KR101088223B1 - 단백질 생산을 위한 포유류 세포 배양 방법에서의 생산물품질 향상 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 세포 또는 포유류 세포 배양, 실례로, 공급 회분식 세포 배양에 제한되지 않는 배양에 의해 단백질, 특히 당단백질의 생산 방법 및 프로세스를 기재하고 있다. 상기 방법은 배양물 중의 D-갈락토스의 시알릴화 유효 수준을 그의 기간 동안 지속하여 생산된 단백질의 시알릴화를 증가시키기 위해 세포에게 D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 바람직하게는 매일 공급하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 배양 기간 동안 수행되는 적어도 이중 온도 이동을 포함할 수 있으며, 여기서 배양 기간 말미에서의 온도가 초기 세포 배양시에서의 온도보다 낮다. 2 단계 이상의 온도 이동과 관련된 본 발명의 세포 배양 방법은 높은 세포 생존력을 지속하고, 단백질 생산기를 연장시킬 수 있다. 상기 방법은 접종 후 시간에 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함할 수도 있다. 배양물에 D-갈락토스를 바람직하게는 공급 배지로 보충하여 갈락토스를 배양물에서 시알릴화 유효 수준으로 배양 운행의 말미까지 지속시키는 것은 시알릴화의 저하를 역전시키며, 이는 배양 규모 확대를 달성하고, 대규모 배양 방법에 대해 유리하다.

포유류 세포, 배양, 당단백질, D-갈락토스, 시알릴화, 온도 이동, 세포 배양 방법, 대규모 배양

Description

단백질 생산을 위한 포유류 세포 배양 방법에서의 생산물 품질 향상 {PRODUCT QUALITY ENHANCEMENT IN MAMMALIAN CELL CULTURE PROCESSES FOR PROTEIN PRODUCTION}

본 발명은 2002년 12월 23일자로 출원한 미국 가출원 번호 제60/436,050호를 우선권으로 주장하며, 그 전체를 본원에 참고로 인용한다.

본 발명은 증가 및 향상된 시알산 함량을 갖는 단백질 생산물, 바람직하게는 글리코실화된 단백질 생성물을 생산하는 포유류 세포의 신규 배양 방법 및 프로세스에 관한 것이다. 이들 각종 측면들에서의 세포 배양 방법 및 프로세스의 수행은 시알산 함량에 의해 측정되는 바와 같이 생산물의 양 및 품질을 높인다.

동물 세포 배양, 특히 포유류 세포 배양은 바람직하게는 치료상 및(또는) 예방상 응용을 위한 재조합 생산되는 글리코실화된 단백질의 발현에 사용된다. 재조합 당단백질의 글리코실화 패턴은 중요한데, 이는 당단백질의 올리고당 측쇄가 단백질 기능 뿐만 아니라 1개의 단백질의 상이한 영역 간의 분자내 상호작용에 영향을 미치기 때문이다. 이러한 분자내 상호작용은 당단백질의 단백질 입체형태 및 3차 구조에 관련된다. (예컨대, 문헌 [A. Wittwer et al., 1990, Biochemistry, 29:4175-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee et al., 1991, Bio/Technol., 9:1347-1355; 및 R.B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754] 참조). 또한, 올리고당은 특정 폴리펩티드를 특이적 세포 탄수화물 수용체에 기초한 특정 구조에 표적화시키는 기능을 할 수 있다 [M.P. Bevilacqua et al., 1993, J. Clin. Invest., 91:379-387; R.M. Nelson et al., 1993, J. Clin. Invest., 91:1157-1166; K.E. Norgard et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072; 및 Y. Imai et al., 1993, Nature, 361-555-557].

당단백질 올리고당 측쇄의 말단 시알산 성분은 흡수, 가용성, 열 안정성, 혈청 반감기, 혈청으로부터의 청소율 (clearance), 뿐만 아니라 그의 물리적 및 화학적 구조/거동 및 그의 면역원성을 포함하는 당단백질의 다수의 측면 및 특성에 대한 영향을 가지는 것으로 공지되어 있다 [A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100; R.B. Parekh, Id., Goochee et al., Id., J. Paulson et al., 1989, TIBS, 14:272-276; 및 A. Kobata, 1992, Eur. J. Biochem., 209:483-501; E.Q. Lawson et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys., 220:572-575; 및 E. Tsuda et al., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411].

일반적으로, 포유류 세포 배양-기초 시스템에서의 단백질 발현 수준은 미생물 발현 시스템, 예를 들어 박테리아 또는 효모 발현 시스템에서보다 상당히 낮다. 그러나, 박테리아 및 효모 세포는 최적으로 고분자량 단백질 생산물을 발현하는 능력, 복합체 입체 구조를 갖는 단백질의 적절한 폴딩 능력, 및(또는) 발현된 당단백질을 성숙시켜 면역원성 및 생산물의 청소율에 작용하기 위한 필수 번역후 변형을 제공하는 능력이 제한되어 있다.

재조합 생산물을 생산하는 동물 또는 포유류 세포, 특히 동물 또는 포유류 세포 배양의 제한 때문에, 대규모 배양 용기의 사용; 기초 배양 조건의 변경, 예컨대 인큐베이션 온도, 용존 산소 농도, pH 등; 상이한 유형의 배지 및 배지용 첨가제의 사용; 및 배양된 세포 밀도의 증가를 포함하는 각종 파라미터의 조작을 조사하였다. 또한, 포유류 세포 배양 방법의 개발은 운행 시간을 연장하여 최종 생성물 농도를 증가시키는 반면 높은 생성물 품질을 유지하는 능력에서의 접근이 유익할 것이다. 중요한 생성물 품질 파라미터는 당단백질 품질의 측정으로서 통상적으로 사용되는 시알산 함량을 갖는 폴리펩티드 생산물의 글리코실화 구조의 정도 및 완료이다.

세포 배양 방법, 특히 비-연속 방법의 운행 시간은 운행 동안에 걸쳐 전형적으로 저하하는 세포의 존속 생존력에 의해 보통 제한된다. 높은 세포 생존력의 최대 가능한 연장이 따라서 요망된다. 생성물 품질 관심사는 또한 세포 사멸이 시알리다제를 배양 상청액으로 유리시킬 수 있기 때문에 (이는 발현된 단백질의 시알산 함량을 감소시킬 수 있음) 생존가능한 세포 밀도의 감소 최소화 및 높은 세포 생존력의 유지에 대한 연구의욕을 제공한다. 단백질 정제 관심사도 생존가능한 세포 밀도의 감소 최소화 및 높은 세포 생존력의 유지에 대한 또다른 연구의욕을 제공한다. 배양물에서 세포 파편의 존재 및 사멸 세포의 함량은 배양 운행 말미에서 단백질 생성물의 단리능 및(또는) 정제능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 더 긴 배양 기간 동안 세포를 생존가능하게 유지시킴으로써 세포 단백질 및 효소, 예컨 대, 세포 프로테아제 및 시알리다제에 의한 배양 배지의 오염화에서 감소가 수반되며, 이는 세포에 의해 생산되는 목적하는 당단백질의 분해 및 그 품질의 궁극적 저하를 유발시킬 수 있다.

각종 파라미터를 세포 배양에서 높은 세포 생존력을 달성하기 위해 조사하였다. 하나의 파라미터는 37 ℃에서의 초기 배양 후에 배양 온도의 단일 저하와 관련되었다 (예를 들어, 문헌 [Roessler et al., 1996, Enzyme and Micorobial Technology, 18:423-427]; 미국 특허 제5,705,364호 및 동 제5,721,121호 (T. Etcheverry et al., 1998); 미국 특허 제5,976,833호 (K. Furukawa et al., 1999); 미국 특허 제5,851,800호 (L. Adamson et al.); WO 99/61650 및 WO 00/65070 (Genentech, Inc.); WO 00/36092 (Biogen, Inc.); 및 미국 특허 제4,357,422호 (Girard et al.)).

조사된 다른 파라미터는 배양물에 대한 성분의 첨가와 관련되었다. 성장 인자 억제제 수라민은 CHO K1:CycE 세포의 기하급수적 성장 동안 아폽토시스를 막는 것으로 나타났다 [Zhangi et al., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325]. 그러나, 수라민은 사멸기 동안 아폽토시스에 대해 보호하지 않았다. 그 결과, 수라민은 성장기 동안 높은 생존력을 유지할 수 있었지만, 배양 수명을 연장시키지는 못 하였다. 동일한 저자들은 CHO 111-10PF 세포주의 경우에, 덱스트란 술페이트 및 폴리비닐 술페이트가 수라민에 대한 것과 유사하게 대조군 배양에 상대적으로 생존가능 세포 밀도 및 생존력을 3일 증가시킬 수 있었음을 보고하고 있다. 그러나, 사멸기 동안의 덱스트란 술페이트 또는 폴리비닐 술페이트의 효과는 보고되어 있지 않다. 수라민, 덱스트란 술페이트 및 폴리비닐 술페이트는 또한 세포 응집의 차단에 유효한 것으로 보고되어 있다.

부착-의존 세포주를 현탁액 조건에 적응시키기 위해 헤파린을 동물 세포 배양 배지에 보충하였다 (예컨대, 미국 특허 제5,348,877호 (McKenna and Granados, 1994)). 헤파린은 성장 인자, 예컨대 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자에 결합되는 것으로도 공지되어 있다 [HB-EGF; Raab and Klagsbrun, Biochim. Biophys. Acta 1997, 1333, F179-F199]. 세포 표면 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 (HSPG)은 보고에 따르면 야생형 CHO 세포를 포함하는 특정 세포 유형에 대한 HB-EGF 결합 및 생활성을 향상시킨다 [Raab and Klagsbrun, 1997]. [헤파란 술페이트은 단지 보다 소수의 N- 및 O-술페이트기 및 보다 다수의 N-아세틸기가 갖는 것으로 헤파린과는 상이하다 [McKenna and Granados, 1994]. 이 개시 내용의 목적을 위해, 헤파린 및 헤파란 술페이트는 동등물로 고려되고, 일반적으로 헤파린으로 칭해질 것임] 헤파린-결합 성장 인자 FGF-2의 경우에, HSPG에 대한 결합이 세포 표면 상의 국소 FGF-2 농도를 증가시키며, 여기서 또한 세포의 티로신 키나제 수용체에 대한 FGF-2 결합 가능성을 증가시키는 것으로 제안되어 있다 [Raab and Klagsbrun, 1997]. 펜토산 폴리술페이트가 배양된 세포 상에서 헤파린-결합 성장 인자의 작용을 차단할 수 있는 것으로 나타났다 [Zugmaier et al., . J. Nat. Cancer Inst. 1992, 84, 1716-1724].

동물 세포 배양에서 덱스트란 술페이트의 사용에 대한 특허 문헌은

1) 성장 속도를 개선하고, 인간 내피 세포에 대한 노화 전에 개체 배가 수를 증가시키기 위해 (미국 특허 제4,994,387호 및 동 제5,132,223호 (Levine et al., 1991, 1992));

2) 포유류 세포주에서 재조합 단백질 수율을 증가시키기 위해 (미국 특허 제5,318,898호 (Israel, 1994));

3) 곤충 세포주에서 단일 세포 현탁액을 유도하기 위해 (미국 특허 제5,728,580호 (Shuler and Dee, 1996));

4) 인간 간세포-성장 인자의 성장-촉진 활성을 증가시키고, 그의 분해를 저해하기 위해 (미국 특허 제5,545,722호 및 동 제5,736,506호 (Naka, 1996 and 1998));

5) 생존가능한 세포 밀도 및 재조합 단백질 발현을 증가시키기 위해 (WO 98/08934 (Gorfien et al., 1997))

배지에 덱스트란 술페이트를 보충하는 것과 관련한다.

배지에 덱스트란 술페이트의 존재 또는 보충을 나타내는 보고된 모든 경우에, 덱스트란 술페이트는 배양 시간 전체에 걸쳐 주어진 배지에 존재하였다. 지연 첨가가 유리한 경우는 보고되지 않았다. 또한, 덱스트란 술페이트가 사멸기의 개시를 지연시키거나, 성장기를 연장시키거나, 또는 사멸기를 정지시킬 수 있다고 보고된 적도 없다.

배양물에서 생성물 농도를 증가시킴으로써, 올리고당 당구조의 측정된 시알산 함량으로 측정하여 생성물 품질이 저하되는 세포 배양 방법을 관찰할 수 있다. 보통, 허용가능한 시알산 함량에 대한 하한은 약물 청소율 연구에 의해 측정하여 존재한다. 배양물 중의 세포에 의해 생산된 매우 풍부한 단백질은 결국 의도된 사용을 위해 회수된 단백질의 고품질에 의해 최적으로 달성된다. 이러한 높은 단백질 품질은 이들 파라미터의 측정으로서 사용된 시알산 함량을 갖는 단백질의 글리코실화 구조의 정도 및 완료와 상관관계를 나타낸다.

소규모 세포 배양, 예컨대 2 리터 (2 L) 생반응기의 기초 배지에 대한 D-갈락토스 (4 g/L)의 첨가가 배양된 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체 (MAb)의 중쇄의 갈락토실화를 증가시키는 것으로 보고되어 있다 [S. Weikert et al., "Engineering CHO Cells to Maximize Sialic Acid Content of Recombinant Protein", presentation at the "Protein Expression" Meeting, sponsored by the Cambridge Healthtech Institute, April 5-6, 2001, McLean, VA]. 보고된 바와 같이, 갈락토스는 전체 배양 기간에 걸쳐 제공되는 공급 배지 첨가제로서가 아니라, 소규모 배양에 대한 1회 첨가제로서 제공되었다. 상기 보고서는 대규모 (예컨대, 2 L 초과)로 유지되는 배양물에서 생산되는 당단백질의 시알릴화와 관련된 장애물의 인식이 없다.

WO 01/59075 A1 (Genentech, Inc.)에는 돌연변이 UDP-GlcNac2-에피머라제 (특이적 뉴클레오티드 당, CMP 시알산의 생합성 경로에서 속도-제한 효소임)를 코딩하는 핵산 서열을 배양물 중의 세포 내로 도입시킴으로써 당단백질의 개선되거나 또는 향상된 시알릴화 방법이 개시되어 있다 . 유사한 방식으로, 문헌 [X. Gu and D. Wang, 1998, Biotech. Bioeng., 58(6):642-648]에는 배양 배지를 시알산 합성에 대한 특이적 전구체인 ManNac으로 보충하여 CMP-시알산의 이용가능성을 증가시키 고, 생성물 시알릴화를 개선하는 것이 기재되어 있다.

WO 01/59075 A1과 유사하게, 문헌 [X. Gu and D.I.C. Wang, 1998, Biotech. Bioeng., 58(6):642-648]에는 배양 배지를 N-아세틸만노스아민 (ManNAc)으로 보충하는 것이 세포의 CMP-시알산 풀을 증가시키고, 궁극적으로 20 mL 규모의 배양물 중의 재조합 생산된 인간 IFN-γ 당단백질의 시알산 함량을 증가시켰다는 것이 개시되어 있다. ManNAc 보충은 배양 96 시간 후에 생산된 생성물의 시알릴화 분석 전에 배양물로의 이 성분의 초기 첨가와 관련되었다.

WO 01/59089 A2 (Genentech, Inc.)에는 CAD 억제제에 내성인 당단백질-생산 세포에서 세포내 CAD 활성의 향상이 개시되어 있다. 이 공개된 국제 출원에는 CAD가 피리미딘, 특히 UTP로 전환되는 UMP의 새로운 생합성의 3가지의 제1 반응을 촉매하는 다중효소 폴리펩티드 복합체 (카르바모일 포스페이트 신세타제 (CPS II), 아스파르테이트 트랜스카르바모일라제 및 디히드로-오로타제)로 칭해지는 것이 개시되어 있다. CAD-내성 세포는 증가된 UTP 풀을 가지고, 단백질 생산물의 증가된 글리코실화와 함께 UDP-갈락토스 수준을 증가시키는 것으로 보고되어 있는데; UDP-갈락토스는 글리코실화 경로에서 공지된 기질이다.

적절하게 글리코실화되고, 시알릴화된 재조합 생산된 단백질 생산물은 치료술, 치료 및 예방법으로서 사용하기에 의학적으로 및 임상적으로 더욱더 중요시되고 있다. 따라서, 증가된 최종 단백질 생성물 농도를 예컨대 시알산 함량에 의해 측정되는 고수준의 생성물 품질과 함께 경제적으로 및 유효하게 달성하는 신뢰성 있는 세포 배양 방법의 개발은 당업계에서 목적하고 요구되는 목표를 성취시키고 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 동물 또는 포유류 세포 배양에 의한 단백질, 바람직하게는 재조합 단백질 생산물, 더 바람직하게는 당단백질 생산물의 신규 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 세포 배양 방법은 유리하게 배양물에 대한 D-갈락토스의 첨가를 포함하는 신규 개발 공급 계획의 사용을 통해 배양된 세포에 의해 생산된 당단백질 생성물의 증가 및 향상된 시알산 함량을 달성한다.

본 발명의 일 측면은 단백질 생산물, 바람직하게는 당단백질 생산물, 더 바람직하게는 재조합 당단백질 생산물을 생산하기 위한 세포 배양 방법을 제공하는 것이며, 여기서 당단백질의 시알산 함량이 배양 조건 및 배양 방법에 사용된 파라미터에 의해 증가되고 향상된다. 본 발명의 바람직한 측면에 따라, 생산된 당단백질의 시알산 함량은 D-갈락토스가 배양물에 공급, 바람직하게는 공급 배지로 첨가되는 공급 방법을 사용함으로써 증가되고 향상된다. 본 발명의 특정 및 관련 측면에 따라, D-갈락토스는 세포에 전체 배양 기간 동안 매일 공급되며, 이는 생성물의 D-갈락토스 함량을 증가시키고, 추가 시알산 잔기를 당구조에 첨가하여 최종 당단백질 생산물의 품질을 증가시키는 것을 유도한다.

본 발명의 또다른 측면은 증가된 반응기 규모, 예컨대 세포 배양 용적 및 반응기 크기로 단백질의 규모 확대 생산을 종종 달성하는, 당단백질 시알릴화의 저하 문제를 유효하게 역전시키는 방법을 제공한다. 시알릴화 유효량의 D-갈락토스를 갖는 당단백질 생성물을 생산하는 세포의 대규모 배양물의 공급 방법은 상기 "규모 영향"을 역전시킬 수 있게 한다. 반응기 규모에 독립적으로 세포에 의한 대량의 고도로 시알릴화된 당단백질의 생산도 달성된다.

본 발명의 추가 측면은 배양된 세포에 의해 생산되는 당단백질의 시알릴화를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 공급 배지로의 공급물로서 갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스의 첨가와 관련된다. 또다른 측면은 갈락토스가 예를 들어, 매일, 또는 간헐적으로, 예컨대 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다 등으로 배양물에 보충되는 단백질 생산을 위한 세포 배양 방법을 제공한다. D-갈락토스를 함유한 공급 배지는 배양물에 1일 1회 이상 첨가될 수 있다. 바람직한 공급 레지멘 (regimen)에는 공급 배지를 사용하는 배양물의 일일 볼루스 공급 및 세포 배양물 내로의 공급 배지의 점적 또는 주입에 의한 연속 공급이 포함된다. 다른 측면에서, D-갈락토스는 공급 배지 이외에 일부 방식으로 임의의 상기 간격에서 배양물에 공급될 수 있다. 비제한적 예로서, D-갈락토스는 공급 배지 이외에 배지 또는 배양 배지로 배양물에 공급될 수 있거나, 또는 D-갈락토스는 물로 배양물에 공급될 수 있다. 비제한적 예로서, 배양물에 D-갈락토스가 공급될 수 있고, 또한 공급 배지가 공급될 수 있는데, 즉 공급되는 조성물이 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 단백질 생산 및 생산된 당단백질의 시알산 함량을 증가시키는 세포 배양 방법을 제공한다. 상기 방법은 추가로 생산된 단백질의 고수준의 시알릴화 뿐만 아니라 세포 생존력을 유지하고, 지속한다. 본 발명의 이 측면은 배양물에 D-갈락토스를 공급하는 것과 함께 세포 배양 기간 동안 2 단계 이상의 온도 이동과 관련된 배양 방법이 사용되는 실시양태를 포함한다. 이 측면에 서, 온도 이동 세포 배양 방법은 배양 운행 기간 동안 배양의 높은 세포 생존력을 지속한다. 2 단계 이상의 온도 이동은 세포가 배양 운행을 유리하게 연장하여 목적하는 생산물의 증가된 역가 및 고품질 (시알산 함량에 의해 특징지어짐)을 달성할 수 있는 기간 동안 유지되게 할 수도 있다. 이러한 연장된 배양 운행과 관련된 방법은 표준, 또는 2주, (약 10-14일) 배양 기간에 비해 예를 들어 2, 3, 또는 4주 이상 (약 14 내지 30일 이상)의 총 세포 배양 기간을 포함한다. 온도 이동 및 세포에 D-갈락토스를 바람직하게는 공급 배지로 및 바람직하게는 매일 공급하는 것을 조합한 결과, 배양에서 세포에 의한 증가 및 개선된 양 및 품질을 갖는 시알릴화된 당단백질 생성물의 생산 방법을 향상시켰으며, 이는 본 발명의 세포 배양 방법에 의해 신규로 제공된다. 상기 방법은 공급 회분식 세포 배양에 특히 유리하다.

본 발명의 각종 다른 측면에서, 2 단계 이상의 하향 온도 이동을 포함하는 다단계 온도 이동, 바람직하게는 정기의 다단계 온도 이동은 포유류 세포의 배양에 사용되어 목적하는 단백질 생산물, 특히 당단백질 생산물을 생산한다. 배양의 성장기 후에 수행될 수 있는 2 단계 이상 (즉, 적어도 2 단계)의 온도 이동은 본 발명의 이 측면의 방법을 포함한다. 적어도 이중 온도 이동으로, 바람직하게는 이동간의 대략 4일 증가로, 목적하는 단백질 생성물의 높은 시알산 함량과 함께 높은 단백질 수율을 달성할 수 있다. 상기 배양 방법을 포함하는 다중 온도 이동은 단백질 생산물의 높은 품질 및 양 모두를 달성할 뿐만 아니라 세포 생존력을 배양 기간 동안 지속시킬 수 있다. 본원에 기재된 온도 이동 세포 배양 방법과 관계된 바람직한 파라미터는 배양물에 D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스를 함유하기 위 해 보충된 공급 배지를 공급하는 것이다. 일일 공급 레지멘이 가장 바람직하다.

본 발명의 온도 이동 세포 배양 방법에 따라, 제1 온도 이동과 제2, 제3, 제4, 또는 추가 하향 온도 이동의 조합은 높은 세포 생존력을 지속하는 세포 배양을 가능하게 하고, 본 발명의 실시양태에서 연장된 생산기를 제공하며, 이 기간 동안 단백질 생성물의 역가가 증가하고, 시알산 함량에 의해 특성화되는 생성물 품질은 배양 운행의 말미까지 높게 남아있다.

본원에 사용되는 배양 운행은 배양 기간, 바람직하게는 전체 배양 기간을 나타낸다. 본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 온도 이동이 없거나, 또는 단지 단일 온도 이동만을 포함하는 운행 동안 세포 배양물에 D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하는 것은 단백질 생산물의 높은 양 및 품질 (생산된 생산물의 시알릴화에 의해 측정됨)을 달성한다. 본 발명에 의해 신규로 제공되는, 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 배양 운행의 경우에, 생산 운행 동안 세포에 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하는 것은 증가된 시알산 함량의 생산된 당단백질을 유도한다 (예컨대, 매일 볼루스 공급이 사용되는 도 1 참조). 전체 배양 운행의 길이는 제2 온도 이동 (예를 들어, 약 10-14일) 직후에서 약 28 내지 30일 이상까지 지속될 수 있다. 제3 (이상) 온도 이동을 포함하는 배양 운행의 경우에, 전체 운행 길이는 제3 (또는 최종) 온도 이동 (예를 들어, 약 14 내지 21일) 직후에서 약 28 내지 30일 이상 지속될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 세포는 10일 초과, 14일 초과, 또는 21일 초과의 총 운행 기간 동안 배양될 수 있다. 바람직하게는, 배양 운행은 적어도 약 10 내지 14일에서 약 21 내지 30 일 이상까지 동안 지속된다.

총 배양 운행은 2, 3, 4 단계 이상 온도 이동을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 2 단계 온도 이동은 하기와 같이 수행된다: 배양 온도를 초기에 37 ℃ 또는 그 주변에서 0일 내지 약 6일 동안 유지하고; 약 6일 내지 약 10일 동안 배양 온도를 34 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 10일에서 이후로, 예컨대, 약 14 내지 28일, 약 14 내지 18일 또는 배양 운행의 말미까지 배양 온도를 32 ℃ 또는 그 주변에서 유지한다. 본 발명에 따른 3-단계 온도 이동 배양 과정은 하기 비제한적 예시 포맷을 포함한다: 세포 배양 온도를 37 ℃ 또는 그 주변으로 0일 내지 약 6일 동안 조절하고; 약 6일 내지 약 10일 동안, 배양 온도를 34 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 10일 내지 약 14일 동안, 배양 온도를 32 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 14일에서 이후로, 예컨대, 약 21일 내지 30일 이상까지, 즉 운행의 말미까지 배양 온도를 30 ℃ 또는 그 주변에서 유지하였다.

따라서, 높은 양 및 품질의 단백질 생산이 달성되는 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 본 발명의 세포 배양 방법의 사용은 "더 짧은", 예컨대, 표준 기간 (예컨대, 약 10 내지 약 14일)의 배양 운행 뿐만 아니라 표준 생산 운행보다 더 길게 지속할 수 있는 배양 운행에 대해 유익하다. 이러한 더 긴 기간의 배양 운행이 달성되는데, 이는 본 발명의 방법이 배양된 세포에 의한 단백질 생산의 초기 또는 표준 생산기 (초기 또는 표준 생산기가 일반적으로 약 6 내지 14일에 발생함)의 연장을 제공하기 때문이다. 예를 들어, 본 발명에 따라 배양 운행에서 이중, 삼중 이상 온도 이동을 사용함으로써, 온도 이동을 사용하지 않거나 또는 기껏해야 단일 온도 이동을 사용하는 배양에서의 단백질 생산 및 생성물 품질에 비해 단백질 생산의 높은 품질 및 양, 및 높은 세포 생존력이 유지될 수 있고, 약 10-14일 내지 약 21 내지 28일 이상의 총 운행 시간 동안 지속될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 상기 이중 또는 삼중 초과의 온도 이동을 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다. 이러한 다단계 온도 이동 운행에서, 세포는 3 단계 배양 기간에 대해 기재된 바와 같이 실질적으로 배양되고, 추가 하향 온도 이동은 배양 기간의 말기까지 수행된다. 예를 들어, 제4 하향 온도 이동, 즉 온도 저하는 제3 온도 이동 배양 기간 이후에 수행될 수 있으며, 여기서 세포 배양 온도는 배양의 개시로부터 15-19일 또는 약 15-19일에, 바람직하게는 18일에 약 30 ℃에서 약 28 ℃ 또는 29 ℃, 바람직하게는 약 29 ℃로 추가로 이동된다. 추가 온도 이동에는 단백질 생산을 운행 말미까지, 바람직하게는 28-30일 초과 동안 추가로 연장하기 위해 세포를 더 낮은 온도, 예컨대 29 ℃ 미만에서 유지시키는 세포 배양 방법에 포함될 수 있다. 모든 경우에서, 필요에 따라 본원에 기재된 바와 같이 당업계에 통상적으로 실행되는 기술을 사용하여 배양 기간 말미에서 세포에 의해 생산되는 단백질을 전형적으로 회수, 예컨대, 단리 및(또는) 실질적으로 정제한다. 또한, 시알산 함량을 통상적 방법에 의해 평가한다.

특정 일 측면에서, 본 발명은 2 단계 이상 온도 이동 방법을 사용함으로써 생성물의 최종 역가가 향상되고, 생산된 당단백질의 시알산 함량이 더 높은 프로세스 (또는 방법)를 제공한다. 이 특정 측면에 따라, 2 단계 이상의 정기적 온도 이동의 조합은 배양물의 높은 세포 생존력을 지속시켜 생산물, 바람직하게는 재조합 생산물의 역가가 증가되고, 시알산 함량에 의해 특성화되는 생성물 품질이 고수준에서 유지되는 생산기를 연장시킬 수 있다. 이러한 2 단계 이상의 온도 이동은 세포 배양 방법 동안 생성물의 생산에서 단백질 역가와 시알산 함량 간의 일반적 균형화를 최소화시킬 수 있다. 따라서, 온도 이동은 배양 방법의 중요한 성능 파라미터, 즉 "말기 (즉, 최종) 역가" x "말기 (즉, 최종) 시알산" ("말기 역가 x 말기 시알산")의 수리적 생성물의 향상에 긍정적 효과를 제공한다. 2 단계 이상의 배양 방법에서, 세포에 바람직하게는 D-갈락토스를 함유한 배지를, 단백질 생산물을 고수준의 시알릴화 가능하게 하는 양, 심지어 연장된 배양 기간, 예컨대, 약 2주 이상보다 긴 기간에 걸쳐 유지되는 대량 배양으로 공급한다.

