CN114041049A - 改善dmb标记的唾液酸的荧光信号的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了改善来自用染料1,2‑二氨基‑4,5‑亚甲二氧基苯(“DMB”)标记的唾液酸的信号的方法和试剂盒。所述方法包括将所述唾液酸用在水溶液中的DMB标记，所述水溶液包含pH通过酸诸如磷酸或盐酸调节至1.5‑3.2的甘氨酸氨基酸和还原剂。

Description

改善DMB标记的唾液酸的荧光信号的方法和试剂盒

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年6月14日提交的美国临时专利申请号62/861,924的权益和优先权，其内容出于所有目的通过引用并入本文。

联邦资助声明

不适用。

背景技术

本发明涉及改善来自用染料1,2-二氨基-4,5-亚甲氧基苯(“DMB”)标记的唾液酸(诸如从糖缀合物或参考标准品释放的那些)的信号的领域。

多个商业和法规要求使得需要确定糖蛋白或糖肽上存在的聚糖的性质和量，并且特别是对于用作治疗剂的糖蛋白。由于附着至糖蛋白的聚糖可以影响对于糖蛋白的功能至关重要的特征，包括其药代动力学、稳定性、生物活性和免疫原性，重要的是确定存在哪些聚糖。食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)要求进行附接至生物制品(诸如治疗性糖蛋白和疫苗)的聚糖的表征，以显示物质的组成和制造的一致性，从而导致需要对产品进行广泛表征。对于治疗性和非治疗性重组蛋白二者的生产中的质量控制，对碳水化合物谱的分析也是重要的，其中碳水化合物谱的变化可以指示系统中的应激，从而表明可能需要丢弃商业规模发酵罐的内容物的状况。因此，生物化学家、临床化学家、制药商和蛋白质生产商对确定生物学样品(诸如治疗性糖蛋白)中聚糖的分布谱非常感兴趣。

唾液酸是在与糖蛋白相关的许多聚糖上发现的9碳羧化2-酮糖家族。如Reiding等人,Analyt.Chem.,2014,86:5784-93,“N-glycans on mammalian proteins oftenexhibit terminal sialic acids such as N-acetylneuraminic acid,which...showsimportance in cellular communication,and determines protein half-life.Sialicacids are most frequently attached to a terminal galactose viaα2,6orα2,3glycosidic linkages and show different functionality as a consequence.”Reiding等人,第5784页所指出。自然界中已鉴定出超过25种唾液酸衍生物，并且已显示其在多种生物活性中发挥作用。

可以通过以下方式进行与糖蛋白或其他糖缀合物附接的唾液酸的存在和类型的确定：通过用唾液酸酶进行唾液酸的酶消化或通过将糖蛋白或其他糖缀合物在80℃下在酸溶液诸如2M乙酸或0.05N HCl中孵育1至3小时进行部分酸水解来释放唾液酸。一旦唾液酸从它们所附接的任何糖缀合物中被释放出来，就可以将其用DMB标记并且然后通过各种分析技术进行检测。典型地，将唾液酸在包含大约1.5M乙酸和至少一种还原剂(典型地是β-巯基乙醇)的溶液中用DMB标记，通过液相色谱法分离所得的DMB标记的唾液酸，以及将分离的标记的唾液酸提供给荧光检测器，然后对来自标记的唾液酸的信号进行定量。

不幸的是，乙酸可能是唾液酸的酸水解和随后唾液酸的DMB标记中最常用的酸，具有强烈的气味和挥发性。如果不保持被盖紧，则酸的体积会减少，从而无法计算浓度。此外，DMB标记方案中常用的还原剂β-巯基乙醇不仅具有强烈的令人不快的气味，而且还是一种毒素，其如果被吸入、吞咽或通过使用者的皮肤吸收，则可能会致命。而且，虽然DMB标记被认为是用于检测样品中存在的唾液酸的灵敏且选择性的技术，但一些唾液酸仅以少量存在于一些糖缀合物上，并且一些糖缀合物非常昂贵或难以生产，以至于减少测量其唾液酸化所需的糖缀合物的量将是有用的。增加来自DMB标记的唾液酸的信号将有助于增加检测样品中唾液酸的能力，即使仅存在少量。

本领域仍然需要这样的方法和试剂盒，其提供另外的用于增加来自用DMB标记的唾液酸的信号的方法。此外，本领域仍然需要使用比乙酸挥发性更低并且气味更低的酸的方法以及使用比β-巯基乙醇毒性更小并且气味更低但允许增加从DMB标记的唾液酸获得的信号的还原剂的方法。令人惊讶地，本发明满足这些和其他需求。

发明内容

本发明提供了用于改善来自用染料1,2-二氨基-4,5-亚甲氧基苯(“DMB”)标记的游离唾液酸(诸如从糖缀合物或参考标准品释放的那些)的信号的方法和试剂盒。在第一组实施方案中，本发明提供了用于用DMB标记游离唾液酸以及任选地用于分析所述DMB标记的唾液酸的体外方法，所述方法包括步骤(a)将所述游离唾液酸与在水溶液中的有效量DMB在足以允许标记的时间和温度下一起孵育，从而使所述游离唾液酸被DMB标记，所述水溶液包含(i)甘氨酸和酸的水溶液，其中所述甘氨酸以0.25M至3M的摩尔浓度存在并且所述溶液具有1.5-3.2的pH，和(ii)选自硫代甘油和β-巯基乙醇(“BME”)的还原剂。在一些实施方案中，所述溶液进一步包含连二亚硫酸钠。在一些实施方案中，所述酸是磷酸。在一些实施方案中，所述酸是盐酸。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.25M至2.5M±0.25M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.25M至2.0M±0.25M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.40M至1.75M±0.25M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.4M至1.5M±0.25M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.4M至1.25M±0.25M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.5M至1M±0.25M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.5M至0.9M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是从0.6M至0.8M±0.1M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是0.75M±0.1M。在一些实施方案中，所述甘氨酸的摩尔浓度是0.75M±0.05M。在一些实施方案中，所述溶液具有2至3.2的pH。在一些实施方案中，所述溶液具有2.5±0.1至3的pH。在一些实施方案中，所述溶液具有2.7±0.25至2.9±0.25的pH。在一些实施方案中，所述溶液具有2.8±0.25的pH。在一些实施方案中，所述酸是磷酸。在一些实施方案中，所述酸是盐酸。在一些实施方案中，足以标记所述游离唾液酸的所述时间是1-6小时。在一些实施方案中，足以标记所述游离唾液酸的所述时间是2-5小时。在一些实施方案中，足以标记所述游离唾液酸的所述时间是3小时±30分钟。在一些实施方案中，足以标记所述游离唾液酸的所述时间是2.5小时±30分钟。在一些实施方案中，足以标记所述游离唾液酸的所述温度是35℃-65℃。在一些实施方案中，足以标记所述游离唾液酸的所述温度是50℃±5℃。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(b)分离游离的DMB标记的唾液酸。在一些实施方案中，通过使所述游离的DMB标记的唾液酸经受液相色谱法进行所述游离的DMB标记的唾液酸的分离。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(c)通过使游离的分离的DMB标记的唾液酸经受分析方法来分析游离的分离的DMB标记的唾液酸。在一些实施方案中，所述分析方法是荧光检测。在一些实施方案中，所述分析方法是UV检测。

