ES2873204T3 - Diagnóstico y tratamiento de enfermedades autoinmunes - Google Patents

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Abstract

Un método para diagnosticar una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método: medir un nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido en una muestra biológica que ha sido proporcionado del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune; e identificar que el paciente humano tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad autoinmune, si el nivel de HMWK escindido en la muestra biológica es elevado en comparación con una muestra de control, en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; y en donde la muestra biológica es una muestra de suero o una muestra de plasma.

Description

DESCRIPCIÓN
Diagnóstico y tratamiento de enfermedades autoinmunes
ANTECEDENTES
La calicreína plasmática (pKal) es la principal enzima generadora de bradiquinina en la circulación y un componente del sistema calicreína-quinina plasmática (KKS). Colman, R. W. y Schmaier, A. H. (1997) Blood 90, 3819-3843. La activación de la pKal se produce a través del sistema de contacto, que se ha demostrado que es la causa de la patología de la enfermedad asociada al angioedema hereditario (AEH). Zuraw, B. L. y Christiansen, S. C. (2008) Expert Opin Investig Drugs 17, 697-706. La bradiquinina es un mediador clave del dolor, la inflamación, el edema y la angiogénesis. Maurer, M., et al. (2011) Allergy 66, 1397-1406; Colman, R. W. (2006) Curr Pharm Des 12, 2599-2607. Isordia-Salas et al. Arch Med Res. 2005 ene-feb;36(1):87-95 sugieren que las proteínas del sistema calicreína-quinina podrían ser dianas atractivas para la terapia con fármacos en enfermedades inflamatorias crónicas.
Khan et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006 Oct; 26(10):2260-6 postularon un vínculo directo entre HKa y la liberación de citoquinas/quimioquinas.
El documento US 5025796 describe un método para discernir una respuesta mediada periféricamente de la simulación térmica provocada por un fármaco en un sujeto incontrolado.
El documento US 2011/0212104 describe biomarcadores asociados con la enfermedad inflamatoria del intestino. Isordia-Salas et al. Blood. 15 de oct. de 2003;102(8):2835-42 describen que una mutación Ser51 1Asn conduce a la N-glicosilación y aumenta la escisión del quininógeno de alto peso molecular en ratas genéticamente susceptibles a la inflamación.
SUMARIO
La invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método:
medir un nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido en una muestra biológica que ha sido proporcionado del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune; e identificar que el paciente humano tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad autoinmune, si el nivel de HMWK escindido en la muestra biológica es elevado en comparación con una muestra de control, en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; y en donde la muestra biológica es una muestra de suero o una muestra de plasma.
La invención proporciona también un método para vigilar una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método:
medir un primer nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido en una primera muestra biológica que ha sido proporcionada del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune en un primer momento;
medir un segundo nivel de HMWK escindido en una segunda muestra biológica que ha sido proporcionada del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune en un segundo momento posterior al primer momento; y
evaluar el desarrollo de la enfermedad autoinmune en el paciente humano basándose en el cambio de los niveles de HMWK escindido en la primera y segunda muestras biológicas,
en donde el segundo nivel de HMWK escindido más alto que el primer nivel de HMWK escindido indica que la enfermedad autoinmune progresa en el paciente humano o que el paciente humano ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar la enfermedad autoinmune,
en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; y en donde la primera y segunda muestras biológicas son muestras de suero o muestras de plasma.
La invención proporciona también un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método:
medir los niveles de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) en múltiples muestras biológicas que han sido proporcionadas del paciente humano sometido a un tratamiento para una enfermedad autoinmune durante el curso del tratamiento; y
evaluar la eficacia del tratamiento en el paciente humano basándose en el cambio de los niveles de HMWK escindido durante el transcurso del tratamiento,
en el que si el nivel de HMWK escindido disminuye durante el curso del tratamiento, esto indica que el tratamiento es eficaz en el paciente humano,
en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, y
en donde al menos una de las muestras biológicas es una muestra de suero o una muestra de plasma.
La presente divulgación se basa en las observaciones de que los niveles de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido son elevados en pacientes que tienen una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA), enfermedad de Crohn (CD) y colitis ulcerosa (UC). Por consiguiente, en esta memoria se describen métodos para diagnosticar una enfermedad autoinmune, tal como RA, CD o UC, monitorizar el progreso de la enfermedad autoinmune o evaluar la eficacia de un tratamiento para la enfermedad autoinmune en base al nivel de HMWK escindido.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para diagnosticar una enfermedad autoinmune (p. ej., RA, CD o UC) en un sujeto, comprendiendo el método: (i) proporcionar una muestra biológica (p. ej., una muestra de suero o una muestra de plasma) de un sujeto sospechoso de tener la enfermedad autoinmune; (ii) medir un nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido en la muestra biológica; e (iii) identificar al sujeto que tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad autoinmune, si el nivel de HMWK escindido en la muestra biológica es elevado en comparación con una muestra de control.
En algunas realizaciones, el nivel de HMWK escindido se mide mediante un ensayo que implica un agente de unión (p. ej., un anticuerpo) específico para HMWK escindido. El ensayo puede ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un ensayo de inmunotransferencia, p. ej., un ensayo de transferencia Western que implica la detección de LiCor.
El método puede comprender, además,someter al sujeto a un tratamiento para la enfermedad autoinmune. En algunos casos, al sujeto se le administra una cantidad eficaz de un inhibidor de la calicreína plasmática (pKal), p. ej., los descritos en esta memoria.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de vigilar el desarrollo de una enfermedad autoinmune (p. ej., RA, CD o UC) en un sujeto, comprendiendo el método: (i) proporcionar una primera muestra biológica de un sujeto sospechoso de tener la enfermedad autoinmune en un primer momento; (ii) medir un primer nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) en la primera muestra biológica; (iii) proporcionar una segunda muestra biológica del sujeto en un segundo momento posterior al primer momento; (iv) medir un segundo nivel de HMWK escindido en la segunda muestra biológica; y (v) evaluar el desarrollo de la enfermedad autoinmune en el sujeto basándose en el cambio de los niveles de HMWK escindido en la primera y segunda muestras biológicas. Si el segundo nivel de HMWK escindido es más alto que el primer nivel de HMWK escindido, esto indica que la enfermedad autoinmune progresa en el sujeto o que el sujeto ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar la enfermedad autoinmune.
En algunas realizaciones, la primera muestra biológica, la segunda muestra biológica o ambas son muestras de suero o muestras de plasma. En otras realizaciones, el primer o segundo nivel de HMWK escindido se mide mediante un ensayo que implica un agente de unión (p. ej., un anticuerpo) específico para e1 HMWK escindido. En algunos ejemplos, el ensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un ensayo de inmunotransferencia, p. ej., un ensayo de transferencia Western que implica la detección de LiCor.
El método puede comprender, además,someter al sujeto a un tratamiento para la enfermedad autoinmune. En algunos casos, al sujeto se le administra una cantidad eficaz de un inhibidor de la calicreína plasmática (pKal), tal como los descritos en esta memoria.
Además, la presente divulgación proporciona un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad autoinmune (p. ej., RA, CD o UC) en un paciente, comprendiendo el método: (i) proporcionar múltiples muestras biológicas (p. e., muestras de suero o muestras de plasma) de un paciente sometido a un tratamiento por una enfermedad autoinmune durante el curso del tratamiento; (ii) medir los niveles de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) en las múltiples muestras biológicas; y (iii) evaluar la eficacia del tratamiento en el paciente basándose en el cambio de los niveles de HMWK escindido durante el transcurso del tratamiento. Si el nivel de HMWK escindido disminuye durante el curso del tratamiento, esto indica que el tratamiento es eficaz en el paciente.
En algunas realizaciones, el tratamiento implica al menos un inhibidor de calicreína plasmática, p. ej., los descritos en esta memoria. En otras realizaciones, los niveles de HMWK escindido en las múltiples muestras biológicas se miden mediante un ensayo que implica un agente de unión ( p. ej., un anticuerpo) específico para HMWK escindido. En algunos ejemplos,
el ensayo puede ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un ensayo de inmunotransferencia, p. ej., un ensayo de transferencia Western que implica la detección de LiCor. En cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, la muestra biológica utilizada en esta memoria puede comprender un inhibidor de proteasa o un cóctel de inhibidor de proteasa, que se añade a la muestra biológica después de la recogida.
El inhibidor de calicreína útil en los métodos puede ser, p. ej., un inhibidor de calicreína plasmática (pKal). En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de calicreína plasmática.
Los inhibidores de calicreína útiles en los métodos pueden ser cualquiera de los polipéptidos del dominio de Kunitz conocidos en la técnica o descritos en esta memoria, comprendiendo polipéptidos más grandes cualquiera de dominios de Kunitz de este tipo, con la condición de que los polipéptidos inhibidores de calicreína se unan e inhiban la calicreína como se determina en ensayos estándares, proteínas de unión de calicreína (p. ej., anticuerpos, p. ej., anticuerpos anti-calicreína plasmática) u otros inhibidores de calicreína descritos en esta memoria.
Ejemplos de péptidos de dominio de Kunitz capaces de inhibir la actividad de pKal incluyen: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:2; DX-88), o un fragmento del mismo, tales como los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el inhibidor de calicreína comprende o consiste en una región marco de un dominio de Kunitz y regiones de bucle de unión primera y segunda del polipéptido DX-88.
En algunas realizaciones, el inhibidor de calicreína comprende o consiste en una secuencia de aproximadamente 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido DX-88 que tiene la secuencia de 60 aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el inhibidor de calicreína comprende una proteína de unión a calicreína plasmática (p. ej., un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo anti-calicreína plasmática descrito en esta memoria).
En algunas realizaciones, la proteína de unión (p. ej., anticuerpo, p. ej., anticuerpo humano) se une al mismo epítopo o compite por unirse con una proteína descrita en esta memoria.
En algunas realizaciones, la proteína descrita en esta memoria se selecciona del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04. Proteínas de unión de este tipo se describen, p. ej., en la Publicación PCT WO2012/094587 y la Publicación de la Solicitud de Patente de EE,.UU. 20100183625.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítopo que X81-B01, X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, .X124-G01, o X63-G06.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (p. ej., precalicreína humana), pero sí a la forma activa de calicreína plasmática (p. ej., calicreína plasmática humana).
En determinadas realizaciones, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de la calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une a un epítopo que se solapa con el sitio activo de la calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la tríada catalítica de la calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana). En otras realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana). En aún otras realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: Arg 551, Gln 553, Tyr 555 y/o Arg 560 (numeración de la posición de los aminoácidos basada en la secuencia de calicreína humana). En aún otras realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: Ser 478, Asn 481, Ser 525 y/o Lys 526 (numeración de la posición de los aminoácidos basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de Factor XIla y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%. aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% en comparación con un patrón, p. ej., el Factor XI Ia y/o la producción de bradiquinina bajo las mismas condiciones, pero en ausencia de la proteína.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) de menos de 1000, 500, 100 o 10 nM.
En una realización, las secuencias de los dominios variables de HC y LC son componentes de la misma cadena polipeptídica.
En otra realización, las secuencias de los dominios variables de HC y LC son componentes de diferentes cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2’, scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab u otra molécula que comprenda el sitio de combinación de antígeno de una de las proteínas de unión de esta memoria. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA LC, HSA::VH::CH1 LC, LC::HSA VH::CH1, HSA::LC VH::CH1 u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o no es inmunogénica en un ser humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones marco de anticuerpos humanos, p. ej., todas las regiones marco humanas.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo de primate o primatizado o no es inmunogénica en un ser humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones marco de anticuerpos de primates, p. ej., todas las regiones marco de primates.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos, (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lémures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones marco humanas, o regiones marco que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idénticas a regiones marco humanas.
En determinadas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (p. ej., no es un anticuerpo murino o de conejo).
En algunas realizaciones, la proteína de unión (p. ej., un anticuerpo tal como un anticuerpo humano) comprende una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera, en donde: la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada comprende uno, dos o tres (p. ej., tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en esta memoria, y/o
la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende una, dos o tres (p. ej., tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en esta memoria, en donde la proteína se une a (p. ej., e inhibe) calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (p. ej., tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como Dx -2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81 -B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (p. ej., tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la una, dos o tres (p. ej., tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (p. ej., tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera. son de X81-B01 o de X67-D03.
En algunas realizaciones, la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en esta memoria, y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en esta memoria.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04(respectivamente).
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, o X63-G06 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, o X63-G06 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en esta memoria y/o la cadena ligera de una proteína descrita en esta memoria.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, MM5-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, o X63-G06 y/o la cadena ligera de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, o X63-G06 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o una región marco humana; (b) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina comprende una o más (p. ej., 1,2 o 3) CDRs que son al menos 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en esta memoria; (c) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina comprende una o más (p. ej., 1, 2 o 3) CDRs que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idénticas a una CDR de un dominio variable LC descrito en esta memoria; (d) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a un dominio variable de LC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs); (e) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina es al menos 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a un dominio variable de HC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs); (f) la proteína se une a un epítopo unido por una proteína descrita en esta memoria o compite por unirse con una proteína descrita en esta memoria; (g) una CDR de primate o una región marco de primate; (h) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina comprende una CDR1 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de HC descrito en esta memoria; (i) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina comprende una CDR2 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de HC descrito en esta memoria; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC comprende una CDR3 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable HC descrito en esta memoria; (k) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina comprende una CDR1 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable LC descrito en esta memoria; (1) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina comprende una CDR2 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable LC descrito en esta memoria; (m) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC comprende una CDR3 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de LC descrito en esta memoria; (n) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable LC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs); y (o) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable HC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs).
En algunas realizaciones, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) de menos de 1000, 500, 100 o 10 nM.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligera y pesada de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpo ligeras y/o pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (p. ej., precalicreína humana, pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (p. ej., calicreína plasmática humana).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de Factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%. aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% en comparación con un patrón, p. ej., el Factor XIIa y/o la producción de bradiquinina bajo las mismas condiciones, pero en ausencia de la proteína.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) de menos de 1000, 500, 100 o 10 nM.
En una realización, las secuencias de los dominios variables de HC y LC son componentes de la misma cadena polipeptídica.
Los detalles de una o más realizaciones de la presente divulgación se recogen en los dibujos adjuntos y la descripción más adelante. Otras características, objetos y ventajas de la presente divulgación resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIGURA 1 es un gráfico que muestra la asociación de HMWK escindido con artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación se basa en el descubrimiento inesperado de que se observaron niveles elevados de HMWK escindido en pacientes que tenían RA, CD o UC. En particular, se observó un nivel extenso de HMWK escindido en pacientes con RA y se observó un nivel moderado de HMWK escindido tanto en pacientes con CD como con UC. Por consiguiente, en esta memoria se proporcionan nuevos métodos de diagnóstico y pronóstico para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune, tal como RA, UC o CD, vigilando el progreso de la enfermedad autoinmune y evaluando la eficacia de un tratamiento para la enfermedad autoinmune en un sujeto basado en el nivel de HMWK escindido en una muestra biológica del sujeto. También se describen en esta memoria métodos para tratar una enfermedad autoinmune de este tipo, así como otras enfermedades asociadas con el sistema de calicreína plasmática (pKal) utilizando un inhibidor de pKal tal como los descritos en esta memoria.
Definiciones
Por conveniencia, antes de la descripción ulterior de la presente divulgación, se definen aquí determinados términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas.
Las formas en singular "un", "una" y "el", ”la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de la cadena pesada (H) (abreviada en esta memoria como VH) y una región variable de la cadena ligera (L) (abreviada en esta memoria como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de la cadena pesada (H) y dos regiones variables de la cadena ligera (L). El término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos (p. ej., anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y sFab, F(ab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (de Wildt et al. al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39.)) así como anticuerpos completos. Un anticuerpo puede tener las características estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas). Los anticuerpos pueden ser de cualquier fuente, pero se prefieren las de primates (primates humanos y no humanos) y las primatizadas.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones marco" ("FR"). El alcance de la región marco y las CDRs se ha definido con precisión (véase Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NH N° 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, véase también www.hgmp.mrc.ac.uk). En este memoria se utilizan las definiciones de Kabat. Cada una de las VH y VL se compone típicamente de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir, además, toda o parte de una región constante de la cadena pesada o ligera, para formar con ello una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en donde las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras están interconectadas, p. ej., mediante enlaces disulfuro. En las IgG, la región constante de la cadena pesada incluye tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera incluye un dominio CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente en la unión del anticuerpo a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo está glicosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o la citotoxicidad mediada por complemento.
Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las CDRs pueden ser humanas, p. ej., h C CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3. Cada una de las CDRs de cadena ligera puede ser humana. HC CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones marco pueden ser humanas, p. ej., FR1, FR2, FR3 y FR4 de HC o LC. Por ejemplo, la región Fc puede ser humana. En una realización, todas las regiones marco son humanas, p. ej., tienen una secuencia de un marco de un anticuerpo producido por una célula somática humana, p. ej., una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una realización, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, p. ej., codificadas por un ácido nucleico de la línea germinal. En una realización, los residuos marco (FR) de un Fab seleccionado se pueden convertir en el tipo de aminoácido del residuo correspondiente en el gen de la línea germinal de primates más similar, especialmente el gen de la línea germinal humana. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, al menos el 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 o 100% de un dominio variable de inmunoglobulina, la región constante, los dominios constantes (CH1, CH2, CH3, CL1) o el anticuerpo completo puede ser humano o efectivamente humano.
Todo o parte de un anticuerpo puede ser codificado por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Genes de inmunoglobulina humana ejemplares incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como muchos genes de la región variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 KDa o aproximadamente 214 aminoácidos) son codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH -. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o aproximadamente 446 aminoácidos) son codificadas de manera similar por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante mencionados anteriormente, p. ej., gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). La longitud del HC humano varía considerablemente porque la HC CDR3 varía de aproximadamente 3 residuos de aminoácidos a más de 35 residuos de aminoácidos.
La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que conservan la capacidad de unirse específicamente a una diana de interés. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada que conserva la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una única cadena de proteína en donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv). Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. 5.260.203, 4.946.778 y 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse utilizando cualquier técnica apropiada, incluyendo técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. La expresión "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, p. ej., un epítopo. Esta expresión incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" que, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos de composición molecular única, independientemente de cómo se generó el anticuerpo.
La constante de inhibición (Ki) proporciona una medida de la potencia del inhibidor; es la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática a la mitad y no depende de las concentraciones de enzima o sustrato. La Ki aparente (Ki,ap) se obtiene a diferentes concentraciones de sustrato midiendo el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de inhibidor (p. ej., proteína de unión inhibidora) sobre la extensión de la reacción (p. ej., actividad enzimática); al ajustar el cambio en la constante de velocidad de pseudo-primer orden como una función de la concentración de inhibidor a la ecuación de Morrison (Ecuación 1) se obtiene una estimación del valor de Ki aparente. La Ki se obtiene de la intersección con el eje y extraída de un análisis de regresión lineal de una gráfica de Ki, ap frente a la concentración de sustrato.
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Ecuación 1
En que v = velocidad medida; vo = velocidad en ausencia de inhibidor; Ki,ap = constante de inhibición aparente; I = concentración total de inhibidor; y E = concentración total de enzima.
Tal como se utiliza en esta memoria, «afinidad de unión» se refiere a la constante de asociación aparente o Ka . La Ka es el recíproco de la constante de disociación (Kd). Una proteína de unión puede, por ejemplo, tener una afinidad de unión de al menos 105 , 106 , 107 , 108 , 109 , 1010 y 1011 M-1 para una molécula diana particular. La unión de afinidad alta de una proteína de unión a una primera diana con relación a una segunda diana puede indicarse por una Ka más alta (o un valor numérico de Kd más pequeño) para la unión de la primera diana que la Ka (o valor numérico de Kd) para la unión a la segunda diana. En tales casos, la proteína de unión tiene especificidad para la primera diana (p. ej., una proteína en una primera conformación o imitación de la misma) con relación a la segunda diana (p. ej., la misma proteína en una segunda conformación o imitación de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (p. ej., para la especificidad u otras comparaciones) pueden ser al menos de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, o 105 veces.
La afinidad de unión se puede determinar mediante una diversidad de métodos que incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia del plasmón de la superficie o espectroscopía (p. ej., utilizando un ensayo de fluorescencia). Condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión están en tampón TRIS (TRIS 50 mM, NaCI 150 mM, CaCÍ25 mM a pH 7,5). Estas técnicas pueden utilizarse para medir la concentración de proteína de unión unida y libre en función de la concentración de proteína de unión (o diana). La concentración de proteína de unión unida ([Unida]) está relacionada con la concentración de proteína de unión libre ([Libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana, en que (N) es el número de sitios de unión por molécula diana mediante la siguiente ecuación:
[Unidla] = N -[LibreH(1/Ka] [Libre]).
Sin embargo, no siempre es necesario hacer una determinación exacta de la Ka, ya que a veces es suficiente obtener una medida cuantitativa de afinidad, p. ej., determinada utilizando un método tal como ELISA o análisis FACS, es proporcional a Ka y, por lo tanto, puede utilizarse para comparaciones, tales como determinar si una afinidad más alta es, p. ej., 2 veces mayor, para obtener una medición cualitativa de afinidad, o para obtener una inferencia de afinidad, p. ej., por actividad en un ensayo funcional, p. ej., un ensayo in vitro o in vivo
La expresión "proteína de unión" se refiere a una proteína que puede interactuar con una molécula diana. Esta expresión se utiliza indistintamente con "ligando". Una "proteína de unión a calicreína plasmática" se refiere a una proteína que puede interactuar con (p. ej., unirse) calicreína plasmática e incluye, en particular, proteínas que interactúan preferente o específicamente con y/o inhiben la calicreína plasmática. Una proteína inhibe la calicreína plasmática si provoca una disminución en la actividad de la calicreína plasmática en comparación con la actividad de la calicreína plasmática en ausencia de la proteína y en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo.
La expresión "inhibidor de calicreína" se refiere a cualquier agente o molécula que inhibe la calicreína.
El término "combinación" se refiere al uso de dos o más agentes o terapias para tratar al mismo paciente, en donde el uso o la acción de los agentes o terapias se solapan en el tiempo. Los agentes o terapias pueden administrarse al mismo tiempo (p. ej., como una única formulación que se administra a un paciente o como dos formulaciones separadas administradas simultáneamente) o secuencialmente en cualquier orden.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales de carácter básico (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Es posible que uno o más residuos de aminoácidos de estructura y/o CDR (o residuos de aminoácidos del bucle de unión) de una proteína de unión incluyan una o más mutaciones (p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones o deleciones) con relación a una proteína de unión descrita en esta memoria. Una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener mutaciones (p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones o deleciones) (p. ej., al menos una, dos, tres o cuatro, y/o menos de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones) con respecto a una proteína de unión descrita en esta memoria, p. ej., mutaciones que no tienen un efecto sustancial sobre la función de la proteína. Las mutaciones pueden estar presentes en regiones marco, CDRs (o bucles de unión) y/o en regiones constantes. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región marco. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una CDR. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región constante. El que se tolere o no una sustitución particular, es decir, no afectará negativamente a las propiedades biológicas, tal como la actividad de unión, se puede predecir, p. ej., evaluando si la mutación es conservadora o mediante el método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.
Una región variable de inmunoglobulina "efectivamente humana" es una región variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos estructurales humanos de manera que la región variable de inmunoglobulina no provoca una respuesta inmunogénica en un ser humano normal. Un anticuerpo "efectivamente humano" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos humanos de modo que el anticuerpo no provoque una respuesta inmunogénica en un ser humano normal.
Un "epítopo" se refiere al sitio en un compuesto diana que está unido por una proteína de unión (p. ej., un anticuerpo tal como un Fab o un anticuerpo de longitud completa). En el caso de que el compuesto diana sea una proteína, el sitio puede estar compuesto completamente por componentes de aminoácidos, compuesto completamente por modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (p. ej., restos glicosilo), o compuesto por combinaciones de los mismos. Los epítopos solapantes incluyen al menos un residuo de aminoácido común, grupo glicosilo, grupo fosfato, grupo sulfato u otra característica molecular.
Una primera proteína de unión (p. ej., anticuerpo) "se une al mismo epítopo" que una segunda proteína de unión (p. ej., anticuerpo) si la primera proteína de unión se une al mismo sitio en un compuesto diana al que se une la segunda proteína de unión, o al que se une un sitio que se solapa (p. ej., 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de solapamiento, p. ej., en términos de secuencia de aminoácidos u otra característica molecular (p. ej., grupo glicosilo, grupo fosfato o grupo sulfato)) con el sitio al que se une la segunda proteína de unión.
Una primera proteína de unión (p. ej., anticuerpo) "compite por unirse" con una segunda proteína de unión (p. ej., anticuerpo) si la unión de la primera proteína de unión a su epítopo disminuye (p. ej., en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más) la cantidad de la segunda proteína de unión que se une a su epítopo. La competencia puede ser directa (p. ej., la primera proteína de unión se une a un epítopo que es el mismo que, o se superpone con el epítopo unido por la segunda proteína de unión), o indirecta (p. ej., la unión de la primera proteína de unión a su epítopo provoca un cambio estérico en el compuesto diana que disminuye la capacidad de la segunda proteína de unión de unirse a su epítopo).
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (el término y la expresión se utilizan indistintamente en esta memoria) se realizan como sigue.. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden descartarse para fines de comparación). El alineamiento óptimo se determina como la mejor puntuación utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5. Luego se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se utiliza en esta memoria, la "identidad" de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a "homología" de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.
En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60% e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina.
Una región variable de inmunoglobulina "humanizada" es una región variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos estructurales humanos de manera que la región variable de inmunoglobulina no provoca una respuesta inmunogénica en un ser humano normal. Descripciones de inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo, los documentos US 6.407.213 y US 5.693.762.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, alta o muy alta" describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse una orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. ( (1989), 6,3.1 -6,3.6. Métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden utilizar. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en esta memoria son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en 0.2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55°C para condiciones de baja rigurosidad); (2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y (4) condiciones de hibridación muy rigurosas son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65°C. Condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deberían utilizarse a menos que se especifique lo contrario. La divulgación incluye ácidos nucleicos que se hibridan con rigurosidad baja, media, alta o muy alta con un ácido nucleico descrito en esta memoria o con un complemento del mismo, p. ej., ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión descrita en esta memoria. Los ácidos nucleicos pueden tener la misma longitud o estar dentro del 30, 20 o 10% de la longitud del ácido nucleico de referencia. El ácido nucleico puede corresponder a una región que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina descrita en esta memoria.
Una "composición aislada" se refiere a una composición que se elimina de al menos el 90% de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la composición aislada. Las composiciones producidas artificial o naturalmente pueden ser "composiciones de al menos" un determinado grado de pureza si la especie o población de especies de interés es de al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, o 99% pura sobre una base de peso-peso.
Una proteína "aislada" se refiere a una proteína que se elimina de al menos el 90% de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la proteína aislada. Las proteínas "de al menos" un determinado grado de pureza si la especie o población de especies de interés es de al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, o 99% puras sobre una base de peso-peso.
Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo salvaje del agente de unión, p. ej., el anticuerpo, sin abolir o,más preferiblemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que el cambio de un residuo de aminoácido "esencial"da como resultado una pérdida sustancial de actividad. Un "paciente", "sujeto" o "huésped" (estos términos se utilizan indistintamente) a tratar por el método puede significar un animal humano o no humano.
Un "sujeto que lo necesita" incluye, por ejemplo, un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno descrito en esta memoria o un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno descrito en esta memoria.
El término "calicreína" (p. ej., calicreína plasmática) se refiere a peptidasas (enzimas que escinden enlaces peptídicos en proteínas), un subgrupo de la familia de las serina proteasas. La calicreína plasmática escinde el quininógeno para generar quininas, potentes péptidos pro-inflamatorios. DX-88 (también denominado en esta memoria «PEP-1») es un inhibidor potente (Ki < 1 nM) y específico de la calicreína plasmática (NP_000883). (Véase también, p. ej., el documento WO 95/21601 o WO 2003/103475).
La secuencia de aminoácidos de KLKb1 (calicreína plasmática) es:
KLKbl
>gi|78191798|ref|NP_000883.2| precursor B1 de la calicreína plasmática [Homo sapiens]
MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSIN
□MEKRFGCFLKDSVIGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTSN
IRCQFF3YATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGF3LKPCALSEIGCHMNIFQHLAF3DVDVARV
LTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESSTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHS KIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSG YSLRLCNTGDNSVCTTKTSTF.IVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDV
WRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKV3EGNHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLP3KGDTSTIYTNCWV
TGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVG ITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA (SEQ IDNO: 3).
Tal como se utiliza en este memoria, el término "DX-2922" se utiliza indistintamente con el término "X101-A01". Otras variantes de este anticuerpo se describen a continuación.
Figure imgf000012_0001
Tal como se utiliza en este memoria, el término "DX-2930" se utiliza indistintamente con el término "X124-G01". Otras variantes de este anticuerpo se describen a continuación.
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000013_0001
KLK1
>gi|13529059|gb|AAH05313.11 calicreína 1 [Homo sapiens]
MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDN YQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSE3FPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKYV
ELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKVHVQKVTDFIYLCVGHLEGGKDTC VGDSGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAEMS (SEQ IDNO: 4)
Las expresiones "administración parenteral" y "administrada por vía parenteral", tal como se utilizan en esta memoria significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica. inyección e infusión intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
El término "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, p. ej., la administración de un fármaco, de manera que se prevenga al menos un síntoma de la enfermedad, es decir, se administre antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (p. ej., enfermedad u otro estado no deseado del animal huésped) de modo que protege al huésped contra el desarrollo de la afección no deseada. "Prevenir" una enfermedad también puede denominarse "profilaxis" o "tratamiento profiláctico".
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, debido a que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es probable pero no necesariamente menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sustancialmente idéntica" (o "sustancialmente homóloga") se utiliza en esta memoria para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (p. ej., con una cadena lateral similar, p. ej., sustituciones de aminoácidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos, de modo que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos tengan (o codifiquen proteínas que tienen) actividades similares, p. ej., una actividad de unión, una preferencia de unión o una actividad biológica. En el caso de los anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos el 50%, al menos el 25% o al menos el 10% de la afinidad con respecto al mismo antígeno.
Las secuencias similares u homólogas (p. ej., al menos aproximadamente un 85% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas en esta memoria también forman parte de esta solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con una proteína de unión descrita en esta memoria.. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia en las regiones de marco de HC y/o LC (p. ej., HC y/o LC FR 1, 2, 3 y/o 4) a una proteína de unión descrita en esta memoria. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia en las CDRs de HC y/o LC (p. ej., HC y/o LC CDR1,2 y/o 3) a una proteína de unión descrita en esta memoria. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia en la región constante (p. ej., CH1, CH2, CH3 y/o CL1) CON una proteína de unión descrita en esta memoria..
Además, existe una identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico se hibridan en condiciones de hibridación selectivas (p. ej., condiciones de hibridación altamente rigurosas) con el complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
Las secuencias de motivos para biopolímeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoácidos variados. Por ejemplo, el símbolo "X" en un contexto de este tipo se refiere generalmente a cualquier aminoácido (p. ej., cualquiera de los veinte aminoácidos naturales) a menos que se especifique lo contrario, p. ej., para hacer referencia a cualquier aminoácido que no sea cisteína. También se pueden indicar otros aminoácidos permitidos, por ejemplo, utilizando paréntesis y barras. Por ejemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que se permiten alanina, triptófano, fenilalanina, asparagina y glutamina en esa posición particular.
La significancia estadística puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Tests estadísticos ejemplares incluyen: el test T de Student, la prueba no paramétrica U de Mann Whitney y la prueba estadística no paramétrica de Wilcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen un valor de P de menos de 0,05 o 0,02. Proteínas de unión particulares pueden mostrar una diferencia, p. ej., en la especificidad o unión, que son estadísticamente significativas (p. ej., valor de P < 0,05 o 0,02). Los términos "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir" o similares, p. ej., que designan diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, y pueden referirse a una diferencia, p. ej., una diferencia estadísticamente significativa, entre los dos estados.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la proteína de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Una "dosis terapéuticamente eficaz" modula preferiblemente un parámetro medible de una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz puede reducir el grado de un síntoma de la enfermedad o trastorno en al menos aproximadamente un 20%, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40%, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60% y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80% en comparación con el síntoma antes del tratamiento. La capacidad de un compuesto de modular un parámetro medible, p. ej., un parámetro asociado a una enfermedad, puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en trastornos y afecciones humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto de modular un parámetro in vitro.
"Tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto (incluyendo, p. ej., "tratar" a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno) se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, p. ej., la administración de un fármaco, de modo que al menos un síntoma de la enfermedad se prevenga, cure, alivie, disminuya o similar.