따라서, 본원에 기재된 2 단계 배양 방법에 대한 또다른 특정 측면에서, 세포를 배양물 중에서 0일 내지 6일 또는 그 부근 동안 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 유지하고; 6일 또는 약 6일째에, 세포 배양의 온도를 34 ℃ 또는 그 주변으로 저하시키고; 10일 또는 그 부근에서, 온도를 다시 32 ℃ 또는 그 주변으로 저하시킨다. 이러한 2 단계 온도 이동 방법의 일 측면에서, 생산기를 약 14일 초과로 연장하고, 배양 운행의 말미, 예컨대 약 21일, 또는 약 28 내지 30일까지 지속하며, 이 기간 동안 세포를 배양물 중에서 32 ℃ 또는 그 주변 미만의 온도에서 유지한다. 단백질 생성물을 본원에 추가로 기재하는 바와 같이 연장된 생산기의 말미에 회수할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 세포를 배양 운행 동안 2 단계 이상 온도 이동시킴으로써 배양물 중의 세포의 생존력을 증가시키는 방법을 제공한다. 배양물 중의 세포 생존력의 기간이 상기 조건의 부재 하보다 상기 조건의 존재 하에 더 커지는 경우에 조건, 예컨대 2 단계 이상 온도 이동은 세포 생존력을 증가시킨다. 이 측면에 따라, 상기 2 단계 이상의 온도 이동 세포 배양 방법은 세포를 증가된 기간, 예컨대 표준 생산 기간 초과 동안 생존가능한 채로 있게 한다. 본원에 논의된 바와 같이, 배양된 세포의 보다 증가된 세포 생존력의 유익한 결과는 (고품질의) 생성물의 더 큰 양이 생존가능한 세포의 유지에 기여하는 조건 하에 배양 기간 말미에서 생산되는 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 2 단계 이상의 온도 이동 세포 배양 방법의 실행으로부터 생성된 증가된 세포 생존력이 배양 시간에 걸쳐 세포 파편 및 사멸되거나 또는 사멸되고 있는 세포의 유리된 함량의 감소된 양과 상관 관계를 나타내는 것이다. 배양물 중의 세포 파편의 존재 및 사멸 세포의 함유는 단백질 생성물을 배양 운행의 말미에서의 단리능 및(또는) 정제능에 대해 부정적 영향을 미칠 수 있다. 더 긴 배양 기간 동안 세포를 생존가능하게 유지시킴으로써 세포 단백질 및 효소, 예컨대, 세포 프로테아제 및 시알리다제에 의한 배양 배지의 오염화에서 감소가 수반되며, 이는 세포에 의해 생산되는 목적하는 당단백질의 분해 및 그 품질의 궁극적 저하를 유발시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가와 관련된 배양 방법은 D-갈락토스를 갖는 배양물의 공급과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가와 관련된 배양 방법 및 2 단계 이상의 온도 이동과 관련된 배양 방법은 모두 D-갈락토스를 갖는 배양물의 공급과 함께 사용할 수 있다.

세포 배양물에 대한 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 이들 측면에서, 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가는 증가된 세포 생존력을 달성한다. 다가음이온성 화합물은 바람직하게는 덱스트란 술페이트이다. 다가음이온성 화합물은 배양 접종 후 시간에 첨가된다.

다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 본 발명의 일 측면에서, 다가음이온성 화합물을 초기 사멸기의 개시 전, 초기 성장기 동안, 초기 성장기의 제2 절반기간 동안, 또는 초기 성장기의 말미 또는 그의 주변인 배양 접종 후 시간에 첨가한다. 본 발명의 이 측면에 따라, 성장기가 연장되고(거나) 사멸기의 개시가 수일과 같은 기간 동안 지연된다. 추가적으로, 사멸기가 개시되면, 사멸 속도가 크게 감소된다.

또다른 측면에서, 다가음이온성 화합물을 배양물에 초기 사멸기 동안 첨가한다. 본 발명의 이 측면에 따라, 세포 사멸은 수일과 같은 기간 동안 정지된다.

본 발명 및 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 또다른 바람직한 측면에서, D-갈락토스-함유 공급 배지의 공급을 포함하는 신규로 개발된 세포 배양 방법은 가용성 CTLA4 분자 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예컨대 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg의 생산에 특히 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 가용성 CTLA4 분자 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 이들 단백질을 발현하고 생산하기 위해 유전학적으로 가공된 숙주 세포에 의해 높은 양 및 품질로 생산된다 (실시예 1 내지 5 참조). 본 발명의 바람직한 실시양태는 배양 운행 동안 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 사용 하는 배양물의 공급과 병용되는 다중 온도 이동을 사용하여 대량의 고품질 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg 생산물 (최종 생성물의 시알산 측정에 의해 측정됨)을 달성하는 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg 생산 세포의 배양을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 바와 같이 높은 시알산 함량을 갖는 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg 생산물을 달성하기에 유효한 양으로 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 세포 배양물에 공급하는 것과 함께 하는 다중 온도 이동 배양 방법을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 사용하는 배양물의 공급과 병용되는 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 사용하여 가용성 CTLA4 분자 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예컨대 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg 생산 세포의 배양을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 사용하는 배양물의 공급과 병용되는 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가 및 다중 온도 이동을 사용하여 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg 생산 세포의 배양을 포함한다.

본 발명의 추가 측면, 특징 및 이점은 본 발명의 상세한 설명을 볼 때, 도면을 고려할 때에 올바르게 인식될 것이다.

도 1은 당단백질 생산물, 즉 CTLA4Ig 융합 단백질을 수득하기 위한 50-L 반응기 규모에서 세포 배양의 방법 동안 공급 배지 중에 D-갈락토스를 포함하는 공급 레지멘을 사용한 결과를 나타낸다. 도 1로부터 관찰되는 바와 같이, 시알릴화의 정도는 50-L 반응기 규모에서 공급 배지 중의 D-갈락토스의 더 높은 농도 (12.5 g/L)로 증가되었다. 또한, 공급 배지에서 20.0 g/L로의 D-갈락토스 농도의 추가 증가는 단백질 시알릴화에 대한 양성적 효과를 갖지 못하였다.

도 2는 본 발명의 배양 및 공급 방법을 사용하는 50-L 반응기 규모의 21일 세포 배양 운행에서 생성물 역가에 대한 D-갈락토스의 영향을 도시한다. 도 2에서 관찰되는 바와 같이, 역가 증가 (즉, 세포 특이적 생산성)는 D-갈락토스의 첨가에 의해 유의하게 영향받는 것으로 나타나지 않았다.

도 3은 공급 배지 중의 12.5 g/L의 D-갈락토스의 농도에서 본 발명의 잔여 D-갈락토스 농도 세포 배양을 나타내며, 이는 50-L 및 5000-L 반응기 규모에서 최적인 것으로 나타났다. 생산기 동안 역가가 증가된 때 (즉, 6-21일)에, 배양물 중의 잔여 D-갈락토스 농도는 바람직하게는 0.25 g/L 이상이었다.

도 4는 CTLA4Ig 생산을 위해 5000-L로의 세포 배양 방법의 규모 확대 동안 관찰된 규모 영향을 도시한다. 당단백질의 시알릴화가 반응기 규모의 증가로 저하되는 것으로 나타났다.

도 5는 매일 공급하는 공급 배지로의 D-갈락토스 12.5 g/L의 첨가 후의 규모 효과의 역전을 나타낸다. 이 D-갈락토스 공급 기술은 대규모 생산 반응기에서 대량의 고도로 시알릴화된 CTLA4Ig의 생산을 가능하게 하였다.

도 6은 5 리터 (5 L) 반응기 규모에서 배양된 세포에 대한 세포 생존력에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 5에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 온도 이동 없음 ("T-이동 없음"), 단일 온도 이동 ("단일 T-이동") 및 이중 하향 온도 이동 ("이중 T-이동")과 관련된 배양 방법들 중에서 비교한다.

도 7은 50 리터 (50 L) 반응기 규모에서 배양된 세포의 세포 생존력에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 5에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 삼중 하향 온도 이동 ("삼중 T-이동") 및 이중 하향 온도 이동 ("이중 T-이동")과 관련된 배양 방법들 간에 비교한다.

도 8은 시그날 펩티드, 위치 +1에서의 메티오닌에서 시작하고 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종결되거나, 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종결되는 CTLA4의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열, 및 Ig 영역을 갖는 CTLA4Ig의 뉴클레오티드 서열 (서열 1) 및 그를 코딩하는 아미노산 서열 (서열 2)을 도시한다.

도 9는 시그날 펩티드, 위치 +1에서의 메티오닌에서 시작하고 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종결되거나, 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종결되는 CTLA4의 돌연변이 세포외 도메인, 및 Ig 영역을 갖는 CTLA4 돌연변이 분자 (L104EA29YIg)의 뉴클레오티드 서열 (서열 3) 및 그를 코딩하는 아미노산 서열 (서열 4)을 도시한다.

도 10은 온코스타틴 M 시그날 펩티드 (위치 -26 내지 -2)에 융합된 인간 CTLA4 수용체 (본원에 "야생형" CTLA4로서 칭함)의 핵산 서열 (서열 5) 및 그를 코팅하는 완전 아미노산 서열 (서열 6)을 도시한다 (미국 특허 제5,434,131호 및 동 제5,844,095호).

도 11은 덱스트란 술페이트를 초기 성장기의 말미에서 첨가한 배양에서 생존가능한 세포 밀도, 총 세포 밀도, 및 생존율에 대한 덱스트란 술페이트의 지연된 첨가의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 8에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 덱스트란 술페이트를 초기 성장기의 말미에서 첨가한 배양 및 덱스트란 술페이트를 첨가하지 않은 배양 간에 비교한다. 평균 값을 플롯팅하고; 오차 막대기는 표준 편차를 나타낸다.

도 12는 사멸 속도에 대한 덱스트란 술페이트의 지연된 첨가의 영향을 나타낸다. 시간에 대한 함수로서 생존가능한 세포 밀도를 로그로 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 8에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 덱스트란 술페이트를 초기 성장기의 말미에서 첨가한 배양 및 덱스트란 술페이트를 첨가하지 않은 배양 간에 비교한다. 평균 값을 플롯팅한다. 오차 막대기는 표준 편차를 나타낸다.

도 13은 덱스트란 술페이트를 초기 사멸기 동안에 첨가한 배양에서 생존가능한 세포 밀도, 총 세포 밀도, 및 생존율에 대한 덱스트란 술페이트의 지연된 첨가의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 9에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 덱스트란 술페이트를 초기 사멸기 동안에 첨가한 배양 및 덱스트란 술페이트를 첨가하지 않은 배양 간에 비교한다.

도 14는 덱스트란 술페이트를 초기 사멸기 동안에 첨가한 배양에서 생존가능한 세포 밀도, 총 세포 밀도, 및 생존율에 대한 덱스트란 술페이트의 지연된 첨가의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 10에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 덱스트란 술페이트를 초기 사멸기 동안에 첨가한 배양 및 덱스트란 술페이트를 첨가하지 않은 배양 간에 비교한다.

도 15는 덱스트란 술페이트를 배양 0일째에 첨가한 배양에서 생존가능한 세 포 밀도, 총 세포 밀도, 및 생존율을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 11에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다.

도 16은 덱스트란 술페이트를 초기 성장기의 3가지 상이한 시간 (3, 4 및 5일)에 첨가한 배양에서 생존가능한 세포 밀도 및 생존율을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 12에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다.

도 17은 생존가능한 세포 밀도에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 13에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 온도 이동 없음 ("T-이동 없음"), 단일 온도 이동 ("단일 T-이동") 및 이중 하향 온도 이동 ("이중 T-이동")과 관련된 배양 방법들 중에서 비교한다.

도 18은 생존율에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 13에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 온도 이동 없음 ("T-이동 없음"), 단일 온도 이동 ("단일 T-이동") 및 이중 하향 온도 이동 ("이중 T-이동")과 관련된 배양 방법들 중에서 비교한다.

도 19는 역가에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타낸다. 이들 결과를 본원의 실시예 13에 기재되는 실험으로부터 관찰하였다. 온도 이동 없음 ("T-이동 없음"), 단일 온도 이동 ("단일 T-이동") 및 이중 하향 온도 이동 ("이중 T-이동")과 관련된 배양 방법들 중에서 비교한다.

본 발명은 포유류 세포 배양에서 단백질, 바람직하게는 재조합 단백질 생산물, 더 바람직하게는 당단백질 생산물의 신규 생산 방법을 기술한다. 본 발명에 따른 세포 배양 방법은 배양된 세포에 의해 생산된 당단백질의 향상 및 증가된 시알산 함량을 달성하여 배양 운행의 말미에 고품질 단백질 생성물을 제공한다.

D-갈락토스의 공급과 관련된 배양 방법

본 발명은 생산된 당단백질의 시알산 함량이 D-갈락토스를 배양물에, 바람직하게는 공급 배지 중에 공급하는 신규로 기술하는 공급 계획을 사용함으로써 증가되는, 포유류 세포 배양에 의한 당단백질, 특히 재조합 당단백질의 향상된 제조 프로세스 (방법)에 관한 것이다. D-갈락토스를 세포 배양물에 제공하여 D-갈락토스가 생산된 단백질의 높은 시알릴화를 배양 운행의 말미까지 이루고 유지하는 데 유효한 양으로 배양물 중에 존재하게 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 잔여 D-갈락토스가 배양물에 배양 운행 기간 동안 존재하게 하는 각종 공급 레지멘은 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따라, 생산된 단백질의 당구조에 대한 D-갈락토스의 첨가는 생성물 시알릴화의 속도-제한 단계인 것으로 확인되었다. 배양 방법 동안에 걸쳐 공급 배지 중에 유효량의 D-갈락토스의 존재는 생산물의 D-갈락토스 함량을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 이는 추가 시알산 잔기를 단백질 당구조에 첨가하여 생성물 품질을 증가시킨다. 생산물의 더 높은 정도의 시알릴화를 유지하고(거나) 지속하기 위해, 배양 운행 전체에 걸쳐 D-갈락토스 공급 계획을 유지하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프로세스 및 방법은 소규모 (예컨대, 50 L-100 L) 및 대규모 (예컨대, 500 L 이상) 세포 배양 모두에 적합하다. 또한, 본 발명의 방법은 추가로 본원에 기재되는 바와 같이 소규모 및 대규모 모두의 공급 회분식 배양으로서 성장되고 유지되는 세포에 특히 적합하다. 또한, 당업계에 공지된 각종 배양 배지는 본 발명의 배양 방법에 사용될 수 있다. 적합한 배양 배지는 추가로 본원에 기재된다.

본 발명의 이점은 본원에 기재된 배양 방법이 달성됨으로써 최종 생성물의 전체 품질 (예컨대, 시알산 함량에 의해 측정됨)에서의 증가에 의해 단백질 생산 비용이 감소되는 것이다. 바람직한 실시양태에서, D-갈락토스가 세포 배양에 바람직하게는 매일 공급되는 공급 배지에 포함되는 경우에 생성물의 높은 시알산 함량이 배양 운행 전체에 걸쳐 유지되었다 (예컨대, 실시예 1 및 2 참조). 흥미롭게도, 배양 운행 10일째에 D-갈락토스 공급의 중단 또는 중지는 높은 생성물 품질의 역전 및 더 낮은 시알릴화된 단백질 종의 형성을 유도하였다 (실시예 2). 또한, 공급 배지를 통해 주어진 단백질, 예컨대 CTLA4Ig를 생산하는 세포 배양, 바람직하게는 대규모 배양에 D-갈락토스를 첨가하는 것은 생산물의 품질에 대한 관찰된 불리한 규모 영향 (예컨대, 증가된 반응기 크기)을 역전시킬 수 있다. 갈락토스가 배양물의 매일 공급 배지에 존재하는 경우에 규모 영향의 역전은 가장 유의하였다. 공급 배지에 대한 D-갈락토스 첨가의 부재 하에, 당단백질의 시알릴화 정도는 반응기 규모 증가로 저하되었다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 바람직하게는 매일 공급하여 반응기 규모에 독립적으로 대량의 고도로 시알릴화된 당단백질을 생산하도록 생산 운행 전체에 걸친 D-갈락토스 공급 계획의 유지를 포함한다. 전체 세포 배양 방법 전체에 걸쳐 시알릴화 유효 수준으로 D-갈락토스를 함유하는 공급, 바람직하게는 D-갈락토스를 포함하는 공급 배지를 제공하는 것은 유리하게 규모 확대 영향의 역전을 유발하고, 단백질 시알릴화의 저하 및 더 낮게 시알릴화된 당단백질 생성물 종의 형성을 막는다. 예를 들어, 수천 리터 반응기 부피로의 세포 배양 방법의 규모 확대 동안, 당단백질의 시알릴화 정도에 의해 측정되는 생성물 품질이 반응기 규모의 증가로 저하되는 것이 관찰될 수 있다. 이 관찰은 더 큰 규모에서 배양에 의해 경험되는 더 높은 스트레스 수준 때문일 수 있으며, 이는 세포의 D-갈락토스 대사에 영향을 준다. 본원에 예시된 바와 같이, 공급 배지를 통해 배양물에 D-갈락토스를 배양 운행 동안 1회 이상 첨가하는 것 (예컨대, 매일 기준으로)은 이러한 불리한 규모 확대 영향을 역전시키거나 또는 그 영향이 미치지 않게 할 수 있고, 사용되는 반응기 크기에 독립적으로 고품질 및 시알릴화 특성의 당단백질을 생산하게 할 수 있었다. 따라서, 공급, 바람직하게는 공급 배지 중의 D-갈락토스의 지속된 수준의 존재는 가장 두드러진 규모 영향을 갖는 대규모 세포 배양에 대해 특히 유리하다.

공급, 바람직하게는 세포 배양 공급 배지 중의 성분으로서의 유효 농도의 D-갈락토스는 생산 운행 전체에 걸쳐 생성물의 높은 시알산 함량을 향상, 증가, 유지 및(또는) 지속시킨다. 공급 배지에 사용하기에 적합한 D-갈락토스의 양은 배양물의 반응기 크기 및 부피에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 방법은 대소 생산 규모에 제한되지 않고, 반응기 규모, 예컨대 대규모 배양 또는 상업적 규모 배양, 예컨대 50 L 초과, 더 바람직하게는 500 L 초과를 포함하는 단백질 생산이 수행되는 모든 반응기 규모에 적합하다. 예를 들어, 갈락토스 공급 방법은 예컨대 약 50 리터 (50 L) 이하의 부피를 갖는 생산 규모 배양 뿐만 아니라 수백 또는 수천 리터의 부피를 가질 수 있는 반응기 규모 배양에 적용가능하다.

본 발명의 방법에 따라, 공급 배지 중의 갈락토스 농도는 바람직하게는 배양 방법 동안 배양물 또는 반응기에 지속 또는 유지된 수준의 D-갈락토스를 제공하는 양으로 제공된다. 공급 배지에 사용하기에 적합한 D-갈락토스의 양은 약 1 g/L 내지 약 50 g/L, 바람직하게는 약 3 g/L 내지 약 25 g/L, 더 바람직하게는 약 3 g/L 내지 약 20 g/L를 포함한다. 특이적 비제한적 예로서, 공급 배지 중의 12.5 g/L의 D-갈락토스가 본 발명의 배양 방법, 특히 예를 들어 50 L 반응기 규모에 적합하다. 추가로, (예컨대, 반응기 또는 배양 용기 중에) 세포를 배양하기 위해 사용되는 배양 배지 중의 잔여 갈락토스 농도가 배양 운행 전체 걸쳐 약 0.1-10 g/L, 바람직하게는, 약 0.1-5 g/L, 더 바람직하게는 약 0.2-5 g/L, 더 바람직하게는, 약 0.2-2.5 g/L, 더욱더 바람직하게는, 약 0.5-2 g/L, 가장 바람직하게는 약 0.5-1.0 g/L의 양으로 유지 및 지속되는 것이 바람직하다. 배양 배지 중의 갈락토스의 이들 잔여 농도는 갈락토스가 공급 배지를 통해 또는 일부 다른 방식으로 공급되든지 간에 적용된다.

세포 배양에 각종 공급 스케줄 또는 레지멘을 사용하여 D-갈락토스를 함유하는 공급 배지를 제공하여 시알릴화 유효 D-갈락토스 농도를 지속하고 당단백질의 시알릴화를 향상시키고 증가시키는 양으로 배양물 중에 D-갈락토스를 전달하고 유지한다. 일반적으로, 본 발명의 배양 방법은 세포 배양에 공급 배지 중의 D-갈락토스를 배양 운행 동안 1회 이상 공급하는 것을 포함한다. 배양 운행의 말미에 공급 배지에 의해 부여된 배양 부피가 전형적으로 원래 배양 부피의 대략 30-60％를 포함하는 것으로 이해된다.

세포 배양에 D-갈락토스를 매일, 또는 2일 마다, 예컨대 1일당 1회 미만으로 및 다양한 간격, 바람직하게는 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다 등을 포함하는 정기 간격에서 공급한다. 예를 들어, D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스-함유 공급 배지를 세포 배양물에 공급하는 것은 1일 당 1회, 1일 당 1회 이상, 또는 1일 당 1회 미만 수행될 수 있고, 총 배양 운행 동안 1, 2회 이상, 예컨대 3, 4, 5회 이상 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 세포에 D-갈락토스를 1회 이상 공급한다.

또한, 본 발명에는 예를 들어 배양물 내로의 D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스-함유 공급 배지의 연속 주입과 관련된 연속 공급 스케줄이 포함된다. 이러한 연속 공급 레지멘에서, 배양물에 바람직하게는 공급 배지 중의 D-갈락토스를 예를 들어 배양물에 대한 연속-공급 "점적", 또는 주입, 또는 다른 자동화 첨가로서 정기적으로, 조절된 방식으로, 및(또는) 프로그래밍된 방식으로 공급하여 배양물 중에 적절한 양의 갈락토스를 달성 및 유지한다. 배양 운행의 개시부터 세포 수확일까지의 배양 운행의 각각의 날에 D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 사용하는 1일 당 1회 볼루스 공급을 포함하는 공급 레지멘이 가장 바람직하다.

본 발명에 따라, 공급 배지 이외의 일부 방식으로 D-갈락토스를 세포 배양물에 임의의 상기 언급된 간격에서 공급할 수 있다. 비제한적 예로서, D-갈락토스를 공급 배지 이외의 배지 또는 배양 배지로 배양물에 공급할 수 있거나, 또는 D-갈락토스를 배양물에 물로 공급할 수 있다. 비제한적 예로서, 배양물에 D-갈락토스가 공급될 수 있고, 또한 공급 배지가 공급될 수 있는데, 즉 공급되는 조성물이 1종 이상일 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "공급"은 접종 후에 배양물로의 제조된 임의의 물질의 첨가를 나타낸다. 공급은 하나 이상의 첨가일 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "접종"은 출발 배지에 세포를 첨가하여 배양을 시작하는 것을 나타낸다.

본원에 사용되는 용어 "공급 배지" 및 "공급하는 배지"는 접종 후에 때때로 시작하는 배양물에 첨가하는 1종 이상의 영양물을 함유하는 배지를 나타낸다.

본원에 사용되는 용어 "기초 배지"는 세포를 첨가하여 배양을 시작하는 출발 배지를 나타낸다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 갈락토스, 예컨대 D-갈락토스를 배양 배지에 첨가하는 것을 포함하는 세포 배양 방법 또는 세포 배양에 의해 생산된 당단백질 생성물의 시알릴화 증가 방법을 포함한다. 관련 실시양태는 D-갈락토스가 생산 운행 기간 동안 배양물에 공급되고, 바람직하게는 공급 배지에 존재하는 세포 배양 방법과 관련된다. 바람직한 실시양태는 D-갈락토스를 함유하는 배지를 배양물에 매일 공급하는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 배양 운행 동안 1회 이상, 더 바람직하게는 매일 공급되는 본 발명의 방법에 의해 제공되는 바와 같이 배양물에서 세포에 대한 갈락토스의 이용가능성은 배양물 중의 제한 양의 갈락토스에 대한 잠재력을 극복하여 당단백질이 그 구조에 첨가되는 충분한 시알산 잔기를 형성함으로써 최종 생성물의 시알릴화를 증가시키고, 규모 확대 영향의 상기 문제를 역전시킨다.

본 발명에 따라, 단백질의 시알릴화는 D-갈락토스 공급 부재 하의 세포 배양 또는 배양 운행의 종료 전에 D-갈락토스의 공급이 중단되거나 또는 중지된 배양에 비해 세포 배양물에 D-갈락토스를 배양 운행 동안 공급하는 경우에 평균적으로 약 1.2 내지 1.5배 증가된다.

추가로 하기에 기재되는 바와 같이 가용성 CTLA4 당단백질 분자, 예컨대 CTLA4Ig, 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예컨대 L104EA29YIg를 생산하는 세포의 배양을 포함하는 바람직한 실시양태에서, 생산 운행 전체에 걸쳐 생성물의 높은 시알산 함량을 유지하기에 유효한 D-갈락토스의 농도가 공급 배지에 존재하였고, 세포 배양물에 매일 공급하였다 (실시예 2). 실례로, 공급 배지 중의 유효량의 D-갈락토스는 약 1 g/L 내지 약 50 g/L, 바람직하게는 약 3 g/L 내지 약 25 g/L, 더 바람직하게는 약 3 g/L 내지 약 20 g/L로 구성된다. 공급 배지 중에 약 12.5 g/L의 양인 D-갈락토스가 본 발명의 방법에 따른 대규모 배양 (예컨대, 50 L)에 사용하기에 특히 적합하다.

CTLA4Ig 당구조에 대한 D-갈락토스의 첨가를 생성물 시알릴화의 속도-제한 단계가 되도록 측정하였다. D-갈락토스 공급의 중단 또는 중지는 더 낮은 시알릴화된 CTLA4Ig 당단백질 생산물의 역전 및 형성을 유도하였다. 따라서, 매일 공급 배지 중의 D-갈락토스의 함유는 바람직하게는 생산 운행 전체에 걸쳐 유지되어 고품질의 완전히 시알릴화된 생성물을 달성 및 지속하였다.

CTLA4Ig를 생산하는 대규모 배양의 경우 공급 배지에 대한 D-갈락토스의 매일 첨가는 최종 생성물의 품질에 대한 관찰된 불리한 규모 영향의 역전을 달성하는 것으로 밝혀졌다. 더 구체적으로, 공급 배지 중의 D-갈락토스의 부재 하에, CTLA4Ig 당단백질의 시알릴화 정도는 반응기 규모 증가로 저하되었다. CTLA4Ig를 생산하는 대규모 배양에 대한 D-갈락토스의 매일 첨가는 반응기 규모에 독립적으로 대량의 고도로 시알릴화된 당단백질을 생산하였다.

갈락토스의 공급을 배양 운행 동안 온도 이동과 조합하는 것을 포함하는 배양 방법

본 발명의 다른 실시양태는 증가된 세포 생존력을 달성하고 생성물에 대한 생산기를 연장하고 생산물 뿐만 아니라 시알산 함량에 의해 측정되는 생성물의 품질을 증가시키는 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 세포 배양 프로세스 및 방법은 2002년 12월 23일 출원한 통상적으로 지정된 미국 특허 출원 제60/436,101호, 및 이와 동시에 출원한 동 제10/ 호에 개시되어 있으며, 이들 내용은 본원에 참고로 인용되고, 하기에 추가로 기재된다. 이러한 온도 이동 배양 방법은 본원에 기재된 갈락토스 공급 방법과 조합하여 편리하게 사용되어 고수준의 최종 생성물 품질 및 양을 얻을 수 있다.

본 발명의 온도 이동 배양 방법에 따라, 세포 배양 기간 동안 2 단계 이상의 온도 이동, 바람직하게는 하향 온도 이동의 조합은 온도 이동 없거나 또는 단지 단일 온도 이동과 관련된 배양 방법에 비해 배양 기간 말미에 세포에 의해 생산되는 단백질 생성물의 높은 양 및 품질을 가능하게 할 수 있다. 실례로, 실시예 5에 나타내는 바와 같이, 이중 또는 삼중 온도 이동을 갖는 배양 방법은 온도 이동 없거나 또는 단지 단일 온도 이동에 비해 배양 운행의 총 길이에 관계없이 단백질의 양 (예컨대, 최종 역가)을 증가시키는 것으로 나타났다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 정기적 다단계 온도 이동을 포유류 세포의 배양에 사용하여 목적하는 단백질 생산물, 특히 당단백질 생산물을 생산한다. 더 바람직하게는, 상기 세포는 재조합 생산된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 생산물을 생산한다. 그러나, 일부 경우에, 세포는 본 발명의 실행에 따라 수확 또는 회수될 수 있는 내인성 또는 천연 생성물을 활성적으로 생산 또는 과생산할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 배양 기간 동안 적절하게 정기적 간격에서 수행되는 2 단계 이상의 온도 이동, 바람직하게는 조절된 하향 온도 이동을 본 발명의 방법으로 사용하여 높은 단백질 수율과 동시에 높은 시알산 함량을 달성하였다.

