CN102422161A - 利用糖蛋白的糖基化的癌症诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用含有参与癌症发展的糖蛋白糖基化信息的肽的癌症诊断方法。更具体地，本发明涉及一种癌症诊断方法，其通过使用酶的水解过程从参与癌症发展的糖蛋白中获得肽，从由此得到的肽中定量检测受蛋白糖基化影响并在水解过程中显示出特异定量改变的糖基化相关特异肽，从而选择根据癌症发展显示出特异定量改变的糖基化相关特异肽。本发明的癌症诊断方法使用所选的糖基化相关特异肽作为标记物。

Description

利用糖蛋白的糖基化的癌症诊断方法
发明领域
本发明涉及一种选择含有参与癌症发展的相关糖蛋白糖基化信息的多肽的选择方法，以及一种使用所选的多肽进行癌症诊断的癌症诊断方法。
相关技术的描述
蛋白质是一种参与生物体中持续进行的各项生命保障活动的重要成分。因此，关于内源性蛋白的功能和鉴定的研究，对理解此类参与关键活动的蛋白、并基于理解此类蛋白的功能而进一步建立疾病早期诊断及治疗的方法是非常重要的。
蛋白质在生命保障活动中发挥着重要的作用，一旦需要，蛋白质将经由信号转导进行翻译后修饰。最具代表性的翻译后修饰过程是糖基化和磷酸化。特别是对于糖蛋白的糖基化，许多存在于细胞膜表面的单糖经信号转导穿过细胞膜，导致所需蛋白质被N-乙酰葡糖胺基转移酶糖基化。这些糖蛋白由于位于外膜上，发挥具有重要作用。一旦糖蛋白完成其既定使命所需作用，它们将经糖苷酶作用进入糖酵解。然而，多数一些位于细胞膜表面的糖蛋白或糖脂通常会在特殊信号，如致癌基因等的引导作用下被异常糖基化。现已知许多一些疾病与糖苷酶及糖基转移酶的此类异常功能密切相关，而这些异常功能是由致癌基因导致的异常信号转导引起的(Kim，Y.J.等人；Glycoconj.J.，1997，14，569-576.；Hakomori，S.，Adv.Cancer Res.，1989，52，257-331.；Hakomori，S.，Cancer Res.，1996，56，5309-5318)。
蛋白糖基化大致可分为两种类型：一种是N-连接糖基化，其特征在于在蛋白合成过程中，通过特定序苷列组合中(NXS/T，X是除脯氨酸外的氨基酸)的天冬酰胺的侧链进行糖基化；另一种是O-连接糖基化，其特征在于通过形成氨基酸如丝氨酸、苏氨酸等侧链的羟基进行糖基化。广泛见于糖蛋白中的是聚糖，如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、海藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlucNAc)、及N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)。(Frank Kjeldsen等人，Anal.Chem.2003，75，2355-2361)。糖基化蛋白的功能，如折叠、识别、和溶解度等，受到糖多样性的调节(Varki，A等人，Glycobiology 1993，3，97-130.；Parodi，A.J.等人，Annu.Rev.Biochem.2000，69，69-93)。
从正常组和病患组获得的蛋白样品的糖基化差异可以是区分病患组和正常组的一个重要线索。迄今为止，报道了一些分析方法可以辨别糖蛋白的差异。蛋白质图谱就是筛查蛋白质糖基化差异的方法的实例，该方法通过使用质谱仪分析糖蛋白水解得到的聚糖(Cooke C.L.等人，Anal.Chem.，2007，79，8090-8097)。然而，此方法的缺点是丢失了糖基化亚型上关于各蛋白质特定糖基化位点上的糖基化特征及糖基化结构特征的信息，因为此方法只能分析聚糖的平均状态，而所述聚糖的平均状态由来源于和合并自不同蛋白和糖基化位点的所有种类的聚糖组成。基于整体图谱的不同，此常规方法可以区分正常人与患者，但是由于糖蛋白、糖基化位点、及糖基化亚型等的信息的丢失，它能提供的信息有限。
在另一方法中，可以富集具有高分子量的完整糖蛋白。为进行富集，可用多种凝集素，包括ConA(甘露糖)、WGA(N-乙酰葡糖胺)、榴莲凝集素(Jacalin)(半乳糖)、SNA(sailic acid)、AAL(海藻糖)或通过混合各种凝集素制备的多凝集素(Yang，Z.等人，J.Chromatogr，A，2004，1053，79-88.；Wang，Y.等人，Glycobiology，2006，16，514-523)。也可使用称为聚糖捕捉器的酰肼(Zhang H.等人，Nat.Biotechnol.，2003，21，660～666)。这些方法不仅可用于富集糖蛋白，也可用于富集糖肽。为了提高定量分析的可靠性，定量分析中可以使用其中糖已经被所需方法分离的多种糖蛋白的水解得到的肽，或者使用同位素标记的试剂(Tian Y.等人，Nat.Protocols，2007，2，334-339)。但是这种方法仍无法区分具有不同糖基化结构的不同聚糖亚型。
血浆蛋白质组由至少50000种成分构成，其中蛋白质成分的丰度非常动态化(1～1012)。所以，以极低浓度存在的候选蛋白生物标记物很难用液相色谱-质谱联用法检测(LC/MS/MS)并进行定量分析(Anderson N.L.等人，Mol.Cell Proteomics.2002，1，845-867)。为了使样品复杂度降到最低从而有效检测血清中的疾病生物标记物，首先用蛋白去除柱(如MARS，多重亲和去除系统)清除占血浆蛋白质组约90％或以上的高丰度蛋白质，如白蛋白、IgG、IgA、铁传递蛋白、及结合珠蛋白，然后使用所得的蛋白质组。或者，也可使用未经此清除过程的蛋白质组。但是一般清除占血清的90％的蛋白来制备目标蛋白质组。为了得到糖蛋白，仅用多凝集素富集糖蛋白，而不使用大量蛋白去除柱；或者可以逐步使用大量蛋白去除柱和多凝集素。还可以使用其他大量蛋白去除柱或者具有相应组成的凝集素。从而，制得的血浆蛋白质组进行经丙酮沉淀或MWCO(分子量截留)法的纯化过程，以清除糖蛋白收集过程中使用的盐。
