JP6189751B2 - 病原体不活性化剤としてのグリコール - Google Patents
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Description
アフィニティー・クロマトグラフィー溶出液中に45%(v/v)で存在するプロピレングリコール(PG)による2つのエンベロープウイルス(TGEVおよびBVDV)の不活性化を評価した。関心のあるトランスジェニックタンパク質(乳中に分泌される、そのタンパク質を産生するトランスジェニック動物由来の乳組成物中の)の産生中に、溶出液が生成された。
出発材料(溶出液)の細胞毒性、ウイルス干渉および抑制のパラメータを、PGの存在下でのインキュベーションアッセイの前に判定した。細胞毒性、ウイルス干渉および抑制を判定するためのアッセイを、アフィニティー・クロマトグラフィーの溶出液サンプルについて行った。
ウイルス干渉制御およびサンプル抑制のパラメータを同時に決定した。
動作条件
プロピレングリコール(PG)によるエンベロープウイルス(TGEVおよびBVDV)の不活性化の反応速度(kinetics)は、これらのウイルスを20℃(±5℃)で6時間に亘り、トランスジェニックタンパク質の精製プロセス中に得られた、45%(v/v)のPGを含有するアフィニティークロマトグラフィーの溶出液と接触させることによって評価した。ウイルスは、5%(v/v)の濃度でサンプルに加えた。各ウイルスについて、アッセイは二重に行った。
出発材料はアフィニティー・クロマトグラフィー溶出液であった。この出発材料に、5%(v/v)のウイルスで加えた。
ビーカーを、20℃±5℃の加熱装置に入れた。このビーカーを、マグネチックスターラー上に配置し、処理前に20℃±5℃に維持した。
・ 20℃±5℃の温度および6時間のインキュベーション期間、
・ 計画通りのサンプルアリコートの採取。
上述したアッセイ中に作製したサンプルの滴定は同じ日に行った。
表IIIに示されたサンプルのウイルスの滴定は、TGEVに関する研究L−50およびBVDVに関する研究L−319にしたがって行った。
・ 第1の実験により得られたサンプル(表V)を標準プロトコルによって最初に滴定した、
・ 標準プロトコルによりウイルスが検出されなかった第1の実験により得られた分画を、第2の実験により得られたサンプルに類似の大容量平板培養(LPV)において分析した、
・ 標準プロトコルにおいてウイルスが検出されなかった場合、第1のサンプルと最後のサンプル(6時間のインキュベーション後に採取したサンプル)を、LVPを使用して、最小限に滴定した。
培養上清を除去し、滴定すべきサンプルの20μLで置き換えた。
「n」の複製におけるウイルス滴定法「大容量平板培養」により、試験されるサンプル容量を増加させることができ、それゆえ、検出限界を増加させることができる。分析は、サンプル希釈を一回だけ使用して行い、1枚以上の96穴プレートの全ての穴に配置したことを除いて、プロトコルは標準滴定と同一である。統計分析は、スピアマン・ケルバーの方法にしたがって行った。
サンプル滴定と並行して、以下の対照を作製した:
・ 各一連の滴定に、負の対照を使用した。この対照は、培地(一連の滴定に使用した)のサンプル滴定に使用した条件による滴定からなる。
・ 各一連の滴定に、正の対照も使用した。この研究において、正の対照として、BVDVおよびTGEVを使用した。これらの正の対照の力価は、6.08log10TCID50/mL±0.5log10TCID50/mLおよび6.41log10TCID50/mL±0.5log10TCID50/mLであった。
滴定アッセイは、以下であれば、有効であると考えた:
・ 細胞外層の破壊が負の対照に観察されなかった。
・ サンプル滴定が、少なくとも3回の連続希釈について、0%と100%の間の正の穴の率を示す。
・ サンプルの少なくとも最後の希釈について、0%と等しい正の穴の率が認識される。
6日間のインキュベーション期間後(各ウイルスについて)、各希釈の各穴について、細胞外層の全破壊または部分破壊を有した細胞の数を数量化した(40倍および/または100倍のサイズの顕微鏡により)。各穴のウイルス力価をTCID50/mL(log10で)で表されたケルバーの式にしたがって決定した。
qiは、希釈iでの負の穴の率である、
により計算した。
νは、穴毎の接種材料容積であり、