본 발명의 세포 배양 방법 및 프로세스 (생산 또는 발효 운행으로도 칭해짐)에 따라, 배양 운행 동안 2 단계 이상의 온도 이동과 함께 배양된 세포는 운행 동안 높은 양 및 품질의 생성물을 생산할 수 있으며, 이는 운행 말미에서의 최종 역가 및 시알산 함량에 의해 측정된다. 본 발명의 방법과 관련된 높은 양 및 품질의 단백질 생산은 배양 운행이 약 10-14일 또는 14일 이상 총 운행 시간 동안 수행되든지 간에 관계없이 온도 이동 없거나 또는 기껏 단일 온도 이동이 사용되는 방법에 상대적으로 수득된다. 또한, 배양 방법 동안 2 단계 이상의 온도 이동의 결과로서, 세포는 실질적으로 표준 또는 초기 생산기를 연장시키는 기간 동안 배양물에서 유지될 수 있다. 표준 또는 초기 생산기는 전형적으로 약 6 내지 14일이다. 고품질 단백질의 증가된 생산, 뿐만 아니라 지속된 세포 생존력은 2 단계 이상의 온도 이동과 관련된 본 발명의 배양 방법의 연장된 생산기 동안 달성된다.

또한, 본 발명의 배양 방법에 따라, 세포는 약 10일 초과, 약 14일 초과, 약 21일 초과, 또는 약 28일 초과, 바람직하게는 약 14 내지 30일 이상의 총 운행 기간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 본 발명의 배양 운행에서, 전체 운행 길이는 제2 (또는 마지막) 온도 이동 직후 (예를 들어, 약 14일) 내지 약 21 내지 30일 이상, 바람직하게는 약 28일 이상 지속될 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 연장된 생산기는 본 발명의 세포 배양 방법을 포함하는 다중 온도 이동과 관련된다. 본 발명의 신규 세포 배양 방법에 따라, 제2, 제3, 또는 추가 온도 이동과 제1 온도 이동과의 조합은 배양 운행 기간 전체에 걸쳐 세포 배양이 높은 양 및 품질의 생성물을 생산하게 하고, 운행 및(또는) 연장된 생산기 전체에 걸쳐 배양 운행의 말미까지 배양이 높은 세포 생존력을 지속하게 한다. 연장된 생산기를 포함하는 배양 운행 동안, 단백질 생성물의 역가를 증가시키고, 시알산 함량으로 특성화되는 생성물 품질을 높게 존속하게 한다.

더욱 특히, 특이적 일 실시양태에서, 본 발명은 배양된 세포에 의해 단백질 생산의 초기 생산기를 연장시키는 세포 배양 방법 (즉, 약 6-14일을 포함하는 표준 생산기가 연장됨)을 포함한다. 본 발명에 따라 배양 운행에 2 단계 이상의 온도 이동을 사용함으로써, 약 14-21일에서의 연장된 생산기를 달성하였다. 배양 운행에서의 삼중 (또는 그 이상) 온도 이동으로 더 높은 수율의 고품질 (예컨대, 높은 시알산 함량)의 단백질 생성물과 함께 배양 운행을 약 21-28 또는 30일 이상 추가로 연장시켰다 (예컨대, 실시예 5).

따라서, 본 발명은 유리하게는 본 발명에 따른 2 단계 이상의 온도 이동 세포 배양 방법을 공급 배지에 대한 D-갈락토스의 첨가를 포함하는 공급 레지멘의 포함과 조합한다. D-갈락토스를 공급 배지 중의 성분으로서 포함함으로써, 생성물 시알릴화에서의 유의한 증가가 세포 배양 방법 전체에 걸쳐 발생하는 것으로 밝혀졌고, 고수준의 시알릴화된 단백질이 배양 운행의 말미에 생산되었다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 세포 배양 (또는 발효) 방법은 세포를 총 배양 운행 동안 3가지 상이한 온도에서 유지하는 2 단계 하향 온도 이동을 포함한다. 이 실시양태에서, 총 세포 배양 기간은 최종 단백질 생성물의 수득 (및 시알산 함량 측정) 전에 약 10일 초과, 더 구체적으로 약 14 내지 28일 이상, 즉, 약 2 내지 3주 이상을 지속한다. 예를 들어, 이러한 2 단계 방법에서, 세포를 약 36 ℃ 내지 38 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 또는 그 주변의 제1 온도에서 0일 내지 약 6일의 초기 배양 기간 동안 유지한다. 따라서, 약 5 내지 7일, 바람직하게는 6 내지 약 10일 동안, 배양 온도를 약 33 ℃ 내지 35 ℃, 바람직하게는 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 유지한다. 34 ℃ 또는 그 주변에서의 세포 배양 후에, 제2 시간 (제2 T-이동)의 온도를 약 31 ℃ 내지 33 ℃, 바람직하게는 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도로 이동시켰다. 제2 T-이동은 또는 약 6일 내지 약 14일, 바람직하게는 약 10일 내지 약 14일, 더 바람직하게는 10일 또는 그 주변에서 수행되며, 이는 각종 실시양태에서 표준 생산기, 성장기 동안, 또는 사멸기 동안일 수 있다. 바람직하게는, 제1 및 제2 온도 이동 간에 대략 4일 증가, 더 바람직하게는 4일 증가가 있다. 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 총 배양 운행의 말미, 예컨대 약 10일 초과, 더 구체적으로 약 12-18일 동안, 또는 약 14-18일, 또는 약 14-28일 또는 30일 이상까지 유지된다. 배양 방법의 말미에서, 생성물을 배양 배지 내로 유리하는 경우에 단백질 생성물을 전형적으로 예를 들어 배양 상청액으로부터 단리하고(거나) 정제한다.

또는, 본 발명의 다중 온도 이동 배양 방법에서, 온도는 배양기에 기초하여 먼저 더 낮아질 수 있다. 제1 온도 이동은 바람직하게는 사멸기의 개시 전에 수행한다. 일 실시양태에서, 온도는 느린 세포 성장과 동시에 먼저 더 낮아질 수 있다. 세포가 기하급수적 성장기에 더 이상 있지 않고, 배양이 정지기, 예를 들어 배양 약 6일 또는 그 주변인 경우에, 예를 들어 온도를 37 ℃ 또는 그 주변에서 34 ℃ 또는 그 주변으로 이동시킨다. 이 때에, 생존가능한 세포 농도는 단백질 생산, 바람직하게는 향산된 단백질 생산에 대한 적합한 세포 밀도, 예를 들어 약 2-12 x 10⁶ 세포/mL, 예컨대 2-9 x 10⁶ 세포/mL, 3-7 x 10⁶ 세포/mL, 4-5 x 10⁶ 세포/mL, 3-4 x 10⁶ 세포/mL, 2-4 x 10⁶ 세포/mL, 4-6 x 10⁶ 세포/mL, 6-8 x 10⁶ 세포/mL, 8-10 x 10⁶ 세포/mL, 또는 10-12 x 10⁶ 세포/mL에 도달하였다. 이론에 얽매이지 않고, 느린 세포 성장이 세포 배양 배지의 영양물 및(또는) 특정 성분의 고갈, 예컨대, 배지 중의 질소 제한과 상관 관계가 있을 수 있다.

또다른 실시양태에서, 온도의 제1 이동은 성장기 동안, 예를 들어 생존가능한 세포 농도가 약 2-12 x 10⁶ 세포/mL, 예컨대 2-9 x 10⁶ 세포/mL, 3-7 x 10⁶ 세포/mL, 4-5 x 10⁶ 세포/mL, 3-4 x 10⁶ 세포/mL, 2-4 x 10⁶ 세포/mL, 4-6 x 10⁶ 세포/mL, 6-8 x 10⁶ 세포/mL, 8-10 x 10⁶ 세포/mL, 또는 10-12 x 10⁶ 세포/mL인 때에 수행된다.

2-단계 온도 이동 배양 방법을 포함하는 또다른 특정 실시양태에서, 배양 온도를 37 ℃ 또는 그 주변에서 0일 내지 6일 유지하고; 약 6일 내지 약 10일 동안, 배양 온도를 34 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 10일 내지 약 14일 동안, 배양 온도를 32 ℃ 또는 그 주변에서 유지하는 14일 운행 동안 세포를 배양한다. 또다른 실시양태로서, 배양 온도를 37 ℃ 또는 그 주변에서 0일 내지 약 6일 유지하고; 약 6일 내지 약 10일 동안, 배양 온도를 34 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 10일 내지 약 21일 동안, 배양 온도를 32 ℃ 또는 그 주변에서 유지하는 약 21일 기간 동안 세포를 배양한다. 또다른 실시양태로서, 배양 온도를 37 ℃ 또는 그 주변에서 0일 내지 약 6일 유지하고; 약 6일 내지 약 10일 동안, 배양 온도를 34 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 10일 내지 약 28일 동안, 배양 온도를 32 ℃ 또는 그 주변에서 유지하는 약 28일 기간 동안 세포를 배양한다.

본 발명은 또한 세포 배양 방법이 삼중 이상 온도 이동을 포함하는 실시양태를 포함한다. 3-단계 온도 이동 배양 방법을 포함하는 일 실시양태에서, 세포를 약 36 ℃ 내지 38 ℃, 바람직하게는, 37 ℃ 또는 그 주변에서의 제1 온도에서 약 6일 동안 초기에 배양하고; 이후, 배양 온도를 약 33 ℃ 내지 35 ℃, 바람직하게는, 34 ℃ 또는 그 주변으로 주어진 기간 동안 이동 및 유지하고; 이후에 약 31 ℃ 내지 33 ℃, 바람직하게는, 32 ℃ 또는 그 주변에서의 온도로의 제2 이동을 수행한다. 32 ℃ 또는 그 주변에서의 배양 기간 후에 약 29 ℃ 내지 31 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 또는 그 주변에서의 온도로의 제3 온도 이동을 수행하고; 온도를 이어서 30 ℃ 또는 그 주변에서 운행의 말미까지 유지한다.

다른 실시양태에서, 배양 방법의 제3 온도 이동 이후에 추가 온도 이동, 바람직하게는 하향 온도 이동을 수행할 수 있다. 예를 들어, 제4 온도 이동을 제3 이동 후 15-20일 또는 그 주변에, 바람직하게는 배양 개시로부터 약 18일째에 수행할 수 있다. 제4 하향 이동은 배양 온도를 28 ℃ 내지 29 ℃ 또는 그 주변에서, 바람직하게는 약 29 ℃에서 유지하고, 배양 운행을 약 28일 초과, 예컨대 약 28-32일 이상으로 증가시키며, 이 때에 생성물을 수득한다.

본 발명에 따른 2 단계 온도 이동 배양 운행 과정에서와 같이, 본 발명의 다중 온도 이동 방법에서 온도의 제1 이동은 세포가 실질적으로 성장을 중지하고, 정지기 또는 대략 정지기인 때에 수행될 수 있다. 실례로, 온도 이동은 생존가능한 세포 농도가 약 2-12 x 10⁶ 세포/mL, 예컨대 2-9 x 10⁶ 세포/mL, 3-7 x 10⁶ 세포/mL, 4-5 x 10⁶ 세포/mL, 3-4 x 10⁶ 세포/mL, 2-4 x 10⁶ 세포/mL, 4-6 x 10⁶ 세포/mL, 6-8 x 10⁶ 세포/mL, 8-10 x 10⁶ 세포/mL, 또는 10-12 x 10⁶ 세포/mL인 때에 수행된다. 또는, 온도의 제1 이동은 성장기 동안, 예를 들어 생존가능한 세포 농도가 약 2-12 x 10⁶ 세포/mL, 예컨대 2-9 x 10⁶ 세포/mL, 3-7 x 10⁶ 세포/mL, 4-5 x 10⁶ 세포/mL, 3-4 x 10⁶ 세포/mL, 2-4 x 10⁶ 세포/mL, 4-6 x 10⁶ 세포/mL, 6-8 x 10⁶ 세포/mL, 8-10 x 10⁶ 세포/mL, 또는 10-12 x 10⁶ 세포/mL인 때에 수행된다.

바람직한 실시양태에서, 다단계 세포 배양 방법은 약 3 내지 4주, 예컨대, 21-30일 이상, 바람직하게는 28일 이상의 배양 기간 동안 3가지 정기적 조절 온도 이동을 포함하며, 이는 배양의 세포에 의한 생성물의 연장된 생산을 제공한다. 실례로서, 3-단계 온도 이동 방법은 0 내지 약 6일, 바람직하게는 6일의 초기 배양 기간을 포함하며, 이 기간 동안 세포를 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 배양한다. 약 6일 내지 약 10일 동안, 세포를 34 ℃ 또는 그 주변에서 배양한다. 약 10일 내지 약 14일 동안, 배양 온도를 32 ℃ 또는 그 주변에서 유지하고; 약 14일에서 이후에서, 즉 약 21일 내지 약 30 이상까지, 또는 운행 종료까지, 배양 온도를 30 ℃ 또는 그 주변에서 유지한다. 따라서, 본 발명의 3-단계 온도 이동 배양 방법에서, 생산기를 또한 연장시켜 단지 단일 온도 이동 또는 온도 이동 없는 약 6 내지 14일의 표준 생산기에 비해 더 높은 최종 역가의 단백질 및 더 높은 세포 생존력을 약 14일 초과 동안 얻을 수 있다. 유리하게, 생산기 및 세포 생존력을 3-단계 T-이동 방법으로, 즉 약 3주 이상까지 생산물의 고품질의 달성 (시알산 함량으로 측정됨)과 함께 추가로 연장할 수 있다.

본 발명의 각종 실시양태에서, 32 ℃ 또는 그 주변으로의 제2 온도 이동은 더 높은 양 및 품질의 단백질을 배양 운행의 말미에 가능하게 하고, 또한 약 2주 이상 동안 지속될 수 있는 운행 동안 연장된 단백질 생산과 관계된다. 온도의 2 단계 이상 이동은 배양물이 배양의 이전 2주 동안 수행될 수 있는 세포 생존력의 저속 저하를 안정하게 한다. 약 2주 또는 그 부근에서 정기적인 32 ℃ 또는 그 주변에서, 30 ℃ 또는 그 주변에서의 또다른 온도 이동은 생산기의 추가 연장을 제공하여 세포 배양의 생산기를 배양 운행의 말미, 예컨대 약 21일 내지 30일 이상으로 연장시키는 동시에, 생성된 생성물의 품질 (시알릴화로 측정됨)의 손상 없이 세포 생존력을 유지한다 (실시예 5, 표 2 및 3 참조). 추가 온도 이동은 이중 및 삼중 온도 이동 운행보다 더 세포 생산을 연장할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 배양이 정지기인 때에 세포 배양의 온도를 저하시키고, 세포를 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 배양하는 것; 및 약 6일 내지 14일, 예컨대, 배양 개시로부터 10일 또는 그 부근에서 배양 기간의 말미까지의 표준 생산기 동안 세포 배양의 온도를 다시 저하시키고, 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 배양하는 것을 포함하는, 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 (i) 세포 배양 방법, (ii) 바람직하게는 증가된 세포 생존력과 관련된 단백질 생산의 증가 방법, (iii) 단백질 생산물의 시알릴화 향상 방법, (iv) 세포 생존력의 향상 방법, 또는 (v) 단백질 생산의 연장 방법에 관한 것이다. 본원에 나타낸 바와 같이, 배양 기간은 10일 초과, 14일 초과, 21일 초과, 또는 28-30일 초과의 총 운행 시간을 포함한다. 세포를 32 ℃에서 배양한 후에, 즉, 배양 운행의 말미에, 생산된 단백질 생산물, 바람직하게는 당단백질을 수득한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 약 5일 내지 7일째에 시작하여 세포 배양의 온도를 저하시키고, 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 배양하는 것; 및 약 6일 내지 14일, 예컨대, 배양 개시로부터 10일 또는 그 부근에서 시작하여 배양 기간의 종료까지 세포 배양의 온도를 다시 저하시키고, 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 배양하는 것을 포함하는, 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 (i) 세포 배양 방법, (ii) 바람직하게는 증가된 세포 생존력과 관련된 단백질 생산의 증가 방법, (iii) 단백질 생산물의 시알릴화 향상 방법, (iv) 세포 생존력의 향상 방법, 또는 (v) 단백질 생산의 연장 방법에 관한 것이다. 본원에 나타낸 바와 같이, 배양 기간은 10일 초과, 14일 초과, 21일 초과, 또는 28-30일 초과의 총 운행 시간을 포함할 수 있다. 세포를 32 ℃에서 배양한 후에, 즉, 배양 운행의 말미에, 생산된 단백질 생산물, 바람직하게는 당단백질을 수득한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 배양 개시로부터 14일 또는 그 부근에서 배양 방법의 말미까지 32 ℃ 또는 그 주변에서 30 ℃ 또는 그 주변으로의 또다른 온도 하향이동에 의해 표준 생산기를 상당히 초과하게 배양 기간을 연장시키는 것을 추가로 포함하는 배양 방법을 제공한다. 배양 방법 동안 단백질 생산 뿐만 아니라 세포 생존력을 추가로 연장시키기 위해, 상기 방법은 배양 개시로부터 약 15 내지 19일 또는 그 부근에서, 바람직하게는 18일부터, 배양 방법의 말미까지 30 ℃ 또는 그 주변에서 29 ℃ 또는 그 주변으로의 제4 온도 하향이동을 포함할 수 있다.

본 발명의 온도 이동은 전형적으로 배양의 성장기의 전후일 수 있는 배양 기간의 6일 또는 그 부근이고, 그 이후에 대략 4일 증가, 바람직하게는 4일 증가에서 이다. 일부 실시양태에서, 온도의 이동 시기는 표준 생산기의 초기 (예컨대, 6일 또는 그 부근), 중기 (예컨대, 10일 또는 그 부근) 및 말기 (예컨대, 14일 또는 그 부근에서)에 근접할 수 있다. 생산된 당단백질의 최종 역가 및 시알산 함량이 다단계 (예컨대, 2 단계, 3 단계 이상) 온도 이동 프로파일의 사용에 의해 향상되는 본 발명에 따른 배양 프로세스 또는 방법에서, 2 단계 이상의 정기적 온도 이동의 조합은 총 배양 운행이 생산물의 최종 역가 및 시알릴화의 손해없이 10일 초과, 14일 초과, 21일 초과, 또는 28 초과 이상 동안 수행되도록 하게 한다.

본 발명의 배양 방법에 따라, 2 단계 이상의 온도 이동은 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하지 않는 동일한 기간 동안 수행되는 운행에 비해 배양의 높은 세포 생존력을 지속하고, 배양 운행에서 생산되는 단백질의 역가 및 품질을 더 높게 할 수 있다. 또한, 2 단계 이상의 온도 이동은 표준 생산기 및(또는) 온도 이동 없거나 또는 단지 단일 온도 이동을 갖는 배양의 생산보다 배양의 생산기를 연장시킬 수 있다. 이러한 다단계 온도 이동, 예컨대 2 단계 이상의 온도 이동은 세포 배양 방법에서 단백질 생성물의 생산에서의 역가 ("최종 역가")와 시알산 함량 간의 일반적 균형화를 최소화시킬 수 있다. 따라서, 온도 이동은 단백질 생산 방법에 대해 개선하는 "최종 역가 x "최종 시알산"의 수리적 생성물의 향상에 긍정적 효과를 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 2 단계 이상의 온도 이동 단계를 포함하고, 세포에 D-갈락토스, 바람직하게는 D-갈락토스를 함유하도록 보충한 배지를 지속되는 농도로 바람직하게는 매일 공급하여 배양 운행의 말미에 당단백질 생성물의 시알릴화를 증가시키는 것을 포함하는, 주어진 단백질, 당단백질 생산물의 시알릴화의 증가 및 향상과 함께 하는 (i) 세포 배양 방법, (ii)단백질 생산의 증가 방법, 또는 (iii) 세포 생존력의 향상 방법에 관한 것이다. ^**

단백질을 생산하기 위한 세포 배양 방법은 목적하는 단백질을 세포 배양에서 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 세포 배양에서 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 숙주 세포를 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 배양하는 것; 세포를 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 배양하는 것; 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 배양하는 것; 및 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다.

2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 세포 배양 방법의 본 발명에 따른 추가 실시양태

본 발명의 일 실시양태에 목적하는 단백질을 37 ℃ 또는 그 주변의 제1 온도에서 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 시간 동안 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 다중 온도 이동 배양 방법이 포함된다. 세포 성장 기간 후에, 세포 성장이 늦추어지고 대략 정지기가 되는 때에 세포를 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 배양한다. 따라서, 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 배양의 표준 생산기 동안, 즉 6일 또는 그 부근에서 14일 또는 그 부근까지 배양한다. 세포에 매일 영양공급한다. 배양 방법의 말미에, 생산된 단백질 생성물을 수득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 여러 시기, 즉 세포를 37 ℃ 또는 그 주변의 제1 온도에서 배양하는 성장기; 세포를 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도 및 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 배양하여 연장된 단백질 생산기를 제공하며, 이는 30 ℃ 또는 그 주변의 제4 온도, 및 임의로 이후 추가되는 더 낮은 온도, 예컨대 29 ℃ 또는 그 주변을 포함할 수 있는 초기 또는 표준 생산기를 포함하는 회분식-공급 방법에서 세포를 배양한다. 본 발명의 2 단계 이상 온도 이동 운행의 경우에, 단백질 생산의 연장은 온도의 2 단계 이상 하향 이동과 관련된다. 상기 배양에 바람직하게는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 매일 또는 연속식으로 공급한다. 본원에 기재된 바와 같이, 연장된 생산기는 제1 온도를 37 ℃ 또는 그 주변에서 34 ℃ 또는 그 주변으로 바꾼 후에 상이한 간격에서 2회 이상 배양 온도의 연속 저하를 포함한다. 온도 이동 없거나 또는 단지 단일 온도 이동에 상대적으로, 2 단계 이상 하향 온도 이동을 포함하는 이들 방법을 배양 운행 동안 수행함으로써 단백질 생산은 증가되고, 높은 생성물 품질 (최종 생성물의 시알산 함량에 의해 측정된)이 달성된다.

세포가 기하급수적 세포 성장 또는 대수기의 이 기간에서 전형적으로 빠르게 분할하기 때문에 세포 배양의 성장기, 예컨대 0일 내지 약 6일 동안, 배양물 중의 세포 밀도는 증가된다. 본 발명의 일부 측면으로 나타나는 비-성장 관련 세포 배양 및 단백질 생산 방법에서는, 비-유의한 양의 단백질 생성물은 세포 성장이 적절한 성장 조건 하에 실질적으로 최대화되는 성장기 동안 생산된다. 따라서, 배양물에서 영양물 제한의 결과로서, 세포는 전형적으로 약 4 내지 6일째에 신속한 세포 성장이 안정하고(거나) 저하되는 정지기를 통과한다. 이들 배양 방법에서, 단백질 생산기는 세포 성장이 실질적으로 종료되는 때 (예컨대, 약 6일 내지 약 10일)에 시작된다 (실시예 4).

바람직한 실시양태의 배양 방법에 따라, 세포가 약 6일째에 정지기에 도달하는 때에, 온도를 37 ℃ 또는 그 주변에서 34 ℃ 또는 그 주변으로 하향 이동시킨다. 이후에, 제1 온도 이동 (약 6일)과 연장된 생산기의 개시 (약 14일) 간의 중간 부근에서, 배양물 온도를 다시 34 ℃ 또는 그 주변에서 32 ℃ 또는 그 주변으로 저하시킨다. 제2 온도 이동은 배양물이 전형적으로 약 14일까지 서서히 저하되는 세포 생존력을 안정화시키게 하고, 이후에 생산기의 연장이 시작된다 (약 14일에서 약 21일 내지 30일 이상으로, 바람직하게는 약 21일 내지 28일 이상으로). 상기 기재한 바와 같이, 예컨대 제3, 제4 이상과 같은 다른 온도 이동을 배양 운행의 연장된 생산기 동안 사용할 수 있다.

다가음이온성 화합물의 지연된 첨가와 조합한 갈락토스의 공급을 포함하는 배양 방법

본 발명의 다른 실시양태는 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 세포 배양 방법에 관련된다. 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 세포 배양 방법은 본원과 같이 출원한 통상적으로 지정된 미국 특허 출원 제10/ 호에 개시되어 있으며, 이들 내용은 본원에 참고로 인용되고, 하기에 추가로 기재된다. 이러한 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가는 본원에 기재된 갈락토스 공급 방법과 조합하여 사용될 수 있다.

제공되는 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 본 발명의 실시양태에 따라, 상기 방법은 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함한다. 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가는 다가음이온성 화합물의 첨가 부재 하에 관찰되거나 또는 다가음이온성 화합물이 접종시에 첨가되는 경우에 관찰되는 것에 비해 증가된 세포 생존력을 달성한다.

따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명을 수행하는 경우에, 세포 배양물의 세포 생존율이 증가한다는 것을 밝혀냈다 (실시예 8 참조). 세포 생존력으로서도 공지된 세포 생존율은 세포의 총수에서 생존가능한 세포의 백분율이다. 상기 조건, 예컨대 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가는 배양물의 세포 생존력이 상기 조건의 부재 하보다 상기 조건의 존재 하의 기간 동안 더 높은 경우에 세포 생존력을 증가시킨다 .

따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 배양물 중의 세포 생존력의 증가 방법에 관한 것이며, 여기서 세포 배양의 세포 생존력은 증가된다.

다가음이온성 화합물에는 덱스트란 술페이트 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 입수가능함), 헤파린 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 헤파란 술페이트 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 만난 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 데르마탄 술페이트 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 케라탄 술페이트 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 히알루로네이트 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 폴리(비닐 술페이트) (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 카파-카라게난 (시그마-알드리치로부터 입수가능함), 및 수라민 (시그마-알드리치로부터 입수가능함)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 상기 화합물은 열거된 공급원으로부터 용이하게 입수가능하거나, 또는 당업자에게 공지된 수단을 통해 용이하게 수득가능하다. 이들 화합물은 나트륨 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 염의 형태로 종종 입수가능하지만, 비-염 형태로 사용될 수도 있다. 다가음이온성 화합물에는 나트륨 염과 같은 염 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그의 모든 형태가 포함된다.

바람직한 다가음이온성 화합물에는 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 펜토산 술페이트, 크실로푸라난 술페이트, 쿠르들란 술페이트, 쿠르들란 갈락토스 술페이트, 쿠르들란 아라비노스 술페이트, 만난 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 폴리(비닐 술페이트), 카파-카라게난, 및 수라민을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리술페이트화된 화합물이 포함된다. 덱스트란 술페이트가 가장 바람직하다. 덱스트란 술페이트의 평균 분자량은 5,000 내지 500,000 Da일 수 있다. 덱스트란 술페이트의 분자량은 5,000 Da이 바람직하다.

본 발명에 따라, 다가음이온성 화합물을 접종 후 시간에 첨가하는데, 즉 다가음이온성 화합물이 기초 배지 중에 및 접종시에는 존재하지 않는다. 바람직하게는, 다가음이온성 화합물을 배양 1일 이후에 첨가한다. 접종을 0일에 수행하다.

본 발명에 따라, 다가음이온성 화합물을 특정 기간 동안 (예컨대, 접종 후 시간에) 세포 배양물에 1, 2, 3회 또는 임의의 회수 첨가할 수 있다. 1종 이상의 다가음이온성 화합물을 함께 사용할 수 있다. 즉, 다가음이온성 화합물의 임의의 주어진 단일 첨가는 하나 이상의 다른 다가음이온성 화합물의 첨가를 포함할 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 다가음이온성 화합물의 첨가가 있는 경우에, 상이한 다가음이온성 화합물을 상이한 첨가 때에 첨가할 수 있다. 다가음이온성 화합물을 포함하는 추가 화합물 및 물질을 다가음이온성 화합물의 첨가 전후 또는 함께 (특정 기간 동안 또는 그 동안이 아닌 때에) 배양물에 첨가할 수 있다. 바람직한 실시양태에는, 다가음이온성 화합물의 단일, 즉 1회 첨가가 있다. 바람직한 실시양태에서는, 1종의 다가음이온성 화합물을 첨가한다.