在第二组实施方案中，本发明提供了释放、标记和任选地分析存在于糖缀合物上的唾液酸的方法，所述方法包括：(a)使希望体积的所述糖缀合物与包含甘氨酸的第一水溶液接触，所述甘氨酸用酸调节至1.5-3.2的pH，(b)将所述糖缀合物与所述第一水溶液在足以从所述糖缀合物中释放所述唾液酸的时间和温度下一起孵育，从而从所述糖缀合物中释放所述唾液酸，(c)将在所述第一水溶液中的所述释放的唾液酸冷却至50℃±10°的温度，(d)使所述释放的唾液酸与溶液接触，从而形成样品/标记混合物，所述溶液由以下组成：(i)有效量的1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)，(ii)包含甘氨酸的第二水溶液，所述溶液用酸调节至1.5-3的pH，和(iii)有效量的一种或多种还原剂，以及(e)将所述样品/标记混合物在足以标记所述混合物中的所述释放的唾液酸的时间和温度下孵育，从而使所述释放的唾液酸被DMB。在一些实施方案中，所述糖缀合物是糖蛋白。在一些实施方案中，所述糖缀合物是糖脂或寡糖。在一些实施方案中，第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至1.5-3.2的pH。在一些实施方案中，第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至2-3的pH。在一些实施方案中，第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至2.5-3的pH。在一些实施方案中，第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至2.8±0.1的pH。在一些实施方案中，第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至1.5-3.2的pH。在一些实施方案中，第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至2-3的pH。在一些实施方案中，第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至2.5-3的pH。在一些实施方案中，第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且pH用酸调节至2.8±0.1的pH。在一些实施方案中，在第一水溶液中的酸是磷酸。在一些实施方案中，在第二水溶液中的酸是磷酸。在一些实施方案中，在第一水溶液和第二水溶液中调节所述溶液的pH的酸是磷酸。在一些实施方案中，在第一水溶液中的酸是盐酸。在一些实施方案中，在第二水溶液中调节所述溶液的pH的酸是盐酸。在一些实施方案中，在第一水溶液和第二水溶液中的酸是盐酸。在一些实施方案中，所述一种或多种还原剂包括β-巯基乙醇(“BME”)。在一些实施方案中，所述一种或多种还原剂包括硫代甘油。在一些实施方案中，所述一种或多种还原剂包括BME和连二亚硫酸钠。在一些实施方案中，所述一种或多种还原剂包括硫代甘油和连二亚硫酸钠。在一些实施方案中，在步骤(b)中释放唾液酸的时间是0.5-5小时。在一些实施方案中，在步骤(b)中释放唾液酸的时间是1.0-4小时。在一些实施方案中，在步骤(b)中释放唾液酸的时间是2小时±30分钟。在一些实施方案中，在步骤(b)中用于释放唾液酸的温度是70℃-100℃。在一些实施方案中，在步骤(b)中用于释放唾液酸的温度是70℃-90℃。在一些实施方案中，在步骤(b)中用于释放唾液酸的温度是80℃±5℃。在一些实施方案中，在步骤(e)中用于标记释放的唾液酸的时间是1-6小时。在一些实施方案中，在步骤(e)中足以标记释放的唾液酸的时间是2-5小时。在一些实施方案中，在步骤(e)中足以标记释放的唾液酸的时间是3小时±30分钟。在一些实施方案中，在步骤(e)中足以标记释放的唾液酸的时间是2小时±30分钟。在一些实施方案中，在步骤(e)中足以标记释放的唾液酸的温度是35℃-65℃。在一些实施方案中，在步骤(e)中足以标记释放的唾液酸的温度是50℃±5℃。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(f)，分离释放的DMB标记的唾液酸。在这些实施方案中的一些中，通过使所述释放的DMB标记的唾液酸经受液相色谱法进行所述释放的DMB标记的唾液酸的分离。在释放的DMB标记的唾液酸已被分离的一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(g)，通过使释放的分离的DMB标记的唾液酸经受分析方法来分析释放的分离的DMB标记的唾液酸。在这些实施方案中的一些中，所述分析方法通过检测荧光来进行。

在再又一组实施方案中，本发明提供了用1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)标记游离唾液酸的试剂盒。所述试剂盒包含DMB、甘氨酸、酸和还原剂。方便地，DMB、甘氨酸、酸和还原剂可以布置在一个或多个容器中。在一些实施方案中，所述酸是磷酸。在一些实施方案中，所述酸是盐酸。在一些实施方案中，所述甘氨酸与所述酸在溶液中预混合。在一些实施方案中，包含与酸混合的所述甘氨酸的溶液具有在2与3之间的pH。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含连二亚硫酸钠。在一些实施方案中，所述还原剂是β-巯基乙醇(“BME”)。在一些实施方案中，所述还原剂是硫代甘油。在一些实施方案中，所述酸是盐酸并且所述还原剂是硫代甘油。在一些实施方案中，所述酸是磷酸并且所述还原剂是硫代甘油。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种唾液酸标准品。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种唾液酸酶。在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)在溶液中的甘氨酸，所述溶液用磷酸调节至2.8的pH，(b)硫代甘油，(c)DMB，和(d)连二亚硫酸钠。在这些实施方案中的一些中，所述硫代甘油以0.72摩尔±0.1摩尔提供，所述DMB以5毫摩尔±1毫摩尔提供，并且所述连二亚硫酸钠以56毫摩尔±10毫摩尔提供。

附图说明

图1是条形图，其示出了比较在等量的唾液酸在标记溶液中被染料1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)标记后从示例性唾液酸标准品检测到的荧光信号的研究结果，所述标记溶液包含(a)由以下之一提供的酸性缓冲液：1.5M乙酸、用氢氧化钠滴定至2.8的pH的1.5M磷酸(“磷酸钠”)、用磷酸调节至2.8的pH的1.5M甘氨酸溶液(“甘氨酸磷酸盐”)或用盐酸调节至2.8的pH的1.5M甘氨酸溶液(“甘氨酸HCl”)，(b)选自β-巯基乙醇(“巯基乙醇”)或硫代甘油的还原剂，和(c)连二亚硫酸钠。为了允许准备好比较，来自在标准试剂乙酸、β-巯基乙醇和连二亚硫酸钠的存在下标记的唾液酸的信号被陈述为100％，如左起第一个条所示，而在条下方标注的其他试剂的存在下标记相同唾液酸的信号被陈述为占来自在标准试剂的存在下标记的唾液酸的信号的百分比。

