CN106662588A - 肝细胞癌标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供一种检测肝细胞癌的标志物，其包含不依赖于肝脏的状态变化、由于癌的出现而开始存在于肝脏中的糖蛋白。本发明提供一种肝细胞癌标志物，其包含含有糖链表位的NPA凝集素结合性糖蛋白，所述糖链表位为NPA凝集素结合性糖链表位且具有下述(1)～(5)中的至少1个特性。(1)糖链表位不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)、(2)糖链表位含有甘露糖个数为3的(不超过4的)复合型糖链、(3)糖链表位不含甘露糖为5个以上的高甘露糖型糖链、(4)糖链表位包含不依赖于LCA凝集素的结合性的复合型糖链、(5)糖链表位包含不依赖于ConA凝集素的结合性的复合型糖链。通过对被检试样中的本发明的肝细胞癌标志物进行检测，可以判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度。

Description

肝细胞癌标志物
技术领域
本发明涉及用于准确且简便地诊断肝细胞癌的新型肝细胞癌标志物，及使用该标志物的肝细胞癌的检查方法。更详细而言，涉及用于肝细胞癌的早期发现和用于预测罹患癌症的患者的预后的检查方法，进一步涉及用于检查的检查用试剂盒。具体而言，对在肝组织中的非癌部区域不表达、在癌部区域中的肝细胞癌或癌细胞周边间质部位(TME)特异性表达的糖蛋白进行鉴定，从而提供包含该糖蛋白的肝细胞癌标志物。此外，涉及提供使用与该糖蛋白结合的凝集素的肝细胞癌的检测方法及用于该检测方法的试剂盒。
背景技术
在日本，癌(恶性新生物)成为主要死亡原因且持续增加，在昭和56年以后为死因的第1位，在平成23年度，大幅超越了由心脏疾病、肺炎、脑疾病等其它疾病引起的死亡人数，在全部死亡人数中所占的比例达到28.5％。也即，在全部死亡人数中，约3.5人中就有一人死于癌症。
在全部癌症死亡人数中，肝癌次于肺癌、胃癌、大肠癌，排在第4位。肝癌可以分为：在肝脏中原发的原发性肝癌；和在肝以外的脏器中产生的癌类别转移到肝内的转移性肝癌。在肝脏中产生的主要原发性肝癌有：源自肝细胞的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma：HCC)和源自胆管上皮细胞的肝内胆管癌(或胆管细胞癌)，还存在应视为两者的混合型的癌症。源自肝细胞的肝细胞癌占原发性肝癌的90％以上，肝细胞癌大多由于病毒性肝炎(HCV、HBV)而产生。在包括日本在内的东亚，HCV罹患率本来就高，可以认为这是肝细胞癌的发生率高于欧美的原因。
肝细胞癌对化学疗法、放射线治疗显示出抵抗性，手术成为唯一的完全缓解疗法，为了进行有效的治疗，通过早期发现而在可治疗的时期进行处置是无比重要的。
为了进行肝细胞癌的早期检测，一直在进行使用肿瘤标志物的检测手段的开发。关于肝细胞癌，迄今为止已经开发了多种癌检测用标志物，α1胎儿球蛋白(AFP)及PIVKA-II(维生素K缺乏或拮抗剂诱导的蛋白质-II)在临床中被作为肝细胞癌的肿瘤标志物使用。此外，作为肝癌的肿瘤标志物，还已知例如：CEA、CA19-9、KMO-1、DuPAN-2、SPan-1、CA50、SLX、胎儿碱性蛋白(BFP)、NCC-ST-439、碱性磷酸酶同工酶、γ-GTP同工酶、IAP、TPA、β2-微球蛋白、铁蛋白、POA及胰蛋白酶抑制剂等(专利文献1)。
例如，在临床中，测定血清中的AFP、PIVKA-II，通过其表达量来判定肝细胞癌罹患可能性的程度，然而，PIVKA-II单独阳性为26％，多于AFP单独阳性的9％，肝细胞癌患者的61％中任一者为阳性，但存在39％的两者均为阴性的患者。因此，已有的肿瘤标志物对于肝细胞癌的诊断而言并不充分，需要开发新的肿瘤标志物。
因此，现在，用于肝细胞癌早期发现的检查、诊断并非通过肝细胞癌标志物单独进行，而是通过超声波检查、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像法(MRI)等影像检查来进行。
近年，开发了多种包含在肝细胞癌中表达的基因、多肽的肝细胞癌的肿瘤标志物。公开了例如包含如下基因或多肽的肝细胞癌的肿瘤标志物：Gla衰竭凝血因子VII(专利文献2)；醛缩酶β基因、氨甲酰磷酸合酶I基因、纤溶酶原基因、EST51549、白蛋白基因、细胞色素P450亚家族2E1基因、视黄醇结合蛋白基因或有机阴离子转运体C基因(专利文献3)；具有锌指结构域以及SET结构域的人基因ZNFN3A1(专利文献4)；作为硫酸乙酰肝素蛋白多糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)(专利文献5)；位于染色体带1p36.13的区域的、对肌动蛋白细胞骨架的再构成进行调节的发生·分化促进因子1(DDEFL1)(专利文献6)等。
进而公开了例如包含如下基因或多肽的肝细胞癌的肿瘤标志物：染色体区域中的8p12、16p13.2-p13.3、16q23.1-q24.3或19p13.2-p13.3的区域中有无缺损的基因(专利文献7)，编码分泌富半胱氨酸蛋白家族的Wnt-1(专利文献8)，氨甲酰磷酸合酶L链MGC47816，及含有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构域及橙色结构域(Orange domain)的蛋白质HES6的基因(专利文献9)，包含SEMA5A(脑信号蛋白5A)、SLC2A2(溶质载体家族成员)、ABCC2(ATP结合盒亚家族C成员2)或HAL(组氨酸脱氨酶)的细胞相关性肝细胞癌(HCC)蛋白(专利文献10)，或人α2,6唾液酸转移酶(专利文献11)，等。
但是，利用包含在肝癌中表达的基因、多肽的肝癌的肿瘤标志物来检测肝癌的发生的方法，难以用于以血清、胆汁等作为被检试样的情况，在用于检测基因表达需要复杂的操作以及癌源的鉴别诊断或癌检测的灵敏度、精度方面，作为用于在医疗现场准确且简便地使用的肝癌的早期检测·诊断的检测手段，尚存在多种限制，并非能够令人满意。
如前所述，肝细胞癌大多是由病毒性肝炎(HCV、HBV)引起的。特别是HCV(丙型肝炎病毒)的情况下，多数情况下，在罹患后由急性病毒性肝炎发展成慢性病毒性肝炎，在经过长时间后(约20年左右)发展为肝硬化，此后大概率地发生癌化。由于肝硬化中重复发生炎症和再生，因此正常的肝组织减少，向着由纤维组织构成的脏器转变。在HCV及HBV患者的情况下，就由慢性肝炎起始的癌变率而言，在慢性肝炎轻度(F1)或慢性肝炎中度(F2)中为每年0.8～0.9％左右，一旦达到慢性肝炎重度(F3)则变为每年3.5％，由肝硬化(F4)发展为癌症的概率则上升到每年7％。并且，伴随着肝疾病的病态的恶化，在以慢性肝炎、肝组织的功能降低为起始，纤维化加剧，逐渐演变成成肝硬化的这一过程中，肝细胞癌出现。即，肝细胞癌的背景肝是纤维化高度发展的状态，因此受到肝脏的功能降低、纤维化影响的标志物缺乏癌特异性，与肝癌的早期发现并无关联。
近年的一系列研究报道指出：在肝细胞癌患者的血清中、肝脏细胞前体细胞中，合成某种特定糖链结构的糖转移酶的活性上升或下降，以及在正常成熟肝细胞中观察不到的糖链结构表达。
其中，关于肝细胞癌标志物的AFP(α1胎球蛋白)，具有α1→6岩藻糖化糖链的糖链异构体由于与LCA凝集素的反应性，因此作为被称为AFP-L3组分的糖链标志物而被熟知。已知的是，AFP-L3组分进一步反映出癌的出现且数值上升，因此通过测定血中的AFP中的L3组分的比例，可以提高肝细胞癌的诊断精度(特异度)。但是，在肝细胞癌患者中以高比例存在的AFP非增加例中，L3组分也不增加，因此未确认到作为肝细胞癌标志物的充分效果，仍未充分满足医疗上的需求。另一方面，在与肝纤维化相伴随的肝脏的状态变化中，也确认了由于肝细胞癌的出现而岩藻糖化亢进的情况，例如，多次报道了作为肝纤维化标志物已知的AGP(α1酸性糖蛋白)中的岩藻糖化等。但是，AGP的岩藻糖化的亢进通常在癌患者中也广泛地观察到，对肝细胞癌的特异性低，难以设定截止值等。
血清糖蛋白的构成糖链组中受到关注的肝细胞癌标志物也被公开了(专利文献12)。并且公开了：对随着肝细胞癌的发病而消失或减少的三唾液酰化(trisialylated)糖链进行标记并作为肝细胞癌标志物用于肝细胞癌的检测；用阴离子交换柱进行分离，基于使用了ODS二氧化硅柱的高效液相色谱的洗脱图的分析算出由被检体制备的肝细胞癌标志物的量。
最近，在包括肝细胞癌标志物在内的癌标志物的探索中，提出了灵活运用糖蛋白组学技术、凝集素微阵列或抗体覆盖(antibody overlay)·凝集素微阵列等多种尖端技术、对标志物候选分子进行包罗性地检索、检验的策略(非专利文献1、专利文献13)。公开了测定被检血清中的指标糖链标志物量、根据标准曲线可以识别肝硬化和肝细胞癌，截至目前已有多个成果实例。
但是，肝细胞癌标志物的开发几乎局限于含岩藻糖的糖蛋白，在识别糖链的表达量随着肝组织的纤维化进展度而增大、即血清中的存在量差异这一点上，与现有的肝细胞癌标志物基本相同。即使成为肝疾病的病态或纤维化进展度的优异的血清指标，也不能称之为可以超过AFP-L3的、区别于肝硬化而高精度地对肝细胞癌进行鉴别诊断的指标。
另外，观察这些现有的包含糖链或糖蛋白的肝细胞癌标志物的糖链部分时，几乎都是岩藻糖，尤其是“岩藻糖α1→6糖链”或“岩藻糖α1→3糖链”，这些“含岩藻糖的糖蛋白”被用作主要的肝细胞癌指标(非专利文献4～8等多个文献)。如上所述，作为现在临床上使用的肝细胞癌标志物，也是甲胎蛋白(AFP)中具有受到α1→6岩藻糖修饰糖链的糖链异构体(称为AFP-L3组分)检测肝细胞癌的精度最高。
本发明人等通过以前进行的健康人血清中蛋白质与肝细胞癌细胞株之间的大规模的比较糖链解析，阐明了岩藻糖是表征肝疾病的糖链修饰，并鉴定了一组多种含岩藻糖的糖蛋白作为肝疾病病态指标标志物(非专利文献6，专利文献14)。
这些肝疾病病态指标标志物均为可确定由肝脏的健康状态按照病毒感染、慢性肝炎、肝硬化这样的病状发展的肝组织纤维化的蛋白质组，其大部分可以作为用于调查肝纤维化、肝硬化的优异的标志物来利用(非专利文献7、8)。但是，难以作为可明确区分肝细胞癌和肝硬化的肝细胞癌标志物来利用(非专利文献8)。
这与所报道的、进行α1→6岩藻糖修饰的酶即α1→6岩藻糖转移酶(FUT8)在慢性肝炎、肝硬化的情况下在肝组织中的表达也亢进的情况是一致的(非专利文献2)。虽然作为酶的供体底物的GDP-岩藻糖量在人肝癌组织的癌部是增加的这一点已经得到确认(非专利文献3)，但其增加量不过为2倍左右，难以作为血中标志物进行利用。
另一方面，AFP-L3的实际血中浓度在癌中显著上升虽然是事实，但无法仅通过上述合成机制进行说明。这之后的研究提出了如下假说：不仅AFP-L3组分，多种特定的含岩藻糖的糖蛋白组并不是肝细胞癌自身表达并使血中浓度提高的，而是随着肝细胞的癌化，在肝细胞内被(极性)输送·分泌到胆管侧(胆汁)的岩藻糖化蛋白被输送·放出到血管侧(血中)的，因此血中浓度提高(分泌路径的变化)(非专利文献4，5)。如此地，即使观察岩藻糖化蛋白的血中的表达量增加，也并不是直接反映细胞的癌化进展程度，因此可以说岩藻糖化蛋白无法成为治疗靶标。
综上，有过如追踪AFP-L3组分那样的一个时期、即以“含岩藻糖的糖蛋白”、尤其是“岩藻糖α1→6糖链”或“岩藻糖α1→3糖链”为靶标的肝细胞癌标志物的探索及研究开发极其活跃的时期。其结果是，多种肝细胞癌标志物得到鉴定，在肝疾病的病态解析等领域取得了一定成果，但就肝细胞癌标志物而言，未能提供在准确性、简便性等方面超过现在临床中使用的AFP(特别是AFP-L3组分)的优异的标志物，现在处于停滞不前的状态。
基于这样的背景，强烈期望提供可以高精度、切实地将肝硬化和肝细胞癌区别开来、特异性检测肝细胞癌的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-323499号公报
专利文献2：日本特开平8-184594号公报
专利文献3：日本特开2004-105013号公报
专利文献4：日本特表2005-511023号公报
专利文献5：日本特表2005-526979号公报
专利文献6：日本特表2005-503176号公报
专利文献7：日本特开2006-94726号公报
专利文献8：日本特开2007-139742号公报
专利文献9：日本特表2007-506425号公报
专利文献10：日本特表2007-534772号公报
专利文献11：日本特开2007-322373号公报
专利文献12：日本特开2007-278803号公报
专利文献13：WO2011/007797
专利文献14：WO2011/007764
专利文献15：WO2010/055950
专利文献16：WO2010/010674
非专利文献
非专利文献1：Narimatsu H等,FEBS J,2010Jan；277(1):95-105
非专利文献2：Noda K等,Hepatology,1998Oct；28(4):944-52
非专利文献3：Noda K等,Cancer Res,2003Oct 1；63(19):6282-89
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非专利文献8：Ocho等,J Proteome Res,2014Mar 7；13(3):1428-37
非专利文献9：Hirabayashi J等,Chem Soc Rev,2013May 21；42(10):4443-58
非专利文献10：Matsuda A等,Biochem Biophys Res Commun 2008May 30；370(2):259-63
非专利文献11：Matsuda A等,Hepatology,2010July；52(1):174-82
非专利文献12：Quail DF等,Nat Med,2013Nov.；19(11):1423-1437
非专利文献13：Hirabayashi J等,Electrophoresis 2011May；32(10)1118-28
发明内容
发明要解决的问题
为了开发真正的肝细胞癌标志物，需要捕获仅在肝癌细胞或其附近特异性存在的标志物而不是与纤维化相伴随的结构变化，因此有必要对其标志物分子由实际癌部(癌细胞自身或特异性存在于其附近间质区域的细胞)表达进行可视化。
现状是，还没有观察到肝癌细胞或局限于其附近间质区域的细胞中特异性产生糖蛋白上的糖链变化这一现象的例子。
本发明提供一种检测肝细胞癌的标志物，其不依赖于肝脏的状态变化而由于癌的出现而开始存在于肝脏中。更具体而言，发现了一种凝集素，其能够特异性地仅识别具有如下糖链的糖蛋白，所述糖链是将肝细胞癌部和其周边的非癌部进行比较而确认到明显仅存在于癌部的糖链；从而旨在提供一种作为真正的肝细胞癌标志物的糖蛋白。
用于解决问题的方案
从以上的发现出发，本发明人等获得了如下结论：为了开发对肝癌进行检测的标志物，必须探索、寻找不受肝纤维化、功能降低的影响的、对癌特异性更高的在癌组织中出现的标志物。更具体而言，我们认为：具有如下糖链的糖蛋白是真正的肝癌标志物，所述糖链是将作为原发性肝癌的肝细胞癌和其周边的非癌部进行比较而确认到明显仅存在于癌部的糖链。
一直以来，在肝细胞癌中，为了鉴定在癌细胞表面特异性表达的糖蛋白，也进行了在正常细胞中不表达而在癌细胞中特异性表达的基因的探索，以及在癌细胞表面的膜组分中特异性表达的糖蛋白的探索，但并未获得满意的成果。本发明人们此次考虑：不仅包括肝细胞癌细胞自身表达的糖蛋白，也包括构成癌组织的各种细胞即肿瘤微环境(tumormicroenvironment：TME)，以癌细胞或构成癌组织的细胞所分泌的且局限于癌组织的糖蛋白为靶标，旨在进行癌组织的糖链解析。为此，尝试了使用本发明人们开发的凝集素阵列，通过激光显微解剖(LMD)将肝细胞癌患者组织标本中分化度不同的癌组织及非癌部组织明确分级，在提取存在于这些中的糖蛋白后，进行比较糖链解析。