본 발명에 따라, 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 임의의 수단으로 첨가할 수 있다. 다가음이온성 화합물의 첨가 수단에는 물, 배양 배지, 공급 배지, 적합한 배지 중의 용해로, 및 수득되는 형태로의 첨가가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 다가음이온성 화합물을 물 중에 용해하여 첨가한다.

본 발명에 따라, 다가음이온성 화합물을 첨가하여 배양물 중의 농도를 적절한 수준으로 얻는다. 비제한적 예로서, 다가음이온성 화합물을 1 내지 1000 mg/L, 1 내지 200 mg/L, 1 내지 100 mg/L, 또는 25 내지 75 mg/L의 농도로 첨가한다. 바람직하게는 다가음이온성 화합물을 25 내지 200 mg/L 또는 25 내지 100 mg/L, 더 바람직하게는 약 50 내지 100 mg/L 또는 50 내지 100 mg/L, 더 바람직하게는 약 50 mg/L 또는 약 100 mg/L, 가장 바람직하게는 50mg/L 또는 100 mg/L의 농도로 첨가한다.

본 발명에 따라, 배양을 다가음이온성 화합물의 첨가 후에 임의의 시간 동안 운행할 수 있다. 배양 운행 시간은 관련 인자, 예컨대 회수가능한 단백질의 양 및 품질, 및 세포 융해로부터 생성된 상청액 중의 오염 세포 종 (예컨대, 단백질 및 DNA)의 수준을 기초로 하여 당업자에 의해 결정할 수 있으며, 이는 목적하는 단백질의 회수를 복잡하게 할 것이다.

본 발명의 세포 배양 방법 및 세포 생존력 증가 방법의 특정 실시양태에서, 다가음이온성 화합물을 초기 사멸기의 개시 전인 접종 후 시간에 첨가한다. 바람직하게는, 다가음이온성 화합물을 초기 성장기 동안인 접종 후 시간에 첨가한다. 더 바람직하게는, 다가음이온성 화합물을 초기 성장기의 제2 절반기간 동안 첨가한다. 더 바람직하게는, 다가음이온성 화합물을 초기 성장기의 말미 또는 그의 주변에서 첨가한다.

초기 성장기는 다가음이온성 화합물의 특정 첨가 부재 하에 관찰되는 성장기를 나타낸다. 초기 사멸기는 다가음이온성 화합물의 특정 첨가 부재 하에 관찰되는 사멸기를 나타낸다.

초기 성장기는 초기 사멸기의 개시 시에 종료될 수 있거나, 또는 초기 성장기와 초기 사멸기 간에 임의의 길이의 정지기가 있을 수 있다.

특정 실시양태에서, 초기 성장기가 0일 내지 6일이고 초기 사멸기가 7일째에 시작하는 세포 배양에서, 특정 실시양태에서는 다가음이온성 화합물을 접종 후 및 7일 전에 첨가한다. 특정 실시양태에서, 다가음이온성 화합물을 접종 후 및 6일까지에 첨가한다. 특정 실시양태에서, 다가음이온성 화합물을 1 내지 6일에 첨가한다. 또다른 특정 실시양태에서, 다가음이온성 화합물을 4, 5 또는 6일째에 첨가한다. 다른 특정 실시양태에서, 다가음이온성 화합물을 6일 또는 그 부근에 첨가한다.

다가음이온성 화합물을 접종 후 시간 및 초기 사멸기의 개시 전에 첨가하는 경우에, 성장기를 초기 성장기 초과하여 연장시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다 (실시예 8 및 12 참조). 초기 성장기 초과하여 연장시킨 성장기는 초기 성장기, 즉 다가음이온성 화합물의 첨가 부재 하에 관찰된 성장기보다 더 길게 지속된다. 바람직하게는, 초기 성장기 동안 얻는 생존가능한 세포 밀도의 피크보다 연장된 성장기 동안 더 높은 피크의 생존가능한 세포 밀도가 관찰되었다.

따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 사멸기의 개시 전인 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 성장기 연장 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 성장기는 연장된다. 더 특정한 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 성장기 동안인 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 성장기 연장 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 성장기는 연장된다. 더 특정한 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 성장기의 제2 절반기간 동안 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 성장기 연장 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 성장기는 연장된다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 성장기의 말미 또는 그의 주변에서 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 성장기 연장 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 성장기는 연장된다.

성장기를 초기 성장기 초과한 임의의 기간 동안 연장할 수 있다. 단지 예로서, 성장기를 1 내지 10일, 2 내지 9일, 3 내지 8일, 또는 약 5일 동안 연장할 수 있다. 바람직하게는, 성장기를 1일 이상, 더 바람직하게는 2일 이상, 더 바람직하게는 3일 이상, 가장 바람직하게는 4일 이상 동안 연장시킨다. 예를 들어, 실시예 6에서 성장기는 11일까지 연장되었으며, 초기 성장기가 6일까지였다. 따라서, 실시예 8에서는 성장기가 초기 성장기 5일 초과 동안 연장되었다. 연장된 성장기를 사멸기 또는 정지기까지 지속시킬 수 있다. 마찬가지로, 초기 성장기를 사멸기 또는 정지기까지 지속시킬 수 있다.

다가음이온성 화합물을 접종 후 및 초기 사멸기의 개시 전에 첨가하는 경우에, 사멸기의 개시를 초기 사멸기의 개시 즉, 다가음이온성 화합물의 첨가 부재 하에 관찰된 사멸기의 개시 초과하여 지연시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다 (실시예 8 및 12 참조). 개시가 지연된 사멸기는 초기 사멸기보다 늦은 시간에 시작된다.

따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 사멸기의 개시 전인 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 사멸기 지연 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 사멸기의 개시는 지연된다. 더 특정한 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 성장기 동안인 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 사멸기 지연 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 사멸기의 개시는 지연된다. 더 특정한 실시양태에서 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 성장기의 제2 절반기간 동안 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 사멸기 지연 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 사멸기의 개시는 지연된다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 성장기의 말미 또는 그의 주변에서 첨가하는 것을 포함하는 세포 배양물의 사멸기 지연 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 사멸기의 개시는 지연된다.

사멸기의 개시를 임의의 기간 동안 지연시킬 수 있다. 단지 예로서, 사멸기의 개시를 1 내지 10일, 2 내지 9일, 3 내지 8일, 또는 약 5일 동안 지연시킬 수 있다. 바람직하게는, 사멸기의 개시를 1일 이상, 더 바람직하게는 2일 이상, 더 바람직하게는 3일 이상, 가장 바람직하게는 4일 이상 동안 지연시킨다. 상기 기재한 본 발명의 세포 배양 방법 및 세포 생존력 증가 방법의 또다른 특정 실시양태에서, 다가음이온성 화합물을 초기 사멸기 동안인 접종 후 시간에 첨가한다.

다가음이온성 화합물을 초기 사멸기 동안에 첨가하는 경우에, 사멸기를 정지시킬수 있다는 것을 밝혀냈다 (실시예 9 및 10 참조). 정지 사멸기의 정지라는 것은 일부 기간 동안 다가음이온성 화합물의 첨가 부재 하에 관찰되는 생존가능한 세포 밀도의 저하를 정지시키는 것을 의미한다. 정지는 다가음이온성 화합물의 첨가 직후에 또는 이후에 발생할 수 있다. 사멸기가 정지되는 경우에, 이어지는 것은 성장기 또는 정지기일 수 있다. 최종적으로, 물론, 배양물은 다시 사멸기를 통과할 것이다.

따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 초기 사멸기 동안에 첨가하는 것을 포함하는 (1) 세포 배양 방법, 및 (2) 세포 배양물의 사멸기 정지 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 사멸기는 정지된다.

사멸기를 사멸기가 재-통과되기 전의 임의의 기간 동안 정지시킬 수 있다. 단지 예로서, 사멸기를 1 내지 20일, 2 내지 18일, 5 내지 15일, 또는 8 내지 13일 동안 정지시킬 수 있다. 바람직하게는, 사멸기를 1일 이상, 더 바람직하게는 2일 이상, 더 바람직하게는 3일 이상, 가장 바람직하게는 4일 이상 동안 정지시킨다. 사멸기 정지의 연속을 필수적으로 함축하지는 않는데, 즉 일정하거나 또는 증가하는 생존가능한 세포 밀도의 2개의 범위 간의 생존가능한 세포 밀도 프로파일이 "국소적으로" 감소될 수 있다.

세포 배양 방법, 특히 비-연속 방법의 운행 시간은 사멸기 동안 감소하는 생존가능한 세포 밀도의 존속에 의해 보통 제한된다. 더 긴 운행 시간은 달성되는 생성물 역가를 더 높게 할 수 있다. 따라서, 성장기의 연장을 포함하는 사멸기의 가능한 긴 지연 또는 정지가 바람직하다. 생성물 품질 관심사는 또한 세포 사멸이 발현된 단백질의 시알산 함량을 감소시킬 수 있는 시알리다제를 배양 상청액으로 유리할 수 있기 때문에 사멸기의 지연 또는 정지에 대한 연구의욕을 제공한다. 단백질 정제 관심사도 사멸기의 지연 또는 정지에 대한 또다른 연구의욕을 제공한다. 배양물에서 세포 파편의 존재 및 사멸 세포의 함량은 배양 운행 말미에서 단백질 생성물의 단리능 및(또는) 정제능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다.

특정 실시양태에서, 2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 본원에 기재된 임의의 세포 배양 방법 및 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 본원에 기재된 임의의 세포 배양 방법을 세포 배양에 함께 사용한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 목적하는 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; b) 세포 배양의 온도를 저하시키고, 세포를 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 약 5일 내지 7일에 배양하는 것; (c) 세포 배양의 온도를 다시 저하시키고, 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 약 6일 내지 14일에 배양하는 것; 및 (d) 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 (i) 세포 배양 방법, 및 (ii) 세포 생존력의 증가 방법에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가 및 추가로 세포에 대한 D-갈락토스의 공급을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가, 상기 2 단계 이상의 온도 이동 및 세포에 대한 D-갈락토스의 공급을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양물에서 목적하는 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다. 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양물에서 목적하는 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 37 ℃ 또는 그 주변의 온도에서 숙주 세포를 배양하는 것; 세포를 34 ℃ 또는 그 주변의 제2 온도에서 배양하는 것; 세포를 32 ℃ 또는 그 주변의 제3 온도에서 배양하는 것; 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것; 및 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 접종 후 시간에 첨가하는 것을 포함하는, 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다.

당단백질 정제 및 분석과 관련된 기술 및 과정

본 발명에 의해 포함되는 배양 방법에서, 총 세포 배양 기간의 말미에 당업계에 공지되고 실행되는 단리 및 정제 방법을 이용하여 세포에 의해 생산되는 단백질을 필요에 따라 전형적으로 수집, 회수, 단리, 및(또는) 정제, 또는 실질적으로 정제한다. 바람직하게는, 배양된 세포로부터 유리되는 당단백질을 배양 배지 또는 상청액으로부터 단리하지만; 당업계에 공지되고 실행되는 방법을 추가로 하기 기재된 바와 같이 이용하여 단백질을 숙주 세포, 예컨대 세포 융해물로부터 회수될 수도 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산되는 당단백질을 포함하는 복합체 탄수화물을 필요에 따라 탄수화물 분석의 통상적 기술에 의해 일상적으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 공지된 기술, 예컨대 렉틴 블로팅은 말단 만노스 또는 다른 당, 예컨대 갈락토스의 비율을 나타낸다. 시알산에 의한 모노-, 비-, 트리-, 또는 테트라-안테나리 올리고당의 종결은 무수 히드라진 또는 효소 방법을 사용하는 단백질로부터의 당의 유리 및 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 당업계에 잘 공지된 기타 방법에 의한 올리고당의 분획화에 의해 확인할 수 있다.

당단백질의 pI는 시알산을 제거하는 뉴라미니다제 처리 전 및 후에 측정할 수도 있다. 뉴라미니다제 처리 후의 pI에서의 증가는 당단백질 상의 시알산의 존재를 나타낸다. 탄수화물 구조는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합 탄수화물로서 발현된 단백질 상에서 발생된다. N-결합 및 O-결합 탄수화물은 그의 코어 구조에서 1차적으로 상이하다. N-결합 글리코실화는 GlcNAc를 통해 탄수화물 잔기를 펩티드 쇄 중의 아스파라긴 잔기에 부착시키는 것을 나타낸다. N-결합 탄수화물은 모두 통상의 Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R 코어 구조 (여기서, 이 코어 구조 중의 R은 아스파라긴 잔기를 나타냄)를 함유한다. 생산된 단백질의 펩티드 서열은 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌, 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X는 프롤린 이외의 임의의 아미노산임)을 함유할 것이다.

대조적으로, O-결합 탄수화물을 트레오닌 또는 세린의 수산기에 부착된 GalNAc인 통상의 코어 구조에 의해 특성화한다. N-결합 및 O-결합 탄수화물 중에, 복합체 N- 및 O-결합 탄수화물이 가장 중요하다. 이러한 복합체 탄수화물은 몇몇의 안테나리 구조를 함유한다. 모노-, 비-, 트리-, 및 테트라-외부 구조는 말단 시알산의 첨가에 중요하다. 이러한 외부 쇄 구조는 단백질 생산물의 탄수화물을 포함하는 특이적 당 및 연결기에 대한 추가 부위에 제공된다.

생성된 탄수화물을 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 분석할 수 있다. 몇몇의 방법은 글리코실화 분석을 위해 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 내용에 유용하다. 이들 방법은 확인과 관련된 정보 및 생산된 펩티드에 부착된 올리고당의 조성물을 제공한다. 본 발명과 연관하여 유용한 탄수화물 분석 방법에는 렉틴 크로마토그래피; 하전에 기초하여 올리고당을 분리하는 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 HPAEC-PAD; NMR; 질량 분광측정법; HPLC; GPC; 단당류 조성 분석; 및 순차적 효소 절단이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

또한, 올리고당 유리 방법은 당업계에 공지되어 있고 실행되고 있다. 이들 방법에는 1) 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 통상적으로 수행되는 효소 방법; 2) 황량한 알칼리 환경을 사용하여 주로 O-결합 구조를 유리시키는 β 제거 방법; 및 3) 무수 히드라진을 사용하여 N- 및 O-결합 올리고당 모두를 유리시키는 화학적 방법이 포함된다. 상기 분석은 하기 단계를 사용하여 수행할 수 있다: 1. 샘플을 탈이온화수에 대해 투석하여 모든 완충액 염을 제거한 후에, 동결건조시키는 단계. 2. 무손상 올리고당 쇄를 무수 히드라진으로 유리시키는 단계. 3. 무손상 올리고당 쇄를 무수 메탄올계 HCl로 처리하여 개별 단당류를 O-메틸 유도체로서 유리시키는 단계. 4. 임의의 1급 아미노기의 N-아세틸화 단계. 5. 유도체화시켜 퍼-O-트리메틸실릴 메틸 글리코시드를 수득하는 단계. 6. 이들 유도체를 CP-SIL8 컬럼 상에서의 모세관 기체-액체 크로마토그래피 (GLC)에 의해 분리하는 단계. 7. 공지된 기준물과 비교하는 GLC 및 질량 분석기로부터의 체류 시간에 의해 개별 글리코시드 유도체의 확인 단계. 8. 내부 기준물 (13-O-메틸-D-글루코스)을 사용하는 FID에 의한 개별 유도체의 정량 단계.

중성 및 아미노 당을 펄스 전류측정 탐지 (HPAE-PAD 탄수화물 시스템; 디오넥스 코포레이션 (Dionex Corp.))와 조합된 고성능 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 당은 20％ (v/v) 트리플루오로아세트산 중에 100 ℃에서 6 시간 동안 가수분해함으로써 유리될 수 있다. 가수분해물을 이어서 동결건조 또는 스피드-백 (Speed-Vac) (Savant Instruments)으로 건조시킨다. 잔류물을 이어서 1％ 나트륨 아세테이트 삼수화물 용액에 용해하고, HPLC-AS6 컬럼 상에서 분석하였다 (문헌 [Anumula et al., 1991, Anal. Biochem., 195:269-280]에 기재되어 있음).

또는, 면역블롯 탄수화물 분석을 수행할 수 있다. 이 과정에서 단백질-결합 탄수화물을 문헌 [Haselbeck et al., 1993, Glycoconjugate J., 7:63]에 기재된 산화 면역블롯 과정에 기초한 상업적 글리칸 탐지 시스템 (Boehringer)을 사용하여 탐지한다. 단백질을 니트로셀룰로스 막 대신에 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 옮기고, 블로킹 완충액이 0.9％ 염화나트륨을 갖는 10 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) 중의 5％ 소 혈청 알부민을 함유하는 것을 제외하고는 제조자에 의해 추천된 염색 프로토콜에 따라 수행한다. 탐지는 100 mM 염화나트륨 및 50 mM 염화마그네슘을 함유한 100 mM 트리스 완충액 (pH 9.5) 중의 포스파타제 기질, 4-니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 0.03％ (w/v) 및 5-브로모-4 클로로-3-인도일-포스페이트 0.03％ (w/v)를 사용하며 알칼리 포스페이트 컨쥬게이트 (Boehringer)와 연결된 항-디곡시게닌 항체 (트리스 완충 염수 중의 1:1000 희석)로 수행하였다. 탄수화물을 함유한 단백질 밴드를 보통 약 10 내지 15 분간 시각화시켰다.

단백질과 결합된 탄수화물을 펩티드-N-글리코시다제 F로 분해함으로써 분석할 수도 있다. 이 과정에 따라, 잔류물을 0.18％ SDS, 18 mM 베타-메르캅토에탄올, 90 mM 포스페이트, 3.6 mM EDTA를 함유한 완충액 (pH 8.6) 14 ㎕에 현탁하고, 100 ℃에서 3 분 동안 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후에, 샘플을 2개의 동일 부위로 나눈다. 추가로 처리하지 않은 1부를 대조군으로서 제공한다. 다른 부를 약 1％ NP-40 세제로 조정한 후에 0.2 단위의 펩티드-N-글리코시다제 F (Boehringer)를 첨가한다. 샘플 모두를 37 ℃에서 2 시간 동안 가온하고, 이어서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다.

또한, 당단백질 생성물의 시알산 함량을 통상적 방법으로 평가한다. 예를 들어, 시알산을 바람직하게는 3벌 샘플을 사용하여 직접 비색 방법 [Yao et al., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335]에 의해 개별적으로 측정할 수 있다. 또다른 시알산 측정 방법은 문헌 [Warren et al., 1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975]에 기재된 바와 같이 티오바르바투르산 (TBA)의 사용을 포함한다. 또다른 방법은 예컨대 문헌 [H.K. Ogawa et al., 1993, J. Chromatography, 612:145-149]에 기재된 고성능 크로마토그래피를 포함한다.

당단백질 회수, 단리 및(또는) 정제에 대한 실례로, 세포 배양 배지 또는 세포 융해물을 원심분리하여 미립자 세포 및 세포 파편을 제거한다. 적합한 정제 기술에 의해 가용성 단백질 및 폴리펩티드를 오염시키지 않고 목적하는 폴리펩티드 생성물을 단리 또는 정제한다. 하기 과정을 단백질 정제 방법의 비제한적인 예로서 제공한다: 면역친화도에 대한 분리 또는 분획, 또는 이온-교환 컬럼; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 수지, 예컨대 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예컨대, 세파덱스 (Sephadex) G-75, 세파로스 (Sepharose)를 사용하는 겔 여과; 면역글로불린 오염물 제거를 위한 단백질 A 세파로스 크로마토그래피 등. 다른 첨가제, 예컨대 프로테아제 억제제 (예컨대, PMSF 또는 프로테이나제 K)를 사용하여 정제 동안 단백질가수분해 분해를 억제할 수 있다. 목적하는 주어진 폴리펩티드에 대한 정제 방법은 세포 배양에서 재조합적으로 발현되는 폴리펩티드에서의 변화를 가능하게 하는 개질을 요구할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 탄수화물에 대해 선별하고, 시알산에 대해 풍부하게 할 수 있는 이들 정제 과정, 예컨대 이온-교환 연질 겔 크로마토그래피 또는 보다 산성인 분획(들)을 수집하는 양이온- 또는 음이온-교환 수지를 사용하는 HPLC가 특히 바람직하다.

세포, 단백질 및 세포 배양

본 발명의 세포 배양 방법 또는 프로세스에서, 세포를 각종 세포 배양 배지, 즉 통상적으로 당업계에 공지된 기초 배양 배지에서 유지할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 영양물 등을 보충할 수 있는 세포 배양 배지에서 유지되는 큰 부피의 세포를 사용하는 데 적용가능하다. 전형적으로, "세포 배양 배지" ("배양 배지"로도 칭함)는 당업자에 의해 이해되고, 세포, 바람직하게는 동물 또는 포유류 세포가 성장하고, 일반적으로 하기의 것으로부터 1종 이상 성분을 제공하는 영양물 용액을 나타내는 것으로 공지되어 있는 용어이다: 에너지원 (보통 탄수화물, 예컨대 글루코스의 형태임); 모든 필수 아미노산, 및 일반적으로 20종의 기본 아미노산, 및 시스테인; 비타민 및(또는) 다른 유기 화합물 (전형적으로 저농도로 요구됨); 지질 또는 유리 지방산, 예컨대, 리놀레산; 및 미량 원소, 예컨대, 전형적으로 매우 낮은 농도, 보통 마이크로몰 범위로 요구되는 무기 화합물 또는 자연 발생 원소. 세포 배양 배지는 각종 임의 성분, 예컨대 호르몬 및 다른 성장 인자, 예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예컨대 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트, 및 완충액, 예컨대 HEPES; 뉴클레오시드 및 염기, 예컨대 아데노신, 티미딘, 히폭산틴; 및 단백질 및 조직 가수분해물, 예컨대, 가수분해된 동물 단백질 (동물 부산물, 정제된 젤라틴 또는 식물 물질로부터 수득할 수 있는 펜톤 또는 펜톤 혼합물); 항생제, 예컨대 젠타마이신; 및 세포 보호제, 예컨대 플루로닉 (Pluronic) 폴리올 (플루로닉 F68)을 함유하기 위해 보충할 수도 있다. 혈청-무함유이고, 동물 기원의 생산물 또는 성분이 무함유인 세포 영양 배지가 바람직하다.

당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 동물 또는 포유류 세포를 배양되는 특정 세포에 적합한 배지에서 배양하고, 이는 부적절한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지를 사용할 수 있고, 여기에는 예를 들어 미니말 에센셜 미디엄 (Minimal Essential Medium) (MEM, 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마); 함스(Ham's) F10 배지 (시그마); 둘베코스 모디파이드 이글스 미디엄 (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (DMEM, 시그마); RPMI-1640 미디엄 (시그마); 히클론 (HyClone) 세포 배양 배지 (미국 유타주 로간 소재의 히클론); 및 특정 세포 유형에 대해 제제화된 화학적으로 정의된 (CD) 배지, 예컨대 CD-CHO 미디엄 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐 (Invitrogen))가 포함된다. 상기 대표적 배지에 상기 보충 성분 또는 임의 성분을 포함하는 성분을 적절한 농도 또는 양으로 필수적으로 또는 필요에 따라 당업자에 의해 공지되고 수행되는 바와 같이 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 적합한 세포 배양 조건은 pH, 예컨대 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5; 용존 산소 (O₂), 예컨대 약 5-90％의 공기 포화 및 이산화탄소 (CO₂), 교반 및 습도, 또한 온도에 유의하는, 전형적으로 세포의 회분식, 공급 회분식, 또는 연속 배양에 사용되고 공지된 조건이다. 비제한적인 실례로서, 본 발명의 공급 회분식 방법에 적합한 세포 배양 배지는 개질된 CD-CHO 미디엄 (미국 캘리포니아 칼스바드 소재의 인비트로겐) 및 바람직하게는 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 포함한다 (예컨대, 실시예 1 및 3).

동물 세포, 포유류 세포, 배양된 세포, 동물 또는 포유류 숙주 세포, 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 숙주 세포 등은 배양된 본 발명의 방법에 따라 배양할 수 있는 세포에 대한 모든 용어이다. 이러한 세포는 전형적으로 포유류로부터 수득하거나 또는 유도된 세포주이고, 적절한 영양물 및(또는) 성장 인자를 함유한 배지 중의 단층 배양물 또는 현탁액 배양물에 두는 경우에 성장 및 생존할 수 있다. 특정 세포 배양의 성장 및 유지에 필요한 성장 인자 및 영양물을 당업자에 의해 경험적으로 용이하게 결정할 수 있고, 예컨대 문헌 [Barnes and Sato, 1980, Cell, 22:649]; [Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, NY, 1984]; 및 미국 특허 제5,721,121호에 기재되어 있다.

다수의 유형의 세포를 본 발명의 방법에 따라 배양할 수 있다. 세포는 발현 및 유리하거나, 또는 분자 가공하여 대량의 목적하는 특정 단백질, 더욱 특히 당단백질을 배양 배지 내로 발현 및 유리할 수 있는 전형적으로 동물 또는 포유류 세포이다. 숙주 세포에 의해 생산되는 당단백질이 숙주 세포에 대해 내인성 또는 상동성이다는 것은 이해될 것이다. 또는, 바람직하게는, 당단백질은 숙주 세포에 대해 이종성, 즉 외인성인데, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포에 의해 생산 및 유리되는 인간 당단백질이 있다. 또한, 바람직하게는, 포유류 당단백질, 즉 포유류 생물로부터 기원적으로 수득하거나 유도된 단백질은 본 발명의 방법에 의해 달성되고, 바람직하게는 세포에 의해 배양 배지 내로 유리된다.

본 발명의 방법에 의해 유리하게 생산될 수 있는 포유류 당단백질의 예에는 시토킨, 시토킨 수용체, 성장 인자 (예컨대, EGF, HER-2, FGF-α, FGF-β, TGF-α, TGF-β, PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-β); 융합 또는 키메라 단백질을 포함하는 성장 인자 수용체가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 기타 비제한적 예에는 성장 호르몬 (예컨대, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬); 인슐린 (예컨대, 인슐린 A 쇄 및 인슐린 B 쇄), 프로인슐린; 에리트로포이에틴 (EPO); 콜로니 자극 인자 (예컨대, G-CSF, GM-CSF, M-CSF); 인터루킨 (예컨대, IL-1 내지 IL-12); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 그의 수용체 (VEGF-R); 인터페론 (예컨대, IFN-α, β 또는 γ); 종양 괴사 인자 (예컨대, TNF-α 및 TNF-β) 및 그의 수용체, TNFR-1 및 TNFR-2; 트롬보포이에틴 (TPO); 트롬빈; 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP); 응고 인자 (예컨대, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란츠 (von Willebrands) 인자, 등); 항-응고 인자; 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA), 예컨대, 우로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직 유형 TPA; 난포 자극 호르몬 (FSH); 황체형성 호르몬 (LH); 칼시토닌; CD 단백질 (예컨대, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, 등); CTLA 단백질 (예컨대, CTLA4); T-세포 및 B-세포 수용체 단백질; 골 형태발생 단백질 (BNP, 예컨대, BMP-1, BMP-2, BMP-3, 등); 신경영양 인자, 예컨대, 골 유도 신경영양 인자 (BDNF); 뉴로트로핀, 예컨대, 3-6; 레닌; 류마티스 인자; RANTES; 알부민; 렐락신; 대식세포 억제 단백질 (예컨대, MIP-1, MIP-2); 바이러스 단백질 또는 항원; 표면 막 단백질; 이온 채널 단백질; 효소; 조절 단백질; 항체; 면역조절 단백질, (예컨대, HLA, MHC, B7 족); 귀소 수용체; 수송 단백질; 과산소 디스뮤타제 (SOD); G-단백질 연결 수용체 단백질 (GPCR); 신경조절 단백질; 알쯔하이머병 관련 단백질 및 펩티드, (예컨대, A-베타), 및 당업계에 공지된 기타의 것이 포함된다. 융합 단백질 및 폴리펩티드, 키메라 단백질 및 폴리펩티드, 뿐만 아니라 임의의 상기 단백질 및 폴리펩티드의 단편 또는 부위, 또는 돌연변이체, 변형체, 또는 유사체가 또한 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 적합한 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 중에 포함된다.

차후 단리 및(또는) 정제를 위한 단백질의 은닉, 발현 및 생산에 적합한 동물 또는 포유류 숙주 세포의 비제한적 예에는 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO), 예컨대 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 ([Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909]; 및 WO 01/92337 A2), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포 (CHO/-DHFR, [Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]), 및 dp12.CHO 세포 (미국 특허 제5,721,121호); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포 (예컨대, 293 세포, 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 [Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL-10); 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 사바나 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, [Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL-75); 인간 간암 세포 (HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL-51); 물소 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포 [Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68]; MCR 5 세포; FS4 세포가 포함된다. CHO 세포, 특히, CHO/-DHFR 세포가 바람직하다.

