JP6657098B2 - 自己免疫疾患の診断と治療 - Google Patents

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関連出願への相互参照
本願は、２０１３年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９３，５４２号の出願日の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）は、循環系における主要なブラジキニン産生酵素であり、かつ血漿カリクレイン−キニン系（ＫＫＳ）の構成要素である（Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．およびＳｃｈｍａｉｅｒ，Ａ．Ｈ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ９０、３８１９−３８４３）。ｐＫａｌの活性化は、接触系を介して起こり、このことは遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）に関連する疾患病理の原因であることが実証されている（Ｚｕｒａｗ，Ｂ．Ｌ．およびＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｃ．（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ１７、６９７−７０６）。ブラジキニンは、疼痛、炎症、浮腫および血管新生の重要な媒介因子である（Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．ら（２０１１）Ａｌｌｅｒｇｙ６６、１３９７−１４０６；Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．（２００６）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ１２、２５９９−２６０７）。
要約
本開示は、切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の濃度が、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような自己免疫疾患を有する患者で上昇するという知見に基づく。したがって、本明細書において、切断型ＨＭＷＫの濃度に基づく、ＲＡ、ＣＤもしくはＵＣのような自己免疫疾患の診断、自己免疫疾患の進行の監視、または自己免疫疾患の治療効果の判定のための方法が開示される。
一態様において、本開示は対象における自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＣＤもしくはＵＣ）の診断方法を提供し、ここで方法は、（ｉ）自己免疫疾患を有することが疑われる対象の生物学的試料（例えば、血清試料もしくは血漿試料）を提供するステップ；（ｉｉ）該生物学的試料中の切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の濃度を測定するステップ；ならびに（ｉｉｉ）該生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度が対照の試料と比較して上昇している場合に、対象が自己免疫疾患を有しているかまたは自己免疫疾患の危険性があると識別するステップを含む。
ある実施態様において、切断型ＨＭＷＫの濃度は、切断型ＨＭＷＫに特異的である結合剤（例えば抗体）を含むアッセイによって測定される。アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、もしくは、例えばＬｉＣｏｒ検出を含むウェスタンブロットアッセイのようなイムノブロットアッセイであり得る。
方法は、対象に自己免疫疾患の治療を施すことをさらに含み得る。ある実施態様において、対象は、例えば本明細書に記載されるもののような血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤の有効量を投与される。
別の態様において、本開示は、対象における自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＣＤもしくはＵＣ）の進行を監視する方法を提供し、方法は、（ｉ）第一の時点において、自己免疫疾患を有していることが疑われる対象の第一の生物学的試料を提供するステップ；（ｉｉ）該第一の生物学的試料中の高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の第一の濃度を測定するステップ；（ｉｉｉ）該第一の時点に続く第二の時点における該対象の第二の生物学的試料を提供するステップ；（ｉｖ）該第二の生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの第二の濃度を測定するステップ；ならびに（ｖ）該第一のおよび第二の生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度変化に基づいて対象中の自己免疫疾患の進行を判定するステップを含む。切断型ＨＭＷＫの第二の濃度が切断型ＨＭＷＫの第一の濃度よりも高い場合、自己免疫疾患が対象において進行していること、または対象が自己免疫疾患を発症したこともしくは自己免疫疾患を発症する危険性を持つということを示す。
ある実施態様において、第一の生物学的試料、第二の生物学的試料、もしくはその両方は、血清試料もしくは血漿試料である。他の実施態様において、切断型ＨＭＷＫの第一のもしくは第二の濃度は、切断型ＨＭＷＫに特異的な結合剤（例えば抗体）を含むアッセイによって測定される。ある例において、アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、もしくは、例えばＬｉＣｏｒ検出を含むウェスタンブロットアッセイのようなイムノブロットアッセイであってよい。
方法は、対象に自己免疫疾患の治療を施すことをさらに含み得る。ある実施態様において、対象は、本明細書に記載されるもののような血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤の有効量を投与される。
さらに、本開示は、患者における自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＣＤもしくはＵＣ）の治療効果を判定する方法を提供し、方法は、（ｉ）治療の過程において自己免疫疾患の治療を施される患者の複数の生物学的試料（例えば、血清試料もしくは血漿試料）を提供するステップ；（ｉｉ）該複数の生物学的試料中の高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の濃度を測定するステップ；ならびに（ｉｉｉ）治療の過程における切断型ＨＭＷＫの濃度の変化に基づいて、患者における治療効果を判定するステップを含む。治療の過程において、切断型ＨＭＷＫの濃度が減少する場合、患者において治療が有効であることを示す。
ある実施態様において、治療は例えば本明細書に記載されるもののような血漿カリクレイン阻害剤の少なくとも一つを含む。他の実施態様において、複数の生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度は、切断型ＨＭＷＫに特異的な結合剤（例えば抗体）を含むアッセイによって測定される。ある例において、アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、もしくは、例えばＬｉＣｏｒ検出を含むウェスタンブロットアッセイのようなイムノブロットアッセイである。本明細書に記載される任意の方法において、そこで使用される生物学的試料は、採取の後に生物学的試料に添加されるプロテアーゼ阻害剤もしくはプロテアーゼ阻害剤カクテルを含み得る。
該方法において有用なカリクレイン阻害剤は、例えば血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤であり得る。ある実施態様において、阻害剤は血漿カリクレイン阻害剤である。
該方法において有用なカリクレイン阻害剤は、当技術分野に公知であるかもしくは本明細書に記載されるＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチド、そのような任意のＫｕｎｉｔｚドメインを含むより大きなポリペプチド（カリクレイン阻害剤ポリペプチドが、標準的なアッセイでの測定により、カリクレインに結合し、かつカリクレインを阻害することを条件として）、カリクレイン結合タンパク質（例えば、例えば抗血漿カリクレイン抗体のような抗体）、または本明細書に記載される他のカリクレイン阻害剤のいずれかであり得る。
ｐＫａｌ活性を阻害できる例示的なＫｕｎｉｔｚドメインペプチドは：Ｇｌｕ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列識別番号２；ＳＸ−８８）、もしくは配列識別番号２のアミノ酸３〜６０のようなそれらの断片を含む。
ある実施態様において、カリクレイン阻害剤は、Ｋｕｎｉｔｚドメインのフレームワーク領域ならびにＤＸ−８８ポリペプチドの第一のおよび第二の結合ループ領域を含むかまたはそれらからなる。
ある実施態様において、カリクレイン阻害剤は、配列識別番号２のアミノ酸３〜６０の約５８アミノ酸配列もしくは配列識別番号２の６０アミノ酸配列を持つＤＸ−８８ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる。
ある実施態様において、カリクレイン阻害剤は、血漿カリクレイン結合タンパク質（例えば、例えば本明細書に記載される抗血漿カリクレイン抗体のような抗体）を含む。
ある実施態様において、結合タンパク質（例えば、例えばヒト抗体のような抗体）は、本明細書に記載されるタンパク質と同じエピトープに結合するか、もしくは本明細書に記載されるタンパク質と結合に関して競合する。
ある実施態様において、本明細書に記載されるタンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される。そのような結合タンパク質は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０９４５８７および米国特許出願公開ＵＳ２０１０１８３６２５に記載され、その両方とも参照によって本明細書にその全ての内容が組み込まれる。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ１０１−Ａ０１、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１もしくはＸ６３−Ｇ０６と競合するか、またはそれらと同じエピトープを持つ。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、プレカリクレイン（例えばヒトプレカリクレイン）には結合しないが、血漿カリクレイン（例えばヒト血漿カリクレイン）の活性型には結合する。
ある実施態様において、該タンパク質は、血漿カリクレインもしくはその断片の触媒ドメインの活性部位もしくはその近傍に結合するか、または血漿カリクレインの活性部位と重なるエピトープに結合する。
ある実施態様において、該タンパク質は、血漿カリクレインの触媒三残基：Ｈｉｓ４３４、Ａｓｐ４８３および／もしくはＳｅｒ５７８（番号はヒトの配列に基づく）を形成する一つもしくはそれ以上のアミノ酸に結合する。他の実施態様において、該タンパク質は、Ｓｅｒ４７９、Ｔｙｒ５６３および／もしくはＡｓｐ５８（番号はヒトの配列に基づく）の一つもしくはそれ以上のアミノ酸に結合する。さらに他の実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ａｒｇ５５１、Ｇｌｎ５５３、Ｔｙｒ５５５および／もしくはＡｒｇ５６０（アミノ酸の位置の番号はヒトカリクレイン配列に基づく）の一つもしくはそれ以上のアミノ酸に結合する。さらに他の実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ｓｅｒ４７８、Ａｓｎ４８１、Ｓｅｒ５２５および／もしくはＬｙｓ５２６（アミノ酸の位置の番号はヒトカリクレイン配列に基づく）の一つもしくはそれ以上のアミノ酸に結合する。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、第ＸＩＩａ因子および／もしくはブラジキニンの産生を、例えば、タンパク質の非存在下での同じ条件下での標準的な、例えば第ＸＩＩａ因子および／もしくはブラジキニンの産生と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％よりも大きく減少させる。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭもしくは１０ｎＭ未満の見かけの阻害定数（Ｋｉ，ａｐｐ）を持つ。
ある実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。
他の実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。例えば、血漿カリクレイン結合タンパク質は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧである。血漿カリクレイン結合タンパク質は、可溶性Ｆａｂ（ｓＦａｂ）であり得る。
他の実施において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ｆａｂ２'、ｓｃＦｖ、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ：：Ｆｃ融合体、Ｆａｂ：：ＨＳＡ融合体、ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合体、Ｆａｂ：：ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合体、もしくは本明細書における結合タンパク質の一つの抗原結合部位を含む他の分子を含む。これらのＦａｂのＶＨおよびＶＬ領域は、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ２'、ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ、ペグ化ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ２、ＶＨ：：ＣＨ１：：ＨＳＡ＋ＬＣ、ＨＳＡ：：ＶＨ：：ＣＨ１＋ＬＣ、ＬＣ：：ＨＳＡ＋ＶＨ：：ＣＨ１、ＨＳＡ：：ＬＣ＋ＶＨ：：ＣＨ１、もしくは他の適切な構造として提供され得る。
一実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、該タンパク質は、例えばすべてのヒトフレームワーク領域のようなヒト抗体フレームワーク領域の一つもしくはそれ以上を含む。
一実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ヒトＦｃドメイン、またはヒトＦｃドメインと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。
一実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、霊長類抗体もしくは霊長類化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、タンパク質は、例えばすべての霊長類フレームワーク領域のような霊長類抗体フレームワーク領域の一つもしくはそれ以上を含む。
一実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、霊長類Ｆｃドメイン、または霊長類Ｆｃドメインと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。「霊長類」は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓおよびＰａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ（ボノボ））、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）、テナガザル、サル、キツネザル、アイアイ（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）ならびにメガネザルを含む。
一実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ヒトフレームワーク領域、またはヒトフレームワーク領域と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるフレームワーク領域を含む。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、マウスもしくはウサギからの配列を一切含まない（例えばマウスもしくはウサギ抗体ではない）。
ある実施態様において、結合タンパク質（例えば、ヒト抗体のような抗体）は、重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列および軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるタンパク質の重鎖可変ドメインからの１個、２個もしくは３個（例えば３個）のＣＤＲ領域を含み、ならびに／または、軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるタンパク質の軽鎖可変ドメインからの１個、２個もしくは３個（例えば３個）のＣＤＲ領域を含み、そしてここで、該タンパク質は血漿カリクレインと結合（例えば、結合して阻害）する。
ある実施態様において、重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４の重鎖可変ドメインからの１個、２個もしくは３個（例えば３個）のＣＤＲ領域を含み、ならびに／または軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４の軽鎖可変ドメインからの１個、２個もしくは３個（例えば３個）のＣＤＲ領域を含む（それぞれ）。
ある実施態様において、重鎖可変ドメインからの１個、２個もしくは３個（例えば３個）のＣＤＲ領域は、Ｘ８１−Ｂ０１由来であり、ならびに／または、軽鎖可変領域からの１個、２個もしくは３個（例えば３個）のＣＤＲ領域は、Ｘ８１−Ｂ０１由来もしくはＸ６７−Ｄ０３由来である。
ある実施態様において、重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるタンパク質の重鎖可変ドメインを含み、ならびに／または軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるタンパク質の軽鎖可変ドメインを含む。
ある実施態様において、重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４の重鎖可変ドメインを含み、ならびに／または、軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４の軽鎖可変ドメインを含む（それぞれ）。
ある実施態様において、重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｘ８１−Ｂ０１の重鎖可変ドメインを含み、ならびに／または軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｘ８１−Ｂ０１の軽鎖可変ドメインを含む。
ある実施態様において、重鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ１０１−Ａ０１、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１もしくはＸ６３−Ｇ０６の重鎖可変ドメインを含み、ならびに／または軽鎖イムノグロブリン可変ドメイン配列は、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ１０１−Ａ０１、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１もしくはＸ６３−Ｇ０６の軽鎖可変ドメインを含む（それぞれ）。
ある実施態様において、該タンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質の重鎖および／もしくは本明細書に記載されるタンパク質の軽鎖を含む。
ある実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４の重鎖を含む（それぞれ）。
ある実施態様において、該タンパク質は、Ｘ８１−Ｂ０１の重鎖および／もしくはＸ８１−Ｂ０１の軽鎖を含む。
ある実施態様において、該タンパク質は、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ１０１−Ａ０１、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１もしくはＸ６３−Ｇ０６の重鎖ならびに／またはＸ６７−Ｄ０３、Ｘ１０１−Ａ０１、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１もしくはＸ６３−Ｇ０６の軽鎖を含む（それぞれ）。
ある実施態様において、該タンパク質は、以下の：（ａ）ヒトＣＤＲもしくはヒトフレームワーク領域；（ｂ）ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるＣＤＲの一つもしくはそれ以上（例えば１、２もしくは３個）を含む；（ｃ）ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるＣＤＲの１個もしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）を含む；（ｄ）ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域もしくはＣＤＲ）と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である；（ｅ）ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域もしくはＣＤＲ）と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である；（ｆ）該タンパク質が、本明細書に記載されるタンパク質が結合するエピトープに結合するか、または、結合に関して本明細書に記載されるタンパク質と競合する；（ｇ）霊長類ＣＤＲもしくは霊長類フレームワーク領域；（ｈ）ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲ１から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個もしくは３個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ１を含む；（ｉ）ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲ２から、少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ２を含む；（ｊ）ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲ３から、少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個もしくは６個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ３を含む；（ｋ）ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲ１から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個もしくは５個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ１を含む；（ｌ）ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲ２から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個もしくは４個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ２を含む；（ｍ）ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲ３から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個もしくは５個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ３を含む；（ｎ）ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域もしくはＣＤＲ）から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個を超えるアミノ酸が異なることのない；ならびに（ｏ）ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列が、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域もしくはＣＤＲ）から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個を超えるアミノ酸が異なることのない、という特徴の一つもしくはそれ以上を含む。
ある実施態様において、該タンパク質は、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭもしくは１０ｎＭ未満の見かけの阻害定数（Ｋｉ，ａｐｐ）を持つ。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される抗体の軽鎖および重鎖を持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される抗体の重鎖を持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される抗体の軽鎖を持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される抗体の軽鎖および／もしくは重鎖の抗体可変領域を持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、プレカリクレイン（例えばヒトプレカリクレイン）には結合しないが、血漿カリクレイン（例えばヒト血漿カリクレイン）の活性型に結合する。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、第ＸＩＩａ因子および／もしくはブラジキニンの産生を、タンパク質の非存在下での同じ条件下での標準的な、例えば第ＸＩＩａ因子および／もしくはブラジキニンの産生と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％よりも大きく減少させる。
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭもしくは１０ｎＭ未満の見かけの阻害定数（Ｋｉ，ａｐｐ）を持つ。
ある実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。