凝集素阵列是世界上灵敏度最高的糖链解析技术(非专利文献9)，这种解析方法擅长的是对存在于少量细胞、组织中的糖蛋白上的糖链进行解析。目前，在对培养细胞进行处理的情况下，已经建立了将细胞的表层、内部的成分进行分级、分析的方法，但在由用LMD等取得的超微量的组织碎片提取蛋白质时，尚未建立明确的分级方法。即，成为分析对象的组织提取蛋白质液不仅混合了存在于组织中细胞的表面的蛋白质而且还有细胞内的蛋白质。进而，着眼点在于对包括癌细胞周边的间质部位也进行解析的实验例子还不存在。因此，通过现有的使用癌组织碎片的解析，即使利用某种糖链在癌组织和正常组织之间的凝集素信号差异观察到了差别，也不能确定该糖链是存在于癌细胞、组织表面上还是癌细胞附近间质区域。为了对其进行检验而需要某种手段，本发明人们采用了松田等人以前报道的、基于利用标记凝集素进行的癌细胞或组织表面的凝集素染色的检验法(非专利文献10、11)。并且，通过使用该染色法，本发明人等能够将作为靶标的、包括肝细胞癌细胞附近的间质区域(TME)在内的肝细胞癌及其周边区域中存在的、糖蛋白的糖链全部作为对象并进行可视化。
本发明人们通过凝集素阵列发现了多个在非癌区域中不存在而在癌部区域观察到特异性高的荧光的凝集素，因此决定按照松田等的方法(非专利文献8、9)对各凝集素进行标记，针对肝细胞癌组织进行凝集素染色而进行检验。作为此时的标记，首先使用病理解析中广泛使用的辣根过氧化物酶(HRP)进行DAB染色，但用凝集素阵列均无法获得能够得到数值的显著性差异的、显示出明确的染色强度差异的影像，反而得到了非癌部的染色性看起来高于癌部这样的、与凝集素阵列恰恰相反的结果。然后，尝试将条件的调整非常困难的荧光染色作为标记，开始时仍然无法获得癌部和非癌部的染色显著不同的结果。即使如此也没有放弃，对染色条件进行了研究，结果可以确认：在多种凝集素中，只有NPA凝集素对癌部、非癌部均染色，其染色图案(分布、染色强度等)显著不同。将凝集素阵列的结果和凝集素染色的结果相结合，首次证实NPA凝集素为与特异性存在于原发性肝细胞癌的癌部细胞膜及附近间质的一部分区域的糖链反应的凝集素。
观察凝集素染色结果的影像时，观察到与NPA凝集素反应的是：在非癌部的情况下，与存在于肝细胞的内部的特定(免疫)细胞反应；在癌部的情况下，与不仅存在于癌细胞表面也存在于癌组织中的癌细胞周边间质部位(TME)的特定(免疫)细胞反应。即，就与NPA凝集素反应的该糖蛋白而言，在正常的肝细胞的情况下存在于细胞内；罹患肝细胞癌时，则可能在癌细胞表面和/或癌细胞周边的TME内的细胞表面表达或分泌，并且原本存在于细胞表面的糖蛋白的糖链结构也可能随着肝细胞癌的发病而变为NPA凝集素反应性糖链。此外，与肝细胞癌表面分泌的糖蛋白不同的是，也存在如下可能性：从TME中特异性存在的免疫细胞等中，相同或不同的糖蛋白逐渐被分泌到细胞表面，或仅糖链结构发生变化。任意情况下均可以看到，由于原发性的肝细胞癌的发病，在癌细胞表面和/或癌细胞周边的TME中逐渐存在具有NPA凝集素反应性糖链的糖蛋白。
但是，最近逐渐了解到，此类作为癌细胞附近的微环境的TME在癌细胞的维持、湿润、转移等中发挥重要作用(非专利文献12)，尤其是胰癌、肺癌等周边间质大的癌的情况下，作为癌治疗的对象也逐渐引起注目(专利文献15)。
本发明中，与NPA凝集素反应的糖蛋白很可能是肝细胞癌的细胞膜表面及TME中特异性存在的(免疫)细胞的糖蛋白，成为肝细胞癌的诊断用标志物自不必说，还可以期待成为今后的肝细胞癌的治疗靶标。
综上，本发明中，作为验证试验的工序，不是简单地着眼于在癌部和非癌部的凝集素染色中有无染色性，而是对染色强度、图案的获取下功夫，从而首次发现了对NPA凝集素显示出结合性的糖蛋白为符合目标的分子组。
公知的是，NPA凝集素除了与作为N结合型糖链的母核结构的α甘露糖基残基有反应性以外，对“岩藻糖α1→6糖链”的反应性也高(专利文献16等)。但是，为同样作为“岩藻糖α1→6糖链”识别性凝集素的LCA凝集素(Lentil Lectin)的情况下，利用凝集素阵列进行的存在于癌部及非癌部组织区域中的糖蛋白的比较糖链解析的结果中，获得的是癌部的信号相对于非癌部降低这一正相反的结果。在与NPA凝集素时同样条件的组织染色中，LCA凝集素也显示完全不同的染色像，由此，作为肝细胞癌特异性的糖链，NPA凝集素所识别的糖链至少不是“岩藻糖α1→6糖链”。此外，与“岩藻糖α1→6糖链”不反应而与高甘露糖型中长链的富甘露糖糖链的反应性高的ConA(刀豆素A)，也是与非癌部相比在癌部为显著低的值的凝集素，由此可以说：
(1)根据非专利文献13等多篇文献，NPA被分类为高甘露糖结合凝集素，但根据详细的特异性解析(参照LfDB“http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearch”)时，对所谓的甘露糖的个数超过5的高甘露糖型糖链的亲和性不那么强，亲和性高的糖链的甘露糖数主要为3个，尤其对甘露三糖中结合有1个以上GlcNAc和/或Gal的糖链的亲和性高。此外，如专利文献16等，与含有核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的复合糖链的结合强，因此有时也被分类在核心岩藻糖识别凝集素中。
(2)LCA基本上与含有核心岩藻糖的糖链强烈结合，此外也与高甘露糖型糖链弱结合。这种情况下，与甘露糖的个数超过5的糖链结合强。
(3)ConA为与高甘露糖型糖链强烈结合的凝集素的代表。
具有如下特征：亲和性根据甘露糖的个数而变化较大、甘露糖个数超过7时显示显著的结合。
综上可以推测，此次作为NPA凝集素结合性发现的配体糖链的特征为：不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)而甘露糖的个数为3(不超过4)的复合型糖链。
即，本发明中发现的成为原发性的肝细胞癌标志物的糖蛋白，在“NPA凝集素结合性糖蛋白”中也可以称为“不含核心岩藻糖的NPA凝集素结合性糖蛋白”。
或者，由于NPA凝集素是独立于与LCA凝集素、ConA的结合性的因子，因此还可以表述为“不依赖于LCA凝集素的结合性的NPA凝集素结合性糖蛋白”或“不依赖于LCA凝集素及ConA的结合性的、NPA凝集素结合性糖蛋白”。
以上的结果显示，已证实与肝组织的纤维化协同而在血清中增加的“核心岩藻糖”与原发性肝细胞癌的发生无直接相关性。即，该结果还表明，由肝硬化向肝细胞癌的转变并非连续进行，而是存在某种突破(breakthrough)。
此外，NPA凝集素所识别的、成为肝细胞癌标志物的糖蛋白并不存在于癌细胞内部而明显局限地存在于癌细胞表面及其周边间质部(TME)，因此很可能是分泌性的糖蛋白。其被分泌到血液、其它体液中的可能性也高，并且与IgG等以高浓度存在于血中的糖蛋白不同的是，其是不依赖于与LCA凝集素等岩藻糖识别凝集素的结合性的糖蛋白，由此可以期待即便通过更低侵袭性的体液诊断中也能够与无关于纤维化状态的肝硬化进行区别。
即，此前在肝细胞癌判定中，一直是着眼于“含有岩藻糖的糖链”，因此将与LCA凝集素的反应性低的情况判定为阴性、将反应性高的情况判定为阳性，但已经证实，反而有可能与LCA凝集素的反应性低时原发性肝细胞癌才为阳性，表明了在原发性肝细胞癌判定中确认与NPA凝集素的反应性的重要性。
进一步，该包含“不依赖于LCA凝集素的结合性的NPA凝集素结合性糖蛋白”的原发性肝细胞癌标志物可以称之为局限在覆盖癌细胞表面、其周边的TME中的糖蛋白，因此可能成为用于癌治疗的治疗靶标。
通过得到以上的见解而完成了本发明。
即，本发明包含以下的发明。
〔1〕一种肝细胞癌标志物，其包含含有糖链表位的NPA凝集素结合性糖蛋白，所述糖链表位为NPA凝集素结合性糖链表位且具有下述(1)～(5)中的至少1个特性：
(1)糖链表位不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)、
(2)糖链表位含有甘露糖的个数为3的(4以下的)复合型糖链、
(3)糖链表位不含甘露糖的个数为5以上的高甘露糖型糖链、
(4)糖链表位包含不依赖于LCA凝集素的结合性的复合型糖链、
(5)糖链表位包含不依赖于ConA凝集素的结合性的复合型糖链。
〔2〕根据前述〔1〕所述的肝细胞癌标志物，其中，所述糖蛋白为存在于肝组织的癌细胞表面或存在于癌细胞附近的间质的糖蛋白。
〔2’〕一种肝细胞癌标志物，其为在用于检测肝细胞癌的方法中使用的、前述〔1〕或〔2〕所述的肝细胞癌标志物，该方法含有由受试者采集生物样品的工序。
〔3〕根据前述〔1〕或〔2〕所述的肝细胞癌标志物，其中，所述糖蛋白为选自补体因子H(CFH)、原纤蛋白1(FBN1)、纤连蛋白(FN)、氧调蛋白(HYOU1)、表皮生长因子受体(EGFR)、鞘脂激活蛋白原(PSAP)、组织蛋白酶D(CTSD)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)中的任一糖蛋白。
〔4〕前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的肝细胞癌标志物的检测用试剂，其特征在于，含有NPA凝集素。
〔5〕根据前述〔4〕记载的检测用试剂，其特征在于，还含有LCA凝集素或ConA凝集素。
〔6〕根据前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的肝细胞癌标志物的检测用试剂，其特征在于，含有与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体，所述NPA凝集素结合性糖蛋白为选自补体因子H(CFH)、原纤蛋白1(FBN1)、纤连蛋白(FN)、氧调蛋白(HYOU1)、表皮生长因子受体(EGFR)、鞘脂激活蛋白原(PSAP)、组织蛋白酶D(CTSD)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)中的至少一种。
〔7〕一种肝细胞癌的检测方法，其特征在于，通过对被检试样中的前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的肝细胞癌标志物进行体外检测，从而对肝细胞癌进行检测。
〔8〕根据前述〔7〕所述的方法，其特征在于，通过使用了被标记的NPA凝集素进行的被检细胞或组织的NPA染色，进行所述肝细胞癌标志物的体外检测。
〔9〕根据前述〔7〕所述的方法，其特征在于，通过使用含有NPA凝集素的凝集素阵列的凝集素阵列解析法或含有NPA凝集素的凝集素-抗体ELISA法，进行所述肝细胞癌标志物的体外检测。
〔10〕根据〔9〕所述的方法，其特征在于，所述凝集素阵列解析法使用含有与NPA凝集素并且至少含有LCA凝集素或ConA凝集素的凝集素阵列。
〔11〕根据前述〔9〕所述的方法，其特征在于，所述凝集素-抗体ELISA法为利用夹心法检测肝细胞癌标志物的方法，所述夹心法使用了NPA凝集素及与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体，将与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体在支持体上固相化，通过用被标记的NPA凝集素夹持作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白的凝集素覆盖而进行；或者，通过用被标记的所述抗体夹持作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白的抗体叠加而进行。
〔12〕根据前述〔11〕所述的方法，其特征在于，所述与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体为与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
〔13〕根据前述〔7〕、〔9〕～〔12〕中任一项所述的方法，其特征在于，使用含有血清成分的血液试样作为被检试样进行肝细胞癌标志物的体外检测时，设置如下工序：预先使被检试样与在支持体上固相化的α2,6唾液酸结合性凝集素的吸附工序，和取得α2,6唾液酸结合性凝集素非吸附组分的工序。
〔14〕根据前述〔13〕所述的方法，其中，α2,6唾液酸结合性凝集素为选自SNA、SSA、TJAI及PSLla凝集素中的至少一种凝集素。
〔15〕一种测定方法，其特征在于，其为用于判断是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度的测定方法，包括如下工序：
对来自被检肝组织的被检试样，使用含有NPA凝集素的凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法，测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序。
〔16〕根据前述〔15〕所述的测定方法，其特征在于，在所述测定方法中设置如下工序：
(1)预先在所述凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法中，测定多种肝细胞癌组织及正常组织对含有NPA凝集素的凝集素的反应性，准备对应于肝细胞癌的进展或恶性的程度的判别式或标准曲线的工序，及
(2)将所述被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的测定值代入所述判别式或标准曲线，判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的工序。
〔17〕一种测定方法，其特征在于，其为用于使用含血清试样作为被检试样判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的测定方法，包括：对于被检含血清试样，
(1)与在支持体上固相化的α2,6唾液酸结合性凝集素进行吸附的工序，
(2)取得α2,6唾液酸结合性凝集素非吸附组分的工序，和
(3)使用含有NPA凝集素的凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序。
〔18〕一种测定方法，其特征在于，其为用于判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的测定方法，包括如下工序：
对于来自被检肝组织的被检试样，使用含有NPA凝集素的凝集素与抗体的夹心ELISA法测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序，所述抗体为与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
〔19〕一种使用含有NPA凝集素的凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法判定是否罹患肝细胞癌或者癌进展或恶性的程度的方法，其中，
(1)预先在所述凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法中，测定多种肝细胞癌组织及正常组织对含有NPA凝集素的凝集素的反应性，准备对应于肝细胞癌的进展或恶性的程度的判别式或标准曲线的工序，
(2)将来自被检肝组织的被检试样供于所述凝集素阵列或ELISA，测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序，
(3)将工序(2)中获得的、被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的测定值代入工序(1)中获得的判别式或标准曲线中，判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度的工序。