본 발명의 방법 및 프로세스에서 배양에 적합한 세포는 예컨대 형질전환, 형질감염, 감염, 또는 주사를 통해 도입된, 배양 방법에서 발현 및 생산을 위한 단백질을 코딩하는 코딩 서열 또는 그의 부위를 보유하는 발현 벡터 (작제물), 예컨대 플라스미드 등을 함유할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 요소를 함유한다. 당업자에게 잘 공지되어 있고, 수행되는 방법을 사용하여 생산된 단백질 및 폴리펩티드, 뿐만 아니라 적절한 전사 및 번역 조절 구성요소를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전학적 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 문헌 [J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.] 및 [F.M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기재되어 있다.

제어 구성요소 또는 조절 서열은 벡터의 비-번역 영역, 예컨대 숙주 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 번역을 수행하는 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역이다. 이러한 구성요소는 그의 강도 및 특이성에 따라 다양할 수 있다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주 세포에 따라, 구성적 및 유도가능 프로모터를 포함하는 임의 수의 적합한 전사 및 번역 구성요소를 사용할 수 있다. 포유류 세포 시스템에서, 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터의 프로모터가 바람직하다. 단백질 발현 시스템에 사용하기 위한 작제물은 1종 이상의 프로모터, 인핸서 서열 (임의로, 포유류 발현 시스템용) 및 유전자 발현의 적절한 전사 및 조절을 위해 필요하거나 또는 요구되는 기타 서열 (예컨대, 전사 개시 및 종료 서열, 복제 부위의 기점, 폴리아데닐화 서열, 예컨대 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리 A 서열)을 함유하기 위해 디자인한다.

당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 적절한 벡터, 예컨대 플라스미드, 진핵 (예컨대, 포유류) 발현 시스템에서 생산하기 위한 단백질의 적절한 전사, 발현 및 단리를 위한 성분의 선별은 공지되어 있고, 당업자에 의해 일상적으로 결정되고, 실행되고 있다. 본 발명의 방법에 따라 배양된 세포에 의한 단백질의 발현을 프로모터, 예컨대 바이러스 프로모터, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 티미딘 키나제 (TK), 또는 α-액틴 프로모터의 조절하에 둘 수 있다. 추가로, 조절되는 프로모터는 특정 화합물 또는 분자에 의해 유도가능성을 수여하는데, 예컨대 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV)의 글루코코르티코이드 반응 구성요소 (GRE)는 글루코코르티코이드에 의해 유도된다 [V. Chandler et al., 1983, Cell, 33:489-499]. 또한, 조직-특이적 프로모터 또는 조절 구성요소를 필요에 따라 또는 목적에 따라 사용할 수 있다 [G. Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646].

발현 작제물을 당업자에게 공지된 각종 유전자 전달 방법, 예를 들어 통상적 유전자 형질감염 방법, 예컨대 인산칼슘 공-침전, 리포솜 형질감염, 미세주사, 전기천공, 및 감염 또는 바이러스 형질도입에 의해 세포 내로 도입할 수 있다. 상기 방법의 선택은 당업자의 능력 이내에 있다. 세포에 발현하기 위한 DNA 서열을 갖는 하나 이상의 작제물을 세포 내로 형질감염시켜 발현 생산물을 차후에 세포에서 생산하고(거나) 그로부터 수득할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

특정 측면에서, 적절한 제어 및 조절 서열을 함유한 포유류 발현 시스템이 본 발명의 단백질 발현 포유류 세포에 사용하기에 바람직하다. 포유류 발현 벡터를 생산하기 위해 통상적으로 사용되는 진핵 조절 서열은 포유류 세포와 상용가능한 프로모터 및 조절 서열, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (CDM8 벡터) 및 조류 육아종 바이러스 (ASV) πLN 벡터를 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 프로모터는 원숭이 바이러스 40 (SV40)으로부터의 초기 및 말기 프로모터 [Fiers et al., 1973, Nature, 273:113], 또는 기타 바이러스 프로모터, 예컨대 폴리오마, 아데노바이러스 2, 및 소 유두종 바이러스로부터 유도된 것을 포함한다. 유도가능 프로모터, 예컨대 hMTII [Karin et al., 1982, Nature, 299:797-802]도 사용할 수 있다.

진핵 숙주 세포에 적합한 발현 벡터의 예에는 포유류 숙주 세포용 벡터 (예컨대, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (Stratagene), 레트로바이러스 벡터 (예컨대, pFB 벡터 (Stratagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), 아데노바이러스 벡터; 아데노-관련 바이러스 벡터, 베큘로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예컨대, pESC 벡터 (Stratagene)), 또는 상기 것의 개질된 형태가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 유전자 발현을 최적화하기 위해 프로모터 영역 서열 상류 또는 하류 인핸서 서열을 포함할 수도 있다.

선별가능 마커를 또한 재조합 벡터 (예컨대, 플라스미드)에 사용하여 적절한 선별 배지에서 선별을 가능하게 하는 벡터를 갖는 세포 (바람직하게는, 안정하게 통합됨)에 내성을 수여할 수 있다. 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV TK), [Wigler et al., 1977, Cell, 11:223), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HGPRT) [Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Lowy et al., 1980, Cell, 22:817] 유전자 (tk-, hgprt-, 또는 aprt- 세포 (APRT)에 각각 사용될 수 있음)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선별 시스템을 사용할 수 있다.

항-대사물 내성을 마커 유전자의 하기 비제한적 예에 대한 선택을 기초로 하여 사용할 수도 있다: 메토트렉세이트에 내성을 수여하는 dhfr [Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357; 및 O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527]; 미코페놀산에 내성을 수여하는 gpt [Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072]; 아미노글리코시드 G418에 내성을 수여하는 neo [Clinical Pharmacy, 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21; May, 1993, TIB TECH, 11(5):155-215]; 및 히그로마이신에 내성을 수여하는 hygro [Santerre et al., 1984, Gene, 30:147]. 재조합 DNA 기술의 당업계에 통상적으로 공지된 방법을 목적하는 재조합 세포 클론의 선별에 일상적으로 적용할 수 있고, 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981. J. Mol. Biol., 150:1]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용된다.

또한, 발현된 단백질 분자의 발현 수준을 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 (리뷰용 [Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987] 참조). 단백질을 발현하는 벡터 시스템 중의 마커가 증폭가능한 경우에, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 단백질-코딩 유전자와 결합되기 때문에, 단백질의 생산이 동시에 증가될 것이다 [Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257].

선별가능 마커로서 글루타민 신타제 (GS) 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 코딩 핵산을 갖는 벡터를 약물 메티오닌 술폭시민 또는 메토트렉세이트의 각각 존재하에 증폭시킬 수 있다. 글루타민 신타제 기초 벡터의 이점은 글루타민 신타제 음성인 세포주 (예컨대, 뮤린 골수종 세포주, NSO)의 이용가능성이다. 글루타민 신타제 발현 시스템은 추가 억제제를 제공하여 내인성 유전자의 기능을 제공함으로써 글루타민 신타제 발현 세포 (예컨대, CHO 세포)에서 기능할 수도 있다.

DHFR을 선별가능 마커로서 발현하는 벡터에는 pSV2-dhfr 플라스미드 [Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981)]이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 글루타민 신타제를 선별가능 마커로서 발현하는 벡터에는 문헌 [Stephens and Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res., 17:7110]에 기재되어 있는 pEE6 발현 벡터가 포함되지만 이에 제한되지 않다. 글루타민 신타제 발현 시스템 및 그의 성분은 PCT 공보인 W087/04462; W086/05807; W089/01036; W089/10404; 및 W091/06657에 상세히 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용된다. 또한, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 글루타민 신타제 발현 벡터는 예를 들어 론자 바이올로직스, 인크. (Lonza Biologics, Inc.) (미국 뉴햄프셔주 포츠머스 소재)를 포함하는 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다.

특정 실시양태에서, 가용성 CTLA4 분자 또는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 핵산 서열은 외인성 서열을 진핵 숙주에서 발현하기 위해 디자인한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 벡터의 조절 구성요소는 특정 진핵 숙주에 따라 달라질 것이다. 가용성 CTLA4 또는 가용성 CTLA4 돌연변이체를 진핵 숙주 세포에서 발현하는 벡터는 단백질 발현을 최적화하기 위한 인핸서 서열을 포함할 수 있다.

세포 배양의 유형

제한 없이 이해를 목적으로 하는 경우에, 단백질 생산을 위한 세포 배양 및 배양 운행이 3가지 일반 유형; 즉, 연속 배양, 회분식 배양 및 공급 회분식 배양을 포함할 수 있다는 것으로 당업자는 인식할 것이다. 연속 배양에서는, 예를 들어 새로운 배양 배지 보충 (즉, 공급 배지)을 세포에 배양 기간 동안 제공하는 반면, 오래된 배양 배지를 매일 제거하고, 생성물을 예를 들어 매일 또는 연속적으로 수확한다. 연속 배양에서는, 공급 배지를 매일 및 연속적으로, 즉 점적 또는 주입으로 첨가할 수 있다. 연속 배양의 경우에, 세포를 필요한 만큼, 세포가 생존하는 만큼 및 환경 및 배양 조건이 유지되는 만큼 배양물에 존속시킬 수 있다.

회분식 배양에서는, 세포를 초기에 배지에서 배양하고, 이 배지를 제거, 교체 또는 보충하지 않는데, 즉 세포에 신규 배지를 배양 운행 동안 또는 그의 말미 전에 "공급"하지 않는다. 목적하는 생성물을 배양 운행의 말미에서 수확한다.

공급 회분식 배양의 경우에는, 배양 운행 시간은 배양 배지에 1회 이상 매일 (또는 연속적으로) 새로운 배지를 운행 동안 보충함으로써 증가되는데, 즉 세포에 신규 배지 ("공급 배지")를 배양 기간 동안 "공급"한다. 공급 회분식 배양은 상기 각종 공급 레지멘 및 시간, 예를 들어 매일, 격일, 2일 마다 등, 1일 당 1회 이상, 또는 1일 당 1회 미만 등을 포함할 수 있다. 추가로, 공급 회분식 배양물에 연속적으로 공급 배지를 공급할 수 있다. 목적하는 생성물을 이어서 배양/생산 운행의 말미에 수확한다. 본 발명은 바람직하게는 D-갈락토스-함유 공급 배지를 매일 공급하며, 배양 기간 동안 2 단계 이상의 온도 이동이 온도 이동 없거나 또는 단지 단일 온도 이동을 사용하는 것보다 증가된 품질의 단백질 생산을 수득하고, 단백질 생산기를 연장시킬 수 있는 공급 회분식 세포 배양을 포함한다. 다중 온도 이동 배양 방법은 2002년 12월 23일자로 출원한 통상적으로 지정된 미국 특허 출원 제60/436,101호 및 이와 같이 동시에 출원한 동 제10/ 호에 기재되어 있으며, 이들 내용은 본원에 그 전체로 참고로 인용된다.

2 단계 이상의 온도 이동을 포함하는 본 발명의 측면에서, 본 발명의 세포 배양 방법을 포함하는 2 단계 이상의 온도 이동은 상기 방법 또는 생산 운행의 말미까지 배양물에 생존하는 세포를 더 생존가능하게 한다. 생존하는 세포 수가 클수록 단백질 생산의 비-성장 관련 방법, 예컨대 본원에 예시된 방법의 일부로 생산되는 양의 단백질 생성물의 양이 크다. 따라서, 목적하는 생성물의 축적 양이 상기 방법의 말미에서 더 커진다. 배양물에서 개별 세포에 의한 단백질 또는 당단백질 생산 속도 (즉, 세포 특이적 생산성)는 본 발명의 온도 이동 배양 방법에 의해 영향 받거나 또는 증가되지 않는다 (예컨대, 실시예 6). 대조적으로, 성장-관련 배양 방법에서 단백질은 배양의 성장기 동안 세포를 성장시킴으로써 주로 생산된다.

본 발명에 따라, 단백질의 대규모 또는 소규모 생산에 대한 조건 하에 동물 또는 포유류 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배양 용기 및(또는) 배양 기기를 사용하여 세포 배양을 수행하고, 당단백질을 세포에 의해 생산할 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 조직 배양 디쉬, T-플라스크 및 교반 플라스크를 실험실 규모로 전형적으로 사용한다. 더 큰 규모 (예컨대, 500 L, 5000 L 등)에 대한 배양의 경우에, 유동화 층 생반응기, 중공 섬유 생반응기, 롤러 병 배양, 또는 교반 탱크 생반응기 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 과정을 사용할 수 있다. 미세담체는 롤러 병 또는 교반 탱크 생반응기 시스템과 함께 사용하거나 사용하지 않을 수 있다. 상기 시스템을 회분식, 연속식, 또는 공급 회분식으로 작업할 수 있다. 또한, 배양 기기 또는 시스템에 필터, 중력, 원심력 등을 사용하는 세포 분리기를 장착하거나 또는 장착하지 않을 수 있다.

세포 배양의 시기 및 관련 파라미터

용어 "접종"은 세포를 출발 배지에 첨가하여 배양을 개시시키는 것을 나타낸다.

배양의 성장기는 임의의 시간대에 생존가능한 세포 밀도가 임의의 이전 시간대보다 높은 동안의 시기이다.

배양의 정지기는 생존가능한 세포 밀도가 임의의 길이의 기간에 걸쳐 대략 일정한 (즉, 측정 오차 이내임) 동안의 시기이다.

배양의 사멸기는 성장기 이후 또는 성장기 및 정지기 이후에 접하는 시기이고, 임의의 시간대에 생존가능한 세포 밀도가 이 시기 동안의 임의의 이전 시간대보다 낮은 동안이다.

성장-관련 배양 방법에서, 예컨대 다가음이온성 화합물이 연장된 성장기를 유발하는 경우에, 생산기는 연장된 성장기 동안 시작될 수 있다.

비-성장 관련 배양 방법에서, 세포 배양의 생산기는 정지기일 수 있다.

바람직하게는, 배양 배지를 생산기 동안 보충 ("공급")하여 연속적인 단백질 생산을 특히 연장된 생산기에서 지원하고, 충반한 양의 고품질 당단백질 생성물 (예시된 바와 같이 및(또는) 단백질 회수시에 고수준의 종료 시알산 함량에 의해 결정됨)을 달성한다. 공급을 매일 또는 다른 스케줄에 따라 수행하여 세포 생존력 및 단백질 생산을 지원할 수 있다.

성장 및 표준 (초기) 생산기에서의 온도(들)보다 연속적으로 저하되도록 이동시키는 온도에서의 연장된 생산기 동안, 세포에 공급하고, 생존가능하게 존속된다. 이는 초기 배양 온도 또는 온도가 초기 배양 온도로부터 단지 1회 이동되는 때보다 연장되거나 또는 더 긴 총 기간 동안 목적하는 단백질 생성물을 생산한다. 본 발명에 따른 배양 방법은 배양 기간의 말미까지 생존하는 세포를 더 생존가능하게 할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포가 더 생존할수록 세포가 목적하는 생산물을 더 생산한다. 또한, 이는 개별 세포에 의한 단백질 생산 속도로, 즉 세포 특이적 생산성이 동일하게 유지된 채 배양 방법의 말미에 생성물의 축적 양을 크게 한다 (예컨대, 실시예 4 참조). 당업계에 공지된 세포 특이적 생산성 또는 세포 특이적 속도는 전형적으로 세포 또는 세포 매스 또는 부피의 측정 당 생산된 생성물의 특이적 발현 속도를 나타낸다. 세포 특이적 생산성을 예를 들어 1일 당 1 세포 당 생산된 단백질 (g)로 측정하고, 하기 공식과 관련된 적분 방법에 따라 측정할 수 있다:

식 중,

q_p는 세포 특이적 생산성 상수이고;

X는 세포수 또는 세포 부피, 또는 세포 매스 당량이고;

dP/dt는 단백질 생산 속도이다.

따라서, q_p를 생성물 농도 대 생존가능한 세포의 시간 적분 (∫₀ ^t Xdt "생존가능한 세포 시간 (일)")의 플롯으로부터 얻을 수 있다. 이 공식에 따라, 생산된 양의 당단백질 생성물을 생존가능한 세포 시간(일)에 대해 플로팅하는 경우에, 경사는 세포 특이적 속도에 대응한다. 생존가능한 세포를 몇몇의 측정, 예를 들어 바이오매스, O₂ 섭취 속도, 락타제 데히드로게나제 (LDH), 패킹된 세포 부피 또는 혼탁도 (예컨대, 미국 특허 제5,705,364호 (T. Etcheverry et al.))에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 배양 방법에 의한 가용성 CTLA4 분자 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 생산

본 발명에 포함되는 다른 실시양태에서, 세포 배양 방법을 하기와 같이 사용하여 가용성 CTLA4 분자 또는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 생산한다. 가용성 CTLA4 분자는 바람직하게는 CTLA4 융합 단백질, 바람직하게는 CTLA4Ig이다. 더 바람직하게는 도 8에 나타낸 바와 같이 아미노산 -1 내지 357 또는 +1 내지 357을 포함하는 CTLA4Ig이다. 가장 바람직하게는 도 8에 나타낸 바와 같이 아미노산 -1 내지 357 또는 +1 내지 357로 이루어진 CTLA4Ig이다. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 바람직하게는 도 9에 나타낸 바와 같이 아미노산 -1 내지 357 또는 +1 내지 357을 포함하는, 가장 바람직하게는 도 9에 나타낸 바와 같이 아미노산 -1 내지 357 또는 +1 내지 357로 이루어진 L104EA29YIg이다. 단백질 생성물에 대한 연장된 생산기 및 D-갈락토스를 함유한 배지를 공급하는 것을 포함하는 2- 및 3-단계 온도 이동 세포 배양 방법은 배양물 중의 숙주 세포에 의해 고품질 및 대량의 가용성 CTLA4 분자 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 생산하기에 특히 적합하다.

바람직한 실시양태에서, CTLA4Ig를 재조합적으로 가공한 숙주 세포에 의해 생산한다. CTLA4Ig 융합 단백질은 CTLA4Ig를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된 CHO 세포에 의해 재조합 생산할 수 있다 (미국 특허 제5,844,095호 (P.S. Linsley et al.) 및 본원의 실시예 참조). 본 발명의 다단계 온도 이동 방법에 따라 배양하는 경우에 CTLA4Ig 융합 단백질은 대량으로 생산되고, 적절하게 시알릴화된다. 본 발명은 고수준의 회수가능한 단백질 생산물, 예컨대 시알릴화된 CTLA4Ig 단백질 생산물의 생산을 제공한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 도 9에 나타낸 바와 같이 아미노산 -1 내지 357 또는 +1 내지 357을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 본 발명의 세포 배양 방법에 의해 생산한다.

CTLA4에 대한 리간드는 B7 분자이다. 본원에 사용되는 "리간드"는 구체적으로 또다른 분자를 인지하고, 그와 결합하는 분자를 나타낸다. 분자 및 그의 리간드의 상호작용을 본 발명의 배양 방법의 생산물에 의해 조절할 수 있다. 예를 들어, CTLA4와 그의 리간드 B7과의 상호작용을 CTLA4Ig 분자의 투여에 의해 블로킹할 수 있다. 다른 예로서, 종양 괴사 인자 (TNF)와 그의 리간드인 TNF 수용체 (TNFR)와의 상호작용을 에타네르셉트 또는 다른 TNF/TNFR 블로킹 분자의 투여에 의해 블로킹할 수 있다.

야생형 CTLA4 또는 "비-돌연변이 CTLA4"는 B7 분자를 인식하고 그와 결합하거나 또는 B7 분자를 간섭하여 CD28 및(또는) CTLA4 (예컨대, 내인성 CD28 및(또는) CTLA4)에 대한 결합을 블로킹하는, 도 10에 나타낸 바와 같이 자연 발생 전장 CTLA4의 아미노산 서열 (미국 특허 제5,434,131호, 동 제5,844,095호 및 동 제5,851,795호에 또한 기재되어 있으며, 이들은 본원에 그 전체로 참고로 인용됨) 또는 그의 임의의 부위를 가진다. 야생형 CTLA4는 예를 들어 도 10에 나타낸 바와 같이, 야생형 CTLA4를 위치 +1에서의 메티오닌으로 시작하고 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종결되는 세포외 도메인 또는 야생형 CTLA4를 위치 -1에서의 알라닌으로 시작하고 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종결되는 세포외 도메인을 포함하는 특정 부위를 포함한다.

자연 발생 야생형 CTLA4는 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 C-말단 세포질 도메인을 갖는 세포 표면 단백질이다. 세포외 도메인은 표적 분자, 예컨대 B7 분자에 결합한다. 세포에서, 자연 발생 야생형 CTLA4 단백질을 아미노 또는 N-말단 끝에서의 시그날 펩티드를 포함하는 미성숙 폴리펩티드로서 번역한다. 미성숙 폴리펩티드에는 시그날 펩티드의 절단 및 제거를 포함하는 번역후 프로세싱이 수행되어 미성숙 형태에서의 N-말단 끝과 상이한 새롭게 생산된 N-말단 끝을 갖는 CTLA4 절단 생성물을 생산한다. 당업자는 하나 이상의 아미노산을 CTLA4 절단 생산물의 새롭게 생산된 N-말단 끝으로부터 제거하는 추가 번역후 프로세싱이 발생될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 성숙 CTLA4 단백질은 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작할 수 있다. CTLA4 분자의 성숙 형태는 B7에 결합하는 세포외 도메인 또는 임의의 그의 부위를 포함한다.

본원에 사용되는 CTLA4 돌연변이 분자는 돌연변이 또는 다중 돌연변이를 야생형 CTLA4 서열에서, 바람직하게는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인에서 가지고, B7과 결합하는, 도 10에 나타낸 바와 같이 야생형 CTLA4 또는 임의의 그의 부위 또는 유도체를 포함하는 분자를 나타낸다. CTLA4 돌연변이 분자는 야생형 CTLA4 분자의 서열과 유사하지만 동일하지 않고, 여전히 B7과 결합하는 서열을 가진다. 돌연변이는 보존성 (예컨대, 이소류신에 대해 치환된 류신) 또는 비-보존성 (예컨대, 트립토판으로 치환된 글리신) 구조 또는 화학적 특성, 아미노산 결실, 추가, 프레임쉬프트 또는 말단절단을 갖는 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

CTLA4 돌연변이 분자는 그중의 또는 그에 부착된 비-CTLA4 분자, 즉 CTLA4 돌연변이체 융합 단백질을 포함할 수 있다. 돌연변이 분자는 가용성 (즉, 순환)이거나 또는 세포 표면에 결합 (막-결합)할 수 있다. CTLA4 돌연변이 분자는 L104EA29YIg 및 미국 특허 출원 제09/865,321호, 동 제60/214,065호 및 동 제60/287,576호; WO 01/92337 A2; 미국 특허 제6,090,914호, 동 제5,844,095호 및 동 제5,773,253호; 및 문헌 [R.J. Peach et al., 1994, J Exp Med, 180:2049-2058]에 기재된 것을 포함한다. CTLA4 돌연변이 분자를 합성 또는 재조합 생산할 수 있다.

CTLA4Ig는 B7, 면역글로불린 (Ig) 분자 또는 그의 부위와 결합하는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인 또는 그의 부위를 포함하는 가용성 융합 단백질이다. CTLA4의 세포외 도메인 또는 그의 부위는 융합 분자 가용성을 부여하는 면역글로불린 분자의 모두 또는 일부, 바람직하게는 면역글로불린 불변 영역의 모두 또는 일부, 예컨대 IgCγ1 (IgC감마1), IgCγ2 (IgC감마2), IgCγ3 (IgC감마3), IgCγ4 (IgC감마4), IgCμ (IgC뮤), IgCα1 (IgC알파1), IgCα2 (IgC알파2), IgCδ (IgC델타) 또는 IgCε (IgC엡실론)의 모두 또는 일부를 포함하는 Ig 잔기와 결합한다. Ig 잔기는 상기 불변 영역 또는 다른 불변 영역의 힌지 (hinge), CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, Ig 잔기는 인간 또는 원숭이의 것이고, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는 Ig 잔기는 인간 IgCγ1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나 또는 인간 IgCγ1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진다. CTLA4Ig의 Ig 잔기에서, Ig 불변 영역 또는 그의 부위를 돌연변이시켜 그의 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,637,481호, 동 제5,844,095호 및 동 제5,434,131호 참조). 본원에 사용되는 용어 Ig 잔기, Ig 불변 영역, Ig C(불변) 도메인, IgCγ1 (IgC감마1), IgCγ2 (IgC감마2), IgCγ3 (IgC감마3), IgCγ4 (IgC감마4), IgCμ (IgC뮤), IgCα1 (IgC알파1), IgCα2 (IgC알파2), IgCδ (IgC델타) 또는 IgCε(IgC엡실론)은 천연 서열 및 돌연변이된 서열, 예컨대 이펙터 기능을 감소시키는 불변 영역 중의 돌연변이를 갖는 서열을 모두 포함한다.

CTLA4에 관련된 특정 실시양태는 도 8에 나타낸 바와 같이, 위치 +1에서의 메티오닌에서 시작하여 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종료되거나 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하여 위치 +124에서의 아스파르트산에서 종료되는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인; 위치 +125에서의 접합 아미노산 잔기 글루타민; 및 위치 +126에서의 글루탐산 내지 위치 +357에서의 리신을 포함하는 면역글로불린 부위를 포함한다. 이 CTLA4Ig를 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약 하에 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC)에 1991년 5월 31일자로 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 ATCC 68629를 수여받았다 [P. Linsley et al., 1994, Immunity 1:793-80]. CTLA4Ig를 발현하는 CHO 세포주는 ATCC에 확인 번호 CRL-10762로 1991년 5월 31일자로 기탁되었다. 본원에 기재된 방법에 따라 생산한 가용성 CTLA4Ig 분자는 시그날 (리더) 펩티드 서열를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 도 8 및 9는 시그날 (리더) 펩티드 서열의 실례를 포함한다. 전형적으로, 상기 분자는 시그날 펩티드 서열을 포함하지 않는다.

L104EA29YIg는 Ig 꼬리에 연결된 아미노산 변경 A29Y (위치 29에서의 알라닌에 대해 치환하는 티로신 아미노산 잔기) 및 L104E (위치 +104에서의 류신에 대해 치환하는 글루탐산 아미노산 잔기)를 갖는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자인 융합 단백질이다. 도 9는 L104EA29YIg를 도시한다. L104EA29YIg의 아미노산 서열은 도 9에 나타낸 바와 같이 아미노산 위치 -1에서의 알라닌 내지 아미노산 위치 +357에서의 리신을 포함한다. 또는, L104EA29YIg의 아미노산 서열은 아미노산 위치 +1에서의 메티오닌 내지 아미노산 위치 +357에서의 리신을 도 9에 나타낸 바와 같이 포함한다. L104EA29YIg는 위치 +125에서의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 위치 +126에서의 글루탐산 내지 위치 +357에서의 리신을 포함하는 Ig 부위를 포함한다. L104EA29YIg를 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2000년 6월 20일자로 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-2104를 수여받았다. 104EA29Y-Ig는 동시 계류중인 미국 특허 출원 제09/579,927호, 동 제60/287,576호 및 동 제60/214,065호, 및 WO/01/923337 A2에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용된다. 본 발명의 배양 방법에 의해 생산하는 가용성 L104EA29YIg 분자는 시그날 (리더) 펩티드 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따라 생산하는 분자는 시그날 펩티드 서열을 포함하지 않는다.

본원에 사용되는 용어 가용성은 세포에 결합 또는 부착되지 않는, 즉 순환하는 임의의 분자 또는 그의 단편을 나타낸다. 예를 들어, Ig 잔기를 CTLA4, B7 또는 CD28의 세포외 도메인에 각각 부착함으로써 CTLA4, B7 또는 CD28을 가용성으로 만들 수 있다. 또는, 분자, 예컨대 CTLA4에 그의 막횡단 도메인을 제거함으로써 가용성을 부여할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따라 생산되는 가용성 분자는 시그날 (또는 리더) 서열을 포함하지 않는다.

