KR20230125857A - 치료학적 재조합 클로토 단백질 및 이를 수반하는 조성물및 방법 - Google Patents

치료학적 재조합 클로토 단백질 및 이를 수반하는 조성물및 방법 Download PDF

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KR20230125857A
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조셉 에프. 타르시오
디네쉬 라투리
제임스 알. 플랜트
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클로토 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

재조합 클로토 단백질 및 변이체, 이를 암호화하는 핵산, 이를 발현하는 세포주 및 현탁 배양액, 및 이를 제조하고 투여하는 방법이 개시된다. 단백질은 용해성 또는 당화 및 융합 단백질 태그와 같은 반감기 연장 특성(half-life-extending feature)을 포함한다. 단백질은 인간 알파 클로토 이소폼 1의 일부에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 치료 프로토콜은 개체에서 혈청 가용성 클로토 수준을 결정하는 단계, 개체에서 혈청 가용성 클로토 수준을 소정의 수준으로 상승시키기에 충분한 단백질의 투여량을 계산하는 단계, 단백질의 투여량을 개체에게 일시주사(bolus injection) 또는 점진적 주사(gradual injection)와 같은 바에 의해 투여하는 단계, 제1 투여량의 투여 후 개체의 혈청에서 클로토 단백질 감소율을 결정하는 단계, 클로토 단백질의 차후의 투여량의 양과 시간을 계산하는 단계, 및 클로토 단백질의 차후의 투여량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

치료학적 재조합 클로토 단백질 및 이를 수반하는 조성물 및 방법{THERAPEUTIC RECOMBINANT KLOTHO PROTEINS AND COMPOSITIONS AND METHODS INVOLVING THE SAME}
본 개시는 치료제로서 재조합 인간 클로토 단백질 조성물의 생성과 투여에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시는 CGMP 등급의 인간 재조합 가용성 알파-클로토 단백질 (CGMP-grade human recombinant soluble alpha-Klotho protein) 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물과 이를 제조하는 방법 및 이를 인간 또는 인간이 아닌 개체에 투여하는 방법에 관한 것이다.
클로토(또는 알파-클로토, α-클로토 등)는 인간 유전자 13에 위치하는 KL (또는 클로토) 유전자에 의해 암호화되는 최근 특성화된 단백질이다. 선택적 RNA 스플라이싱을 통해 단일 클로토 유전자로부터 발생한 두 개의 전사물이 밝혀졌다. 도 1과 2를 참고한다. 첫번째 전사물은 클로토 이소폼 1-두 개의 상동 (내부 반복) 도메인 [KL1 (450 잔기의 길이인 인간 잔기 56-506) 및 KL2 (438 잔기의 길이인 인간 잔기 515-953)로 칭하며, 각각은 β-글루코시다제에 대해 20%-40%의 아미노산 서열 상동성을 공유하나, 글루코시다제 촉매 활성은 결핍됨], 및 신호 서열 (signal sequence, SS) 도메인 (인간 잔기 1-33)을 포함하는 세포 외 영역 또는 도메인 (인간 잔기 1-981), 막 관통(transmembrane, TM) 도메인 (인간 잔기 982-1002), 및 짧은 세포질 꼬리 (인간 잔기 1003-1012)가 있는 전체길이 1,012 아미노산의 단일 통과 막관통 단백질(single-pass transmembrane-membrane protein)-을 암호화하는 것으로 예측된다. SS, KL1, 및 KL2 도메인을 함유한 세포 외 영역 (인간 잔기 1-981)은 α/β-세크레타제에 의해 효소적으로 절단되고, 가용성 클로토[soluble klotho, (또는 s클로토, s-클로토, 알파 가용성-클로토 등)]로 칭하는 130 kDa의 순환 단백질(circulating protein)로서 순환 스트림(circulatory stream) 내로 방출될 수 있다. 또한, 세포 외 영역은 별도의 68 kDa의 단백질 (KL1 + SS)과 64 kDa의 단백질 (KL2)로 절단될 수 있다.
알파-클로토 mRNA의 스플라이싱 변이체인 두번째 전사물은 주로 KL1 도메인에 대응하는 클로토 단백질의 제2 이소폼을 암호화한다. 내부 스플라이스 공여부위(splice donor site)는 클로토 유전자의 엑손 3에 위치될 것으로 생각된다. 그에 따른 선택적으로 스플라이싱된 전사물은 이의 말단에 프레임 내 종결 코돈(in-frame translation stop codon)이 있는 엑손 3 뒤 50 bp의 삽입(insertion)을 함유한다 (도 1; 회색). 발현된 단백질 생성물은 순환 내로 분비되고, 분비된 클로토 (또는 클로토 이소폼 2)로 칭한다. 따라서, 유전자 발현, RNA 스플라이싱, 및 효소적 절단에 따라 언제든지 많은 상이한 클로토 단백질들이 순환에 있을 수 있다. 알파-클로토 단백질의 다양한 형태의 존재에도 불구하고, 전체 길이의, 막 결합된(membrane-bound), 이소폼 1 만이 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF) 수용체와 복합체를 형성한다고 알려져 있으며, 소변 내로 인산염 분비(phosphate excretion)를 유도하는 뼈 유래 호르몬(a bone-derived hormone)으로, Pi와 비타민 D 물질대사에서 조절 역할을 갖는 FGF23에 대해 절대적 공동수용체 (obligatory co-receptor)로 기능한다.
클로토는 신장, 뇌에서 고도로 발현되며, 다른 기관에서는 보다 적게 발현되고, 또한, 포유류의 뇌척수액(cerebrospinal fluid)과 소변에서 발견될 수 있다. 포유류에서 클로토 단백질의 순환 수준은 나이와 함께 감소되는 것으로 생각된다. 더욱이, 클로토 결실 마우스(mouse)는 가속화된 노화 표현형을 보이는 반면, 마우스에서 클로토의 과발현은 수명을 연장시킴을 보여왔다. 더욱이, 클로토는 노화와 관련된 많은 세포적 과정(cellular process)에서 연루되어왔다. 전술한 관점에서, 전개하는 가설은 가용성 클로토는 인체에서 항노화 화합물로서 기능할 수 있다고 진술한다.