图2是从嵌合单克隆抗体利妥昔单抗释放并且在包含乙酸、β-巯基乙醇(“巯基乙醇”)和连二亚硫酸钠的溶液中用DMB标记的唾液酸的色谱图(从荧光检测器读出的荧光图)。阴影区域是唾液酸Neu5Ac的峰。在保留时间1.5分钟处的小峰是唾液酸Neu5Gc的峰。在保留时间0.5-0.6分钟处的峰是伪影。

图3是从嵌合单克隆抗体利妥昔单抗释放并且在溶液中用DMB标记的唾液酸的色谱图，所述溶液包含通过磷酸调节至pH 2.8的甘氨酸(“甘氨酸磷酸盐”)、硫代甘油和连二亚硫酸钠。阴影区域是唾液酸Neu5Ac的峰。在保留时间1.5分钟处的小峰是唾液酸Neu5Gc的峰。在保留时间0.5-0.6分钟处的峰是伪影。

具体实施方式

引言

如背景技术中所阐述，与糖缀合物诸如糖蛋白和糖脂附接的聚糖的种类和数量的分析对于各种监管和质量控制目的而言是重要的。特别地，与治疗性糖蛋白(诸如单克隆抗体)附接的聚糖的类型以及每种类型的聚糖的量的分析在此类糖蛋白的生产中以及在确认它们将具有所希望的药理学活性时已经成为重要的质量控制测量。

唾液酸是神经氨酸(一种九碳酸)的N-和O-衍生物家族，其发现于与糖蛋白和糖苷附接的糖链末端。糖缀合物诸如糖蛋白可以具有不同的半衰期和生物活性，取决于其上是否存在唾液酸以及如果存在，那么存在哪些唾液酸。因此，存在于目的糖缀合物上的唾液酸的量和类型的确定对于确定糖缀合物的生物学特性是重要的。对于旨在用作治疗剂的糖蛋白诸如融合蛋白，确认糖蛋白的唾液酸化在整个生产过程中保持不变对于维持预期生物学效应的一致性和监管批准而言都是重要。

唾液酸典型地通过部分酸水解或通过多种唾液酸酶中的任何一种对糖缀合物进行酶消化从糖缀合物中释放。未与糖缀合物附接的唾液酸，诸如由这些方法中的任一种从糖缀合物中释放的唾液酸或作为参考标准品提供的唾液酸，在本文中有时被称为“游离唾液酸”。游离唾液酸典型地在酸性水溶液中在一种或多种还原剂的存在下用染料1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)标记(用DMB标记游离唾液酸在本文中将有时被称为“标记反应”)。典型的DMB标记方案要求将唾液酸与在酸性水溶液中的DMB在50℃下孵育两至三个小时。在标记反应之后，典型地通过液相色谱法诸如高效液相色谱法(“HPLC”)分离DMB标记的唾液酸，并且然后通过将分离的DMB标记的唾液酸提供至荧光检测器或至紫外(“UV”)检测器进行分析。通过部分酸水解从糖蛋白中释放唾液酸，用DMB标记唾液酸，并且通过荧光检测来检测标记的唾液酸已至少自1990年代初期就被使用(参见，例如，Lagana等人,Anal.Biochem,1993,215(2):266-272；Hayakawa等人,J Chromatography B:Biomed Sciand Applns,1993,620(1):25-31；Kawano等人,J Biol Chem,1995,270(27):16458-16463)。假定从业者熟悉当前用于从糖缀合物中释放唾液酸、对游离唾液酸(无论是从糖缀合物释放的还是参考标准品)进行DMB标记以及随后分离和检测已被DMB标记的唾液酸的技术和条件。还应注意，本领域常规的是将已用DMB标记的唾液酸称为“DMB标记的唾液酸”，无论它们在被标记后是否在唾液酸的化学定义内。本文将遵循这种用法。

尽管已数十年来使用DMB标记来提供唾液酸的检测，但希望通过增加来自标记的唾液酸的信号来进一步改善对DMB标记的唾液酸的检测灵敏度。此外，目前的方法具有几个缺点。特别地，典型地用于维持标记反应所需的酸条件的酸是乙酸，乙酸具有强烈的气味并且是挥发性的。如果在标记反应之前和过程中不注意保持装有酸的容器盖好，则挥发性可能引起酸的损失以及随之而来的摩尔浓度和试剂量变化。而且，标记程序中最常用的还原剂是β-巯基乙醇(本文也称为“BME”)。不幸的是，BME不仅是一种毒素，而且还具有强烈且令人不快的气味。希望具有较少令人讨厌的气味和潜在较低毒性的替代还原剂。

令人惊讶地，现已发现，作为数十年来在用DMB标记游离唾液酸的方案中使用的酸的乙酸不仅可以被替代，而且用被强酸调节至所希望的pH的两性离子氨基酸甘氨酸替代乙酸导致与当在本领域标准乙酸的存在下用DMB标记时相同的游离唾液酸相比在酸缓冲的甘氨酸的存在下用DMB标记的示例性游离唾液酸的信号大幅增加。用酸调节至所希望的pH的甘氨酸溶液在本文中有时称为“酸缓冲的甘氨酸”，并且所得的在酸性溶液中的甘氨酸溶液在本文中有时称为“甘氨酸缓冲液”或“酸性甘氨酸缓冲液”。

预期这种信号的增加将显著增加测定的灵敏度以及改善检测样品中游离唾液酸的能力，无论所述游离唾液酸是参考标准品，还是通过唾液酸酶从糖缀合物中酶释放而获得的唾液酸，还是通过部分酸水解从糖缀合物中获得的。预期信号的增加会显著改善检测仅少量的目的糖缀合物上存在的唾液酸以及确定目的糖缀合物(其中所述糖缀合物仅少量可用)上存在的唾液酸的能力。在优选的实施方案中，所述糖缀合物是糖蛋白。

甚至更令人惊讶地，还已发现，使用酸缓冲的甘氨酸还大幅减少当随后通过荧光检测分析被DMB标记的游离唾液酸时所见的伪影。伪影的减少使得更加容易检测仅少量的样品中唾液酸的存在。增加信号强度和减少伪影的组合使得试剂以及使用它们的程序和试剂盒的新组合在其获得和分析来自DMB标记的唾液酸的信号的能力方面比目前本领域使用的标记反应令人惊讶地更灵敏。

此外，还已发现，多年来在唾液酸的DMB标记方案中使用的还原剂BME可以用硫代甘油替代，硫代甘油具有比BME更低的气味和更小的毒性。基于本发明的研究显示，硫代甘油导致DMB标记至少与在BME的存在下唾液酸的DMB标记相当，并且甚至可以导致与在BME的存在下用DMB标记相同唾液酸相比更强的信号。