가용성 CTLA4 분자는 가용성 CTLA4 융합 단백질; 가용성 CTLA4 융합 단백질, 예컨대 CTLA4Ig 융합 단백질 (예컨대, ATCC 68629) (여기서, CTLA4의 세포외 도메인은 Ig 분자의 모두 또는 일부, 바람직하게는 Ig 불변 영역의 모두 또는 일부, 예컨대 IgC1 (IgC감마1), IgCγ2 (IgC감마2), IgCγ3 (IgC감마3), IgCγ4 (IgC감마4), IgCμ (IgC뮤), IgCα1 (IgC알파1), IgCα2 (IgC알파2), IgCδ (IgC델타) 또는 IgCε(IgC엡실론)의 모두 또는 일부인 Ig 잔기에 융합되며, 이는 융합 분자 가용성을 부여함); 가용성 CTLA4 융합 단백질 (여기서, 세포외 도메인은 미국 특허 제5,844,095호에 기재된 바와 같이 생물학적 활성 또는 화학적 활성 단백질, 예컨대 유두종바이러스 E7 유전자 생성물 (CTLA4-E7), 흑색종-관련 항원 p97 (CTLA4-p97) 또는 HIV env 단백질 (CTLA4-env gp120)의 부위와 융합되거나 결합되며, 상기 특허는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨); 하이브리드 (키메라) 융합 단백질, 예컨대 CD28/CTLA4Ig (미국 특허 제5,434,131호에 기재된 되어 있으며, 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨); 단백질 가용성을 부여하는 막횡단 도메인을 제거한 CTLA4 분자 (예컨대, 문헌 [M.K. Oaks et al., 2000, Cellular Immunology, 201:144-153] 참조, 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨); 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 포함하지만 이에 제한되지 않는, B7과 결합하는 야생형 CTLA4를 포함하는 비-세포-표면-결합 (즉, 순환) 분자, 또는 임의의 그의 부위 또는 유도체를 나타낸다.

가용성 CTLA4 분자는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자일 수도 있다. 본 발명에 따라 생산된 가용성 CTLA4 분자는 시그날 (리더) 펩티드 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 시그날 펩티드는 온코스타틴 M [Malik et al., 1989, Molec. Cell. Biol., 9:2847-2853] 또는 CD5 [N.H. Jones et al., 1986, Nature, 323:346-349]로부터의 시그날 펩티드, 또는 임의의 세포외 단백질로부터의 시그날 펩티드를 포함하는 분자의 유리를 허용할 것인 임의의 서열일 수 있다. 본 발명의 배양 방법에 의해 생산된 가용성 CTLA4 분자는 CTLA4의 세포외 도메인의 N-말단 끝에 연결된 온코스타틴 M 시그날 펩티드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에서 상기 분자는 시그날 펩티드 서열을 포함하지 않는다.

본원에 사용되는 CTLA4 융합 단백질은 B7에 결합하며 CTLA4 분자 가용성을 부여하는 비-CTLA4 잔기, 예컨대 Ig 잔기에 융합된 야생형 CTLA4 또는 그의 부위의 세포외 도메인을 포함하는 분자를 나타낸다. 예를 들어, CTLA4 융합 단백질은 Ig 불변 영역의 모두 또는 일부에 융합된 CTLA4의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. CTLA4에 융합될 수 있는 Ig 불변 도메인 (또는 그의 부위)의 예에는 상기 열거된 모두를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. CTLA4 융합 단백질은 CTLA4 돌연변이 분자일 수도 있다.

본원에 사용되는 "비-CTLA4 잔기"는 CD80 및(또는) CD86과 결합하지 않고, CTLA4와 그의 리간드의 결합을 간섭하지 않는 분자 또는 그의 부위를 나타낸다. 그 예에는 예컨대 유두종바이러스 E7 유전자 생성물 (CTLA4-E7), 흑색종-관련 항원 p97 (CTLA4-p97) 또는 HIV env 단백질 (CTLA4-env gp120)과 같은 Ig 분자의 모두 또는 일부, 생물학적으로 활성 또는 화학적으로 활성 단백질의 일부인 Ig 잔기 (미국 제5,844,095호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. Ig 잔기의 예에는 면역글로불린 불변 도메인, 예컨대 IgC1 (IgC감마1), IgCγ2 (IgC감마2), IgCγ3 (IgC감마3), IgCγ4 (IgC감마4), IgCμ (IgC뮤), IgCα1 (IgC알파1), IgCα2 (IgC알파2), IgCδ (IgC델타) 또는 IgCε(IgC엡실론)의 모두 또는 일부가 포함된다. Ig 잔기에는 상기 불변 영역 또는 다른 불변 영역의 힌지, CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, Ig 잔기는 인간 또는 원숭이의 것이고, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는 Ig 잔기는 인간 IgCγ1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나 또는 인간 IgCγ1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. Ig 잔기에서, Ig 불변 영역 또는 그의 부위를 돌연변이시켜 그의 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,637,481호, 동 제5,844,095호 및 동 제5,434,131호 참조).

CTLA4의 세포외 도메인은 B7을 인식하고 그와 결합하는 야생형 CTLA4의 임의의 부위를 나타낸다. 예를 들어, CTLA4의 세포외 도메인은 위치 +1에서의 메티오닌 내지 위치 +124에서의 아스파르트산을 포함한다 (도 10). 예를 들어, CTLA4의 세포외 도메인은 위치 -1에서의 알라닌 내지 위치 +124에서의 아스파르트산을 포함한다 (도 10).

본원에 사용되는 용어 돌연변이는 야생형 분자의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화, 예를 들어 야생형 CTLA4 세포외 도메인의 DNA 및(또는) 아미노산 서열에서의 변화를 나타낸다. DNA에서의 돌연변이는 코돈을 변화시켜 코딩된 아미노산 서열에서의 변화를 유도할 수 있다. DNA 변화는 치환, 결실, 삽입, 교대 스플라이싱 또는 말단절단을 포함할 수 있다. 아미노산 변화는 단백질의 치환, 결실, 삽입, 추가, 말단절단, 또는 프로세싱 또는 에러 절단을 포함할 수 있다. 또는, 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이는 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이 아미노산 서열에 사일런트 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 또한, 이해되는 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 코돈은 동일한 아미노산을 코딩한다. 실례는 아미노산 아르기닌 (R)을 코딩하는 뉴클레오티드 코돈 CGU, CGG, CGC, 및 CGA; 또는 아미노산 아스파르트산 (D)을 코딩하는 코돈 GAU, 및 GAC를 포함한다.

따라서, 단백질은 그의 특이적 뉴클레오티드 서열에서 상이하지만, 여전히 동일한 서열을 갖는 단백질 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 돌연변이 분자는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 안내를 위해, 아미노산 코딩 서열은 하기와 같다:

본원에 사용되는 단편 또는 부위는 분자의 임의의 부위 또는 분절이다. CTLA4 또는 CD28의 경우에, 단편 또는 부위는 바람직하게는 B7을 인식하고 그와 결합하거나 또는 B7을 간섭하여 CD28 및(또는) CTLA4에 결합하는 것을 블로킹하는 CTLA4 또는 CD28의 세포외 도메인, 또는 그의 부위 또는 분절이다. 또한, 본원에 사용되는 "상응하는"이란 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.

본원에 사용되는 B7은 CTLA4 및(또는) CD28을 인식하고 그와 결합하는 B7-1 (CD80) (문헌 [Freeman et al., 1989, J Immunol., 143:2714-2722], 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨), B7-2 (CD86) (문헌 [Freeman et al., 1993, Science, 262:909-911], 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨; 문헌 [Azuma et al., 1993, Nature, 366:76-79], 이는 본원에 그 전체로 참고로 인용됨)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분자의 B7족의 임의의 구성원을 나타낸다. CD28은 미국 제5,580,756호 및 동 제5,521,288호 (이들은 본원에 그 전체로 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같이 B7을 인식하고 그와 결합하는 분자를 나타낸다. 본원에 사용되는 B7-양성 세포는 세포 표면에서 발현되는 B7 분자의 하나 이상의 유형을 갖는 임의의 세포를 포함한다.

본원에 사용되는 "유도체"는 그의 모 분자의 서열 유사성 및 활성을 갖는 분자이다. 예를 들어, CTLA4의 유도체는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인에 대해 70％ 이상 유사한 아미노산 서열을 가지고, B7을 인식하고 그와 결합하는 가용성 CTLA4 분자, 예컨대 CTLA4Ig 또는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 포함한다. 유도체는 아미노산의 아미노산 서열 및(또는) 화학적 품질에 대한 임의의 변화, 예컨대 아미노산 유사체를 의미한다.

본원에 사용되는 면역 반응의 조절은 면역 반응을 활성화, 자극, 상향조절, 억제, 블로킹, 저하, 약화, 하향조절 또는 개질하는 것이다. 각종 질환, 예컨대 자가면역 질환은 면역 반응, 예컨대 B7-양성 세포로 기능적 CTLA4- 및(또는) CD28-양성 세포 상호작용을 조절함으로써 처리할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응의 조절 방법은 B7-양성 세포를 가용성 CTLA4 분자, 예컨대 본 발명에 따라 생산된 것과 접촉시켜 가용성 CTLA4/B7 복합체를 형성하는 것을 포함하며, 여기서 가용성 CTLA4 분자는 내인성 CTLA4 및(또는) CD28 분자와 B7 분자와의 반응을 간섭한다. 본원에 나타내는 바와 같이 수용체, 시그날 또는 분자를 "블로킹" 또는 "억제"하는 것은 수용체, 시그날 또는 분자의 활성화를 간섭 (당업계 인지 시험에 의해 탐지됨)하는 것을 의미한다. 블로킹 또는 억제는 부분 또는 전체일 수 있다.

본원에 사용되는 "B7 상호작용의 블로킹"은 B7이 그의 리간드, 예컨대 CD28 및(또는) CTLA4에 결합하는 것을 간섭하여 T-세포 및 B7-양성 세포 상호작용을 방해하는 것을 나타낸다. B7 상호작용을 블로킹하는 제제의 예에는 임의의 CTLA4, CD28 또는 B7 분자 (예컨대, B7-1, B7-2)를 인지하여 그와 결합하는 분자, 예컨대 항체 (또는 그의 부위); 가용성 CTLA4와 같은 분자의 가용성 형태 (또는 그의 부위); CTLA4/CD28/B7-매개 상호작용을 통해 세포 시그날을 간섭하도록 디자인한 펩티드 단편 또는 다른 소분자가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 블로킹 제제는 가용성 CTLA4 분자, 예컨대 CTLA4Ig (ATCC 68629) 또는 L104EA29YIg (ATCC PTA-2104); 가용성 CD28 분자, 예컨대 CD28Ig (ATCC 68628); 가용성 B7 분자, 예컨대 B7-Ig (ATCC 68627); 항-B7 모노클로날 항체 (예컨대, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 및 모노클로날 항체, 이는 미국 특허 제6,113,898호 또는 문헌 [Yokochi et al., 1982, J. Immunol., 128(2):823-827에 기재되어 있음); 항-CTLA4 모노클로날 항체 (예컨대, ATCC HB-304, 및 모노클로날 항체, 이는 참조문헌 82-83에 기재되어 있음); 및(또는) 항-CD28 모노클로날 항체 (예컨대, ATCC HB 11944 및 MAb 9.3, 이는 문헌 [Hansen et al., 1980, Immunogenetics, 10: 247-260, 또는 Martin et al., 1984, J. Clin. Immunol., 4(1):18-22]에 기재되어 있음)이다. B7 상호작용의 블로킹은 T-세포/B7-세포 상호작용에서의 감소 또는 B7과 CTLA4/CD28과의 상호작용에서의 감소를 측정함으로써 당업계 인지되는 시험, 예컨대 면역 질환 (예컨대, 류마티스성 질환) 관련 증상의 저하 측정에 의해 탐지될 수 있다. 블로킹은 부분 또는 전체일 수 있다.

또한, 본원에 사용되는 유효량의 분자는 분자와 그의 리간드와의 상호작용을 블로킹하는 양을 나타낸다. 예를 들어, B7과 CTLA4 및(또는) CD28과의 상호작용을 블로킹하는 분자의 유효량은 B7 분자가 B7-양성 세포 상에 결합하는 경우에 B7 분자가 내인성 리간드, 예컨대 CTLA4 및 CD28에 결합하는 것을 억제하는 분자의 양이다. 또는, B7과 CTLA4 및(또는) CD28과의 상호작용을 블로킹하는 분자의 유효량은 CTLA4 및(또는) CD28 분자가 T 세포 상에 결합하는 경우에 B7 분자가 내인성 리간드, 예컨대 CTLA4 및 CD28에 결합하는 것을 억제하는 분자의 양이다. 억제 또는 블로킹은 부분 또는 전체일 수 있다.

임상 프로토콜의 경우에, 융합 단백질의 Ig 잔기, 예컨대 CTLA4Ig 또는 돌연변이체 CTLA4Ig가 불리한 면역 반응을 대상체에서 도출시키 않는 것이 바람직하다. 바람직한 잔기는 인간 또는 비-인간 영장류 Ig 불변 영역을 포함하는 Ig 불변 영역의 모두 또는 일부이다. 적합한 Ig 영역의 예에는 이펙터 기능, 예컨대 Fc 수용체에 결합하는 것, 상보성-의존 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 관련된 힌지, CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgCγ1 (IgC감마1), IgCγ2 (IgC감마2), IgCγ3 (IgC감마3), IgCγ4 (IgC감마4), IgCμ (IgC뮤), IgCα1 (IgC알파1), IgCα2 (IgC알파2), IgCδ (IgC델타) 또는 IgCε (IgC엡실론)이 포함된다. Ig 잔기는 그중에 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 이펙터 기능, 예컨대 CDC 또는 ADCC를 감소시키기 위해 CH2 도메인 중에 있는 것)를 가지며, 여기서 상기 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Ig의 결합능을 상승 또는 저하시킴으로써 Ig의 리간드에 대한 Ig의 결합능을 조정한다. 예를 들어, Ig 잔기 중의 돌연변이는 힌지 도메인 내의 그의 시스테인 잔기의 임의의 것 또는 모두에서의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 8에 나타낸 바와 같이, 위치 +130, +136, 및 +139에서의 시스테인은 세린으로 치환된다. Ig 잔기는 또한 세린으로 치환되는 위치 +148에서의 프롤린을 도 8에 나타낸 바와 같이 포함할 수 있다. 추가로, Ig 잔기 중의 돌연변이는 페닐알라닌으로 치환되는 위치 +144에서의 류신; 글루탐산으로 치환되는 위치 +145에서의 류신; 또는 알라닌으로 치환되는 위치 +147에서의 글리신을 갖는 것을 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 본 발명의 특정 측면을 기재하고, 당업자를 위해 본 발명의 방법의 설명을 제공한다. 실시예는 본 발명을 제한하지 않고, 단지 예로서 본 발명 및 그의 각종 측면의 이해 및 실행에 유용한 특정 방법 및 예시를 제공하는 것으로 구성되어야 한다.

하기 실시예 1 및 2는 다중 온도 이동과 조합하여 사용하는 갈락토스 공급을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 실험을 기술한다. 실시예 3 내지 6은 갈락토스 공급 없이 배양 운행 동안 온도 이동을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 실험을 기술한다. 실시예 7 내지 13은 갈락토스 공급 및 다중 온도 이동과 조합하여 다가음이온성 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 세포 배양 방법에 관한 실험을 기술한다.

실시예 1

이 실시예는 일반적으로 실시예 2에서 본원에 기재된 바와 같이 예시된 CTLA4Ig 융합 단백질을 생산하는 재조합 세포의 배양을 위해 본 발명의 D-갈락토스 연속 공급 배양 방법을 기술한다.

T-75 플라스크, 250, 500 및 1000-mL 스피너를 사용하여 글루타민, 중탄산나트륨, 인슐린 및 메토트렉세이트 (표 1)를 함유한 개질 CD-CHO 배지 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에서 세포를 부피 증대하였다. T-플라스크 및 스피너를 37 ℃ 및 6％ CO₂에서 인큐베이션하였다.

개질 CD-CHO 배지 성분	농도
CD-CHO 25x 산 I (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
CD-CHO 25x 산 II (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
CD-CHO 25x 염 I (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
CD-CHO 25x 염 II (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
L-글루타민 (인비트로겐)	0.585 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL) (인비트로겐)	0.1 ml/L
메토트렉세이트 (20 mM 용액) (미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재의 ICN)	5 ㎕/L
중탄산나트륨 (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 말렌크로드트 베이커 (Mallenkrodt Baker))	2.22 g/L

충분한 접종물을 생산한 후에, 동일한 배지의 3 또는 30 L 작업 부피를 각각 갖는 5 또는 50 L 생반응기 내로 배양물을 옮겼다. 초기 시딩 밀도는 200,000 생존가능 세포/mL이었다. 5 L 용기는 1개의 해양 추진기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 아플리콘(Applikon))을 장착한 유리 반응기이고, 50 L 용기는 2개의 해양 추진기를 장착한 스테인레스 스틸 반응기 (미국 뉴욕주 시라쿠세 소재의 펠드메이어(Feldmeier))이었다. 인텔루션 픽스32 (Intellution Fix32)를 사용하는 데이타 획득 시스템이 운행 전체에 걸쳐 온도, pH, 및 DO를 기록하였다. 기류를 유량계를 통해 조절하였다. 침하된 프릿 (5 ㎛ 공경) 및 CO₂ 제거용 반응기 헤드 스페이스를 통해 반응기 내로 공기를 살포하였다. DO 조절을 위해 동일한 프릿을 통해 분자 산소를 살포하였다. 높은 측면 pH 조절을 위해 CO₂를 동일한 프릿을 통해 살포하였다. 낮은 측면 pH 조절을 1 N NaOH의 첨가를 통해 실현하였다.

생반응기 중의 배양물에 글루코스, 글루타민, 인슐린, TC 이스톨레이트 (Yeastolate) (벡톤 딕킨손 (Becton Dickinson)) 및 D-갈락토스를 함유한 개질 eRDF 배지 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) (표 2)를 사용하여 하기 방식으로 매일 볼루스 공급하였다: 접종 1일 후에 시작하여, 최소의 1％ 배양 부피를 공급 배지로서 첨가하고; 글루코스 수준이 3 g/L 미만으로 떨어지는 경우에, 계산된 부피를 첨가하여 글루코스 수준을 3 g/L으로 다시 회복시켰다. 발효 프로세스의 기간은 14-21일이었다. 샘플을 반응기로부터 매일 채취하였다. 세포 계수용 샘플을 트리판 블루 (미국 미주리주 소재의 시그마)로 염색하였다. 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 혈구계/현미경을 통해 수행하였다. 대사물을 분석하는 경우에, 세포 분리를 위해 추가 샘플을 20 분 동안 2000 rpm (4 ℃)에서 원심분리하였다. 상청액을 하기 파라미터에 대해 분석하였다: 역가, 시알산, 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, pH, pO₂, pCO₂, 암모니아, 및 LDH.

개질 eRDF 배지 성분	농도
eRDF-I (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	16.8 g/L
덱스트로스 (VWR-말렌크로드트 베이커)	30.94 g/L
L-글루타민 (인비트로겐)	4.1 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL) (인비트로겐)	1 ml/L
TC 이스톨레이트 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 딕킨손)	5 g/L
D-갈락토스 (미국 일리노이주 와우케간 소재의 페로-프판스티에흘 (Ferro-Pfanstiehl))	0, 3.0,12.5, 또는 20.0 g/L

3개의 해양 추진기를 장착하고, 종횡비 3:1인 스테인레스 스틸 반응기 (미국 뉴욕주 소재의 펠드메이어)를 사용하여 4500 L 작업 부피를 갖는 5000 L 반응기 규모에서 대규모 세포 배양을 수행하였다. 접종 배양물을 스피너로부터 시드 반응기로 부피 증대하고, 5000-L 규모에서의 초기 시딩 밀도는 150 내지 200,000 생존가능 세포/mL이었다. 대규모 배양 및 프로세스 조절과 관련된 실험적 방법은 5 L 및 50 L 프로세스에 대해 기재한 것과 동일하였다.

실시예 2

이 실시예는 단백질 생산물의 최종 역가 및 최종 시알산 파라미터와 관련된 비교를 위해 실험적 배양 조건의 몇몇 세트를 사용하는, 도 3에서 -1 내지 357 또는 +1 내지 357로 나타낸 CTLA4Ig (ATCC 68629로서 기탁된 DNA를 코딩함)를 생산하는 세포의 배양을 기술한다. 2 단계 온도 이동 방법 및 매일 공급 레지멘을 모두 포함하는 세포 배양 방법으로부터 이들 결과를 얻으며, 여기서 시알산 지속 유효량의 D-갈락토스가 공급 배지에 존재하였다. 개선된 생성물 품질 향상을 관찰하였다.

5, 50, 및 5000-L 생반응기에서의 배양 조건을 하기와 같이 조절하였다: pH 7.0, 용존 산소 40-60％, 교반 30-50 rpm, 역압 5 psi (5-L 유리 반응기에 대한 주위 압력). 37 ℃의 제1 온도, 34 ℃의 제2 온도로 6일째에 낮추고, 32 ℃의 제3 온도로 10일째에 낮추는 것을 포함하는 이중-온도 이동 세포 배양 방법을 사용하였다.

실험적 세트의 기재

실험적 세트 I: D-갈락토스를 함유하지 않는 공급 배지를 사용하는 5-L 배양;

실험적 세트 II: 12.5 g/L의 D-갈락토스를 함유하는 공급 배지를 사용하는 5-L 배양;

실험적 세트 III: D-갈락토스를 함유하지 않는 공급 배지를 사용하는 50-L 배양;

실험적 세트 IV: 3.0 g/L의 D-갈락토스를 함유하는 공급 배지를 사용하는 50-L 배양; (실험적 세트 IV에서, D-갈락토스 공급을 10일째에 중단하고, 일반 공급 배지 (D-갈락토스 없음)를 이어서 11 내지 16일 동안 사용하였음);

실험적 세트 V: 12.5 g/L의 D-갈락토스를 함유하는 배지를 사용하는 50-L 배양;

실험적 세트 VI: 20.0 g/L의 D-갈락토스를 함유하는 배지를 사용하는 50-L 배양;

실험적 세트 VII: D-갈락토스를 함유하지 않는 공급 배지를 사용하는 5000-L 배양; 및

실험적 세트 VIII: 12.5 g/L의 D-갈락토스를 함유하는 공급 배지를 사용하는 5000-L 배양.

표 3에 나타낸 결과로부터 얻는 바와 같이, 공급 배지 중의 12.5 g/L의 D-갈락토스의 사용은 5, 50, 및 5000-L 규모에서 D-갈락토스를 공급에 함유하지 않는 대조군에 비해 생성물의 시알산 함량을 유의하게 증가시켰다. 추가로, 10일째에 중단하는 50-L 규모에서의 D-갈락토스 3 g/L의 첨가는 일시적으로 시알릴화 정도에 대한 양성적 영향을 가지지만 (실험적 세트 IV; 표 3; 및 도 1), 시알산 수준이 10일 직후에 감소되었다. 시알릴화의 정도는 50-L 규모에서 공급 배지 중의 더 높은 농도의 D-갈락토스 (12.5 g/L)로 증가하였다 (실험적 세트 V; 표 3; 도 1). 이 발견은 D-갈락토스를 포함하는 공급 배지를 사용하는 배지 및 매일 공급 레지멘에서 D-갈락토스 공급 농도가 더 높다라는 것을 지지한다.

실시예 #	반응기 규모 [L]	공급 계획	SA (NANA) [몰비 대 총 단백질]	갈락토스 [몰비 대 총 단백질]	역가 [g/L]
I	5	공급 배지 중에 D-갈락토스 없음	7.5(12일)	8.8(12일)	1.8(14일)
II	5	공급 배지 중에 D-갈락토스 12.5 g/L	9.1(12일)	15.9(12일)	1.9(14일)
III	50	공급 배지 중에 D-갈락토스 없음	6.1(13일) 5.0(16일)	9.2(13일) 8.1(16일)	1.4(13일) 2.0(16일)
IV	50	공급 배지 중에 D-갈락토스 3.0 g/L; 10일째에 D-갈락토스 공급 중단	7.8(13일) 5.5(16일)	n/a n/a	1.2(13일) 1.9(16일)
V	50	공급 배지 중에 D-갈락토스 12.5 g/L	9.4(14일) 8.2(20일)	13.3(14일) 14.4(20일)	1.4(14일) 2.4(20일)
VI	50	공급 배지 중에 D-갈락토스 20.0 g/L	8.4(14일) 6.2(21일)	14.5(14일) 11.2(21일)	1.4(14일) 2.7(21일)
VII	5000	공급 배지 중에 D-갈락토스 없음	5.3(12일)	9.1(12일)	0.85(12일)
VIII	5000	공급 배지 중에 D-갈락토스 12.5 g/L	9.7(14일)	11.5(14일)	0.80(14일)

이들 실험에 따라, D-갈락토스의 첨가는 세포 특이적 생산성 (즉, 역가 증가)에 유의하게 영향을 미치지 않았다 (도 2). 공급에서 D-갈락토스 농도의 추가 증가 (즉, 20.0 g/L로)는 추가로 유익한 효과가 없었다 (실험적 세트 VI; 표 3; 도 1). 도 3은 50 L 및 5000 L 규모에서 최적인 것으로 밝혀진 공급 중에 D-갈락토스 12.5 g/L 농도의 배양에서의 잔여 D-갈락토스 농도를 나타낸다. 역가가 증가한 생산기 (즉, 6-21일) 동안에, 배양물 중의 잔여 D-갈락토스 농도가 0.25 g/L 이상에서 유지되도록 요구되었다. 도 4는 5000 L로의 CTLA4Ig 생산을 위한 세포 배양 방법의 규모 확대 동안 관찰된 규모 영향을 나타낸다. 당단백질의 시알릴화는 반응기 규모 증가로 저하되었다. 도 5는 D-갈락토스 12.5 g/L를 공급 배지 내로 첨가한 후의 규모 영향의 역전을 나타낸다. D-갈락토스를 매일 공급하는 기술은 대량의 고도로 시알릴화된 CTLA4Ig를 대규모, 예를 들어 50 L, 예컨대 5000 L 생산 반응기로 생산할 수 있게 하였다.

실시예 3

이 실시예는 구체적으로 본원의 실시예 4 내지 6에 기재되는 온도 이동 세포 배양 방법에 관한 것이고, CTLA4Ig 융합 단백질을 생산하는 재조합 세포를 배양하기 위한 온도 이동 방법에 사용되는 재료 및 시약을 제공한다.

1. 세포 배양 배지

세포 접종물 생산의 모든 시기 동안 및 배양물의 성장 동안 5 리터 (5 L) 및 50 리터 (50 L) 생산 반응기를 포함하는 생반응기 중에 사용하는 기초 세포 배양 배지는 글루타민, 중탄산나트륨, 인슐린 및 메토트렉세이트를 함유한 개질된 CD-CHO 배지였다 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐; 표 1 참조). 배지를 pH 7.0으로 1 N HCl을 사용하여 조정하였다.

공급 회분식 방법으로 세포에 공급하는 경우에는, 글루코스, 글루타민, 인슐린 및 TC 이스톨레이트 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 딕킨손)를 함유한 개질된 공급 배지, 즉 eRDF-1 배지 (인비트로겐) (표 2)를 사용하였다. 이들 실험을 위해서, 갈락토스는 공급 배지에 존재하지 않았다. 모든 성분을 첨가한 후에, 공급 배지를 pH 7.0으로 1 N NaOH를 사용하여 조정하였다.

2. 생반응기에서의 생산기

온도, 압력, pH 및 용존 산소 농도를 면밀히 모니터링 및 조절하며 생산 생반응기를 초기에 회분식 반응기로서 작업하였다. 배양의 조건은 생존가능한 세포 밀도 및 몇몇의 중요한 대사물의 농도를 측정함으로써 평가하였다. 공급 방법을 접종 1일 후에 개시하였다. 잔여 발효를 공급 회분식 방식으로 수행하였다.

5 L 규모 (1개의 해양 추진기를 갖는 유리 반응기) 및 50 L 규모 (2개의 해양 추진기를 갖는 스테인레스 스틸 반응기)의 생반응기를 사용하였다 (실시예 4 참조). 데이타 획득 시스템 (인텔루션 픽스 32)으로 운행 전체에 걸쳐 온도, pH, 및 용존 산소 (DO)를 기록하였다. 기류를 유량계를 통해 조절하였다. 침하된 프릿 (5 ㎛ 공경) 및 CO₂ 제거용 반응기 헤드 스페이스를 통해 반응기 내로 공기를 살포하였다. DO 조절을 위해 동일한 프릿을 통해 분자 산소를 살포하였다. pH 조절을 위해 사용하는 바와 같이 동일한 프릿을 통해 CO₂를 살포하였다.

3. 공급 계획

접종 24 시간 후에, 글루코스 농도가 3.0 g/L인 경우에 일일 최소인 배양 부피 1％의 개질 eRDF-I 공급 배지를 생반응기 내에 첨가하였다. 글루코스 농도가 3 g/L 미만인 경우에, 일일 볼루스 공급의 부피를 계산하여 글루코스 농도를 3.0 g/L로 되돌렸다. 일일 공급량을 배치 시트 상에 기록하였다.