本開示の一つもしくはそれ以上の実施態様の詳細は、付随する図表および以下の記載において説明される。本開示の他の特徴、目標および利点は、記載および図表、ならびに請求項より明らかであろう。
本出願全体において引用されるすべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、参照により本明細書において、明示的に組み込まれる。
図１は、切断型ＨＭＷＫと関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎との相関を示す表である。
本開示は、ＲＡ、ＣＤもしくはＵＣを有する患者において切断型ＨＭＷＫの上昇した濃度が観察されたという、予期せぬ発見に基づく。特に、切断型ＨＭＷＫの高濃度がＲＡ患者において観察され、切断型ＨＭＷＫの中程度の濃度がＣＤおよびＵＣの患者の両方において観察された。したがって、対象の生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度に基づく、ＲＡ、ＵＣもしくはＣＤのような自己免疫疾患を有しているかまたはそれらを発症する危険性のある対象を識別するため、自己免疫疾患の進行を監視するため、ならびに対象における自己免疫疾患の治療効果を判定するための新規の診断および予後判定の方法が本明細書において開示される。本明細書に記載されるもののようなｐＫａｌ阻害剤を用いて、そのような自己免疫疾患および血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系に関連する他の疾患の治療のための方法もまた本明細書において開示される。
定義
便宜のため、本開示のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語をここで定義する。
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数への言及を含む。
用語「抗体」は、少なくとも一つのイムノグロブリン可変ドメインもしくはイムノグロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）を含み得る。他の例において、抗体は、２個の重（Ｈ）鎖可変領域と２個の軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ Ｗｉｌｄｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、２６（３）、６２９〜６３９））ならびに完全な抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ）の構造的特徴を持ち得る。抗体は任意の起源由来であってよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒトの霊長類）および霊長類化のものが好ましい。
ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれるより保存された領域が介在する「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」と呼ばれる超可変領域へとさらに細分され得る。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照。ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋもまた参照できる。）。Ｋａｂａｔの定義を本明細書において使用する。それぞれのＶＨおよびＶＬは、典型的には３個のＣＤＲと４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置される。
抗体のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖はそれぞれ、重鎖定常領域もしくは軽鎖定常領域のすべてもしくは部分をさらに含んでもよく、それによってイムノグロブリン重鎖もしくはイムノグロブリン軽鎖をそれぞれ形成する。一実施態様において、抗体は２個のイムノグロブリン重鎖と２個のイムノグロブリン軽鎖とのテトラマーであり、ここで、イムノグロブリン重鎖とイムノグロブリン軽鎖とは、例えばジスルフィド結合によって相互結合されている。ＩｇＧにおいて、重鎖定常領域は、３個のイムノグロブリンドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主の組織もしくは因子への抗体の結合を媒介する。イムノグロブリンの軽鎖は、κもしくはλのタイプであってよい。一実施態様において、抗体はグリコシル化されている。抗体は、抗体依存性細胞傷害性および／もしくは補体依存性細胞障害性に関して機能的であり得る。
抗体の一つもしくはそれ以上の領域はヒトもしくは事実上ヒトのものであってよい。例えば、可変領域の一つもしくはそれ以上は、ヒトもしくは事実上ヒトのものであってよい。例えば、ＣＤＲの一つもしくはそれ以上はヒトの、例えばＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３であってよい。軽鎖ＣＤＲのそれぞれはヒトのものであってよい。ＨＣ ＣＤＲ３はヒトのものであってよい。フレームワーク領域の一つもしくはそれ以上は、ヒトの、例えばＨＣもしくはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４であってよい。例えば、Ｆｃ領域はヒトのものであってよい。一実施態様において、フレームワーク領域の全てはヒトのものであり、例えばイムノグロブリンを産生する造血細胞もしくは非造血細胞のような、例えばヒトの体細胞で産生された抗体のフレームワークの配列を持つ。一実施態様において、ヒトの配列は、例えば生殖細胞系列の核酸によってコードされる、生殖細胞系列の配列である。一実施態様において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）の残基を、最も類似する霊長類の生殖細胞系列の遺伝子、特にヒトの生殖細胞系列の遺伝子における対応する残基のアミノ酸タイプに変換することができる。定常領域の一つもしくはそれ以上は、ヒトもしくは事実上ヒトのものであってよい。例えば、イムノグロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）もしくは抗体全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％もしくは１００％は、ヒトもしくは事実上ヒトのものであってよい。
抗体のすべてもしくは部分は、イムノグロブリン遺伝子もしくはそのセグメントによってコードされ得る。例示的なヒトイムノグロブリン遺伝子は、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμの定常領域遺伝子ならびに多くのイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。全長のイムノグロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａもしくはアミノ酸約２１４個）は、ＮＨ２末端における可変領域遺伝子（アミノ酸約１１０個）、ならびに、ＣＯＯＨ末端におけるκもしくはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長のイムノグロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａもしくはアミノ酸約４４６個）は、同様に、可変領域遺伝子（アミノ酸約１１６個）および例えば（アミノ酸約３３０個をコードする）γのような他の上述の定常領域遺伝子の一つによってコードされる。ヒトＨＣの長さは、ＨＣ ＣＤＲ３がアミノ酸残基約３個からアミノ酸残基３５個超まで変化するために、大幅に変化する。
全長抗体の「抗原結合断片」という用語は、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の一つもしくはそれ以上の断片を指す。全長抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合する２個のＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）機能性を保持する、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、ＶＬおよびＶＨであるＦｖ断片の２個のドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらを、組換え法を用いて、合成リンカーによって結合して、ＶＬおよびＶＨ領域が対を形成して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することができる（例えば米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第４，８８１，１７５号、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６および Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照）。
抗体断片は、当業者に公知の従来技術を含む任意の好適な技術を用いて取得できる。用語「単一特異的抗体」は、例えばエピトープのような特定の標的に対する単一の結合特異性および結合親和性を示す抗体を指す。この用語は「モノクローナル抗体」もしくは「モノクローナル抗体組成物」を含み、それらは、本明細書において、抗体がどのように生成されたかに関わらず、単一の分子組成の抗体もしくはその断片の調製物を指すのに用いられる。
阻害定数（Ｋｉ）は、阻害剤の効力の尺度を提供し、それは、酵素活性を半減させるのに必要な阻害剤の濃度であり、酵素もしくは基質の濃度に依存しない。見かけのＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）を、異なる濃度の阻害剤（例えば阻害的結合タンパク質）が反応の度合い（例えば酵素活性）に及ぼす阻害効果を測定することによって、異なる基質濃度で得て、阻害剤の濃度の関数としての擬１次速度定数の変化をモリソン式（式１）に適合させることで見かけのＫｉ値の推定値を得る。Ｋｉは、Ｋｉ，ａｐｐ対基質濃度のプロットの線形回帰分析から得られるＹ切片から得られる。
Figure 0006657098
本明細書で用いられるとき、「結合親和性」は、見かけの会合定数もしくはＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、特定の標的分子に対して、例えば、少なくとも１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１および１０１１Ｍ−１の結合親和性を持つ。第二の標的と比べて第一の標的に対する結合タンパク質の結合の親和性が高いことは、第一の標的との結合に対するＫａが第二の標的との結合に対するＫａ（もしくは数値Ｋｄ）よりも高いこと（もしくはより小さい数値Ｋｄ）によって示され得る。そのような場合、結合タンパク質は、、第二の標的（例えば、第二の立体構造での同じタンパク質もしくはそれらの模倣体、または第二のタンパク質）と比較して、第一の標的（例えば、第一の立体構造でのタンパク質もしくはそれらの模倣体）に対して特異性を有する。結合親和性の差（例えば特異性もしくは他の比較）は、少なくとも、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３７．５倍、５０倍、７０倍、８０倍、９１倍、１００倍、５００倍、１０００倍、もしくは１０５倍であり得る。
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴もしくは（例えば、蛍光アッセイを用いる）分光法を含むさまざまな方法によって測定できる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中である。これらの技術を使用して、結合タンパク質（もしくは標的）の濃度の関数として、結合しているおよび遊離の結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合している結合タンパク質の濃度（［結合］）は、遊離の結合タンパク質の濃度（［遊離］）および標的上の結合タンパク質に対する結合部位の濃度と、以下の式
［結合］＝Ｎ ［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
で表される関係を有し、式中（Ｎ）は、標的分子当たりの結合部位の数である。
しかし、Ｋａを正確に決定することは必ずしも必要ではなく、その理由は、時に、例えばＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ分析のような方法を用いて決定され、Ｋａに比例し、したがって、より高い親和性が、例えば２倍高いか否かを決定することなどの比較のために使用できる親和性の定量的測定を得ること、親和性の定性的測定を得ること、または、例えばインビトロもしくはインビボのアッセイのような、例えば機能性アッセイの活性によって親和性の推定値を得ることで十分であるためである。
用語「結合タンパク質」は、標的分子と相互作用できるタンパク質を指す。この用語は、「リガンド」と相互交換可能に使用される。「血漿カリクレイン結合タンパク質」は、血漿カリクレインと相互作用（例えば結合）できるタンパク質を指し、特に、選択的もしくは特異的に、血漿カリクレインと相互作用および／もしくは血漿カリクレインを阻害するタンパク質を含む。タンパク質は、該タンパク質の非存在下での同じ条件における血漿カリクレインの活性と比較して、血漿カリクレインの活性の低減を引き起こす場合、血漿カリクレインを阻害する。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は抗体である。
用語「カリクレイン阻害剤」は、カリクレインを阻害する任意の剤もしくは分子を指す。
用語「併用」は、剤もしくは治療の使用もしくは作用の時間が重なる、同じ患者を治療するために二つ以上の剤もしくは治療を使用することを指す。剤もしくは治療は、同時に（例えば、患者に投与される１つの製剤として、もしくは同時に投与される２個別々の製剤として）もしくは任意の順番で連続的に投与され得る。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を持つアミノ酸残基と置換されているものである。類似の側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
結合タンパク質のフレームワークおよび／もしくはＣＤＲアミノ酸残基（または結合ループアミノ酸残基）の一つもしくはそれ以上が、本明細書に記載される結合タンパクと比べて一つもしくはそれ以上の変異（例えば置換（例えば保存的置換もしくは必須でないアミノ酸の置換）、挿入または欠失）を含むことができる。血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質と比べて変異（例えば置換（例えば保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）（例えば少なくとも１個、２個、３個もしくは４個ならびに／または１５個、１２個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個もしくは２個未満）持っていてもよく、例えばタンパク質の機能に実質的に影響を与えない変異を持っていてもよい。変異は、フレームワーク領域、ＣＤＲ（もしくは結合ループ）および／もしくは定常領域に存在してよい。ある実施態様において、変異はフレームワーク領域に存在する。ある実施態様において、変異はＣＤＲに存在する。ある実施態様において、変異は定常領域に存在する。特定の置換が認容されるか否か、すなわち、例えば結合活性のような生物学的特性に悪い影響を与えないことは、例えば、変異が保存的かを評価することによって、またはＢｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７、１３０６〜１３１０の方法によって、予測できる。
「事実上ヒト」のイムノグロブリン可変領域は、イムノグロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を引き起こさないのに十分な数のヒトのフレームワークアミノ酸位置を含むイムノグロブリン可変領域である。「事実上ヒト」の抗体は、抗体が正常ヒトにおいて免疫原性応答を引き起こさないのに十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
「エピトープ」は、結合タンパク質（例えば、Ｆａｂもしくは全長抗体のような抗体）によって結合される標的化合物上の部位を指す。標的化合物がタンパク質である場合、部位はすべてアミノ酸構成要素からなることができるか、もしくは部位がすべてタンパク質のアミノ酸の化学修飾（例えばグリコシル部分）からなることができるか、またはそれらの組み合わせからなることができる。重なるエピトープは、少なくとも一つの共通の、アミノ酸残基、グリコシル基、リン酸基、硫酸基、もしくは他の分子特徴を含む。
標的化合物上で第二の結合タンパク質が結合する部位と同じ部位に第一の結合タンパク質が結合する場合、または第二の結合タンパク質が結合する部位と重なる（例えば、アミノ酸配列もしくは他の分子特徴（例えばグリコシル基、リン酸基もしくは硫酸基）に関して、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％重なる）部位に第一の結合タンパク質が結合する場合、第一の結合タンパク質（例えば抗体）が、第二の結合タンパク質（例えば抗体）と「同じエピトープに結合する」。
第一の結合タンパク質のそのエピトープへの結合が、そのエピトープへと結合する第二の結合タンパク質の量を減少させる（例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％もしくはそれ以上）場合、第一の結合タンパク質（例えば抗体）が、第二の結合タンパク質（例えば抗体）と「結合に関して競合する」。競合は、直接的（例えば、第一の結合タンパク質が第二の結合タンパク質の結合するエピトープと同じエピトープに結合するかまたは、第一の結合タンパク質が第二の結合タンパク質の結合するエピトープと重なるエピトープに結合する）であっても間接的（例えば、第一の結合タンパク質のエピトープに対する結合が標的化合物の立体構造変化を引き起こし、それによって第二の結合タンパク質によるそのエピトープへの結合能が低減する）であってもよい。
２個の配列の間の「相同性」もしくは「配列同一性」（これらの用語は本明細書において相互交換可能に使用される）の計算は、以下のように実施される。配列を、最適比較の目的のために整列させる（例えば最適アラインメントのために、第一のおよび第二のアミノ酸もしくは核酸の配列の一方もしくは両方にギャップを導入でき、非相同性配列は、比較の目的のために度外視できる）。最適アラインメントを、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティでＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスによるＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いた最良のスコアとして決定する。次に、対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が、第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドによって占められているとき、それら分子は、その位置において同一である（本明細書において使用されるとき、アミノ酸もしくは核酸の「同一性」は、アミノ酸もしくは核酸の「相同性」と等価である）。２個の配列の間のパーセント同一性は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
好ましい実施態様において、比較目的で整列させる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％もしくは１００％である。例えば、参照配列は、イムノグロブリン可変ドメイン配列の長さであってよい。
「ヒト化」イムノグロブリン可変領域は、イムノグロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を引き起こさないのに十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように改変されたイムノグロブリン可変領域である。「ヒト化」イムノグロブリンの記載は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「低ストリンジェント、中ストリンジェント、高ストリンジェントもしくは非常に高いストリンジェントな条件下でのハイブリダイズ」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６．」に見出すことができる。水性および非水性の方法がその参考文献に記載され、いずれも使用することができる。本明細書に言及される具体的なハイブリダイゼーションの条件は、以下の：（１）約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の後に、少なくとも５０℃（低ストリンジェント条件において、洗浄温度は５５℃まで上昇させることができる）で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄を行う低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件、（２）約４５℃で６×ＳＳＣ中の後に、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う中ストリンジェントハイブリダイゼーション条件、（３）約４５℃で６×ＳＳＣ中の後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件であり、そして（４）非常に高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳの後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う。非常に高いストリンジェント条件（４）は、好ましい条件であり、他に特定されない限り、使用されるべきものである。本開示は、例えば本明細書に記載される結合タンパク質をコードする核酸のような、本明細書に記載される核酸もしくはその相補体に、低、中、高もしくは非常に高いストリンジェントでハイブリダイズする核酸を含む。該核酸は、参照核酸の長さと同じであるか、またはその３０％、２０％もしくは１０％の範囲の長さであってよい。該核酸は、本明細書に記載されるイムノグロブリン可変ドメインをコードする領域に対応してもよい。
「単離した組成物」は、単離した組成物を取得することのできた天然試料の少なくとも一つの成分の少なくとも９０％が除去された組成物を指す。人工的にもしくは天然で産生された組成物は、関心対象の種もしくは種の集合が、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０％、９０％、９２％、９５％、９８％もしくは９９重量％純粋である場合、「少なくとも」特定の度合いで純粋である「組成物」であり得る。
「単離した」タンパク質は、単離したタンパク質を取得することのできた天然試料の少なくとも一つの成分の少なくとも９０％から除去されたタンパク質を指す。タンパク質は、関心対象の種もしくは種の集合が、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８もしくは９９重量％純粋である場合、「少なくとも」特定の度合いで純粋であり得る。
「非必須」アミノ酸残基は、例えば抗体のような結合剤の野生型配列から生物学的活性を消失させることなく、もしくはより好ましくは実質的に変化させることなく変更できる残基であり、一方で「必須」アミノ酸残基を変化させると、活性の大幅な損失を生じる。
該方法によって治療されるべき「患者」、「対象」もしくは「宿主」（これらの用語は相互交換可能に使用される）は、ヒトもしくは非ヒトの動物のいずれかを意味し得る。
「それを必要とする対象」は、例えば、本明細書に記載される疾患もしくは障害を有する対象、または、本明細書に記載される疾患もしくは障害を発症する危険性のある対象を含む。
用語「カリクレイン」（例えば血漿カリクレイン）は、セリンプロテアーゼファミリーのサブグループであるペプチダーゼ（タンパク質のペプチド結合を切断する酵素）を指す。血漿カリクレインは、キニノーゲンを切断して強力な炎症誘発性ペプチドであるキニンを産生する。ＤＸ−８８（本明細書において「ＰＥＰ−１」とも呼ばれる）は、血漿カリクレイン（ＮＰ＿０００８８３）の強力（Ｋｉ＜１ｎＭ）かつ特異的な阻害剤である（例えばＷＯ９５／２１６０１もしくはＷＯ２００３／１０３４７５を参照）。
ＫＬＫｂ１（血漿カリクレイン）のアミノ酸配列は、
ＫＬＫｂ１
＞ｇｉ｜７８１９１７９８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００８８３．２｜ 血漿カリクレインＢ１前駆体［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＩＬＦＫＱＡＴＹＦＩＳＬＦＡＴＶＳＣＧＣＬＴＱＬＹＥＮＡＦＦＲＧＧＤＶＡＳＭＹＴＰＮＡＱＹＣＱＭＲＣＴＦＨＰＲＣＬＬＦＳＦＬＰＡＳＳＩＮＤＭＥＫＲＦＧＣＦＬＫＤＳＶＴＧＴＬＰＫＶＨＲＴＧＡＶＳＧＨＳＬＫＱＣＧＨＱＩＳＡＣＨＲＤＩＹＫＧＶＤＭＲＧＶＮＦＮＶＳＫＶＳＳＶＥＥＣＱＫＲＣＴＳＮＩＲＣＱＦＦＳＹＡＴＱＴＦＨＫＡＥＹＲＮＮＣＬＬＫＹＳＰＧＧＴＰＴＡＩＫＶＬＳＮＶＥＳＧＦＳＬＫＰＣＡＬＳＥＩＧＣＨＭＮＩＦＱＨＬＡＦＳＤＶＤＶＡＲＶＬＴＰＤＡＦＶＣＲＴＩＣＴＹＨＰＮＣＬＦＦＴＦＹＴＮＶＷＫＩＥＳＱＲＮＶＣＬＬＫＴＳＥＳＧＴＰＳＳＳＴＰＱＥＮＴＩＳＧＹＳＬＬＴＣＫＲＴＬＰＥＰＣＨＳＫＩＹＰＧＶＤＦＧＧＥＥＬＮＶＴＦＶＫＧＶＮＶＣＱＥＴＣＴＫＭＩＲＣＱＦＦＴＹＳＬＬＰＥＤＣＫＥＥＫＣＫＣＦＬＲＬＳＭＤＧＳＰＴＲＩＡＹＧＴＱＧＳＳＧＹＳＬＲＬＣＮＴＧＤＮＳＶＣＴＴＫＴＳＴＲＩＶＧＧＴＮＳＳＷＧＥＷＰＷＱＶＳＬＱＶＫＬＴＡＱＲＨＬＣＧＧＳＬＩＧＨＱＷＶＬＴＡＡＨＣＦＤＧＬＰＬＱＤＶＷＲＩＹＳＧＩＬＮＬＳＤＩＴＫＤＴＰＦＳＱＩＫＥＩＩＩＨＱＮＹＫＶＳＥＧＮＨＤＩＡＬＩＫＬＱＡＰＬＮＹＴＥＦＱＫＰＩＣＬＰＳＫＧＤＴＳＴＩＹＴＮＣＷＶＴＧＷＧＦＳＫＥＫＧＥＩＱＮＩＬＱＫＶＮＩＰＬＶＴＮＥＥＣＱＫＲＹＱＤＹＫＩＴＱＲＭＶＣＡＧＹＫＥＧＧＫＤＡＣＫＧＤＳＧＧＰＬＶＣＫＨＮＧＭＷＲＬＶＧＩＴＳＷＧＥＧＣＡＲＲＥＱＰＧＶＹＴＫＶＡＥＹＭＤＷＩＬＥＫＴＱＳＳＤＧＫＡＱＭＱＳＰＡ（配列識別番号３）である。
本明細書において使用されるとき、用語「ＤＸ−２９２２」は、用語「Ｘ１０１−Ａ０１」と交換可能に使用される。この抗体の他の変異型は以下に記載される。
Figure 0006657098
本明細書において使用されるとき、用語「ＤＸ−２９３０」は、用語「Ｘ１２４−Ｇ０１」と交換可能に使用される。この抗体の他の変異型は以下に記載される。
Figure 0006657098
ＫＬＫ１