〔20〕根据前述〔19〕所述的方法，其特征在于，所述凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法含有NPA凝集素并且还含有LCA凝集素和/或ConA凝集素，预先准备的判别式或标准曲线还包括针对LCA凝集素和/或ConA凝集素的判别式或标准曲线。
〔21〕一种利用组织染色判定是否罹患肝细胞癌或癌进展或恶性的程度的方法，包括下述工序(1)～(4)：
(1)制作来自被检肝组织的被检试样的组织切片的工序，
(2)利用被荧光标记的NPA凝集素进行组织染色的工序，
(3)观察细胞表面和/或其附近的间质中荧光的有无及强度的工序，
(4)在工序(3)中观察到一定水平以上的荧光时，判定罹患肝细胞癌，根据其强度判定癌进展或恶性的程度的工序。
〔21〕一种组织染色用试剂盒用于判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度，其特征在于，含有被荧光标记的NPA凝集素。
〔22〕一种肝细胞癌标志物检测用试剂盒，其特征在于，下述(1)及(2)中的任一者被固相化于支持体，另一者被标记，
(1)含有NPA凝集素的凝集素、
(2)与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
〔22’〕一种肝细胞癌标志物检测用试剂盒，其特征在于，其用于判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度，下述(1)及(2)中的任一者被固相化于支持体，另一者被标记，
(1)含有NPA凝集素的凝集素、
(2)与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
〔23〕一种肝细胞癌标志物检测用试剂盒，其特征在于，至少使用NPA凝集素并且还使用LCA凝集素和/或ConA凝集素。
〔23’〕一种肝细胞癌标志物检测用试剂盒，其特征在于，其为用于判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度，至少使用NPA凝集素并且还使用LCA凝集素和/或ConA凝集素。
〔24〕根据前述〔22〕或〔23〕所述的试剂盒，其特征在于，前述试剂盒为用于以含血清试样作为被检试样的试剂盒，还含有α2,6唾液酸结合性凝集素。
〔25〕前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的肝细胞癌标志物在制造肝细胞癌标志物检测用试剂盒中的用途。
〔26〕前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的肝细胞癌标志物在制造用于判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度的试剂盒中的用途。
发明的效果
根据本发明，可以提供包含不依赖于肝纤维化、功能降低、由于肝细胞癌的出现而开始存在于肝脏中的“不依赖于LCA凝集素的结合性的NPA凝集素结合性糖蛋白”的真正的肝细胞癌标志物，同时可以提供利用含有NPA凝集素的试剂盒的该肝细胞癌标志物的检测法。此外，通过对该肝细胞癌标志物进行检测，还能够和与肝纤维化的进展、功能降低无关的肝硬化进行区别，进而通过以局部存在于癌细胞表面及覆盖其周边的TME的该肝细胞癌标志物为靶标，开辟了用于肝细胞癌治疗的药剂开发、治疗法开发之路。
附图说明
图1：由肝细胞癌患者通过外科手术摘除的肝组织连续薄切标本(苏木精-伊红染色：上段)和LMD后标本(苏木精染色：下段)
图2：HCV感染肝细胞癌患者的肝组织标本利用凝集素阵列得到的比较糖链解析结果
图3：非HCV、非HBV感染肝细胞癌患者的肝组织标本的比较糖链解析结果
图4：各凝集素所结合的N型糖链的前10位
图5：使用了模型细胞株的凝集素阵列和夹心ELISA的性能比较
图6：使用来自肝细胞癌患者组织的蛋白质溶液的凝集素阵列和夹心ELISA的性能比较
图7：由肝细胞癌患者通过外科手术摘出的肝组织标本的苏木精-伊红染色(左)和NPA凝集素染色(右)
图8：示出肝组织标本的凝集素染色的窄视野图像(×60油浸镜)：同一组织中的非癌部区域(上段)、中分化型癌部(下段)。
图9：使用来自肝细胞癌患者(7个病例)组织的癌部及非癌部中的组织裂解物的凝集素阵列和夹心ELISA(图中，■为来自癌部、□为来自非癌部)。
图10：肝细胞癌培养细胞株的AFP产生株和非产生株中的培养上清的凝集素信号比较。
图11：肝细胞癌培养细胞株的AFP产生株和非产生株中的培养上清中的NPA结合糖蛋白的α2,6唾液酸识别凝集素反应性。
图12：应用了多级凝集素利用法的来自非HBV、非HCV患者的血清的SSA非吸附-NPA吸附组分的凝集素解析。
图13：显示来自Huh7、HAK 1A或HLF细胞株的细胞提取物中的NPA凝集素洗脱组分中的、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2糖蛋白的存在的蛋白质印迹图。
图14：显示Huh7、HAK 1A、HAK 1B、KYN-1或HLF细胞株的无血清培养的培养上清中的NPA凝集素洗脱组分中的、CFH、FN、PSAP、CTSD及LAMP-2糖蛋白的存在的蛋白质印迹图。
图15：显示HuH-7、HAK 1B或KYN-1细胞株的无血清培养的培养上清中的NPA凝集素洗脱组分中的、FBN1及FN糖蛋白的存在的抗体-凝集素夹心ELISA；以及显示HAK 1A细胞株的无血清培养的培养上清中的NPA凝集素洗脱组分中的、CTSD、PSAP及LAMP-2糖蛋白的存在的抗体-凝集素夹心ELISA的图。将抗FBN1抗体及FN抗体固定化于平板，通过利用生物素化标记NPA凝集素的夹心ELISA测定体系进行检测。
图16：显示HAK 1A细胞株的无血清培养的培养上清中的、利用抗CD9抗体或抗CD81抗体的免疫沉降洗脱组分中的、CTSD糖蛋白的存在的蛋白质印迹图。
具体实施方式
1.关于本发明中的肝细胞癌标志物
(1-1)成为本发明的肝细胞癌标志物的糖蛋白
本发明的肝细胞癌标志物可以表述为：“NPA凝集素结合性糖蛋白”中的“不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的NPA凝集素结合性糖蛋白”。更具体而言，可以称为“不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)且具有甘露糖的个数为3的(不超过4)复合型糖链的糖蛋白”。或者，还可以称为“表位中不含含有核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)和5个以上甘露糖的糖链的NPA凝集素结合性糖蛋白”。糖链的其它特征如下述(1-3)所示。
此外，该糖蛋白与NPA凝集素明显反应，但不依赖于LCA凝集素的结合性，其中，该LCA凝集素在与核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的结合性中显示相同行为，因此，本发明的肝细胞癌标志物还可以表述为“不依赖于LCA凝集素的结合性的NPA凝集素结合性糖蛋白”。并且，同样也不依赖于与大多被分类为高甘露糖型凝集素的ConA凝集素的结合性，因此还可以表述为“不依赖于LCA凝集素及ConA的结合性的、NPA凝集素结合性糖蛋白”。
综上，若要准确表述本发明的肝细胞癌标志物，则可以叙述如下：
“一种肝细胞癌标志物，其包含含有糖链表位的糖蛋白，所述糖链表位为NPA凝集素结合性糖链表位且具有下述(1)～(5)中的至少1个特性：
(1)糖链表位不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)，
(2)糖链表位含有甘露糖个数为3(不超过4)的复合型糖链，
(3)糖链表位不含甘露糖为5个以上的高甘露糖型糖链，
(4)糖链表位包含不依赖于LCA凝集素的结合性的复合型糖链，
(5)糖链表位包含不依赖于ConA凝集素的结合性的复合型糖链。”。
作为典型的表述，下文中有时也将本发明的肝细胞癌标志物称为“含有不含核心岩藻糖的NPA凝集素结合性糖链表位的糖蛋白”，或简称为“不含核心岩藻糖的NPA凝集素结合性糖蛋白”、“NPA凝集素结合性糖蛋白”。
进而，就成为本发明的肝细胞癌标志物的糖蛋白而言，从组织染色等的结果来看，为局限于肝细胞癌的细胞膜表面及癌细胞周边附近区域(TME)的免疫细胞的糖蛋白，并且，该糖蛋白还可能为如下糖蛋白：在正常细胞时，存在于细胞内的细胞器等中，而随着肝细胞癌的发病被分泌到细胞外。此外，还可能存在如下情况：被蛋白酶切割而向细胞外分泌时，或被呈递到外来体之类的分泌囊泡的表面或被内包的情况。
即，本发明的肝细胞癌标志物在着眼于其存在位置时还可以表述为：“特异性存在于肝细胞癌的细胞膜表面和/或TME中的免疫细胞中的NPA凝集素结合性糖蛋白”。
(1-2)关于本发明中使用的凝集素
(a)用于直接检测来自本发明的肝细胞癌标志物的糖链的凝集素：
本发明中，对于来自成为肝细胞癌标志物的糖蛋白(NPA结合性蛋白质)的糖链的糖链表位直接进行识别的凝集素是NPA凝集素。
＜NPA凝集素＞
NPA凝集素是指来自黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)、属于单子叶植物甘露糖结合凝集素(“Monocot Mannose-binding Lectin”)家族的凝集素。有时也被称为NPL凝集素。这里，“凝集素”被定义为：“特异性识别、结合糖链并形成交联的蛋白质”。
NPA凝集素也可以由黄水仙提取并分离纯化，目前市场上已有销售，可以从EYLabortories,Inc.获得。生物素化NPL可以从Vector Laboratories,Inc.获得。
NPA凝集素的单糖特异性为Man。就NPA凝集素而言，根据详细的特异性解析(参照LfDB)时，如图4中前10位所示，对甘露糖的个数超过5个的所谓高甘露糖型糖链的亲和性不那么强，亲和性高的糖链的甘露糖个数主要为3个，对甘露三糖上结合有1个以上的GlcNAc和/或Gal的糖链的亲和性尤其高。
此外，对含有核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的复合糖链的结合强，有时也作为LCA凝集素等“核心岩藻糖识别凝集素”同等处理(专利文献16)。
(b)用于确认并非来自本发明中的肝细胞癌标志物的糖蛋白(NPA结合性蛋白质)的糖链的凝集素：
来自成为本发明中的肝细胞癌标志物的糖蛋白的糖链的糖链表位，其特征在于，不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)，及不含甘露糖数为5个以上的高甘露糖型糖链。
因此，对“岩藻糖α1→6糖链”的亲和性高且对含有3个甘露糖的糖链不具有亲和性的凝集素或对“甘露糖数为5个以上的高甘露糖型糖链具有高亲和性的凝集素为所谓的“负标志物”，表示：NPA凝集素所结合的糖蛋白不是成为肝细胞癌标志物的糖蛋白。作为这样的典型凝集素，前者为“LCA或PSA、AOL、AAL凝集素”，尤其是“LCA凝集素”；后者为“ConA凝集素”。
＜LCA凝集素＞
LCA凝集素是来自小扁豆(Lens culinaris)、属于豆科凝集素(“Legume Lectin”)家族的凝集素，单糖特异性为Man及Glc。就LCA凝集素而言，如图4中前10位所示，基本上与含有核心岩藻糖的糖链强烈结合。除此以外，还与高甘露糖型糖链弱结合，在高甘露糖型糖链中，与甘露糖的个数超过5的高甘露糖型糖链强烈结合。
LCA凝集素作为典型的对含有核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的糖蛋白的亲和性高的凝集素而被广泛使用，为标准物质(专利文献16等)，结合有LCA凝集素的凝集素柱在市场中有售，以糖蛋白分离、纯化用的凝集素亲和色谱试剂盒形式使用(Science Tools fromAmersham Biotech 3,3(1998)p.5-6)。
＜ConA凝集素＞
ConA(刀豆素A)来自豆科的刀豆(Canavalia ensiformis)，是豆科凝集素(“LegumeLectin”)家族的凝集素，单糖特异性为Man及Glc。ConA为与高甘露糖型糖链强烈结合的凝集素的代表，结合有ConA的凝集素柱在市场有售，与LCA凝集素柱一起以糖蛋白分离、纯化用的凝集素亲和色谱
的试剂盒形式使用(Science Tools from Amersham Biotech 3,3(1998)p.5-6)。
ConA的亲和性具有如下特征：根据甘露糖的个数而大幅变化，甘露糖个数超过7个时显示显著的结合。
(c)关于可通过与NPA凝集素组合使用而提高肝细胞癌标志物检测精度的凝集素：
＜DSA凝集素＞
DSA凝集素是来自曼陀罗(Datura stramonium)的具有Galβ1→4GlucNAc特异性亲和性的凝集素，根据来自感染HCV的肝细胞癌患者的肝组织标本的癌部及非癌部的凝集素阵列解析(图2)时，在癌部与NPA凝集素同等程度地具有显著(p<0.001)高的反应性。即，含有由DSA凝集素所识别的、在非还原末端具有3个以上的Galβ1→4GlcNAc的复合糖链的糖蛋白也可以称为肝细胞癌标志物候选物。但是，就DSA凝集素而言，在非癌部中的值也高，由此来看，其不是由于肝细胞癌发病才开始进行表达或生物合成的糖蛋白，不过是由于癌变而存在量增大，因此不能成为真正意义上的肝细胞癌标志物候选物。因此，本发明中不作为直接对象。但是，通过与本发明的NPA凝集素组合使用，有可能可以提高检测精度。
此外，图3中，在来自非HCV、非HBV感染肝细胞癌患者的肝组织标本的癌部及非癌部的凝集素阵列解析(图3)中，与NPA凝集素同样地具有显著性差异；在癌部为高值、在非癌部为低值的HPA凝集素也由于在非癌部中的值高，在本发明中不作为直接对象。但是，与DSA凝集素的情况同样地，通过与本发明的NPA凝集素，或进一步还与DSA凝集素组合使用，有可能可以提高检测精度。
(d)用于富集血清中的NPA结合性蛋白质的凝集素
此外，在使用血清等血液试样来进行本发明的肝细胞癌标志物的检测时，通过预先除去血清中大量存在的具有α2,6唾液酸(Neu5Acα2-6Gal或Neu5Gcα2-6Gal)的糖蛋白，可以将NPA结合性蛋白质浓缩，可以提高肝细胞癌标志物的检测效率。
已经观察到，在各种恶性度高的癌细胞表面，α2,6唾液酸的表达增加，还报道了N结合型糖蛋白中的α2,6唾液酸的表达增加与癌的进展、转移、预后不良有关(Cancer Res.,2013Apr 1；73(7)2368-78)。但是，在肝细胞癌的情况下，并未观察到α2,6唾液酸的表达与系统相称地增加，就本发明的肝细胞癌标志物糖蛋白(NPA结合糖蛋白)而言，α2,6唾液酸的增减不一定是标志物指标，NPA本身不显示出与含有α2,6唾液酸的糖链的结合性，因此认为，不含α2,6唾液酸的糖蛋白反而可能成为血清标志物。
另一方面，即使是来自正常人的血清，在血清中的糖蛋白中原本也大量存在与NPA结合的糖蛋白。但是，本发明已经阐明，这样的来自正常细胞的糖蛋白大多也同时具有α2,6唾液酸。
综上，在想要使用含有血清的试样进行本发明的肝细胞癌标志物糖蛋白(NPA结合糖蛋白)的检测、测定时，设置预先使含有血清的试样与特异性识别α2,6唾液酸的凝集素(SNA、SSA、TJAI或PSLla凝集素)反应、从而将含有α2,6唾液酸的糖蛋白除去的工序时，具有大幅降低本底的效果，是有利的。例如，用固定有识别这些α2,6唾液酸的凝集素的亲和柱、磁珠柱等，对被检血清试样进行处理。血清中的大部分蛋白质被柱捕获，而本发明的肝细胞癌标志物(NPA结合糖蛋白)直接通过，结果被富集。
作为此时的凝集素，可以列举SNA、SSA、TJAI或PSLla凝集素，还可以使用已知的抗α2,6唾液酸抗体(Cancer Res.,2013Apr 1；73(7)2368-78)代替这些凝集素。这些凝集素或抗体可以单独使用，也可以将多种组合。
＜TJAI凝集素＞