可以用质谱仪分析这些高分子量的蛋白或肽。质谱仪有三个不同的功能部件，即离子化器、分析器、和检测器。样品在离子化部件中被离子化。随后经离子化的样品在分析器中根据质荷比被分离。在检测器中检测被分离的离子。主要有两种温和的离子化方法用于离子化高分子量蛋白或肽。一种是ESI(电喷雾离子化)，与常规离子化法相比，能够在不破坏连接的情况下检测高分子量的生物分子。另一种方法是MALDI(基质辅助激光解吸离子化)。在ESI法中，可以通过结合HPLC或毛细管型电泳法作为样品的预处理过程，而降低样品的复杂度，从而减少盐或杂质的不期望的影响。质谱仪的分析器部件包括IT-LIT(离子阱-线性离子阱)、Q-Q-TOF(四极-四极-飞行时间)、TOF-TOF(飞行时间-飞行时间)、FT-ICR(傅立叶变换离子回旋共振)、Q-Q-Q(四极-四极-四极)、QQ-LIT(四极-四极-离子阱-线性离子阱)、和LIT-轨道阱(线性离子阱-轨道阱)等。总之，优选有助于鉴定片段化肽的单一型或混合型。
内源性的高分子量蛋白质先经过上述样品处理过程断裂成肽，然后用质谱仪分析。之后使用例如下述的搜索引擎进行鉴定：SEQUEST(http://www.thermo.com)、MASCOT(http://www.matrixscience.com)、蛋白表达系统(http://www.waters.com)、X！tandem(http://proteome.ca/opensource.html)、peptideProphet(http://www.proteomecenter.org/software.php)、和OMSSA(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)。样品肽的质量分析结果用电脑数据库中保存的所有序列进行筛查，然后通过运用上述搜索引擎中使用的算法、并考虑蛋白消化规律，而预测假想片段的质量和形态。之后对比预测结果和实验结果。两个结果之间的一致程度以概率表示，依据概率鉴定目标蛋白质。要用质谱法鉴定蛋白质，则该目标蛋白的序列需已经保存在数据库中。这些蛋白序列数据库由Swiss-Prot、TrEMBL(欧洲分子生物学翻译实验室)、UniProt(通用蛋白资源)、NCBI(美国国家生物技术信息中心)、IPI(国际蛋白质索引)等提供(Diamond1 D.L.等人，Hepatology 2006，44，229-308)。
用稳定的同位素进行蛋白标记是用质谱仪定量分析鉴定出的蛋白质的方法之一。例如，最具代表性的标记包括ICAT(同位素编码亲和标签)、ICPL(同位素编码蛋白质标签，所述方法为：培养基中的氮源被15N同位素取代而生成的蛋白质用质谱仪进行分析)、以及SILAC(细胞培养中稳定同位素氨基酸标记，其中向培养基中加入稳定同位素氨基酸，从而在细胞培养过程中将其引入表达的蛋白质中)。还可以使用标记蛋白水解产生的肽的方法，iTRAQ(用于相对和绝对定量的同重标签)，以及仅用同位素取代糖蛋白或经水解的糖肽的方法(Tian Y.等人，Nat.Protocols，2007，2，334-339)。
此外，可以使用无标记方法，其基于通过重复实验确定的可靠肽比较正常组与病患组，该重复实验不对肽或蛋白质进行标记，也不用测定液相色谱的保留时间，而用质谱仪测定精确分子量(Silva J.C.等人，Anal.Chem.2005，77，2187-2200；Finney G.L.等人，Anal.Chem.2008，80，961-971)。当样品中以痕量存在的蛋白质被选定为筛选候选生物标记物时，使用显示具有良好选择性和敏感性的MRM(多反应监测)。MRM通过两种不同方式进行：一种是无标记的比较定量分析；另一种是绝对定量分析，其特征在于事先注入稳定同位素标记的肽标准物。为了更有效的进行MRM，需考虑的重要因素是，选择只在目标蛋白中检测到的肽，以及通过使用特殊程序和数据库如TIQAM(用于通过MRM进行定量分析的目标识别)确定相应蛋白质的MRM检测通道(Anderson L等人，Mol.Cell Proteomics.2006，5，573-588)。
使用SISCAPA(抗肽抗体提取的稳定同位素标准物)的免疫亲和-MS是进行下述的方法：大规模获取代表筛得的候选生物标记蛋白的肽，构建识别所述筛得的肽的抗体，使用所述抗体从混合肽中分离出目标肽，并且通过MRM使样品复杂度最小化从而分析所述目标。该方法能提高LC/MS/MS法的LOD(检测极限)和LOQ(定性极限)。因此，该方法具有极好的LOD和LOQ且不具有肽选择性，可以取代常规方法如ELISA(酶联免疫吸附试验)及蛋白质印迹(Anderson NL等人，J Proteome Res.2004.3，235-244.)。通过使用抗体选择性分离并富集的抗原肽可以与抗体缀合，使用MALDI质谱仪通过免疫-MALDI-MS(iMALDI MS)进行分析。
本发明人研究开发了一种区分正常组与肝癌患者组蛋白糖基化差异的新方法。结果，本发明人证明当糖蛋白被糖基化时，特异肽的水解效率受到空间位阻效应影响，此空间位阻效应是由占据巨大空间的糖链引起的，根据糖基化程度和周围糖链的结构而改变所得肽的水平。本发明人还证明了，由糖蛋白水解产生的并参与糖基化的此类特异肽可用于通过定量质谱诊断癌症，因而此类肽可用作癌症诊断标记物，从而完成了本发明。