＞ｇｉ｜１３５２９０５９｜ｇｂ｜ＡＡＨ０５３１３．１｜ カリクレイン１ ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＷＦＬＶＬＣＬＡＬＳＬＧＧＴＧＡＡＰＰＩＱＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＱＨＳＱＰＷＱＡＡＬＹＨＦＳＴＦＱＣＧＧＩＬＶＨＲＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＳＤＮＹＱＬＷＬＧＲＨＮＬＦＤＤＥＮＴＡＱＦＶＨＶＳＥＳＦＰＨＰＧＦＮＭＳＬＬＥＮＨＴＲＱＡＤＥＤＹＳＨＤＬＭＬＬＲＬＴＥＰＡＤＴＩＴＤＡＶＫＶＶＥＬＰＴＱＥＰＥＶＧＳＴＣＬＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＮＦＳＦＰＤＤＬＱＣＶＤＬＫＩＬＰＮＤＥＣＫＫＶＨＶＱＫＶＴＤＦＭＬＣＶＧＨＬＥＧＧＫＤＴＣＶＧＤＳＧＧＰＬＭＣＤＧＶＬＱＧＶＴＳＷＧＹＶＰＣＧＴＰＮＫＰＳＶＡＶＲＶＬＳＹＶＫＷＩＥＤＴＩＡＥＮＳ（配列識別番号４）
本明細書で使用されるとき、語句「非経口投与」および「非経口で投与される」は、経腸および局所表面の投与以外の投与の様式を意味し、通常注射によるものであり、そして、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を非限定的に含む。
対象における疾患を「予防する」という用語は、対象に例えば薬剤の投与のような薬品治療を施して、疾患の少なくとも一つの症状が予防されるようにすることを指し、すなわち、宿主が望ましくない状態になることを防ぐために、望ましくない状態（例えば疾患もしくは宿主動物の他の望ましくない状態）の臨床症状発現より前に施される。疾患を「予防する」は、「予防」もしくは「予防的治療」とも呼ばれる。
「予防的有効量」は、用量においておよび必要な期間において、所望の予防の結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、疾患の前、もしくは疾患の初期段階において予防的な用量が対象に用いられるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも少なくなり得るが、必ずしもそうであることはない。
本明細書において使用されるとき、用語「実質的に同一」（もしくは「実質的に相同」）は、第一および第二のアミノ酸もしくは核酸配列が類似の活性、例えば結合活性、結合選択性、もしくは生物活性を有する（もしくは有するタンパク質をコードする）ように、第一のアミノ酸もしくは核酸配列が、第二のアミノ酸もしくは核酸配列に対し、十分な数の同一もしくは同等の（例えば、例えば保存的アミノ酸置換のような類似の側鎖を持つ）アミノ酸残基もしくは核酸を含むことを指すものとして本明細書において使用される。抗体の場合、第二の抗体は、同じ抗原に対して、同じ特異性を持ち、かつ同じ抗原に対して少なくとも５０％、少なくとも２５％もしくは少なくとも１０％の親和性を持つ。
本明細書に開示される配列と類似もしくは相同（例えば、少なくとも約８５％の配列同一性）の配列は、本願の部分でもある。ある実施態様において、配列の同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上であってよい。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の、本明細書に記載される結合タンパク質に対する配列同一性を持っていてよい。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、ＨＣおよび／もしくはＬＣフレームワーク領域（例えばＨＣおよび／もしくはＬＣ ＦＲ１、２、３および／もしくは４）において約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を持っていてよい。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、ＨＣおよび／もしくはＬＣ ＣＤＲ（例えばＨＣおよび／もしくはＬＣ ＣＤＲ１、２および／もしくは３）において約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を持っていてよい。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、定常領域（例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／もしくはＣＬ１）において約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を持っていてよい。
さらに、核酸セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件）において相補鎖に結合するとき、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞に、細胞溶解物に、または部分精製型もしくは実質的に純粋型で存在し得る。
バイオポリマーのモチーフ配列は、変異アミノ酸であり得る位置を含み得る。例えば、そのような文脈における記号「Ｘ」は他に特定されない限り任意のアミノ酸（例えば２０種の天然アミノ酸の任意のもの）を指し、例えば、任意の非システインアミノ酸を指す。他の許容されるアミノ酸はまた、例えば括弧およびスラッシュを用いて表記することができる。例えば、「Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギンおよびグルタミンがその特定の位置において許容されることを意味する。
統計学的有意性は、任意の当技術分野に公知の方法によって決定され得る。例示的な統計学的な検定は、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーのＵノンパラメトリック検定およびウィルコクソンのノンパラメトリック検定を含む。ある統計学的に有意な関係は、０．０５もしくは０．０２未満のＰ値を持つ。特定の結合タンパク質は、例えば特異性もしくは結合において、統計的に有意（例えばＰ値＜０．０５もしくは０．０２）である差を示し得る。用語「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇する」、「増加する」、「減少する」などは、例えば二つの状態の間の、区別可能な定性的もしくは定量的な差を示し、そして二つの状態の間の差、例えば統計学的に有意な差を指し得る。
「治療的に有効な量」は、用量においておよび必要な期間において、所望の治療の結果を達成するのに十分な量を指す。組成物の治療的有効量は、個人の疾患の状態、年齢、性別および体重のような要因、ならびに個体において所望の応答を誘発するタンパク質の能力に従って変動し得る。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果が組成物の任意の毒性効果もしくは有害な効果を上回る量である。
「治療的に有効な用量」は、好ましくは疾患もしくは障害の測定可能なパラメータを調節する。例えば、治療的に有効な用量は、疾患もしくは障害の症状の度合いを、治療前の症状と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、そしてさらにより好ましくは約８０％低減できる。例えば疾患に関連するパラメータのような測定可能なパラメータを調節できる化合物の能力は、ヒトの障害および状態における有効性を予測する動物モデル系において評価できる。代替的に、組成物のこの性質は、インビトロのパラメータを調節する化合物の能力を試験することによって評価できる。
対象における疾患もしくは障害の「治療」（例えば疾患もしくは障害を持つかもしくは疾患もしくは障害を発症する危険性のある対象の「治療」を含む）は、例えば薬物投与のような薬品治療を対象に施して、疾患の少なくとも一つの症状が予防、治癒、緩和、減少することなどを指す。
「タンパク質のミスフォールディングもしくは凝集に関連する疾患」は、少なくとも部分的にはタンパク質の折りたたみプロセスにおける変化、もしくはタンパク質の折りたたみ構造の安定性の変化に起因して起こる疾患である。折りたたみプロセスにおける障害、凝集の増加、および天然タンパク質構造の脱安定化は、機能喪失型もしくは機能獲得型の病態を引き起こし得る。タンパク質のミスフォールディングもしくは凝集に関連する疾患は、全身性アミロイドーシス、クリオグロブリン血症、および鎌状赤血球症を含むがそれらには限定されない。タンパク質のミスフォールディングもしくは凝集に関連する神経性疾患は、ヤコブ‐クロイツフェルト病（プリオンタンパク質に関連する）、アルツハイマー病、家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）のような他のアミロイド疾患を含む。
Ｉ． 自己免疫疾患の診断および予後判定のアッセイにおけるバイオマーカーとしての切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）の使用
予期せずに、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような自己免疫疾患において切断型ＨＭＷＫの上昇した濃度が見出された。以下の実施例１を参照できる。したがって、切断型ＨＭＷＫは、自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＵＣおよびＣＤ）の診断、そのような自己免疫疾患の進行の監視、および疾患の治療効果の判定のための信頼できるバイオマーカーとしての役割を果たし得る。
したがって、患者の候補から取得された生物学的試料（例えば血漿試料）中の切断型ＨＭＷＫの濃度に基づく自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＵＣおよびＣＤ）の診断および予後判定の方法が本明細書に記載される。
高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、ウィリアムズ−フィッツジェラルド−Ｆｌａｕｊｅａｃ因子、フィッツジェラルド因子、ＨＭＷＫ−カリクレイン因子としてもまた知られ、血液凝固系ならびにキニン−カリクレイン系由来のタンパク質である。それは、インビボで血液と接触する生体材料表面に吸着するタンパク質である。高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、血漿中で、およそ１１０ｋＤａの分子量を持つ単一のポリペプチド（１本鎖）のマルチドメイン（ドメイン１〜６個）タンパク質として存在する。ＨＭＷＫは、ドメイン４中でｐＫａｌによって切断され、アミノ酸９個の炎症誘発性ペプチドであるブラジキニンと２本鎖型のＨＭＷＫ（切断型キニノーゲン）とを放出する。ＨＭＷＫの２つの鎖は、ＨＭＷＫのドメイン１〜３を含む重鎖、ならびにＨＭＷＫのドメイン５および６を持つ軽鎖である。重鎖および軽鎖は、それぞれ、およそ５６および４６キロダルトンの分子量を持つ。
ＨＭＷＫをコードするヒトの遺伝子は、キニノーゲン１（ＫＮＧ１）である。ＫＮＧ１は、転写され、そして選択的にスプライシングされて、ＨＭＷＫもしくは低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）のいずれかをコードするｍＲＮＡを形成する。ＨＭＷＫの例示的なタンパク質配列は以下に提供される：
＞ｇｉ｜１５６２３１０３７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０９５８８６．１｜ キニノーゲン−１アイソフォーム１前駆体［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＫＬＩＴＩＬＦＬＣＳＲＬＬＬＳＬＴＱＥＳＱＳＥＥＩＤＣＮＤＫＤＬＦＫＡＶＤＡＡＬＫＫＹＮＳＱＮＱＳＮＮＱＦＶＬＹＲＩＴＥＡＴＫＴＶＧＳＤＴＦＹＳＦＫＹＥＩＫＥＧＤＣＰＶＱＳＧＫＴＷＱＤＣＥＹＫＤＡＡＫＡＡＴＧＥＣＴＡＴＶＧＫＲＳＳＴＫＦＳＶＡＴＱＴＣＱＩＴＰＡＥＧＰＶＶＴＡＱＹＤＣＬＧＣＶＨＰＩＳＴＱＳＰＤＬＥＰＩＬＲＨＧＩＱＹＦＮＮＮＴＱＨＳＳＬＦＭＬＮＥＶＫＲＡＱＲＱＶＶＡＧＬＮＦＲＩＴＹＳＩＶＱＴＮＣＳＫＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫＳＬＷＮＧＤＴＧＥＣＴＤＮＡＹＩＤＩＱＬＲＩＡＳＦＳＱＮＣＤＩＹＰＧＫＤＦＶＱＰＰＴＫＩＣＶＧＣＰＲＤＩＰＴＮＳＰＥＬＥＥＴＬＴＨＴＩＴＫＬＮＡＥＮＮＡＴＦＹＦＫＩＤＮＶＫＫＡＲＶＱＶＶＡＧＫＫＹＦＩＤＦＶＡＲＥＴＴＣＳＫＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫＫＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥＩＫＥＥＴＴＶＳＰＰＨＴＳＭＡＰＡＱＤＥＥＲＤＳＧＫＥＱＧＨＴＲＲＨＤＷＧＨＥＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲＤＱＧＨＧＨＱＲＧＨＧＬＧＨＧＨＥＱＱＨＧＬＧＨＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨＶＬＤＨＧＨＫＨＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡＱＴＱＥＫＴＥＧＰＴＰＩＰＳＬＡＫＰＧＶＴＶＴＦＳＤＦＱＤＳＤＬＩＡＴＭＭＰＰＩＳＰＡＰＩＱＳＤＤＤＷＩＰＤＩＱＩＤＰＮＧＬＳＦＮＰＩＳＤＦＰＤＴＴＳＰＫＣＰＧＲＰＷＫＳＶＳＥＩＮＰＴＴＱＭＫＥＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列識別番号５）
無傷の高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、例えば、凝集法もしくは例えばラジオイムノアッセイのような免疫学的方法を用いてアッセイできる（例えばＫｅｒｂｉｒｉｏｕ−Ｎａｂｉａｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、１９８４、５６（２）：２７３４〜２７８６を参照できる）。ヒトＨＭＷＫの軽鎖に対するモノクローナル抗体は公知である（例えば、Ｒｅｄｄｉｇａｒｉ，Ｓ．Ｒ．およびＫａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９９、７４：６９５〜７０２を参照できる）。発色基質に基づいたＨＭＷＫのアッセイもまた使用できる（例えば、Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ、１９８７、４８（６）：６８５〜７００；Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．らＴｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ、２００４、１１４（２）：９１−９６を参照できる）。
切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、本明細書において「切断型キニノーゲン」とも呼ばれ、例えば、例えばウェスタンブロットのような実施例１に記載される方法を用いてアッセイできる。例えばマウスｍＡｂクローン１１Ｈ０５のような、切断型ＨＭＷＫに特異的に結合する抗体を使用できる。さらに、切断型ＨＭＷＫは、質量分析を用いて評価してもよい。切断型ＨＭＷＫの濃度を評価するためのイムノブロット技術は、当技術分野に公知である（例えば、Ｂｕｈｌｅｒ Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、１９９５、６（３）：２２３〜２３２を参照できる）。
切断型キニノーゲンの重鎖および軽鎖の例示的な配列は以下に提供される。
＞ 切断型キニノーゲン−１重鎖
ＱＥＳＱＳＥＥＩＤＣＮＤＫＤＬＦＫＡＶＤＡＡＬＫＫＹＮＳＱＮＱＳＮＮＱＦＶＬＹＲＩＴＥＡＴＫＴＶＧＳＤＴＦＹＳＦＫＹＥＩＫＥＧＤＣＰＶＱＳＧＫＴＷＱＤＣＥＹＫＤＡＡＫＡＡＴＧＥＣＴＡＴＶＧＫＲＳＳＴＫＦＳＶＡＴＱＴＣＱＩＴＰＡＥＧＰＶＶＴＡＱＹＤＣＬＧＣＶＨＰＩＳＴＱＳＰＤＬＥＰＩＬＲＨＧＩＱＹＦＮＮＮＴＱＨＳＳＬＦＭＬＮＥＶＫＲＡＱＲＱＶＶＡＧＬＮＦＲＩＴＹＳＩＶＱＴＮＣＳＫＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫＳＬＷＮＧＤＴＧＥＣＴＤＮＡＹＩＤＩＱＬＲＩＡＳＦＳＱＮＣＤＩＹＰＧＫＤＦＶＱＰＰＴＫＩＣＶＧＣＰＲＤＩＰＴＮＳＰＥＬＥＥＴＬＴＨＴＩＴＫＬＮＡＥＮＮＡＴＦＹＦＫＩＤＮＶＫＫＡＲＶＱＶＶＡＧＫＫＹＦＩＤＦＶＡＲＥＴＴＣＳＫＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫＫＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ （配列識別番号６）
＞ 切断型キニノーゲン−１軽鎖
ＳＳＲＩＧＥＩＫＥＥＴＴＶＳＰＰＨＴＳＭＡＰＡＱＤＥＥＲＤＳＧＫＥＱＧＨＴＲＲＨＤＷＧＨＥＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲＤＱＧＨＧＨＱＲＧＨＧＬＧＨＧＨＥＱＱＨＧＬＧＨＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨＶＬＤＨＧＨＫＨＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡＱＴＱＥＫＴＥＧＰＴＰＩＰＳＬＡＫＰＧＶＴＶＴＦＳＤＦＱＤＳＤＬＩＡＴＭＭＰＰＩＳＰＡＰＩＱＳＤＤＤＷＩＰＤＩＱＩＤＰＮＧＬＳＦＮＰＩＳＤＦＰＤＴＴＳＰＫＣＰＧＲＰＷＫＳＶＳＥＩＮＰＴＴＱＭＫＥＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ （配列識別番号７）
ある例において、無傷のＨＭＷＫおよび切断型ＨＭＷＫの濃度は、例えば、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ（登録商標）ウェスタンブロット解析のようなウェスタンブロット解析によって測定される。Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｕｓｔａｎｄｉら、「Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｍｏｎ（商標）， ａ ｎｅｗ ＣＥ−ｂａｓｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０１２、９月；３３（１７）：２７９０〜２７９７を参照できる）。Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）製品はまた、市販されている（例えば、カリフォルニア州のＳａｎｔａ ＣｌａｒａのＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標）を参照できる）。
本明細書に記載される診断および／もしくは予後判定の方法の任意のものを実施するために、切断型ＨＭＷＫの濃度を測定するための生物学的試料（例えば、血漿試料もしくは血清試料のような体液）が対象の候補（例えばヒトの患者の候補）より取得できる。対象は哺乳類であってよく、より好ましくはヒトであってよい。非ヒトの哺乳類は、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含むがそれらに限定されない。ヒトの対象は、例えばＲＡ、ＣＤもしくはＵＣのような本明細書に記載されるもののような自己免疫疾患を有する疑いのあるヒト患者であってよい。
対象より取得される生物学的試料は、組織もしくは流体の試料であってよい。流体試料の例は、唾液、血液、血漿、血清および尿を含むがそれらには限定されない。ある実施態様において、対象からの生物学的試料は、例えば血液試料のような白血球を含む。生物学的試料は、例えば静脈穿刺、生検もしくはスワッブのような当技術分野に公知の任意の方法を用いて取得できる。分析前に、インビトロでのＨＭＷＫの切断を阻害するためのプロテアーゼ阻害剤もしくはプロテアーゼ阻害剤カクテルを生物学的試料に添加できる。当技術分野に公知の任意のプロテアーゼ阻害剤が、本明細書に記載される方法において使用できる。
切断型ＨＭＷＫの濃度は、当技術分野に公知の任意の好適なアッセイによって測定できる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、ニューヨークを参照でき、マイクロアレイ技術はＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｒ．Ｍａｔｓｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００９、もしくはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、ニューヨークに記載される）。
ある実施態様において、試料中の切断型ＨＭＷＫタンパク質の濃度が測定される。切断型ＨＭＷＫタンパク質濃度を測定するアッセイは、イムノアッセイ（例えば、本明細書においてウェスタンブロット、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡアッセイのような免疫ベースのもしくはイムノベースのアッセイと呼ばれる）、質量分析、およびマルチプレックスビーズベースのアッセイを含むがそれらに限定されない。そのようなタンパク質濃度検出のためのアッセイは、当技術分野において公知である。
ある例において、切断型ＨＭＷＫの濃度は、本明細書に記載されるように、ＬｉＣｏｒ検出を含み得るウェスタンブロットアッセイによって測定される。他の例において、切断型ＨＭＷＫタンパク質の濃度は、切断型ＨＭＷＫに特異的に結合するか、または切断型ＨＭＷＫおよび非切断型ＨＭＷＫに特異的に結合する抗体のような結合パートナーを含み得る、免疫組織化学アッセイによって測定される。
タンパク質検出の結合パートナーは、当技術分野に公知の方法および本明細書に記載される方法を用いて設計され得る。ある実施態様において、例えば抗切断型ＨＭＷＫ抗体のような切断型ＨＭＷＫタンパク質結合パートナーは、ＨＭＷＫタンパク質のアミノ酸配列の一部分もしくはその全体に結合する。タンパク質の検出および定量方法の他の例は、例えば、米国特許第６，９３９，７２０号および米国特許第８，１４８，１７１号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０２５５７６６号に記載されるマルチプレックスイムノアッセイ、ならびに、例えば米国特許出願公開第２００９／００８８３２９号に記載されるようなタンパク質マイクロアレイを含む。切断型ＨＭＷＫ濃度を検出するために切断型ＨＭＷＫに対する任意の好適な結合パートナーが意図されている。ある実施態様において、結合パートナーは、ＨＭＷＫタンパク質もしくは切断型ＨＭＷＫタンパク質に特異的に結合する任意の分子である。そのような結合パートナーは、ＨＭＷＫの切断型（例えば切断型ＨＭＷＫ）に対して、非切断型ＨＭＷＫに対するその結合と比較してさらに高い親和性で結合することができる。ある例において、抗体のような結合パートナーは、ＨＭＷＫの切断型に対してのみ結合し得る。
本明細書に記載される方法において使用すべき抗体は、全長抗体、または、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖもしくはｄＡｂ断片のような、その抗原結合断片を含むがそれらに限定されない任意の形態であってよい。抗体の作成方法は当技術分野に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（第二版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｌｅｗｉｎ“Ｇｅｎｅｓ ＩＶ”， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９０）およびＲｏｉｔｔら“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第二版）、Ｇｏｗｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ロンドン、ニューヨーク（１９８９）、ＷＯ２００６／０４０１５３、ＷＯ２００６／１２２７８６およびＷＯ２００３／００２６０９を参照できる。また本明細書の記載を参照できる）。
他の実施態様において、切断型ＨＭＷＫの濃度を測定するのに使用される結合パートナーは、切断型ＨＭＷＫへと特異的に結合する、非抗体のペプチド分子もしくはアプタマーであってよい。ペプチド分子およびアプタマーを作成する方法はまた、当技術分野に公知である（例えば米国特許出願公開第２００９／００７５８３４号、米国特許第７４３５５４２号、米国特許第７８０７３５１号および米国特許第７２３９７４２号を参照できる）。
候補の対象から取得された生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度が決定されると、対象が、ＲＡ、ＣＤもしくはＵＣのような自己免疫疾患を有するか、それらの危険性を持つかまたはそれらを有する疑いがあるかを決定するために、それを対照の濃度と比較することができる。
ある実施態様において、対照の濃度は、好ましくは候補の対象と同じ種である健康な対象もしくは健康な対象の集団から取得された細胞、組織もしくは流体のような対照の試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度である。本明細書において使用されるとき、健康な対象は、ＨＭＷＫの濃度が測定されたときに標的の疾患（例えばＲＡ、ＣＤもしくはＵＣ）を明らかに有しないか、または疾患の病歴を有しない対象である。
ある実施態様において、対照の濃度は、標準的な検出方法（例えばウェスタンブロットもしくは免疫組織化学）を用いて検出不能であるか、または標準的な検出方法を用いて得られたバックグランド／ノイズレベルより低い切断型ＨＭＷＫの濃度である。好ましくは、標準的な検出方法は、候補対象の試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度を測定するのに用いられたのと同じ方法である。
対照の濃度は、既定の濃度であってもよい。そのような既定の濃度は、本明細書に記載されるような自己免疫疾患を持たないか、その危険性を持たない対象の集団における切断型ＨＭＷＫの濃度を表し得る。既定の濃度は、さまざまな形態をとり得る。例えば、それは、中央値または平均値などの単一のカットオフ値とすることができる。ある実施態様において、そのような既定の濃度は、標的の自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＵＣもしくはＣＤ）を持つことが知られている一つの定義された群と標的の自己免疫疾患を持たないことが知られている他の定義された群のような比較群に基づいて設定できる。代替的に、既定の濃度は、範囲、例えば、既定のパーセンタイル内の対照集団における切断型ＨＭＷＫの濃度を表す範囲であってよい。
既定の濃度は、選択された特定の集団によって決まり得る。例えば、明らかに健康である人（検出可能な疾患を持たない、またはＲＡ、ＣＤもしくはＵＣのような標的の自己免疫疾患の病歴を持たない）は、その構成員が標的の自己免疫疾患を持つかもしくはその危険性があるか、または寛解期であり得る集団とは異なる切断型ＨＭＷＫの「正常」範囲を持つであろう。したがって、選択される既定の濃度は、対象が入るカテゴリーを考慮に入れてもよい。当業者は、単なるルーチンの実験作業で適切な範囲およびカテゴリーを選択することができる。
本明細書に記載される対照の濃度は、通常の技術によって決定され得る。ある例において、対照の濃度は、本明細書に記載されるような対照の試料について従来の方法（例えば、本明細書に記載されるような試験試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度を得るのと同じアッセイ）を行うことによって得ることができる。他の例において、切断型ＨＭＷＫの濃度を、対照集団の構成員から得ることができ、そして結果を、例えばコンピュータープログラムによって分析することで、対照集団における切断型ＨＭＷＫの濃度を表す対照の濃度（既定の濃度）を得ることができる。