TJAI凝集素(日本栝蒌(Trichosanthes japonica)凝集素Ⅰ)可以由Trichosantheskirilowii var.japonica提取，生化学工业株式会社等也有销售。
＜SSA凝集素＞
SSA凝集素(无梗接骨木(Sambucus sieboldiana)凝集素)可以由日本接骨木提取，生化学工业株式会社等也有销售。
<SNA凝集素>
SNA凝集素(西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素)可以由接骨木提取，VECTORLaboratories Corporation也有销售。
<PSL1a凝集素>
PSL1a凝集素(宽鳞多孔菌(Polyporus squamosus)凝集素)可以从宽鳞多孔菌提取，和光纯药工业正在销售保持α2,6唾液酸特异性的重组rPSL1a凝集素。
(e)关于其他凝集素的信息：
关于凝集素的信息可以由凝集素前沿数据库(LfDB)或产业技术综合研究所创药基盘研究部门的主页等获得。
(1-3)本发明的肝细胞癌标志物中的糖链的特征
本发明的肝细胞癌标志物中的糖链的最大特征是，其为不依赖于与LCA凝集素的结合的糖链，其中，所述LCA凝集素与核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的亲和性极高，因此极可能为不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)的糖链。可以至少在成为本发明的标志物的糖蛋白的糖链表位中不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)。
此外，本发明的肝细胞癌标志物中的糖链的特征在于，其为不依赖于与ConA的结合的糖链，其中，所述ConA与甘露糖为5个以上的高甘露糖型糖链的亲和性极高；具体而言，不为甘露糖数为5个以上的高甘露糖型糖链、或者，是甘露糖的个数为3个(不超过4)的复合型糖链。或者，也可以说甘露糖为5个以上的高甘露糖型糖链不会成为本发明标志物的表位。
即，本发明发现的成为原发性肝细胞癌标志物的糖蛋白可以称为：“NPA凝集素结合性糖蛋白”中“含有不含核心岩藻糖的NPA凝集素结合性糖链的糖蛋白”，或“不含甘露糖为5个以上的高甘露糖型糖链的含有NPA凝集素结合性糖链的糖蛋白”。也可以称为：“不含核心岩藻糖，含有甘露糖的个数为3的(不超过4)复合型糖链，且含有NPA凝集素结合性的糖链的糖蛋白”。也可以称为：“含有不具有核心岩藻糖或甘露糖为5个以上的高甘露糖型糖链的糖链表位的NPA凝集素结合性的糖蛋白”。
2.成为本发明的肝细胞癌标志物的糖蛋白和其特异性抗体
(2-1)成为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白
本发明的NPA凝集素结合性糖蛋白可称为：在罹患肝细胞癌的肝脏的癌部中，特异性存在于癌细胞及其附近的间质部(TME)的糖蛋白，因此可知在由肝细胞癌患者摘除的肝细胞癌组织中存在着相当的量。因此，可以大量收集这种被废弃处理的肝细胞癌组织，用已知方法从该癌组织取得蛋白质组分，利用固定有NPA凝集素的凝集素色谱等简单、大量地取得，从而可以根据需要确定所获得的糖蛋白的氨基酸序列及糖链结构。
本发明中，作为能够对这样的候选糖蛋白中的多种高效地进行鉴定的方法，利用本发明人们以前开发的Lec-IGOT-LC/MS法(日本专利第4220257号、Kaji H等Nature Protocols1,3019-3027(2006))鉴定了8种肝细胞癌标志物。
这些糖蛋白为使用被检血清试样或被检细胞切片进行肝细胞癌诊断时的糖链靶标，且也为肝细胞癌治疗时的糖链靶标。
具体而言，为表1记载的补体因子H(CFH)、原纤蛋白1(FBN1)、纤连蛋白(FN)、氧调蛋白(ORP-150，低氧上调1(Hypoxia Up-Regulated 1):HYOU1)、表皮生长因子受体(EGFR)、鞘脂激活蛋白原(Prosaponin，PSAP)、组织蛋白酶D(CTSD)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)。表1记载的这些标志物分子为具有多个以与NPA凝集素特异性结合为特征的N结合型糖链的NPA结合性糖蛋白，成为可检测·判定肝细胞癌的肝细胞癌标志物。
只要是在表1所示的糖附加位置的天冬酰胺残基上附加有糖链的表1记载的肝细胞癌标志物糖蛋白、或者附加有糖链的含有至少1个表1所示的糖附加位置的天冬酰胺残基的糖蛋白片段，均可以作为肝细胞癌标志物使用。这些肝细胞癌标志物可以单独使用，也可以将二种以上组合使用。例如，也可以使用二种以上不同的肝细胞癌标志物糖蛋白。
通过检测这些肝细胞癌标志物的有无，可以判定被检试样中是否罹患肝细胞癌和/或癌的进展或恶性的程度。
[表1]
基因符号 NPA-IGOT N-糖基化位点
EGFR + 11
FN1 + 9
FBN1 + 15
HYOU1 + 9
CFH + 9
CTSD + 2
LAMP2 + 16
PSAP + 5
＜表皮生长因子受体(EGFR)＞
上皮生长因子受体(表皮生长因子受体，简称：EGFR、ERBB、ERBB1)是在上皮系、间充质系等各种细胞膜表面表达的酪氨酸激酶型受体，是与控制细胞增殖、生长的上皮生长因子(EGF)的信号传递有关的糖蛋白。在肾癌、各种恶性肿瘤中可见过度表达，在癌的预后作为不良因子而已知。
＜纤连蛋白1(FN1)＞
纤连蛋白(Fibronectin，简称：FN、FN1、CIG、FINC、GFND2、LETS、MSF)在血清中以可溶性的二聚体糖蛋白形式存在，在细胞表面、胞外基质中以二聚体或多聚体形式存在。作为癌化相关因子也备受关注。
＜原纤蛋白1(FBN1)＞
原纤蛋白(Fibrillin 1，简称：FBN1、FBN、MASS、)MFS1、OCTD、SGS、WMS)属于原纤蛋白家族，是承担微原纤维的10-12nm的Ca结合部位构成蛋白的胞外基质的巨大糖蛋白。
＜氧调蛋白(ORP-150,低氧上调1(Hypoxia Up-Regulated 1):HYOU1)＞
低氧控制因子(氧调蛋白，简称：HYOU1,Grp170，HSP12A、ORP150)属于热休克蛋白70家族，是在囊泡体(ER)内与蛋白质的折叠、分泌有关的蛋白质，还具有凋亡抑制、防御由低氧诱导引起的紊乱的细胞防御作用。在乳癌等中已确认到高表达。
＜补体因子H(CFH)＞
补体H因子(补体因子H，简称：CFH、ARMD4、ARMS1、FHL1、HF、HF1、HF2、HUS)作为补体活化调节(RCA)的成员之一，被分泌到血液中，是与细菌感染的自然防御机制有关的糖蛋白。
＜组织蛋白酶D(CTSD)＞
组织蛋白酶D(Cathepsin D，简称：CTSD、CLN10、CPSD)为溶酶体的Asp蛋白酶的一种，是通过基因变异而形成乳癌、阿尔茨海默症等各种疾病的原因。
＜溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)＞
溶酶体膜蛋白质2(Lysosomal associated membrane protein 2，简称：LAMP-2、CD107b)属于细胞膜糖蛋白家族，具有向选凝素提供糖配体的作用，与癌的转移有关。
＜鞘脂激活蛋白原(PSAP)＞
神经营养因子(Prosaponin，简称：PSAP、GLBA、SAP1)为皂化蛋白(saposin)前体，被切割为皂化蛋白A、B、C及D。皂化蛋白A-D存在于溶酶体区域内，该前体作为分泌性蛋白质或复合膜蛋白具有神经营养活性。
(2-2)用于检测肝细胞癌标志物的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体
然后，可以基于该糖蛋白的氨基酸序列信息制备对蛋白质部分为特异性的抗体。此外，由于基于该糖蛋白的糖链结构可以准确地确定被NPA凝集素识别的糖链表位的糖链结构，因此可以以该糖链表位作为免疫原，通过已知的抗体制备方法简单地获得识别该糖链表位的抗体。此外，还可以取得识别除该糖链表位以外的糖链结构的其它凝集素或抗体。
进而，还可以使用CasMab法(CasMab：Kato Y等,Sci Rep.2014Aug 1；4:5924.doi:10.1038/srep05924)等，制备同时识别该糖蛋白的含有糖链表位的糖链和蛋白质部分的肝细胞癌特异性抗体，因此可以提供以肝细胞癌为治疗靶标的治疗用抗体药物。
在本发明的肝细胞癌标志物的检测方法、肝细胞癌的判定方法中，与NPA凝集素结合性糖蛋白的蛋白质部分特异性结合的抗体尤其有效，也可以单独使用，但优选与NPA凝集素组合使用。这些抗体可以是多克隆抗体，但优选单克隆抗体，只要不损害其抗原活性，则也可以为Fab等抗体片段。将这些抗体及其片段总称为抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体。
此外，作为“抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体”，还包含同时识别糖链部分和蛋白质部分的抗体(肝细胞癌特异性抗体)的情况。该肝细胞癌特异性抗体单独即可极其有效地用于肝细胞癌标志物的检测及肝细胞癌诊断，但通过和与NPA凝集素或蛋白质部分特异性结合的抗体等组合使用，可以进一步提高精度。
本发明中，作为可以用于肝细胞癌标志物的检测、肝细胞癌的判定等的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体，将具体的抗体示于下述表2。
[表2]
(2-3)关于Lec-IGOT-LC/MS法
以下对本发明中使用的“Lec-IGOT-LC/MS法”的具体步骤进行简单说明。
(1)18O标记肽的制备
将2种肝细胞癌培养株(HLF株、HAK1A株)的培养上清、以及由来自肝细胞癌患者病理组织的癌部及非癌部分别制备的蛋白质试样通入结合有NPA凝集素的柱，捕获NPA结合性糖蛋白组，利用胰蛋白酶处理片段化而成为肽后，再次通入NPA凝集素柱，再次捕获NPA凝集素结合性糖肽组。对于获得的候选糖肽用肽-N-糖苷酶(糖肽酶F、PNGase)处理使N结合型糖链脱离，取而代之的是对结合有糖链的Asn导入18O，从而对肽进行稳定同位素标记。(由此，通过实验明确证实了肽上是否结合有糖链，且获知了糖链结合在肽序列上的哪个Asn上。)
(2)标记肽的氨基酸序列及糖链结合位置的鉴定
将通过IGOT法标记的候选糖肽用液相柱色谱(LC)分离，导入质谱(MS)，通过串联质谱法(MS/MS离子检索法)包罗性地确定其氨基酸序列，实验检索软件Mascot鉴定糖链结合位置。
(3)肝细胞癌组织癌部中的高表达糖蛋白的鉴定
将获得的NPA凝集素结合性肽组分别与数据库内的糖蛋白关联，使用对应的各糖蛋白的市售抗体，在肝细胞癌培养株(HLF株、HAK1A株)以及肝细胞癌患者病理组织的任一者中，对与非癌部相比在癌部高表达的糖蛋白进行鉴定，将其作为多种候选糖蛋白。
(4)肝细胞癌标志物糖蛋白的确定
在获得的多种成为肝细胞癌标志物候选物的糖蛋白中，对于实际NPA捕获后获得的NPA结合蛋白质组分，通过在利用抗标志物候选蛋白质抗体的蛋白质印迹中是否出现有合适移动度的条带信号，来检验NPA结合性，将出现信号的选出，作为本发明的肝细胞癌标志物糖蛋白。在无法获得蛋白质印迹用的抗体等，根据情况进行使用了NPA凝集素和抗标志物候选蛋白质抗体的凝集素-抗体夹心ELISA的结果，将相对于本底信号产生了显著性信号(S/N比为2以上)者选出，作为本发明的肝细胞癌标志物糖蛋白。
3.本发明的肝细胞癌标志物的检测方法
(3-1)利用凝集素阵列或夹心ELISA法进行的检测和定量
成为本发明的肝细胞癌标志物的“NPA凝集素结合性糖蛋白”即使仅着眼于糖链部分，也可以通过使用NPA凝集素的凝集素阵列或夹心ELISA法简便且准确地进行检测，并且还能够进行肝细胞癌标志物的定量。这里，通过与NPA凝集素一起组合使用选自作为岩藻糖α1→6糖链结合性凝集素的LCA凝集素等、作为5个甘露糖以上的高甘露糖糖链结合性凝集素的ConA凝集素等、及作为α2,6唾液酸结合性凝集素的SNA、SSA、TJAI、PSLla凝集素等中的至少1种凝集素，来提高检测精度。
此外，通过进一步使用识别NPA凝集素结合性糖蛋白的蛋白质部分的抗体(例如抗LAMP2抗体、抗CTSD抗体、抗CFH抗体、抗FBN1抗体)，或同时识别糖链和蛋白质部分的抗体，可以进行肝细胞癌标志物的检测及定量。这类抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体可以单独使用，特别优选与含有NPA凝集素的凝集素类组合使用的夹心ELISA法。
本发明的肝细胞癌标志物的检测及定量方法可以用于：由从受试者采集的试样检测肝细胞癌标志物，从而判定该受试者是否罹患肝细胞癌。
此外，通过对施与肝细胞癌治疗药后采集的血清(体液)中的上述肝细胞癌标志物的含量进行测定，还可以进行肝细胞癌治疗效果的评价。例如，在治疗药施与前和施与后数天至数月的时刻，对上述肝细胞癌标志物的含量或由其算出的值进行比较，如果后者中的肝细胞癌标志物的含量或由其算出的值降低，则可以判断为有预防或治疗效果。作为肝细胞癌治疗药，可以列举例如：索拉非尼(通用名)等。
本说明书中，“受试者”是指供检查的人，即提供被检试样的人。受试者可以是患有任意疾病的患者或健康人中的任一种。优选为有可能罹患肝细胞癌的人或肝细胞癌患者。
这里，作为被检试样，可以以由受试者通过活组织检查等采集的部分肝组织的组织碎片、来自由肝炎或肝硬化患者切除的肝组织的病变部的组织碎片为对象，对受试者没有特别限定，可以广泛用于有必要判断是否为肝细胞癌的人。
此外，可以使用受试者的血液、淋巴液、脊髓液或胆汁等体液，优选地将由受试者采集的血液分离而得的血清作为被检试样，由于可以实现受试者的负担减轻、检查时间也缩短，因此最为优选。
被检体液可以在采集后立即使用，也可以通过冷冻或冷藏保存一定时间后根据需要进行解冻等处理后使用。本实施方式中，在使用血清时，使用10μL～100μL、20μL～80μL、30μL～70μL、40μL～60μL或45μL～55μL的体积即可检测充分量的肝细胞癌标志物。
在单独使用含有甘露糖的糖链结合性NPA凝集素单独或优选与肝细胞癌标志物检测用抗体组合通过后述任一方法从被检试样检测肝细胞癌标志物时，可以以极高的可能性判断该受试者是否罹患肝细胞癌。
(3-2)组织碎片的凝集素阵列解析法
在以来自受试者的肝组织的组织碎片为被检试样时，可以通过例如以下步骤进行凝集素阵列解析。
需要说明的是，本实施例中，作为基本的方案，按照松田等(非专利文献10)的方法进行，以下的说明也主要是对该方法进行说明，但不受其限定。
＜被检试样的制备＞
将组织碎片在缓冲液中破碎，进行膜蛋白的可溶化，作为通过离心而得的上清而获得组织提取蛋白质，对全部的组织提取蛋白质进行标记。
此外，作为另一方法，可以将与作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体进行荧光标记后，使用该被标记的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体，这种情况下不需要组织提取蛋白质的标记工序。
＜标记＞
作为标记物质的例子，可以列举荧光物质(例如FITC、罗丹明、Cy3、Cy5)、放射性物质(例如14C、3H)、酶(例如碱性磷酸酶、过氧化物酶(辣根过氧化物酶等)、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶)等。此外，还可以利用生物素和(链酶)亲和素的结合。还可以对检测剂进行生物素标记，将(链酶)亲和素用上述标记物质标记，利用生物素和(链酶)亲和素的结合来进行检测。需要说明的是，这里例示的标记方法可以用于对本发明中使用的凝集素的通常标记，进而，与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体等也可以用于本发明中使用的抗体的标记。
作为凝集素阵列解析，优选的是：使生物素化的NPA凝集素与用链酶亲和素包被的固相结合，观察与用Cy3等标记的组织提取蛋白质的结合。