노화는 거의 모든 조직과 기관의 기능장애와 파괴를 야기하는 불가피하며 점진적인 생물학적 과정으로, 궁극적으로 죽음을 야기한다. 인체의 노화는, 예를 들어, 세포 기능의 저하와 관련되며, 다양한 질병의 발달로 이어질 수 있다. 노화는 유전적 및 후천적 요인 사이의 엄격히 조절되며 복잡한 상호작용에 의해 추진되는 것으로 생각되며 노화의 증가, 줄기세포의 정량적 및 정성적 감소, 및 조직 수준에서 비정상적인 구조에 의해 일반적으로 특성화 된다.
소위 말하는 “베이비 부머” 세대가 계속해서 나이를 먹음에 따라, 노화 개인 (예, 60-65세)의 집단은 전세계적으로 빠르게 증가하고 있다. 이 노화 집단을 위한 헬스 케어(health care)에 대한 증가된 수요는 어떤 헬스케어 시스템에서나 심각한 경제적 부담에 놓여있다. 재조합 클로토 단백질은 유망한 치료제를 제공하여 나이 관련된 건강 병태(age-related health condition)에 대응할 수 있다. 가용성 클로토의 생산과 정제(예, 상당한 균질성(homogeneity))에 기초한 전략 및 헬스 인터벤션(health intervention) 방법을 전개시키는 것과 증가하는 노화 집단내의 개체에게 이 단백질의 투여는 이와 관련된 이 상황 및 문제 개선을 도울 수 있다.
현재, 재조합 가용성 인간 알파-클로토 단백질 또는 단백질 변이체, 특히 Current Good manufacturing Practice(CGMP) 규정-미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에 의해 결정되고 집행되는-을 준수하는 단백질과 같은 인간 클로토 단백질의 외인성 형태를 제공하는 방법 또는 제품은 단독 또는 하나 이상의 추가의 유효 성분과의 배합물 여부와 관계없이 존재하지 않는다. 개체에게, 특히 증가하는 노화 집단 내의 개체에게 재조합 S-클로토의 투여에 기초한 전략 및 헬스 인터벤션 방법을 전개시키는 것은 이 상황 개선을 도울 수 있다.
본 개시의 양태는 기술분야의 하나 이상의 전술된 또는 다른 문제점을 재조합 인간 클로토 단백질, 단백질 단편, 및/또는 단백질 변이체, 발현 핵산 구조물 (expression nucleic acid constructs) 및/또는 벡터, 세포주 및/또는 세포 현탁 배양액, 및 이를 제조, 정제, 및 개체에게 (인간 또는 인간이 아닌 동물) 투여하는 방법으로 해결한다.
예를 들어, 본 개시의 일부 양태는 다음을 포함할 수 있다:
재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편, 및/또는 단백질 변이체;
재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 약제 (또는 치료학적 조성물 - 예, 제제);
재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질 및 적어도 하나의 추가의 (유효) 성분의 조성물;
재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 암호화하는 핵산 구조물 또는 벡터;
(i) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 암호화하는 핵산 구조물 또는 벡터를 함유하고/거나 (ii) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 발현하는 세포주;
(i) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 암호화하는 핵산 구조물 또는 벡터를 함유하고/거나 (ii) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 발현하는 세포의 세포 현탁 배양액;
재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 제조, 및 선택적으로 정제하는 방법;
재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 약제(또는 치료학적 조성물 - 예, 제제)를 제조하는 방법;
개체(인간 또는 인간이 아닌 동물)에게 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 투여하는 방법;
개체에서 클로토 단백질 결핍을 결정하는 진단적 방법;
개체에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법;
투여에 의해 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 수용을 필요로 하는지 개체를 진단하는 방법;
효능을 평가하는 방법 및/또는 이를 필요로 하는 개체에게 단백질의 효과적 투여량을 결정하는 방법;
특정 의학적 또는 다른 병태의 치료에서 사용하기 위한 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질; 및/또는
특정 의학적 또는 다른 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 용도.
일부 양태는 재조합 클로토 단백질(recombinant klotho protein)을 제조하는 방법을 포함할 수 있으며, 상기 방법은 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서, 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR) 결실 CHO 세포에서, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포에서, 또는 바람직하게는 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS) 결실 CHO 세포에서, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포에서, 재조합 클로토 단백질을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 단백질은 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는다.
일부 양태는 복수의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포, 또는 바람직하게는 글루타민 합성효소(GS) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포를 포함하는 세포주(cell line)를 포함할 수 있으며, 상기 CHO 세포는 프로모터, 바람직하게는 강력한 프로모터(strong promoter)를 포함하는 외인성 핵산으로서, 폴리펩티드로서 상기 폴리펩티드의 적어도 일부가 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드; 및 선택적으로, 기능성 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 효소 또는 기능성 글루타민 합성효소 (GS) 효소;를 암호화하는 외인성 핵산을 함유하는 것이다.
일부 양태는 액체 배지, 바람직하게는 무혈청 배지 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 배지로서, 상기 액체 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 액체 배지는 하이포크산틴, 티미딘, 및/또는 글루타민이 결핍된 것인 배지, 및 상기 액체 배지에서 생장하는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 세포주로서, CHO 세포가 재조합 클로토 단백질을 포함하며 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 세포주를 포함하는 현탁 배양액을 포함할 수 있다.
일부 양태는 단백질의 적어도 일부는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 재조합 클로토 단백질을 포함할 수 있다.
일부 양태는 본 명세서에 기술된 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 노화에 관련된 또는 다른 병태(condition), 질병(disease), 또는 질환(disorder)을 치료하는 방법을 포함할 수 있다.
일부 양태는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981의 적어도 하나의 부분집합에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 가용성 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 노화에 관련된 또는 다른 병태(condition), 질병(disease), 또는 질환(disorder)을 치료하는 방법을 포함할 수 있다.
일부 양태는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 가용성 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법을 포함할 수 있다.
일부 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.
일부 양태는 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 단백질의 적어도 일부는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 적어도 하나의 부분집합 또는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는다.
일부 양태는 급성 신손상(acute kidney injury, AKI) 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 포함할 수 있고, 상기 방법은 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계로, 상기 단백질의 적어도 일부는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 적어도 하나의 부분집합 또는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부에 대해 적어도 85%, 86%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인 단계를 포함한다.