Una "enfermedad asociada con el plegamiento incorrecto o la agregación de proteínas" es una enfermedad que surge, al menos en parte, debido a un cambio (p. ej., una obstrucción) en el proceso de plegamiento o la estabilidad de la estructura plegada de una proteína. La obstrucción del proceso de plegamiento, los aumentos en la agregación y la desestabilización de la estructura de la proteína nativa pueden provocar patologías de pérdida o ganancia de función. Una enfermedad asociada con el plegamiento incorrecto o la agregación de proteínas incluye, pero no se limita a: amiloidosis sistémica, crioglobulinemia y anemia de células falciformes. Enfermedades neurológicas asociadas con el plegamiento incorrecto o la agregación de proteínas incluyen la enfermedad de Jacob-Kreutzfeld (asociada con las proteínas priónicas), la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides tales como la polineuropatía amiloidótica familiar (FAP).
I. Uso de Quininógeno de Alto Peso Molecular Escindido (HMWK) como un Biomarcador en ensayos de Diagnóstico y Pronóstico de Enfermedades Autoinmunes
Inesperadamente, se encontraron niveles elevados de HMWK escindida en enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide (RA), la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC). Ejemplo 1 más adelante. Por lo tanto, la HMWK escindida puede servir como un biomarcador fiable para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria (p. ej., RA, UC y CD), vigilar el progreso de una enfermedad autoinmune de este tipo y evaluar la eficacia de un tratamiento para la enfermedad.
Por consiguiente, en esta memoria se describen métodos de diagnóstico y pronóstico para una enfermedad autoinmunitaria (p. ej., RA, UC y CD) basados en el nivel de HMWK escindido en una muestra biológica (p. ej., una muestra de plasma) obtenida de un paciente candidato.
El quininógeno de alto peso molecular (HMWK), también conocido como factor de Williams-Fitzgerald-Flaujeac o factor de Fitzgerald o factor de HMWK-calicreína, es una proteína del sistema de coagulación sanguínea y del sistema quinina-calicreína. Es una proteína que se adsorbe en la superficie de materiales biológicos que entran en contacto con la sangre in vivo. El quininógeno de alto peso molecular (HMWK) existe en el plasma en forma de una proteína de un solo polipéptido (1 cadena) multi-dominio (dominios 1-6) con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. El HMWK es escindido por pKal dentro del dominio 4 para liberar los 9 aminoácidos, el péptido proinflamatorio bradiquinina y una forma de 2 cadenas de HMWK (quininógeno escindido). Las 2 cadenas de HMWK son la cadena pesada, que contiene los dominios 1 -3 de HMWK, y la cadena ligera, que contiene los dominios 5 y 6 de HMWK. Las cadenas pesada y ligera tienen un peso molecular de aproximadamente 56 y 46 kiloDalton, respectivamente.
El gen humano que codifica HMWK es quininógeno 1 (KNG1). KNG1 se transcribe y se empalma alternativamente para formar ARNm que codifican HMWK o quininógeno de bajo peso molecular (LMWK). A continuación, se proporciona una secuencia de proteínas ejemplar de HMWK:
>gi|156231037|ref|NP_001095886.11 precursor de quininógeno-1 isoforma 1 [Homo sapiens]
MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDT FYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPWTAQY DCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQWAGLNFRITYSIVQTNCSKEN FLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEE TLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQWAGKKYFIDFVARETTCSKESWEELTESCETKKLGQSLD
CNAEVYWPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSG KEQGHTRRHDWGHEKQRKHMLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHV LDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTF SDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQ MKESYYFDLTDGLS (SEQ IDNO:5)
El quininógeno intacto de alto peso molecular (HMWK) se puede someter a ensayo, por ejemplo, utilizando métodos coagulantes o inmunológicos, p. ej., radioinmunoensayo (véase, p. ej., Kerbiriou-Nabias, D.M., Br J Haematol, 1984, 56(2):2734-86). Se conoce un anticuerpo monoclonal contra la cadena ligera de HMWK humano. Véase, p. ej., Reddigari, S.R. y Kaplan, A.P., Blood, 1999, 74:695-702. También se puede utilizar un ensayo para HMWK que se base en un sustrato cromogénico. Véase, p. ej., Scott, C.F. et al. Thromb Res, 1987, 48(6):685-700; Gallimore, M.J. et al. Thromb Res, 2004, 114(2):91 -96.
El quininógeno escindido de alto peso molecular (HMWK), también denominado en esta memoria "quininógeno escindido", puede evaluarse, por ejemplo, utilizando métodos descritos en el Ejemplo 1, p. ej., transferencia Western. Pueden utilizarse anticuerpos que se unen específicamente a HMWK escindido, tales como, p. ej., el clon de mAb de ratón 11H05. Adicionalmente, el HMWK escindido se puede evaluar utilizando espectrometría de masas. Las técnicas de inmunotransferencia para evaluar los niveles de HMWK escindido se conocen en la técnica. Véase, p. ej., Buhler R. et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 1995, 6(3):223-232.
A continuación se proporcionan secuencias ejemplares de las cadenas pesada y ligera del quininógeno escindido.
> cadena pesada de quininógeno-1 escindido
QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEI KEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTArVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPWTA QYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNMTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRIT YSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECIDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQ PPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLMAENNATFYFKIDNVKKARVQWAGKKYF IDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYWPWEKKIYPTVNCQPLGMISL MK (SEQ IDNO: 6)
> cadena ligera de quininógeno-1 escindido
SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHER DQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNK GKKNGKHNGWKTEHLA33SEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLI ATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTT QMKESYYFDLTDGLS (SEQ IDNO: 7)
En algunos ejemplos, los niveles de HMWK intacto y HMWK escindido se miden mediante un análisis de transferencia Western, p. ej., un análisis de transferencia Western Simple Western™ Protein Simple®. Los ensayos Simple Western™ son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Rustandi et al. Evaluación cualitativa y cuantitativa de Simon ™, Qualitative and quantitative evaluation of Simon™, a new CE-based automated Western blot system as applied to vaccine development. Electrophoresis. Sep. de 201233(17):2790-7). Los productos Simple Western™ también están disponibles comercialmente (véase, p. ej., ProteinSimple®, Santa Clara, CA).
Para poner en práctica cualquiera de los métodos de diagnóstico y/o pronóstico descritos en esta memoria, se puede obtener una muestra biológica (p. ej., una muestra de fluido biológico tal como una muestra de plasma o una muestra de suero) de un sujeto candidato (p. ej., un paciente humano candidato) para medir el nivel de HMWK escindido. Un sujeto puede ser un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos no humanos incluyen, pero no se limitan a animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas. Un sujeto humano puede ser un paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune como las descritas en esta memoria, p. ej., RA, CD o UC.
La muestra biológica obtenida del sujeto puede ser una muestra de tejido o fluido. Ejemplos de muestras de fluidos incluyen, pero no se limitan a saliva, sangre, plasma, suero y orina. En algunas realizaciones, la muestra biológica del sujeto comprende leucocitos, p. ej., una muestra de sangre. La muestra biológica puede obtenerse del paciente utilizando cualquier método conocido en la técnica, p. ej., venopunción, biopsia o hisopo. Antes del análisis, se puede añadir un inhibidor de proteasa o un cóctel de inhibidores de proteasa a la muestra biológica para inhibir la escisión de HMWK in vitro. Cualquier inhibidor de proteasa conocido en la técnica puede utilizarse en los métodos descritos en esta memoria.
El nivel de HMWK escindido se puede medir mediante cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica (véase, p. ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. La tecnología de micromatrices se describe en Microarray Methods and Protocols, R. Matson, CRC Press, 2009, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva ) York.
En algunas realizaciones, se mide el nivel de la proteína HMWK escindida en la muestra. Los ensayos para detectar niveles de proteína HMWK escindida incluyen, pero no se limitan a inmunoensayos (a los que también se alude en esta memoria como ensayos inmune-basados o inmuno-basados, p. ej., ensayos de transferencia Western, inmunohistoquímica y ELISA), espectrometría de masas y ensayos basados en perlas múltiples. Ensayos de este tipo para la detección del nivel de proteínas son conocidos en la técnica.
En algunos ejemplos, el nivel de HMWK escindido se mide mediante un ensayo de transferencia Western, que puede implicar la detección de LiCor tal como se describe en esta memoria. En otros ejemplos, el nivel de proteína HMWK escindida se mide mediante un ensayo de inmunohistoquímica, que puede implicar un participante en la unión, tal como un anticuerpo, que se une específicamente a HMWK escindido o se une específicamente a HMWK escindido y no escindido.
Pueden diseñarse participantes en la unión para la detección de proteínas utilizando métodos conocidos en la técnica y como se describe en esta memoria. En algunas realizaciones, los participantes en la unión a la proteína HMWK escindidas, p. ej., anticuerpos anti HMWK escindidos, se unen a una parte o a una secuencia de aminoácidos completa de la proteína HMWK. Otros ejemplos de métodos de detección y cuantificación de proteínas incluyen inmunoensayos multiplexados tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N°s 6.939.720 y 8.148.171 y la Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada N° 2008/0255766, y micromatrices de proteínas tal como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE.UU.publicada N° 2009/0088329. Se contempla cualquier participante en la unión adecuada para HMWK escindido para la detección de un nivel de HMWK escindido. En algunas realizaciones, el participante en la unión es cualquier molécula que se une específicamente a una proteína HMWK o una proteína HMWK escindida. Un participante en la unión de este tipo puede unirse a la versión escindida de HMWK (p. ej., la HMWK escindida) con una afinidad mucho mayor en comparación con su unión a1HMWK no escindido. En algunos casos, el participante en la unión, tal como un anticuerpo, puede unirse solo a la versión escindida de HMWK.
El anticuerpo a utilizar en el método descrito en esta memoria puede estar en cualquier forma, incluyendo, pero no limitada a un anticuerpo de longitud completa o uno de sus fragmentos de unión a antígeno, tales como Fab, F(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y sFab, F(ab’)2, fragmentos Fd, scFv o fragmentos dAb. Métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (2a Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990) y Roitt et al., "Immunology" (2a Ed.), Gower Medical Publishing, Londres, Nueva York (1989), documentos WO2006/040153, WO2006/122786 y W02003/002609). Véanse también descripciones en esta memoria.
En otras realizaciones, los participantes en la unión utilizados para medir el nivel de HMWK escindido pueden ser moléculas peptídicas que no son anticuerpos o aptámeros que se unen específicamente a HMWK escindido. También se conocen en la técnica métodos para producir moléculas peptídicas y aptámeros (véanse, p. ej., la Solicitud de Patente de EE.UU. publicada N° 2009/0075834 y las Patentes de EE.UU. N°s 7435542, 7807351 y 7239742).
Una vez que se determina el nivel del HMWK escindido en una muestra biológica obtenida de un sujeto candidato, se puede comparar con un nivel de control para determinar si el sujeto tiene, está en riesgo de tener o se sospecha que tiene una enfermedad autoinmune, tal como RA, CD o UC.
En algunas realizaciones, el nivel de control es un nivel de HMWK escindido en una muestra de control, tal como una célula, tejido o fluido obtenido de un sujeto sano o una población de sujetos sanos, que preferiblemente son de la misma especie que el sujeto candidato. Tal como se utiliza en esta memoria, un sujeto sano es un sujeto que aparentemente está libre de la enfermedad diana (p. ej., RA, CD o UC) en el momento en que se mide el nivel de HMWK o no tiene antecedentes de la enfermedad.
En algunas realizaciones, un nivel de control es un nivel de HMWK escindido que es indetectable o está por debajo de un nivel de ruido de fondo obtenido al utilizar un método estándar de detección (p. ej., transferencia Western o inmunohistoquímica). Preferiblemente, el método estándar de detección es el mismo método utilizado para medir el nivel de HMWK escindida en la muestra del sujeto candidato.
El nivel de control también puede ser un nivel predeterminado. Un nivel predeterminado de este tipo puede representar el nivel del HMWK escindido en una población de sujetos que no tienen o que no están en riesgo de padecer una enfermedad autoinmune tal como se describe en esta memoria. El nivel predeterminado puede adoptar una diversidad de formas. Por ejemplo, puede ser un valor de corte único, tal como una mediana o media. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado de este tipo se puede establecer basándose en grupos comparativos tal como cuando se sabe que un grupo definido tiene una enfermedad autoinmune diana (p. ej., RA, UC o CD) y se sabe que otro grupo definido no tiene la enfermedad autoinmune diana. Alternativamente, el nivel predeterminado puede ser un intervalo, por ejemplo, un intervalo que representa los niveles del HWMK escindido en una población de control dentro de un percentil predeterminado.
El nivel predeterminado puede depender de la población particular seleccionada. Por ejemplo, una población aparentemente sana (ninguna enfermedad detectable o antecedentes de una enfermedad autoinmune diana, tal como RA, CD o UC) tendrá un intervalo ‘normal’ diferente de HMWK escindido que una población cuyos miembros tienen o están en riesgo de contraer la enfermedad autoinmune diana, que puede estar en remisión. Por consiguiente, los niveles predeterminados seleccionados pueden tener en cuenta la categoría a la que pertenece un sujeto. Los expertos ordinarios en la técnica pueden seleccionar intervalos y categorías apropiados sin más que una experimentación rutinaria.
El nivel de control tal como se describe en esta memoria se puede determinar mediante tecnología de rutina. En algunos ejemplos, el nivel de control puede obtenerse realizando un método convencional (p. ej., el mismo ensayo para obtener el nivel de HMWK escindido en una muestra de ensayo tal como se describe en esta memoria) en una muestra de control como también se describe en esta memoria. En otros ejemplos, los niveles de HMWK escindido pueden obtenerse de miembros de una población de control y los resultados pueden analizarse, p. ej., mediante un programa computacional, para obtener el nivel de control (un nivel predeterminado) que representa el nivel de HWMK escindido en la población de control.
Comparando el nivel de HMWK escindido de una muestra obtenida de un sujeto candidato con el nivel de control tal como se describe en esta memoria, se puede determinar si el sujeto candidato tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad autoinmune diana. Por ejemplo, si el nivel del HMWK escindido del sujeto candidato se desvía del nivel de control (p. ej., elevado o disminuido en comparación con el nivel de control), el sujeto candidato podría identificarse como teniendo o en riesgo de padecer la enfermedad autoinmune diana.
Tal como se utiliza en esta memoria, "un nivel elevado o un nivel por encima de un control" significa que el nivel de HMWK escindido es más alto que un nivel de control, tal como un umbral predeterminado o un nivel de HMWK escindido en una muestra de control. Niveles de control se describen en detalle en esta memoria. Un nivel elevado de HMWK escindido incluye un nivel de HMWK escindido que está, por ejemplo, 1 %, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% o más por encima de un nivel de control. Un nivel elevado de HMWK escindido también incluye aumentar un fenómeno desde un estado cero (p. ej., HMWK no escindido o indetectable en un control) a un estado distinto de cero (p. ej., algo de HMWK escindido o HMWK escindido detectable en una muestra).
Tal como se utiliza en esta memoria, "un nivel disminuido o un nivel por debajo de un control" significa que el nivel de HMWK escindido es más bajo que un nivel de control, tal como un umbral predeterminado o un nivel de HMWK escindido en una muestra de control. Niveles de control se describen en detalle en esta memoria. Un nivel disminuido de HMWK escindido incluye un nivel de HMWK escindido que está, por ejemplo, 1 %, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% o más por debajo de un nivel de control. Un nivel disminuido de HMWK escindido también incluye disminuir un fenómeno desde un estado distinto de cero (p. ej., HMWK algo escindido o HMWK escindido detectable en una muestra) a un estado cero (p. ej., nada de HMWK escindido o HMWK escindido no detectable en un control).
En algunas realizaciones, si se observa un nivel extenso (p. ej., al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%) de HMWK escindido en una muestra biológica obtenida de un paciente candidato con RA, a ese candidato se le diagnostica que tiene o que está en riesgo de tener un brote de RA. Si se observa un nivel moderado (p. ej., aproximadamente 10-30%) de HMWK escindido en una muestra biológica obtenida de un paciente candidato de UC o CD, se diagnostica que ese candidato tiene o está en riesgo de tener UC o CD.