使用酸缓冲的甘氨酸增加来自唾液酸的DMB标记的信号

在本发明的一个方面，已经发现，(1)用酸缓冲的甘氨酸取代传统用于为DMB标记反应提供温和酸性条件的乙酸导致令人惊讶地更好的来自标记的唾液酸的信号，以及(2)可以将传统用于DMB标记的还原剂改为气味更小并且毒性更小并且仍能获得等效信号的还原剂。(为清楚起见，注意以下所有研究都包括第二还原剂连二亚硫酸钠，也称为硫代亚硫酸钠。先前的研究表明，当使用BME和连二亚硫酸钠两者时DMB标记比单独使用任何一种时更好。)

在基于本发明的研究中，将来自在其中酸性条件由乙酸提供并且还原剂是BME的水溶液中被DMB标记的示例性唾液酸Neu5Ac的样品的荧光信号与来自当在其中酸性条件由通过添加氢氧化钠调节至pH 2.8的磷酸或用通过磷酸或盐酸调节至pH 2.8的甘氨酸提供的水溶液中标记时相同唾液酸的信号进行比较。在DMB标记后，使溶液经受HPLC分离并且然后经受荧光检测以定量来自标记的Neu5Ac的信号。

图1呈现了通过使用上面讨论的试剂标记Neu5Ac获得的结果。为了便于比较结果，将使用常规试剂乙酸和BME获得的峰面积归一化为100％，其他试剂组合的信号显示为相对于所述信号的百分比。技术人员应认识到，峰面积是曲线下面积的积分并且是对信号的定量。

参考图1，在由用氢氧化钠调节至pH 2.8的磷酸(在图中示为“磷酸钠”)提供的酸性条件下标记唾液酸产生的信号强度是当在由乙酸提供的酸性条件下标记唾液酸时获得的信号强度的仅74％。然而，当在由用磷酸调节至pH 2.8的甘氨酸(“甘氨酸磷酸盐”)提供的酸性条件下标记唾液酸时，信号是使用标准酸乙酸提供酸性条件获得的信号的143％，如左起第三个条所示。(如下面实施例中所讨论的，图1中所示研究中使用的溶液是通过以3M甘氨酸水溶液开始并且用酸调节溶液的pH来制造的。然而，相同的溶液可以通过采用上句中添加到甘氨酸溶液中的所选酸的量并且将其添加到相同量的3M甘氨酸溶液中来制造。)通过进行相同的测定来证实使用被酸调节至所希望的pH的甘氨酸的有益效果，除了用盐酸调节至pH 2.8的3M甘氨酸溶液(此溶液有时在本文中称为“甘氨酸盐酸盐”)。如图1左起第五个条所示，在甘氨酸盐酸盐和BME的存在下对唾液酸进行DMB标记产生的信号是在标准酸乙酸和相同的还原剂的存在下标记的相同样品的信号的123％。

此外，研究测试了硫代甘油(3-巯基丙烷-1,2-二醇，有时在本文中称为“TG”)(一种气味强度比BME小且毒性比BME小的还原剂)是否可以替代BME作为用DMB标记游离唾液酸的首选还原剂。在由用磷酸调节至pH 2.8的甘氨酸提供的酸性条件下但使用硫代甘油作为还原剂对示例性唾液酸进行DMB标记使信号增加至当在由乙酸提供的酸性条件和BME中标记时相同唾液酸的信号的146％，是比当在用磷酸调节至pH 2.8的甘氨酸和BME的存在下标记相同唾液酸时获得的结果甚至更好的结果。此外，在用盐酸调节至pH 2.8的甘氨酸和硫代甘油的存在下对示例性游离唾液酸进行DMB标记使信号增加至当在乙酸和BME的存在下标记时相同唾液酸的信号的123％。结果显示，在DMB标记中作为还原剂的BME可以用硫代甘油替代，硫代甘油是比BME更少令人讨厌的气味并且比BME更小毒性而仍然达到等效以及在一些情况下更好标记信号的还原剂。

酸的改变大幅减少伪影

如上所指出，基于本发明的研究显示，与用在DMB标记中使用的标准酸和还原剂乙酸和BME标记唾液酸相比，用酸缓冲的甘氨酸和还原剂标记唾液酸急剧地减少了伪影。图2示出了从利妥昔单抗释放的唾液酸的色谱图，利妥昔单抗是一种用于治疗除其他病症外尤其是白血病和淋巴瘤的商业上重要的治疗性嵌合单克隆抗体。将释放的唾液酸在含有乙酸和BME的标准缓冲溶液中标记(与本文报道的其他标记溶液一样，还存在连二亚硫酸钠)，在HPLC柱上分离，并且流过荧光检测器并且被荧光检测器检测。图的Y轴绘制相对响应(以％为单位)，并且图的X轴绘制当样品的组分流过荧光检测器时以分钟为单位的保留时间。在此色谱图中，最高峰示出了几乎57.5的值，反映了样品中存在唾液酸Neu5Ac，保留时间为大约1.85分钟与2.15分钟之间。测量值几乎为25或是唾液酸Neu5Ac峰的大约43％的第二大峰出现在从0.5分钟至0.6分钟的保留时间处。然而，此峰是伪影，因为在该时间没有唾液酸从HPLC柱出来。在保留时间1.5分钟时，看到测量值约4的较小峰。此峰代表唾液酸Neu5Gc，并且是伪影峰高度的大约16％。

图3示出了含有唾液酸的相同样品的色谱图，但其中在甘氨酸磷酸盐提供酸性条件的溶液中标记唾液酸。BME又用作还原剂(如在本文报道的其他研究中，溶液中还存在连二亚硫酸钠)。轴如图2所述。在此色谱图中，唾液酸Neu5Ac的峰示出了几乎95的值。反映伪影的在从0.5至0.6的保留时间处的峰具有Neu5Ac峰的高度的大约13％或大约14％的高度，而在图2中，伪影峰是Neu5Ac峰的43％。代表唾液酸Neu5Gc峰的在保留时间1.5分钟处看到的较小峰又是约4，但现为伪影峰高度的大约31％，而在图2中，此唾液酸的峰是伪影峰高度的仅16％。因此，从乙酸到具有通过添加强酸调节的pH的甘氨酸溶液的改变令人惊讶地减少了在DMB标记的唾液酸的荧光检测中看到的伪影，并且与伪影相比，使得辨别唾液酸的存在容易得多。

可用于部分酸水解的酸、可以与甘氨酸一起用于唾液酸的DMB标记的酸或两者

一些唾液酸，诸如丰富的唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac或NANA)，会被乙酰化。过去常常避免使用强酸来分析唾液酸，因为强酸可以使乙酰化唾液酸脱乙酰化，使唾液酸“崩溃”并且引起关于起始糖缀合物上存在的唾液酸的信息丢失。也许部分出于这个原因，用于唾液酸的部分酸水解的方案经常在DMB标记反应中使用乙酸，乙酸被认为是一种弱酸。