4. 샘플링

세포의 샘플을 반응기로부터 채취하였다. 세포 계수용 샘플을 트리판 블루 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)로 염색하였다. 현미경을 사용하는 혈구계측을 통해 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. 대사물을 분석하는 경우에, 세포 분리를 위해 추가 샘플을 20 분 동안 2000 rpm (4 ℃)에서 원심분리하였다. 상청액을 하기 파라미터에 대해 분석하였다: 역가, 시알산, 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, pH, pO₂, pCO₂, 암모니아, 및 임의로 락테이트 데히드로게나제 (LDH). 추가 예비 샘플을 -20 ℃에서 동결시켰다.

실시예 4

이 실시예는 배양된 CHO 세포로부터 도 8에 -1 내지 357 또는 +1 내지 357로서 나타낸 CTLA4Ig (ATCC 68629로서 기탁된 DNA를 코딩함)의 생산을 기술한다. 이 실시예는 추가로 2- 또는 3-단계 온도 이동 및 총 운행 시간 14, 21, 또는 28-30일을 갖는 배양 운행을 포함하는 높은 양 및 품질 모두의 CTLA4Ig 단백질을 생산하기 위한 본 발명의 방법을 기술한다. 37 ℃에서 34 ℃로의 온도 이동 (T-이동)을 6일째 (대수 성장기의 말미)에 수행하고, 34 ℃에서 32 ℃로의 제2 T-이동을 10일째에 수행하였다. 운행을 14, 21 또는 28일째에 종료하고, 2 단계 이동을 위해, 온도를 10일째 이동으로부터 운행이 종료될 때까지 32 ℃로 조절하였다. 3-단계 이동을 위해, 온도를 이동일로부터 운행이 종료될 때까지 30 ℃로 조절하였다. 상기 방법은 단일 온도 이동 또는 온도 이동 없는 운행에 비해 단백질 생산물의 최종 역가, 최종 세포 생존율, 및 용적측정 생산성을 증가시켰다. 본 발명에 따라, 제2 및 제3 T-이동은 높은 세포 생존력을 유지하면서 표준 발효 (배양) 방법의 운행 시간을 2 내지 3주 (또는 그 초과)로 연장시켰다. 생성물 역가의 증가가 직선에 가깝게 생산 기간 전체에 걸쳐 관찰되었다.

T-75 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 (Corning)) 및 250 및 500 mL 스피너 (미국 뉴욕주 비넬랜드 소재의 벨코 (Bellco))를 사용하여 글루타민, 중탄산나트륨, 인슐린, 및 메토트렉세이트 (실시예 3 참조)를 함유한 개질 CD-CHO 배지에서 CTLA4Ig 발현에 사용된 CHO 세포를 부피 증대하였다. T-플라스크 및 스피너를 6％ CO₂ 중에 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 충분한 접종물을 생산한 후에, 배양물을 상기 배지의 3L 또는 30L 작업 부피를 각각 갖는 5 L (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 아플리콘) 또는 50 L 생반응기 (미국 뉴욕주 시라쿠세 소재의 펠드메이어) 내로 옮겼다. 초기 시딩 밀도가 약 2 x 10⁵ 생존가능 세포/mL이었다.

5 L 용기는 1개의 해양 추진기를 장착한 유리 반응기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 아플리콘)이고; 50 L 용기는 2개의 해양 추진기를 장착한 스테인레스 스틸 반응기 (미국 뉴욕주 시라쿠세 소재의 펠드메이어)이었다. 인텔루션 픽스32 (미국 매사추세츠주 폭스보로 소재의 인텔루션)를 사용하는 데이타 획득 시스템으로 운행 전체에 걸쳐 온도, pH, 및 용존 산소 (DO)를 기록하였다. 기류를 유량계 (미국 일리노이주 베르논 소재의 힐스 콜 파머 (Cole Parmer))를 통해 조절하였다. 침하된 프릿 (5 ㎛ 공경) 및 CO₂ 제거용 반응기 헤드 스페이스를 통해 반응기 내로 공기를 살포하였다. DO 조절을 위해 동일한 프릿을 통해 분자 산소를 살포하였다. 높은 측면 pH 조절을 위해 CO₂를 동일한 프릿을 통해 살포하였다. 낮은 측면 pH 조절을 1 N NaOH의 첨가를 통해 실현하였다. 제한 없이, 허용가능한 pH 범위는 pH 6-9, 바람직하게는 pH 6.8-7.2이고, 오스몰농도가 200-500 mOsm, 바람직하게는, 280-340 mOsm이었다.

생반응기 중의 배양물에 실시예 3에 기재한 바와 같이 글루코스, 글루타민, 인슐린 및 TC 이스톨레이트 (벡톤 딕킨손)을 갖는 개질 eRDF 배지 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)를 사용하여 하기와 같이 매일 볼루스 공급하였다: 접종 1일 후에 시작하여, 최소의 1％ 배양 부피를 공급 배지로서 첨가하거나, 또는 글루코스 수준이 3 g/L 미만으로 떨어지는 경우에, 계산된 부피를 첨가하여 글루코스 수준을 3 g/L으로 다시 회복시켰다.

발효 프로세스의 기간은 5 L 규모에서 21일 및 50 L 규모에서 28일이었다. 50 L 규모에서의 배양 운행 기간이 길어진 것은 운행 동안 추가된 온도 이동과 상관 관계가 있었다. 분석을 위해 샘플을 반응기로부터 매일 채취하였다. 예를 들어, 세포 계수용 샘플을 트리판 블루 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)로 염색하였다. 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 혈구계 및 현미경 하의 생존가능 염색 세포 계수를 사용하여 수행하였다. 대사물을 분석하는 경우에, 추가 샘플 분취물을 20 분 동안 2000 rpm (4 ℃)에서 원심분리하여 세포를 펠렛화시켰다. 당업계에 통상적으로 실행되는 기술 및 프로토콜을 사용하여 상청액을 단백질 역가, 시알산, 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, pH, pO₂, pCO₂, 암모니아 및 LDH에 대해 분석하였다.

실시예 5

이 실시예는 본 발명의 일 측면에 따라 수행하는 다단계 배양 방법을 포함하는 각종 온도 이동 배양 과정을 평가하기 위한 비교 평가를 기술하고, 그 결과를 나타낸다. 당단백질 생성물의 최종 역가 (g/L)를 측정하며, 단백질의 최종 역가 시알산 함량, 운행의 말미에서의 세포 생존율 (최종 세포 생존율) 및 운행의 말미에서의 세포 밀도 (생존가능한 최종 세포 밀도)도 측정하였다.

실험 I-A, I-B 및 I-C; II-A, II-B 및 II-C; 및 III-A, III-B 및 III-C는 상이한 시간에 평가한 동일한 온도 이동 프로파일을 갖는 동일한 세포 배양 운행을 나타내는데, 즉 생성물 및 세포 파라미터를 I-A, II-A, 및 III-A의 경우 14일 후에 평가하고, I-B, II-B 및 III-B의 경우 21일 후에 평가하고, I-C, II-C 및 III-C의 경우 28일 후에 평가하였다. 배양 조건을 하기와 같이 조절하는 5 L 생반응기에서 이들 실험을 수행하였다: pH 7.0; 용존 산소 40％; 교반 60 rpm; 초기 온도 37 ℃. 데이타를 본 발명의 방법에 따른 공급 회분식 세포 배양 발효로부터 얻었다.

실험 I, II 및 III을 하기와 같이 디자인하였다:

실험 I: 세포 배양 온도를 0일 내지 21일 동안 37 ℃로 조절하였다 (온도 이동 없음).

실험 II: 세포 배양 온도를 0일 내지 6일 동안 37 ℃로 조절하고, 6일 내지 21일 동안 34 ℃로 조절하였다 (단일 온도 이동).

실험 III: 세포 배양 온도를 0일 내지 6일 동안 37 ℃로 조절하고, 6일 내지 10일 동안 34 ℃로 조절하고, 10일 내지 21일 동안 32 ℃로 조절하였다 (본 발명의 2 단계 온도 이동 과정).

실험 IV-A 및 V-A는 초기 (표준) 생산기를 갖는 14일 배양 운행 후에 평가한 생성물 역가, 최종 세포 생존율 및 생존가능한 최종 세포 밀도의 결과를 나타내고; 실험 IV-B 및 V-B는 연장된 생산기를 갖는 21일 배양 운행 후에 평가한 이들 결과를 나타내고; 실험 IV-C 및 V-C는 제2 연장된 생산기를 갖는 28일 배양 운행 후에 평가한 이들 결과를 나타낸다. 실험 IV 및 V는 배양 조건을 하기와 같이 조절하는 50 L 생반응기에서 수행하였다: pH 7.0; 용존 산소 40％; 교반 30 rpm; 초기 온도 37 ℃.

실험 IV 및 V를 하기와 같이 디자인하였다:

실험 IV: 세포 배양 온도를 0일 내지 6일 동안 37 ℃로 조절하고, 6일 내지 10일 동안 34 ℃로 조절하고, 10일 내지 28일 동안 32 ℃로 조절하였다 (본 발명의 2 단계 온도 이동 과정).

실험 V: 세포 배양 온도를 0일 내지 6일 동안 37 ℃로 조절하고, 6일 내지 10일 동안 34 ℃로 조절하고, 10일 내지 14일 동안 32 ℃로 조절하고, 14일 내지 28일 동안 30 ℃로 조절하였다 (본 발명의 3-단계 온도 이동 과정). 실험 V-A, V-B 및 V-C는 상이한 시간에 평가한 동일한 온도 이동 프로파일을 갖는 동일한 세포 배양 운행을 나타내는데, 즉 생성물 및 세포 파라미터를 V-A의 경우 14일 후에 평가하고, V-B의 경우 21일 후에 평가하고, V-C의 경우 28일 후에 평가하였다.

실험 I-V는 상기 기재한 바와 같이 5개의 상이한 배양 운행을 나타낸다. 상기 기재한 바와 같이, 14일 운행을 "A"로 나타내고; 21일 운행을 "B"로 나타내고; 28일 운행을 "C"로 나타낸다.

표 4는 5 L 반응기 규모 배양에서의 세포에 의해 CTLA4Ig의 생산에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타내는 실험의 결과를 나타낸다.

실험 #	반응기 규모 (L)	온도 이동	최종 역가 (g/L)	최종 역가 (％) (100％에 대한 실험 I-A 세트)	최종 SA (NANA*) (몰비)	최종 역가* 최종 SA (NANA)	최종 세포 생존율 (％)	생존가능한 최종 세포 밀도 (x106 세포/mL)
초기 (표준) 생산기를 갖는 14일 운행 후에 생산물 역가, 최종 세포 생존율 및 생존가능한 최종 세포 밀도를 평가함
I-A	5	37 ℃ (0 내지 14일) - T-이동 없음 -	0.73	100	7.3	5.3	56	0.8
II-A	5	37 ℃ (0 내지 6일) 34 ℃ (6 내지 14일) - 1 단계 T-이동 -	1.30	178	8.1	10.5	82	1.5
III-A	5	37 ℃ (0 내지 6일) 34 ℃ (6 내지 10일) 32 ℃ (10 내지 14일) - 2 단계 T-이동 -	2.30	315	7.6	17.5	81	3.1
연장된 생산기를 갖는 21일 운행 후에 생산물 역가, 최종 세포 생존율 및 생존가능한 최종 세포 밀도를 평가함
I-B	5	37 ℃ (0 내지 21일) - T-이동 없음 -	1.30	178	6.6	8.6	20	0.3
II-B	5	37 ℃ (0 내지 6일) 34 ℃ (6 내지 21일) - 1 단계 T-이동 -	2.70	370	5.3	14.3	28	0.4
III-B	5	37 ℃ (0 내지 6일) 34 ℃ (6 내지 10일) 32 ℃ (10 내지 21일) - 2 단계 T-이동 -	3.50	480	6.5	22.8	57	1.7
*: "NANA" (N-아미노-N-노이라민산)는 시알산 (SA)을 나타냄. "최종 NANA"는 배양의 말미에서 생성물의 NANA를 나타냄.

표 5는 50 L 반응기 규모 배양에서의 세포에 의해 CTLA4Ig의 생산에 대한 상이한 온도 이동 프로파일의 영향을 나타내는 실험의 결과를 나타낸다.

실험 #	반응기 규모 (L)	온도 이동	최종 역가 (g/L)	최종 세포 생존율 (％)	생존가능한 최종 세포 밀도 (x106 세포/mL)
초기 (표준) 생산기를 갖는 14일 운행 후에 생산물 역가, 최종 세포 생존율 및 생존가능한 최종 세포 밀도를 평가함
IV-A	50	37 ℃ (0 내지 6일); 34 ℃ (6 내지 10일); 32 ℃ (10 내지 14일) - 2 단계 T-이동 -	1.4	95	5.5
V-A	50	37 ℃ (0 내지 6일); 34 ℃ (6 내지 10일); 32 ℃ (10 내지 14일); 30 ℃ (14 내지 21일) - 3 단계 T-이동 -	1.4	91	5.4
연장된 생산기를 갖는 21일 운행 후에 생산물 역가, 최종 세포 생존율 및 생존가능한 최종 세포 밀도를 평가함
IV-B	50	37 ℃ (0 내지 6일); 34 ℃ (6 내지 10일); 32 ℃ (10 내지 21일) - 2 단계 T-이동 -	2.5	67	2.5
V-B	50	37 ℃ (0 내지 6일); 34 ℃ (6 내지 10일); 32 ℃ (10 내지 14일); 30 ℃ (14 내지 21일) - 3 단계 T-이동 -	2.6	82	3.2
생산기의 추가 연장을 갖는 28일 운행 후에 생산물 역가, 최종 세포 생존율 및 생존가능한 최종 세포 밀도를 평가함
IV-C	50	37 ℃ (0 내지 6일); 34 ℃ (6 내지 10일); 32 ℃ (10 내지 28일) - 2 단계 T-이동 -	2.8	47	1.1
V-C	50	37 ℃ (0 내지 6일); 34 ℃ (6 내지 10일); 32 ℃ (10 내지 14일); 30 ℃ (14 내지 28일) - 3 단계 T-이동 -	3.1	69	1.4

이 실시예의 실험으로 입증한 바와 같이, 다단계 온도 이동 프로파일은 배양 방법 전체에 걸쳐 높은 세포 생존력을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 상기 표 4에서, 실험 III-B는 정기적 2 단계 온도 이동 프로파일을 사용함으로써 21일 배양 방법 (연장된 생산기 포함) 전체에 걸쳐 높은 세포 생존력 (또한 도 6 참조)을 유지하며, 높은 시알산 함량 6.5 [몰비]에서 역가를 3.5 g/L에 도달한다는 것을 나타낸다. 2 단계 배양 과정의 성공을 또한 '최종 역가 x 최종 시알산"의 수리적 생성물의 높은 값으로 입증할 수도 있다 .

대조적으로, 온도 이동 없는 배양 방법 (표 4, 실험 I-B)은 세포 생존력에서 초기 저하를 유도하였다. 추가로, 1-단계 온도 이동 (표 4, 실험 II-B)을 사용함으로써 본 발명에 따른 2 단계 온도 이동 프로파일 및 방법에 비해 더 낮은 최종 역가, 최종 시알산, 및 '최종 역가 x 최종 시알산"- 수리적 생성물을 얻는 것으로 밝혀졌다.

또한, 50 L 반응기 규모에서 수행하는 세포 배양과 관련된 표 5에 나타낸 결과는 본 발명의 다단계 온도 이동 배양 기술의 이점을 입증한다. 30 ℃로의 제3 온도 이동은 14일째에 수행하도록 하였다. 특히, 세포 생존율 및 최종 역가에 대한 삼중 온도 이동의 이점 (표 5, 실험 V-C; 또한 도 7)을 이중 온도 이동에 비해 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 삼중 온도 이동은 이동이 없거나 또는 단일 이동 방법에 상대적으로 추가로 세포 생존력을 연장하여 단백질 생산을 연장시키며, 이는 표 5, 특히 예를 들어 연장된 21 및 28일 배양 운행으로부터 관찰할 수 있다. 세포 배양에서 통상적인 규모 확대 영향 때문에, 50 L 반응기 규모에서의 역가 증대는 5 L 규모에서보다 다소 더 늦는 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 영향이 본 발명에 의해 제공되는 2 단계 이상의 온도 이동 배양 운행의 이점을 감소시키지 않는다는 것이 용이하게 인식된다.

실시예 5에 나타낸 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 온도 이동을 6일째에, 즉 대수 성장기의 말미에 수행하는 운행의 경우에 온도 이동 부재인 대조군 운행에 비해 최종 역가 및 세포 생존율에서 휠씬 더 양호한 결과를 얻었다. 결과로부터 얻을 수 있는 바와 같이, 용적측정 생산성이 단일 온도 이동의 사용에 의해 2배 증가하였다. 10일째의 제2 온도 이동은 더 높은 세포 생존력 및 추가로 증가된 용적측정 생산성 (T-이동 없이 운행한 것에 비해 대략 3배)을 얻으면서, 생성물 품질을 높게 유지하였으며, 이는 당단백질 생산물의 시알산 함량으로 측정하였다.

실시예 6

이 실시예는 본 발명에 따른 이중 하향 온도 이동을 포함하는 세포 배양 방법이 단위 시간 당 세포 당 생산되는 단백질, 예컨대 CTLA4Ig의 양에 대해 통계적으로 유의한 효과를 가지지 않는다는 데이타를 나타낸다. 다중 온도 이동 세포 배양 (발효) 방법에 따라, 상기 방법에서 단백질의 전체 생산이 상기 방법의 말미까지 생존하는 세포를 더 생존가능하게 한다. 연장된 생산 시간 동안 세포를 더 생존시키기 때문에, 더 생존가능한 세포가 상기 방법의 말미에 목적하는 단백질을 생산한다. 또한, 이는 상기 방법 또는 배양 운행의 말미에 더 많은 양의 목적하는 단백질 생성물을 수득한다.

표 6은 본 발명에 의해 포함되는 방법에서 각종 시간에서의 세포 특이적 생산성을 나타낸다. 세포 특이적 생산성을 상기 나타낸 공식으로 측정하였다. 따라서, CTLA4Ig, 다른 가용성 CTLA4 분자, 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 생산을 위해 디자인한 배양 방법은 단백질 생산이 6일 또는 그 부근에서, 즉 기하급수적 세포 성장 이후의 대략 정지기의 개시때에 시작하는 비-성장 관련 방법이었다. 표 6에 나타낸 데이타는 실시예 5에서 수행한 실험과 관련된다.

실시예 / T-이동 파라미터	세포 특이적 단백질 생산 (시간)	세포 특이적 단백질 생산의 양
I-A / T-이동 없음	14일 후	44.7 pg/세포/일
I-B / T-이동 없음	21일 후	64.1 pg/세포/일
II-A / 단일 T-이동	14일 후	55.5 pg/세포/일
II-B / 단일 T-이동	21일 후	60.9 pg/세포/일
III-A / 이중 T-이동	14일 후	47.5 pg/세포/일
III-B / 이중 T-이동	21일 후	51.9 pg/세포/일

표 6의 세포 특이적 생산성을 상기 기재한 바와 같이 세포 밀도 및 역가 측정을 사용하여 계산하였다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 세포 밀도 측정은 보통 약 10-20％ 표준 편차 (SD), 즉 높은 SD를 가지고, 부정확하였다. 따라서, 세포 특이적 생산성의 측정은 상응하는 10-20％ 표준 편차를 가졌다. 따라서, 이들 유형 계산과 관련된 높은 SD 면에서는, 상이한 운행 시간 동안 1일 당 1 세포 당 생산된 생성물의 양이 T-이동 없음, 단일 T-이동 또는 이중 T-이동을 갖는 방법 중에서는 유의하게 상이하지 않았다. 본 발명의 신규 세포 배양 방법에 의해 생산된 고수준의 고품질 단백질 생성물 및 단백질 생산에서의 전체 증가는 다중 하향 온도 이동을 포함하는 전체 배양 방법을 통해 생존하는 더 높은 수의 생존가능한 세포로 인한 것이다.

실시예 7

실시예 7A

이 실시예 7A는 본원의 실시예 7B-13에 기재된 예시된 L104EA29YIg를 생산하는 재조합 세포를 배양하기 위한 본 발명의 방법에 사용하는 재료 및 시약을 제공한다.

1. 세포 배양 배지

세포 접종물 생산의 모든 시기 동안 사용하는 기초 세포 배양 배지는 표 6에 예시된 바와 같이 글루타민, 중탄산나트륨, 인슐린 및 메토트렉세이트 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)를 함유한 개질된 CD-CHO 배지였다. 배지를 pH 7.0으로 1 N HCl을 사용하여 조정하였다. 5 리터 (5L), 10 리터 (10L) 및 50 리터 (50L) 생산 반응기를 포함하는 생반응기 중에서 배양 성장을 위해 사용하는 기초 세포 배양 배지도 메토트렉세이트의 무함유를 제외하고는 표 6에 나타낸 개질 CD-CHO 배지였다. 배지를 pH 7.0으로 1 N HCl을 사용하여 조정하였다.

개질 CD-CHO 배지 성분	농도
CD-CHO 25x 산 I (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
CD-CHO 25x 산 II (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
CD-CHO 25x 염 I (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
CD-CHO 25x 염 II (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	40 ml/L
L-글루타민 (인비트로겐)	0.585 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL) (인비트로겐)	0.1 ml/L
메토트렉세이트 (20 mM 용액) (미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재의 ICN)	5 ㎕/L
중탄산나트륨 (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 말렌크로드트 베이커)	2.22 g/L

실시예 10을 제외한 모든 실시예에서, 공급 회분식 방법으로 세포에 공급하는 경우에는, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 글루코스, 글루타민, 인슐린 및 TC 이스톨레이트 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤-딕킨손)를 함유한 개질된 공급 배지, 즉 eRDF-1 배지 (인비트로겐)를 사용하였다. 모든 성분을 첨가한 후에, 공급 배지를 pH 7.0으로 1 N NaOH를 사용하여 조정하였다.

개질 eRDF 배지 성분	농도
eRDF-I (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)	16.8 g/L
덱스트로스 (VWR-말렌크로드트 베이커)	30.94 g/L
L-글루타민 (인비트로겐)	4.1 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL) (인비트로겐)	1 ml/L
TC 이스톨레이트 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 딕킨손)	5 g/L
D-갈락토스 (미국 일리노이주 와우케간 소재의 페로-프판스티에흘)	12.5 g/L

실시예 10의 경우에는, 공급 배지는 상기한 바와 같이 하나의 개질이 있는 것이었다: eRDF-1가 농도 25.2 g/L이었다.

2. 생반응기에서의 생산기

온도, 압력, pH 및 용존 산소 농도를 면밀히 모니터링 및 조절하며 생산 생반응기를 초기에 회분식 반응기로서 작업하였다. 배양의 조건은 생존가능한 세포 밀도 및 몇몇의 중요한 대사물의 농도를 측정함으로써 평가하였다. 공급 방법을 접종 1일 후에 개시하였다. 잔여 발효를 공급 회분식 방식으로 수행하였다.

5 L 규모 (1개의 해양 추진기를 갖는 유리 반응기), 10 L 규모 (2개의 해양 추진기를 갖는 유리 반응기) 및 50 L 규모 (2개의 해양 추진기를 갖는 스테인레스 스틸 반응기)의 생반응기를 사용하였다 (실시예 2 참조). 데이타 획득 시스템 (인텔루션 픽스 32)으로 운행 전체에 걸쳐 온도, pH, 및 용존 산소 (DO)를 기록하였다. 기류를 유량계를 통해 조절하였다. 침하된 프릿 (5 ㎛ 공경) 및 CO₂ 제거용 반응기 헤드 스페이스를 통해 반응기 내로 공기를 살포하였다. DO 조절을 위해 동일한 프릿을 통해 분자 산소를 살포하였다. pH 조절을 위해 사용하는 바와 같이 동일한 프릿을 통해 CO₂를 살포하였다.

3. 공급 계획

접종 24 시간 후에, 글루코스 농도가 3.0 g/L 이상인 경우에 일일 최소인 배양 부피 1％의 개질 eRDF-I 공급 배지를 생반응기 내에 첨가하였다. 글루코스 농도가 3 g/L 미만인 경우에, 매일 볼루스 공급의 부피를 계산하여 글루코스 농도를 3.0 g/L로 되돌렸다. 일일 공급량을 배치 시트 상에 기록하였다.

4. 샘플링

세포의 샘플을 반응기로부터 매일 채취하였다. 세포 계수용 샘플을 트리판 블루 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)로 염색하였다. 현미경을 사용하는 혈구계측 또는 세덱스 (Cedex) 자동 세포 계수기 (독일 비엘레펠트 소재의 이노바티스 아게 (Innovatis AG))를 통해 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. 대사물을 분석하는 경우에, 세포 분리를 위해 추가 샘플을 20 분 동안 2000 rpm (4 ℃)에서 원심분리하였다. 상청액을 하기 파라미터에 대해 분석하였다: 역가, 시알산, 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, pH, pO₂, pCO₂, 암모니아, 및 임의로 락테이트 데히드로게나제 (LDH). 추가 예비 샘플을 -20 ℃에서 동결시켰다.

실시예 7B

이 실시예 7B는 배양된 CHO 세포로부터 도 9에 -1 내지 357 또는 +1 내지 357로서 나타낸 L104EA29YIg (ATCC에 PTA-2104로 기탁한 DNA를 코딩함)의 생산을 기술한다.

이 실시예는 또한 다가음이온성 화합물, 더 구체적으로 덱스트란 술페이트를 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 본 발명의 방법을 기술한다.

T-75 플라스크 및 진탕-플라스크를 사용하여 L104EA29YIg 발현을 위해 사용하는 CHO 세포를 글루타민, 중탄산나트륨, 인슐린 및 메토트렉세이트를 함유하는 개질 CD-CHO 배지 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)에서 부피 증대하였다. T-플라스크 및 진탕-플라스크를 6％ CO₂ 중에 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 충분한 접종물을 생산한 후에, 메토트렉세이트의 무함유를 제외하고는 상기 기재한 바와 같이 개질 CD-CHO 배지를 사용하여 5 또는 10 L 생반응기 내로 배양물을 옮겼다. 초기 시딩 밀도가 200,000 생존가능 세포/mL 또는 10⁶ 세포/mL이었다.

5L 및 10L 용기는 1 및 2개의 해양 추진기 (미국 캘리포니아주 소재의 아플리콘)를 각각 장착한 유리 반응기들이었다. 기류를 유량계를 통해 조절하였다. 침하된 프릿 (5 ㎛ 공경) 및 CO₂ 제거용 반응기 헤드 스페이스를 통해 반응기 내로 공기를 살포하였다. DO 조절을 위해 동일한 프릿을 통해 분자 산소를 살포하였다. 높은 측면 pH 조절을 위해 CO₂를 동일한 프릿을 통해 살포하였다. 낮은 측면 pH 조절을 1 N NaOH 또는 Na₂CO₃의 첨가를 통해 실현하였다.

생반응기 중의 배양물에 글루코스, 갈락토스, 글루타민, 인슐린 및 TC 이스톨레이트 (벡톤 딕킨손)를 갖는 개질 eRDF 배지 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)를 사용하여 하기 방식으로 매일 볼루스 공급하였다: 접종 1일 후에 시작하여, 최소의 1％ 배양 부피를 첨가하거나, 또는 글루코스 수준이 3 g/L 미만으로 떨어지는 경우에, 계산된 부피를 첨가하여 글루코스 수준을 3 g/L으로 다시 회복시켰다.

실시예 13을 제외한 모든 실시예에서, 온도를 0 내지 6일 동안 37 ℃에서; 6 내지 10일 동안 34 ℃에서; 10일째부터 32 ℃에서 조절하였다.

발효 방법의 전형적인 기간은 14-19일이었다. 샘플을 반응기로부터 매일 채취하였다. 세포 계수용 샘플을 트리판 블루 (미국 미주리주 소재의 시그마)로 염색하였다. 세덱스 자동 세포 계수기 (독일 비엘레펠트 소재의 이노바티스 아게)를 통해 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. 상청액을 LEA29Y 역가, 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, pH, pO₂, pCO₂, 암모니아에 대해 분석하였다.

덱스트란 술페이트 (나트륨 염, 평균 분자량 5000 Da의 덱스트란으로부터, 미국 미주리주 소재의 시그마)를 물 또는 배지 내에 용해하였다. 용액을 멸균-여과하고, 반응기에 농도 50 mg/L로 첨가하였다. 첨가 부피는 첨가시에 반응기의 작업 부피의 최대 2％이었다.

실시예 8

이 실시예는 접종 후 시간에 다가음이온성 화합물, 더 구체적으로 덱스트란 술페이트를 첨가하는 효과를 평가하기 위한 비교 연구를 기술하고, 그 결과를 나타낸다.

5L 및 10L 생반응기를 0.2 x 10⁶ 세포/mL의 L104EA29Y-생산 세포로 접종하였다.