Además, el nivel de HMWK escindido puede utilizarse como un biomarcador para vigilar el desarrollo de una enfermedad autoinmune, tal como RA, UC y CD. Por ejemplo, se pueden obtener al menos dos muestras biológicas (p. ej., muestras de suero o muestras de plasma) de un sujeto humano que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune diana, tal como RA, UC o CD en diferentes momentos. En algunos ejemplos, la segunda muestra biológica se puede obtener al menos 1 mes (p. ej., 3 meses, 6 meses, 9 meses o 12 meses) después de que se obtenga la primera muestra biológica. Los niveles de HMWK escindido se pueden medir en al menos dos muestras biológicas. Si el nivel de HMWK escindido se eleva con el tiempo (p. ej., el nivel de HMWK escindido en una muestra biológica obtenida posteriormente es mayor que el de una muestra biológica obtenida anteriormente en, p. ej., al menos 20%, 50%, 70%, 90%, 1 vez, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces), esto indica el progreso de la enfermedad en el sujeto (p. ej., tener un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad autoinmune o la enfermedad autoinmune se exacerba en el sujeto).
Además, el nivel de HMWK escindido también puede utilizarse como un biomarcador para evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento anti-autoinmune, p. ej.,los descritos en esta memoria. Por ejemplo, se pueden obtener múltiples muestras biológicas de un paciente humano sometido a un tratamiento durante el curso del tratamiento y los niveles de HMWK escindido se pueden medir siguiendo una tecnología de rutina como las descritas en esta memoria. Si el nivel de HMWK escindido en un paciente humano sometido a un tratamiento sigue disminuyendo durante el transcurso del tratamiento (p. ej., el nivel de HMWK escindido en una muestra biológica obtenida posteriormente es menor que el de una muestra biológica obtenida anteriormente, p. ej., en al menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces), esto indica que el paciente humano responde al tratamiento. Por otro lado, si el nivel de HMWK escindido permanece sustancialmente igual durante el transcurso del tratamiento (p. ej., el nivel de HMWK escindido en una muestra biológica obtenida posteriormente es sustancialmente idéntico o disminuye en menos del 20%, p. ej., 15%, 10% o 5% con respecto al de una muestra biológica obtenida anteriormente), esto indica que el paciente humano no responde al tratamiento.
Cuando se identifica que un sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad autoinmune (p. ej., RA, UC o CD) mediante cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, se puede realizar un tratamiento adecuado para tratar la enfermedad. En algunos ejemplos, el sujeto puede ser tratado con uno o más inhibidores de pKal tal como se describe en esta memoria. Cuando se determina que un sujeto no responde a un tratamiento mediante cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, se puede administrar al sujeto una dosis y/o frecuencia de dosificación más alta de un agente terapéutico (p. ej., un inhibidor de pKal). Alternativamente, el sujeto puede cambiar a un tratamiento diferente. Por otro lado, la dosificación o frecuencia de dosificación del agente terapéutico se mantiene, disminuye o cesa en un sujeto identificado como sensible al tratamiento o que no necesita tratamiento adicional.
II. Tratamiento de Enfermedades Autoinmunes
También se describen en esta memoria métodos para tratar enfermedades asociadas con el sistema de calicreína plasmática (pKal), que incluyen, pero no se limitan a, edema macular diabético, proliferación retiniana, trauma cerebral, lesión aguda de la médula espinal, amiloidosis localizada, enfermedades autoinmunes, tales como psoriasis, aclerosis múltiple, enfermedad del intestino inflamatorio, artritis reumatoide, vasculitis, lupus eritematoso sistémico,nefritis, mastocitosis sistémica, quemaduras graves y dolor neuropático (neuralgia diabética y posherpética). Métodos de este tipo comprenden administrar a un sujeto que necesita el tratamiento (p. ej., un paciente humano que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad) una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de calicreína a través de una ruta adecuada.
(A) Calicreína Plasmática
Secuencias ejemplares de calicreína plasmática contra las cuales se pueden desarrollar proteínas de unión a calicreína plasmática pueden incluir secuencias de aminoácidos de calicreína plasmática de ser humano, rata o ratón, una secuencia que es 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una de estas secuencias, o un fragmento de las mismas, p. ej., de una secuencia proporcionada más adelante.
La secuencia de calicreína plasmática humana que se utilizó en las selecciones y el posterior rastreo de proteínas de unión se muestra más adelante (número de acceso NP_000883.2). La calicreína plasmática humano (86 kDa) que se utilizó se purificó a partir de plasma humano y se activó con factor XIIa por un proveedor comercial. El factor XIIa activa la precalicreína escindiendo la secuencia polipeptídica en un solo sitio (entre Arg371-Ile372, sitio de escisión marcado con "/" en la secuencia que figura más adelante) para generar calicreína plasmática activa, que luego consiste en dos polipéptidos enlazados por disulfuro; una cadena pesada de aproximadamente 52 kDa y un dominio catalítico de aproximadamente 34 kDa [Colman y Schmaier, (1997) "Contact System: A Vascular Biology Modulator With Anticoagulant, Profibrinolytic, Antiadhesive, and Proinflammatory Attributes" Blood, 90, 3819-3843]
Las secuencias de aminoácidos de precalicreína humana, de ratón y de rata, y las secuencias de ARNm que las codifican, se ilustran más adelante. Las secuencias de precalicreína son las mismas que las de la calicreína plasmática, excepto que la calicreína plasmática activa (pkal) tiene la cadena polipeptídica simple escindida en una sola posición (indicada por "/") para generar dos cadenas. Las secuencias que se proporcionan más adelante son secuencias completas que incluyen secuencias señal. Tras la secreción de la célula de expresión, se espera que se eliminen las secuencias señal.
Se pueden encontrar proteínas de calicreína plasmática ejemplares de diversas especies en GeneBank bajo los números de acceso NP_000883.2 (proteína pKal humana), NM_000892 (ARNm de pKal humana), NP_032481.1 (proteína pKal de ratón), NM_008455.2 (ARNm de pKal de ratón), NP_036857.2 (proteína pKal de rata) y NM_012725 (ARNm de pKal de rata).
(B) Inhibidores de Calicreína
Inhibidores del Dominio de Kunitz. Un cierto número de inhibidores útiles de calicreína, ya sea calicreína tisular y/o plasmática, incluyen un dominio de Kunitz. En la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US20100183625 se describen inhibidores del dominio de Kunitz ejemplares.
Tal como se utiliza en esta memoria, un "dominio de Kunitz" es un dominio polipeptídico que tiene al menos 51 aminoácidos y que contiene al menos dos, y preferiblemente tres, disulfuros. El dominio se pliega de manera que la primera y sexta cisteínas, la segunda y cuarta y la tercera y quinta cisteínas forman enlaces disulfuro (p. ej., en un dominio de Kunitz que tiene 58 aminoácidos, las cisteínas pueden estar presentes en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 5, 14, 30, 38, 51 y 55, de acuerdo con el número de secuencias homólogas BPTI proporcionadas más adelante, y se pueden formar disulfuros entre las cisteínas en la posición 5 y 55, 14 y 38, y 30 y 51), o, si están presentes dos disulfuros, pueden formarse entre un subconjunto correspondiente de cisteínas de los mismos. El espaciamiento entre cisteínas respectivas puede estar dentro de 7, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos del siguiente espaciamiento entre posiciones correspondientes a: 5 a 55, 14 a 38 y 30 a 51, de acuerdo con la numeración de la secuencia BPTI proporcionada más adelante. La secuencia BPTI se puede utilizar como una referencia para referirse a posiciones específicas en cualquier dominio genérico de Kunitz. La comparación de un dominio de Kunitz de interés con BPTI se puede realizar identificando el alineamiento de mejor ajuste en el que se maximiza el número de cisteínas alineadas.
Se conoce la estructura 3D (a alta resolución) del dominio Kunitz de BPTI. Una de las estructuras de rayos X está depositada en el Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". Se conoce la estructura 3D de algunos homólogos de BPTI (Figenbrot et al., (1990) Protein Engineering, 3(7):591-598; Hynes et al., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022). Se conocen al menos ochenta y una secuencias del dominio de Kunitz. Homólogos humanos conocidos incluyen tres dominios Kunitz de LACI, también conocidos como inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) (Wun et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31 ):18832-18837) dos dominios Kunitz del inhibidor de Inter-a-Tripsina, APP-I (Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), un dominio de Kunitz del colágeno, tres dominios de Kunitz de TFPI-2 (Sprecher et al., (1994) PNAS USA, 91:3353 -3357), los dominios de Kunitz del inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos de tipo 1, los dominios de Kunitz del inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos de tipo 2, los dominios de Kunitz descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. N° 2004-0152633. LACI es una fosfoglicoproteína de suero humano con un peso molecular de 39 kDa que contiene tres dominios de Kunitz.
Los dominios de Kunitz anteriores se denominan LACI-K1 (residuos 50 a 107), LACI-K2 (residuos 121 a 178) y LACI-K3 (213 a 270). La secuencia de ADNc de LACI se reseña en Wun et al. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001-6004). Girard et al. (Nature, 1989, 338:518-20) reseña estudios mutacionales en los que se alteraron los residuos de PI de cada uno de los tres dominios de Kunitz. LACI-K1 inhibe el factor VIIa (F.VIIa) cuando F.VIIa forma un complejo con el factor tisular y LACI-K2 inhibe el Factor Xa.
Las proteínas que contienen dominios de Kunitz ejemplares incluyen las siguientes, con los Números de Acceso de SWISS-PROT entre paréntesis:
A4_HUMANO (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216),
A4_RATÓN (P12023), A4_RATA (P08592), A4_SAISC (Q95241),
AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMANO (Q06481), APP2_RATA (P15943),
AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVINO (P00974),
BPT2_BOVINO (P04815), CA17_HUMANO (Q02388), CA36_POLLO (P15989),
CA36_HUMANO (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (062845),
ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMANO (O95925), EPPI_RATÓN (Q9DA01),
HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR (P00993), IBPC_BOVINO (P00976),
IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVINO (P00975), ICS3_BOMMO (P07481),
IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831),
ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129),
ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660),
IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989),
IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986),
IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859),
VBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980),
IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981),
IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968),
SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMANO (P49223), TKD1_BOVINO (Q28201),
TKD1_OVEJA (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100),
AMBP_BOVINO (P00978), AMBP_HUMANO (P02760), AMBP_MERUN (Q62577),
AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_RATÓN (Q07456), AMBP_CERDO (P04366),
AMBP_RATA (Q64240), IATR_CABALLO (P04365), IATR_OVEJA (P13371),
SPT1_HUMANO (043278), SPT1_RATÓN (Q9R097), SPT2_HUMANO (043291),
SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_MOUSE (O35536),
TFPI_HUMANO (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_RATÓN (054819),
TFPI_CONEJO (P19761), TFPI_RATA (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)
Se puede utilizar una diversidad de métodos para identificar un dominio de Kunitz a partir de una base de datos de secuencias. Por ejemplo, se puede buscar una secuencia de aminoácidos conocida de un dominio de Kunitz, una secuencia de consenso o un motivo (p. ej., el Motivo ProSite) en las bases de datos de secuencias de GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda MD), p. ej., utilizando BLAST; contra la base de datos de Pfam de HMMs (Modelos Ocultos de Markov) (p. ej., utilizando parámetros predeterminados para la búsqueda de Pfam; contra la base de datos SMART; o contra la base de datos de ProDom. Por ejemplo, el Número de Acceso de Pfam PF00014 de la versión 9 de Pfam proporciona numerosos dominios de Kunitz y un HMM para identificar los dominios de Kunitz. Se puede encontrar una descripción de la base de datos Pfam en Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420 y se puede encontrar una descripción detallada de los HMMs, por ejemplo, en Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol.183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314. La base de datos SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, EMBL, Heidelberg, DE) de HMMs tal como se describe en Schultz et al. (1998) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857 y Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231. La base de datos SMART contiene dominios identificados mediante la elaboración de perfiles con los modelos ocultos de Markov del programa de búsqueda HMMer2 (R. Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press). La base de datos también está anotada y supervisada. La base de datos de dominios de proteínas ProDom consiste en una compilación automática de dominios homólogos (Corpet et al. (1999) , Nucl. Acids Res. 27:263- 267). Las versiones actuales de ProDom se construyen utilizando búsquedas PSI-BLAST recursivas (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340.) de las bases de datos de proteínas SWISS-PROT 38 y TREMBL. La base de datos genera automáticamente una secuencia de consenso para cada uno de los dominios. Prosite enumera el dominio de Kunitz como motivo e identifica proteínas que incluyen un dominio de Kunitz. Véase, p. ej., Falquet et al. Nucleic Acids Res.
30:235-238(2002).
Los dominios de Kunitz interactúan con la proteasa diana utilizando, principalmente, aminoácidos en dos regiones de bucle ("bucles de unión"). La primera región de bucle está entre aproximadamente los residuos correspondientes a los aminoácidos 13-20 de BPTI. La segunda región de bucle está entre aproximadamente los residuos correspondientes a los aminoácidos 31-39 de BPTI. Una colección ejemplar de dominios de Kunitz varía una o más posiciones de aminoácidos en las primera y/o segunda regiones de bucle. Posiciones particularmente útiles para variar, cuando se rastrean dominios de Kunitz que interactúan con calicreína o cuando se seleccionan variantes de afinidad mejoradas, incluyen: las posiciones 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34 y 39 con respecto a la secuencia de BPTI. Se espera que al menos algunas de estas posiciones estén en estrecho contacto con la proteasa diana. También es útil variar otras posiciones, p. ej., posiciones que son adyacentes a las posiciones antes mencionadas en la estructura tridimensional.
La "región marco" de un dominio de Kunitz se define como aquellos residuos que forman parte del dominio de Kunitz, pero excluyen específicamente los residuos en la primera y segunda regiones de bucles de unión, es decir, alrededor de los residuos correspondientes a los aminoácidos 13-20 de BPTI y 31-39 de BPTI. A la inversa, los residuos que no están en el bucle de unión pueden tolerar una gama más amplia de sustitución de aminoácidos (p. ej., sustituciones conservadoras y/o no conservadoras).
En una realización, estos dominios de Kunitz son formas variantes de la estructura en bucle que incluye el dominio 1 de Kunitz de la proteína inhibidora de la coagulación asociada a lipoproteínas humana (LACI). LACI contiene tres estructuras de bucle peptídico internas, bien definidas, que son dominios paradigmáticos de Kunitz (Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). Las variantes del dominio 1 de Kunitz de LACI descritas en esta memoria han sido rastreadas, aisladas y se unen a calicreína con una afinidad y especificidad potenciadas(véanse, p. ej., las Pat. de EE.UU. N°s 5.795.865 y 6.057.287). Estos métodos también se pueden aplicar a otros marcos de dominio de Kunitz para obtener otros dominios de Kunitz que interactúan con calicreína, p. ej., calicreína plasmática. Moduladores útiles de la función de calicreína se unen típicamente y/o inhiben calicreína, según se determina utilizando ensayos de unión e inhibición de calicreína.
Un polipéptido ejemplar que incluye un dominio de Kunitz que inhibe la calicreína plasmática tiene o incluye la secuencia de aminoácidos definida por los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2. Otro polipéptido ejemplar que incluye un dominio de Kunitz que inhibe la calicreína plasmática tiene o incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Un polipéptido ejemplar incluye la secuencia de aminoácidos:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO:1).
"Xaa" se refiere a una posición en una cadena peptídica que puede ser cualquiera de un cierto número de aminoácidos diferentes. En un primer ejemplo, Xaa puede contener cualquier aminoácido excepto cisteína. En otro ejemplo, se aplican uno o más de los siguientes: Xaa10 puede ser Asp o Glu; Xaa11 puede ser Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala o Thr; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys o Gln; Xaa15 puede ser Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn o Gln; Xaa16 puede ser Ala, Gly, Ser, Asp o Asn; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln o Thr; Xaa18 puede ser His, Leu, Gln o Ala; Xaa19 puede ser Pro, Gln, Leu, Asn o Ile; Xaa21 puede ser Trp, Phe, Tyr, His o Ile; Xaa31 puede ser Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile o Thr; Xaa32 puede ser Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly o Val; Xaa34 puede ser Ile, Thr, Ser, Val, Ala, Asn, Gly o Leu; Xaa35 puede ser Tyr, Trp o Phe; Xaa39 puede ser Glu, Gly, Ala, Ser o Asp. Los aminoácidos Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoácido.
Adicionalmente, cada uno de los primeros cuatro (Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4) y al menos tres aminoácidos 9 (Xaa56, Xaa57 o Xaa58) de SEQ ID NO: 1 pueden estar opcionalmente presentes o ausentes y puede ser cualquier aminoácido, si está presente, p. ej., cualquier aminoácido que no sea cisteína.
