de una solución.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el tratamiento térmico se lleva a cabo a un pH comprendido
entre 4,5 y 6,5 y a una fuerza iónica comprendida entre 0,0001 y 0,1
M.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 ó
11, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo a una
temperatura comprendida entre 50º a 70ºC y durante un período de
tiempo comprendido entre 10 minutos y 20 horas.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que el tratamiento térmico se lleva
a cabo en presencia de un estabilizador.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el estabilizador se añade a una concentración de por lo menos
el 10% peso/volumen (p/vol.).
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, en el que la inactivación vírica comprende
la puesta en contacto con un fosfato trialquílico en forma de una
solución.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el tratamiento con el fosfato trialquílico se lleva a cabo a
una temperatura comprendida entre 0 y 60ºC y durante un periodo de
tiempo de por lo menos 30 minutos.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó
16, en el que el tratamiento con el fosfato trialquílico se lleva a
cabo en combinación con un fosfato trialquílico y un agente
superficial activo.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que el tratamiento con fosfato
trialquílico se lleva a cabo a un pH comprendido entre 6 y 8.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 18, en el que el tratamiento con el
intercambiador aniónico se lleva a cabo a un pH comprendido entre 5
y 7 y con una fuerza iónica comprendida entre 0,0001 y 0,1 M.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que el intercambiador aniónico incluye un tipo dietilaminoetilo
(DEAE) o un tipo aminoetilo cuaternario (QAE).
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 20, en el que la filtración se lleva a cabo a
un pH comprendido entre 4 y 7 y una fuerza iónica comprendida entre
0,0001 y 0,1 M, y bajo una presión de 0,098 a 0,98 bar (0,1 a 1
kgf/cm^{2}) y a una temperatura comprendida entre 4 y 50ºC.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la membrana porosa posee un tamaño medio del poro comprendido
entre 10 y 75 nm.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 22, en el que el tratamiento de contacto con la
sílice coloidal se lleva a cabo a un pH comprendido entre 4 y 7 y a
con una fuerza iónica comprendida 0,0001 a 0,1 M.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que la sílice coloidal incluye un gel de sílice, un anhídrido
silícico ligero, una tierra de diatomeas, una arcilla ácida, una
bentonita, un caolín o un aluminato silicato magnésico.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, que comprende además el paso de la solución
que contiene inmunoglobina a través de un filtro de aluminio (Al)
con escasos poros.
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