일부 양태는 치료학적 클로토 단백질, 예를 들어 CGMP 등급 인간 재조합 가용성 알파-클로토 단백질, 및 약물, 항체, 호르몬, 인간 세포, 조직, 세포 또는 조직 기반 생성물 (HCT/Ps) 등과 같은 적어도 하나의 다른 유효 성분을 포함하는 조성물, 및/또는 이를 인간 또는 인간이 아닌 개체에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 배합 조성물(combinatorial composition)과 방법이 노화에 관련된 질환 또는 병태, 대사 장애(metabolic disorder), 만성 질병, 급성 손상 등등을 갖는 개체를 치료하는데 유용할 수 있다. 또한, 분명한 병태 또는 질환이 없는 개체에게 병용 치료(combination treatment)의 예방적 투여(prophylactic administration)는 본 명세서에 기술된 특정 병태 또는 질환을 지연시키거나 예방하는데 유용할 수 있다.
일부 양태는 핵산 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 양태는 발현 벡터 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 핵산은 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 변이체를 암호화할 수 있다. 핵산은 자연적이거나 자연적이지 않은 신호전달 서열을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 암호화된 클로토 단백질 서열의 상류 (또는 이에 N-말단)에 자연적이지 않은 신호전달 서열을 암호화할 수 있다.
일부 양태는 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 제조하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 제조 방법은 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 액체배지에서 생장시키는 단계, 상기 재조합 재조합 가용성 클로토 단백질을 상기 CHO 세포에서 생성하는 단계, 및/또는 재조합 가용성 클로토 단백질을 함유한 추출물을 상기 CHO 세포, 액체 배지, 또는 이들 모두로부터 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출물은 적어도 약 98%의 건조 중량 재조합 가용성 클로토 단백질 및/또는 약 1-100 ppm 미만의 CHO 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함할 수 있다. 상기 CHO 세포는 CHO-S 세포와 같은 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 결실 CHO 세포, 또는 GS -/- CHO 세포 같은 글루타민 합성효소 (GS) 결실 CHO 세포일 수 있다. 생성된 (발현된) 단백질은 상기 CHO 세포로부터 액체 배지 내로 방출(예, 분비)될 수 있고/거나 이에 부착된 하나 이상의 글리칸을 가질 수 있다.
CHO 세포는 단백질 및, 선택적으로 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase) 효소와 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS) 효소 등과 같은 기능성 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 함유할 수 있다. 외인성 핵산은 CHO 세포에서 외인성 단백질의 발현을 위한 사용에 통상적인 또는 전형적인 프로모터와 같은 프로모터(예, 강력한 프로모터, 약한 프로모터 등)를 포함할 수 있다. 외인성 핵산은 전이 유전자 또는 cDNA(예, 프로모터의 제어 하에)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 클로토 단백질(예, S-클로토 변이체)을 암호화하는 임의의 다른 적합한 핵산 서열 중 하나에 대해 적어도 85%의 서열 상동성을 가진다.
방법은 외인성 핵산을 형질주입과 같은 바에 의해 CHO 세포 내로 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 CHO 세포를 (인간, (태아) 소, 또는 다른) 무혈청 배지 및/또는 동물 (또는 동물 유래의) 단백질 (성분)이 없는 배지와 같은 액체 배지에서 생장시키는 단계를 포함할 수 있다. 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및/또는 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 바람직하게는 생물반응기에서 포함한다. 특정 CHO 세포주에 따라서, 방법은 메토트렉세이트 (MTX), 메티오닌 설폭시민 (MSX), 또는 다른 제제(agent)의 유효량을 액체 배지내로 도입시키는 단계 및/또는 액체 배지에서 생장하는 살아있는 CHO 세포의 현탁 배양액을 선택하는 단계[예, CHO 세포 서브 클로닝(sub-cloning), 한계 희석(limited dilution), 형광 활성 세포 선별(fluorescence activated cell sorting, FACS) 등에 의함]를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 선택 및/또는 유전자 증폭은 형질 주입된 세포를 하이포크산틴 및/또는 티미딘 (예, -HT 배지), 글루타민 등이 없는 배지와 같은 선택 배지에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, MTX의 낮은 농도(들)이 더해지거나 사용되어 형질 주입된 핵산 (또는 이의 유전자(들))을 증폭시킬 수 있고, 그렇게 함으로써, 증가된 단백질 발현을 선택할 수 있다 (예, DHFR 전이 유전자로 형질 주입된 DHFR-결실 CHO 세포에서). 대안적으로(또는 추가로), 선택 및/또는 유전자 증폭은 적어도 하나의 (외인성) 글루타민 합성효소(GS) 전이 유전자를 갖는 CHO 세포의 현탁 배양액에 MSX [(내인성) 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS)의 억제제]를 더함으로써 수행될 수 있다.
방법은 계대 배양한(sub-culturing) 살아남은 세포 또는 배양액 (예, MTX-저항성 및/또는 MSX-저항성 세포 또는 배양액)을 포함할 수 있다. 선택된 현탁 배양액 및/또는 선택된 CHO 세포는 단백질의 증가된 생산(예, CHO 세포에 의함), 단백질의 증가된 농도 (예, 액체 배지에서), 및/또는 외인성 핵산의 증가된 카피 수(예, 세포 당)를 갖거나 보일 수 있다 (예, 선택되지 않은 현탁 배양액 또는 CHO 세포에 비하여).
특정 양태는 복수의 CHO 세포를 포함한 세포주를 포함할 수 있다. 예를 들어, CHO 세포는 CHO-S 세포와 같은 DHFR-결실 CHO 세포일 수 있다. CHO 세포는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산(전이 유전자 또는 cDNA를 포함하는)의 하나 이상(카피)를 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질을 포함할 수 있다. 외인성 핵산은 전이 유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있고, 이는 바람직하게는 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대해 적어도 85%의 핵산 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 (전이 유전자와 관련된) 및/또는 (기능성) 디히드로 엽산 환원효소(DHFR) 효소, 글루타민 합성효소 (GS) 효소 등을 비롯한 선택적 (외인성) 효소를 (또한) 포함하거나 암호화할 수 있다.