如图1所示，使用通过添加酸至适合进行DMB标记的选定pH得到的两性离子氨基酸甘氨酸的基于本说明书的研究导致来自示例性乙酰化唾液酸(Neu5Ac)的标记的信号显著高于在由标准试剂乙酸或由用氢氧化钠调节至相同选定pH的磷酸提供的酸性条件下标记的信号。

参考图1，左起第一个条示出了来自在由乙酸提供的酸性条件下用BME作为还原剂进行DMB标记的Neu5Ac的样品的信号，并且所述信号被设为100％以提供准备好与来自使用在条下方示出的其他试剂标记的相同量的相同唾液酸的信号的比较。如左起第二个条所示，在用氢氧化钠调节至pH 2.8的磷酸与作为还原剂的BME的存在下标记的唾液酸产生的信号是在乙酸和相同还原剂(第一个条)的存在下标记的信号的仅74％。然而，左起第三个条显示，来自在通过添加磷酸调节至pH 2.8的甘氨酸的存在下相同量的用DMB标记的相同唾液酸的信号给出了比在乙酸的存在下标记该唾液酸的情况高43％的信号并且是调节至相同pH(但通过添加强碱达到)的相同酸的信号的几乎两倍。类似地，在通过添加盐酸调节至pH 2.8的甘氨酸的存在下对相同唾液酸的DMB标记产生的信号是在乙酸的存在下标记的相同唾液酸样品的信号的123％，表明在本发明的方法和试剂盒中可以使用用强酸调节至适当pH的甘氨酸。

基于这些结果，预期用其他强酸(诸如硝酸、硫酸、三氟乙酸(“TFA”)、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸和氯酸)调节至pH 1.5-3.2的甘氨酸将提供与使用本领域标准乙酸对游离唾液酸的DMB标记相比游离唾液酸的DMB标记的信号强度的类似改善并且将可用于本发明的方法和试剂盒。在一些实施方案中，将甘氨酸溶液的pH调节至一定pH，其优选调节至pH约2至3.2(其中“约”意指±0.25)，在一些中，将其调节至优选约2.5至3的pH(其中“约”意指±0.25)，在一些中，更优选将其调节至pH约2.7至3.2(其中“约”意指±0.2)，在一些中，更优选将其调节至pH 2.7-2.9，再更优选将其调节至pH 2.8±0.5，在一些中，甚至更优选将其调节至pH 2.8±0.2，并且最优选将其调节至pH 2.8的pH。

腐蚀性酸(包括盐酸)可以用于本发明的方法和试剂盒中，但在其使用中需要小心以防止进行标记的人员意外或偶然接触所述酸。

酸的浓度是优选0.25M至约2M，并且关于酸浓度的“约”意指±0.25M。

如技术人员所知，标记反应的pH影响标记反应进行所需的时间。在高于3.2的pH下，标记反应进行得更慢，并且因此需要更长的时间。由于更快地收到结果通常优选于在更长时间段之后收到结果，因此优选标记试剂的pH是3.2或更低。合适的pH范围如上所阐述。在实施例中报道的研究中，所测试的溶液通过以下方式产生：将足够的甘氨酸混合到水中形成3M溶液，并且然后通过添加实施例中提到的一定量的酸来调节甘氨酸溶液的pH直到达到所希望的pH。

甘氨酸是两性的；在水中，甘氨酸具有大约7的pH。从业者不需要以3M溶液开始；在本文讨论的工作过程中进行的一些研究中使用3M溶液，使得当添加其他试剂时，所得混合物将具有在酸性溶液中预先选定的甘氨酸浓度以允许有效地进行DMB标记。从业者可以容易地选择其他起始浓度的甘氨酸以与酸混合，以获得具有所希望的pH和浓度的溶液以用于本发明的方法和试剂盒。

任何特定的酸和任何特定的目的酸浓度(为方便起见，其可以分别称为“测试酸”或“测试浓度”)可以容易地通过两个测试来测试其用于唾液酸的DMB标记的适用性。首先，可以将测试酸或测试浓度添加到3M甘氨酸水溶液中，以确定测试酸或测试浓度是否可以将甘氨酸的pH降低至1.5-3.2。如果不能，则测试酸或测试浓度不适用于本发明的方法和试剂盒。其次，测试酸或测试浓度和1.5M乙酸可以在用BME的平行测定中运行以DMB标记相同量的已知唾液酸，并且比较来自在乙酸的存在下标记的唾液酸的荧光信号与来自在测试酸或测试浓度的存在下标记的唾液酸的荧光信号。如果在测试酸或测试浓度或两者的存在下标记的唾液酸产生的信号比来自在1.5M乙酸的存在下标记的唾液酸的信号高至少10％、优选高20％，则测试酸或测试浓度或两者适用于本发明的方法和试剂盒。

在部分酸水解释放步骤中可以使用用第一酸调节至1.5-3.2之间的pH的甘氨酸。甘氨酸和第一酸的相同组合也可以用于DMB标记步骤，或者DMB标记步骤可以使用用第二酸调节至所希望的pH的甘氨酸。例如，部分酸水解步骤可以用用磷酸(第一酸)调节至所希望的pH的甘氨酸来进行，而可以使用用盐酸(第二酸)调节至所希望的pH的甘氨酸进行DMB标记步骤。然而，预期为了方便，从业者通常将避免配制两种不同的酸溶液，而是将选择一种酸来用于调节甘氨酸溶液的pH，配制所希望的pH的甘氨酸溶液/酸混合物，并且在两个步骤中使用该混合物的等分试样。如实施例所报道，使用用酸调节至pH 2.8的甘氨酸溶液进行酸水解，并且然后与含有用相同酸缓冲至相同pH的甘氨酸的标记溶液混合以进行标记步骤。

在一些实施方案中，一种酸可以用于酸水解步骤，并且另一种酸可以用于将甘氨酸溶液的pH调节至所希望的pH。例如，(a)乙酸可以用于通过酸水解释放唾液酸，并且在所述步骤中甘氨酸磷酸盐溶液用于用DMB标记通过酸水解释放的唾液酸，(b)盐酸可以用于通过酸水解释放唾液酸，而甘氨酸磷酸盐溶液用于提供用DMB标记释放的唾液酸所需的酸性条件，或(c)磷酸可以用于通过酸水解释放唾液酸，而甘氨酸盐酸盐溶液可以用于提供用DMB标记释放的唾液酸所需的酸性条件。