候補の対象から得られる試料の切断型ＨＭＷＫの濃度を、本明細書に記載される対照の濃度と比較することによって、候補の対象が、標的の自己免疫疾患を有するかまたはその危険性があるかについて決定することができる。例えば、候補の対象の切断型ＨＭＷＫの濃度が対照の濃度から外れる場合（例えば対照の濃度と比べて上昇するかまたは減少する）、候補の対象は標的の自己免疫疾患を有するかもしくはその危険性があると同定され得る。
本明細書で使用されるとき、「上昇した濃度、もしくは対照を超える濃度」は、切断型ＨＭＷＫの濃度が、既定の閾値もしくは対照試料における切断型ＨＭＷＫ濃度のような対照の濃度よりも高いことを意味する。対照の濃度は、より詳細に本明細書に記載される。切断型ＨＭＷＫの上昇した濃度は、例えば、対照の濃度を１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上超える切断型ＨＭＷＫの濃度を含む。切断型ＨＭＷＫの上昇した濃度はまた、ゼロの状態（例えば、対照中に切断型ＨＭＷＫが存在しないかもしくは検出不能）から非ゼロの状態（例えば、試料中にいくつか切断型ＨＭＷＫがあるかもしくは検出可能な切断型ＨＭＷＫがある）へと現象を増加させることを含む。
本明細書で使用されるとき、「減少した濃度もしくは対照を下回る濃度」は、切断型ＨＭＷＫの濃度が、既定の閾値もしくは対照試料における切断型ＨＭＷＫの濃度のような対照の濃度よりも低いことを意味する。対照の濃度は、より詳細に本明細書に記載される。切断型ＨＭＷＫの減少した濃度は、例えば、対照の濃度を１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上下回る切断型ＨＭＷＫの濃度を含む。切断型ＨＭＷＫの減少した濃度はまた、ある現象が、非ゼロの状態（例えば、試料中にいくつか切断型ＨＭＷＫがあるかもしくは検出可能な切断型ＨＭＷＫがある）からゼロの状態（例えば、対照中に切断型ＨＭＷＫが存在しないかもしくは検出不能）に減少することを含む。
ある実施態様において、高濃度（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％）の切断型ＨＭＷＫが、ＲＡ候補の患者から得た生物学的試料に観察される場合、その候補は、ＲＡ炎症を有するかもしくはその危険性があると診断される。中程度の濃度（例えば約１０〜３０％）の切断型ＨＭＷＫが、ＵＣもしくはＣＤ候補の患者から得た生物学的試料に観察される場合、その候補は、ＵＣもしくはＣＤを有するかもしくはその危険性があると診断される。
さらに、切断型ＨＭＷＫの濃度は、ＲＡ、ＵＣおよびＣＤのような自己免疫疾患の進行を監視するためのバイオマーカーとして使用できる。例えば、少なくとも二つの生物学的試料（例えば血清試料もしくは血漿試料）を、ＲＡ、ＵＣもしくはＣＤのような標的の自己免疫疾患を有するか、発症する危険性のあるヒトの対象より、異なる時点で取得できる。ある例において、第二の生物学的試料は、第一の生物学的試料が取得された後、少なくとも１ヶ月（例えば３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月もしくは１２ヶ月）目に取得できる。切断型ＨＭＷＫの濃度は少なくとも二つの生物学的試料において測定できる。切断型ＨＭＷＫの濃度が、時間と共に上昇する場合（例えば、後に取得された生物学的試料における切断型ＨＭＷＫの濃度が、先に取得された生物学的試料における濃度よりも、少なくとも２０％、５０％、７０％、９０％、１倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍もしくは１００倍高い）、対象において疾患が進行していること（例えば、対象において自己免疫疾患を発症する危険性がより高いこともしくは自己免疫疾患が悪化すること）を示す。
その上、切断型ＨＭＷＫの濃度は、例えば本明細書に記載されるもののような自己免疫疾患の治療に対する対象の応答性を判定するためのバイオマーカーとして使用できる。例えば、治療を施されているヒト患者から複数の生物学的試料を治療期間中に取得でき、そして本明細書に記載されるようなルーチン技術に従って切断型ＨＭＷＫの濃度を測定できる。治療を施されているヒト患者における切断型ＨＭＷＫの濃度が、治療期間にわたって、減少したままである場合（例えば、後に取得された生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度が、先に取得された生物学的試料中の濃度よりも、例えば少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍もしくは１００倍低い場合）、ヒト患者が治療に応答性であることを示す。一方で、切断型ＨＭＷＫの濃度が、治療期間にわたって実質的に同じままである場合（例えば、後に取得された生物学的試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度が、先に取得された生物学的試料中の濃度と実質的に同一であるか、またはそれと比べて２０％未満、例えば１５％、１０％もしくは５％未満減少している場合）、ヒト患者が治療に応答性でないことを示す。
本明細書に記載される方法のいずれかによって、対象が、自己免疫疾患（例えばＲＡ、ＵＣもしくはＣＤ）を有するか、もしくはその危険性があると同定されるとき、疾患を治療するために好適な治療を実施できる。ある例において、対象は一つもしくはそれ以上の、本明細書に記載されるｐＫａｌ阻害剤によって治療され得る。対象が、本明細書に記載される任意の方法によって治療に応答性でないと決定されるとき、より高用量および／もしくは投与回数の治療（例えばｐＫａｌ阻害剤）を対象に投与することができる。代替的に、対象を、異なる治療に切り替えることができる。一方で、治療に応答性であるかまたはさらなる治療を必要としないと同定された対象では、治療剤の用量もしくは投与回数を、維持、低減もしくは停止する。
ＩＩ． 自己免疫疾患の治療
本明細書にはまた、糖尿病性黄斑浮腫、網膜増殖、脳外傷、急性脊髄損傷、局所性アミロイド症、乾癬、多発性硬化症、炎症性大腸炎、関節リウマチ、脈管炎、全身性エリテマトーデス腎炎などの自己免疫疾患、全身性肥満細胞症、重症熱傷、および神経因性疼痛（糖尿病性およびヘルペス後神経痛）を含むがそれらには限定されない、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系に関連する疾患を治療するための方法が記載される。そのような方法は、治療の必要のある対象（例えば、該疾患を有するかまたは該疾患の危険性があるヒト患者）に、有効量の一つもしくはそれ以上のカリクレイン阻害剤を好適な経路で投与することを含む。
（Ａ） 血漿カリクレイン
それに対する血漿カリクレイン結合タンパク質が開発され得る例示的な血漿カリクレインの配列は、ヒト、マウスもしくはラットの血漿カリクレインアミノ酸配列、それらの配列の一つと、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列、もしくはそれらの断片、例えば以下に提供される配列の断片を含み得る。
結合タンパク質の選択およびその後のスクリーニングにおいて使用したヒト血漿カリクレインの配列を、以下に示す（受託番号ＮＰ＿０００８８３．２）。使用したヒト血漿カリクレイン（８６ｋＤａ）は、商用ベンダーがヒトの血漿から精製して、第ＸＩＩａ因子によって活性化したものである。第ＸＩＩａ因子は、単一の部位（Ａｒｇ３７１−Ｉｌｅ３７２の間、以下の配列中で「／」で示される切断部位）においてポリペプチド配列を切断することによってプレカリクレインを活性化して、およそ５２ｋＤａの重鎖とおよそ３４ｋＤａの触媒ドメインのジスルフィド結合された２個のポリペプチドからなる活性な血漿カリクレインを産生する（ＣｏｌｍａｎおよびＳｃｈｍａｉｅｒ（１９９７）“Ｃｏｎｔａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ Ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ， Ｐｒｏｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ， Ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ， ａｎｄ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ”Ｂｌｏｏｄ、９０、３８１９〜３８４３）。
ヒト、マウスおよびラットのプレカリクレインアミノ酸配列、それをコードするｍＲＮＡ配列を、以下に説明する。プレカリクレインの配列は、活性な血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）が単一の位置（「／」で示される）で切断されて２個の鎖を産生する単一のポリペプチド鎖を持つことを除いて血漿カリクレインと同一である。以下に提供される配列は、シグナル配列を含む完全な配列である。発現している細胞からの分泌の際、シグナル配列が除去されると予測される。
さまざまな種由来の例示的な血漿カリクレインタンパク質は、ＮＰ＿０００８８３．２（ヒトｐＫａｌタンパク質）、ＮＭ＿０００８９２（ヒトｐＫａｌ ｍＲＮＡ）、ＮＰ＿０３２４８１．１（マウスｐＫａｌタンパク質）、ＮＭ＿００８４５５．２（マウスｐＫａｌ ｍＲＮＡ）、ＮＰ＿０３６８５７．２（ラットｐＫａｌタンパク質）およびＮＭ＿０１２７２５（ラットｐＫａｌ ｍＲＮＡ）のアクセッション番号でＧｅｎｅＢａｎｋにおいて見いだされ得る。
（Ｂ）カリクレイン阻害剤
Ｋｕｎｉｔｚドメイン阻害剤。組織および／もしくは血漿のカリクレインのいずれのカリクレインにも有用な多数の阻害剤が、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む。例示的なＫｕｎｉｔｚドメイン阻害剤は、米国特許出願公開ＵＳ２０１００１８３６２５に記載され、本明細書での参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において使用されるとき、「Ｋｕｎｉｔｚドメイン」は、アミノ酸少なくとも５１個を持ち、少なくとも２個の、好ましくは３個のジスルフィドを含む、ポリペプチドドメインである。ドメインは、１番目と６番目のシステイン、２番目と４番目の、および３番目と５番目のシステインがジスルフィド結合を形成するように折りたたまれるか（例えば、アミノ酸５８個を持つＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、システインは、以下に提供されるＢＰＴＩ相同配列の付番に従って、５、１４、３０、３８、５１および５５番目のアミノ酸に対応する位置に存在することができ、そしてジスルフィドは、５番目と５５番目、１４番目と３８番目、および３０番目と５１番目の位置のシステイン間で形成できる。）、または２個のジスルフィド結合が存在する場合には、それらのシステインの対応するサブセット間でジスルフィド結合を形成することができるように、折りたたまれる。それぞれのシステイン間の間隔は、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の付番に従って、５番目から５５番目、１４番目から３８番目および３０番目から５１番目に対応する位置の間隔のアミノ酸７、５、４、３、２、１もしくは０個内であり得る。ＢＰＴＩ配列は、任意の一般的なＫｕｎｉｔｚドメイン中の具体的な位置を参照するための参照として使用できる。関心対象であるＫｕｎｉｔｚドメインとＢＰＴＩとの比較は、整列させたシステインの数が最大となる最適アラインメントを同定することによって実施される。
ＢＰＴＩのＫｕｎｉｔｚドメインの３Ｄ構造（高解像度）は公知である。Ｘ線構造の一つは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに「６ＰＴＩ」として寄託されている。いくつかのＢＰＴＩ相同体の３Ｄ構造（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（７）：５９１〜５９８；Ｈｙｎｅｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１００１８〜１００２２）が公知である。少なくとも８１個のＫｕｎｉｔｚドメイン配列が公知である。公知であるヒトの相同体は、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）としても知られるＬＡＣＩの３個のＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｗｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１〜６００４；Ｇｉｒａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８〜５２０；Ｎｏｖｏｔｎｙら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（３１）：１８８３２〜１８８３７）、インターαトリプシンンヒビターの２個のＫｕｎｉｔｚドメイン、ＡＰＰ−Ｉ（Ｋｉｄｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（３４）：１８１０４〜１８１０７）、コラーゲン由来のＫｕｎｉｔｚドメイン、ＴＦＰＩ−２の３個のＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：３３５３−３３５７）、肝細胞増殖因子活性化因子阻害剤タイプＩのＫｕｎｉｔｚドメイン、肝細胞増殖因子活性化因子阻害剤タイプＩＩのＫｕｎｉｔｚドメイン、米国特許公開第２００４−０１５２６３３に記載されるＫｕｎｉｔｚドメインを含む。ＬＡＣＩは、３個のＫｕｎｉｔｚドメインを含む分子量３９ｋＤａのヒト血清ホスホグリコタンパク質である。
上述のＫｕｎｉｔｚドメインは、ＬＡＣＩ−Ｋ１（５０〜１０７番目の残基）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（１２１〜１７８番目の残基）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（２１３〜２７０番目の残基）と呼ばれる。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列は、Ｗｕｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３（１３）：６００１〜６００４）により報告される。Ｇｉｒａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３３８：５１８〜５２０）は３個のＫｕｎｉｔｚドメインのそれぞれのＰ１残基が改変された変異研究を報告する。ＬＡＣＩ−Ｋ１は、第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）が組織因子と複合体を形成するとき、第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）を阻害し、ＬＡＣＩ−Ｋ２は第Ｘａ因子を阻害する。
例示的なＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質は、以下を含み、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号を括弧内に示す。
Ａ４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０５０６７）、Ａ４＿ＭＡＣＦＡ（Ｐ５３６０１）、Ａ４＿ＭＡＣＭＵ（Ｐ２９２１６）、Ａ４＿ＭＯＵＳＥ（Ｐ１２０２３）、Ａ４＿ＲＡＴ（Ｐ０８５９２）、Ａ４＿ＳＡＩＳＣ（Ｑ９５２４１）、ＡＭＢＰ＿ＰＬＥＰＬ（Ｐ３６９９２）、ＡＰＰ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０６４８１）、ＡＰＰ２＿ＲＡＴ（Ｐ１５９４３）、ＡＸＰ１＿ＡＮＴＡＦ（Ｐ８１５４７）、ＡＸＰ２＿ＡＮＴＡＦ（Ｐ８１５４８）、ＢＰＴ１＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７４）、ＢＰＴ２＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ０４８１５）、ＣＡ１７＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０２３８８）、ＣＡ３６＿ＣＨＩＣＫ（Ｐ１５９８９）、ＣＡ３６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１１１）、ＣＲＰＴ＿ＢＯＯＭＩ（Ｐ８１１６２）、ＥＬＡＣ＿ＭＡＣＥＵ（Ｏ６２８４５）、ＥＬＡＣ＿ＴＲＩＶＵ（Ｑ２９１４３）、ＥＰＰＩ＿ＨＵＭＡＮ（Ｏ９５９２５）、ＥＰＰＩ＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ９ＤＡ０１）、ＨＴＩＢ＿ＭＡＮＳＥ（Ｐ２６２２７）、ＩＢＰ＿ＣＡＲＣＲ（Ｐ００９９３）、ＩＢＰＣ＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７６）、ＩＢＰＩ＿ＴＡＣＴＲ（Ｐ１６０４４）、ＩＢＰＳ＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７５）、ＩＣＳ３＿ＢＯＭＭＯ（Ｐ０７４８１）、ＩＭＡＰ＿ＤＲＯＦＵ（Ｐ１１４２４）、ＩＰ５２＿ＡＮＥＳＵ（Ｐ１０２８０）、ＩＳＣ１＿ＢＯＭＭＯ（Ｐ１０８３１）、ＩＳＣ２＿ＢＯＭＭＯ（Ｐ１０８３２）、ＩＳＨ１＿ＳＴＯＨＥ（Ｐ３１７１３）、ＩＳＨ２＿ＳＴＯＨＥ（Ｐ８１１２９）、ＩＳＩＫ＿ＨＥＬＰＯ（Ｐ００９９４）、ＩＳＰ２＿ＧＡＬＭＥ（Ｐ８１９０６）、ＩＶＢ１＿ＢＵＮＦＡ（Ｐ２５６６０）、ＩＶＢ１＿ＢＵＮＭＵ（Ｐ００９８７）、ＩＶＢ１＿ＶＩＰＡＡ（Ｐ００９９１）、ＩＶＢ２＿ＢＵＮＭＵ（Ｐ００９８９）、ＩＶＢ２＿ＤＡＢＲＵ（Ｐ００９９０）、ＩＶＢ２＿ＨＥＭＨＡ（Ｐ００９８５）、ＩＶＢ２＿ＮＡＪＮＩ（Ｐ００９８６）、ＩＶＢ３＿ＶＩＰＡＡ（Ｐ００９９２）、ＩＶＢＢ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９８３）、ＩＶＢＣ＿ＮＡＪＮＡ（Ｐ１９８５９）、ＩＶＢＣ＿ＯＰＨＨＡ（Ｐ８２９６６）、ＩＶＢＥ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９８４）、ＩＶＢＩ＿ＤＥＮＡＮ（Ｐ００９８０）、ＩＶＢＩ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９７９）、ＩＶＢＫ＿ＤＥＮＡＮ（Ｐ００９８２）、ＩＶＢＫ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９８１）、ＩＶＢＴ＿ＥＲＩＭＡ（Ｐ２４５４１）、ＩＶＢＴ＿ＮＡＪＮＡ（Ｐ２０２２９）、ＭＣＰＩ＿ＭＥＬＣＰ（Ｐ８２９６８）、ＳＢＰＩ＿ＳＡＲＢＵ（Ｐ２６２２８）、ＳＰＴ３＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ４９２２３）、ＴＫＤ１＿ＢＯＶＩＮ（Ｑ２８２０１）、ＴＫＤ１＿ＳＨＥＥＰ（Ｑ２９４２８）、ＴＸＣＡ＿ＤＥＮＡＮ（Ｐ８１６５８）、ＵＰＴＩ＿ＰＩＧ（Ｑ２９１００）、ＡＭＢＰ＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７８）、ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２７６０）、ＡＭＢＰ＿ＭＥＲＵＮ（Ｑ６２５７７）、ＡＭＢＰ＿ＭＥＳＡＵ（Ｑ６０５５９）、ＡＭＢＰ＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ０７４５６）、ＡＭＢＰ＿ＰＩＧ（Ｐ０４３６６）、ＡＭＢＰ＿ＲＡＴ（Ｑ６４２４０）、ＩＡＴＲ＿ＨＯＲＳＥ（Ｐ０４３６５）、ＩＡＴＲ＿ＳＨＥＥＰ（Ｐ１３３７１）、ＳＰＴ１＿ＨＵＭＡＮ（Ｏ４３２７８）、ＳＰＴ１＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ９Ｒ０９７）、ＳＰＴ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｏ４３２９１）、ＳＰＴ２＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ９ＷＵ０３）、ＴＦＰ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ４８３０７）、ＴＦＰ２＿ＭＯＵＳＥ（Ｏ３５５３６）、ＴＦＰＩ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１０６４６）、ＴＦＰＩ＿ＭＡＣＭＵ（Ｑ２８８６４）、ＴＦＰＩ＿ＭＯＵＳＥ（Ｏ５４８１９）、ＴＦＰＩ＿ＲＡＢＩＴ（Ｐ１９７６１）、ＴＦＰＩ＿ＲＡＴ（Ｑ０２４４５）、ＹＮ８１＿ＣＡＥＥＬ（Ｑ０３６１０）
配列データベースからＫｕｎｉｔｚドメインを同定するためにさまざまな方法が使用できる。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインの公知のアミノ酸配列、コンセンサス配列もしくはモチーフ（例えばＰｒｏＳｉｔｅモチーフ）を、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベテスダ、ＭＤ）に対して、例えばＢＬＡＳＴを用いて；ＨＭＭ（隠れマルコフモデル）のＰｆａｍデータベースに対して、例えばＰｆａｍ検索に関するデフォルトパラメータを用いて；ＳＭＡＲＴデータベースに対して；もしくはＰｒｏＤｏｍデータベースに対して、検索できる。例えば、Ｐｆａｍリリース９のＰｆａｍアクセッション番号ＰＦ０００１４は、数多くのＫｕｎｉｔｚドメインおよびＫｕｎｉｔｚドメイン同定のためのＨＭＭを提供する。Ｐｆａｍデータベースの説明は、Ｓｏｎｈａｍｍｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８（３）：４０５〜４２０に見出すことができ、ＨＭＭの詳細な説明は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９９０）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６〜１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４３５５〜４３５８；Ｋｒｏｇｈら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１〜１５３１；およびＳｔｕｌｔｚら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：３０５〜３１４に見出すことができる。ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ＥＭＢＬ、ハイデルベルク、ＤＥ）は、Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５８５７およびＳｃｈｕｌｔｚら（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２８：２３１に記載される通りである。ＳＭＡＲＴデータベースは、ＨＭＭｅｒ２検索プログラム（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎら（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）の隠れマルコフモデルによるプロファイリングによって同定されるドメインを含む。データベースはまた、アノテートされ、モニターされる。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは、相同なドメインの自動編集物からなる（Ｃｏｒｐｅｔら（１９９９）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６３〜２６７）。ＰｒｏＤｏｍの現在のバージョンは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ３８およびＴＲＥＭＢＬタンパク質データベースの再帰的ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２；Ｇｏｕｚｙら（１９９９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３：３３３〜３４０）を用いて構築される。データベースはそれぞれのドメインのコンセンサス配列を自動的に生成する。Ｐｒｏｓｉｔｅは、モチーフとしてＫｕｎｉｔｚドメインを列挙し、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質を同定する。例えばＦａｌｑｕｅｔらＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：２３５〜２３８（２００２）を参照できる。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、主として２個のループ領域（「結合ループ」）中のアミノ酸を用いて目標のプロテアーゼと相互作用する。第一のループ領域は、ＢＰＴＩの１３〜２０番目のアミノ酸に対応するおよその残基の間にある。第二のループ領域は、ＢＰＴＩの３１〜３９番目のアミノ酸に対応するおよその残基の間にある。Ｋｕｎｉｔｚドメインの例示的なライブラリは、第一および／もしくは第二のループ領域中の一つもしくはそれ以上のアミノ酸の位置が変化する。カリクレインと相互作用するＫｕｎｉｔｚドメインに関してスクリーニングするとき、もしくは親和性が改善された変異体に関して選択するとき、変化するのに特に有用な位置は、ＢＰＴＩの配列に関して１３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９番目の位置を含む。これらの位置の少なくともいくつかは、標的のプロテアーゼに近接すると予測される。同様に他の位置、例えば、三次元構造において上述の位置に隣接する位置を変化させることも有用である。
Ｋｕｎｉｔｚドメインの「フレームワーク領域」は、Ｋｕｎｉｔｚドメインの一部であるが、第一および第二の結合ループ領域中の残基、すなわち、ＢＰＴＩの１３〜２０番目およびＢＰＴＩの３１〜３９番目のアミノ酸に対応するおよその残基、を明確に除く残基として定義される。逆に、結合ループ中に存在しない残基は、広範囲のアミノ酸置換を許容し得る（例えば、保存的および／もしくは非保存的置換）。
一実施態様において、これらのＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒトリポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ）タンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１を含むループ構造の変異体である。ＬＡＣＩは、３個の内部の明確なペプチドループ構造を含み、これは典型的なＫｕｎｉｔｚドメインである（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．ら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８〜５２０）。本明細書に記載される、ＬＡＣＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１の変異体は、スクリーンされ、単離されており、そして改善された親和性と特異性をもってカリクレインに結合する（例えば、米国特許第５，７９５，８６５号および米国特許第６，０５７，２８７号を参照できる）。これらの方法をまた、他のＫｕｎｉｔｚドメインフレームワークにも適用して、例えば血漿カリクレインのようなカリクレインと相互作用する他のＫｕｎｉｔｚドメインを得ることができる。カリクレインの機能の有用な調節剤は、カリクレイン結合および阻害アッセイを用いて決定した場合に、典型的にカリクレインに結合および／もしくはカリクレインを阻害する。