En una realización, el polipéptido tiene una secuencia con una o más de las siguientes propiedades: Xaa11 puede ser Asp, Gly, Ser o Val; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His o Asn; Xaa15 puede ser Arg o Lys; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser o Ile; Xaa18 puede ser His, Leu o Gln; Xaa19 puede ser Pro, Gln o Leu; Xaa21 puede ser Trp o Phe; Xaa31 es Glu; Xaa32 puede ser Glu o Gln; Xaa34 puede ser Ile, Thr o Ser; Xaa35 es Tyr; y Xaa39 puede ser Glu, Gly o Ala.
Un polipéptido ejemplar puede incluir los siguientes aminoácidos: Xaa10 es Asp; Xaa11 es Asp; Xaa13 puede ser Pro o Arg; Xaa15 es Arg; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 es Ala; Xaa18 es His; Xaa19 es Pro; Xaa21 es Trp; Xaa31 es Glu; Xaa32 es Glu; Xaa34 puede ser Ile o Ser; Xaa35 es Tyr y Xaa39 es Gly.
También es posible utilizar porciones de los polipéptidos descritos en esta memoria. Por ejemplo, los polipéptidos podrían incluir dominios de unión para epítopos de calicreína específicos. Por ejemplo, los bucles de unión de los dominios de Kunitz pueden ciclarse y utilizarse de forma aislada o pueden injertarse en otro dominio, p. ej., un marco de otro dominio de Kunitz. También es posible eliminar uno, dos, tres o cuatro aminoácidos del extremo N de una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria, y/o uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos del extremo C de una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria.
Ejemplos adicionales de secuencia incluyen los que difieren en al menos un aminoácido, pero menos de siete, seis, cinco, cuatro, tres o dos aminoácidos de diferencia con respecto a una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria, p. ej., una secuencia de aminoácidos arriba proporcionada. En una realización, hay menos de tres, dos o una diferencias en uno de los bucles de unión. Por ejemplo, el primer bucle de unión puede no tener diferencias con respecto a una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria, p. ej., una secuencia de aminoácidos arriba proporcionada. En otro ejemplo, ni el primer ni el segundo bucle de unión difieren de una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria, p. ej., una secuencia de aminoácidos arriba proporcionada.
Otros polipéptidos que inhiben calicreína plasmática incluyen una secuencia de aproximadamente 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2 o el polipéptido PEP-1 que tiene la secuencia de 60 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Los términos "PEP-1" y "DX-88", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren ambos a la secuencia de 60 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En una realización, el polipéptido es distinto de aprotinina, p. ej., se diferencia de aprotinina en al menos uno, dos, tres, cinco, diez o quince aminoácidos.
Los polipéptidos descritos en esta memoria se pueden preparar sintéticamente utilizando cualquier protocolo y equipo estándar de síntesis de polipéptidos. Por ejemplo, la síntesis paso a paso de un polipéptido se puede llevar a cabo mediante la eliminación de un grupo protector del extremo amino (N) de un aminoácido inicial (es decir, el extremo carboxi) y el acoplamiento al mismo del extremo carboxilo del siguiente aminoácido en la secuencia del polipéptido. Este aminoácido también está adecuadamente protegido. El grupo carboxilo del aminoácido entrante se puede activar para reaccionar con el extremo N del aminoácido unido mediante la formación de un grupo reactivo tal como la formación de una carbodiimida, un anhídrido de ácido simétrico o un grupo "éster activo", tal como ésteres de hidroxibenzotriazol o pentafluorofenilo. Métodos preferidos de síntesis de péptidos en fase sólida incluyen el método BOC, que utiliza terc.-butiloxicarbonilo como el grupo protector de I-amino, y el método FMOC, que utiliza 9-fluorenilmetiloxicarbonilo para proteger el alfa-amino de los residuos de aminoácidos. Ambos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica (Stewart, J. y Young, J., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco 1989); Merrifield, J., 1963. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky, M. y Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York 1984)). Si se desea, se pueden diseñar aminoácidos amino- y/o carboxi-terminales adicionales en la secuencia de aminoácidos y añadirlos durante la síntesis de polipéptidos.
Los polipéptidos también se pueden producir utilizando tecnología recombinante. Los métodos recombinantes pueden emplear cualquiera de un cierto número de células y los correspondientes vectores de expresión, incluyendo, pero no limitados a vectores de expresión bacterianos, vectores de expresión de levaduras, vectores de expresión de baculovirus, vectores de expresión virales de mamíferos, y similares. Un polipéptido descrito en esta memoria puede ser producido por un animal transgénico, p. ej., en la glándula mamaria de un animal transgénico. En algunos casos, podría ser necesario o ventajoso fusionar la secuencia codificante de un polipéptido que inhibe calicreína (p. ej., un polipéptido que incluye un dominio Kunitz) con otra secuencia codificante en un vector de expresión para formar un polipéptido de fusión que se expresa fácilmente en una célula huésped. Se puede eliminar parte o toda la secuencia adicional, p. ej., mediante digestión con proteasa.
Un ejemplo de sistema de expresión recombinante para producir un polipéptido que inhibe la calicreína (p. ej., un polipéptido que incluye un dominio de Kunitz) es un vector de expresión de levaduras, que permite que una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido inhibidor se enlace en el mismo marco de lectura con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del péptido conductor prepro MATa de Saccharomyces cerevisiae, que a su vez está bajo el control de un promotor de levadura operativo. El plásmido de expresión de levaduras recombinante resultante se puede transformar mediante métodos estándares en las células de un huésped de levadura compatible apropiado, cuyas células son capaces de expresar la proteína recombinante del vector de expresión de levadura recombinante. Preferiblemente, una célula de levadura huésped transformada con vector de expresión recombinante de este tipo también es capaz de procesar la proteína de fusión para proporcionar un polipéptido inhibidor activo. Otro huésped de levaduras ejemplar para producir polipéptidos recombinantes es Pichia pastoris.
Como se indicó arriba, los polipéptidos que inhiben la calicreína pueden incluir un polipéptido del dominio de Kunitz descrito en esta memoria. Algunos polipéptidos pueden incluir una secuencia flanqueante adicional, preferiblemente de uno a seis aminoácidos de longitud, en el extremo amino- y/o carboxi-terminal, con la condición de que aminoácidos adicionales de este tipo no disminuyan significativamente la afinidad de unión de calicreína o la actividad de inhibición de calicreína con el fin de excluir el uso en los métodos y composiciones descritos en esta memoria. Aminoácidos adicionales de este tipo pueden añadirse deliberadamente para expresar un polipéptido en una célula huésped recombinante particular o pueden añadirse para proporcionar una función adicional, p. ej., para proporcionar un enlazador a otra molécula o para proporcionar un resto de afinidad que facilite la purificación del polipéptido. Preferiblemente, el o los aminoácidos adicionales no incluyen cisteína, que podría interferir con los enlaces disulfuro del dominio de Kunitz.
Un polipéptido del dominio de Kunitz ejemplar incluye la secuencia de aminoácidos de los residuos 3-60 de SEQ ID NO: 2. Cuando se expresa y procesa en un sistema de expresión de proteína de fusión de levaduras (p. ej., basado en el plásmido de expresión integrador pHIL-D2), un polipéptido del dominio Kunitz de este tipo retiene un dipéptido de Glu-Ala amino terminal adicional de la fusión con la secuencia del péptido conductor MATalfa-prepro de S. cerevisiae.. Cuando se secreta de la célula huésped de levadura, la mayor parte del péptido conductor se procesa a partir de la proteína de fusión para producir un polipéptido funcional (al que se alude en esta memoria como "PEP-1") que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Un dominio de Kunitz típico, p. ej., que incluye, SEQ ID NO: 1, contiene un cierto número de posiciones invariantes, p. ej., las posiciones correspondientes a la posición 5, 14, 30, 33, 38, 45, 51 y 55 en el esquema de numeración BPTI son cisteína. El espaciamiento entre estas posiciones puede variar en la medida permitida dentro del pliegue del dominio de Kunitz, p. ej., de manera que se formen tres enlaces disulfuro. Otras posiciones tales como, por ejemplo, las posiciones 6, 7, 8, 9, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53 y 54, o las posiciones correspondientes a esas posiciones, pueden ser cualquier aminoácido (incluyendo aminoácidos que se producen codificados no genéticamente). En una realización particularmente preferida, uno o más aminoácidos corresponden al de una secuencia nativa. En otra realización, al menos una posición variable es diferente de la de la secuencia nativa. En otra realización preferida más, cada uno de los aminoácidos puede estar sustituido individual o colectivamente con una sustitución de aminoácidos conservadora o no conservadora.
Sustituciones conservadoras de aminoácidos reemplazan un aminoácido por otro aminoácido de naturaleza química similar y es posible que no afecten la función de las proteínas. Sustituciones no conservadoras de aminoácidos reemplazan un aminoácido por otro aminoácido de estructura química diferente. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservados incluyen, por ejemplo, Asn->Gln, Arg->Lys y Ser->Thr. En una realización preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y/o 21 de estos aminoácidos pueden seleccionarse independiente o colectivamente, en cualquier combinación, para corresponder a la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2.
Otras posiciones, por ejemplo, posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21,22, 23, 31,32, 34, 35, 39, 40, 43 y 45, o posiciones correspondientes a esas posiciones pueden ser cualquiera de un conjunto seleccionado de aminoácidos. Por ejemplo, SEQ ID NO: 1 define un conjunto de posibles secuencias. Cada uno de los miembro de este conjunto contiene, por ejemplo, una cisteína en las posiciones 5, 14, 30, 51 y 55, y cualquiera de un conjunto específico de aminoácidos en las posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21,22, 23, 31,32, 34, 35, 39, 40, 43 y 45, o posiciones correspondientes a esas posiciones. En una realización preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y/o 19 de estos aminoácidos pueden estar, independiente o colectivamente, en cualquier combinación, seleccionada para que corresponda a la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2. El polipéptido tiene preferiblemente al menos 80%, 85%, 90%, 95, 97, 98 o 99% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444-453, que ha sido incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que debe utilizarse si el médico no está seguro de qué parámetros se debe aplicar para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de espacio de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de huecop de desplazamiento de marco de 5.
Inhibidores de Proteínas de Unión. En otras realizaciones, los inhibidores de calicreína son proteínas de unión, tales como anticuerpos. Se describen proteínas de unión ejemplares tales como anticuerpos, p. ej., en la Publicación PCT WO2012/094587 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 20100183625.
En un aspecto, la divulgación presenta una proteína (p. ej., una proteína aislada) que se une a la calicreína plasmática (p. ej., calicreína plasmática humana) e incluye al menos una región variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la proteína incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada (HC) y/o una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera (LC). La proteína puede unirse a e inhibir la calicreína plasmática, p. ej., calicreína plasmática humana.
La proteína puede incluir una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o una región marco humana; (b) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina comprende una o más (p. ej., 1,2 o 3) CDRs que son al menos 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en esta memoria; (c) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina comprende una o más (p. ej., 1,2 o 3) CDRs que son al menos 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idénticas a una CDR de un dominio variable LC descrito en esta memoria; (d) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina es al menos 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a un dominio variable de LC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs); (e) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a un dominio variable de HC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs); (f) la proteína se une a un epítopo unido por una proteína descrita en esta memoria o compite por unirse con una proteína descrita en esta memoria; (g) una CDR de primate o una región marco de primate; (h) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina comprende una CDR1 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de HC descrito en esta memoria; (i) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina comprende una CDR2 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de HC descrito en esta memoria; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC comprende una CDR3 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable HC descrito en esta memoria; (k) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina comprende una CDR1 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable LC descrito en esta memoria; (1) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina comprende una CDR2 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable LC descrito en esta memoria; (m) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC comprende una CDR3 que difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de LC descrito en esta memoria; (n) la secuencia del dominio variable de LC de inmunoglobulina difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable LC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs); y (o) la secuencia del dominio variable de HC de inmunoglobulina difiere en al menos un aminoácido pero no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable HC descrito en esta memoria (p. ej., global o en regiones marco o CDRs).
La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser una proteína aislada (p. ej., al menos 70, 80, 90, 95 o 99% libre de otras proteínas). La proteína de unión a calicreína plasmática puede inhibir la calicreína plasmática, p. ej., calicreína plasmática humana. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (p. ej., precalicreína humana), pero sí a la forma activa de calicreína plasmática (p. ej., calicreína plasmática humana).
En determinadas realizaciones, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de la calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une a un epítopo que se solapa con el sitio activo de la calicreína plasmática. En algunos aspectos, la proteína se une al mismo epítopo o compite por unirse con una proteína descrita en esta memoria.
En algunas realizaciones, la proteína compite con o se une al mismo epítopo que M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922) X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04. Véase, p. ej., la Publicación PCT WO2012/094587 y la Publicación de la Solicitud de Patente de EE,.UU. 20100183625.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la tríada catalítica de la calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
La proteína se puede unir a calicreína plasmática, p. ej., calicreína plasmática humana, con una afinidad de unión de al menos 105 , 106 , 107 , 108 , 109 , 1010 y 1011 M-1. En una realización, la proteína se une a calicreína plasmática humana con una Kdisoc más lenta que 1 x 10-3, 5 x 10-4 s-1 o 1 x 10-4 s-1. En una realización, la proteína se une a calicreína plasmática humana con una Kasoc. más rápida que 1 x 102 , 1 x 103 o 5 x 103 M-1s-1. En una realización, la proteína se une a la calicreína plasmática, pero no a la calicreína tisular y/o la precalicreína plasmática (p. ej., la proteína se une a la calicreína tisular y/o la precalicreína plasmática de manera menos efectiva (p. ej., 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o en absoluto, p. ej., en comparación con un control negativo) de lo que se une a la calicreína plasmática.
En una realización, la proteína inhibe la actividad de la calicreína plasmática humana, por ejemplo, con una Ki de menos de 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 y 10-10 M. La proteína puede tener, por ejemplo, una Cl50 menor que 100 nM, 10 nM o 1 nM. Por ejemplo, la proteína puede modular la actividad de la calicreína plasmática, así como la producción de Factor XIla (p. ej., a partir del Factor XII) y/o bradiquinina (p. ej., a partir de quininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La proteína puede inhibir la actividad de la calicreína plasmática y/o la producción de Factor Xlla (p. ej., a partir de Factor XII) y/o bradiquinina (p. ej., a partir de quininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La afinidad de la proteína por la calicreína plasmática humana se puede caracterizar por una Kd menor que 100 nm, menor que 10 nM o menor que 1 nM. En una realización, la proteína inhibe la calicreína plasmática, pero no inhibe la calicreína tisular (p. ej., la proteína inhibe la calicreína tisular con menor eficacia (p. ej., 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o en absoluto), p. ej., en comparación con un control negativo) que inhibe la calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) de menos de 1000, 500, 100 o 10 nM.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser anticuerpos. Los anticuerpos de unión a calicreína plasmática pueden tener sus secuencias del dominio variable de HC y LC incluidas en un único polipéptido (p. ej., scFv) o en diferentes polipéptidos (p. ej., IgG o Fab).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligera y/o pesada de anticuerpos seleccionadas del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene una o más (p. ej., 1,2 o 3) CDRs de la cadena pesada seleccionadas de las CDRs correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene una o más (p. ej., 1, 2 o 3) CDRs de cadena ligera seleccionadas de las CDRs correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano) que tiene una o más (p. ej., 1, 2 o 3) CDRs de la cadena pesada y una o más (p. ej., 1, 2 o 3) CDRs de la cadena ligera.seleccionadas de las CDRs correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (al que también se alude en esta memoria como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización, las secuencias de los dominios variables de HC y LC son componentes de la misma cadena polipeptídica. En otra, las secuencias de los dominios variables de HC y LC son componentes de diferentes cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, la proteína es una IgG, p. ej., IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble. En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2’, scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab u otra molécula que comprenda el sitio de combinación de antígeno de una de las proteínas de unión de esta memoria. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA LC, HSA::VH::CH1 LC, LC::HSA VH::CH1, h Sa ::LC VH::c H1 u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o no es inmunogénica en un ser humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones marco de anticuerpos humanos, p. ej., todas las regiones marco humanas, o regiones marco al menos 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idéntico a las regiones marco humanas. En una realización, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o no es inmunogénica en un ser humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones marco de anticuerpos de primates, p. ej., todas las regiones marco de primates, o regiones marco al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idéntico a las regiones marco de primates. En una realización, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos, (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lémures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo de primates por la calicreína plasmática humana se caracteriza por una Kd de menos de 1000, 500, 100 o 10 nM, p. ej., menos de 10 nM o menos de 1 nM.