적어도 하나의 양태는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및/또는 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하는 액체 배지에서 생장하는 세포주를 포함하는 현탁 세포 배양액을 포함해서, CHO 세포가 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현한다. 액체 배지는 (인간, (태아) 소, 또는 다른) 무혈청이고/거나 동물 (또는 동물 유래) 단백질 (성분)이 없을 수 있다. 예를 들어, 액체 배지는 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 등이 없을 수 있다.
또한, 액체 배지는 일부 양태에서 MTX 및/또는 MSX의 유효량을 포함할 수 있다. 현탁 배양액 (또는 이의 CHO 세포)은 바람직하게는 선택되지 않은 현탁 배양액에 비하여 단백질의 증가된 생성 (예, CHO 세포에 의함)을 보일 수 있고(보이도록 선택될 수 있고); 단백질의 증가된 농도 (예, 액체 배지에서)를 보일 수 있으며(보이도록 선택될 수 있으며); 단백질 (예, 액체 배지 내로)을 분비할 수 있고(분비하도록 선택될 수 있고); 및/또는 외인성 핵산의 증가된 카피 수 (예, 세포 당)를 가질 수 있다(가지도록 선택될 수 있다). 단백질은 하나 이상의 이에 부착된 글리칸을 가질 수 있다.
일부 양태는 현탁 세포 배양액의 CHO 세포로부터 또는 이의 추출물, 액체 배지, 또는 이들 모두를 포함하며, 이 추출물은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 재조합 단백질을 함유한다. 특정 양태는 CHO 세포로부터 또는 이의 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질 함유 추출물, 액체 배지, 또는 이들 모두 (예, 현탁 세포 배양액의)를 포함한다. 적어도 하나의 양태는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 재조합 단백질을 포함한다.
일부 양태는 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 이를 필요로 하는 인간 또는 인간이 아닌 동물 개체에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 클로토 단백질이 투여되는 개체는 다양한 병태(예, 질환, 질병, 손상(injury), 병(illness) 등)에 대한 위험이 있거나 이로부터 고통받을 수 있다. 예를 들어, 일부 양태는 (인간) 노화와 관련된 육체적, 정신적, 신경학적, 또는 다른 병태와 같은 하나 이상의 만성 질병 및/또는 노화에 관련된 병태를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 양태는 하나 이상의 메커니즘 또는 작용을 통한 치유(healing), 회복(recovery), 장수(longevity), 및/또는 다른 유익한 결과를 촉진시킬 수 있다. 양태는, 예를 들어, 이를 필요로 하는 개체에게 (예, 병태를 발달시킬 위험을 갖거나 위험에 처한) 재조합 가용성 클로토 단백질 또는 단백질 변이체의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단백질 또는 단백질 변이체의 투여는 인간 개체에서 만성적 및/또는 노화에 관련된 질병과 장수를 포함하는 병태의 과정과 결과에 대한 긍정적인 치료학적 효과 및 이의 특징을 가질 수 있다.
약제학적 유효량은 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 수준으로 상승시키기에 충분할 수 있으며, 소정의 수준은 혈청 1 밀리리터 당 약 50 내지 3000 피코그램 보다 큰, 이와 같은, 또는 이 사이의 가용성 클로토 단백질 일 수 있다. 양은 또한 또는 대안적으로 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 임계에서 또는 이 이상으로 소정의 기간 동안 유지하는데 충분할 수 있다. 또한, 양태는 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 임계에서 또는 이 이상으로 소정의 기간 동안 유지하기 위해 단백질을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 양태는 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 결정하는 단계, 약제학적 유효량을 계산하는 단계, 개체의 혈청에서 가용성 클로토 단백질 감소율을 결정하는 단계, 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도가 제2 소정의 수준에 이하일 차후의 투여 시간을 결정된 감소율에 기초하여 계산하는 단계, 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 제2 소정의 수준으로부터 제1 소정의 수준으로 상승시키기에 충분한 단백질의 차후의 투여량을 계산하는 단계, 및/또는 단백질의 차후의 투여량을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
단백질은 IGF-1 및/또는 Wnt 신호전달 경로를 조절할 수 있고(조절에 효과적일 수 있고), β-글루쿠론산 분해효소(β-glucuronidase) 및/또는 시알산 분해효소(sialidase) 활성을 보이며(보이는데 효과적일 수 있으며), p53/p21 신호전달 경로를 억제할 수 있고(억제에 효과적일 수 있고), 및/또는 H2O2 유발성 세포 노화 및 자살을 바람직하게는 p53/p21 신호전달 경로의 억제를 통해 감소시킬 수 있다(감소시키기에 효과적일 수 있다). 단백질은 체액성 인자(humoral factor)로 기능하거나 기능적일 수 있으며, 및/또는 이는 바람직하게는 산화적 스트레스, 성장인자 신호전달, 이온 항상성의 조절, 및/또는 하나 이상의 이온 채널 단백질 및/또는 인슐린/인슐린 유사 성장 인자-1 수용체를 비롯한 성장 인자 수용체와 같은 세포 표면상의 당단백질 활성의 조절에서, 바람직하게는 다면적 활성(pleiotropic activity)을 보인다.
또한, 단백질은 노쇠(frailty), 골밀도 감소(bone density loss) 또는 골염도 감소(bone mineral density loss), 체중 감소(weight loss), 근위축증(muscular atrophy) 또는 근육 변성(muscular degeneration), 근질량 저하(decline in muscle mass), 근력 저하(decline in muscle strength), 악력 저하(decline in hand strength), 각근력 저하(decline in leg strength), 또는 체력 저하(decline in physical fitness), 운동 저하(decline in movement), 운동 자유도 저하(decline in freedom of movement), 삶의 질 저하(decline in quality of life assessment), 박출 계수 저하(decline in ejection fraction), 또는 운동능력 저하 (decline in exercise capacity), 학습 저하(decline in learning), 학습 능력 저하(decline in learning capacity), 기억력 저하(decline in memory), 또는 지능지수 저하 (decline in intellectual quotient), 인지 저하(cognitive deterioration) 또는 건망증(forgetfulness), 인지능력 저하(decline in cognitive capacity) 또는 인지기능 저하(decline in function), 시냅스 가소성 저하(decline in synaptic plasticity) 또는 시냅스 기능 저하(decline in synaptic function), 및 세포 노화(cellular senescence)와 같은 하나 이상의 노화에 관련된 병태 (또는 (인간) 노화와 관련된 병태) 치료에 효과적일 수 있다.