发明概述
本发明的目的是提供一种选择用于癌症诊断的糖基化相关特异肽的方法，所述方法通过利用特异肽的水解过程根据参与癌症发展的糖蛋白的糖链的改变而改变的这一特殊现象；还提供了一种使用所选的特异肽的癌症诊断方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，通过利用下述特殊现象选择糖基化相关肽：当用水解酶将从癌症患者样品中分离/纯化的蛋白质水解成肽时，水解的肽的量根据糖蛋白的糖链的改变而定量且特异地改变。
本发明还提供了一种癌症诊断方法，其特征在于，当用水解酶将从受试者样品中分离/纯化的蛋白质水解成肽时，而糖基化相关肽中的水解的肽的量根据糖蛋白的糖链的改变而定量且特异地改变时，确定具有所述糖基化相关肽的受试者是否具有癌症高风险。
本发明还提供了一种用于癌症的诊断试剂盒，其包括与选自下述的一种或多种糖基化相关肽特异结合的抗体：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的蜂毒明肽afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
本发明还提供了一种用于癌症诊断的生物芯片，所述生物芯片上抗体整合在固体基质上，所述抗体与选自下述的一种或多种糖基化相关肽特异结合：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的蜂毒明肽afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
本发明还提供了一种与选自下述的任意肽特异结合的抗体在制备癌症诊断试剂盒中的用途：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的蜂毒明肽afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
另外，本发明提供了一种生物分子在制备用于癌症诊断的生物芯片中的用途，所述生物分子可以从受试者的血液样品中获得，并且与选自下述的一种或多种肽的组合特异结合：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的蜂毒明肽afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
有益作用
如上文所述，本发明有利于经定量分析特异肽从而进行癌症的快速早期诊断，所述特异肽获得自受试者的样品，含有关于糖基化水平和糖链结构的蛋白异常糖基化的信息，并且所选的特异肽可有效用于癌症诊断的标记物。
附图简述
图1的示意图说明肽片段的LC/MS/MS过程，所述肽片段是用胰蛋白酶消化源自正常组和病患组血浆的蛋白质组而得到的。
图2的图说明用LC/MS/MS定量分析正常组和病患组全部多肽的PCA(主成份分析)统计结果。
图3的图说明与区分正常组和病患组的特异性密切相关的4种选出的特异肽的PCA(主成份分析)统计结果。
图4是一组图，其说明与区分正常组和病患组的特异性密切相关的4种选出的特异肽的ROC(接受者操作特征曲线)。
图5的示意图说明与区分正常组和病患组的特异性密切相关的该4种选出的特异肽是与N-连接糖基化密切相关的肽，也说明糖蛋白水解效率取决于糖基化。
优选实施方式的描述
下文将对本发明进行详细描述。
本发明提供了一种癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，通过利用下述特殊现象选择糖基化相关肽：当用水解酶将从癌症患者样品中分离/纯化的蛋白质水解成肽时，水解的肽的量根据糖蛋白的糖链的改变而定量且特异地改变。
本发明中，糖蛋白中糖链的改变表明在癌症患者或有癌症病史的那些人中示出的蛋白糖基化的不同方面。这些改变可以发生在天冬酰胺、苏氨酸、或丝氨酸位点上，且包括各位点的糖基化水平或糖链结构中的任何改变。
本发明中，癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。认为癌症是通过异常信号传递和异常识别发展的。而所述异常多数源于细胞表面存在的或由细胞表面分泌的糖蛋白。
本发明中，鉴于细胞系、细胞区域、器官组织、药物施用、饮食习惯、营养状况、和病情发展等，可以制备本文所用的糖蛋白或肽并用作用于癌症诊断的样品。
糖蛋白的糖基化位点占据着相当巨大的空间位置，会影响相邻特异肽的水解效率。因此，糖基化位点不同或改变会影响水解产生的特异肽的量。与正常样品不同，癌症样品显现出异常的糖基化，如非必要的糖基化或者由异常信号传递、识别、或粘附引起的改变的糖基化。所述蛋白的异常糖基化导致蛋白质水解不同，这可用特异选择的肽进行定量分析来证明，因而区别癌症患者血液样品和正常血液样品。
具体地，癌症诊断标记物的筛选方法优选包括以下步骤，但不总是限于此：
1)从获自癌症患者的样品中分离总蛋白质；
2)通过使用大量蛋白去除柱纯化经分离的总蛋白质；
3)通过使用水解酶处理经纯化的蛋白质而制备水解的肽片段混合物；
4)定量分析水解的肽片段混合物；
5)筛选与对照组相比显示出量的显著改变的那些肽；以及
6)确认所选的显示出量的显著改变的肽是否源于糖蛋白。
上述方法中，步骤1)中所述的癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。
上述方法中，步骤1)中所述的样品优选血液样品，因为血液含有所有不同器官分泌的各种蛋白质。本文所述的样品不仅可以是血液，也可以是血浆、血清、唾液、尿液、脑脊液、卵泡液、乳汁、晶状体液、和胰液，这些都可以是用于使用糖蛋白相关肽进行癌症诊断的良好样品。