还可以使用酶作为标记物质，并使用与所用的酶相应的适当底物进行检测。例如，在使用过氧化物酶作为酶时，使用邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等作为底物；在使用碱性磷酸酶时，使用对硝基苯磷酸盐(PNPP)等。关于酶反应停止液、底物溶解液，可以根据所选择的酶适当选择使用现有公知的液体。
此外，就糖链的标记而言，还可以使用用2-氨基吡啶进行荧光标记的方法(PA化法)、用氚标签进行放射线标记的方法等。
＜凝集素阵列的制备＞
作为凝集素阵列，只要含有NPA凝集素则可以使用任意的凝集素阵列。例如，可以使用本发明人等开发的、在同一基板上固定有特异性不同的45种植物凝集素的凝集素阵列(Kuno等,Nature Methods 2,851-856,2005)、LecChipTM Ver.1.0(GlycotechnicaCorporation制)，可以适当地按照公知的方法来制备。
凝集素阵列中可以单独为NPA凝集素，但优选在支持体上固定多种其它凝集素。作为此时的其它凝集素，可以列举：LCA凝集素、ConA凝集素、HPA凝集素、DSA凝集素、PHAL凝集素、SNA凝集素、SSA凝集素、TJAI凝集素、PSLla凝集素、UDA凝集素、MAH凝集素、GNA凝集素、PWN凝集素、UEAI凝集素、MAL凝集素、Calsepa凝集素、ADL凝集素、ACG凝集素、PSA凝集素、AAL凝集素等。尤其优选含有LCA凝集素、ConA凝集素、HPA凝集素、DSA凝集素、SNA凝集素、SSA凝集素，特别优选LCA凝集素及ConA凝集素。
可以将NPA凝集素直接固定到支持体上(直接法)，但通过将NPA凝集素制成生物素化NPA、将该NPA凝集素固定到包被有链酶亲和素的支持体上的方式制备(间接法)，可以提高检测灵敏度、大幅促进本底的减少。
作为凝集素阵列的支持体，优选可透过渐消波的透明物质，通常使用有色玻璃、聚碳酸酯等合成树脂等。
＜向凝集素阵列的添加及洗涤＞
将用Cy-3等标记的组织提取蛋白质用缓冲液稀释或者不进行稀释，添加到凝集素阵列反应槽中使其相互作用后，将非特异性结合的夹杂物用凝集素阵列用缓冲液(有市售)洗涤。
＜检测方法＞
通常糖链与凝集素的结合比与抗体的结合弱，抗原抗体反应的结合常数为106～109M-1左右，而凝集素与糖链间的结合常数为104～107M-1。本发明中使用的NPA凝集素的情况下，虽然与肝细胞癌标志物的结合性强，但与通常的凝集素为同等程度，因此信号的检测中优选使用渐消波激发型荧光检测法来进行。渐消波激发型荧光检测法是指利用如下现象的方法：在于载玻片的端面(侧面)发生全反射的条件下使光入射时，在玻璃(固相)和水(液相)等折射率不同的二相的情况下，仅在从界面起数百nm左右的近场渗出被称为渐消波的射程距离极短的光(被称为近场光)。通过该方法，使荧光物质的激发光从端面入射，仅将存在于近场的荧光物质激发，并进行荧光观察。渐消波激发型荧光检测法在Kuno等,NatureMethods,2,851-856(2005)等中有记载。为了进行该检测，可以使用GlycoStationTM Reader1200(Glycotechnica Coporation)等。
此外，在作为另一方法的、使被标记的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体起作用的情况下也可以应用同样的检测方法。
＜评价方法＞
就利用凝集素阵列进行的评价而言，将固定在同一凝集素阵列基板上的信号不根据病变而变化的凝集素作为内部标准凝集素使用，将NPA信号相对值化后，通过判断是否超过某一截止值来进行。这种以某一凝集素的值为基准、将目的凝集素的信号相对值化并用于判别的方法是本发明人已发表的论文中的公知事实，可以参照该论文(Kuno A等,Clin Chem2011 Jan；57(1):48-56)。截止值的设定可以使用被标本化的多种肝细胞癌患者的肝组织标本事先进行。即，预先以从多种肝细胞癌患者摘出的肝组织的肝细胞癌部及非癌部为对象进行凝集素阵列解析，并基于所获得的上述相对值作出判别式。更优选作出多个与肝细胞癌的进展或恶性的程度相对应的判别式，判定被检试样的肝细胞癌的进展或恶性的程度，判定受试者是否罹患肝细胞癌，此外判定肝细胞癌的时期为哪种程度。
(3-3)凝集素-抗体夹心ELISA法
在以来自受试者的肝组织的组织碎片作为被检试样时，例如可以按照以下步骤进行夹心ELISA解析。
包括标记，被检试样的制备方法与(2-1)的凝集素阵列解析法相同。然后，例如使生物素化的NPA凝集素与用链酶亲和素包被的支持体结合，添加被Cy3标记的组织提取蛋白质，使其进行相互作用。然后，用缓冲液洗涤，或不进行洗涤而是将未反应的NPA凝集素封闭，用识别Cy3标记的抗体(抗Cy3/Cy5抗体)进行反应。
还可以应用以下的夹心法：不对被检组织提取蛋白质试样进行标记，而是使用被标记的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体，该被标记的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体是对可以识别、结合作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白的蛋白质部分(或糖链和蛋白质部分)的抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体进行了标记而成的。
此外，与凝集素阵列解析的情况同样地，优选在凝集素阵列中组合使用NPA凝集素以外的LCA凝集素、ConA凝集素、HPA凝集素、DSA凝集素等其它凝集素。
进而，可以制作将抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体固定在支持体上的抗体阵列来代替凝集素阵列。这种情况下，可以在叠加被检组织提取蛋白质试样后利用被标记的NPA凝集素进行检测。此时，还可以将被检组织提取蛋白质试样亲和素化，用被生物素化的NPA凝集素进行检测。
这些凝集素-抗体夹心ELISA法的结果还能够用于使用自动免疫检测装置的自动化。唯一必须要考虑的方面是夹心中使用的抗体与凝集素间的反应。抗体具有至少2条N结合型糖链。因此，在所使用的凝集素识别抗体上的糖链时，在夹心检测时产生起因于该结合反应的本底噪声。为了抑制该噪声信号的产生，想到了对抗体上的糖链部分导入修饰的方法、仅使用不含糖链部分的Fab的方法，这些可以使用公知的方法。作为对糖链部分的修饰方法，有例如Chen S等Nat Methods.4,437-44(2007)、Comunale MA等J Proteome Res.8,595-602(2009)等，作为使用Fab的方法，有例如Matsumoto H等Clin Chem Lab Med 48,505-512(2010)等。
＜肝细胞癌标志物的检测及判别法＞
ELISA法为公知的方法，按照通常步骤实施即可，可以应用最适合于各标记的测定装置。
就利用本法进行的肝细胞癌标志物的定量检测而言，可以使用与NPA结合的蛋白质作为标准物质制作标准曲线，换算为标准物质的相应量。例如如，实施例2(2-5)所示，可以使用作为NPA阳性CHO变异细胞的Lec1细胞的培养上清、细胞裂解物作为标准物质。向NPA阳性细胞中转导1个蛋白质基因并使其表达、大量制备，则可以作为更稳定的标准物质来使用。此外，作为不使用标准物质进行评价方法，可以模仿上述凝集素阵列法，使用信号不根据病变而变化的凝集素作为内部标准凝集素，将NPA信号相对值化后，通过判断是否超过某一截止值来进行。需要说明的是，内部标准凝集素的选择及截止值的设定可以使用被标本化的多种肝细胞癌患者的肝组织标本事先进行。即，可以预先以从多种肝细胞癌患者摘出的肝组织的肝细胞癌部及非癌部为对象进行凝集素阵列解析，根据该解析在统计学上事先设定内部标准。此外，预先以从多种肝细胞癌患者摘出的肝组织的肝细胞癌部及非癌部为对象进行ELISA测定而得到相对值，并基于上述相对值作出判别式。更优选作出多个与肝细胞癌的进展或恶性的程度相对应的判别式，判定被检试样的肝细胞癌的进展或恶性的程度，判定受试者是否罹患肝细胞癌，此外判定肝细胞癌的时期为哪种程度。
(3-4)利用组织染色进行的检测法
接着，成为本发明的肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白从组织染色等的结果来看为局限于肝细胞癌的细胞膜表面及癌细胞周边附近区域(TME)的免疫细胞膜的糖蛋白，因此也优选使用组织染色法。
即，将通过活组织检查等由受试者采集的肝组织的一部分切片，利用被标记的NPA凝集素进行NPA染色。或者，可以组合使用识别肝细胞癌标志物的抗体或其它凝集素，可以使用将这些抗体或凝集素覆盖的夹心法。
(3-5)被检血清试样中的肝细胞癌标志物的检测方法
在使用本发明的肝细胞癌的检测方法进行肝细胞癌的早期检测时，作为用于检测肝细胞癌的被检试样，可以将受试者的血清等体液作为被检试样。特别是在为血清时，由于可以实现受试者的负担轻、检查时间也缩短而最为优选。利用本发明的检测方法，可以检测被检试样中的肝细胞癌标志物，早期检测、判别肝脏中原发的肝细胞癌。
在被检试样为血清等体液时，与组织试样时同样地也可以应用凝集素阵列解析法及ELISA解析法。特别优选应用以下记载的夹心法。
夹心法中，优选与NPA凝集素一起使用与NPA凝集素结合性糖蛋白的蛋白质部分特异性结合的物质，作为这样的与蛋白质部分结合的物质，优选使用上述抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体。
作为具体的方法，可以将该抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体在支持体上固相化，以夹心形式准备作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白，在覆盖被检试样后，通过被标记的NPA凝集素进行检测。
作为另一方法，作为将抗体固定在支持体上的替代方案，在将包含NPA凝集素的多种凝集素在支持体上固相化而成的反应场上，对于呈递、覆盖了作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白的被检试样，使被标记的该抗体起作用而进行检测。
在将包含NPA凝集素的多种凝集素在支持体上固相化、呈递NPA凝集素结合性糖蛋白、用被标记的该抗体进行检测的方法中，可以将NPA凝集素直接固定在支持体上而进行(直接法)；作为该方法的改良法，通过将NPA凝集素制成生物素化NPA、将该NPA凝集素固定在包被有链酶亲和素的支持体上的方式进行制备(间接法)，可以提高检测灵敏度和大幅促进本底的减少。
在本发明的NPA凝集素结合性糖蛋白的测定中使用夹心法时，在该测定中，可以使用ELISA、免疫色谱、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA法)、化学发光免疫测定、渐消波分析法等。这些方法对于本领域技术人员是公知的，可以选择任一种方法。此外，这些方法可以按照常规步骤实施，实际的反应条件的设定等在本领域技术人员通常可以实现的技术范围内。这些中，特别优选分别使用抗体及凝集素作为作为蛋白质结合物质及糖链结合物质的凝集素·抗体夹心ELISA。关于凝集素-抗体夹心ELISA的具体步骤，与上述(3-3)中所述步骤相同。
此外，为了提高利用凝集素与抗体的组合进行的夹心ELISA测定体系的灵敏度，还可以应用使用化学发光的检测体系(化学发光酶免疫测定法，Chemiluminescent EnzymeImmunoassay；CLEIA法)。
被检血清(体液)试样中的NPA凝集素结合性糖蛋白与作为捕获剂使用的支持体上的NPA凝集素或抗NPA凝集素结合性糖蛋白抗体形成复合体。通过测定对该复合体应用作为检测剂的被标记的NPA凝集素或被标记的抗体所产生的信号，从而对被检试样中的NPA凝集素结合性糖蛋白进行检测·定量。就信号的测定而言，根据所使用的标记物质使用适当的测定装置进行即可。
(3-6)多级凝集素利用法
如(3-5)中所述，作为用于使用本发明的肝细胞癌标志物调查受试者是否罹患肝细胞癌等的被检试样，最优选血清试样。
但是，血清中通常存在大量的多种多样的糖蛋白，可以预想，癌细胞所分泌的血液中的NPA结合蛋白质远远少于其它血中蛋白质。此外，已经通过实验证实，血中原本就存在大量的与NPA结合的蛋白质。
因此，本发明中，作为用于进一步有效地由血清试样检测成为肝细胞癌标志物的NPA结合蛋白质的方法，研究了利用对NPA的结合性以外的凝集素反应性、即对α2,6唾液酸的非结合性的多级凝集素利用法(Tan等,Molecular BioSystems 2014)。
结果阐明：血清中大量存在的与NPA结合的糖蛋白中的大部分大多同时也具有α2,6唾液酸。即，预先通过α2,6唾液酸结合性凝集素(SNA、SSA、TJAI或PSLla)除去血清中的具有α2,6唾液酸的大量的糖蛋白，从而可以有效地将NPA结合性蛋白质浓缩，可以提高肝细胞癌标志物的检测效率。
例如，可以包罗性地对血清试样中的蛋白质进行Cy3标记，与预先结合了包被有链酶亲和素的磁珠的α2,6唾液酸结合性凝集素的生物素化物反应，取得未结合的残渣溶液并供于凝集素阵列。
实施例
以下示出实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些例子限定。
本发明中的其他术语、概念基于该领域中惯常使用的术语的意义，用于实施本发明而使用的各种技术除了特别示出出处的技术以外，本领域技术人员可以基于公知的文献等容易且准确地实施。此外，各种分析等基于所使用的分析设备或试剂、试剂盒的操作说明书、产品手册等中记载的方法来进行。
需要说明的是，本说明书中引用的技术文献、专利公报及专利申请说明书中的记载内容作为本发明的记载内容而加以参照。
(实施例1)组织的凝集素阵列解析
本研究中使用的凝集素微阵列是在同一基板上固定有特异性不同的45种植物凝集素、对与成为分析对象的糖蛋白上的糖链的相互作用(结合性)同步进行解析的系统(Kuno等,Nature Methods 2,851-856,2005)。使用该系统，尝试筛选在以肝细胞癌组织为对象的定量测定体系中形成显著的信号高值的凝集素，或在组织染色中可以特异性将癌部染色的最佳凝集素。本实验中使用福尔马林固定石蜡包埋肝细胞癌患者肝组织。通过激光显微解剖(LMD)分别将癌部及非肿瘤性肝实质(非癌部)的一定区域制成组织碎片并回收，然后进行蛋白质提取，在荧光标记后进行凝集素阵列解析。其基本方案按照松田等(Biochem.Biophys.Res.Commun.370,259-263,2008)。具体方法如下所示。
(1-1)由组织切片回收蛋白质
来自组织切片的组织碎片的回收中使用了LMD系统，6000DM(Leica Microsystems)。就LMD用福尔马林固定组织标本而言，在作为LMD用载玻片的覆膜玻璃(PEN-membrane,LeicaMicrosystems)上设置切成5μm厚度的切片而制作。需要说明的是，本实验中使用了肝细胞癌患者的组织标本，标本已经在全部实施设施中得到伦理委员会的认可。按照实施设施的常规方法将组织切片用苏木精进行核染色而可视化。将利用显微镜确认的各样品的癌区域(相当于约1×1mm，参照图1)切出，将其组织片段回收到0.6mL管中。就获得的组织碎片而言，首先，为了利用福尔马林将分子内及分子间交联解离，加入10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)200μL，离心(20,000g，1分钟，4℃)，确认组织切片存在于缓冲液中后，在95℃处理60分钟。热处理后，在20,000×g、1分钟、4℃下离心分离，除去上清后，加入50％浆状的AVICEL悬浮溶液(将Sigma Coporation制的AVICEL用MilliQ水悬浮并制备成规定浓度的产物)4μL，轻轻叩击。离心(20,000×g，1分钟，4℃)后除去上清190uL，然后在残留的含有组织片段的颗粒中加入PBS(-)缓冲液190μL(缓冲液交换工序)。进而在20,000×g、1分钟、4℃下离心后除去上清，在颗粒中加入1.0％NP40-PBS缓冲液10μL(NP40的终浓度达到0.5％)。将颗粒用超声波破碎而细粒化后，在冰上反应60分钟，使膜蛋白质可溶化。反应后，在20,000×g、1分、4℃下离心，回收上清作为组织提取蛋白质。