또한, 단백질은 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease), 파킨슨 질병(Parkinson's disease), 치매(dementia) 또는 혈관성 치매(vascular dementia), 근위축성 축삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 또는 운동 뉴런 질병 (motor neuron disease, MND), 심박 세동 (atrial fibrillation), 만성 폐쇄성 폐질병 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 섬유 근육통 (fibromyalgia), 성년 개시 당뇨(adult onset diabetes), 관절염(arthritis) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataracts), 황반 변성(macular degeneration) 및 다른 안구 질병/질환, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 루푸스(lupus), 및/또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 같은 하나 이상의 노화에 관련된 병태 (또는 (인간) 노화와 관련된 병태) 치료에 효과적일 수 있다.
따라서, 양태는 하나 이상의 노화에 관련된 병태 치료에 있어서 사용하기 위한 조성물을 또한 포함할 수 있다. 조성물은 재조합 가용성 클로토 단백질 (예, SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 가짐)과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
일부 양태는 치료학적 클로토 단백질, 예를 들어 CGMP 등급 인간 재조합 가용성 알파-클로토 단백질, 및 약물, 항체, 호르몬, 인간 세포, 조직, 세포 또는 조직 기반 생성물 (HCT/Ps) 등과 같은 적어도 하나의 다른 유효 성분을 포함하는 조성물, 및 이를 인간 또는 인간이 아닌 개체에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 배합 조성물(combinatorial composition)과 방법이 노화에 관련된 질환 또는 병태, 대사 장애(metabolic disorder), 만성 질병, 급성 손상 등등을 갖는 개체를 치료하는데 유용할 수 있다. 또한, 분명한 병태 또는 질환이 없는 개체에게 병용 치료(combination treatment)의 예방적 투여(prophylactic administration)는 본 명세서에 기술된 특정 병태 또는 질환을 지연시키거나 예방하는데 유용할 수 있다.
본 개시의 다양한 양태에서, 생성물 또는 방법에 상관없이, 재조합 클로토 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 38 중 하나에 대해 80%-100%의 서열 상동성이 있는 서열을 갖고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 74 또는 SEQ ID NO: 75의 서열 중 하나에 대해 80%-100%의 서열 상동성이 있는 C-말단 태그(C-terminal tag)를 가지며, 선택적으로는 이들 사이에 위치된 SEQ ID NO: 73에 대한 80%-100%의 서열 상동성을 갖는 링커 서열(linker sequence)이 있는 클로토 단백질 중 하나를 포함할 수 있다. 단백질은 SEQ ID NO: 71 또는 SEQ ID NO: 72에 대해 80%-100%의 서열 상동성을 갖는 신호 전달 서열(signaling sequence)을 선택적으로 포함할 수 있거나 신호 전달 서열로 발현될 수 있다. 바람직하게는, (제조된, 생성된, 발현된 또는 투여된) 단백질은 SEQ ID NO: 39 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 80%-100%의 서열 상동성을 갖는다.
재조합 클로토 단백질을 제조하는 예시적 방법은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서, 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 결실 CHO 세포에서, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포에서, 또는 바람직하게는 글루타민 합성효소 (GS) 결실 CHO 세포에서, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포에서, 재조합 클로토 단백질을 생성하는 단계를 포함하며, 이 단백질은 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 가진다.
예시적 세포주는 복수의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포, 또는 바람직하게는 글루타민 합성효소 (GS) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포를 포함하며, 상기 CHO 세포는 프로모터, 프로모터, 바람직하게는 강력한 프로모터를 포함하는 외인성 핵산으로서, 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드의 적어도 일부가 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인 폴리펩티드; 및 선택적으로는 기능성 디히드로엽산 환원효소 (DHFR)효소 또는 기능성 글루타민 합성효소 (GS) 효소;를 암호화하는 외인성 핵산을 함유하는 것이다.
예시적 현탁 세포 배양액은 액체 배지, 바람직하게는 무혈청 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 액체 배지(액체 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하는 것이며, 더욱 바람직하게는 액체 배지는 하이포크산틴, 티미딘, 및/또는 글루타민이 없음); 및 액체 배지에서 생장하는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 세포주를 포함해서, CHO 세포는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드- 재조합 클로토 단백질을 포함하는-를 발현한다.
예시적 재조합 클로토 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 포함한다.
노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 예시적 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981의 적어도 하나의 부분집합에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 가용성 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 예시적 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 가용성 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
예시적 약제학적 조성물은 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량 (단백질의 적어도 일부가 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 적어도 하나의 부분집합 또는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는); 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
급성 신손상 (AKI) 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 예시적 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 단백질의 적어도 일부가 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 적어도 하나의 부분집합 또는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부에 대해 적어도 85%, 86%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 가진다.
노화 개인을 치료하는 예시적 방법으로, 노화 개인은 클로토 단백질을 암호화하는 유전자에서 동형접합 또는 이형접합 돌연변이를 갖는다. 방법은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더욱 바람직하게는 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드의 치료학적 농도를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태는 본 개시의 다른 부분에 명시된 특징, 옵션, 및/또는 가능성 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 본 개시의 다른 측면 또는 양태에서 포함한다. 또한, 본 명세서에 기술된 전술한, 후술하는, 및/또는 다른 특징의 각각이 본 개시의 별도의 양태를 나타내는 것을 유의해야 한다. 더욱이, 이러한 특징의 임의의 둘 이상의 조합은 본 개시의 별도의 양태를 나타낸다. 또한, 이러한 특징 또는 양태는 이 명세서의 범위로부터 벗어나지 않는 임의의 적합한 조합 및/또는 순서로 합쳐질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 각각의 특징은 임의의 적합한 조합 및/또는 순서로 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 다른 특징과 합쳐질 수 있는 것이다. 따라서, 본 개시는 본 명세서에 상술된 예시적 양태의 특정한 조합에 제한되는 것은 아니다.