上述方法中，步骤1)中所述的蛋白质不受其大小限制，且可以是寡肽、多肽或者蛋白质。
上述方法中，由于从样品中分离的蛋白质组的蛋白成分的密度非常动态化，使得难以检测候选生物标记蛋白并进行定量分析，因此通过使用大量蛋白去除柱(如MARS，多重亲和去除系统)进行步骤2)所述的纯化，从而使样品的复杂度最小化；但不总是限于此。
难以在蛋白质水平上分析从样品中获得的蛋白质。为了分析蛋白质，需要将其进行水解。为此，可以进行预处理，例如变性、还原、半胱氨酸烷基化、去磷酸化、或去糖基化。
蛋白质的分离/纯化优选通过1D-凝胶蛋白分离、2D-PAGE、SEC(尺寸排阻色谱)、FFE系统(自由流动电泳系统)、或FFF(场流分馏)进行；但不总是限于此。
上述方法中，步骤3)所述的水解酶优选是选自下述的一种或多种酶：Arg-C、Asp-N、Glu-c、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，更优选胰蛋白酶；但不总是限于此。
预处理后，优选通过使用多种水解酶将高分子蛋白质或糖蛋白水解成低分子肽，从而使用质谱仪对其进行分析。
一般而言，为将蛋白质水解成肽片段，主要使用胰蛋白酶，其可以消化赖氨酸和精氨酸之间的酰胺键。然而，根据目的，也可以选择性地或逐步地使用仅消化赖氨酸位点的Lys-C、仅消化精氨酸位点的Arg-C、和仅消化天冬酰胺位点的Asp-N等。
作为预处理的一个步骤，水解的肽片段优选地使用LC上装配的可用于自动清除盐的Zip-Tip或捕获柱进行脱盐，从而清除所有可能导致质谱分析中任何问题的盐。
上述方法中，步骤4)中所述的定量分析优选通过选自下述的方法进行：蛋白芯片分析、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱)、双向电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、蛋白质印迹和ELISA，更优选通过直接与nano-UPLC相连的电喷雾离子化(ESI)进行；但不总是限于此。
为了比较正常组和病患组，定量分析的结果用层次聚类、PCA(主成份分析)等进行统计分析。如有必要，可进行归一化，从而最小化每批分析的差异。
上述方法中，步骤5)中所述的“量的显著改变”是指量的增加或者减少。
上述方法中，步骤6)所述的源自糖蛋白的肽优选具有距离氨基酸序列N-末端或者C-末端处水解位点的8个氨基酸范围内的糖基化位点；但不总是限于此。
糖蛋白的糖基化位点占据着相当巨大的空间位置，会影响邻近特异肽的水解效率。因此，糖基化位点的不同或改变会影响水解产生的特异肽的量。与正常样品不同，癌症样品显现出异常的糖基化，如非必要的糖基化或者由异常信号传递、识别、或粘附引起的改变的糖基化。所述蛋白的异常糖基化导致蛋白质水解不同，这可用特异选择的肽进行定量分析来证明，因而区别癌症患者血液样品和正常血液样品。
本发明还提供了一种癌症诊断方法，其特征在于，当用水解酶将从受试者样品中分离/纯化的蛋白质水解成肽时，而糖基化相关肽中的水解的肽的量根据糖蛋白的糖链的改变而定量且特异地改变时，确定具有所述糖基化相关肽的受试者是否具有癌症高风险。
具体地，所述癌症诊断方法优选包括以下步骤，但不总是不限于此：
1)从获自受试者的样品中分离总蛋白质；
2)通过使用大量蛋白去除柱纯化经分离的总蛋白质；
3)通过使用水解酶处理经纯化的蛋白质而制备水解的肽片段混合物；
4)定量分析水解的肽片段混合物；
5)筛选与对照组相比显示出量的显著改变的那些肽；
6)确认所选的显示出量的显著改变的那些肽是否源于糖蛋白；以及
7)当确认显示出量的显著改变的肽源于糖蛋白时，判断或诊断受试者的癌症或癌症高风险。
上述方法中，所述癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。
上述方法中，步骤1)中所述的样品优选血液样品，因为血液含有所有不同器官所分泌的各种蛋白质。本文所述的样品不仅可以是血液，也可以是血浆、血清、唾液、尿液、脑脊液、卵泡液、乳汁、晶状体液、和胰液，这些都可以是用于使用糖蛋白相关肽进行癌症诊断的良好样品。
上述方法中，步骤1)中所述的蛋白质不受其大小限制，且可以是寡肽、多肽或者蛋白质。
上述方法中，由于从样品中分离的蛋白质组的蛋白成分的密度非常动态化，使得难以检测候选生物标记蛋白质并进行定量分析，因此通过使用大量蛋白去除柱(如MARS，多重亲和去除系统)进行步骤2)所述的纯化，以使样品的复杂度最小化；但不总是限于此。
难以在蛋白质水平上分析从样品中获得的蛋白质。为分析蛋白质，需要将其进行水解。为此，可以进行预处理，例如变性、还原、半胱氨酸烷基化、去磷酸化、或去糖基化。
蛋白质的分离/纯化优选通过1D-凝胶蛋白分离法、2D-PAGE、SEC(尺寸排阻色谱)、FFE系统(自由流动电泳系统)、或FFF(场流分馏)进行；但不总是限于此。
上述方法中，步骤3)所述的水解酶优选是选自下述的一种或多种酶：Arg-C、Asp-N、Glu-c、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，更优选胰蛋白酶；但不总是限于此。
预处理后，优选通过使用多种水解酶将高分子蛋白或糖蛋白水解成低分子肽，从而使用质谱仪对其进行分析。
一般而言，为将蛋白质水解成肽片段，主要使用胰蛋白酶，其可以消化赖氨酸和精氨酸之间的酰胺键。然而，根据目的，也可以选择性地或逐步地使用仅消化赖氨酸位点的Lys-C、仅消化精氨酸位点的Arg-C、和仅消化天冬酰胺位点的Asp-N等。