En una realización, la proteína incluye regiones marco humanas, o regiones marco que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idénticas a regiones marco humanas. En determinadas realizaciones, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (p. ej., no es un anticuerpo murino o de conejo).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona el uso de proteínas (p. ej., proteínas de unión, p. ej., anticuerpos) (p. ej., las proteínas descritas en esta memoria) que se unen a la calicreína plasmática (p. ej., calicreína plasmática humana) e incluyen al menos una región variable de inmunoglobina en métodos para tratar una enfermedad o trastorno descrito en este memoria. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada (HC) y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera (LC). En esta memoria se describe un cierto número de proteínas de unión a calicreína plasmática ejemplares.
Los anticuerpos pueden descubrirse mediante el rastreo de una colección utilizando una diana de calicreína, así como por otros métodos. Por ejemplo, la proteína calicreína o una región de la misma se puede utilizar como un antígeno en un animal no humano, p. ej., un roedor. Pueden generarse anticuerpos humanizados reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están directamente implicadas en la unión de antígenos con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Métodos generales para generar anticuerpos humanizados son proporcionados por Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, by Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al. Patentes de EE.UU. N°s 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la totalidad o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Se encuentran disponibles numerosas fuentes de un ácido nucleico de este tipo. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, tal como se describió arriba. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o un fragmento del mismo, puede luego clonarse en un vector de expresión apropiado.
Las proteínas de unión a inmunoglobulina calicreína (p. ej., proteínas de unión a calicreína IgG o Fab) pueden modificarse para reducir la inmunogenicidad. Es deseable una inmunogenicidad reducida en las proteínas de unión a calicreína destinadas a ser utilizadas como agentes terapéuticos, ya que ésta reduce la posibilidad de que el sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria contra la molécula terapéutica. Técnicas útiles para reducir la inmunogenicidad de las proteínas de unión a calicreína incluyen la eliminación/modificación de epítopos de células T humanas potenciales y la ‘germinización’ de secuencias fuera de las CDRs (p. ej., marco y Fc).
Un anticuerpo de unión a calicreína puede modificarse mediante deleción específica de epítopos de células T humanas o "desinmunización" mediante los métodos descritos en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo se analizan en cuanto a péptidos que se unen a MHC de Clase II; estos péptidos representan epítopos potenciales de células T (tal como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopos de células T, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado "enhebrado de péptidos" y, además, se puede buscar en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos los motivos presentes en las secuencias VH y VL, tal como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR del MHC de clase II y, por lo tanto, constituyen epítopos potenciales de células T. Los epítopos potenciales de células T detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácidos en las regiones variables o, preferiblemente, mediante sustituciones de un solo aminoácido. En la medida de lo posible se realizan sustituciones conservadoras, a menudo, pero no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común en esta posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se describen en Tomlinson, I.A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al., 1995, Immunol. Today Vol.
16 (5): 237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio. 227:799-817. El directorio V Ba Se proporciona un directorio completo de secuencias de regiones variables de la inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, IA et al. MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Una vez identificados los cambios desinmunizantes, los ácidos nucleicos que codifican Vh y Vl pueden construirse mediante mutagénesis u otros métodos sintéticos (p. ej., síntesis de novo, sustitución de casetes, etcétera). La secuencia variable mutagenizada puede, opcionalmente, fusionarse con una región constante humana, p. ej., regiones constantes de IgG 1 humana o k.
En algunos casos, un epítopo de células T potencial incluirá residuos que se sabe o se predice que son importantes para la función del anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos de células T potenciales están habitualmente orientados hacia las CDRs. Además, pueden aparecer epítopos de células T potenciales en residuos marco importantes para la estructura y unión del anticuerpo. Los cambios para eliminar estos epítopos potenciales requerirán en algunos casos un mayor escrutinio, p. ej., creando y testando cadenas con y sin el cambio. Cuando fue posible, los epítopos de células T potenciales que se solapan con las CDRs se eliminaron mediante sustituciones fuera de las CDRs. En algunos casos, una alteración dentro de una CDR es la única opción y, por lo tanto, se deben probar las variantes con y sin esta sustitución. En otros casos, la sustitución necesaria para eliminar un epítopo de células T potencial se encuentra en una posición de residuo dentro del marco que podría ser crítico para la unión del anticuerpo. En estos casos, deben testarse variantes con y sin esta sustitución. Por tanto, en algunos casos se diseñaron varias regiones variables de la cadena pesada y ligera desinmunizadas variantes y se testaron diversas combinaciones de cadena pesada/ligera con el fin de identificar el anticuerpo desinmunizado óptimo. La elección del anticuerpo desinmunizado final puede hacerse entonces considerando la afinidad de unión de las diferentes variantes junto con el grado de desinmunización, es decir, el número de epítopos de células T potenciales que quedan en la región variable. La desinmunización puede utilizarse para modificar cualquier anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que incluye una secuencia no humana, p. ej., un anticuerpo sintético, un anticuerpo murino, otro anticuerpo monoclonal no humano o un anticuerpo aislado de una colección de presentación.
Los anticuerpos que se unen a la calicreína son "germinados" invirtiendo uno o más aminoácidos no de la línea germinal en las regiones marco en los correspondientes aminoácidos de la línea germinal del anticuerpo, siempre que se retengan sustancialmente las propiedades de unión. También pueden utilizarse métodos similares en la región constante, p. ej., en dominios de inmunoglobulina constantes.
Los anticuerpos que se unen a calicreína, p. ej., un anticuerpo descrito en esta memoria, pueden modificarse con el fin de hacer que las regiones variables del anticuerpo sean más similares a una o más secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos, p. ej., en un marco, una CDR o región constante, para hacerlo más similar a una secuencia de la línea germinal de referencia. Un método de germinización ejemplar puede incluir identificar una o más secuencias de la línea germinal que son similares (p. ej., las más similares en una base de datos particular) a la secuencia del anticuerpo aislado. A continuación, se producen mutaciones (al nivel de aminoácidos) en el anticuerpo aislado, ya sea de forma incremental o en combinación con otras mutaciones. Por ejemplo, se crea una coiección de ácidos nucleicos que incluye secuencias que codifican algunas o todas las posibles mutaciones de la línea germinal. A continuación, los anticuerpos mutados se evalúan, p. ej., para identificar un anticuerpo que tiene uno o más residuos de línea germinal adicionales con respecto al anticuerpo aislado y que todavía es útil (p. ej., tiene una actividad funcional). En una realización, se introducen tantos residuos de la línea germinal en un anticuerpo aislado como sea posible.
En una realización, la mutagénesis se utiliza para sustituir o insertar uno o más residuos de la línea germinal en un marco y/o una región constante. Por ejemplo, una estructura de la línea germinal y/o un residuo de la región constante pueden ser de una secuencia de la línea germinal que es similar (p. ej., la más similar) a la región no variable que se está modificando. Después de la mutagénesis, se puede evaluar la actividad (p. ej., la unión u otra actividad funcional) del anticuerpo para determinar si el residuo o residuos de la línea germinal son tolerados (es decir, no anula la actividad). Se puede realizar una mutagénesis similar en las regiones marco.
La selección de una secuencia de la línea germinal se puede realizar de diferentes formas. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia de la línea germinal si cumple con un criterio predeterminado de selectividad o similitud, p. ej., al menos un determinado porcentaje de identidad, p. ej., al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% de identidad. La selección se puede realizar utilizando al menos 2, 3, 5 o 10 secuencias de la línea germinal. En el caso de CDR1 y CDR2, identificar una secuencia de la línea germinal similar puede incluir seleccionar una de tales secuencias. En el caso de CDR3, identificar una secuencia de la línea germinal similar puede incluir seleccionar una de tales secuencias, pero puede incluir el uso de dos secuencias de la línea germinal que contribuyan por separado a la porción amino-terminal y la porción carboxi-terminal. En otras implementaciones, se utilizan más de una o dos secuencias de la línea germinal, p. ej., para formar una secuencia consenso.
En una realización, con respecto a una secuencia del dominio variable de referencia particular, p. ej., una secuencia descrita en esta memoria, una secuencia del dominio variable relacionada tiene al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de las posiciones de aminoácidos de la CDR que no son idénticas a los residuos en las secuencias de CDR de referencia, residuos que son idénticos a los residuos en las posiciones correspondientes en una secuencia de la línea germinal humana (es decir, una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de la línea germinal humana).
En una realización, con respecto a una secuencia del dominio variable de referencia particular, p. ej., una secuencia descrita en esta memoria, una secuencia del dominio variable relacionada tiene al menos 30, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de las regiones FR idénticas a la secuencia de la FR de una secuencia de la línea germinal humana, p. ej., una secuencia de la línea germinal relacionada con la secuencia del dominio variable de referencia.
Por consiguiente, es posible aislar un anticuerpo que tiene una actividad similar a un anticuerpo de interés dado, pero que es más similar a una o más secuencias de la línea germinal, particularmente una o más secuencias de la línea germinal humana. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% idéntico a una secuencia de la línea germinal en una región fuera de las CDRs (p. ej., regiones marco). Además, un anticuerpo puede incluir al menos 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de la línea germinal en una región CDR, siendo el residuo de la línea germinal de una secuencia de la línea germinal similar (p. ej., la más similar) a la región variable que se modifica. Secuencias de la línea germinal de interés principal son las secuencias de la línea germinal humana. La actividad del anticuerpo (p. ej., la actividad de unión medida por Ka) puede estar dentro de un factor de 100, 10, 5, 2, 0,5, 0,1 y 0,001 del anticuerpo original.
Se han determinado secuencias de la línea germinal de los genes de inmunoglobina humana y están disponibles de un cierto número de fuentes, incluyendo el international ImMunoGeneTics information system® (IMGT), disponible a través de la red mundial en mgt.cines.fr, y el directorio V BASE (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido, disponible a través de la red mundial en vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk).
Secuencias de referencia de la línea germinal ejemplares para Vkappa incluyen: O12/O2, O18/O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9 ,L24, L11, L12, O11/O1, A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11, L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10, y A14. Véase, p. ej., Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-3.
Una secuencia de referencia de la línea germinal para el dominio variable de HC puede basarse en una secuencia que tiene estructuras canónicas particulares, p. ej., estructuras 1-3 en los bucles hipervariables H1 y H2. Las estructuras canónicas de los bucles hipervariables de un dominio variable de inmunoglobulina se pueden inferir a partir de su secuencia, tal como se describe en Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798); y Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38. Secuencias ejemplares con una estructura 1-3 incluyen: DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32, DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53, y DP-54.
Polipéptidos útiles también pueden ser codificados por un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en esta memoria. Los ácidos nucleicos pueden hibridar en condiciones de rigurosidad media, alta o muy alta. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, alta o muy alta" describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse una orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. ( (1989), 6,3.1-6,3.6. Métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden utilizar. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en esta memoria son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en 0.2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55°C para condiciones de baja rigurosidad); (2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y (4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65°C.
Producción de Proteínas. Pueden utilizarse métodos estándares de ácido nucleico recombinante para expresar una proteína que se une a la calicreína plasmática. Generalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión de ácido nucleico. Por supuesto, si la proteína incluye múltiples cadenas polipeptídicas, cada una de las cadenas puede clonarse en un vector de expresión, p. ej., el mismo o diferentes vectores, que se expresan en la misma o diferentes células.
Producción de Anticuerpos. Algunos anticuerpos, p. ej., Fabs, se pueden producir en células bacterianas, p. ej., células de E. coli. Por ejemplo, si el Fab es codificado por secuencias en un vector de presentación de fagos que incluye un codón de parada suprimible entre la entidad de presentación y una proteína de bacteriófago (o un fragmento de la misma), el ácido nucleico del vector se puede transferir a una célula bacteriana que no puede suprimir un codón de parada. En este caso, el Fab no se fusiona con la proteína del gen III y se secreta en el periplasma y/o el medio.
Anticuerpos también se pueden producir en células eucarióticas. En una realización, los anticuerpos (p. ej., scFvs) se expresan en una célula de levadura tal como Pichia (véase, p. ej., Powers et al., 2001, J. Immunol. Methods. 251:123-35), Hanseula, o Saccharomyces.
En una realización preferida, los anticuerpos se producen en células de mamífero. Células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos clon o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen el ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, utilizado con un marcador seleccionable DHFR, p. ej., tal como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621), líneas de células linfocíticas, p. ej., células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, células HEK293T (J. Immunol. Methods (2004) 289(1-2): 65-80), y una célula de un animal transgénico, p. ej., un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.
Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina diversificado, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N°s 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418).
En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células CHO dhfr- mediante transfección mediada por fosfato cálcico.. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo están enlazados operativamente a elementos reguladores del potenciador/promotor (p. ej., derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador del potenciador de SV40/promotor AdMLP o un elemento regulador del potenciador de CMV/promotor de AdMLP) para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan técnicas estándar de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden aislarse mediante cromatografía de afinidad con una matriz acoplada de Proteína A o Proteína G.
Para anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede producir anticuerpos en los que la región Fc está glicosilada. Por ejemplo, el dominio Fc de las moléculas de IgG está glicosilado en la asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio de modificación con oligosacáridos de tipo biantenario. Se ha demostrado que esta glicosilación se requiere para las funciones efectoras mediadas por los receptores Fcg y el complemento C1q (Burton y Woof, 1992, Adv. Immunol. 51:1 -84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). En una realización, el dominio Fc se produce en un sistema de expresión de mamífero que glicosila apropiadamente el residuo correspondiente a la asparagina 297. El dominio Fc también puede incluir otras modificaciones postraduccionales eucarióticas.
Anticuerpos también se pueden producir por un animal transgénico. Por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N° 5.849.992 describe un método para expresar un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico para la leche y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de interés y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por hembras de mamíferos transgénicos de este tipo incluye, secretada en ella, el anticuerpo de interés. El anticuerpo puede purificarse de la leche o, para algunas aplicaciones, utilizarse directamente.
(C) Modificaciones
Es posible modificar de diversas maneras polipéptidos que inhiben la calicreína. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden fijar a uno o más restos de polietilenglicol para estabilizar el compuesto o prolongar los tiempos de retención, p. ej., en al menos 2, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 50, 100, 500 o 1000 veces.
En una realización, una proteína de unión a calicreína se asocia físicamente con un resto que mejora su estabilización y/o retención en la circulación, p. ej., en sangre, suero, linfa u otros tejidos, p. ej., en al menos 1,5, 2, 5, 10. o 50 veces. Por ejemplo, una proteína de unión a calicreína se puede asociar con un polímero, p. ej., un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un poli(óxido de alquileno) o un poli(óxido de etileno). Polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Se pueden utilizar polímeros que tienen pesos moleculares medios numéricos que varían de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 (o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000 y de 2.000 a aproximadamente 12.500). Por ejemplo, una proteína de unión a calicreína se puede conjugar con un polímero hidrosoluble, p. ej., polímeros de polivinilo hidrófilos, p. ej., poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Se puede fijar una pluralidad de restos poliméricos a un polipéptido, p. ej., al menos dos, tres o cuatro restos de este tipo, p. ej., que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 2.000 a 7.000 Dalton. Una lista no limitante de polímeros de este tipo incluye homopolímeros de poli(óxido de alquileno), tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque.
Por ejemplo, el polipéptido se puede conjugar con un polímero hidrosoluble, p. ej., un polímero de polivinilo hidrófilo, p. ej., poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de polímeros de este tipo incluye homopolímeros de poli(óxido de alquileno), tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Polímeros útiles adicionales incluyen polioxialquilenos, tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloques de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (p. ej., ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos, tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicógeno o la subunidad de polisacáridos de mucopolisacáridos ácidos, p. ej., ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar, tales como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparano.
Es posible que uno o más residuos de aminoácidos de marco y/o CDR de una proteína de unión incluyan una o más mutaciones (p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones o deleciones) con relación a una proteína de unión descrita en esta memoria. Una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener mutaciones (p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones o deleciones) (p. ej., al menos una, dos, tres o cuatro, y/o menos de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones) con respecto a una proteína de unión descrita en esta memoria, p. ej., mutaciones que no tienen un efecto sustancial sobre la función de la proteína. Las mutaciones pueden estar presentes en regiones marco, CDRs y/o regiones constantes. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región marco. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una CDR. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región constante. El que se tolere o no una sustitución particular, es decir, no afectará negativamente a las propiedades biológicas, tal como la actividad de unión, se puede predecir, p. ej., evaluando si la mutación es conservadora o mediante el método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.
Una proteína que indica calicreína también se puede asociar con una proteína de soporte, p. ej., una albúmina de suero, tal como una albúmina de suero humano. Por ejemplo, se puede utilizar una fusión de traducción para asociar la proteína de soporte con la proteína de unión a calicreína.