본 개시의 예시적 양태의 추가의 특징 및 이점은 후술하는 설명에서 명시될 것이며, 부분적으로는 설명으로부터 자명할 것이거나, 이러한 예시적 양태의 실행에 의해 알 수 있다. 이러한 양태의 특징 및 이점은 첨부된 청구항에서 특히 언급된 기구 및 조합의 수단에 의해 실현 및 획득될 수 있다. 이러한 및 다른 특징들은 다음의 설명 및 첨부된 청구항으로부터 더욱 완전히 명백해질 것이거나, 이하 명시되는 바와 같은 이러한 예시적 양태의 실행에 의해 알 수 있다.
본 개시의 상기 나열된 및 다른 이점과 특징이 획득될 수 있는 방식을 설명하기 위하여, 위에서 간략하게 설명된 양태의 개시의 보다 특정한 설명은 첨부된 도면들에 도시된 이의 특정 양태를 참조하여 제공될 것이다. 더 나은 이해를 위해, 유사한 요소가 도면(들) 전체에 걸쳐 유사한 참조 번호에 의해 표기되었다. 이러한 도면들은 본 개시의 전형적인 양태만을 도시한 것이므로, 이의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 본 개시는 수반하는 도면(들)의 사용을 통해 추가의 특성 및 세부사항과 기술 및 설명될 것이다.
도 1은 본 개시의 양태에 따른 다양한 클로토 단백질의 세포 생산(cellular production)을 도시하는 개략도를 그린다.
도 2a는 인간 α-클로토의 이소폼 1과 이소폼 2의 개략적 구조 및 C-D (잔기 800 내지 900)의 생성에 사용된 항체 결합을 위한 항원 결정기의 위치를 그린다.
도 2b는 각각 붉은색과 초록색으로 나타낸 KL1 및 KL2가 있는 1012개의 아미노산의 전체 길이의 α-클로토 단백질 서열 및 강조된 TM (검은색)을 그린다.
도 2c 내지 2d는 인간 세포 용해물(C)과 인간 조직(D)의 웨스턴 블랏 분석을 그린다.
도 3a는 2010년 특정 아미노글리코시드를 수용한 성인 환자의 수를 도시한다.
도 3b는 도 3a에 나타낸 아미노글리코시드를 수용하는 성인 환자의 나이 분포를 도시한다.
도 4는 도 3a에 나타낸 아미노글리코시드를 수용하는 성인 환자에서 수집된 치료 데이터를 도시한다.
본 개시의 다양한 양태를 상술하기 전에, 이 개시는 양태마다 다를 수 있다는 수 있는 특히 예시된 시스템, 방법, 및/또는 제품의 특정 매개변수, 표현, 및 설명에만 한정되는 것이 아님이 이해될 것이다. 따라서, 특정 특징 (예, 구성(configuration), 매개변수(parameter), 특성(property), 단계(step), 성분(component), 재료(ingredient), 부재(member), 요소(element), 파트(part), 및/또는 부분(portion) 등)을 참조하여 본 개시의 특정 양태가 상술될 것인 반면, 설명은 예시적인 것이며 본 개시 및/또는 청구된 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 양태를 설명하기 위한 것이며, 본 개시 및/또는 청구된 발명의 범위를 필연적으로 제한하고자 하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다.
시스템, 방법, 및/또는 제품을 포함하는 본 개시의 다양한 측면은 하나 이상의 양태에 관하여 도시될 수 있으며, 이는 사실상 예시적인 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “양태”는 “예, 예시, 또는 도시로서 제공하는 것”을 의미하며, 본 명세서에 개시된 다른 측면에 대해 바람직하거나 유리한 것으로서 필연적으로 이해되어서는 안될 것이다. 더욱이, 본 개시 또는 발명의 “양태”에 대한 언급은 본 발명의 범위를 제한하지 않는 실례가 되는 예를 제공하기 위함으로, 이는 첨부된 청구항에서 나타낸다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수의 표현 (“a”, “an”, 및 “the”)은 명확히 다르게 지시하지 않는 한, 각각 단수 및 복수의 지시대상 모두를 고려하고, 포함하며, 구체적으로 개시한다. 예를 들어, “단백질”에 대한 언급은 하나뿐만 아니라 복수의(예, 둘 이상, 셋 이상 등) 단백질들을 고려하고 구체적으로 개시한다. 마찬가지로, 복수의 지시대상의 사용은 복수의 이러한 지시대상을 필연적으로 요구하는 것은 아니나, 문맥이 명확히 다르게 지시하지 않는 한, 단수뿐만 아니라 복수의 이러한 지시대상에 대한 지지를 고려하고, 포함하며, 구체적으로 지시하고/거나 제공한다.
이 개시 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단어 “~ 할 수 있다(can)” 및 “~ 할 수도 있다(may)”는 강제적인 의미(즉, “~해야 한다”를 의미) 보다는 자유로운 의미로 사용되었다(즉, 의미는 “~할 잠재력”을 가짐). 추가적으로, 청구항을 포함하는 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 “포함하는(including)”, “가지는(having)”, “수반하는(involving)”, “함유하는(containing)”, “~에 의해 특성화되는(characterized by)”, 이의 변형 (예, “포함한다(include)”, “가진다(have)”, 및 “수반한다(involve)”, “함유한다(contain)” 등), 및 유사한 용어는 포괄적이고/거나 개방형일 것이며, 단어 “포함하는(comprising)” 및 이의 변형 (예, “포함한다(comprise 및 comprises)”)와 동일한 의미를 가질 것이고, 추가의, 나열되지 않은 요소 또는 방법 단계를 실례적으로 배제하지 않는다.