(1-2)蛋白质的荧光标记
将回收的全部组织提取蛋白质溶液添加到预先在PCR管中各分装了10μg的Cy3-SE(GEHEALTHCARE制)中。在室温、暗处反应1小时后，为了使剩余Cy3-SE的活性基团失活而添加含有甘氨酸的缓冲液80μL，在室温、暗处反应2小时。将获得的溶液作为来自荧光标记组织切片的蛋白质溶液。
(1-3)凝集素阵列解析
来自荧光标记组织切片的蛋白质溶液用凝集素阵列用缓冲液稀释2倍或4倍，分别向凝集素阵列的各反应槽中添加60μL。作为凝集素阵列，使用LecChipTM Ver.1.0(Glycotechnica Corporation制)。在20℃下使其相互作用反应一晚后，将各反应槽用凝集素阵列用缓冲液洗涤3次，按照常规方法进行扫描。需要说明的是，以上的分析中未获得信号时，将上述来自荧光标记组织切片的蛋白质溶液不进行稀释直接添加到凝集素阵列并进行分析。就获得的扫描数据而言，按照常规方法将信号作为净强度(Net Intensity)并数值化，为了此后的统计解析而按照久野等(J Proteom Bioinform 1,68-72(2008))的方法标准化。
(1-4)统计解析
标准化的全部数据用于癌部(中分化)和非癌部的2组的比较检验中。各数据使用与各凝集素存在对应的2组比较检验、即Wilcoxon符号秩检验进行差异显著性检验，并用于选定在癌部中显示显著的信号上升的凝集素。
(1-5)HCV感染肝细胞癌患者的肝组织标本的比较解析结果
将从丙型肝炎患者的肝细胞癌发病例通过外科手术摘出的肝组织块中，根据HE染色组织的组织学诊断限定含有不同的多种分化型的癌的类型(称为结节内结节型)，将必定含有中分化型肝细胞癌的23例用于实验。用LMD中按照总面积达到1mm2的方式切出被分类为中分化型肝细胞癌的区域、其以外的分化型(高分化或低分化型)的癌部、及非癌部(图1)。通过凝集素阵列解析取得69个数据，使用其中的分化型肝癌部位和非癌部各23个数据进行2组比较检验。其结果如图2所示，8种凝集素显示出统计学上的显著性差异(P<0.05)。特别是NPA、DSA，可确认与非癌部相比，信号在癌部显著增加(P=0.0002)。颇具意味的是，分类为岩藻糖识别凝集素的4种凝集素(LCA、PSA、AOL、AAL)在癌部全部显示为显著低的值。
(1-6)非HCV、非HBV感染肝细胞癌患者的肝组织标本的比较糖链解析结果
为了证明上述结果不是由于肝的纤维化进展、功能降低，而是由于癌的发生而带来的，使用均无HBV和HCV感染经历的8名肝细胞癌患者的肝组织标本进行了同样的实验。由于病例数少，仅将各病例的各1个位置用于分析时难以显示出统计学上的显著性差异，因此从各标本的多种癌部及非癌部区域(癌部19个、非癌部20个)各切出1mm2用于以后的实验。因此，在统计解析中，使用了作为无对应的非参数检验的Mann-Whitney U-检验。其结果如图3所示，显示出P<0.05的显著性差异的凝集素为14种，其中，NPA在癌部显示出显著高的值(P＝0.0002)，ConA显示为低值(P＝0.0002)。
(1-7)NPA结合性糖链表位
如上所述，只有NPA在2个实验中同样地在癌部显示为显著高的值。对该凝集素的糖结合特异性进行了讨论。图4中，利用可以系统地阅览凝集素的亲和性的数据库LfDB(http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearch)，对数据库中登录的糖链中的、与NPA结合的前10位的糖链进行了记载。需要说明的是，就ConA的糖结合特异性解析而言，由于在LfDB中没有公开，因此从有明确记载的文献(Ohyama Y等J Biol Chem 1985Jun 10；260(11):6882-7)中引用。
对于作为显示作为NPA的特异性的一部分的核心岩藻糖结合性的凝集素的代表的LCA所结合的前10位的糖链，也一起记载在文献中。此次的结果中，NPA与LCA在癌部及非癌部间的信号差异为正和负，是完全不同的。因此，NPA在癌部为高值则表明不是由与核心岩藻糖的结合引起的。进而，根据非B、非C病例的实验结果，显示NPA与ConA呈负相关，因此还表明不是由与甘露糖单元数超过5的高甘露糖型糖链的结合引起的。
(实施例2)基于夹心ELISA法的肝细胞癌培养细胞及肝癌患者组织的NPA凝集素反 应性研究
研究了使用预先通过凝集素阵列确认了对NPA的反应性的7种肝细胞癌培养细胞株(HuH-7、HepG2、KYN-1、KYN-2、HAK-1A、HAK-1B、HLF)及肝癌患者组织是否可以构建图5b所示的夹心ELISA体系。需要说明的是，由培养细胞提取蛋白质至荧光标记的基本方案按照馆野等或丰田等的方法(Methods Enzymol 478,181-195,2010,Genes Cells 16,1-11,2011)来进行。需要说明的是，由组织标本制备样品按照实施例1来进行。
(2-1)从培养细胞提取蛋白质
将肝癌培养细胞株分别调整为每个1.5mL管中为2×106个。形成颗粒后，将剩余的培养基成分·血清成分用PBS(-)1mL洗涤3次而除去。本实验中，为了配合从组织切片提取蛋白质的方法，在颗粒中加入10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)200μL，在95℃处理90分钟。热处理后，在20,000×g、5分钟、4℃下进行离心分离，除去上清。在残留的细胞颗粒中加入PBS(-)200μL(缓冲液交换工序)。进而，在20,000×g、5分、4℃下进行离心后，除去上清，在颗粒中加入0.5％NP40-PBS 40μL。将颗粒通过超声波破碎而细粒化后，在冰上反应60分钟，使膜蛋白质可溶化。反应后，在20,000×g、5分钟、4℃下进行离心，回收上清作为组织提取蛋白质。
(2-2)蛋白质的荧光标记
对于所制备的细胞提取蛋白质溶液，首先对各培养细胞蛋白质提取溶液用BCA法测定蛋白质浓度。BCA测定使用MicroBCA试剂盒(Thermo Corporation制)按照附带的操作规程进行测定。确定蛋白质的量后，在预先在PCR管中各分装了10μg的Cy3-SE(GE HEALTHCARE制)中添加各细胞株提取蛋白质200ng。在室温、暗处进行1小时的化学反应后，为了使反应完全终止而添加含有甘氨酸的缓冲液180μL，在室温、暗处反应2小时。将获得的溶液作为来自荧光标记组织切片的蛋白质溶液。
(2-3)NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA
将微量滴定板(链酶亲和素包被96孔板(NUNC immobilizer)预先用洗涤液(含有0.1％Tween20的PBS)洗涤2次，向其中在各孔中加入各50μL的溶解于PBS缓冲液的生物素化NPL(Vector Laboratories Corporation制，5μg/mL)，在4℃下保温一晩，将NPL固定到支持体上。将未结合的WFA用洗涤液各洗涤2次，制成NPL固定孔板。然后，将Cy3标记的蛋白质溶液用洗涤液调整为50μL，向NPL固定化孔中添加后，在37℃下进行1小时的结合反应。反应后，在各孔中加入封闭剂(调整为0.5mg/mL的脱唾液酸胎球蛋白溶液)4μL，在37℃下反应15分钟，从而将未反应的NPL凝集素封闭。用洗涤液洗涤5次而除去未结合的蛋白质后，将预先用洗涤液调整为0.125μg/mL的检测剂(抗Cy3/Cy5抗体，Sigma-Aldrich Coporation)在每个孔中加入各50μL，在37℃下进行30分钟的抗原抗体反应。为了除去未结合的抗体，用洗涤液洗涤5次后，将用洗涤液稀释10,000倍的抗小鼠IgG抗体-HRP溶液(Vector LaboratoriesCoporation制)在每个孔中加入各50μL，在37℃下保温20分钟。将各孔用洗涤液洗涤5次后，将作为显色试剂的1-StepTM ULTRA TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Coporation制)在各孔中加入各100μL，在室温下进行30分钟的显色反应。将1M的H2SO4溶液在每个孔中加入100μL使反应停止，用酶标仪(SpectraMax M5,Molecular Devices Coporation)测定450nm处的吸光度。需要说明的是，板的洗涤是用板清洗器(ImmunoWashTM 1575微孔板清洗器,Bio-Rad Laboratories Coporation)将洗涤液在各孔中加入300μL而实施的。
(2-4)使用细胞的夹心ELISA
对由7种肝细胞癌培养细胞株(HuH-7、HepG2、KYN-1、KYN-2、HAK-1A、HAK-1B、HLF)分别制备的细胞裂解物中的、以蛋白质量计200ng的裂解物赋予Cy-3标签，将其中的相当于500pg的裂解液用50微升稀释液稀释后添加到孔中。需要说明的是，ELISA中，为了提高通用性，通过显色而不是通过荧光来进行检测。其结果是，用各细胞株获得了图5b所示的数值。为了调查凝集素阵列解析中的NPA信号与本实验的结果之间是否相关，使用剩余的Cy3标记蛋白质溶液进行了凝集素阵列解析。将其结果示于图5a。对NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA的测定值与凝集素阵列的NPA信号的强度进行比较，可知细胞间的相对的强度差的倾向是类似的。以上表明：在实施例1那样的、利用凝集素阵列对肝细胞癌患者的肝组织裂解物的癌部·非癌部进行的比较解析中确认到显著性差异的NPA信号的倾向，可以通过更简易的NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA测定来再现。然后，作为其验证实验，使用实施例1的凝集素阵列解析中所用的组织裂解物进行本实验。
(2-5)使用组织的夹心ELISA
在实施例1已经赋予Cy3标签的组织裂解物的23个病例中，从存在的剩余液量足够进行NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA测定的病例中随机选择9例，使用来自癌部及非癌部的裂解物的Cy3标签样品(计18个样品)进行NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA。将赋予了Cy3标签的组织裂解物10μL用洗涤液调整为50μL并添加到各孔中。需要说明的是，将作为NPA阳性细胞的CHO细胞变异株(Lec1)的细胞提取液作为标准糖蛋白溶液使用，在与样品相同的时机，对2倍稀释系列进行NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA，由此制作标准曲线。各样品的测定值以由该标准曲线换算的标准蛋白质量的换算值形式来求出，进行比较解析。将其结果示于图6。在NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA中，癌部也显示出显著高的值(P＝0.0091)。需要说明的是，P值通过Wilcoxon符号秩检验来求出。
(实施例3)利用组织染色进行的NPA染色性的研究
(3-1)组织染色方法
从实施例1发现，利用NPA进行组织染色可能也可以检测组织切片中的肝细胞癌。为了通过组织染色来检验作为凝集素阵列的结果所获得的信号强度的差，使用进行实施例1时预先从肝细胞癌患者的肝组织连续切出的标本，按照以下方式进行研究。NPA染色中使用的组织标本由九州大学大学院消化器官·综合外科所收集的包含背景肝疾病的肝癌病变的福尔马林固定石蜡包埋块制作。将连续切出的5μm厚度的组织切片脱石蜡后，用REALRetrieval Solution pH6.0(Dako Coporation)在110℃处理10分钟，进行组织切片的活化。然后，将用Carbo-Free Blocking Solution(Vector Coporation)在20℃进行30分钟的封闭处理、在PBS中洗涤3次后用10mM HEPES稀释为5μg/mL的生物素标记NPL(VectorCoporation)添加到组织切片上，在4℃下反应一晩。反应后，在PBS中洗涤3次，与用PBS稀释成20μg/mL的Alexa 488标记链酶亲和素(Life Technologies Coporation)在20℃下反应60分钟。反应后，在PBS中洗涤3次，与hoechst33342(Life Technologies Coporation)在20℃下反应20分钟，对核进行染色。NPA的特异性信号使用荧光显微镜(KEYENCE Coporation)来检测。
(3-2)染色结果
将以低倍率(宽视野)观察1个染色例的图像示于图7。在使用NPA凝集素的荧光染色像中，乍一看时癌部及非癌部似乎被同样染色。该倾向在利用DAB染色的其他实验中也可观察到，甚至在DAB染色中，与癌部相比，结果反倒是非癌部显示相对强的染色性。
将用高倍率(窄视野)观察同样的荧光染色标本的图像示于图8。需要说明的是，所观察的位置相当于在凝集素阵列解析时通过LMD切出的部位。依然是癌部·非癌部中均存在发出荧光的部位，但颇具意味的是，发现其染色图案及强度在癌部和非癌部存在大的差异。即，在非癌部，肝实质细胞同样显示弱染色性且颗粒状的染色物被包封在细胞中。与此相对地，在癌部中，反而是细胞的与膜相当的部分和位于细胞周边的间质的部分显示粒状的染色且其染色强度相对强。与此相对地，利用LCA凝集素得到的染色像与利用NPA染色得到的染色像的图案差异大，非癌部的癌周边区域显示强染色性。这再现了凝集素阵列的结果。
(实施例4)使用来自肝细胞癌患者组织的追加实验
为了显示此前的实施例中所进行的实验的妥当性，使用来自与实施例1～3不同的肝细胞癌患者的组织进行追加实验。将来自从九州大学大学院消化器官·综合外科获得的得到伦理委员会认可的肝细胞癌患者的福尔马林固定石蜡包埋肝细胞癌组织标本的7个病例制成薄的切片，贴于激光显微解剖(LMD)用载玻片。对癌部及非癌部分别切出各49个1毫米见方的区域(总计98个样品)，通过与实施例1(1-1)同样的方法制作组织裂解物，分别应用与实施例1(1-3)的凝集素阵列解析及实施例2(2-5)的NPA凝集素-抗Cy3抗体夹心ELISA解析同样的方法(图9)。
其结果是，在凝集素阵列解析、夹心ELISA解析任一者中，与非癌部
相比，在癌部中均显示显著高的值(p＜0.01)。
(实施例5)对来自肝细胞癌的NPA结合蛋白质特征性的其它凝集素反应性的研究
由癌细胞分泌的、血液中含有大量的各种血中蛋白质，因此可以预想，即使是来自肝细胞癌患者的血清，NPA结合蛋白质的存在量远远少于其它血中蛋白质。此外，已经通过实验证实，血中原本就存在与NPA结合的蛋白质。可以预想，这些将成为以血清试样作为本发明的肝细胞癌标志物的检测用试样时的较大噪声的原因，因此有必要预先尽可能地除去与肝细胞癌没有相关性的NPA结合性蛋白质。
因此，本实施例中，为了研究是否能够通过与NPA凝集素的结合性以外的与凝集素的反应性来说明被分泌到来自肝细胞癌患者的血清中的血中蛋白质的特征，考虑以Tan等(Molecular BioSystems 2014)的方法为参考，来实施应用凝集素阵列的多级凝集素利用法。
具体而言，使由实施例2中使用的7种肝癌培养细胞株的培养上清制备的Cy3标记分泌蛋白质、以及实施例2(2-5)中取得的Cy3标记组织蛋白质溶液，分别与预先结合于链酶包被磁珠(Veritastk Coporation制)的NPA(所选择的凝集素)的生物素化物(VectorCoporation制)反应。NPA结合性组织蛋白质通过磁体进行回收，将残渣溶液供于凝集素阵列。作为对照，使用不含凝集素的磁珠也进行同样的实验。扫描后，通过数值解析提取NPA结合蛋白质的特征。