nは、各希釈についての接種した穴の数であり、
rは、感染した穴の数である、
にしたがって計算した。
総ウイルス量=力価×サンプル容積(mL)
にしたがって、力価およびサンプル容積により計算した。
類似の研究を、X−MuLVウイルスおよびPRVウイルスを使用し、標準偏差の決定を含む、45%のPGで溶出したアフィニティークロマトグラフィーについて行った。
他の実施態様
1.病原体不活性化剤としてのグリコールの使用。
2.前記グリコールがプロピレングリコールである、実施態様1記載の使用。
3.生物学的組成物中の病原体を不活性化させる方法であって、前記生物学的組成物をグリコールと接触させる工程を含む方法。
4.前記グリコールがプロピレングリコールである、実施態様3記載の方法。
5.前記生物学的組成物が血液組成物または乳組成物である、実施態様3または4記載の方法。
6.前記病原体が、ウイルス、細菌、菌類、原生動物、寄生虫、およびプリオンからなる群より選択される、実施態様3から5いずれか1項記載の方法。
7.前記ウイルスが、X−MuLV、PRV、BVDVおよびTGEVウイルスからなる群より選択される、実施態様6記載の方法。
8.前記方法により、4Log 10 TCID(組織培養感染量)以上の病原体除去がもたらされ、該TCIDがケルバーの方法および/またはスピアマン・ケルバーの方法にしたがう、実施態様3から7いずれか1項記載の方法。
9.前記接触工程後のグリコールの濃度が、前記生物学的組成物の40%(v/v)と50%(v/v)の間である、実施態様3から8いずれか1項記載の方法。
10.15℃と25℃の間の温度で行われる、実施態様3から9いずれか1項記載の方法。
11.7.0と8.0の間のpHで行われる、実施態様3から10いずれか1項記載の方法。
12.実施態様3から11いずれか1項記載の方法により得られる、グリコールを含む生物学的組成物。
13.前記グリコールが40%(v/v)と50%(v/v)の間の濃度である、実施態様12記載の生物学的組成物。
14.前記グリコールがプロピレングリコールである、実施態様12または13記載の生物学的組成物。
Claims (8)
- 治療剤の製造において使用するまたは臨床サンプルとして使用するための生物学的組成物におけるウイルス病原体不活性化剤としてのグリコールの使用であって、前記生物学的組成物は、血液組成物、乳組成物、尿、汗、唾液、糞、脊髄液、細胞抽出物または組織抽出物であり、前記グリコールがプロピレングリコールであり、前記生物学的組成物中の前記グリコールの濃度が40%(v/v)と50%(v/v)の間である、使用。
- 治療剤の製造において使用するまたは臨床サンプルとして使用するための生物学的組成物中のウイルス病原体を不活性化させる方法であって、前記生物学的組成物をグリコールと接触させる工程を含み、前記生物学的組成物が、血液組成物、乳組成物、尿、汗、唾液、糞、脊髄液、細胞抽出物または組織抽出物であり、前記グリコールがプロピレングリコールであり、前記接触工程後のグリコールの濃度が、前記生物学的組成物の40%(v/v)と50%(v/v)の間である、方法。
- 前記ウイルス病原体がエンベロープウイルスである、請求項2記載の方法。
- 前記エンベロープウイルスが、X−MuLV、PRV、BVDVおよびTGEVウイルスからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
- 前記方法により、4Log10TCID(組織培養感染量)以上の病原体除去がもたらされ、該TCIDがケルバーの方法および/またはスピアマン・ケルバーの方法にしたがう、請求項2から4いずれか1項記載の方法。
- 15℃と25℃の間の温度で行われる、請求項2から5いずれか1項記載の方法。
- 7.0と8.0の間のpHで行われる、請求項2から6いずれか1項記載の方法。
- 病原体不活性化剤としてグリコールを含む、治療剤の製造において使用するまたは臨床サンプルとして使用するための生物学的組成物であって、該生物学的組成物が、血液組成物、乳組成物、尿、汗、唾液、糞、脊髄液、細胞抽出物または組織抽出物であり、前記グリコールがプロピレングリコールであり、前記生物学的組成物中の前記グリコールの濃度が40%(v/v)と50%(v/v)の間である、生物学的組成物。
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