血漿カリクレインを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含む例示的なポリペプチドは、配列識別番号２の３〜６０番目のアミノ酸によって定義されるアミノ酸配列を持つかもしくは含む。血漿カリクレインを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含む他の例示的なポリペプチドは、配列識別番号２のアミノ酸配列を持つかもしくは含む。
例示的なポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８ （配列識別番号１）
を含む。
「Ｘａａ」は、数多くの異なるアミノ酸の任意のものであり得る、ペプチド鎖における位置をさす。第一の例において、Ｘａａは、システイン以外の任意のアミノ酸であり得る。他の例において、一つもしくはそれ以上の以下のものが適用される：Ｘａａ１０はＡｓｐもしくはＧｌｕであり得る；Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＡｌａもしくはＴｈｒであり得る；Ｘａａ１３は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＬｙｓもしくはＧｌｎであり得る；Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＡｓｎもしくはＧｌｎであり得る；Ｘａａ１６は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐもしくはＡｓｎであり得る；Ｘａａ１７は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、もしくはＴｈｒであり得る；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｎもしくはＡｌａであり得る；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＡｓｎもしくはＩｌｅであり得る；Ｘａａ２１は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＨｉｓもしくはＩｌｅであり得る；Ｘａａ３１は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅもしくはＴｈｒであり得る；Ｘａａ３２は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙもしくはＶａｌであり得る；Ｘａａ３４は、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＧｌｙもしくはＬｅｕであり得る；Ｘａａ３５は、Ｔｙｒ、ＴｒｐもしくはＰｈｅであり得る；Ｘａａ３９は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒもしくはＡｓｐであり得る。アミノ酸Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３およびＸａａ５４は任意のアミノ酸であり得る。
さらに、配列識別番号１のアミノ酸の最初の４個（Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４）および最後の３個（Ｘａａ５６、Ｘａａ５７もしくはＸａａ５８）の各々は、任意で存在してもしていなくてもよく、存在する場合には、任意のアミノ酸、例えば任意の非システインアミノ酸であり得る。
一実施態様において、ポリペプチドは、以下の性質の一つもしくはそれ以上を有する配列を持つ：
Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＶａｌであり得る；Ｘａａ１３は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、ＨｉｓもしくはＡｓｎであり得る；Ｘａａ１５は、ＡｒｇもしくはＬｙｓであり得る；Ｘａａ１６は、ＡｌａもしくはＧｌｙであり得る；Ｘａａ１７は、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＳｅｒもしくはＩｌｅであり得る；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓ、ＬｅｕもしくはＧｌｎであり得る；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏ、ＧｌｎもしくはＬｅｕであり得る；Ｘａａ２１は、ＴｒｐもしくはＰｈｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕである；Ｘａａ３２は、ＧｌｕもしくはＧｌｎであり得る；Ｘａａ３４は、Ｉｌｅ、ＴｈｒもしくはＳｅｒであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒである；ならびにＸａａ３９は、Ｇｌｕ、ＧｌｙもしくはＡｌａであり得る。
例示的なポリペプチドは、以下のアミノ酸を含み得る：
Ｘａａ１０は、Ａｓｐである；Ｘａａ１１は、Ａｓｐである； Ｘａａ１３は、ＰｒｏもしくはＡｒｇであり得る；Ｘａａ１５は、Ａｒｇである；Ｘａａ１６は、ＡｌａもしくはＧｌｙであり得る；Ｘａａ１７は、Ａｌａである；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓである；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏである；Ｘａａ２１は、Ｔｒｐである；Ｘａａ３１は、Ｇｌｕである；Ｘａａ３２は、Ｇｌｕである；Ｘａａ３４は、ＩｌｅもしくはＳｅｒであり得る；Ｘａａ３５は、Ｔｙｒである；ならびにＸａａ３９は、Ｇｌｙである。
本明細書に記載されるポリペプチドの部分を使用することもまた可能である。例えば、ポリペプチドは、特異的カリクレインエピトープの結合ドメインを含み得る。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインの結合ループを環化して単独で使用することができるか、または例えば他のＫｕｎｉｔｚドメインのフレームワークのような他のドメイン上に移植することができる。本明細書に記載されるアミノ酸配列のＮ末端から１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸を除去することもまた可能であり、ならびに／または本明細書に記載されるアミノ酸配列のＣ末端から１個、２個、３個４個もしくは５個のアミノ酸を除去することもまた可能である。
配列のさらなる例は、例えば上記に提供されるアミノ酸配列のような本明細書に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１個であるが、７個、６個、５個、４個、３個もしくは２個未満のアミノ酸が異なる配列を含む。一実施態様において、３個、２個もしくは１個未満の差異は、結合ループの一つに存在する。例えば、第一の結合ループは、例えば上記に提供されるアミノ酸配列のような本明細書に記載されるアミノ酸配列に対して差異を持たないものであり得る。他の実施態様において、第一および第二の結合ループのいずれも、例えば上に提供されるアミノ酸配列のような本明細書に記載されるアミノ酸配列と差異がない。
血漿カリクレインを阻害するさらに他のポリペプチドは、配列識別番号２の３〜６０番目のアミノ酸のアミノ酸約５８個の配列もしくは配列識別番号２のアミノ酸６０個の配列を持つＰＥＰ−１ポリペプチドを含む。本明細書において使用されるとき、用語「ＰＥＰ−１」および「ＤＸ−８８」の両方は、配列識別番号２のアミノ酸６０個の配列を指す。一実施態様において、該ポリペプチドは、アプロチニン以外であり、例えば、少なくとも１個、２個、３個、５個、１０個もしくは１５個のアミノ酸がアプロチニンと異なる。
本明細書において記載されるポリペプチドは、任意の標準的なポリペプチド合成プロトコールおよび機器を用いて合成により作製できる。例えば、ポリペプチドの段階的合成は、最初の（すなわちカルボキシ末端の）アミノ酸からのアミノ（Ｎ）末端保護基の除去、およびそこへの該ポリペプチドの配列の次のアミノ酸のカルボキシル末端のカップリングによって実施できる。アミノ酸はまた、好適に保護される。生じるアミノ酸のカルボキシル基を活性化させて、カルボジイミド、対称型酸無水物、または、ヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基の形成のような反応基の形成によって、結合アミノ基のＮ−末端と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法は、Ｉ−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを用いるＢＯＣ法、ならびにアミノ酸残基のアルファ−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を用いるＦＭＯＣ法を含む。いずれの方法も、当業者に周知である（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．、サンフランシスコ１９８９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．、１９６３．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１５４；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク１９８４））。所望なら、追加のアミノ−および／もしくはカルボキシ−末端アミノ酸を、該アミノ酸配列に含むよう設計し、ポリペプチド合成の際に追加できる。
ポリペプチドはまた、組換え技術を用いて産生できる。組換え法は、多くの細胞の任意のもの、ならびに細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、哺乳動物ウイルス発現ベクターなどを含むがそれらに限定されない対応する発現ベクターの任意のものを利用できる。本明細書に記載されるポリペプチドは、トランスジェニック動物によって、例えばトランスジェニック動物の乳腺中で産生できる。ある場合には、宿主細胞において容易に発現される融合ポリペプチドを形成するために、カリクレインを阻害するポリペプチド（例えばＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）をコードする配列と、発現ベクター中の他のコード配列とを融合する必要があるか、または融合することが有益であり得る。追加の配列の部分もしくは全ては、例えばプロテアーゼ消化によって除去できる。
カリクレインを阻害するポリペプチド（例えばＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）を産生する例示的な組換え発現システムは、阻害剤ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＡＴαプレプロリーダーペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と同じリーディングフレームで結合することができ、それにより機能的な酵母プロモーターの制御下となる酵母発現ベクターである。生じる組換え酵母発現プラスミドにより、適切な適合性の酵母宿主の細胞内を標準的な方法によって形質転換でき、該細胞は組換え酵母発現ベクターからの組換えタンパク質を発現することができる。好ましくは、そのような組換え発現ベクターによって形質転換される宿主酵母細胞はまた、融合タンパク質を処理して活性のある阻害剤ポリペプチドを提供できる。組換えポリペプチドを産生するための他の例示的な酵母宿主はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。
上述されるように、カリクレインを阻害するポリペプチドは、本明細書に記載されるＫｕｎｉｔｚドメインを含み得る。いくつかのポリペプチドは、好ましくは長さがアミノ酸１〜６個の追加の隣接配列を、アミノおよび／もしくはカルボキシの末端に含むことができるが、ただしそのような追加のアミノ酸は、本明細書に記載される方法および組成物において使用できなくなるほど、カリクレイン結合親和性もしくはカリクレイン阻害活性を著しく減少させない。そのような追加のアミノ酸は、特定の組換え宿主細胞においてポリペプチドを発現させるために意図的に追加できるか、または、追加の機能を提供するために、例えば他の分子とのリンカーを提供するためもしくはポリペプチドの精製を促進するための親和性部分を提供するために追加できる。好ましくは、追加のアミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメインのジスルフィド結合と干渉し得るシステインを含まない。
例示的なＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドは、配列識別番号２の３〜６０番目の残基のアミノ酸配列を含む。酵母融合タンパク質発現システムにおいて発現され、そしてプロセシングを受ける際に（例えば組み込む発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２に基づいて）、そのようなＫｕｎｉｔｚドメインポリペプチドは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＡＴα−プレプロリーダーペプチド配列との融合に由来する追加のアミノ末端Ｇｌｕ−Ａｌａ２ペプチドを保持する。酵母宿主細胞から分泌されるとき、リーダーペプチドのほとんどが融合タンパク質からプロセシングされて、配列識別番号２のアミノ酸配列を持つ機能的なポリペプチド（本明細書において「ＰＥＰ−１」と呼ぶ）を得る。
例えば配列識別番号１を含む典型的なＫｕｎｉｔｚドメインは、多くの不変の位置、例えば、ＢＰＴＩの付番規定で、５、１４、３０、３３、３８、４５、５１および５５番目の位置に対応する位置はシステインである。これらの位置の間の間隔は、例えば、３個のジスルフィド結合が形成されるように、Ｋｕｎｉｔｚドメインの折りたたみの中で許容できる範囲で変化し得る。例えば、６、７、８、９、２０、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４１、４２、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３および５４番目、または、これらの位置に対応する位置のような他の位置は、任意のアミノ酸（遺伝的にコードされて生じるものでないアミノ酸を含む）であり得る。特に好ましい実施態様において、一つもしくはそれ以上のアミノ酸は、天然の配列のものに対応する。他の実施態様において、少なくとも一つの可変の位置は、天然の配列のものとは異なる。さらに他の好ましい実施態様において、該アミノ酸はそれぞれ、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換によって個別にもしくは集合的に置換され得る。
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を類似の化学的性質の他のアミノ酸と置換し、そしてタンパク質の機能に影響を与えないことができる。非保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を非類似の化学的性質の他のアミノ酸と置換する。保存的アミノ酸の例は、例えば、Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ａｒｇ→ＬｙｓおよびＳｅｒ→Ｔｈｒを含む。好ましい実施態様において、これらのアミノ酸の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、および／もしくは２１個を、個別にもしくは集合的に、任意の組み合わせにおいて、配列識別番号２の対応する位置に対応するよう選択することができる。
例えば、１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３および４５番目の位置、もしくはそれらの位置に対応する位置のような他の位置は、アミノ酸の選択されたセットの任意のものであり得る。例えば、配列識別番号１は、可能性のある配列のセットを規定する。このセットのそれぞれの構成要素は、例えば、５、１４、３０、５１および５５番目の位置のシステイン、ならびに１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３および４５番目の位置またはこれらの位置に対応する位置のアミノ酸の特定のセットの任意のものを含む。好ましい実施態様において、これらのアミノ酸の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個および／もしくは１９個を、個別にもしくは集合的に、任意の組み合わせにおいて、配列識別番号２の対応する位置に対応するように選択することができる。該ポリペプチドは好ましくは、配列識別番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を持つ。
２つの配列の間の配列の比較および相同性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施態様において、２個のアミノ酸配列の相同性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスもしくはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５もしくは６の長さ重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたアルゴリズムであるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３を用いて決定される。さらに他の好ましい実施態様において、２個の核酸配列の間の相同性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびに４０、５０、６０、７０もしくは８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５もしくは６の長さ重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定される。特に好ましいパラメータのセット（および分子が相同性の限定範囲内にあるかを決定するために、どのパラメータを適用すべきかを実施者がわからない場合に使用すべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティおよび５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスである。
結合タンパク質阻害剤
他の実施態様において、カリクレインの阻害剤は、抗体のような結合タンパク質である。抗体のような例示的な結合タンパク質は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０９４５８７および米国特許出願公開ＵＳ２０１００１８３６２５に記載され、それらはいずれも、参照によりそのすべての内容において本明細書に組み入れられる。
一態様において、本開示は、血漿カリクレイン（例えば、ヒト血漿カリクレイン）に結合し、少なくとも一つのイムノグロブリン可変領域を含むタンパク質（例えば単離したタンパク質）を特徴とする。例えば、該タンパク質は、重鎖（ＨＣ）イムノグロブリン可変ドメイン配列および／もしくは軽鎖（ＬＣ）イムノグロブリン可変ドメイン配列を含む。該タンパク質は例えばヒト血漿カリクレインのような血漿カリクレインに結合して阻害することができる。
該タンパク質は、一つもしくはそれ以上の以下の性質を含み得る：（ａ）ヒトＣＤＲもしくはヒトフレームワーク領域、（ｂ）本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるＣＤＲを一つもしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）含む、ＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｃ）本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるＣＤＲを一つもしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）含む、ＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｄ）本明細書に記載されるＬＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域中もしくはＣＤＲ中）と、少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｅ）本明細書に記載されるＨＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域中もしくはＣＤＲ中）と、少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｆ）本明細書に記載されるタンパク質が結合するエピトープに結合するか、または本明細書に記載されるタンパク質と結合に関して競合する、タンパク質、（ｇ）霊長類ＣＤＲもしくは霊長類フレームワーク領域、（ｈ）本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲ１と少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個もしくは３個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ１を含むＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｉ）本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲ２から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ２を含むＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｊ）本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲ３から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個もしくは６個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ３を含むＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｋ）本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲ１から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個もしくは５個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ１を含むＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｌ）本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲ２から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個もしくは４個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ２を含むＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｍ）本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲ３から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個もしくは５個を超えるアミノ酸が異なることのないＣＤＲ３を含むＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、（ｎ）本明細書に記載されるＬＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域中もしくはＣＤＲ中）から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個を超えるアミノ酸が異なることのないＬＣイムノグロブリン可変ドメイン配列、ならびに（ｏ）本明細書に記載されるＨＣ可変ドメイン（例えば、全体またはフレームワーク領域中もしくはＣＤＲ中）から少なくとも１個のアミノ酸が異なるが、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個を超えるアミノ酸が異なることのないＨＣイムノグロブリン可変ドメイン配列。
血漿カリクレイン結合タンパク質は、単離したタンパク質（例えば他のタンパク質を少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％不含である）であってよい。血漿カリクレイン結合タンパク質は、例えばヒト血漿カリクレインのような血漿カリクレインを阻害できる。ある実施態様において、血漿カリクレインはプレカリクレイン（例えばヒトプレカリクレイン）には結合しないが、活性型の血漿カリクレイン（例えばヒト血漿カリクレイン）に結合する。
ある実施態様において、タンパク質は、血漿カリクレインもしくはその断片の触媒ドメインの活性部位もしくはその近辺に結合するか、または血漿カリクレインの活性部位と重なるエピトープに結合する。ある態様において、該タンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質と同じエピトープと結合するかまたは結合に関して競合する。
ある実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４と競合するかまたはそれらと同じエピトープと結合する。ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０９４５８７および米国特許出願公開ＵＳ２０１００１８３６２５を参照できる。
ある実施態様において、該タンパク質は血漿カリクレインの触媒三残基：Ｈｉｓ４３４、Ａｓｐ４８３および／もしくはＳｅｒ５７８（付番はヒトの配列に基づく）からの一つもしくはそれ以上のアミノ酸と結合する。
ある実施態様において、該タンパク質は、Ｓｅｒ４７９、Ｔｙｒ５６３および／もしくはＡｓｐ５８５の一つもしくはそれ以上に結合する（付番はヒトの配列に基づく）。
タンパク質は例えばヒト血漿カリクレインのような血漿カリクレインと、１０５ Ｍ−１、１０６ Ｍ−１、１０７ Ｍ−１、１０８ Ｍ−１、１０９ Ｍ−１、１０１０ Ｍ−１および１０１１ Ｍ−１の結合親和性で結合できる。ある実施態様において、該タンパク質は、ヒト血漿カリクレインと１×１０−３ ｓ−１、５×１０−４ ｓ−１もしくは１×１０−４ ｓ−１より遅いＫｏｆｆで結合する。ある実施態様において、該タンパク質は血漿カリクレインに結合するが、組織カリクレインおよび／もしくは血漿プレカリクレインには結合しない（例えば、該タンパク質は、血漿カリクレインに結合するよりも低い効率で組織カリクレインおよび／もしくは血漿プレカリクレインに結合する（例えば、陰性対照と比較して５倍、１０倍、５０倍、１００倍もしくは１０００倍低い効率で結合するかまたはまったく結合しない））。