实施例2中使用的7种培养细胞株根据AFP(甲胎蛋白)的生产率的差异而可以大致分为AFP生产株和AFP非生产株。根据各凝集素阵列解析发现，在AFP产生株和非产生株之间，对唾液酸的反应性有显著不同，AFP生产株对α2,6唾液酸识别凝集素的反应性相对高(图10)。另一方面，与实施例2的实验结果同样地，NPA在全部的细胞株中均显示强反应性。
然后，通过多级凝集素利用法，使NPA结合性糖蛋白组吸附于珠子，将作为非吸附组分的上清(流过(Through)组分)供于凝集素阵列，取得数据后，根据与原数据(投入，Input)的差值取得NPA结合糖蛋白组的凝集素阵列谱(投入减去流过(Input-Through))。如上所述，AFP生产株中，α2,6唾液酸识别凝集素组的信号的比例相对高，但对NPA结合糖蛋白组中的α2,6唾液酸识别凝集素组的信号的比例进行调查(图11的中的Input-Through)，结果是比例大幅降低，与AFP非生产株为同等程度。即，阐明了作为来自全部的肝细胞癌的细胞的共同特征，是存在不显示与α2,6唾液酸识别凝集素结合性的NPA结合糖蛋白。该倾向与使用Cy3标记组织蛋白质溶液的实验也是一致的。
该对α2,6唾液酸识别凝集素的非结合性特征表明，对存在于血中的来自肝细胞癌的NPA结合糖蛋白的富集有效。即，如上所述，血液中原本就存在大量与NPA结合的糖蛋白，在健康人和癌患者之间几乎没有显著性差异。此外，通过实验获知，其大部分对α2,6唾液酸识别凝集素显示结合性。而根据此次的实验结果，来自肝细胞癌的细胞同样地分泌不被α2,6唾液酸识别的NPA结合糖蛋白。从而可以推测，首先将被检血清供于α2,6唾液酸识别凝集素柱，将α2,6唾液酸识别凝集素结合蛋白质吸附除去，以非吸附组分为对象解析NPA结合糖蛋白，可以容易地捕获来自肝细胞癌的NPA结合蛋白质。
(实施例6)基于多级凝集素利用法的非B、非C原发性肝癌患者血清中NPA结合蛋白 质的富集
如实施例5所述，健康人血清中存在大量与NPA结合的糖蛋白。但是获知其几乎也都与α2,6唾液酸识别凝集素结合。因此，研究了在基于多级凝集素利用法从血清中吸附排除α2,6唾液酸含有糖蛋白后，利用NPA回收的蛋白质组在健康人和癌患者之间是否产生显著的质的差异。肝癌大多是病毒感染者，这种情况下，背景肝已发生纤维化，受其影响而存在糖链变化，因此担心即使在与健康人的比较中产生了差异，也难以判断是由于癌引起的还是由于背景肝的差异(纤维化的进展度的差异)而引起的，因此决定使用无HBV及HCV的病史的(非B、非C)原发性肝癌患者血清进行实验。
使用SSA凝集素(J-OIL MILLS Coporation制)作为α2,6唾液酸识别凝集素制作SSA固定化珠子，进行SSA结合反应。首先，在1.5ml微管中分注洗涤过的SA珠子10ul，向其中加入各10ul的凝集素溶液(含有作为α2,6唾液酸识别凝集素的SSA的生物素化物1ug)后，在4℃下混合反应30分钟。使珠子吸附于磁体后，除去上清(将该上清作为Through 1)，将残存珠子用含有1％Triton X-100的PBS(PBSTx)洗涤3次。向其中加入Cy3标记后的血清蛋白质溶液10μl(以血清计相当于0.001μl)，在4℃下混合反应一晩。使珠子吸附于磁体后，将上清作为SSA非吸附组分回收到新管中(将其作为Through 2)，在以后的NPA结合反应中使用。需要说明的是，残存珠子在用PBSTx洗涤3次后，加入含有0.2％SDS的PBS 10ul并混合后，在95℃加热处理5分钟，冷却后，使珠子吸附于磁体，将上清回收作为SSA吸附组分(将该上清作为Elution 1)。
为了进行NPA结合反应，首先在1.5ml微管中分注各10μl洗涤过的SA珠子，向其中加入各10μl的凝集素溶液(含有生物素化NPA 1ug)，在4℃下混合反应30分钟。使珠子吸附于磁体，除去上清(将该上清作为Through 3)，将残存珠子用PBSTx洗涤3次。向其中加入SSA非吸附组分(Through 2)，在4℃下混合反应一晩。反应后，将上清作为SSA-NPA非吸附组分回收到新管中(将其作为Through 4)。将残存珠子用PBSTx洗涤3次后，加入含有0.2％SDS的PBS10μl，混合后，在95℃下加热处理5分钟。冷却后，使珠子吸附于磁体，回收上清(该将上清作为Elution 2)。向其中加入洗涤过的SA珠子10μl，在4℃下混合反应30分钟。反应后，将上清作为SSA-NPA非吸附组分回收到新管中(将其作为Elution 3)。
使用健康人血清和非B、非C原发性肝癌患者血清进行以上的实验，对各组分进行凝集素阵列解析。将分级前血清和SSA非吸附-NPA吸附组分的扫描数据示于图12。
其结果是，就分级前的血清而言，在癌患者和健康人的血清之间谱图没有大的差异，NPA的信号也没有显著性差异。这支持来自癌的糖蛋白在血中仅微量存在。而就SSA非吸附-NPA吸附组分而言，发现在包含NPA的多种凝集素中，癌患者血清中的信号显著增强。这意味着该组分中存在来自原癌变的分泌糖蛋白。
(实施例7)基于糖蛋白组学(IGOT-LC/MS法)的肝细胞癌标志物候选糖蛋白的鉴定
该实施例中，将本发明人们以前开发的基于Lec-IGOT-LC/MS法(日本专利第4220257号等)的糖链肽鉴定方法应用于肝细胞癌培养株培养上清及来自肝细胞癌患者病理组织的糖蛋白试样，来鉴定成为肝细胞癌标志物候选物的糖蛋白。
(7-1)利用IGOT法从来自人肝细胞癌培养株的试样制备标记肽
将实施例2中使用的肝细胞癌培养株中的HLF株、HAK1A株这2种分别用含有10％FBS的培养基培养后，吸出培养液废弃，重新加入无血清培养基，洗涤4次后，添加该无血清培养基，培养48小时。收集培养上清进行3100rpm×30分钟的离心后，回收上清。残留细胞颗粒也用于解析，因而保存。上清在用截止分子量3K的超滤膜浓缩为30倍并用0.45μm过滤器过滤后，用丙酮沉淀法将蛋白质沉淀。回收沉淀物后，进行短时间的减压除去丙酮，获得培养基蛋白质浓缩物(沉淀)。
将获得的培养基蛋白质浓缩物(沉淀)及细胞通过常规方法用胍溶液可溶化，通过高速离心分离回收上清(提取液)。通过氮气除去溶解氧后，将与蛋白质重量等量的二硫苏糖醇(DTT)以粉末或溶解于少量的可溶化缓冲液后加入。
在氮气存在下，为了将二硫键还原而在室温下反应1～2小时。然后，为了S-烷基化而加入为蛋白质重量的2.5倍的碘乙酰胺，在遮光下、室温下反应液1～2小时。反应后，用50～100倍量的缓冲液进行透析，除去变性剂(盐酸胍)、过剩的试剂。进行蛋白质定量后，加入为蛋白质量的1/100～1/50重量的胰蛋白酶和1/100～1/200重量的赖氨酰肽链内切酶(LysylEndopeptidase)，在37℃消化过夜(约16小时)。加入终浓度5mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，使反应停止。将该消化物供于使用Amide80柱的亲水性相互作用色谱，捕获糖肽组分。
用缓冲液(50mM Tris盐酸缓冲液，pH7.5)稀释后，添加到用该缓冲液进行了平衡的NPA-琼脂糖柱中，洗涤后，用含有0.2M甲基甘露糖苷的该缓冲液洗脱。糖肽组分供于ODS柱而除去洗脱糖和盐。将用70％乙腈(0.1％TFA)洗脱的组分作为试样糖肽(NPA(+))。将其干燥后，加入用稳定同位素氧-18标记的水(H2 18O)和肽-N-糖苷酶F将糖链切除、标记糖链连接部位，制备来自培养株的标记肽试样。
(7-2)由来自人肝细胞癌患者的组织试样制备标记肽
将实施例4中使用的来自肝细胞癌患者的福尔马林固定石蜡包埋肝细胞癌组织中的1个切成5μm厚度，贴在激光显微解剖(LMD)用载玻片上，在显微镜下，通过LMD将癌部、非癌部切出多个各约1.8mm2的部分。
将癌部中的3个在PTS缓冲液(含有0.1M Tris盐酸缓冲液pH9.0、12mM脱氧胆酸和12mMN-月桂酰肌氨酸钠)中膨胀，超声波处理后在100℃加热1小时。将其在氮气氛下用二硫苏糖醇(DTT)还原后，用碘乙酰胺烷基化。用50mM碳酸氢铵缓冲液pH8.6稀释后，用胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶在37℃消化过夜(18小时)。在其中加入1mM PMSF使反应停止。在其中加入等体积的乙酸乙酯，将表面活性剂萃取到有机相中并除去，回收下层的肽。将其供于使用Amide80柱(TOSOH)的亲水性相互作用色谱，捕获糖肽。将其用缓冲液(50mM Tris盐酸缓冲液，pH7.5)稀释，在其中加入NPA-固定化琼脂糖凝胶，在室温下反应30分钟。通过离心回收上清后，将珠子用该缓冲液洗涤，除去未反应物。将珠子干燥后，加入用稳定同位素氧-18标记的水(H2 18O)、和肽-N-糖苷酶F，将糖链切除、标记糖链连接部位，制备来自患者组织的标记肽试样。
(7-3)标记肽的LC/MS鸟枪法分析
将(7-1)及(7-2)中获得的来自培养株及来自患者组织的标记肽试样用0.1％甲酸稀释，进行LC/MS shotgun分析。注入的候选糖肽暂时被捕获到脱盐用捕获柱(反相C18硅胶系的载体)上，洗涤后，使用填充有相同树脂的呈喷嘴(spray chip)形状的无塞(fritless)微柱(内径150μm×50-100mm)，通过乙腈的浓度梯度法进行分离。洗脱液通过电喷雾接口而离子化并直接导入质谱器中。质谱是在数据依赖模式下选择最多10个离子同时进行基于碰撞诱导解离(CID)的串联质谱分析。
(7-4)基于MS/MS-离子检索法的候选糖肽的检索及鉴定
将获得的数千个MS/MS谱数据文件用Proteome Discoverer(Thermo ScientificCoporation的软件)变换为Mascot-通用文件(mgf)。以该数据为基础，使用蛋白质氨基酸序列数据库用MS/MS离子检索法鉴定候选糖肽。
以鉴定的肽中存在N结合型糖链连接的共有序列、存在其个数以下的Asn修饰(变换为Asp，及18O的引入)等为指标信息鉴定确认处理，获得肝细胞癌鉴别标志物糖肽候选物。
(7-5)
基于这些肝细胞癌鉴别标志物糖肽候选物的“肽序列”，由氨基酸序列数据库NCBI-Refseq与全长的糖蛋白的氨基酸序列进行对应。对这些糖蛋白中此前已经确认在肝细胞癌细胞中表达量高的8种糖蛋白(EGFR、FN1、FBN1、HYOU1、CFH、PSAP、CTSD及LAMP-2)，进一步研究是否可成为肝细胞癌标志物候选物。
(实施例8)成为肝细胞癌标志物候选物的糖蛋白的检验(用培养细胞株的细胞提 取物的NPA结合组分的蛋白质印迹解析)
本实施例对(实施例7)选出的肝细胞癌标志物候选糖蛋白分子组进一步检验显著性，使用肝细胞癌细胞株的细胞提取物来确认在肝细胞癌细胞株中以NPA结合性糖蛋白形式进行表达。
(8-1)基于凝集素亲和性的被检试样的分级
从实施例2中使用的肝细胞癌细胞株中的Huh7、HAK 1A及HLF细胞株，按照实施例2记载的方法获得细胞提取物，将生物素化NPA(Vector Coporation制)1μg加入到悬浮于含有1％TritonX-100的PBS(PBSTx)的链酶亲和素固定磁珠(Invitrogen Coporation制)10μL中，在4℃下混合反应30分钟，将生物素化NPA固定到磁珠。使珠子吸附于磁体后，除去上清，将珠子用PBSTx 200μL洗涤3次。洗涤后，将以蛋白质总量计10μg的各样品用PBSTx调整为100μL，向其中加入上述珠子，在4℃下混合反应一晩。使珠子吸附于磁体后，除去上清，对珠子加入含有0.2％SDS的PBS 10μL，在95℃下热处理10分钟，从而将吸附物洗脱。冰冷却1分钟后，将上清10μL转移到新管中，加入相当于20μL的链酶亲和素珠子，用PBSTx调整为20μL，在4℃下混合反应1小时，从而将剩余的生物素化NPA除去。反应后回收上清(20μL)，作为NPA结合蛋白质洗脱组分。
(8-2)基于来自肝细胞癌的细胞株蛋白质印迹法的肝细胞癌标志物分子的检测
将获得的NPA结合蛋白质洗脱组分在SDS-PAGE还原条件下用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并转印至PVDF膜。用含有5％脱脂奶粉的PBS封闭后，使用抗HYOU1抗体(R&DCoporation制)、抗EGFR抗体(Cell Sibnaling Coporation制)、抗PSAP抗体(Proteintechgroup Coporation制)、抗CTSD抗体(Life Span Coporation制)及抗LAMP-2抗体(SantaCruz抗体)，基于HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2糖蛋白分子的蛋白质印迹法进行检测。蛋白质印迹法按照常规方法进行，与上述各第一抗体在室温下反应1小时。洗涤PVDF膜后，与抗山羊IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch Coporation制)等市售的第二抗体(0.5μg/mL)在室温下反应1小时。洗涤这些PVDF膜后，用蛋白质印迹检测试剂(Perkin ElmerCoporation)通过化学发光进行检测。
(结果)
将结果示于图13。从任一来自肝细胞癌的细胞株的NPA结合组分中均检测了各标志物分子。由此表明：可证明本发明的HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及LAMP-2糖蛋白任一者均在肝细胞癌中表达并且证明为具有NPA结合性糖链的分子。
(实施例9)成为肝细胞癌标志物候选物的糖蛋白的检验(用培养细胞株的培养上 清的NPA结合组分的蛋白质印迹解析)
本实施例对(实施例7)选出的肝细胞癌标志物候选糖蛋白分子组中的CFH、FN、PSAP、CTSD及LAMP-2糖蛋白进一步检验显著性，使用肝细胞癌细胞株的培养上清来确认在肝细胞癌细胞株中以NPA结合性糖蛋白形式进行表达。
对实施例2中使用的肝细胞癌细胞株中的Huh7、HAK 1A、HAK及HLF细胞株的无血清培养上清，通过与(8-1)同样的方法进行NPA凝集素分级。使用抗CFH抗体(Santa CruzCoporation制)、抗FN抗体(Santa Cruz Coporation制)、抗PSAP抗体(Proteintech groupCoporation制)抗CTSD抗体(Life Span Coporation制)及抗LAMP-2抗体(Santa Cruz抗体)，基于CFH、FN、PSAP、CTSD及LAMP-2糖蛋白分子的蛋白质印迹法进行检测。
将该NPA结合组分(NPA凝集素洗脱组分)在SDS-PAGE还原条件下用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并转印至PVDF膜。用含有5％脱脂奶粉的PBS封闭后，与前述第一抗体(CFH抗体以及FN抗体)在室温下反应1小时。洗涤PVDF膜后，与第二抗体(0.5μg/mL)在室温下反应1小时。洗涤这些PVDF膜后，用蛋白质印迹检测试剂(Perkin Elmer Coporation)通过化学发光进行检测。
(结果)
将结果示于图14。从任一肝细胞癌细胞的培养上清的NPA结合组分中均检测了各标志物分子。由此表明：本发明的CFH、FN、PSAP、CTSD及LAMP-2糖蛋白任一者均为具有NPA结合性糖链的分泌糖蛋白。
(实施例10)成为肝细胞癌标志物候选物的糖蛋白的检验(用培养细胞株的培养上 清基于NPA凝集素-抗体夹心ELISA测定体系来检测标志物分子)
本实施例对(实施例7)选出的肝细胞癌标志物候选糖蛋白分子组中的FBN1、FN及LAMP-2糖蛋白分子进一步检验显著性，使用肝细胞癌细胞株的细胞提取物来确认在肝细胞癌细胞株中以NPA结合性糖蛋白形式进行表达。