用唾液酸酶从糖缀合物中释放唾液酸

作为从目的糖缀合物中释放唾液酸的替代方案，唾液酸可以通过酶消化来释放。如Juge等人,Biochem Soc Trans.,2016,44(1):166-175:“Sialidases(also commonlyreferred to as neuraminidases)are a large group of enzymes,the majority ofwhich are exo-sialidases catalysing the cleavage of terminal sialic acidsfrom complex carbohydrates on glycoproteins or glycolipids”所陈述。许多唾液酸酶是已知的，并且许多是可商购的。例如，MilliporeSigma(密苏里州圣路易斯)出售多种具有不同特异性的唾液酸酶，所述唾液酸酶最初是从许多微生物中分离出的，所述微生物包括产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)。

一旦从业者选择了将释放目的唾液酸的唾液酸酶并且进行了糖缀合物的去唾液酸化，就可以通过以下方式标记从糖缀合物释放的唾液酸：将样品等分到容器中，向其中添加DMB、缓冲液或酸和还原剂，并且如本公开文本其他地方所述将其标记。分离和分析DMB标记的唾液酸

在与DMB和标记试剂一起孵育后，典型地通过用过量的水稀释染料来终止标记反应。然后典型地通过液相色谱法诸如高效液相色谱法(“HPLC”)或“超高效液相色谱法”分离用DMB标记的唾液酸。然后通常通过荧光检测器检测分离的DMB标记的唾液酸。在一些实施方案中，可以分离标记的唾液酸并且然后通过检测DMB标记的存在进行分析。在一些实施方案中，通过荧光检测器诸如Agilent 1260Infinity II荧光检测器(AgilentTechnologies，加利福尼亚州圣克拉拉)进行检测。可以使用373nm的激发频率和448nm的发射频率检测DMB。在一些实施方案中，通过使用紫外(“UV”)检测器进行检测。

试剂盒

在一些实施方案中，本发明进一步提供了用于从糖缀合物释放唾液酸以及用于唾液酸(无论所述唾液酸是从糖缀合物中释放的还是游离唾液酸，诸如在测定中可以作为分析和定量标准的单独提供的已知唾液酸)的DMB标记的试剂盒。

所述试剂盒优选含有选择的酸、甘氨酸、调节甘氨酸在溶液中时的pH的酸、DMB和一种或多种选择的还原剂。在一些实施方案中，可以在预先混合的溶液中提供甘氨酸和酸，以提供处于所希望的pH和浓度的甘氨酸。在一些实施方案中，所述酸是磷酸。在一些实施方案中，所述酸是盐酸。所述试剂盒中的试剂典型地提供在一个或多个容器中。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有pH在1.5-3.2之间的甘氨酸磷酸盐或pH在1.5-3.2之间、更优选2-3、仍更优选2.8±0.1的甘氨酸盐酸盐，用于糖缀合物的部分酸水解。在一些实施方案中，甘氨酸磷酸盐或甘氨酸盐酸盐以3M提供在10μl的等分量中。在一些实施方案中，所述试剂盒含有一种或多种唾液酸酶，用于通过酶消化从糖缀合物中释放唾液酸。

在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于标记游离唾液酸的DMB标记混合物。所述DMB标记混合物优选包含DMB；通过酸调节至在1-3.2之间、更优选2-3、仍更优选2.8±0.1的pH的甘氨酸；以及一种或多种还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂是BME。在一些实施方案中，所述还原剂是硫代甘油。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含连二亚硫酸钠。

在一些实施方案中，所述DMB标记混合物包含0.3M甘氨酸磷酸盐pH 2.8、0.72摩尔硫代甘油、20毫摩尔DMB和225毫摩尔连二亚硫酸钠。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以含有DMB标记混合物的10μl等分试样，所述DMB标记混合物含有0.3M甘氨酸磷酸盐pH 2.8、0.72摩尔硫代甘油、20毫摩尔DMB和225毫摩尔连二亚硫酸钠。

实施例

实施例1

本实施例阐述了测试不同的酸和还原剂配制品的对来自在其存在下用DMB标记的唾液酸的信号的影响的方案。

在每个标记测试中分析了一千皮摩尔Neu5Ac(USP)。对每组标记条件进行四次重复分析。将每个反应(每个反应40微升)在密封容器中在50℃下孵育3小时，并且然后用去离子水稀释至200微升。使用Agilent Poroshell 120EC-C18柱(2.1毫米直径x 75毫米长度，2.7微米粒度)通过HPLC分析五微升每个稀释的样品。用于HPLC的流动相是在水中的4％甲醇和8％乙腈，流速为0.4毫升/分钟。

实施例2

本实施例阐述了不同的酸和还原剂的一些组合，其中在本说明书中体现的工作过程中，将唾液酸用DMB标记。

“乙酸巯基乙醇”：1.5摩尔乙酸(CAS 64-19-7)、0.75摩尔β-巯基乙醇(“BME”CAS60-24-2)、14毫摩尔连二亚硫酸钠(CAS7575-14-6)、7毫摩尔DMB(CAS81864-15-5)。

“磷酸钠pH 2.8巯基乙醇”：1.5摩尔磷酸钠pH 2.8、0.75摩尔β-巯基乙醇、14毫摩尔连二亚硫酸钠、7毫摩尔DMB。通过将磷酸用氢氧化钠调节至pH 2.8来制备3摩尔(2x强度)的磷酸钠。

“甘氨酸磷酸盐pH 2.8巯基乙醇”：1.5摩尔甘氨酸磷酸盐pH 2.8、0.75摩尔β-巯基乙醇、14毫摩尔连二亚硫酸钠、7毫摩尔DMB。通过将甘氨酸用磷酸调节至pH 2.8来制备3摩尔(2x强度)的甘氨酸磷酸盐。

“甘氨酸磷酸盐pH 2.8硫代甘油”：1.5摩尔甘氨酸磷酸盐pH 2.8、0.75摩尔硫代甘油(CAS 96-27-5)、14毫摩尔连二亚硫酸钠、7毫摩尔DMB。通过将甘氨酸用磷酸调节至pH2.8来制备3摩尔(2x强度)的甘氨酸磷酸盐。

“甘氨酸HCl pH 2.8巯基乙醇”：1.5摩尔甘氨酸盐酸盐pH 2.8、0.75摩尔β-巯基乙醇、14毫摩尔连二亚硫酸钠、7毫摩尔DMB。通过将甘氨酸用盐酸调节至pH 2.8来制备3摩尔(2x强度)的甘氨酸盐酸盐。

“甘氨酸HCl pH 2.8硫代甘油”：1.5摩尔甘氨酸HCl pH 2.8、0.75摩尔硫代甘油(CAS 96-27-5)、14毫摩尔连二亚硫酸钠、7毫摩尔DMB。通过将甘氨酸用盐酸调节至pH 2.8来制备3摩尔(2x强度)的甘氨酸盐酸盐。