作为预处理的一个步骤，水解的肽片段优选地使用LC上装配的可用于自动清除盐的Zip-Tip或捕获柱进行脱盐，从而清除所有可能导致质谱分析中任何问题的盐；但不总是限于此。
上述方法中，步骤4)中所述的定量分析优选通过选自下述的方法进行：蛋白芯片分析、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱)、双向电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、蛋白质印迹和ELISA，更优选通过直接与nano-UPLC相连的电喷雾离子化(ESI)进行；但不总是限于此。
为了比较正常组和病患组，定量分析的结果用层次聚类、PCA(主成份分析)等进行统计分析。如有必要，可进行归一化，从而最小化每批分析的差异。
上述方法中，步骤5)中所述的“量的显著改变”是指量的增加或者减少。
上述方法中，步骤6)所述的源自糖蛋白的肽优选具有距离氨基酸序列N-末端或者C-末端处水解位点的8个氨基酸范围内的糖基化位点；但不总是限于此。
所述方法是不进行标记而用于正常组和病患组的定性/定量分析方法。在用所述无标记法定量分析蛋白质组时，用质谱仪测量经LC柱分离的混合肽的分子量和可重复的保留时间，其精确度非常重要。因此，优选的，以规律的间隔加入其确切分子量已知的肽，以便于在分析后调整分子量；但不总是限于此。
上述方法中，当用质谱仪通过无标记法进行定量分析时，需要校正批次样品间的误差。为此，内标物使用样品中检测不到的通过水解标准蛋白而得到的肽。减少批次定量分析间误差的优选方法是，每次向每个样品中加入等量的此内标物，以归一化批误差；但不总是限于此。在此，任何种类的蛋白质均可用作内标物，只要所述蛋白在要分析的样品中检测不到即可；或者，质谱法检测到的蛋白的肽也可用作内标物，只要在正常组和病患组中观察不到定量差异即可。
上述方法具有以下优势：可以通过常规蛋白质组处理方法进行预处理；无需收集糖或糖蛋白的任何额外步骤；它靶向以根据近期蛋白质组分析技术能检测到的浓度包含于目标样品中的那些蛋白质；并且能区分病患组和正常组，而不使用非常复杂且定量分析昂贵的同位素置换法。
上述方法中，基于对未标记的受试者样品的研究结果进行定量分析，区分病患组和正常组。但也可以选择性地使用多种蛋白标记法或水解肽标记法。
上述方法中，糖蛋白相关肽可以被快速筛选。与正常人不同，癌症患者的糖基化发展异常，所以此快速筛选有助于了解正常组和病患组间不同的生命保障活动，也有助于有效的诊断各种疾病。
本发明人从正常人和癌症患者的血液中分离蛋白质组。用大量蛋白去除柱清除至少90％的大量蛋白，随后经丙酮沉淀得到纯化的蛋白质组。通过用胰蛋白酶水解一定量的纯化的蛋白质组，以得到肽混合物。从各蛋白质组获得的肽混合物通过LC/MS/MS法分析3次。用129种已确认的肽构建焦点数据库，在此基础上，对各蛋白质组样品进行定性/定量质谱分析(见图1)。基于上述结果进行PCA(主成份分析)，由此明确区分病患组和正常组(见图2)。
为了筛选特异显示正常组与病患组间差异的那些肽，对每个蛋白的肽谱(peptide pattern)进行分析。结果，从示出正常组与病患组间可量化差异的多个肽片段中，选出4种源自糖蛋白的特异肽(见图2)。对所选的4种特异肽进行PCA(主成份分析)。由此更明确地证实了正常组和病患组之间的差异(见图3)。用ROC曲线分析所选肽。结果证明，所述肽显示区分病患组和正常组的高灵敏性和特异性(见图3)。因此，证明通过比较所选4种特异肽的可量化差异区分癌症患者组和正常组，而无需量化地比较所有蛋白质(见图4)。
本发明人对所选4种特异肽进行序列分析。结果证明所述序列与N-连接的蛋白糖基化特异基序(N-X-S/T基序)相关(见图4)。通过定量分析所选特异肽证实由蛋白糖基化导致蛋白水解的不同。根据此结果，能区分癌症患者的血液样品和正常血液样品(见图3)。因此，本发明所选的特定肽可有效用作可用于使用人血液样品诊断、预测或验证癌症的标记物肽。
本发明还提供了一种癌症诊断试剂盒，其包括与选自下述的一种或多种糖基化相关肽特异性结合的抗体：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白-1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
通过证明显著定量改变是由水解酶处理受试者样品而引起糖链改变导致的，所述试剂盒可用于诊断及筛选癌症。
本文所述癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。
所述试剂盒中可另外包括所述4种标记物肽或其同位素标记的肽作为标准物。
可用于所述试剂盒中的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、和表位可连接片段等。多克隆抗体可用传统常规方法制备，包括以下步骤：将其中一种多肽标记物注入动物体内；从动物上取血；并得到含抗体的血清。所述多克隆抗体可用选自于山羊、兔子、绵羊、猴子、马、猪、牛、狗等的宿主动物制备，并用本领域技术人员现有技术中熟知的常规方法纯化。在此本文所述的单克隆抗体可以用任何可以在通过细胞系连续培养中产生抗体分子的技术制备，例如，但不仅限于，杂交瘤技术、人类B-细胞杂交瘤技术、和EBV-杂交瘤技术(Kohler G等人，Nature 256：495-497，1975；；Kozbor D等人，J Immunol Methods 81：31-42，1985；；Cote RJ等人，ProcNatl Acad Sci 80：2026-2030，1983；and；以及Cole SP等人，Mol Cell Biol62：109-120，1984)；但不总是限于此。还可制备具含有特异于其中一种所述多肽标记物的特异结合位点的抗体片段(Huse WD等人，Science 254：1275-1281，1989)，。而制备这种含具有特殊序列的多肽特异性抗体的技术方法是本领域技术人员已熟知的现有技术。