ある実施態様において、該タンパク質はヒト血漿カリクレイン活性を、１０−５ Ｍ、１０−６ Ｍ、１０−７ Ｍ、１０−８ Ｍ、１０−９ Ｍ、および１０−１０ Ｍより低いＫｉで阻害する。該タンパク質は、例えば、１００ ｎＭ、１０ ｎＭもしくは１ ｎＭより低いＩＣ５０を持ち得る。例えば、該タンパク質は、血漿カリクレイン活性、ならびに（例えば第ＸＩＩ因子からの）活性化第ＸＩＩ因子の産生および／もしくは（例えば高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）からの）ブラジキニンの産生を調節できる。該タンパク質は、血漿カリクレイン活性、ならびに／または（例えば第ＸＩＩ因子からの）活性化第ＸＩＩ因子の産生および／もしくは（例えば高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）からの）ブラジキニンの産生を阻害できる。ヒト血漿カリクレインに対する該タンパク質の親和性は、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満のＫｄを特徴とすることができる。ある実施態様において、該タンパク質は血漿カリクレインを阻害するが組織カリクレインを阻害しない（例えば、該タンパク質は、血漿カリクレインを阻害するよりも低い効率で組織カリクレインを阻害する（例えば、陰性対照と比較して５倍、１０倍、５０倍、１００倍もしくは１０００倍低い効率で阻害するかまたはまったく阻害しない））。
ある実施態様において、該タンパク質は、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭもしくは１０ｎＭ未満の見かけの阻害定数（Ｋｉ，ａｐｐ）を持つ。
血漿カリクレイン結合タンパク質は抗体であってよい。血漿カリクレイン結合抗体では、単一のポリペプチド中（例えばｓｃＦｖ）もしくは異なるポリペプチド上（例えばＩｇＧもしくはＦａｂ）にそのＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列が含まれ得る。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される抗体の軽鎖および／もしくは重鎖を持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる重鎖の群の対応するＣＤＲより選択される重鎖ＣＤＲを一つもしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる軽鎖の群の対応するＣＤＲより選択される軽鎖ＣＤＲを一つもしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
好ましい実施態様において、該タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる軽鎖の群の対応するＣＤＲより選択される重鎖ＣＤＲを一つもしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）ならびに軽鎖ＣＤＲを一つもしくはそれ以上（例えば１個、２個もしくは３個）持つ抗体（例えばヒト抗体）である。
ある実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。他の実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。例えば、該タンパク質は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧである。該タンパク質は可溶性Ｆａｂであり得る。他の実施において、該タンパク質はＦａｂ２'、ｓｃＦｖ、ミニボディー、ｓｃＦｖ：：Ｆｃ融合体、Ｆａｂ：：ＨＳＡ融合体、ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合体、Ｆａｂ：：ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合体、もしくは、本明細書に記載される結合タンパク質の一つの抗原結合部位を含む他の分子を含む。これらのＦａｂのＶＨおよびＶＬ領域は、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ２'、ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ、ペグ化ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ２、ＶＨ：：ＣＨ１：：ＨＳＡ＋ＬＣ、ＨＳＡ：：ＶＨ：：ＣＨ１＋ＬＣ、ＬＣ：：ＨＳＡ＋ＶＨ：：ＣＨ１、ＨＳＡ：：ＬＣ＋ＶＨ：：ＣＨ１もしくは他の適切な構造として提供され得る。
一実施態様において、該タンパク質は、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、該タンパク質は、一つもしくはそれ以上のヒト抗体フレームワーク領域、例えば全てのヒトフレームワーク領域、またはヒトフレームワーク領域と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるフレームワーク領域を含む。一実施態様において、該タンパク質は、ヒトＦｃドメイン、またはヒトＦｃドメインと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。
一実施態様において、該タンパク質は霊長類もしくは霊長類化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、該タンパク質は、一つもしくはそれ以上の霊長類の抗体フレームワーク領域、例えば全ての霊長類のフレームワーク領域、または霊長類のフレームワーク領域と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるフレームワーク領域を含む。一実施態様において、該タンパク質は、霊長類のＦｃドメイン、または霊長類のＦｃドメインと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。「霊長類」は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓおよびＰａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ（ボノボ））、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）、テナガザル、サル、キツネザル、アイアイ（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）ならびにメガネザルを含む。
ある実施態様において、ヒト血漿カリクレインに対する霊長類の抗体の親和性は、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭもしくは１０ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満もしくは１ｎＭ未満のＫＤを特徴とする。
一実施態様において、該タンパク質は、ヒトフレームワーク領域、またはヒトフレームワーク領域と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるフレームワーク領域を含む。ある実施態様において、該タンパク質は、マウスもしくはウサギ由来の配列をまったく含まない（例えば、マウスもしくはウサギの抗体ではない）。
ある態様において、本開示は、血漿カリクレイン（例えばヒト血漿カリクレイン）に結合し、そして少なくとも一つのイムノグロブリン可変領域を含むタンパク質（例えば、例えば抗体のような結合タンパク質）（例えば本明細書に記載されるタンパク質）の、本明細書に記載される疾患もしくは障害を治療する方法における使用を提供する。例えば、血漿カリクレイン結合タンパク質は、重鎖（ＨＣ）イムノグロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）イムノグロブリン可変ドメイン配列を含む。多くの例示的な血漿カリクレイン結合タンパク質が本明細書に記載される。
抗体は、カリクレイン標的を用いてライブラリをスクリーニングすることによって、ならびに他の方法によって発見できる。例えば、カリクレインタンパク質もしくはそれらの領域を、例えばげっ歯動物のような非ヒトの動物における抗原として利用できる。ヒト化抗体は、抗原結合に直接的に関係しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域由来の同等の配列と置換することによって産生できる。ヒト化抗体を産生するための一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７によって、Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４によって、ならびにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号によって提供される。それらの方法は、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも一つからのイムノグロブリンＦｖ可変領域のすべてもしくは部分をコードする核酸配列の単離、操作および発現を含む。そのような核酸の数多くの源が使用可能である。例えば、核酸は、上述されるような所定の標的に対する抗体を産生しているハイブリドーマから取得できる。その後、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡ、もしくはその断片を、適切な発現ベクターへとクローニングできる。
イムノグロブリンカリクレイン結合タンパク質（例えば、ＩｇＧもしくはＦａｂのカリクレイン結合タンパク質）は、免疫原性を低減するために改変できる。免疫原性の低減は、治療薬としての使用を意図されているカリクレイン結合タンパク質にとって、対象が治療用分子に対して免疫応答を起こす可能性を減ずるために望ましい。カリクレイン結合タンパク質の免疫原性を低減するのに有用な技術は、潜在的ヒトＴ細胞エピトープの除去／改変およびＣＤＲ外の配列（例えばフレームワークおよびＦｃ）の「生殖細胞系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」を含む。
カリクレイン結合抗体は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示される方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特異的な除去もしくは「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」によって改変できる。要約すると、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、潜在的Ｔ細胞エピトープを示す（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において定義されるように）ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して分析する、。ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されるように、潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のために「ペプチドスレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と称するコンピュータモデリングアプローチを適用でき、さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフに関して検索できる。これらのモチーフは、１８個の主要なＭＨＣクラスＩＩＤＲアロタイプの任意のものに結合し、従って、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基の置換、好ましくは単一のアミノ酸置換によって、排除され得る。可能な保存的置換がなされる限り、しばしばヒト生殖細胞系列の抗体配列中の当該位置に共通のアミノ酸を使用してもよいがこれに限定されない。ヒト生殖細胞系列の配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａら、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ． Ｐ．ら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５） ２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら、１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２２７：７９９〜８１７に開示される。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒトイムノグロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ケンブリッジ、英国のＴｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．らによって編集される）。脱免疫化の変化を同定した後、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸を、変異導入もしくは他の合成方法（例えば新規合成、カセット交換など）によって構築することができる。変異導入された可変配列は、任意選択で、例えばＩｇＧ１もしくはκ定常領域のようなヒト定常領域へと融合できる。
ある場合、潜在的Ｔ細胞エピトープは、抗体の機能に重要であると知られているかもしくはそうであると予測される残基を含むであろう。例えば、潜在的Ｔ細胞エピトープは、通常、ＣＤＲに対してバイアスを有する。加えて、潜在的Ｔ細胞エピトープは、抗体の構造および結合にとって重要なフレームワーク残基中に存在し得る。これらの潜在的ピトープを排除するための改変は、場合によっては、例えば改変を持つ鎖および改変を持たない鎖の作製および試験のような、より多くの精査を必要とする。可能なら、ＣＤＲと重なり合う潜在的Ｔ細胞エピトープを、ＣＤＲ外での置換によって排除する。ある場合には、ＣＤＲ内の改変が唯一の選択肢であり、したがって、この置換のある変異体および置換のない変異体を試験すべきである。他の場合、潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するのに必要とされる置換が、抗体結合に重要であり得るフレームワーク内の残基位置に存在する。これらの場合には、この置換のある変異体および置換のない変異体を試験するべきである。したがって、ある場合、いくつかの変異体脱免疫化重鎖および軽鎖可変領域を設計して、最適な脱免疫化抗体を同定するために、さまざまな重鎖／軽鎖の組み合わせを試験した。最終的な脱免疫化抗体の選択は、脱免疫化の度合い、すなわち可変領域中に残された、潜在的Ｔ細胞エピトープの数と併せて、異なる変異体の結合親和性を考慮してなされる。脱免疫化は、任意の抗体、例えば、非ヒト配列を含む抗体、例えば、合成抗体、マウス抗体、他の非ヒトのモノクローナル抗体、もしくはディスプレイライブラリから単離された抗体を改変するのに利用できる。
カリクレイン結合抗体は、フレームワーク領域中の一つもしくはそれ以上の非生殖細胞系列のアミノ酸を、結合能が実質的に残される限り、抗体の対応する生殖系列のアミノ酸へと転換することによって「生殖細胞系列化」される。同様の方法はまた、例えばイムノグロブリン定常ドメインのような定常領域においても利用できる。
例えば本明細書に記載される抗体のようなカリクレインに結合する抗体は、一つもしくはそれ以上の生殖細胞系列の配列により類似する抗体の可変領域を作製するために改変できる。例えば、抗体は、基準となる生殖細胞系列の配列により類似となるように、例えば、フレームワーク、ＣＤＲもしくは定常領域において、１個、２個、３個もしくはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。一つの例示的な生殖細胞系列化の方法は、単離した抗体の配列に類似である（例えば特定のデータベースにおいてもっとも類似である）一つもしくはそれ以上の生殖細胞系列の配列を同定することを含み得る。次に、単離した抗体において、漸増的にもしくは他の変異と組み合わせて、変異（アミノ酸レベルでの）を作製する。例えば、部分のもしくは全ての可能性のある生殖細胞系列の変異をコードする配列を含む核酸ライブラリを作製する。次に、変異させた抗体を、例えば、単離した抗体と比べて一つもしくはそれ以上の追加の生殖細胞系列の残基を持つが、それでもなお有用である（例えば機能活性を持つ）抗体を同定するために評価する。一実施態様において、可能な限り多くの生殖細胞系列の残基が単離された抗体に導入される。
一実施態様において、変異導入を用いて、フレームワークおよび／もしくは定常領域において、一つもしくはそれ以上の生殖細胞系列の残基を、置換もしくは挿入する。例えば、生殖細胞系列のフレームワークおよび／もしくは定常領域の残基は、改変される非可変領域に類似する（例えば最も類似する）生殖細胞の配列由来であり得る。変異導入後、抗体の活性（例えば結合もしくは他の機能活性）を、生殖細胞系列の残基もしくは複数の残基が認容されるかどうかを判定するために評価することができる。同様の変異導入はフレームワーク領域において実施できる。
生殖細胞系列配列の選別は異なる方法によって実施できる。例えば、生殖細胞系列の配列は、選択性もしくは類似性についての所定の基準、例えば少なくとも特定のパーセントの同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の同一性を満たす場合に選択できる。選別は、少なくとも２個、３個、５個もしくは１０個の生殖細胞系列の配列を用いて実施できる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖細胞系列の配列の同定は、１個のそのような配列の選別を含み得る。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖細胞系列の配列の同定は、１個のそのような配列の選別を含み得るが、アミノ末端部分とカルボキシ末端部分とに別々に寄与する２個の生殖細胞系列の配列を用いることを含み得る。他の実施において、例えばコンセンサス配列を形成するために、１個もしくは２個より多い生殖細胞系列の配列が使用される。
一実施態様において、例えば本明細書に記載される配列のような特定の基準可変ドメイン配列に関して、関連する可変ドメイン配列は、基準ＣＤＲ配列における残基と同一ではないＣＤＲアミノ酸の位置を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％持ち、ヒト生殖細胞系列の配列（すなわちヒト生殖細胞系列の核酸においてコードされるアミノ酸配列）における対応する位置の残基と同一である残基を持つ。
一実施態様において、例えば本明細書に記載される配列のような特定の基準可変ドメイン配列に関して、関連する可変ドメイン配列は、例えば基準可変ドメイン配列に関連する生殖細胞系列の配列のようなヒト生殖細胞系列の配列由来のＦＲ配列と同一のＦＲ領域を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％持つ。
したがって、関心対象の所定の抗体と類似の活性を持つが、一つもしくはそれ以上の生殖細胞系列の配列、特に一つもしくはそれ以上のヒト生殖細胞系列の配列とより類似である抗体を単離することが可能である。例えば、抗体は、ＣＤＲの外側（例えばフレームワーク領域）において、生殖細胞系列の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％同一であり得る。さらに、抗体は、ＣＤＲ領域において、改変される可変領域に類似（例えば最も類似）の生殖細胞系列の配列由来である、少なくとも１個、２個、３個、４個もしくは５個の生殖細胞系列の残基を含み得る。最も関心がある生殖細胞系列の配列はヒト生殖細胞系列の配列である。抗体の活性（例えば、ＫＡによって測定される結合活性）は、元の抗体の等倍または１００倍、１０倍、５倍、２倍、０．５倍、０．１倍および０．００１倍の範囲内であり得る。
ヒトイムノグロブリン遺伝子の生殖細胞系列の配列は、決定されており、ワールドワイドウェブを通じてｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒにおいて入手可能なｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）、およびＶ ＢＡＳＥディレクトリ（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ケンブリッジ、英国のＴｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．らによって編集され、ワールドワイドウェブを通じてｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋにおいて入手可能である）を含む数多くの供給源より入手可能である。
Ｖｋａｐｐａの例示的な生殖細胞系列の基準の配列は：Ｏ１２／Ｏ２、Ｏ１８／Ｏ８、Ａ２０、Ａ３０、Ｌ１４、Ｌ１、Ｌ１５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５／Ｌ１９、Ｌ８、Ｌ２３、Ｌ９、Ｌ２４、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｏ１１／Ｏ１、Ａ１７、Ａ１、Ａ１８、Ａ２、Ａ１９／Ａ３、Ａ２３、Ａ２７、Ａ１１、Ｌ２／Ｌ１６、Ｌ６、Ｌ２０、Ｌ２５、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２６／Ａ１０およびＡ１４を含む。例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１８）：４６２８〜３を参照できる。
ＨＣ可変ドメインの生殖細胞系列基準配列は、例えばＨ１およびＨ２の超可変ループにおける１〜３個の構造のような特定の標準の構造を持つ配列に基づき得る。イムノグロブリン可変ドメインの超可変ループの標準の構造は、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１８）：４６２８〜３８に記載されるように、その配列から推測できる。１〜３個の構造を有する例示的な配列は：ＤＰ−１、ＤＰ−８、ＤＰ−１２、ＤＰ−２、ＤＰ−２５、ＤＰ−１５、ＤＰ−７、ＤＰ−４、ＤＰ−３１、ＤＰ−３２、ＤＰ−３３、ＤＰ−３５、ＤＰ−４０、７−２、ｈｖ３００５、ｈｖ３００５ｆ３、ＤＰ−４６、ＤＰ−４７、ＤＰ−５８、ＤＰ−４９、ＤＰ−５０、ＤＰ−５１、ＤＰ−５３およびＤＰ−５４を含む。
有用なポリペプチドはまた、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされ得る。該核酸は、中ストリンジェント、高ストリンジェント、もしくは非常に高いストリンジェントな条件においてハイブリダイズできる。本明細書において使用されるとき、用語「低ストリンジェント、中ストリンジェント、高ストリンジェントもしくは非常に高いストリンジェントな条件でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、参照により組み入れられるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６．に見出すことができる。水性および非水性の方法がその参考文献に記載され、いずれも使用することができる。本明細書に言及される具体的なハイブリダイゼーションの条件は、以下の：（１）約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の後に、少なくとも５０℃（低ストリンジェント条件において、洗浄温度は５５℃まで上昇させ得る）で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄を行う低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件、（２）約４５℃で６×ＳＳＣ中の後に、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う中ストリンジェントハイブリダイゼーション条件、（３）約４５℃で６×ＳＳＣ中の後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件であり、そして（４）非常に高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳの後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う。
タンパク質産生。標準的な組換え核酸法を用いて、血漿カリクレインに結合するタンパク質を発現させることができる。一般的に、該タンパク質をコードする核酸配列は、核酸発現ベクターへとクローニングされる。当然、タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、それぞれの鎖を、例えば同じもしくは異なるベクターのような、同じもしくは異なる細胞において発現される発現ベクターにおいてクローニングすることができる。
抗体産生。例えばＦａｂのようないくつかの抗体は、例えばＥ． ｃｏｌｉの細胞のような細菌の細胞において産生できる。例えば、Ｆａｂが、ディスプレイ部分とバクテリオファージタンパク質（もしくはその断片）との間に抑制可能なストップコドンを含むファージディスプレイベクター中の配列によってコードされる場合、ベクターの核酸は、ストップコドンを抑制できない細菌細胞中に移入できる。この場合、ＦａｂはｇｅｎｅＩＩＩタンパク質とは融合せず、ペリプラズムおよび／もしくは培地に分泌される。
抗体はまた、真核細胞においても産生できる。一実施態様において、抗体（例えばｓｃＦｖ）は、Ｐｉｃｈｉａ（例えばＰｏｗｅｒｓら、２００１、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３〜３５を参照）、Ｈａｎｓｅｕｌａ、もしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅのような酵母細胞中で発現される。
一つの好ましい実施態様において、抗体は、哺乳動物細胞において産生される。クローン抗体もしくはその抗原結合断片を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１〜６２１に記載されるようなＤＨＦＲ選別可能マーカーと共に用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６〜４２２０に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、例えばＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞のようなリンパ球細胞株、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４）２８９（１〜２）：６５〜８０）、および例えばトランスジェニック哺乳動物のようなトランスジェニック動物由来の細胞を含む。例えば該細胞は乳腺上皮細胞である。