实施例3

本实施例报告了遵循实施例1中所述方案测试实施例2中所述的试剂组合的研究结果。研究结果如图1中以图形方式所示。实施例2中引号中的术语对应于在图1中的条的图中表示不同配制品的方式。

来自在乙酸、BME和连二亚硫酸钠的存在下用DMB标记的Neu5Ac的样品的信号示出在左侧起第一个条中(“乙酸/BME信号”)。由于标准标记方案使用乙酸为标记提供酸性条件并且使用BME作为还原剂，因此将此配制品提供的信号用作比较基础。为易于比较，将来自此标记样品的信号设为100％，并且来自在其他测试条件下标记的样品的信号陈述为占来自第一个条中所示信号的百分比。

如左起第二个条所示，在磷酸钠pH 2.8巯基乙醇配制品的存在下标记的类似Neu5Ac样品产生的信号是乙酸/BME信号的仅74％。相比之下，如左起第三个条所示，在甘氨酸磷酸盐pH 2.8巯基乙醇配制品的存在下标记的类似Neu5Ac样品产生的信号是来自标准乙酸/BME配制品的信号的143％。从在甘氨酸磷酸盐pH 2.8硫代甘油配制品的存在下标记的样品中看到甚至更好的信号。在甘氨酸磷酸盐pH 2.8巯基乙醇配制品中将酸切换为盐酸产生的信号是乙酸/BME信号的123％，如左起第五个条所示。而且，如左起最后一个条所示，在甘氨酸磷酸盐pH 2.8硫代甘油配制品中，将此配制品中的还原剂切换为硫代甘油又导致信号是乙酸/BME信号的123％。

实施例4

本实施例描述了从示例性目的糖蛋白中释放唾液酸，使用两种不同的酸用DMB标记，并且然后分析以查看酸的改变对DMB标记的唾液酸的荧光信号的影响的方案。

将治疗上重要的嵌合抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗用作目的糖缀合物，从其中获得唾液酸用于分析。每个反应分析二百微克利妥昔单抗。在“酸释放”步骤中，将利妥昔单抗在下述一种酸性条件中在80°摄氏度下孵育2小时。然后，此步骤之后是“DMB标记”步骤，其中在使用相应DMB标记混合物的密封容器中将在样品所经受的酸释放步骤中从利妥昔单抗释放的唾液酸在50°摄氏度下孵育3小时。DMB标记步骤之后是“分析”步骤，其中将每个样品用去离子水稀释至200微升。使用Agilent Poroshell 120EC-C18柱(2.1毫米直径x 75毫米长度，2.7微米粒度)通过HPLC分析五微升每个稀释的样品。用于HPLC的流动相是在水中的4％甲醇和8％乙腈，流速为0.4毫升/分钟。

“乙酸巯基乙醇”：

酸释放步骤：将每个利妥昔单抗样品与2摩尔乙酸在80°摄氏度下孵育2小时。

DMB标记步骤：向每个样品中添加1.5摩尔乙酸、0.75摩尔β-巯基乙醇、14毫摩尔连二亚硫酸钠和7毫摩尔DMB。

“甘氨酸磷酸盐pH 2.8巯基乙醇”：

酸释放：将每个样品与1摩尔甘氨酸磷酸盐pH 2.8在80°摄氏度下孵育2小时。

DMB标记：0.75摩尔甘氨酸磷酸盐pH 2.8、0.75摩尔β-巯基乙醇、14毫摩尔连二亚硫酸钠、7毫摩尔DMB。通过将甘氨酸用磷酸调节至pH 2.8来制备3摩尔(2x强度)的甘氨酸磷酸盐。

实施例5

本实施例阐述了实施例4中所述的研究结果。

图2是色谱图，其以图形方式示出了在含有乙酸和BME的标准缓冲溶液中释放和标记(与本文报道的其他标记溶液一样，还存在连二亚硫酸钠)，在HPLC柱上分离，并且流过荧光检测器并且被荧光检测器检测的唾液酸的从荧光检测器出来的信号的迹线。图的Y轴绘制相对响应(以％为单位)，并且图的X轴绘制当样品的组分流过荧光检测器时以分钟为单位的保留时间。在此色谱图中，最高峰示出了几乎57.5的值，反映了样品中存在唾液酸Neu5Ac，保留时间为大约1.85分钟与2.15分钟之间。测量值几乎为25或是唾液酸Neu5Ac峰的大约43％的第二大峰出现在从0.5分钟至0.6分钟的保留时间处。然而，此峰是伪影，因为在该时间没有唾液酸从HPLC柱出来。在保留时间1.5分钟时，看到测量值约4的较小峰。此峰代表唾液酸Neu5Gc，并且是伪影峰高度的大约16％。

图3示出了含有唾液酸的相同样品的色谱图，但所述唾液酸是在甘氨酸磷酸盐提供酸性条件的标记溶液中标记的。BME又用作还原剂(如在本文报道的其他研究中，标记溶液中还存在连二亚硫酸钠)。轴如图2所述。在此色谱图中，唾液酸Neu5Ac的峰示出了几乎95的值。反映伪影的在从0.5至0.6的保留时间处的峰具有Neu5Ac峰的高度的大约13％或大约14％的高度，而在图2中，伪影峰是Neu5Ac峰的43％。代表唾液酸Neu5Gc峰的在保留时间1.5分钟处看到的较小峰又是约4，但现为伪影峰高度的大约31％，而在图2中，此唾液酸的峰是伪影峰高度的仅16％。因此，酸的改变令人惊讶地减少了在DMB标记的唾液酸的荧光检测中看到的伪影，并且与伪影相比，使得辨别唾液酸的存在容易得多。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据它们进行的各种修改或改变将为本领域技术人员知晓，并且应包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有公开案、专利和专利申请出于所有目的通过引用以其整体特此并入。

Claims (82)

1.一种用于用1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)标记游离唾液酸以及任选地用于分析所述DMB标记的唾液酸的体外方法，所述方法包括步骤(a)将所述游离唾液酸与在水溶液中的有效量DMB在足以允许所述标记的时间和温度下一起孵育，从而使所述游离唾液酸被DMB标记，所述水溶液包含(i)甘氨酸和酸的水溶液，其中所述甘氨酸以0.25M至3M的摩尔浓度存在并且所述溶液具有1.5-3.2的pH，和(ii)选自硫代甘油和β-巯基乙醇(“BME”)的还原剂。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步其中所述溶液包含连二亚硫酸钠。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是磷酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是盐酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.25M至2.5M±0.25M。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.25M至2.0M±0.25M。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.40M至1.75M±0.25M。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.4M至1.5M±0.25M。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.4M至1.25M±0.25M。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.5M至1M±0.25M。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.5M至0.9M。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是从0.6M至0.8M±0.1M。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是0.75M±0.1M。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸的所述摩尔浓度是0.75M±0.05M。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有2至3.2的pH。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有2.5±0.1至3的pH。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有2.7±0.25至2.9±0.25的pH。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有2.8±0.25的pH。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是磷酸。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是盐酸。