(D) Tratamiento de Enfermedades Autoinmunes Asociadas con el Sistema de Calicreína
Uno o más de los inhibidores de pKal tal como se describen en esta memoria se pueden utilizar para tratar enfermedades asociadas con el sistema de pKal, que incluyen, pero no se limitan a, edema macular diabético, proliferación retiniana, trauma cerebral, lesión aguda de la médula espinal, amiloidosis localizada, enfermedades autoinmunes, tales como psoriasis, aclerosis múltiple, enfermedad del intestino inflamatorio, artritis reumatoide, vasculitis, lupus eritematoso sistémico nefritis, mastocitosis sistémica, quemaduras graves y dolor neuropático (neuralgia diabética y posherpética).
Un sujeto que está en riesgo (p. ej., un paciente humano) de desarrollar una enfermedad autoinmune u otras enfermedades asociadas a pKal mencionadas en esta memoria puede ser, p. ej., un sujeto que tiene una enfermedad asociada con el desarrollo de la enfermedad, un sujeto que ha sido expuesto a un factor ambiental asociado con el desarrollo de la enfermedad, un sujeto que tiene antecedentes familiares de la enfermedad o un sujeto que porta un gen asociado con el desarrollo de la enfermedad.
Los sujetos pueden ser seres humanos que necesiten tratamiento para una enfermedad autoinmune o una de las otras enfermedades asociadas con pKal (p. ej., seres humanos que tienen la enfermedad o en riesgo de desarrollar la enfermedad) o sujetos no humanos (p. ej., un modelo animal de una enfermedad autoinmune o una de la otra enfermedad asociada a pKal).
En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto (p. ej., un paciente humano) que está en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune tal como artritis reumatoide (RA), enfermedad de Crohn (CD) o colitis ulcerosa (UC). Las enfermedades autoinmunes son enfermedades provocadas por una respuesta inmunitaria anormal al propio cuerpo de un sujeto. La respuesta inmune anormal puede ser contra un determinado órgano o tejido, dependiendo del tipo de enfermedad autoinmune.
La RA es una enfermedad inflamatoria crónica que generalmente afecta a las articulaciones, tales como las articulaciones sinoviales de las manos y/o los pies. La respuesta inflamatoria en la RA a menudo causa la destrucción del cartílago y la fusión de las articulaciones, lo que resulta en pérdida de función y movilidad. Síntomas de la RA incluyen articulaciones inflamadas y/o calientes, rigidez, nódulos reumatoides, fatiga, fiebre y pérdida de peso. Tratamientos ejemplares para la RA incluyen fisioterapia, ortesis, analgésicos, fármacos antiinflamatorios, esteroides y fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs).
La CD es una enfermedad del intestino inflamatorio que puede afectar a cualquier parte del tracto GI. Los síntomas incluyen dolor abdominal, diarrea, fiebre, fatiga y pérdida de peso. Tratamientos ejemplares para la CD incluyen corticosteroides, fármacos de ácido 5-aminosalicílico, azatioprina, metotrexato, infliximab, adalimumab, certolizumab, natalizumab, ajustes dietéticos y cirugía.
La UC es una enfermedad del intestino inflamatorio que generalmente afecta al intestino grueso. Los síntomas incluyen diarrea con sangre y/o mucosidad, pérdida de peso, anemia, dolor abdominal y sangre en el recto. Tratamientos ejemplares para la UC incluyen fármacos de ácido 5-aminosalicílico, corticosteroides, azatioprina, budesonida, infliximab, adalimumab y cirugía.
(E) Terapia de Combinación
El inhibidor de calicreína plasmática se puede administrar junto con otro agente terapéutico como parte de una terapia de combinación para una enfermedad o trastorno descrito en esta memoria.
La terapia de combinación con un inhibidor de calicreína y otro agente terapéutico puede proporcionarse en múltiples configuraciones diferentes. En situaciones en las que el inhibidor de calicreína se ha de administrar mediante inyección intraarticular, el inhibidor de calicreína y el agente terapéutico pueden co-administrarse como una sola composición, o pueden administrarse mediante inyecciones separadas. En algunas situaciones, el inhibidor de calicreína y el agente terapéutico se administran en estrecha proximidad temporal (p. ej., un breve intervalo de tiempo entre las inyecciones, tal como durante la misma sesión de tratamiento), o más espaciados, dependiendo del programa de administración deseado para los dos componentes de la terapia de combinación. Cuando el inhibidor de calicreína se ha de administrar mediante administración sistémica (parenteral), el inhibidor de calicreína y el agente terapéutico pueden administrarse en estrecha proximidad temporal o más espaciados, dependiendo del programa de dosificación pretendido para los dos componentes de la terapia de combinación.
En otras realizaciones, el inhibidor de calicreína se puede administrar en combinación con otros compuestos útiles para tratar o prevenir la inflamación, que está implicada en enfermedades autoinmunes. Agentes antiinflamatorios ejemplares incluyen, por ejemplo, esteroides (p. ej., cortisol, cortisona, fludrocortisona, prednisona, 6[alfa]-metilprednisona, triamcinolona, betametasona o dexametasona), fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDS (p. ej., aspirina, acetaminofén, tolmetina, ibuprofeno, ácido mefenámico, piroxicam, nabumetona, rofecoxib, celecoxib, etodolac o nimesulida). En otra realización, el otro agente terapéutico es un antibiótico (p. ej., vancomicina, penicilina, amoxicilina, ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cefixima, rifampinmetronidazol, doxiciclina o estreptomicina). En otra realización, el otro agente terapéutico es un inhibidor de PDE4 (p. ej., roflumilast o rolipram). En otra realización, el otro agente terapéutico es un antihistamínico (p. ej., ciclizina, hidroxizina, prometazina o difenhidramina).
Ejemplos adicionales de agentes antiinflamatorios incluyen, por ejemplo, aceclofenaco, acemetacina, ácido eacetamidocaproico, acetaminofén, acetaminosalol, acetanilida, ácido acetilsalicílico, S-adenosilmetionina, alclofenaco, alclometasona, alfentanilo, algestona, alilprodina, alminoprofeno, aloxiprin, alfaprodina, bis(acetilsalicilato) de aluminio, amcinonida, amfenac, aminoclorotenoxazina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, 2-amino-4-picolina, aminopropilon, aminopirina, amixetrina, salicilato de amonio, ampiroxicam, amtolmetin guacil, anileridina, antipirina, antrafenina, apazona, beclometasona, bendazac, benorilato, benoxaprofen, benzpiperilona, benzidamina, bencilmorfina, bermoprofeno, betametasona, betametasona-17-valerato, bezitramida, [alfa]-bisabolol, bromfenaco, pbromoacetanilida, acetato del ácido 5-bromosalicílico, bromosaligenina, bucetina, ácido buclóxico, bucoloma, budesonida, bufexamac, bumadizon, buprenorfina, butacetina, butibufeno, butorfanol, carbamazepina, carbifeno, caiprofen, carsalam, clorobutanol, cloroprednisona, clorotenoxazina, salicilato de colina, cinchophen, cinmetacina, ciramadol, clidanac, clobetasol, clocortolona, clometacina, clonitazeno, clonixino, clopirac, cloprednol, clavo, codeína, metilbromuro de codeína, fosfato de codeína, sulfato de codeína, cortisona, cortivazol, cropropamida, crotetamida y ciclazocina.
Ejemplos adicionales de agentes antiinflamatorios incluyen deflazacort, dihidrotestosterona, desomorfina, desonida, desoximetasona, dexametasona, dexametasona-21- isonicotinato, dexoxadrol, dextromoramida, dextropropoxifeno, deoxicorticosterona, dezocina, diampromida, diamorfona, diclofenaco, difenamizol, difenpiramida, diflorasona, diflucortolona, diflunisal, difluprednato, dihidrocodeína, enol acetato de dihidrocodeína, dihidromorfina, acetilsalicilato de dihidroxialuminio, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, butirato de dioxafetilo, dipipanona, diprocetil, dipirona, ditazol, droxicam, emorfazona, ácidfo enfenámico, enoxolona, epirizol, eptazocina, etersalato, etenzamida, etoheptazina, etoxazeno, etilmetiltiambuteno, etilmorfina, etodolac, etofenamato, etonitazeno, eugenol, felbinac, fenbufen, ácido fenclózico, fendosal, fenoprofeno, fentanilo, fentiazac, fepradinol, feprazona, floctafenina, fluazacort, flucloronida, ácido flufenámico, flumetasona, flunisolida, flunixin, flunoxaprofen, fluocinolona acetonida, fluocinonida, fluocinolona acetonida, fluocortina butilo, fluocoitolona, fluoresona, fluorometolona, fluperolona, flupirtina, fluprednideno, fluprednisolona, fluproquazona, flurandrenolida, flurbiprofeno, fluticasona, formocortal y fosfosal.
Otros ejemplos de agentes antiinflamatorios incluyen ácido gentísico, glafenina, glucametacina, salicilato de glicol, guaiazuleno, halcinonida, halobetasol, halometasona, haloprednona, heroína, hidrocodona, hidro cortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, succinato de hidrocortisona, hemisuccinato de hidrocortisona, 21 -lisinato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, hidromorfona, hidroxipetidina, ibufenaco, ibuprofeno, ibuproxam, salicilato de imidazol, indometacina, indoprofeno, isofezolac, isoflupredona, acetato de isoflupredona, isoladol, isometadona, isonixina, isoxepac, isoxicam, ketobemidona, ketoprofeno, ketorolac, p- lactofenetida, lefetamina, levalorfano, levorfanol, levofenacilmorfano, lofentanilo, lonazolac, lornoxicam, loxoprofeno, acetilsalicilato de lisina, mazipredona, ácido meclofenámico, medrisona, ácido mefenámico, meloxicam, meperidina, meprednisona, meptazinol, mesalamina, metazocina, metadona, metotrimeprazina, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, sulfato de metilprednisolona, ácido metiazínico, metofolina, metopon, mofebutazona, mofezolac, mometasona, morazona, morfina, hidrocloruro de morfina, sulfato de morfina, salicilato de morfolina y mirofina.
Ejemplos adicionales de agentes antiinflamatorios incluyen nabumetona, nalbufina, nalorfina, salicilato de 1 -naftilo, naproxeno, narceína, nefopam, nicomorfina, nifenazona, ácido niflúmico, nimesulida, 5’-nitro-2’-propoxiacetanilida, norlevorfanol, normetadona, normorfina, norpipanona, olsalazina, opio, oxaceprol, oxametacina, oxaprozina, oxicodona, oximorfona, oxifenbutazona, papaveretum, parametasona, paranilina, parsalmida, pentazocina, perisoxal, fenacetina, fenadoxona, fenazocina, hidrocloruro de fenazopiridina, fenocol, fenoperidina, fenopirazona, fenomorfano, acetilsalicilato de fenilo, fenilbutazona, salicilato de fenilo, feniramidol, piketoprofeno, piminodina, pipebuzona, piperilona, pirazolac, piritramida, piroxicam, pirprofeno, pranoprofeno, prednicarbato, prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, proglumetacina, proheptazina, promedol, propacetamol, properidina, propiram, propoxifeno, propifenazona, proquazona, ácido protizínico, proxazol, ramifenazona, remifentanilo, metilsulfato de rimazolio, salacetamida, salicina, salicilamida, salicilamida ácido o-acético, ácido salicílico, ácido salicilsulfúrico, salsalato, salverina, simetrida, sufentanilo, sulfasalazina, sulindac, superóxido dismutasa, suprofeno, suxibuzona, talniflumato, tenidap, tenoxicam, terofenamato, tetrandrina, tiazolinobutazona, ácido tiaprofénico, tiaramida, tilidina, tinoridina, tixocortol, ácido tolfenámico, tolmetina, tramadol, triamcinolona, triamcinolona acetonida, tropesina, viminol, xenbucina, ximoprofeno, zaltoprofeno y zomepirac.
(F) Administración
El paciente es generalmente un ser humano, pero también puede ser un mamífero no humano. Los pacientes humanos incluyen adultos, p. ej., pacientes entre 19-25, 26-40, 41-55, 56-75 y 76 y mayores, y pacientes pediátricos, p. ej., pacientes entre 0-2, 3-6, 7- 12 y 13-18.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un soporte o excipiente no tóxico que puede administrarse a un paciente, junto con un inhibidor de calicreína descrito en esta memoria. El soporte o excipiente se elige para que sea compatible con la actividad biológica o farmacológica de la composición. Los inhibidores de calicreína (y, en el caso de la terapia de combinación, otro agente terapéutico) descritos en esta memoria se pueden administrar local o sistémicamente por cualquier medio adecuado para el suministro de una cantidad inhibidora del inhibidor y/u otro agente terapéutico a un paciente, incluyendo pero no limitado a administraciones sistémicas, tales como, por ejemplo, intravenosa y por inhalación. Se prefiere particularmente la administración parenteral para el inhibidor de calicreína.
Para la administración parenteral, el inhibidor de calicreína se puede inyectar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. La inyección subcutánea y la administración i.v. son las vías preferidas para la administración parenteral. También es útil la inyección local (intraarticular).
Típicamente, las composiciones para administración por inyección son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril (p. ej., solución salina tamponada con fosfato de sodio/potasio). Otros soportes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a agua estéril, solución salina y solución salina tamponada (incluyendo tampones tales como fosfato o acetato), alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina, etc. En los casos en los que sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes, etc. siempre que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos. De manera similar, la composición puede comprender excipientes convencionales, p. ej., sustancias de soporte orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables, adecuadas para aplicación parenteral, enteral o intranasal que no reaccionan de manera perjudicial con los compuestos activos. Generalmente, los ingredientes se suministrarán por separado o mezclados juntos en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla, bolsita o vial que indique la cantidad de agente activo en unidades de actividad. En los casos en los que la composición se ha de administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contenga "agua para inyección" estéril de calidad farmacéutica o solución salina. En los casos en los que la composición se ha de administrar mediante inyección, se puede proporcionar un recipiente (p. ej., ampolla o vial) de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Formulaciones ejemplares para la administración subcutánea de un inhibidor de calicreína aislado incluyen soluciones tamponadas que contienen un agente tampón (p. ej., tampón histidina o fosfato) y un crioprotector (p. ej., sacarosa o sacarosa y manitol, que opcionalmente incluyen un dextrano tal como dextrano 40) y se pueden liofilizar para el almacenamiento y la distribución tal como se describe en la Pub. de Sol. de EE.UU. N° 2007-0213275 (N° de Serie de EE.UU. 11/716,278, presentada el 9 de marzo de 2007).
En un caso, el inhibidor de calicreína se administra a un paciente en forma de una infusión intravenosa de acuerdo con cualquier procedimiento aprobado. En otro caso, el inhibidor de calicreína se administra a un paciente en forma de un bolo subcutáneo. En otro caso, el inhibidor de calicreína se administra a un paciente mediante inyección intraarticular. La administración I.V. e intraarticular se llevan a cabo típicamente por un profesional de la salud en un entorno clínico (p. ej., hospital, atención de urgencia o consultorio médico), pero las inyecciones subcutáneas pueden ser auto-administradas o administradas por un profesional de la salud.
Los parámetros que pueden evaluarse para determinar una dosis del inhibidor de calicreína para la administración sistémica se describen a continuación con respecto a DX-88 (un inhibidor de calicreína que no se produce de forma natural, SEQ ID NO: 2). Se informa que la cantidad total de precalicreína circulante en plasma es de aproximadamente 500 nM a 600 nM (Silverberg et al., «The Contact System and Its Disorders», en Blood: Principles and Practice of Hematology, Handin, R. et al., editores, J B Lippincott Co., Filadelfia, 1995). Si se activa toda la precalicreína, se pueden utilizar aproximadamente 520 nmoles/L de DX-88 (DX88) para inhibir la calicreína de una manera estequiométrica. Un individuo que tenga 5 L de plasma requeriría una dosis de 2,6 micromoles de DX-88, o aproximadamente 18 mg basado en el peso molecular de DX-88 de 7.054 Dalton. Esto se calcula como sigue: la K¡ de DX88 es 0,025 nM. Cuando se desea tener una concentración de calicreína plasmática (PK) de, p. ej., 1 nM, la siguiente fórmula para un inhibidor de unión estrecha indica que la concentración de DX-88 libre es 12,0 nM. Por lo tanto, la cantidad total de DX-88 necesaria sería 499 12 o 511 nM.