多様化したイムノグロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選別可能なマーカー遺伝子の配列のような追加の配列を有し得る。選別可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選別を促進する（例えば米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号および米国特許第５，１７９，０１７号を参照できる）。例えば、典型的に、選別可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートのような薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選別可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選別／増幅によりｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用する）ならびにｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選別のため）を含む。
抗体もしくはその抗原結合部分の組換え発現のための例示的なシステムにおいて、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内において、抗体重鎖および抗体軽鎖の遺伝子は、遺伝子の高レベルの転写を推進するために、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントもしくはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントのようなＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来するもの）へとそれぞれ作動可能に結合される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサート選別／増幅を用いてベクターがトランスフェクトされているＣＨＯ細胞の選別を可能にするためのＤＨＦＲ遺伝子も有する。選別された形質転換体宿主細胞を、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするよう培養して、そして完全な抗体を培地より回収する。標準的な分子生物学の技法が、組換え発現ベクターの調製、宿主細胞のトランスフェクト、形質転換体の選別、宿主細胞の培養および培養培地からの抗体の回収のために使用される。例えば、ある抗体は、プロテインＡもしくはプロテインＧ結合マトリクスを持つアフィニティークロマトグラフィーによって単離される。
Ｆｃドメインを含む抗体において、抗体産生システムは、Ｆｃ領域がグリコシル化された抗体を産生できる。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメインの２９７番目のアスパラギンにおいてグリコシル化される。このアスパラギンは、２分岐型オリゴ糖による修飾の部位である。このグリコシル化がＦｃｇ受容体と補体Ｃ１ｑとによって媒介されるエフェクター機能に必要とされることは実証されている（ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ、１９９２、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５１：１〜８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １６３：５９〜７６）。一実施態様において、Ｆｃドメインは、２９７番目のアスパラギンに対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現システムにおいて産生される。Ｆｃドメインはまた、他の真核細胞翻訳後修飾を含み得る。
抗体はまた、トランスジェニック動物において産生できる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現する方法を記載する。乳汁特異的プロモーターおよび関心対象抗体をコードする核酸、ならびに分泌のためのシグナル配列を含むトランスジーンを構築する。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生される乳汁は、その中に分泌される関心対象抗体を含む。該抗体を乳汁より精製することができるかまたは、ある用途においては、直接使用することができる。
（Ｃ）修飾
カリクレインを阻害するポリペプチドをさまざまな方法で修飾することが可能である。例えば、化合物を安定化するかまたは、保持時間を、例えば少なくとも２倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍延長するために、ポリペプチドを一つもしくはそれ以上のポリエチレングリコール部分に結合させることができる。
一実施態様において、カリクレイン結合タンパク質を、循環中で、例えば、血液、血清、リンパ中で、もしくは他の組織においてその安定化および／もしくは保持を、例えば少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍もしくは５０倍向上させる部分と物理的に結合させる。例えば、カリクレイン結合タンパク質を、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドもしくはポリエチレンオキシドのような実質的に非抗原性のポリマーのようなポリマーに結合させることができる。好適なポリマーは、実質的に重量に応じて変動するであろう。約２００から約３５，０００（または約１，０００から約１５，０００および２，０００から約１２，５００）の範囲の数平均分子量を持つポリマーを使用できる。例えば、カリクレイン結合タンパク質を、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンに結合させることができる。複数のポリマー部分、例えば２，０００から７，０００ダルトンの平均分子量を持つ、例えば少なくとも２個、３個もしくは４個のそのような部分を、一つのポリペプチドに結合させることができる。そのようなポリマーの非限定的列挙は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマー、およびブロックコポリマーの水溶性が維持される限り、それらのブロックコポリマーを含む。
例えば、ポリペプチドを、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンに結合させることができる。そのようなポリマーの非限定的列挙は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマー、およびブロックコポリマーの水溶性が維持される限り、それらのブロックコポリマーを含む。さらなる有用なポリマーは、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）のブロックコポリマーのようなポリオキシアルキレン；ポリメタクリラート；カルボマー；乳糖、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミラーゼ、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、もしくは例えばヒアルロン酸のような酸ムコ多糖類の多糖類サブユニットのようなホモ多糖およびヘテロ多糖などの、糖単量体であるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸、もしくはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分岐もしくは非分岐の多糖類；ポリソルビトールおよびポリマンニトールのような糖アルコールのポリマー；ヘパリンもしくはヘパランを含む。
結合タンパク質の一つもしくはそれ以上のフレームワークおよび／もしくはＣＤＲアミノ酸残基が、本明細書に記載される結合タンパク質と比べて一つもしくはそれ以上の変異（例えば置換（例えば、保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）、挿入もしくは欠失）を含むことは可能である。血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質と比べて、変異（例えば置換（例えば、保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）、挿入もしくは欠失）（例えば少なくとも１個、２個、３個、もしくは５個の、ならびに／または１５個、１２個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個もしくは２個未満の、変異）、例えばタンパク質の機能に実質的な影響を与えない変異を有し得る。変異はフレームワーク領域、ＣＤＲおよび／もしくは定常領域に存在し得る。ある実施態様において、変異は、フレームワーク領域に存在する。ある実施態様において、変異はＣＤＲに存在する。ある実施態様において、変異は、定常領域に存在する。特定の置換が認容されるかどうか、すなわち、結合活性のような生物学的特性に負の影響を与えないことは、例えば、変異が保存的であるか評価することによってもしくはＢｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６〜１３１０の方法によって予想できる。
カリクレイン結合タンパク質はまた、例えばヒト血清アルブミンのような血清アルブミンのような担体タンパク質と結合できる。例えば、担体タンパク質とカリクレイン結合タンパク質とを結合するのにタンパク質融合が利用できる。
（Ｄ）カリクレイン系に関連する自己免疫疾患の治療
本明細書に記載されるｐＫａｌ阻害剤の一つもしくはそれ以上を、糖尿病性黄斑浮腫、網膜増殖、脳外傷、急性脊髄損傷、局所性アミロイド症、乾癬、多発性硬化症、炎症性大腸炎、関節リウマチ、脈管炎、全身性エリテマトーデス腎炎などの自己免疫疾患、全身性肥満細胞症、重症熱傷、および神経因性疼痛（糖尿病およびヘルペス後神経痛）を含むがそれらに限定されないｐＫａｌ系に関連する疾患の治療のために使用できる。
本明細書に記載される自己免疫疾患もしくは他のｐＫａｌ関連疾患を発症する危険性のある対象（例えばヒト患者）は、例えば、当該疾患の発症に関連する疾患を有する対象、当該疾患の発症に関連する環境因子に曝されている対象、当該疾患の家族の既往を持つ対象、もしくは当該疾患の発症に関連する遺伝子を持つ対象であり得る。
対象は、自己免疫疾患もしくは他のｐＫａｌ関連疾患の一つの治療を必要とするヒト（例えば疾患を有するかもしくは疾患を発症する危険性のあるヒト）または非ヒトの対象（例えば自己免疫疾患もしくは他のｐＫａｌ関連疾患の一つの動物モデル）であり得る。
ある実施態様において、対象は、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病（ＣＤ）もしくは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような自己免疫疾患を発症する危険性のある対象（例えばヒト患者）である。自己免疫疾患は、対象自身の身体に対する異常な免疫応答によって引き起こされる疾患である。異常な免疫応答は、自己免疫疾患の型に応じて、特定の器官もしくは組織に対するものであり得る。
ＲＡは、概して、手および／もしくは足の滑膜関節のような関節に影響を与える慢性炎症性疾患である。ＲＡにおける炎症反応はしばしば軟骨の破壊および関節の癒合を引き起こし、機能および可動性の喪失を生じる。ＲＡの症状は、腫脹したおよび／もしくは熱を持つ関節、こわばり、リウマチ結節、疲労、発熱、ならびに体重減少を含む。ＲＡの例示的な治療は、理学療法、整形術、鎮痛薬、抗炎症薬、ステロイド、および疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を含む。
ＣＤは、胃腸管の任意の部分に影響を与え得る炎症性腸疾患である。症状には、腹痛、下痢、発熱、倦怠感および体重減少が含まれる。ＣＤのための例示的な治療は、コルチコステロイド、５−アミノサリチル酸薬、アザチオプリン、メトトレキサート、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ナタリズマブ、食事の調整、および外科手術を含む。
ＵＣは、概して大腸に影響を与える炎症性腸疾患である。症状は血液性下痢および／もしくは粘液含有下痢、体重減少、貧血、腹痛、ならびに直腸内出血を含む。ＵＣの例示的な治療は、５−アミノサリチル酸薬、コルチコステロイド、アザチオプリン、ブデソニド、インフリキシマブ、アダリムマブ、および外科手術を含む。
（Ｅ）併用療法
血漿カリクレイン阻害剤は、本明細書に記載される疾患もしくは障害のために、併用療法の一部として他の治療剤と共に投与できる。
カリクレイン阻害剤と他の治療剤との併用療法は、複数の異なる形態で提供され得る。カリクレイン阻害剤が関節内注射として投与される状況において、カリクレイン阻害剤と治療剤とは単一の組成物として同時投与でき、またはそれらは別々の注射によって投与できる。ある状況において、カリクレイン阻害剤と治療剤とは、時間的に近接して（例えば、同一の治療セッションのあいだのような短い時間間隔で）投与されるか、または、併用療法の２つの成分の望ましい投与スケジュールに応じて、より広い間隔をあけて投与される。カリクレイン阻害剤が、全身（経口）投与されるとき、カリクレイン阻害剤と治療剤とは、併用療法の２つの成分のための意図される投与スケジュールに応じて、時間的に近接して、もしくはより広い間隔において投与され得る。
他の実施態様において、カリクレイン阻害剤は、自己免疫疾患に含まれる炎症の治療もしくは防御のために有用な他の化合物と併用して投与され得る。例示的な抗炎症剤は、例えば、ステロイド（例えば、コルチゾール、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、６［α］−メチルプレドニゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾンまたはデキサメタゾン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ（例えば、アスピリン、アセトアミノフェン、トルメチン、イブプロフェン、メフェナム酸、ピロキシカム、ナブメトン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクもしくはニメスリド））を含む。他の実施態様において、他の治療剤は、抗生剤（例えば、バンコマイシン、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、リファンピンメトロニダゾール、ドキシサイクリンもしくはストレプトマイシン）である。他の実施態様において、他の治療剤は、ＰＤＥ４阻害剤（例えば、ロフルミラストもしくはロリプラム）である。他の実施態様において、他の治療剤は、抗ヒスタミン薬（例えばシクリジン、ヒドロキシジン、プロメタジンもしくはジフェンヒドラミン）である。
抗炎症剤のさらなる例は、例えば、アセクロフェナク、アセメタシン、ｅ−アセトアミドカプロン酸、アセトアミノフェン、アセトアミノサロール、アセトアニリド、アセチルサリチル酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、アルクロフェナク、アルクロメタゾン、アルフェンタニル、アルゲストン、アリルプロジン、アルミノプロフェン、アロキシピリン、アルファプロジン、アルミニウムビス（アセチルサリチル酸）、アムシノニド、アンフェナク、アミノクロルテノキサジン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、２−アミノ−４−ピコリン、アミノプロピロン、アミノピリン、アミキセトリン、サリチル酸アンモニウム、アムピロキシカム、アムトルメチングアシル、アニレリジン、アンチピリン、アントラフェニン、アパゾン、ベクロメタゾン、ベンダザック、ベノリラート、ベノキサプロフェン、ベンズピペリロン、ベンジダミン、ベンジルモルフィン、ベルモプロフェン、ベタメタゾン、ベタメタゾン−１７−吉草酸、ベジトラミド、［α］−ビサボロール、ブロムフェナク、ｐ−ブロモアセトアニリド、５−ブロモサリチル酸アセタート、ブロモサリゲニン、ブセチン、ブクロクス酸、ブコローム、ブデソニド、ブフェキサマク、ブマジゾン、ブプレノルフィン、ブタセチン、ブチブフェン、ブトルファノール、カルバマゼピン、カルビフェン、カルプロフェン、カルサラム、クロロブタノール、クロロプレドニゾン、クロルテノキサジン、サリチル酸コリン、シンコフェン、シンメタシン、シラマドール、クリダナク、クロベタゾール、クロコルトロン、クロメタシン、クロニタゼン、クロニキシン、クロピラク、クロプレドノール、クローブ、コデイン、コデイン臭化メチル、リン酸コデイン、硫酸コデイン、コルチゾン、コルチバゾール、クロプロパミド、クロテタミドおよびシクラゾシンを含む。
抗炎症剤のさらなる例は、デフラザコート、デヒドロテストステロン、デソモルヒネ、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、デキサメタゾン−２１−イソニコチン酸、デキソキサドロール、デキストロモラミド、デキストロプロポキシフェン、デオキシコルチコステロン、デゾシン、ジアムプロミド、ジアモルフォン、ジクロフェナク、ジフェナミゾール、ジフェンピラミド、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジヒドロコデイン、ジヒドロコデインノンエノールアセタート、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロキシアルミニウムアセチルサリチラート、ジメノキサドール、ジメフェプタノール、ジメチルチアムブテン、ジオキサフェチルブチラート、ジピパノン、ジプロセチル、ジピロン、ジタゾール、ドロキシカム、エモルファゾン、エンフェナム酸、エノキソロン、エピリゾール、エプタゾシン、エテルサラート、エテンザミド、エトヘプタジン、エトキサゼン、エチルメチルチアンブテン、エチルモルヒネ、エトドラク、エトフェナマート、エトニタゼン、オイゲノール、フェルビナク、フェンブフェン、フェンクロジン酸、フェンドザール、フェノプロフェン、フェンタニル、フェンチアザク、フェプラジノール、フェプラゾン、フロクタフェニン、フルアザコート、フルクロロニド、フルフェナム酸、フルメタゾン、フルニソリド、フルニキシン、フルノキサプロフェン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオレゾン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルピルチン、フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルプロクアゾン、フルランドレノリド、フルルビプロフェン、フルチカゾン、ホルモコータルおよびフォスフォサルを含む。
抗炎症剤のさらなる例は、ゲンチシン酸、グラフェニン、グルカメタシン、サリチル酸グリコール、グアイアズレン、ハルシノニド、ハロベタゾール、ハロメタゾン、ハロプレドノン（ｈａｌｏｐｒｅｄｎｏｎｅ）、ヘロイン、ヒドロコドン、ヒドロコルタマート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンヘミスクシナート、ヒドロコルチゾン２１−リジナート、ヒドロコルチゾンシピオナート、ヒドロモルフォン、ヒドロキシペチジン、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロキサム、イミダゾールサリチル酸、インドメタシン、インドプロフェン、イソフェゾラック、イソフルプレドン、酢酸イソフルプレドン、イソラドール（ｉｓｏｌａｄｏｌ）、イソメタドン、イソニキシン、イソキセパック、イソキシカム、ケトベミドン、ケトプロフェン、ケトロラク、ｐ−ラクトフェネチド、レフェタミン、レバロルファン、レボルファノール、レボフェナシル−モルファン（ｌｅｖｏｐｈｅｎａｃｙｌ−ｍｏｒｐｈａｎ）、ロフェンタニル、ロナゾラク、ロルノキシカム、ロキソプロフェン、アセチルサリチル酸リジン、マジプレドン、メクロフェナム酸、メドリゾン、メフェナム酸、メロキシカム、メペリジン、メプレドニゾン、メプタジノール、メサラミン、メタゾシン、メタドン、メトトリメプラジン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、メチルプレドニゾロンスレプトナート（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ ｓｕｌｅｐｔｎａｔｅ）、メチアジン酸、メトホリン、メトポン、モフェブタゾン、モフェゾラク、モメタゾン、モラゾン、モルヒネ、塩酸モルヒネ、硫酸モルヒネ、サリチル酸モルホリンおよびミロフィンを含む。
抗炎症剤のさらなる例は、ナブメトン、ナルブフィン、ナロルフィン、サリチル酸１−ナフチル、ナプロキセン、ナルセイン、ネフォパム、ニコモルフィン、ニフェナゾン、ニフルム酸、ニメスリド、５'−ニトロ−２'−プロポキシアセトアニリド、ノルレボルファノール、ノルメタドン、ノルモルフィン、ノルピパノン、オルサラジン、アヘン、オキサセプロール、オキサメタシン、オキサプロジン、オキシコドン、オキシモルフォン、オキシフェンブタゾン、パパベレタム、パラメタゾン、パラニリン、パルサルミド、ペンタゾシン、ペリソキサール、フェナセチン、フェナドキソン、フェナゾシン、フェナゾピリジン塩酸塩、フェノコール、フェノペリジン、フェノピラゾン、フェノモルファン、アセチルサリチル酸フェニル、フェニルブタゾン、サリチル酸フェニル、フェニラミドール、ピケトプロフェン、ピミノジン、ピペブゾン、ピペリロン（ｐｉｐｅｒｙｌｏｎｅ）、ピラゾラク（ｐｉｒａｚｏｌａｃ）、ピリトラミド、ピロキシカム、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン（ｐｒｅｄｎｙｌｉｄｅｎｅ）、プログルメタシン、プロヘプタジン、プロメドール、プロパセタモール、プロペリジン、プロピラム、プロポキシフェン、プロピフェナゾン、プロクアゾン、プロチジン酸、プロキサゾール、ラミフェナゾン、レミフェンタニル、リマゾリウムメチルスルファート（Ｒｉｍａｚｏｌｉｕｍ Ｍｅｔｉｌｓｕｌｆａｔｅ）、サラセタミド（ｓａｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、サリシン、サリチルアミド、サリチルアミド−Ｏ−酢酸、サリチル酸、サリチル硫酸、サルサラート、サルベリン（ｓａｌｖｅｒｉｎｅ）、シメトリド、スフェンタニル、スルファサラジン、スリンダク、スーパーオキシドジスムターゼ、スプロフェン、スキシブゾン、タルニフルマート、テニダップ、テノキシカム、テロフェナマート、テトランドリン、チアゾリノブタゾン、チアプロフェン酸、チアラミド、チリジン、チノリジン、チキソコルトール（ｔｉｘｏｃｏｒｔｏｌ）、トルフェナム酸、トルメチン、トラマドール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トロペシン、ビミノール、キセンブシン（ｘｅｎｂｕｃｉｎ）、キシモプロフェン、ザルトプロフェンおよびゾメピラクを含む。
（Ｆ） 投与
患者は該してヒトであるが、非ヒトの哺乳動物であってもよい。ヒト患者は、例えば年齢１９〜２５、２６〜４０、４１〜５５、５６〜７５歳の間、および７６歳ならびにそれ以上の患者のような成人、例えば年齢０〜２、３〜６、７〜１２および１３〜１８歳の間の患者のような小児患者を含む。
用語「医薬的に許容可能な」組成物は、本明細書に記載されるカリクレイン阻害剤と共に患者に投与できる非毒性の担体もしくは賦形剤を指す。担体もしくは賦形剤は、組成物の生物活性もしくは薬理活性と適合するように選択される。本明細書に記載されるカリクレイン阻害剤（および、併用療法の場合には他の治療剤）は、阻害剤および／もしくは他の治療剤の阻害量を患者に送達するための、例えば静脈内および吸入のような全身的投与を含むがそれらに限定されない任意の好適な手段によって局所的にもしくは全身的に投与できる。
非経口投与する場合、カリクレイン阻害剤は、静脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下へ注射できる。皮下注射および静脈内投与は、非経口投与のための好ましい経路である。局所（関節内）注射もまた有用である。
典型的に、注射による投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム／カリウム緩衝生理食塩水）中の溶液である。他の医薬的に許容可能な担体は、滅菌水、生理食塩水溶液および緩衝生理食塩水（リン酸塩もしくは酢酸塩のような緩衝液を含む）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン等を含むがそれらに限定されない。必要なら、該組成物はまた、可溶化剤、注射部位における痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、塩、潤滑剤等を、それらが、活性成分に有害に反応しない限り含むことができる。同様に、該組成物は、例えば、活性成分に有害に反応しない、非経口、経腸もしくは鼻腔内投与に好適な医薬的に許容可能な有機もしくは無機の担体物質のような標準的な賦形剤を含むことができる。概して、成分は、例えば、活性単位で活性剤の量を示すアンプル、小袋、もしくはバイアルなどの密封容器中の凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、単位剤形において、別々でもしくは一緒に混合されてのいずれかで供給されるであろう。該組成物が点滴により投与されるとき、それは、滅菌された医薬グレードの「注射用水」もしくは生理食塩水を含む点滴ボトルによって調剤され得る。該組成物が注射によって投与されるとき、注射用水もしくは生理食塩水の容器（例えばアンプルもしくはバイアル）は、活性成分が投与前に混合できるように、供給され得る。
単離されたカリクレイン阻害剤の皮下投与のための例示的な製剤は、緩衝剤（例えばヒスチジンもしくはリン酸緩衝液）および凍結保護剤（例えば、任意選択でデキストラン４０のようなデキストランを含むショ糖またはショ糖およびマンニトール）を含む緩衝液を含み、そして、米国特許出願公開２００７−０２１３２７５（２００７年３月９日出願の米国特許出願番号１１／７１６，２７８）に記載されるように、貯蔵および分配のために凍結乾燥され得る。
一実施態様において、カリクレイン阻害剤は、任意の承認された手順に従って、静脈内注入として患者に投与される。他の実施態様において、カリクレイン阻害剤は、皮下ボーラスとして患者に投与される。他の実施態様において、カリクレイン阻害剤は、関節内注射によって患者に投与される。静脈内投与および関節内投与は、典型的には、臨床の現場（例えば病院、緊急ケア、もしくは診察室）での医療専門家によって実施されるが、皮下注射は、自己投与され得るかもしくは医療専門家により投与され得る。
全身投与のためのカリクレイン阻害剤の用量を決定するために評価され得るパラメータは、ＤＸ−８８（非天然のカリクレイン阻害剤、配列識別番号２）に関連して以下に記載される。血漿中の循環するプレカリクレインの総量は、およそ５００ｎＭ〜６００ｎＭであると報告される（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、“Ｔｈｅ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，” ｉｎ Ｂｌｏｏｄ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｈａｎｄｉｎ，Ｒ．ら編集、Ｊ Ｂ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、フィラデルフィア、１９９５）。すべてのプレカリクレインが活性化される場合、化学量論的にカリクレインを阻害するのに、約５２０ｎｍｏｌｅ／ＬのＤＸ−８８（ＤＸ８８）を使用することができる。５リットルの血漿を持つ個人は、７，０５４ダルトンのＤＸ−８８の分子量に基づいて、２．６マイクロモル、もしくはおよそ１８ｍｇのＤＸ−８８の用量を必要とするであろう。これは以下のように計算された。ＤＸ８８のＫｉは０．０２５ｎＭである。例えば１ｎＭの血漿カリクレイン（ＰＫ）の濃度を持つことが望まれるとき、以下の強結合阻害剤の式は、遊離のＤＸ−８８の濃度が１２．０ｎＭであると示す。したがって、必要とされるＤＸ−８８の全量は、４９９＋１２もしくは５１１ｎＭとなるであろう。