21.根据权利要求1所述的方法，其中足以标记所述游离唾液酸的所述时间是1-6小时。

22.根据权利要求1所述的方法，其中足以标记所述游离唾液酸的所述时间是2-5小时。

23.根据权利要求1所述的方法，其中足以标记所述游离唾液酸的所述时间是3小时±30分钟。

24.根据权利要求1所述的方法，其中足以标记所述游离唾液酸的所述时间是2.5小时±30分钟。

25.根据权利要求1所述的方法，其中足以标记所述游离唾液酸的所述温度是35℃-65℃。

26.根据权利要求1所述的方法，其中足以标记所述游离唾液酸的所述温度是50℃±5℃。

27.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括步骤(b)，分离所述游离的DMB标记的唾液酸。

28.根据权利要求27所述的方法，其中通过使所述游离的DMB标记的唾液酸经受液相色谱法进行所述游离的DMB标记的唾液酸的所述分离。

29.根据权利要求28所述的方法，所述方法进一步包括步骤(c)，通过将所述游离的分离的DMB标记的唾液酸提供至分析装置来分析所述游离的分离的DMB标记的唾液酸。

30.根据权利要求29所述的方法，进一步其中所述分析装置是荧光检测器。

31.根据权利要求29所述的方法，进一步其中所述分析装置是UV检测器。

32.一种释放、标记和任选地分析存在于糖缀合物上的唾液酸的方法，所述方法包括

(a)使希望体积的所述糖缀合物与包含甘氨酸的第一水溶液接触，所述甘氨酸用酸调节至1.5-3.2的pH，

(b)将所述糖缀合物与所述第一水溶液在足以从所述糖缀合物中释放所述唾液酸的时间和温度下一起孵育，从而从所述糖缀合物中释放所述唾液酸，

(c)将在所述第一水溶液中的所述释放的唾液酸冷却至50℃±10°的温度，

(d)使所述释放的唾液酸与溶液接触，从而形成样品/标记混合物，所述溶液由以下组成：(i)有效量的1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)，(ii)包含甘氨酸的第二水溶液，其中所述溶液的pH用酸调节至1.5-3的pH，和(iii)有效量的一种或多种还原剂，以及

(e)将所述样品/标记混合物在足以标记所述混合物中的所述释放的唾液酸的时间和温度下孵育，

从而使所述释放的唾液酸被DMB。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述糖缀合物是糖蛋白。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述糖缀合物是糖脂或寡糖。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至1.5-3.2的pH。

36.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至2-3的pH。

37.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至2.5-3的pH。

38.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至2.8±0.1的pH。

39.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至1.5-3.2的pH。

40.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至2-3的pH。

41.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至2.5-3的pH。

42.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二水溶液是从0.25至2.0M的甘氨酸并且用酸调节至2.8±0.1的pH。

43.根据权利要求32所述的方法，其中在所述第一水溶液中的所述酸是磷酸。

44.根据权利要求32所述的方法，其中在所述第二水溶液中的所述酸是磷酸。

45.根据权利要求32所述的方法，其中在所述第一水溶液和所述第二水溶液中调节所述溶液的pH的所述酸是磷酸。

46.根据权利要求32所述的方法，其中在所述第一水溶液中的所述酸是盐酸。

47.根据权利要求32所述的方法，其中在所述第二水溶液中调节所述溶液的pH的所述酸是盐酸。

48.根据权利要求32所述的方法，其中在所述第一水溶液和所述第二水溶液中的所述酸是盐酸。

49.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种还原剂包括BME。

50.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种还原剂包括硫代甘油。

51.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种还原剂包括BME和连二亚硫酸钠。

52.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种还原剂包括硫代甘油和连二亚硫酸钠。

53.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)中足以释放所述唾液酸的所述时间是0.5-5小时。

54.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)中足以释放所述唾液酸的所述时间是1.0-4小时。

55.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)中足以释放所述唾液酸的所述时间是2小时±30分钟。

56.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)中足以释放所述唾液酸的所述温度是70℃-100℃。

57.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)中足以释放所述唾液酸的所述温度是70℃-90℃。

58.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)中足以释放所述唾液酸的所述温度是80℃±5℃。

59.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(e)中足以标记所述释放的唾液酸的所述时间是1-6小时。

60.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(e)中足以标记所述释放的唾液酸的所述时间是2-5小时。

61.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(e)中足以标记所述释放的唾液酸的所述时间是3小时±30分钟。

62.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(e)中足以标记所述释放的唾液酸的所述时间是2小时±30分钟。

63.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(e)中足以标记所述释放的唾液酸的所述温度是35℃-65℃。

64.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(e)中足以标记所述释放的唾液酸的所述温度是50℃±5℃。

65.根据权利要求32所述的方法，所述方法进一步包括步骤(f)，分离所述释放的DMB标记的唾液酸。

66.根据权利要求62所述的方法，其中通过使所述释放的DMB标记的唾液酸经受液相色谱法进行所述游离的DMB标记的唾液酸的所述分离。

67.根据权利要求63所述的方法，所述方法进一步包括步骤(g)，通过将所述释放的分离的DMB标记的唾液酸提供至分析装置来分析所述游离的分离的DMB标记的唾液酸。

68.根据权利要求64所述的方法，进一步其中所述分析装置是荧光检测器。

69.一种用于用1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(“DMB”)标记游离唾液酸的试剂盒，所述试剂盒包含(a)DMB，(b)甘氨酸，(c)酸，和(d)还原剂。

70.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述酸是磷酸。

71.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述酸是盐酸。

72.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述甘氨酸在含所述酸的溶液中。

73.根据权利要求72所述的试剂盒，其中包含与所述酸混合的所述甘氨酸的所述溶液具有在2与3之间的pH。

74.根据权利要求69所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含连二亚硫酸钠。

75.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述还原剂是β-巯基乙醇(“BME”)。

76.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述还原剂是硫代甘油。

77.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述酸是盐酸并且所述还原剂是硫代甘油。

78.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述酸是磷酸并且所述还原剂是硫代甘油。

79.根据权利要求69所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种或多种唾液酸标准品。

80.根据权利要求69所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种或多种唾液酸酶。

81.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含(a)在溶液中的甘氨酸，所述溶液的pH用磷酸调节至2.8的pH，(b)硫代甘油，(c)DMB，和(d)连二亚硫酸钠。

82.根据权利要求81所述的试剂盒，进一步其中所述硫代甘油以0.72摩尔±0.1摩尔提供，所述DMB以5毫摩尔±1毫摩尔提供，并且所述连二亚硫酸钠以56毫摩尔±10毫摩尔提供。

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