실험 8-a 및 8-b를 하기와 같이 디자인하였다:

실시예 8-a: 덱스트란 술페이트를 배양물에 첨가하지 않았다 ('대조군' 배양: 5L 생반응기에서 4개의 배양물, 10L 생반응기에서 4개의 배양물).

실시예 8-b:

덱스트란 술페이트를 농도 50 mg/L로 6일째에 배양물에 첨가하였다 ('DS 6일' 배양: 5L 생반응기에서 2개의 배양물, 10L 생반응기에서 1개의 배양물).

실시예 8-a 및 8-b에 대한 평균 생존율, 생존가능한 세포 밀도, 및 총 세포 밀도 프로파일, 및 이들의 표준 편차를 도 11에 보고한다.

대조군 배양에서, 생존가능한 세포 밀도의 안정기가 정지기에 상응하는 6 내지 7일 사이에서 관찰되었다. 대조군 배양의 경우에 생존가능한 세포 밀도 및 생존력의 저하는 사멸기에 상응하는 7일 후에 (평균) 관찰되었다. 덱스트란 술페이트를 배양물에 6일째에 첨가하는 경우에, 성장기는 11일까지 연장되었다. 생존가능한 세포 밀도는 대조군의 경우에 3.5 x 10⁶ 세포/mL에 비해 평균 5.2 x 10⁶ 세포/mL에 도달하였다. 생존율은 이 연장된 성장기 동안 90％ 초과 존속하였다. 11일 후에, 생존가능한 세포 밀도 및 총 세포 밀도는 비례적으로 저하하였으며, 이는 세포 융해를 나타내고, 그 결과, 생존율 지수가 15일까지 90％ 초과 존속하였다.

도 12는 덱스트란 술페이트 첨가가 있는 배양과 대조군 운행을 위한 배양에 대한 시간 함수로서 생존가능한 세포 밀도의 로그식 표현이다. 사멸 속도 (도 11에서 생존가능한 세포 밀도의 경사에 의해 주어짐)는 덱스트란 술페이트의 존재 또는 부재에 따라 상이하였다. 덱스트란 술페이트의 존재 하에, 사멸 속도는 12 내지 19일 동안 0.0012 시간^-1의 값으로 대략 일정하였다. 대조적으로, 대조군의 평균 사멸 속도는 8 내지 12일에서 최대 0.0024 시간^-1이었다. 따라서, 덱스트란 술페이트를 6일째에 첨가하는 것은 사멸기 동안 2개의 인자에 의해 세포 사멸 속도를 저하시켰다.

상기 덱스트란 술페이트의 유익한 효과에도 불구하고, 생성물 L104EA29YIg 역가는 덱스트란 술페이트 첨가가 있거나 또는 없는 경우에 유사하였다 (표 9).

14일째의 생성물 L104EA29YIg 역가에 대한 6일째 덱스트란 술페이트 첨가의 영향
조건	운행 수	14일째 평균 역가 [g/L]	역가의 표준 편차 [g/L]
대조 방법	8	1.60	0.18
6일째 덱스트란 술페이트 방법	3	1.57	0.13

상이한 운행에 대한 L104EA29YIg 시알릴화의 정도를 표 10에 보고한다. 상대적으로 운행간 큰 변이성이 주어지기 때문에, L104EA29YIg 시알릴화는 6일째의 덱스트란 술페이트의 첨가에 의해 유의하게 영향받지 않는 것으로 고려될 수 있다.

생성물 L104EA29YIg 시알릴화에 대한 6일째 덱스트란 술페이트 첨가의 영향
조건	운행 #	NANA 몰비 (일)
대조 방법	1	6.8 (14)
대조 방법	2	5.5 (14)
대조 방법	3	5.7 (15)
대조 방법	4	5.5 (15)
대조 방법	5	5.5 (15)
대조 방법	6	6.3 (16)
6일째 덱스트란 술페이트 방법	7	5.4 (14)
6일째 덱스트란 술페이트 방법	8	6.9 (14)
6일째 덱스트란 술페이트 방법	9	6.9 (16)

실시예 9

이 실시예는 덱스트란 술페이트를 사멸기인 세포 배양물에 첨가하는 효과를 나타낸다.

L104EA29YIg-생산 세포의 5L 생반응기를 밀도 10⁶ 세포/mL에서 접종하고, 사멸기는 5일째에 시작되었다. 덱스트란 술페이트를 6일째에 첨가하였다.

생존율, 생존가능한 세포 밀도 및 총 세포 밀도 프로파일을 도 13에 나타낸다. 이러한 배양의 6일째 덱스트란 술페이트의 첨가는 17일 이하까지 생존가능한 세포 밀도에서 주요 저하의 발생을 차단할 수 있었다. 따라서, 덱스트란 술페이트를 사멸기 동안에 첨가하는 경우에, 세포 사멸을 수일 동안 정지시킬 수 있다.

이 운행에서, NANA 몰비 6.6인 역가 1.9 g/L를 14일째에 얻었다.

실시예 10

이 실시예는 덱스트란 술페이트를 사멸기인 세포 배양물에 첨가하는 효과를 나타낸다.

10L 생반응기를 L104EA29YIg-생산 세포의 0.2 x 10⁶ 세포/mL로 접종하였다. 이 특정 실시예에서는, 일일 공급물이 더 농축된 제제화물이고, 그 결과 사멸기의 개시가 10일까지 지연되었다 (도 14). 덱스트란 술페이트를 14일까지 첨가하지 않았다.

생존율, 생존가능한 세포 밀도 및 총 세포 밀도 프로파일을 도 14에 나타낸다. 14일째 덱스트란 술페이트 첨가는 생존가능한 세포 밀도를 4일 동안 안정화시킬 수 있었고, 이후에는 배양을 중단하였다.

이 실시예는 덱스트란 술페이트를 배양물에 첨가할 때 세포 사멸은 사멸기 동안 정지된다는 또다른 예증이다.

실시예 11

이 실시예는 덱스트란 술페이트를 0일째에 첨가하는 효과를 나타낸다. 덱스트란 술페이트의 첨가가 지연된 다른 실험에서 나타나는 효과와 이 실험에서 나타나는 효과를 비교함으로써 덱스트란 술페이트의 지연된 첨가의 효과를 나타낼 수 있다.

2개의 반복 5L 생반응기를 L104EA29YIg-생산 세포의 0.2 x 10⁶ 세포/mL로 접종하고, 덱스트란 술페이트를 농도 50 mg/L로 접종 (0일)과 동일한 날에 첨가하였다.

생존율, 생존가능한 세포 밀도, 및 총 세포 밀도 프로파일을 도 15에 나타낸다. 배양 모두가 덱스트란 술페이트가 결여된 배양보다 더 높은 세포 밀도를 달성하지 못하였다 (도 11 및 15 비교). 세포는 7 또는 8일째에 사멸기를 통과하지만, 이와 반대로, 덱스트란 술페이트를 6일째에 첨가하는 경우에는 11일째에 통과하였다 (11 및 15 비교). 이들 운행에서 14일째에 얻은 L104EA29YIg 역가는 0.57 g/L (운행 #1) 및 0.86 g/L (운행 #2)이었으며, 이는 대조 방법 또는 6일째 덱스트란 술페이트 첨가를 갖는 방법에서 얻는 역가보다 유의하게 낮았다 (실시예 8 참조).

이들 결과는 첨가 과정에 대한 덱스트란 술페이트 첨가의 시기의 중요함을 입증한다.

이론에 얽매이지 않은채, 본 발명자들은 펜토산 폴리술페이트가 헤파린-결합 성장 인자에 결합하는 것 [Zugmaier et al., 1992]과 유사한 방식으로 덱스트란 술페이트가 다양한 자가분비 인자에 결합함으로써 덱스트란 술페이트 첨가 및 첨가 시기에 대한 그의 의존성에 대한 관찰된 효과가 연장될 수 있다는 것을 제안한다. 본 발명자들은 덱스트란 술페이트가 이들 인자에 그의 헤파린-결합 도메인에서 결합하여 세포 표면 헤파란 술페이트 프로테오글리칸에 결합에 사용될 수 없게 된다는 것을 제안한다. 그 결과, 덱스트란 술페이트-결합 인자는 세포 표면에서 고농도화되지 않아서 그의 수용체에 결합하는 그의 가능성을 크게 감소시킨다. 실효과는 이들 인자가 세포 상에서 그의 정상적 작용을 더이상 발휘하지 못한다는 것이다. 접종 직후 처음 수일에, 세포는 특정 성장 인자를 생산하는데, 그의 기능은 세포 성장의 신호 전달이다. 0일째에 첨가한 덱스트란 술페이트는 비가역적으로 생산된 이들 인자에 결합한다. 그러나, 덱스트란 술페이트가 이들 인자에 결합하는 것은 어쩌면 세포가 성장 인자 생산을 증가시킴으로써 반응할 수 있기 때문에 역으로 세포 성장에 크게 영향을 미치지는 않는다. 성장기 이후에, 성장 인자의 생산은 정지하고, 세포는 상이한 유형의 자가분비 인자의 생산을 시작하는데, 고 농도에서의 그의 효과는 성장기 및 세포 사멸의 개시의 신호 전달이다. 이들 인자는 0일째에 저농도에서 이후에 고농도로 축적된다. 이 때에, 이들 인자는 세포에 성장 중지, 및 정지기 및 사멸기 통과의 신호를 유효하게 전달한다. 본 발명자들은 덱스트란 술페이트가 우선적으로 이들 사멸-신호전달 인자에 결합하여 그의 신호전달 기능을 무력하게 하고, 성장기의 연장을 가능하게 한다는 것을 제안한다. 이들 인자에 의한 연속 유도는 진행되는 세포 사멸에 요구되는 것으로 나타나며, 그 결과 사멸-신호전달 인자가 덱스트란 술페이트에 의해 무력화되는 경우에 사멸기를 통과한 세포는 정지기 내로 (실시예 9 및 10), 심지어 배양에서 14일 만큼 늦게 다시 세팅될 수 있다. 역으로, 0일째에 첨가하여 성장 인자에 결합한 덱스트란 술페이트는 여전히 이들 인자에 성장기의 말미에서 결합되어 있고, 이는 이들이 사멸-신호전달 분자에 대한 결합에 사용되지 못하게 한다. 따라서, 성장기의 연장 및 세포 사멸의 지연 개시는 덱스트란 술페이트가 0일째에 첨가한는 배양 (실시예 11)의 경우에 덱스트란 술페이트를 성장기의 말미에 첨가하는 경우와 동일한 방식으로 발생하지 않는다.

실시예 6에서 덱스트란 술페이트를 6일째에 보충한 배양에서 11일째의 세포 성장의 정지 및 세포 사멸의 개시는 덱스트란 술페이트-결합 자가분비 인자에 의한 유도와는 상이한 메카니즘으로 발생한다는 가설을 세운다. 아마, 성장 11일 후에 배지에서의 특정 영양물의 고갈로 인해 이들 배양에서 성장기의 종료가 초래될 수 있을 것이다.

실시예 12

이 실시예는 덱스트란 술페이트를 초기 성장기 동안 3가지 상이한 시간에 첨가하는 것에 대한 효과를 비교한다.

L104EA29YIg-생산 세포의 배양물을 10⁶ 세포/mL로 5-L 생반응기에 접종하였다. 덱스트란 술페이트를 배양물에 농도 50 mg/L로 상이한 시간에 첨가하였다. 덱스트란 술페이트를 제1 배양에서 3일째에, 제2 배양에서 4일째에 및 제3 배양에서 5일째에 첨가하였다.

생존율 및 생존가능한 세포 밀도 프로파일을 도 16에 보고한다. 높은 생존가능한 세포 밀도 (> 10⁷ 세포/mL)를 3가지 첨가의 경우 (3, 4 또는 5일) 모두에서 달성하지만, 초기 첨가 (3 또는 4일)는 성장기 직후 생존가능한 세포 밀도의 저하를 차단하지 못하였다. 대조적으로, 5일째 첨가는 성장기 이후 4일 동안 생존가능한 세포 밀도를 안정화시켰다. 250시간 후에, 5일째 덱스트란 술페이트 첨가 배양에서의 생존가능한 세포 밀도는 항상 4일째 덱스트란 술페이트 첨가 배양보다 더 높거나 또는 동일 (측정 오차 범위 이내)하고, 4일째 덱스트란 술페이트 첨가 배양에서의 생존가능한 세포 밀도는 항상 3일째 덱스트란 술페이트 첨가 배양보다 더 높거나 또는 동일 (측정 오차 범위 이내)하였다. 따라서, 덱스트란 술페이트 첨가에 대한 최적 시간이 초기 성장기의 말미 (임의의 덱스트란 술페이트 첨가 부재 하에서는 관찰되지 않는 성장기를 나타냄)라는 것을 이 실시예에서 나타낸다. 초기 첨가는 성장기를 연장시킬 수 있지만 덱스트란 술페이트-유도 연장 성장기 후에 생존가능한 세포 밀도를 안정화시키는 데 유효하지 않을 것인 반면, 후기 첨가 (사멸기 동안)는 생존가능한 세포 밀도를 안정화시킬 것이지만 생존가능한 세포 밀도에서의 실질적 증가를 제공하지 못할 수 있다 (실시예 9 및 10 참조). 따라서, 5일째 덱스트란 술페이트 첨가는 14일째에 역가 2.7 g/L를 얻는 반면, 3 또는 4일째 덱스트란 술페이트 첨가는 14일째에 역가 2.6 g/L를 얻고, 6일째 덱스트란 술페이트 첨가는 14일째에 역가 1.9 g/L를 얻었다 (실시예 9). NANA 몰비는 상기 언급한 운행에서 각각 6.3, 6.6, 6.0 및 6.6이었으며, 이는 덱스트란 술페이트 첨가의 최적 시간으로 더 높은 역가를 일정한 수준의 시알릴화와 함께 수득하였음을 나타낸다.

실시예 13

이 실시예는 L104EA29YIg를 생산하는 배양에서의 단일 및 이중 온도 이동의 효과를 나타낸다. 배양물에 또한 덱스트란 술페이트의 지연 첨가를 수행하였다.

5L 반응기를 밀도 200,000 세포/mL로 접종하였다.

이중 T-이동, 단일 T-이동 또는 T-이동 없음을 적용하였다. 단일 온도 이동의 경우에, 온도를 37 ℃에서 34 ℃로 6일째에 이동시켰다. 이중 온도 이동의 경우에, 온도를 37 ℃에서 34 ℃로 6일째에 이동시키고, 34 ℃에서 32 ℃로 10일째에 이동시켰다. 모든 경우에 덱스트란 술페이트는 6일째에 첨가하였다. 이중 T-이동의 경우는 평균 3회 운행하고, 표준 편차를 막대기로 나타낸다.

생존가능한 세포 밀도, 생존율 및 역가를 도 17, 18, 및 14에 각각 보고한다.

그 결과는 단일 이상의 온도 이동의 사용에 대한 이점을 나타낸다. 온도를 37 ℃에서 운행 전체에 걸쳐 유지하는 경우에, 배양은 사멸기를 10일째에 통과하고, 생존가능한 세포 밀도 및 생존율의 감소 경사가 급하였다. 그 결과, 12일 후에 배양에서 L104EA29YIg 용적측정 생산성의 명백한 감소가 있었다. 14일 이상의 배양의 경우에는, 단일 또는 이중 온도 이동을 갖는 배양이 역가 면에서 온도 일정 배양을 능가할 것이라는 것은 명백하다.

단지 단일 온도 이동을 수행하는 경우 (6일째에, 34 ℃로)에, 생존가능한 세포 밀도 및 생존율에서 경사가 급한 감소를 16일 이후에 관찰되었다. 제1 온도 이동에 추가하여 제2 온도 이동을 수행하는 (10일째에, 32 ℃로) 배양은 16일 이후에 생존가능한 세포 밀도 및 생존율에서 경사가 급한 감소를 나타내지 않았다. 배양 18일 후에, 단일 T-이동 배양에서의 용적측정 생산성은 이중 T-이동 배양보다 명백히 열등하였다. 대조적으로, 단일 T-이동을 갖는 배양에서의 용적측정 생산성은 11 내지 15일 사이의 배양 시간에서의 이중 T-이동 배양보다 명백히 우수하였다.

결론적으로, 제1 온도 이동은 목적하는 수확 시간에 독립적인 것이 유리한 반면, 제2 온도 이동의 이점은 효과적 하류 프로세싱을 위한 의도된 수확 시간 및 생존력 요구에 따라 달라진다. 제2 온도 이동의 부재는 더 높은 생성물 역가에 20일까지 도달하도록 할 것이지만, 20일 초과 동안 운행하는 배양의 경우에는 이중 온도 이동을 갖는 운행이 역가 면에서 단일 온도 이동을 갖는 운행을 능가할 것이다. 또한, 12일 후 수확이 단일 T-이동의 경우에 이중 T-이동의 경우보다 더 높은 양의 세포 융해 생산물을 함유할 것으로 고려되어야 하며, 이는 하류 프로세싱을 복잡하게 할 수 있다. 단일 T-이동 프로파일의 경우에 12일 후에 관찰된 생존가능한 세포 밀도에서의 경사 급한 감소는 상응하는 세포 사멸이 생성물 시알릴화를 저하시킬 수 있는 유의한 적재량의 시알리다제를 상청액 내로 유리할 수 있기 때문에 생성물 품질에 대한 관심사일 수 있다.

본 발명이 속하는 업계의 상태를 더 충분히 기술하기 위해 본원에 참조 또는 인용된 모든 허여 및 등록된 특허, 특허 출원, 공개된 PCT 및 미국 출원, 문헌, 도서, 참조문헌, 참조 및 지시 안내서, 및 요약서의 내용을 그에 의해 그 전체로 참고 인용한다.

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SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> Product Quality Enhancement in Mammalian Cell Culture Processes for Protein Production <130> D0274 PCT <140> PCT/US03/40939 <141> 2003-12-18 <150> US 60/436,050 <151> 2002-12-23 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4Ig, fusion protein including extracellular domain of human CTLA4 <220> <221> CDS <222> (1)..(1149) <220> <221> mat_peptide <222> (79)..() <400> 1 atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca 48 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 ctc ctg ttt cca agc atg gcg agc atg gca atg cac gtg gcc cag cct 96 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro -10 -5 -1 1 5 gct gtg gta ctg gcc agc agc cga ggc atc gct agc ttt gtg tgt gag 144 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tct cca ggc aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg 192 Tyr Ala Ser 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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260 cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 912 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275 gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 960 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1008 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg 1056 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1104 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340 cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1152 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4Ig, fusion protein including extracellular domain of human CTLA4 <400> 2 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro -10 -5 -1 1 5 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 105 110 115 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 155 160 165 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 235 240 245 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L104EA29YIg, fusion protein including mutated extracellular domain of human CTLA4 <220> <221> CDS <222> (1)..(1149) <220> <221> mat_peptide <222> (79)..() <400> 3 atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca 48 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 ctc ctg ttt cca agc atg gcg agc atg gca atg cac gtg gcc cag cct 96 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro -10 -5 -1 1 5 gct gtg gta ctg gcc agc agc cga ggc atc gct agc ttt gtg tgt gag 144 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tct cca ggc aaa tat act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg 192 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 cag gct gac agc cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg 240 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc 288 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 agt gga aat caa gtg aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac 336 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 acg gga ctc tac atc tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac 384 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 tac gag ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432 Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 105 110 115 ccg tgc cca gat tct gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac 480 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130 aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtc 528 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150 ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc 576 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 155 160 165 cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag 624 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 672 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195 aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc 720 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210 gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 768 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230 tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc 816 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 235 240 245 tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 864 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260 cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 912 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275 gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 960 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1008 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg 1056 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1104 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340 cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1152 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L104EA29YIg, fusion protein including mutated extracellular domain of human CTLA4 <400> 4 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro -10 -5 -1 1 5 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 105 110 115 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 155 160 165 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 235 240 245 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 5 <211> 636 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(636) <220> <221> mat_peptide <222> (79)..() <400> 5 atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca 48 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 ctc ctg ttt cca agc atg gcg agc atg gca atg cac gtg gcc cag cct 96 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro -10 -5 -1 1 5 gct gtg gta ctg gcc agc agc cga ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag 144 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tct cca ggc aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg 192 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 cag gct gac agc cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg 240 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc 288 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 agt gga aat caa gtg aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac 336 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 acg gga ctc tac atc tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac 384 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 105 110 115 ccg tgc cca gat tct gac ttc ctc ctc tgg atc ctt gca gca gtt agt 480 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser 120 125 130 tcg ggg ttg ttt ttt tat agc ttt ctc ctc aca gct gtt tct ttg agc 528 Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 135 140 145 150 aaa atg cta aag aaa aga agc cct ctt aca aca ggg gtc tat gtg aaa 576 Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 155 160 165 atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct tat ttt 624 Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe 170 175 180 att ccc atc aat 636 Ile Pro Ile Asn 185 <210> 6 <211> 212 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro -10 -5 -1 1 5 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 105 110 115 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser 120 125 130 Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 135 140 145 150 Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 155 160 165 Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe 170 175 180 Ile Pro Ile Asn 185

Claims (59)

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22. a) 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양에서 가용성 CTLA4 분자를 생산하는 CHO 세포를 배양하는 것; 및

    b) 세포에 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하는 것

    을 포함하는, 가용성 CTLA4 분자를 생산하기 위한 세포 배양 방법.
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26. 제22항에 있어서,

    c) 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 37 ℃의 온도에서 CHO 세포를 배양하는 것;

    d) 배양 6일째에 시작하여 CHO 세포를 34 ℃의 제2 온도에서 배양하는 것; 및

    e) 배양 10일째에 시작하여 CHO 세포를 32 ℃의 제3 온도에서 배양하는 것

    을 추가로 포함하는 방법.
27. 제22항에 있어서,

    c) 접종 후에, 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 첨가하는 것

    을 추가로 포함하는 방법.
28. 제26항에 있어서,

    f) 접종 후에, 다가음이온성 화합물을 세포 배양물에 첨가하는 것

    을 추가로 포함하는 방법.
29. 제22항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가, 힌지 (hinge), CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하고, D-갈락토스가 세포 배양물에서 0.1 내지 10 g/L의 농도로 지속 또는 유지되며, 세포 배양 부피가 500 리터 이상인 세포 배양 방법.
30. 제22항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하고, 세포에는 배양 부피의 1％ 이상인 다량의 공급 배지를 매일 공급하며, 공급 배지가 D-갈락토스를 3 내지 25 g/L의 농도로 함유하고, 세포 배양 부피가 500 리터 이상이며, 세포 배양물이 초기 시딩 밀도를 갖는 것인 세포 배양 방법.
31. 제30항에 있어서, 세포 배양물이, 3 g/L로 유지되는 수준의 글루코스를 함유한 것인 세포 배양 방법.
32. 제31항에 있어서, 세포 배양물에서의 글루코스 수준이 3 g/L로 유지되고, 세포에 공급되는 공급 배지의 부피는 글루코스 수준이 3 g/L가 되도록 계산된 것인 세포 배양 방법.
33. 제31항에 있어서, 세포 배양물의 초기 시딩 밀도가 150,000 내지 200,000 생존가능 세포/mL인 세포 배양 방법.
34. 제30항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자의 시알릴화가 세포에 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하지 않은 배양물에서의 시알릴화에 비해 증가되는 것인 세포 배양 방법.
35. 제30항에 있어서,

    a) 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 37 ℃의 온도에서 CHO 세포를 배양하는 것;

    b) 배양 6일째에 시작하여 CHO 세포를 34 ℃의 제2 온도에서 배양하는 것; 및

    c) 배양 10일째에 시작하여 CHO 세포를 32 ℃의 제3 온도에서 배양하는 것

    을 추가로 포함하는 세포 배양 방법.
36. 제36항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자를 정제하는 것을 추가로 포함하는 세포 배양 방법.
37. 제36항에 있어서, 글루코스 수준이 3 g/L로 유지되고, 세포 배양물의 초기 시딩 밀도가 150,000 내지 200,000 생존가능 세포/mL인 세포 배양 방법.
38. 제31항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가 ATCC에 ATCC 기탁 번호 CRL-10762로 기탁된 세포에 의해 발현된 CTLA4Ig 융합 단백질인 세포 배양 방법.
39. 제31항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가 ATCC에 ATCC 기탁 번호 68629로 기탁된 DNA에 의해 코딩된 CTLA4Ig 융합 단백질인 세포 배양 방법.
40. 제22항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 4에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자이고, D-갈락토스가 세포 배양물에서 0.1 내지 10 g/L의 농도로 지속 또는 유지되며, 세포 배양 부피가 500 리터 이상인 세포 배양 방법.
41. 제22항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 4에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자이고, 세포에는 배양 부피의 1％ 이상인 다량의 공급 배지를 매일 공급하며, 공급 배지가 D-갈락토스를 3 내지 25 g/L의 농도로 함유하고, 세포 배양 부피가 500 리터 이상인 세포 배양 방법.
42. 제22항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 4에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자이거나, 가용성 CTLA4 분자가 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하고, 세포에는 D-갈락토스를 3 내지 25 g/L의 농도로 함유한 공급 배지를 1일 당 1회 이상 공급하며, 세포 배양 부피가 500 리터 이상인 세포 배양 방법.
43. 제42항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자의 시알릴화가 세포에 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하지 않은 배양물에서의 시알릴화에 비해 증가되는 것인 세포 배양 방법.
44. 제42항에 있어서, 접종 후에, 덱스트란 술페이트를 세포 배양물에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 세포 배양 방법.
45. 제46항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 정제하는 것을 추가로 포함하는 세포 배양 방법.
46. 제43항에 있어서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 ATCC 기탁 번호 PTA-2104를 갖는 DNA에 의해 코딩된 것인 세포 배양 방법.
47. 제31항, 제43항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 배지가 D-갈락토스를 12.5 g/L의 농도로 함유한 것인 세포 배양 방법.
48. 제22항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 잔기와 결합한, 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하고, 세포에는 배양 부피의 1％ 이상인 다량의 공급 배지를 매일 공급하며, 공급 배지가 D-갈락토스를 12.5 g/L의 농도로 함유하고, 세포 배양 부피가 500 리터 이상이며, 세포 배양물이 초기 시딩 밀도를 갖는 것인 세포 배양 방법.
49. 제31항에 있어서, 세포 배양물이, 3 g/L로 유지되는 수준의 글루코스를 함유한 것인 세포 배양 방법.
50. 제31항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자의 시알릴화가 세포에 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하지 않은 배양물에서의 시알릴화에 비해 증가되는 것인 세포 배양 방법.
51. 제31항에 있어서,

    a) 세포 성장이 가능하도록 하는 조건 하에 및 그 기간 동안 37 ℃의 온도에서 CHO 세포를 배양하는 것;

    b) 배양 6일째에 시작하여 CHO 세포를 34 ℃의 제2 온도에서 배양하는 것; 및

    c) 배양 10일째에 시작하여 CHO 세포를 32 ℃의 제3 온도에서 배양하는 것

    을 추가로 포함하는 세포 배양 방법.
52. 제43항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자의 시알릴화가 세포에 D-갈락토스를 함유한 공급 배지를 공급하지 않은 배양물에서의 시알릴화에 비해 증가되는 것인 세포 배양 방법.
53. 제43항에 있어서, 접종 후에, 덱스트란 술페이트를 세포 배양물에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 세포 배양 방법.
54. a. 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양에서, 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 융합 단백질인 가용성 CTLA4 분자를 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및

    b. 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것

    을 포함하는, 가용성 CTLA4 분자를 생산하기 위한 세포 배양 방법.
55. a. 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양에서, 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4Ig 분자인 가용성 CTLA4 분자를 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및

    b. 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것

    을 포함하는, 가용성 CTLA4 분자를 생산하기 위한 세포 배양 방법.
56. a. 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양에서, 서열 4에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 124에서의 아스파르트산에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자인 가용성 CTLA4 분자를 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및

    b. 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것

    을 포함하는, 가용성 CTLA4 분자를 생산하기 위한 세포 배양 방법.
57. a. 단백질 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 세포 배양에서, 서열 4에 나타낸 바와 같이 아미노산 -1 내지 357 또는 +1 내지 357을 포함하는 L104EA29YIg인 가용성 CTLA4 분자를 생산하는 숙주 세포를 배양하는 것; 및

    b. 세포에 D-갈락토스를 공급하는 것

    을 포함하는, 가용성 CTLA4 분자를 생산하기 위한 세포 배양 방법.
58. 제30항, 제31항, 제32항, 제35항, 제36항, 제38항, 제52항, 제53항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가 서열 2에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 357에서의 리신에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포 배양 방법.
59. 제42항, 제43항, 제45항, 제46항, 제55항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CTLA4 분자가 서열 4에 나타낸 바와 같이 위치 +1에서의 메티오닌 또는 위치 -1에서의 알라닌에서 시작하고 위치 357에서의 리신에서 종결되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포 배양 방법.

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