간결성을 위해, 본 개시만이 수치 값의 리스트 또는 범위를 나열할 수 있다. 그러나, 이러한 수치 값의 리스트 또는 범위(예, 특정 값 보다 큰, 특정 값 보다 작은, 특정 값까지, 적어도 특정 값, 및/또는 약 특정 값, 및/또는 두 개의 나열된 값 사이)가 개시되거나 나열되는 경우, 개시된 값 또는 리스트 또는 값의 범위 내에 떨어지는 임의의 특정 값 또는 값의 범위는 본 명세서에서 마찬가지로 구체적으로 개시되고 고려됨이 인식될 것이다. 따라서, 약 10 유닛 이하의 또는 0 및 10 유닛 사이의 실례가 되는 치수의 개시(예, 길이, 너비, 두께 등)는 (i) 9 유닛, 5 유닛, 1 유닛, 또는 0 유닛 및/또는 10 유닛을 포함하는 0 및 10 유닛 사이의 임의의 다른 값의 치수; 및/또는 (ii) 9 유닛 및 1 유닛 사이의, 8 유닛 및 2 유닛 사이의, 6 유닛 및 4 유닛 사이의, 및/또는 0 및 10 유닛 사이 값의 임의의 다른 범위의 치수의 구체적 개시를 실례적으로 포함할 수 있다.
이해를 용이하게 하기 위해, 본 개시의 상이한 양태에 통상적인 유사한 요소를 지정하는 것이 가능하다면, 유사한 참조 (즉, 성분 및/또는 요소의 유사한 명명)가 사용되었다. 마찬가지로, 유사한 기능이 있는 성분 또는 유사한 성분은 가능하다면, 비슷한 참조 명칭과 제공될 것이다. 특정한 언어는 본 명세서 사용되어 예시적 양태를 기술할 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 개시의 범위를 한정하지 않음이 그럼으로써 의도되는 것이 이해될 것이다. 그 보다, 예시적 양태의 기술에 사용된 언어가 단지 실례적이며 본 개시의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는 것이 이해될 것이다(이러한 언어가 본 명세서에서 필수적으로 명확히 기술되지 않는 한).
상세한 설명이 섹션으로 분리되어 있으나, 섹션 헤더와 각 섹션내의 콘텐츠는 단지 조직적 목적을 위한 것으로, 자족적인 설명 및 양태가 되거나 본 개시 또는 청구항의 범위를 한정하는 의도는 아니다. 그 보다, 하나의 섹션의 요소가 다른 섹션과 관련있고/거나 다른 섹션에 영향을 미치는 경우, 상세한 설명내의 각 섹션의 콘텐츠는 집합적인 완전체로서 읽고 이해될 것으로 의도된 것이다. 따라서, 하나의 섹션 내에 구체적으로 개시된 양태는 동일한 및/또는 비슷한 제품, 방법, 및/또는 용어를 가지는 다른 섹션 내 추가의 및/또는 대안적 양태와 관련되고/거나 이로서 제공할 수 있다.
본 개시의 양태는 제품, 조성물, 및/또는 (Current Good Manufacturing Practice (CGMP)-등급) 인간 재조합 가용성 알파-클로토 단백질, 단백질 단편, 및/또는 단백질 변이체와 같은 재조합 인간 클로토 단백질을 제조하는 방법 및/또는 이를 이용하는 방법을 포함한다.
유전자 치료는 동물 연구에서 효과적일 수 있다. 그러나, 특히 인간 치료에 대한 유전자 치료의 안전은 여전히 의심스럽다. 클로토 유전자의 동물 (세포)로 바이러스적 전달(viral delivery)에 비하여, 인간에서 외인성 및/또는 재조합 클로토 단백질의 투여는 더 안전하며, 용이할 수 있고, (내분비의) 클로토 수준을 회복시키는 더욱 직접적인 양상일 수 있다. 따라서, CKD 환자에서 빈혈 (anemia)을 고치기 위해 에리트로포이에틴(erythropoietin) 또는 적혈구생성 촉진제(erythropoiesis-stimulating agent)를 투여하는 것 및/또는 I 형 당뇨병 환자(type I diabetics)에서 정상적인 포도당 물질대사를 유지하기 위해 인슐린을 투여하는 것과 비슷하게, 외인성 (인간 재조합 알파 가용성) 클로토 단백질의 투여는 가까운 미래에 노화 및/또는 노화에 관련된 질환을 치료하기 위한 실행 가능하며 효과적인 선택일 수 있다. 예를 들어, 인간에게 외인성 (인간 재조합 알파 가용성) 클로토 단백질의 투여는 줄기세포 손실을 유보 또는 지연시키거나 및/또는 노화에 관련된 노쇠 또는 다른 병리학적인 과정을 약화시키기 위한 효과적인 전략일 수 있다.
전임상 데이터(preclinical data)는 가용성 클로토 단백질의 노화에 관련된 질환 및 클로토 결실 관련 질병의 치료학적 잠재성을 지지한다. 역학적 데이터(epidemiological data)는 가용성 클로토가 젊은 성인보다 노인에서 더 낮은 것과 가용성 클로토의 수준이 나이와 반비례하여 상관되어 있는 것을 보여왔는데, 이는 노화가 가용성 클로토 감소와 관련되어 있음을 나타낸다.
정의된 용어의 간략한 목록
전술한 및 후술하는 서면으로 된 설명 및 첨부된 청구항의 범위와 내용의 이해를 돕기 위하여, 선택된 일부 용어가 바로 아래에 정의된다.
용어 “병태(condition)”는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해된 바와 같은 환자에서 나타나거나 예측되는 임의의 질환(disorder), 질병(disease), 손상(injury), 또는 병(illness)을 나타낸다. 이러한 병태의 증상은 기술분야에 알려진 바와 같은 증상의 초기, 중기, 또는 말기 징후(manifestation)에 있을 수 있으며, 이는 전병태 증상 (pre-condition symptom), 조짐(sign), 또는 마커(marker)를 포함한다. 이러한 병태의 예측은 과학적 또는 의학적 증거, 위험 평가, 또는 한낱 우려 또는 두려움에서 발견되는 여부와 관계없이 예상되는(predicted), 기대되는(expected), 가시적인(envisioned), 추정되는(presumed), 추측되는(supposed), 및/또는 짐작되는(speculated) 병태의 발생이거나 이를 포함할 수 있다.
용어 “환자”는 일반적으로 용어가 본 명세서에서 정의된 바와 같은 의사의 보살핌 하에 있는 임의의 동물, 특히 의학 박사 또는 다른 관련 있는 전문 의료진의 보살핌 하에 있는 인간에 관하여 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 “의사(physician)”는 일반적으로 의학 박사(medical doctor)를 의미한다. 이 용어는 문맥상 적절할 경우, 의사 보조인력(physician's assistant), 간호사, 사혈 전문의사 (phlebotomist), 수의사(veterinarian) 등과 같은 임의의 허가된 전문 의료진(licensed medical professional), 외과의(surgeon), 또는 종양학자(oncologist)를 비롯한 임의의 전문 의료진(medical professional)을 포함한다.