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プレカリクレインのすべてが活性化されない場合、もしくは一部分のカリクレインが、例えばＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）のような内在性の阻害剤によって不活化される場合、用量を比例して低減することができる。したがって、ある実施態様において、単一用量において、もしくは２４時間の期間にわたって分割された１回もしくはそれ以上の用量において、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約６０ｍｇ、約８０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約１０００ ｍｇのＤＸ−８８を対象に投与できる。患者の年齢、体重および症状の重篤度のようないくつかの他の要素を考慮することは、実際に必要なＤＸ−８８の用量のより正確な推定を提供できる。
ある実施態様において、カリクレイン阻害剤ポリペプチドは、約１〜５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１〜２５０ｍｇ／ｍ２、１〜１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
（Ｇ）デバイス及びキット
カリクレイン阻害剤を含む医薬組成物は、医療デバイスによって投与され得る。該デバイスは、病院もしくは救急室／緊急医療施設の外部の状況で（例えば、家庭内もしくは診療室において患者によってまたは介護者によって）使用できるように、可搬性、室温保存、および使用の容易さのような特徴を備えるよう設計され得る。該デバイスは、例えば、単離されたカリクレイン阻害剤を含む医薬製剤を貯蔵するための一つもしくはそれ以上のハウジングを含み得、そして、剤もしくは複数の剤の一つもしくはそれ以上の単位用量を送達するよう構成され得る。
静脈内投与は、適切な注射もしくは注入装置（例えば、カテーテル、注入ポンプ、インプラントなど）を用いてボーラスもしくは注入によってなされ得る。皮下注射は、例えば、カテーテルおよび注入ポンプもしくは植え込み可能なデバイスを用いる注入としてでもよい。多くの他のデバイス、インプラント、送達システム、およびモジュールもまた公知である。
カリクレイン阻害剤が凍結乾燥粉末として分配されるとき、それは、使用前に再構成しなければならない。手作業での再構成（例えば、凍結乾燥製剤を含む容器への注入ポートを通じた注入による、凍結乾燥製剤への希釈剤の手作業での添加）も使用でき、または、カリクレイン阻害剤は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＤ（商標） Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｒｙ Ｉｎｊｅｃｔｏｒのような自動再構成（例えば、凍結乾燥製剤への希釈剤の自動添加）のために構成されたデバイス中に提供されてもよい。
単離されたカリクレイン阻害剤は、キット中に提供され得る。一実施態様において、キットは、（ａ）単離されたカリクレイン阻害剤を含む組成物を含む容器、ならびに（ｂ）本明細書に記載される方法および／もしくは治療的恩典を得るための剤の使用に関連する情報資料を含み得る。
ある実施態様において、キットはまた、別の治療剤を含む。例えば、キットは、単離されたカリクレイン阻害剤を含む組成物を含む第一の容器、および他の治療剤を含む第二の容器を含む。単離されたカリクレイン阻害剤および他の治療剤は、カリクレイン阻害剤と治療剤が単一の組成物として投与される方法において使用するために、同じ容器において供給されてもよい。
キットの情報資料は、その形態において限定されない。一実施態様において、情報資料は、化合物の製造、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチもしくは製造場所の情報などについての情報を含み得る。一実施態様において、情報資料は、対象を治療するための、例えば、好適な用量、剤形もしくは投与の様式（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、もしくは投与の様式）において、単離されたカリクレイン阻害剤を投与する方法に関する。該情報は、印刷された文書、コンピュータ読み取り可能な材料、ビデオ録画、もしくはオーディオの録音、または実質的な材料へのリンクまたはアドレスを提供する情報を含むさまざまな様式において供給され得る。
単離されたカリクレイン阻害剤（および、存在する場合には追加の治療剤）に加えて、キット中の組成物は、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、または保存剤のような他の成分を含み得る。単離されたカリクレイン阻害剤（および存在する場合には追加の治療剤）は、好ましくは実質的に純粋および／もしくは無菌的である任意の形態、例えば、液体、乾燥もしくは凍結乾燥形態で供給され得る。剤が液体溶液で提供されるとき、該液体溶液は好ましくは水溶液である。剤が乾燥形態として提供されるとき、再構成は一般に、適切な溶媒の添加によってなされる。例えば、滅菌水または緩衝液のような溶媒を、任意選択でキット中に提供することができる。
キットは、組成物もしくは剤を含む組成物のための、一つもしくはそれ以上の容器を含み得る。ある実施態様において、キットは、組成物および情報資料のために、分離した容器、仕切りもしくは区画を含む。例えば、組成物を、ボトル、バイアルもしくはシリンジ中に含めることができ、情報資料を、プラスチックのスリーブもしくはパケット中に含めることができる。他の実施態様において、キットの別々の要素は、単一の区切りのない容器内に含まれる。例えば、ラベルの形態での情報資料がその上に貼付されたボトル、バイアルもしくはシリンジ中に組成物が含まれる。ある実施態様において、キットは、それぞれが一つもしくはそれ以上の単位剤形（例えば本明細書に記載される剤形）を含む、複数の（例えばパック）の個別の容器を含む。容器は、組み合わせ単位用量、例えば単離されたカリクレイン阻害剤と他の治療剤との両方を、例えば所望の比率で含む単位を含み得る。例えば、キットは、例えば、それぞれが単一の組み合わせ単位用量を含む、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック、または医療デバイスを含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分の変化もしくは蒸発に対して不透過性）および／もしくは遮光性であってよい。
キットは任意選択で、例えばシリンジもしくは他の好適な送達デバイスのような、組成物の投与に好適なデバイスを含む。該デバイスは、該剤の一つもしくは両方をあらかじめ充填されて供給されてもよく、または充填するために好適な空であり得る。
（実施例）
実施例
以下の実施例は、さらなる説明を提供するが限定するものではない。
実施例１ 切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）と自己免疫疾患との関連
自己免疫疾患における切断型ＨＭＷＫの濃度を測定するために、関節リウマチ（ＲＡ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）の患者から、ならびに健康な対象から取得された血漿試料中の無傷のＨＭＷＫおよび切断型ＨＭＷＫの量を、以下に記載されるように、ＬｉＣｏｒ検出を伴うウェスタンブロットを用いて測定した。
（ｉ）試料調製
１０μＬの１０×抗プロテアーゼ阻害剤カクテルを９０μＬの１００％ＨＭＷＫ欠損血漿に添加することによって、処置済のＨＭＷＫ欠損血漿を調製した。溶液を、使用前に少なくとも３０分間静置した。
１本鎖のＨＭＷＫの１：４中間体は、１５μＬの処置済ＨＭＷＫ欠損血漿に対して５μＬの保存溶液（１．６１ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって調製した。２本鎖のＨＭＷＫの１：４中間体は、１５μＬの処置済ＨＭＷＫ欠損血漿に対して５μＬの保存溶液（２．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって調製した。
４５μｇ／ｍＬの処置済ＨＭＷＫ欠損の対照血漿溶液は、２３．９６μＬの処置済ＨＭＷＫ欠損血漿に対して、３．３５μＬの１：４の１本鎖ＨＭＷＫ中間体と２．６９μＬの１：４の２本鎖ＨＭＷＫ中間体とを添加することによって調製した。
それぞれの試料を、５μＬの血漿試料を９５μＬの１×ＴＢＳに添加することによって１×ＴＢＳ中で５％血漿（１：２０）となるように希釈した。非還元試料は、１５μＬの５％試料に対して５μＬの４×試料緩衝液を添加することによって調製した。還元試料は、１３μＬの５％試料に対して５μＬの４×試料緩衝液と２μＬの１０×還元剤とを添加することによって調製した。
すべての試料を、ヒートブロックを用いて９５℃で４分間加熱した。それぞれの試料を、試料チューブのキャップからいかなる溶液も除去するために短時間遠心沈降させた。
（ｉｉ）ゲルへのローディング、泳動および転写
Ｔｒｉｓ−酢酸泳動緩衝液は、１９００ｍＬのＤＩ水に対して１００ｍＬの２０×泳動緩衝液を添加することによって調製した。４μＬの容量の単色のタンパク質マーカーを、すべてのアッセイにおいて対照として使用した。１３μＬの容量の非還元試料および還元試料を、ゲル１のゲルのレーンに添加した。ゲルを１２５ボルトで〜２時間泳動した。
ｉＢｌｏｔ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐａｐｅｒを、ＤＩ水中に入れて、５分間浸した。Ａｎｏｄｅ Ｓｔａｃｋ、Ｂｏｔｔｏｍを開封して、銅側を下にしてｉＢｌｏｔのブロッティング表面上に配置した。ゲルの泳動の完了時に、２個のゲルカセットを開けて、ゲルを取り出した。ゲルを、転写用メンブレンに載せた。予め浸したろ紙をゲルの上部に載せた。Ｃａｔｈｏｄｅ Ｓｔａｃｋ、Ｔｏｐを開封して、銅側を上にしてろ紙の上部に載せた。スタック中の気泡を、ブロッティングローラーを用いてゆっくりと押し出した。使い捨てスポンジをｉＢｌｏｔの蓋に配置した。ｉＢｌｏｔのスイッチを入れて、プログラムＰ０を選択した。
ｉＢｌｏｔの転写完了時に、ｉＢｌｏｔを開けて、スポンジ、陰極スタックおよびゲルを廃棄した。それぞれのメンブレンを個別にｉＢｌｏｔから取り出して、２０ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを含むプラスチックトレイに入れた。メンブレンを、室温で１時間、プレート振とう器上でインキュベートした。
（ｉｉｉ）ＬｉＣｏｒ検出を伴うウェスタンブロットアッセイ
１μｇ／ｍＬの一次抗体溶液は、８０ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｅｒ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０に対して、５７．１４μＬのマウス抗ＬＣ ＨＭＷＫ、クローン＃１１Ｈ０５（保存液の濃度１．４ｍｇ／ｍＬ）を添加することによって調製した。ブロッキング緩衝液を、プラスチックトレイより除去した。２０ｍＬの容量の一次抗体溶液をそれぞれのトレイに添加して、メンブレンを、室温で１時間、プレート振とう器上でインキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ ＩＲＤｙｅ６８０溶液は、８０ｍＬのＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｅｒ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０に対して、５．３３μＬの保存溶液を添加することによって、１：１５，０００希釈で調製した。一次抗体溶液をプラスチックトレイより除去した。メンブレンを２０ｍＬの１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０によって５分間洗浄し、その後洗浄液を廃棄した。洗浄を３回繰り返して全部で４回洗浄した。２０ｍＬの容量のヤギ抗マウスＩｇＧ ＩＲＤｙｅ６８０溶液をそれぞれのトレイに添加した。メンブレンおよび二次抗体溶液を光から保護するために、トレイをアルミニウムホイルで覆った。メンブレンを、室温で１時間、プレート振とう器上でインキュベートした。二次抗体溶液をプラスチックトレイから除去した。メンブレンを２０ｍＬの１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄して、洗浄液を廃棄した。洗浄を３回繰り返して全部で４回洗浄した。メンブレンをＰＢＳで洗浄し、ＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ上でスキャンした。メンブレンを、アルミニウムホイルで覆って、一晩乾燥させた。乾燥したメンブレンを、保護カバーシート中に入れて、後の使用のために保存した。
（ｉｖ）結果
４５μｇ／ｍＬの１本鎖および２本鎖のＨＭＷＫを添加した対照の処置済ＨＭＷＫ欠損血漿は、予想通り、１２０ｋＤａおよび９５ｋＤａ付近でバンドを生じた。正常ヒト血漿は、１２０ｋＤａおよび１００ｋＤａ付近でバンドを生じ、ＨＭＷＫの２１．３％が切断された。抗プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む患者の試料は、クエン酸ナトリウム中で採取した患者の試料とは劇的に異なる結果をもたらした。抗プロテアーゼ阻害剤を添加して採取した患者の試料は、還元型の２本鎖のＨＭＷＫよりも有意に多い１本鎖のＨＭＷＫを含んだ。この結果は、抗プロテアーゼ阻害剤カクテルの添加が、採取後のＨＭＷＫの切断を防ぐのに必要であることを示す。
多数のＵＣ、ＣＤ、ＲＡおよびＨＡＥ患者からの血漿試料を、この試験において調べた。対照の試料および正常ヒト血漿は、予想された結果をもたらした。ＨＡＥ発作時の試料は、ＨＡＥの基準試料よりも多くの切断型ＨＭＷＫを含んだ。以下の表１および図１において示されるように、自己免疫疾患の患者からの試料、特に関節リウマチの試料の大部分は、４６ｋＤａのバンドのみをもたらし、切断型ＨＭＷＫの濃度がＲＡ、ＵＣおよびＣＤのような自己免疫疾患と関連することを示す。より詳細には、ＲＡの症状再燃は、大量の切断型ＨＭＷＫと関連し、クローン病は、中程度の量の切断型ＨＭＷＫを持つことが見出され、そして潰瘍性大腸炎は、中程度の量の切断型ＨＭＷＫを持つことが見出された。
まとめると、本試験の結果は、ＣＤ、ＵＣおよびＲＡのような自己免疫疾患の血漿における接触活性化を示す。したがって、ｐＫａｌの阻害剤（例えば本明細書に記載されるもの）のような接触活性化を阻害する剤は、そのような疾患の治療に有効であり得る。さらに、本試験の結果は、切断型ＨＭＷＫの濃度が、ＣＤ、ＵＣおよびＲＡのような自己免疫疾患を持つか、その危険性を持つ患者を同定するための信頼できるバイオマーカーとして、ならびに／または、そのような自己免疫疾患の治療の有効性を判定するためのバイオマーカーとして役立ち得ることを示す。
Figure 0006657098
本願全体にわたって引用された参照文献、発行された特許、公開もしくは非公開の特許出願をならびに以下に列挙されたものを含む全ての引用された参照の内容は、本明細書に参照される目的もしくは課題について、その全ての内容について参照により本明細書によって明示的に組み入れられる。矛盾する場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が優先するであろう。
均等物および範囲
当業者は、単なるルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される本開示の具体的な実施態様に対する多くの均等物を、認識するかまたは確認することができるであろう。本願の開示の範囲は、上述の説明に限定されないと意図され、むしろ添付の特許請求の範囲に説明される。
請求項において、「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」のような冠詞は、文脈より明らかに反対のものもしくは他のものを示されていない限り、一つもしくは一つ以上を意味することができる。群の一つもしくはそれ以上の構成要素の間の「ｏｒ」を含む請求項もしくは記載は、文脈から明らかに反対のものもしくは他のものを示されていない限り、与えられた産物もしくはプロセスにおいて、群の構成要素の一つもしくは一つ以上、または全てが、存在し、使用され、もしくはその他で関連している場合を満たされるとみなされる。本開示は、群の正確に一つの構成要素が、与えられた産物もしくはプロセスにおいて存在し、使用されもしくはその他で関連している実施態様を含む。本開示は、群の一つ以上または群の全ての構成要素が、与えられた産物もしくはプロセスにおいて存在し、使用されもしくはその他で関連している実施態様を含む。
さらに、本開示は、列挙された請求項の一つもしくはそれ以上からの、一つもしくはそれ以上の限定、要素、項および記述用語が他の請求項に導入されるすべての変更、組み合わせ、および置換を包含する。例えば、他の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見出される一つもしくはそれ以上の限定を含むよう修飾することができる。要素が、例えばマーカッシュ群形式での列挙として存在するとき、それぞれの要素のサブグループもまた開示され、そして任意の要素を、該群より除去できる。一般的に、本開示もしくは本開示の態様が特定の要素および／もしくは特徴を含むとして示されるとき、本開示の特定の実施態様もしくは本開示の態様は、そのような要素および／もしくは特徴からかるか、もしくは本質的にそれらからなるということは理解されるべきである。単純化のため、そのような実施態様は、本明細書においてこのとおりの言葉で具体的に説明されていない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、制限がないことを意図し、さらなる要素もしくはステップを含むことを許容する。範囲が与えられるとき、端点は含まれる。さらに、文脈および当業者の理解から他が示されることもしくは他が明確である場合を除き、範囲として表される値は、文脈が明確に他を指示するのでない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本開示の他の実施態様中に述べられる範囲中の任意の具体的な値もしくはサブ範囲をとることができる。
本願はさまざまな発行された特許、公開された特許出願、雑誌記事および他の刊行物を参照し、そのすべては参照により本明細書に組み入れられる。組み入れられた参考文献の任意のものと本明細書の間で矛盾が存在する場合、本明細書が優先する。さらに、従来技術の範囲内にある本開示の任意の特定の実施態様は、請求項の任意の一つもしくはそれ以上から明確に除外され得る。そのような実施態様は当業者に公知であるとみなされるため、それらは、本明細書に除外が明確に説明されない場合でも、除外できる。本開示の任意の特定の実施態様は、従来技術の存在に関連するか否かによらず、任意の理由により任意の請求項から除外できる。
当業者は、単なるルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される具体的な実施態様の多くの均等物を理解するかもしくは確認することができるであろう。本明細書に記載される本実施態様の範囲は、上述の説明を限定しないと意図され、それはむしろ添付の特許請求の範囲に説明される。当業者は、以下の請求項に記載されるような本開示の精神もしくは範囲から離れずに、本説明に対してさまざまな変更および修正を行ってもよいことを認識するであろう。

Claims (21)

  1. 生物学的試料を分析する方法であって、前記方法が、
    自己免疫疾患を有することが疑われるヒト対象の生物学的試料における切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）のパーセントを測定することと、
    前記生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントを対照試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントと比較することと、
    を含み、
    前記自己免疫疾患が関節リウマチ、クローン病または潰瘍性大腸炎であり、
    前記生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントが前記対照試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントよりも高い場合、前記ヒト対象は、前記自己免疫疾患を有しているかまたは前記自己免疫疾患の危険性があり、
    前記生物学的試料が、血液試料、血清試料または血漿試料である、
    方法。
  2. 前記生物学的試料が、１種以上のプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 切断型ＨＭＷＫのパーセントが、切断型ＨＭＷＫに特異的な結合剤を含むアッセイによって測定される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記結合剤が抗体である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記アッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）もしくはイムノブロットアッセイである、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記アッセイがウェスタンブロットアッセイである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 生物学的試料を分析する方法であって、前記方法が、
    第一の時点において、自己免疫疾患を有することが疑われるヒト対象の第一の生物学的試料における切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）のパーセントを測定することと、
    前記第一の時点に続く第二の時点において、前記ヒト対象の第二の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントを測定することと、
    前記第一の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントを前記第二の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントと比較することと、
    を含み、
    前記自己免疫疾患が関節リウマチ、クローン病または潰瘍性大腸炎であり、
    前記第二の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントが前記第一の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントよりも高い場合、前記対象は、前記自己免疫疾患を発症しているかまたは前記自己免疫疾患を発症する危険性があり、
    前記生物学的試料が、血液試料、血清試料または血漿試料である、
    方法。
  8. 前記第一の生物学的試料、前記第二の生物学的試料またはその両方が、１種以上のプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第一の生物学的試料および前記第二の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントが、切断型ＨＭＷＫに特異的な結合剤を含むアッセイによって測定される、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記結合剤が抗体である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記アッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）もしくはイムノブロットアッセイである、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記アッセイがウェスタンブロットアッセイである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 生物学的試料を分析する方法であって、前記方法が、
    治療の過程において自己免疫疾患の治療を施されるヒト患者の複数の生物学的試料における切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）のパーセントを測定することと、
    治療の過程にわたって切断型ＨＭＷＫのパーセントを比較することと、
    を含み、
    前記自己免疫疾患が関節リウマチ、クローン病または潰瘍性大腸炎であり、
    治療の過程において切断型ＨＭＷＫのパーセントが減少する場合、前記治療は、前記患者において有効であり、
    前記複数の生物学的試料のうちの少なくとも一つが、血液試料、血清試料または血漿試料である、
    方法。
  14. 前記治療が、少なくとも１種の血漿カリクレイン阻害剤を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記複数の生物学的試料のうちの少なくとも一つが、１種以上のプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記複数の生物学的試料における切断型ＨＭＷＫのパーセントが、切断型ＨＭＷＫに特異的な結合剤を含むアッセイによって測定される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記結合剤が抗体である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記アッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）もしくはイムノブロットアッセイである、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記アッセイがウェスタンブロットアッセイである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. ヒト対象における自己免疫疾患の治療における使用のための血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤であって、
    前記対象は、健康対照と比較して切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）のパーセントが上昇しており、
    前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、もしくは潰瘍性大腸炎である、
    血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤。
  21. ｐＫａｌに特異的な抗体である、請求項２０に記載のｐＫａｌ阻害剤。
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