所述抗体优选对糖基化改变之前和/或之后的肽特异，但不总是限于此。
本发明所述试剂盒中所用的抗体可固定于固体基质，以便于进行后续步骤，例如洗涤或分离。本文所述的固体基质例如合成树脂、硝酸纤维素、玻璃板、金属板、玻璃纤维、微球、和微珠。本文所述合成树脂可以是聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF、或尼龙。
使从受试者得到的样品与固定于固体基质上特异结合一种肽标记物的抗体接触。在此，接触前可以对样品进行适当稀释。
在使从受试者得到的样品与固定于固体基质上特异结合一种肽标记物的抗体接触后，通过洗涤去除未结合的蛋白，随后用MALDI-MS检测特异肽。
本发明所述试剂盒可另外包括与所述肽标记物特异结合的检测抗体。本文所述检测抗体可以是用着色酶、荧光物质、放射性同位素、胶体等标记的缀合物，优选与所述标记物特异结合的二抗。本文所述的着色酶可以是过氧化酶、碱性磷酸酶、或酸性磷酸酶(如辣根过氧化物酶)。本文所述的荧光物质可以是羧酸荧光素(FCA)、异硫氰酸荧光素(FITC)、硫脲荧光素(FTH)、7-乙酰氧基香豆素-3-基、荧光素-5-基、荧光素-6-基、2’，7’-二氯荧光素-5-基、2’，7’-二氯荧光素-6-基、二氢四甲基若丹明-4-基、四甲基若丹明-5-基、四甲基若丹明-6-基、4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3-乙基或4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3-乙基。
本发明所述试剂盒可另外包括与着色酶反应的底物，以及用于清除未结合蛋白且只保留缀合的肽标记物的洗液或洗脱剂。
本发明还提供了一种用于癌症诊断的生物芯片，所述生物芯片上抗体整合于固体基质上，所述抗体与选自下述的一种或多种糖基化相关肽特异结合：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
通过证明显著定量改变是由水解酶处理受试者样品而引起糖链改变导致的，所述生物芯片可用于诊断及筛选癌症。
本文所述癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。
本文所述的生物分子优选抗体或适配体，但不总是限于此。所述生物分子不仅指小分子如初级代谢物、次级代谢物和天然物质，还指由活生物体产生的有机分子例如蛋白质、多糖和核酸。本文所述适配体是指与特殊靶向分子结合的寡核苷酸或者肽。
本文所述的固体基质优选自塑料、玻璃、金属、和硅，但不总是限于此。
本发明还提供了一种与选自下述的任意肽特异结合的抗体在制备癌症诊断试剂盒中的用途：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
本文所述癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。
此外，本发明提供了一种生物分子在制备用于癌症诊断生物芯片中的用途，所述生物分子可以从受试者的血液样品中获得，并且与选自下述的一种或多种肽的组合特异结果：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
所述癌症优选是选自下述的癌症：结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、和胰腺癌，更优选肝癌；但不总是限于此。
本文所述生物分子优选是抗体或适配体，但不总是限于此。所述生物分子不仅指小分子如初级代谢物、次级代谢物和天然物质，还指由活生物体产生的有机分子例如蛋白质、多糖和核酸。本文所述适配体是指能与特殊靶向分子结合的寡核苷酸或者肽。
本发明的实用且目前优选的实施方式将在下列实施例中阐明。
然而，欢迎本领域的技术人员，在本发明的基础上，在本发明的精神和范围内，进行调整和改进。
实施例1 制备样品
如表1所示，本发明人从正常血液和肝癌患者血液(取自韩国延世大学西富兰斯医院医院)中获得蛋白质组，随后根据通常已知方法为方便纯化而进行预处理过程。
【表1】
  患者编号   年龄   性别   期数   坏死程度   病原   病理
  1   25   男   3   0   HBV   肝炎
  2   61   男   1～2   0   HCV   慢性肝炎
  3   72   男   2   10   HBV   慢性肝炎
  4   46   女   3   0   HBV   肝硬化
  5   66   女   1   0   HCV   肝硬化
  6   46   男   1～2   30   HBV   肝硬化
  7   59   男   2   30   HBV   肝硬化