(10-1)基于NPA凝集素-抗体夹心ELISA测定体系的标志物分子的检测-1
(方法)
对实施例2中使用的肝细胞癌细胞株中的HuH-7、HAK 1B及KYN-1细胞株的无血清培养的培养上清，通过与(8-1)同样的方法进行NPA凝集素分级。使用抗FBN1抗体(AbnovaCoporation制)及抗FN抗体(Santa Cruz Coporation制)，基于FBN1及FN糖蛋白分子的NPA凝集素-抗体夹心ELISA测定体系进行检测。对在ELISA板固相(化)侧分别使用抗FBN1抗体及抗FN抗体的夹心ELISA测定体系进行研究。
首先，将抗FBN1抗体及FN抗体用PBS稀释成4μg/mL，向ELISA用微孔板(ThermoScientific Coporation制Nunc 436013、immobilizer[氨基]板)中添加各100μL/孔。在4℃、一晚的条件下使各抗体吸附于板后，将溶液废弃，将孔用PBS-T(PBS,0.05％Tween-20)洗涤。然后，将TBS(50mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0,0.1％NaN3)封闭液按照300μL/孔来加入，进行封闭。将前述封闭液废弃，洗涤后，将样品(肝脏癌细胞株、HuH-7,HAK 1B,KYN-1的无血清培养的培养上清)的溶液100μL添加到各孔中。在室温下反应2小时后，将孔中的溶液废弃，用PBS-T洗涤后，将被生物素标记的NPA凝集素分别调整为2μg/mL，在室温下反应1.5小时。然后，将溶液废弃，洗涤后，在每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链酶亲和素(Jackson Coporation)溶液100μL，在室温下反应1小时。将反应液废弃，洗涤后，以450nm的吸光度测定由1StepUltra TMB底物液(Thermo Scientific Coporation)引起的显色。
已经确认；上述实施例中研究的FBN1及FN糖蛋白的、基于NPA-抗体夹心ELISA体系的反应性是浓度依赖性的。(需要说明的是，已经确认：在仅缓冲液的阴性对照中未见反应性)。将结果示于图15。由此表明：本发明的FBN1及FN糖蛋白任一种均为具有NPA结合糖链的分泌糖蛋白，且由肝细胞癌细胞分泌。
(10-2)基于NPA凝集素-抗体夹心ELISA测定体系的标志物分子的检测-2
与(10-1)同样地，使用来自肝细胞癌细胞株HAK-1A株的无血清培养的培养上清的NPA凝集素分级，将抗CTSD抗体(Life Span Coporation制)、抗PSAP抗体(Proteintech groupCoporation制)及抗LAMP-2抗体(Santa Cruz抗体)固定到ELISA板上，进行与NPA凝集素的夹心ELISA解析。
其结果是，肝癌细胞中的HAK-1A株的情况下，CTSD及PSAP糖蛋白的分泌在检测限以下，可以确认至少LAMP-2糖蛋白以具有NPA结合糖链的分泌糖蛋白形式被显著分泌(图15)。
(实施例11)外来体组分中的肝脏癌标志物分子的检测
本实施例对确认本发明的NPA结合性糖蛋白、尤其是原本存在于膜组分和溶酶体的糖蛋白在肝细胞癌细胞附近的TME中特异性存在的可能理由之一、即以外来体(exosome)内的糖蛋白形式由肝细胞癌细胞分泌的可能性进行检验。近年相继报道了：已经阐明了外来体为癌细胞所分泌的颗粒，在癌的转移中肩负着重要的作用(Nat Med.2012 Jun；18(6):883-91.doi:10.1038/nm.2753等)。
(方法)
使用作为外来体标志物CD9及CD81的抗体的抗CD9抗体(Cosmobio Coporation制)及CD81抗体(Cosmobio Coporation制)，由肝细胞癌细胞株HAK 1A的无血清培养上清用免疫沉降法浓缩外来体。
具体而言，使生物素化抗CD9抗体及CD81抗体各500ng与(实施例8)中使用的链酶包被磁珠10μL在4℃下反应1小时，从而制作生物素化抗体固定珠子。将珠子用含有0.1％Tween20的PBS(PBSt)200μL洗涤3次后，将HAK 1A培养上清20μg用PBSt稀释至20μL并对珠子进行添加，在4℃、过夜条件下实施抗原-抗体反应。除去上清，将珠子用PBSt 200μL洗涤3次后，对珠子添加0.2％SDS-PBS 10μL，在95℃下热处理10分钟，从而实施结合糖蛋白的洗脱。冰冷却1分钟后，在上清中加入浓缩为2倍的链酶亲和素珠子10μL，在4℃下反应1小时，从而对过剩洗脱的生物素化抗体实施除去，将获得的上清作为CD9、CD81结合组分。对该组分，用抗CTSD抗体(Life Span Coporation制)实施该分子的蛋白质印迹。用10％-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并转印至PVDF膜。用封闭溶液(Block ase,DS PHARMA BIOMEDICALCO.,LTD.制)在4℃、过夜的条件下实施封闭。将膜用含有0.1％Tween20的TBS(TBS-t)洗涤，作为第一抗体反应，将山羊抗组织蛋白酶D单克隆抗体(R&D Coporation)用抗体稀释液(Can Get signal，TOYOBO Coporation制)调整为1μg/mL，将膜在室温下孵育2小时。反应后，将膜用TBS-t洗涤5分钟，洗涤3次；作为第二抗体反应，用TBS-t进行抗山羊IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch Coporation制)的10,000倍稀释，在室温下孵育1小时。反应后将膜用TBS-t洗涤15分钟、5分钟，用TBS洗涤5分钟后，添加作为HRP反应底物的ImmunostarLD(Wako Coporation制)，利用C-DiGiT印迹扫描仪(M&S TechnoSystems Coporation制)实施检测。
(结果)
将结果示于图16。该标志物分子是从肝细胞癌细胞HAK 1A的CD81结合组分检测的。由此表明：本发明的组织蛋白酶D(CTSD)糖蛋白为细胞质内的溶酶体Asp蛋白酶的一种，在肝细胞癌中，至少在HAK1A细胞的情况下以被CD81阳性外来体包封或呈递到表面的糖蛋白形式存在。

Claims (25)

1.一种肝细胞癌标志物，其包含含有糖链表位的NPA凝集素结合性糖蛋白，所述糖链表位为NPA凝集素结合性糖链表位且具有下述(1)～(5)中的至少1个特性：
(1)糖链表位不含核心岩藻糖(岩藻糖α1→6糖链)、
(2)糖链表位含有甘露糖的个数为4以下的复合型糖链、
(3)糖链表位不含甘露糖的个数为5以上的高甘露糖型糖链、
(4)糖链表位包含不依赖于LCA凝集素的结合性的复合型糖链、
(5)糖链表位包含不依赖于ConA凝集素的结合性的复合型糖链。
2.根据权利要求1所述的肝细胞癌标志物，其中，所述糖蛋白为存在于肝组织的癌细胞表面、或存在于癌细胞附近的间质的糖蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的肝细胞癌标志物，其中，所述糖蛋白为选自补体因子H(CFH)、原纤蛋白1(FBN1)、纤连蛋白(FN)、氧调蛋白(HYOU1)、表皮生长因子受体(EGFR)、鞘脂激活蛋白原(PSAP)、组织蛋白酶D(CTSD)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)中的任一糖蛋白。
4.权利要求1～3中任一项所述的肝细胞癌标志物的检测用试剂，其特征在于，含有NPA凝集素。
5.根据权利要求4所述的检测用试剂，其特征在于，还含有LCA凝集素或ConA凝集素。
6.权利要求1～3中任一项所述的肝细胞癌标志物的检测用试剂，其特征在于，含有与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体，所述NPA凝集素结合性糖蛋白为选自补体因子H(CFH)、原纤蛋白1(FBN1)、纤连蛋白(FN)、氧调蛋白(HYOU1)、表皮生长因子受体(EGFR)、鞘脂激活蛋白原(PSAP)、组织蛋白酶D(CTSD)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)中的至少一种。
7.一种肝细胞癌的检测方法，其特征在于，通过对被检试样中的权利要求1～3中任一项所述的肝细胞癌标志物进行体外检测，从而对肝细胞癌进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过使用了被标记的NPA凝集素进行的被检细胞或组织的NPA染色，进行所述肝细胞癌标志物的体外检测。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过使用含有NPA凝集素的凝集素阵列的凝集素阵列解析法或含有NPA凝集素的凝集素-抗体ELISA法，进行所述肝细胞癌标志物的体外检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述凝集素阵列解析法使用含有NPA凝集素并且至少含有LCA凝集素或ConA凝集素的凝集素阵列。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述凝集素-抗体ELISA法为利用夹心法检测肝细胞癌标志物的方法，所述夹心法使用了NPA凝集素及与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体，将与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体在支持体上固相化，通过用被标记的NPA凝集素夹持作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白的凝集素覆盖而进行；或者，通过用被标记的所述抗体夹持作为肝细胞癌标志物的NPA凝集素结合性糖蛋白的抗体覆盖而进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述与NPA凝集素结合性糖蛋白结合的抗体为与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
13.根据权利要求7、9～12中任一项所述的方法，其特征在于，使用含有血清成分的血液试样作为被检试样进行肝细胞癌标志物的体外检测时，设置如下工序：
预先使被检试样与在支持体上固相化的α2,6唾液酸结合性凝集素的吸附工序，和
取得α2,6唾液酸结合性凝集素非吸附组分的工序。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，α2,6唾液酸结合性凝集素为选自SNA、SSA、TJAI及PSLla凝集素中的至少一种凝集素。
15.一种测定方法，其特征在于，其为用于判断是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的测定方法，包括如下工序：
对来自被检肝组织的被检试样，使用含有NPA凝集素的凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法，测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序。
16.根据权利要求15所述的测定方法，其特征在于，在所述测定方法中设置如下工序：
(1)预先在所述凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法中，测定多种肝细胞癌组织及正常组织对含有NPA凝集素的凝集素的反应性，准备对应于肝细胞癌的进展或恶性的程度的判别式或标准曲线的工序，及
(2)将所述被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的测定值代入所述判别式或标准曲线，判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的工序。
17.一种测定方法，其特征在于，其为用于使用含血清试样作为被检试样判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的测定方法，包括：
对于被检含血清试样，
(1)与在支持体上固相化的α2,6唾液酸结合性凝集素进行吸附的工序，
(2)取得α2,6唾液酸结合性凝集素非吸附组分的工序，和
(3)使用含有NPA凝集素的凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序。
18.一种测定方法，其特征在于，其为用于判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的测定方法，包括如下工序：
对于来自被检肝组织的被检试样，使用含有NPA凝集素的凝集素与抗体的夹心ELISA法测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序，所述抗体为与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
19.一种使用含有NPA凝集素的凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法判定是否罹患肝细胞癌或者癌进展或恶性的程度的方法，其中，
(1)预先在所述凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法中，测定多种肝细胞癌组织及正常组织对含有NPA凝集素的凝集素的反应性，准备对应于肝细胞癌的进展或恶性的程度的判别式或标准曲线的工序，
(2)将来自被检肝组织的被检试样供于所述凝集素阵列或ELISA，测定被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的工序，
(3)将工序(2)中获得的、被检试样与含有NPA凝集素的凝集素的反应性的测定值代入工序(1)中获得的判别式或标准曲线中，判定是否罹患肝细胞癌或者癌的进展或恶性的程度的工序。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述凝集素阵列解析法或凝集素-抗体ELISA法含有NPA凝集素并且还含有LCA凝集素和/或ConA凝集素，预先准备的判别式或标准曲线还包括针对LCA凝集素和/或ConA凝集素的判别式或标准曲线。
21.一种利用组织染色判定是否罹患肝细胞癌或者癌进展或恶性的程度的方法，包括下述工序(1)～(4)：
(1)制作来自被检肝组织的被检试样的组织切片的工序，
(2)利用被荧光标记的NPA凝集素进行组织染色的工序，
(3)观察细胞表面和/或其附近的间质中荧光的有无及强度的工序，
(4)在工序(3)中观察到一定水平以上的荧光时，判定罹患肝细胞癌，根据其强度判定癌进展或恶性的程度的工序。
22.一种组织染色用试剂盒，其用于判定是否罹患肝细胞癌或癌的进展或恶性的程度，其特征在于，含有被荧光标记的NPA凝集素。
23.一种肝细胞癌标志物检测用试剂盒，其特征在于，下述(1)及(2)中的任一者被固相化于支持体，另一者被标记，
(1)含有NPA凝集素的凝集素、
(2)与选自CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及LAMP-2中的至少一种糖蛋白结合的抗体。
24.一种肝细胞癌标志物检测用试剂盒，其特征在于，至少使用NPA凝集素并且还使用LCA凝集素和/或ConA凝集素。
25.根据权利要求23或24所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为应用于以含血清试样作为被检试样的试剂盒，还含有α2,6唾液酸结合性凝集素。
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