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51 b ¡ M = (0.025)(499) /(l) (499)
La dosis puede reducirse proporcionalmente si no se activa toda la precalicreína o si una parte de la calicreína se desactiva mediante un inhibidor endógeno, p. ej., el inhibidor de la esterasa C1 (C1INH). Por lo tanto, en determinados casos, se pueden administrar aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 80, 120, 250, 500, 600, 700, 800, 1000 mg de DX-88 a un sujeto, en una dosis única o en una o más dosis repartidas a lo largo de un período de veinticuatro horas. La consideración de varios otros factores puede proporcionar una estimación más precisa de la dosis de DX-88 requerida en la práctica, tal como la edad del paciente, el peso y la gravedad de la afección ().
En algunos casos, el polipéptido inhibidor de calicreína se administra en una dosis de aproximadamente 1 -500 mg/m2, de preferencia aproximadamente 1-250 mg/m2, 1-100 mg/m2.
(G) Dispositivos y Kits
Composiciones farmacéuticas que incluyen el inhibidor de calicreína se pueden administrar con un dispositivo médico. El dispositivo puede diseñarse con características tales como portabilidad, almacenamiento a temperatura ambiente y facilidad de uso de modo que se pueda utilizar en entornos fuera de un hospital o sala de emergencias/centro de atención de urgencia (p. ej., por el paciente o un cuidador en el hogar o en el consultorio de un médico). El dispositivo puede incluir, p. ej., una o más carcasas para almacenar preparaciones farmacéuticas que incluyen un inhibidor de calicreína aislado, y puede configurarse para administrar una o más dosis unitarias del agente o agentes.
La administración i.v. puede ser por bolo o infusión, utilizando dispositivos de inyección o infusión apropiados (p. ej., catéteres, bombas de infusión, implantes y similares). La inyección subcutánea puede ser como una infusión, por ejemplo utilizando un catéter y una bomba de infusión o un dispositivo implantable. También se conocen muchos otros dispositivos, implantes, sistemas de suministro y módulos.
Cuando el inhibidor de calicreína se distribuye como un polvo liofilizado, debe reconstituirse antes de su uso. Se puede utilizar la reconstitución manual (p. ej., adición manual de diluyente a la formulación liofilizada mediante inyección a través de una lumbrera de inyección en el recipiente que contiene la formulación liofilizada), o se puede proporcionar el inhibidor de calicreína en un dispositivo configurado para reconstitución automática (p. ej., adición automática del diluyente a la formulación liofilizada), tal como el inyector líquido seco BECTON-DICKINSON BD™.
El inhibidor de calicreína aislado se puede proporcionar en un kit. En un caso, el kit incluye (a) un recipiente que contiene una composición que incluye un inhibidor de calicreína aislado y (b) material informativo que se relaciona con los métodos descritos en esta memoria y/o el uso de los agentes para el beneficio terapéutico.
En determinados casos, el kit también incluye otro agente terapéutico. Por ejemplo, el kit incluye un primer recipiente que contiene una composición que incluye el inhibidor de calicreína aislado y un segundo recipiente que incluye el otro agente terapéutico. El inhibidor de calicreína aislado y el otro agente terapéutico se pueden suministrar en el mismo recipiente para uso en métodos en los que el inhibidor de calicreína y el agente terapéutico se administran como una composición única.
El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En un caso, el material informativo puede incluir información sobre la producción del compuesto, el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de caducidad, la información del lote o del lugar de producción, etcétera. En un caso, el material informativo se refiere a métodos de administrar el inhibidor de calicreína aislado, p. ej., en una dosis, forma de dosificación o modo de administración adecuado (p. ej., una dosis, forma de dosificación o modo de administración descrito en esta memoria), para tratar un sujeto (). La información se puede proporcionar en una diversidad de formatos, que incluyen texto impreso, material legible por computadora, grabación de vídeo o grabación de audio, o una información que proporciona un enlace o dirección a material sustantivo.
Además del inhibidor de calicreína aislado (y, si está presente, el o los agentes terapéuticos adicionales), la composición del kit puede incluir otros ingredientes, tales como un disolvente o tampón, un estabilizador o un conservante. El inhibidor de calicreína aislado (y otro agente terapéutico, si está presente) se puede proporcionar en cualquier forma, p. ej., en forma líquida, seca o liofilizada, de preferencia sustancialmente pura y/o estéril. Cuando los agentes se proporcionan en una solución líquida, la solución líquida es preferiblemente una solución acuosa. Cuando los agentes se proporcionan en forma seca, la reconstitución generalmente se realiza mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, p. ej., agua estéril o tampón, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.
El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición o composiciones que contienen los agentes. En algunos casos, el kit contiene recipientes, divisores o compartimientos separados para la composición y el material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en una botella, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plástico. En otros casos, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un recipiente único e indiviso. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, vial o jeringa que tiene adherido el material informativo en forma de una etiqueta. En algunos casos, el kit incluye una pluralidad (p. ej., un paquete) de recipientes individuales, cada uno de los cuales contiene una o más formas de dosificación unitarias (p. ej., una forma de dosificación descrita en esta memoria) de los agentes. Los recipientes pueden incluir una combinación de dosificación unitaria, p. ej., una unidad que incluye tanto el inhibidor de calicreína aislado como otro agente terapéutico, p. ej., en una relación deseada. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de aluminio, envases blísteres o dispositivos médicos, e.g., cada uno de los cuales contiene una única combinación de dosis unitaria. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, impermeables (e.g., impermeables a los cambios de humedad o evaporación) y/o herméticos a la luz.
El kit incluye opcionalmente un dispositivo adecuado para la administración de la composición, e.g., una jeringa u otro dispositivo de suministro adecuado. El dispositivo puede proporcionarse precargado con uno o ambos agentes o puede estar vacío, pero es adecuado para la carga.
EJEMPLOS
Los siguientes Ejemplos proporcionan una ilustración adicional y no son limitantes.
Ejemplo 1: Asociación entre quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido y enfermedades autoinmunes
Para determinar los niveles de HMWK escindido en enfermedades autoinmunes, las cantidades de HMWK intacto y escindido en muestras de plasma obtenidas de pacientes con artritis reumatoide (RA), colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn (CD), así como de sujetos sanos, se midieron utilizando la transferencia Western con detección de LiCor tal como se describe a continuación.
(i) Preparación de M uestras
El plasma deficiente en HMWK tratado se preparó añadiendo 10 gL de cóctel inhibidor de anti-proteasa 10X a 90 gL de plasma deficiente en HMWK al 100%. La solución se dejó reposar durante al menos 30 minutos antes de su uso.
Se preparó un intermedio 1:4 de HMWK de una cadena añadiendo 5 gL de la solución madre (1,61 mg/mL) a 15 gL de plasma deficiente en HMWK tratado. Se preparó un intermedio 1:4 de HMWK de dos cadenas añadiendo 5 gL de la solución madre (2,01 mg/mL) a 15 gL de plasma deficiente en HMWK tratado.
Se preparó una solución de plasma de control deficiente en HMWK tratado de 45 gg/mL añadiendo 3,35 gL del intermedio de HMWK de una cadena 1:4 y 2,69 gL del intermedio HWMK de dos cadenas 1:4 a 23,96 gL de plasma deficiente en HWMK tratado.
Cada una de las muestras se diluyó al 5% de plasma (1:20) en 1X TBS añadiendo 5 gL de la muestra de plasma a 95 gL de 1X TBS. Las muestras no reducidas se prepararon añadiendo 5 gL de tampón de muestra 4X a 15 gL de muestra al 5%. Las muestras reducidas se prepararon añadiendo 5 gL de tampón de muestra 4X y 2 gL de agente reductor 10X a 13 gL de muestra al 5%.
Todas las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 minutos utilizando un bloque de calor. Cada una de las muestras se centrifugó brevemente para eliminar cualquier solución de la tapa de los tubos de muestra.
(ii) Carga, Funcionamiento y Transferencia de Gel
Se preparó tampón de desarrollo Tris-acetato añadiendo 100 mL de tampón de desarrollo 20X a 1.900 mL de agua DI. Se utilizó un volumen de 4 gL del marcador de proteína de un color como control en todos los ensayos. Se añadió un volumen de 13 gL de muestras no reducidas y las muestras reducidas a las pistas de un gel. de gel 1. Los geles se procesaron a 125 voltios durante ~ 2 horas.
El papel de filtro iBlot se colocó en agua DI y se empapó durante 5 minutos. La pila de ánodo, la parte inferior se abrió y se colocó en la superficie secante del iBlot con el lado de cobre hacia abajo. Una vez completadas las pruebas de gel, se abrieron dos casetes de gel y se retiraron los geles. Los geles se colocaron sobre la membrana de transferencia. El papel de filtro empapado previamente se colocó encima de los geles. La pila de cátodos, superior se abrió y se colocó encima del papel de filtro, con el lado de cobre hacia arriba. Las burbujas de la pila se extendieron suavemente utilizando el rodillo secante. La esponja desechable se colocó en la tapa del iBlot. Se encendió el iBlot y se seleccionó el programa P0.
Una vez completada la transferencia de iBlot, se abrió el iBlot y se desechó la esponja, la pila de cátodos y los geles. Cada una de las membranas se retiró individualmente del iBlot y se colocó en una bandeja de plástico que contenía 20 mL de tampón de bloqueo Odyssey. Las membranas se incubaron en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 1 hora.
(iii) E nsayo de Transferencia Western con Detección de LiCor
Se preparó una solución de anticuerpo primario de 1 gg/mL añadiendo 57,14 gL de HMWK anti-LC de ratón, clon n° 11H05 (concentración de reserva 1,4 mg/mL) a 80 mL de Bloqueador Odyssey Tween-20 al 0,2%. El tampón de bloqueo se retiró de las bandejas de plástico. Se añadió un volumen de 20 mL de solución de anticuerpo primario a cada una de las bandejas y las membranas se incubaron en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de cabra anti-IgG de ratón IRDye 680 se preparó a una dilución 1:15.000 añadiendo 5,33 gL de la solución madre a 80 mL de Bloqueador Odyssey Tween-20 al 0,2%. La solución de anticuerpo primario se retiró de las bandejas de plástico. Las membranas se lavaron con 20 mL de 1X PBS Tween-20 al 0,1% durante cinco minutos y luego se descartó el lavado. Se repitió 3 veces para un total de 4 lavados. Se añadió a cada una de las bandejas un volumen de 20 mL de la solución IRDye 680 de IgG anti-ratón de cabra. Las bandejas se cubrieron con papel de aluminio para proteger las membranas y la solución de anticuerpo secundario de la luz. Las membranas se incubaron en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de anticuerpo secundario se retiró de las bandejas de plástico. Las membranas se lavaron con 20 mL de 1X PBS Tween-20 al 0,1% durante cinco minutos y luego se descartó el lavado. Se repitió 3 veces para un total de 4 lavados. Las membranas se lavaron con PBS y se escanearon en LiCor Odyssey Clx. Las membranas se cubrieron con papel de aluminio y se dejaron secar durante la noche. Las membranas secas se colocaron en una hoja protectora y se guardaron para su uso posterior.
(Iv) R esultados:
El control, tratado con plasma deficiente en HMWK enriquecido con 45 pg/mL de HMWK de una cadena y de dos cadenas, se comportó como se esperaba produciendo bandas de alrededor de 120 y 95 kDa. El plasma humano normal produjo bandas alrededor de 120 y 100 kDa con un 21,3% del HMWK escindido. Las muestras de pacientes que contenían cócteles de inhibidores de anti-proteasa produjeron resultados drásticamente diferentes a las muestras de pacientes recogidas en citrato de sodio. Las muestras de pacientes recogidas con inhibidor de anti-proteasa añadido contenían significativamente más HMWK de una cadena que HMWK de dos cadenas reducido. Este resultado indica que la adición de cócteles anti-inhibidores de proteasa es necesaria para prevenir la escisión de HMWK después de la recogida.
En este estudio se examinaron muestras de plasma de un cierto número de pacientes con UC, CD, RA y HAE. La muestra de control y el plasma humano normal produjeron los resultados esperados. La muestra de ataque de HAE contenía más HWMk escindido que la muestra basal de HAE. Como se muestra en la Tabla 1 que figura a continuación y también en la Figura 1, una gran mayoría de las muestras de los pacientes autoinmunes, especialmente las muestras de artritis reumatoide, solo produjeron bandas a 46 kDa, lo que indica que el nivel de HWMK escindido está asociado con enfermedades autoinmunes, tales como como RA, UC y CD. Más específicamente, se encontró que los brotes de RA estaban asociados con HMWK escindido extenso; se encontró que la enfermedad de Crohn tiene una cantidad moderada de HMWK escindido; y se encontró que la colitis ulcerosa tenía una cantidad moderada de HMWK escindido.
En resumen, los resultados de este estudio indican la activación por contacto en enfermedades autoinmunes tales como plasma de CD, UC y RA. Por consiguiente, un agente que inhibe la activación por contacto, tal como un inhibidor de pKal (p. ej., los descritos en esta memoria) puede ser eficaz en el tratamiento de enfermedades de este tipo. Además, los resultados de este estudio indican que el nivel de HMWK escindido puede servir como un biomarcador fiable para identificar pacientes que tienen o están en riesgo de tener enfermedades autoinmunes tales como CD, UC y RA y/o como un biomarcador para evaluar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad autoinmune de este tipo.
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En las reivindicaciones, artículos tales como "un", "una" y "el", “la” pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. Reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean en o son relevantes de otro modo para un producto o procedimiento determinado, a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente por el contexto. La presente divulgación incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea en o de otra manera es relevante para un producto o procedimiento dado. La presente divulgación incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean en o de otra manera son relevantes para un producto o procedimiento dado.
También se observa que las expresiones "que comprende" y "que contiene" están destinadas a ser abiertas y permiten la inclusión de elementos o etapas adicionales. En los casos en los que se den intervalos, se incluyen los puntos finales. Además, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o sub-intervalo específico dentro de los intervalos establecidos en diferentes realizaciones de la presente divulgación, para la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método: medir un nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido en una muestra biológica que ha sido proporcionado del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune; e
identificar que el paciente humano tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad autoinmune, si el nivel de HMWK escindido en la muestra biológica es elevado en comparación con una muestra de control,
en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; y
en donde la muestra biológica es una muestra de suero o una muestra de plasma.
2. Un método para vigilar una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método: medir un primer nivel de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) escindido en una primera muestra biológica que ha sido proporcionada del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune en un primer momento; medir un segundo nivel de HMWK escindido en una segunda muestra biológica que ha sido proporcionada del paciente humano sospechoso de tener una enfermedad autoinmune en un segundo momento posterior al primer momento; y evaluar el desarrollo de la enfermedad autoinmune en el paciente humano basándose en el cambio de los niveles de HMWK escindido en la primera y segunda muestras biológicas,
en donde el segundo nivel de HMWK escindido más alto que el primer nivel de HMWK escindido indica que la enfermedad autoinmune progresa en el paciente humano o que el paciente humano ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar la enfermedad autoinmune,
en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; y
en donde la primera y segunda muestras biológicas son muestras de suero o muestras de plasma.
3. Un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad autoinmune en un paciente humano, comprendiendo el método:
medir los niveles de quininógeno de alto peso molecular (HMWK) en múltiples muestras biológicas que han sido proporcionadas del paciente humano sometido a un tratamiento para una enfermedad autoinmune durante el curso del tratamiento; y
evaluar la eficacia del tratamiento en el paciente humano basándose en el cambio de los niveles de HMWK escindido durante el transcurso del tratamiento,
en el que si el nivel de HMWK escindido disminuye durante el curso del tratamiento, esto indica que el tratamiento es eficaz en el paciente humano,
en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, y
en donde al menos una de las muestras biológicas es una muestra de suero o una muestra de plasma.
4. El método de la reivindicación 1, en el que, la muestra biológica comprende uno o más inhibidores de proteasa, que se añaden a la muestra biológica después de su recogida,
el método de la reivindicación 2, en el que la primera muestra biológica, la segunda muestra biológica o ambas comprenden uno o más inhibidores de proteasa, que se añaden a la muestra o muestras biológicas después de su recogida, o
el método de la reivindicación 3, en el que al menos una de las múltiples muestras biológicas comprende uno o más inhibidores de proteasa, que se añaden a la muestra después de su recogida.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4, en el que el nivel de HMWK escindido se mide mediante un ensayo que implica un agente de unión específico para HMWK escindido.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4, en el que el primer o segundo nivel de HMWK escindido se mide mediante un ensayo que implica un agente de unión específico para HMWK escindido.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que los niveles de HMWK escindido en las múltiples muestras biológicas se miden mediante un ensayo que implica un agente de unión específico para HMWK escindido.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el agente de unión es un anticuerpo.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que el ensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un ensayo de inmunotransferencia.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el ensayo es un ensayo de transferencia Western.
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