血浆蛋白质组由至少50000种成份构成，蛋白成份的密度非常动态化(1～1012)。因此，候选生物标记蛋白，尤其是以极低浓度存在且占不到10％的蛋白，难以用检测极限是104～106的液相色谱-质谱(LC/MS/MS)检测并进行定量分析。因此，为了使样品复杂度最小化以有效检测血清中疾病生物标记物，先用蛋白去除柱(如MARS，多重亲和去除系统)清除占血浆蛋白质组约90％或以上的那些蛋白质，如白蛋白、IgG、IgA、铁传递蛋白、及结合珠蛋白，制得的血浆蛋白质组经丙酮沉淀或分子量截留(MWCO)纯化。经纯化的蛋白质溶于Tris-HCL缓冲液(pH＝8.00)，然后用Bradford法定量。接着，从各正常组和病患组制备等量的总蛋白。向制得的蛋白样品中加入二硫苏糖醇(DTT，10mM)，之后于60℃下反应30分钟。结果，半胱氨酸位点上的二硫键被还原，导致蛋白质变性。在暗室里，通过与IAA(碘乙酰胺)烷基化试剂在室温下反应，封闭已被还原的半胱氨酸位点。通过与胰蛋白酶在37℃下反应10小时，消化半胱氨酸位点被保护的蛋白质。由蛋白水解得到的肽用真空干燥机干燥。各正常组和病患组经干燥的肽溶于等体积缓冲液，以制备相同浓度的肽样品。向所有样品中加入相同浓度的源自酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(GPD)肽作为内标物，随后进行<实施例2>所述的实验。
<实施例2>分析多肽
为了分离和纯化<实施例1>中制备的样品，将捕获柱(C18，5μm，180μm X 20mm，Waters)和分析柱(BEH，C18，1.7μm，75μm X 15cm，Waters)与nano-UPLC(Waters)连接使用。用与nano-UPLC直接连接的电喷雾离子化(ESI)质谱仪(Premier(四级飞行时间(Q-TOF))，Waters，英国)对已分离/纯化的样品进行ESI-MS/MS。每个样品蛋白质组经胰蛋白酶水解而得到混合肽，将5μL相同浓度的所述混合肽上样到与质谱仪相连的液相色谱(LC-ESI/MS/MS)中。样品经过捕获柱(C18，5μm，180μm X 20mm)以清除其中的盐。然后，复杂肽经分析柱(BEH，C18，1.7μm，75μm X 15cm)分离。各时间区域的样品经过质谱仪以m/z值的形式检测。分析完成后，通过搜索引擎如蛋白表达系统、MASCOT、和SEQUEST等对蛋白质进行定性。根据上述质谱分析得到的分离时间和m/z值，用选择离子色谱法确定所述定性的肽。为了使用无标记的定量分析法对定性的ESI-MS/MS结果进行定量分析，重要的是要知道肽的确切分子量和肽分离时间的可重复性。所以在Premier型质谱仪上安装的锁定喷雾器，以防止液相色谱中分离的电喷雾离子进入质谱仪，同时仅喷出分子量已经精确鉴定的标准物(GFP，Glu-血纤维蛋白肽B)。因此，构建的系统经过更精确地校正各肽的分子量而提供可重复的高度可靠的结果。为了使正常组和病患组样品的定量分析建立在更加可靠的可复现的结果上，ESI-MS/MS分析重复3次。
实施例3 定性定量分析
用搜索引擎MASCOT对<实施例2>中得到的结果进行定性。通过收集从正常组和病患组得到的所有已定性的蛋白质列表，构建焦点数据库。基于焦点数据库，用蛋白表达系统(Waters，UK.2.1版)进行定性/定量分析。定性/定量分析的结果由Excel导出，随后进行主成份分析(PCA)。结果如图2所示，病患组明显有别于正常组(图2)。由此证明，本发明所述的肽分析法可用于正常组和病患组的比较筛选。
基于统计处理过的PCA结果，对从正常组和病患组获得的那些蛋白质进行肽谱分析。因而，从源于相同蛋白的肽中选出特别显示出定量改变并与糖基化位点密切相关的特异肽，如表2所示。经证实，所有选出的肽与各糖蛋白中的N-连接糖基化位点相关(表4)。
【表2】
Figure BDA0000106095160000171
通过上述相同方式，还单独对所选的糖蛋白特异肽进行主成份分析。结果如图3所示，较之图2所示结果，病患组更明显地区别于正常组。
所选各糖蛋白相关特异肽的灵敏性和特异性通过ROC曲线(接受者操作特征曲线)呈现，其可用于区分病患组和正常组。结果如表3和图4所示，所选特异肽具有高灵敏性和特异性(表3和图4)。ROC曲线中的面积指示精确度，而ROC曲线下的面积(AUC)可以是确定病患组是否可与正常组相区别的工具。如表3所示，两种源于afamin前体和激肽原-1前体的高分子量亚型的肽具有极好的精确度，至少为0.90。源自α1酸性糖蛋白1前体的肽的精确度很好，至少为0.80。另一种源自玻连蛋白前体的肽精确度良好，为约0.70。因此，可分别使用或一起使用这些肽，以区分病患组和正常组。
总之，当比较筛选正常组和病患组时，无需比较所有经ESI-MS/MS检测到的所有肽。相反，例如在肝癌患者的情况中，仅筛选糖蛋白相关特异肽，就可以区分病患组与正常组。
【表3】
Figure BDA0000106095160000181
如表4所示，ESI-MS/MS结果表明所选的肽与各蛋白的N-连接糖基化相关(表4)。当蛋白被糖基化时，由于糖链占据空间巨大，产生空间位阻效应。因而，如图5所示，相邻特异肽的水解效率也受到影响。结果，根据着糖基化和区域中糖基化结构的改变，可观测到所得特异肽的定量改变(图5)。
【表4】
工业应用
如上所述，本发明提供了一种糖基化特异肽的选择方法以及一种用所选肽作为标记物的癌症诊断方法，通过所述方法可用血液样品诊断多种癌症。
Figure IDA0000106095230000011

Claims (22)

1.一种癌症诊断标记物的筛选方法，所述筛选方法包括下列步骤：
1)从获自癌症患者的样品中分离总蛋白质；
2)通过使用大量蛋白去除柱纯化所述经分离的总蛋白质；
3)通过使用水解酶处理经纯化的蛋白质而制备水解的肽片段混合物；
4)定量分析所述水解的肽片段混合物；
5)筛选与对照组相比显示出量的显著改变的那些肽；以及
6)确认所选的显示出量的显著改变的肽是否源于糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，所述癌症选自肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和胰腺癌。
3.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述样品是选自下述的样品：细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、卵泡液、乳汁、晶状体液和胰液。
4.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，步骤3)中所述经纯化的蛋白质在水解前使用二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)进行预处理。
5.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，步骤3)中所述水解酶选自Arg-C、Asp-N、Glu-c、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，步骤4)中所述质谱法通过液相色谱-质谱(LS-MS)进行。
7.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，步骤6)中所述源于糖蛋白的肽具有距离氨基酸序列N-末端或者C-末端处水解位点8个氨基酸范围内的糖基化位点。
8.根据权利要求1所述的癌症诊断标记物的筛选方法，其特征在于，步骤6)中所述源于糖蛋白的肽选自具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
9.一种用于提供癌症诊断信息的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从获自受试者的样品中分离总蛋白质；
2)通过使用大量蛋白去除柱纯化所述经分离的总蛋白质；
3)通过使用水解酶处理所述经纯化的蛋白质而制备水解的肽片段混合物；
4)定量分析所述水解的肽片段混合物；
5)筛选与对照组相比显示出量的显著改变的那些肽；
6)确认所选的显示出量的显著改变的那些肽是否源于糖蛋白；以及
7)当确认所述显示出量的显著改变的肽源于糖蛋白时，判断或诊断受试者为癌症或癌症高风险。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述样品是选自下述的样品：细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、卵泡液、乳汁、晶状体液和胰液。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述水解酶选自Arg-C、Asp-N、Glu-C、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤7)中所述源于糖蛋白的肽具有距离氨基酸序列N-末端或者C-末端处水解位点8个氨基酸范围内的糖基化位点。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤7)中所述源于糖蛋白的肽选自具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
14.一种癌症诊断试剂盒，其包含与选自下述的肽特异结合的抗体：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
15.根据权利要求14所述的癌症诊断试剂盒，其特征在于，所述癌症选自肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和胰腺癌。
16.一种癌症诊断生物芯片，所述生物芯片上的生物分子整合在固体基质上，所述生物分子与由一种或多种选自下述的肽组成的肽组合特异结合：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
17.根据权利要求16所述的癌症诊断生物芯片，其特征在于，所述生物分子是抗体或适体。
18.根据权利要求16所述的癌症诊断生物芯片，其特征在于，所述固体基质选自塑料、玻璃、金属、和硅。
19.根据权利要求16所述的癌症诊断生物芯片，其特征在于，所述癌症选自肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和胰腺癌。
20.一种与选自下述的任何肽特异结合的抗体在制备癌症诊断试剂盒中的用途：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
21.一种生物分子在制备癌症诊断生物芯片中的用途，所述生物分子可以从受试者血液样品中获得，并且与选自下述的一种或多种肽的组合特异结合：具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的afamin前体、具有SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列的α1酸性糖蛋白1、具有SEQ.ID.NO：3所示氨基酸序列的激肽原-1前体的高分子量亚型、以及具有SEQ.ID.NO：4所示氨基酸序列的玻连蛋白前体。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的用途，其特征在于，所述癌症选自肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和胰腺癌。
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