용어 “암”은 비정상적인 전형적으로 제어가 되지 않는 세포의 성장을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 “암 세포”는 비정상적인, 정형적으로 제어가 되지 않는 성장을 포함하는 악성 세포를 포함한다. 이와 같이, 용어 암은 전형적인 제어가 되지 않는 방식으로 성장하는 악성 세포에 의해 특성화 되는 복수의 상이한 별개의 질병을 망라하는 포괄적인 용어이다.
용어 “공통 투여(co-administration)” 및 비슷한 용어는 둘 이상의 성분의 동시에 발생하는, 순차적인, 및/또는 병용적 투여를 나타낸다. 예를 들어, 둘 이상의 성분은 별개의 투여에서 각 성분을 동시에, 일제히, 또는 순차적으로 투여(예, 기간에 의해 분리된 별개의 투여)함으로써 공동 투여될 수 있다. 기간은 매우 짧거나(예, 제1 투여 후 실질적으로 즉시) 혹은 더 길 수 있다 (예, 1-60 초, 1-60 분, 1-24 시간, 1-7 일, 1-4 주, 1-12 개월 등등 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위). 동시적인 또는 일제의 투여는 둘 이상의 성분에 대한 오버래핑 투여 기간(overlapping administration timeframe) 또는 둘 이상의 성분의 혼합물을 포함하는 병용물의 투여를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “핵산” 및 비슷한 용어는 DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 혼성, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 여부와 상관없이 자연적으로 발생한 또는 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 특히, 핵산은 DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이의 임의의 조합을 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 본 개시의 핵산은 기술분야에 알려진 뉴클레오티드 또는 핵산 유사체 (예, BrdU), 및 인산디에스테르가 아닌 (뉴클레오시드 간) 결합 또는 뼈대 [예, 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA) 또는 티오디에스테르 결합(thiodiester linkages)]를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “표준 아미노산”은 다음을 포함한다: 알라닌 - ala - A; 아르기닌 - arg - R; 아스파라긴 - asn - N; 아스파르트 산 - asp - D; 시스테인 - cys - C; 글루타민 - gln - Q; 글루탐산 - glu - E; 글리신 - gly - G; 히스티딘 - his - H; 이소류신 - ile - I; 류신 - leu - L; 리신 - lys - K; 메티오닌 - met - M; 페닐알라닌 - phe - F; 프롤린 - pro - P; 세린 - ser - S; 트레오닌 - thr - T; 트립토판 - trp - W; 티로신 - tyr - Y; 및 발린 - val - V.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “코돈 최적화된” 또는 “코돈 최적화”는 뉴클레오티드 서열 내 코돈을 분자의 발현을 위해 사용되는 유기체에서 바람직하거나 코돈 사용의 패턴에 더욱 가깝게 매치하는 코돈으로 변형시키거나 변화시키는 과정을 나타낸다. 따라서, 코돈은 핵산 발현의 유효성을 강화시키기 위해, 예를 들어, 더 빠른 번역속도 (translate rate) 및 높은 정확도를 달성하기 위해 유기체에서 알려진 코돈 사용에 기초한 발현이 목적되는 특정 유기체에서 사용에 최적화될 수 있다. 특정 유기체에서 코돈 사용이 알려져 있다.
암호화하는 핵산 분자는 변형된 야생형(wild-type) 또는 코돈 최적화 서열-코돈이 예를 들어, CHO 세포 또는 293 세포를 비롯한 포유류 세포와 같은 특정 숙주 세포, 또는 효모, 또는 식물 세포, 진핵생물 세포에서 발현에 최적화된-일 수 있다.
특정 실시예에서, 핵산 서열은 코돈 최적화되어, 예를 들어, 암호화된 서열의 발현수준을 증가시킬 수 있다. 특정 코돈 사용은 변형된 폴리펩티드가 발현되는 숙주 유기체에 의존한다. 기술분야의 통상적 기술자는 포유류 또는 인간 세포, 예를 들어 대장균(E. coli) 또는 사카로미세스 세리비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 박테리아 또는 효모에서 발현을 위한 최적의 코돈에 익숙하다. 예를 들어, 코돈 사용 정보는 kazusa.or.jp.codon에서 입수 가능한 Codon Usage Database로부터 이용할 수 있다 (예, Richmond (2000) Genome Biology, 1:241 for a description of the database를 참고한다. 또한, Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78을 참고한다).
치료학적 단백질
본 개시의 양태는 하나 이상의 치료학적 및/또는 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편, 및/또는 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
단백질은 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-1012, 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 모두 또는 부분집합을 포함할 수 있다. 단백질은 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-1012, 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 모두 또는 부분집합에 대한 적어도 또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 예를 들어, 단백질의 적어도 일부가 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나, 또는 이들 중 둘 이상의 조합에 대해 적어도 85% 등의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원에 기재된 단백질 서열의 다른 부분 또는 단편은 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 일부 양태는 SEQ ID NOS: 1-75 중 하나의 임의의 적합한 부분, 또는 이들 중 둘 이상의 조합에 대해 적어도 85% 등의 아미노산 서열 상동성이 있는 적어도 일부를 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
일부 양태는 인간 알파 클로토 이소폼 1에 비하여 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 실례적으로, 단백질은 인간 C370 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 C370S 변형을 포함함으로써, S370을 포함할 수 있다. 단백질은 일부 양태에서 인간 F352 또는 F352V 이외의 것을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 단백질은 C370S 변형을 포함할 수 있고, 이로써 F352V 변이체가 없는, 바람직하게는 F352이 있는 S370을 포함한다. 단백질은 H193 또는 H193R 변이체 이외의 것을 포함할 수 있다. 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기(또는 위치) 193, 352, 및/또는 370에서 모든 다른 표준 아미노산 치환은 본 명세서에서 고려되고 명백하게 개시된다.
일부 양태는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 45에서 변이를 포함한다. 위치 45에서, 잔기는 발린 (Val; V), 페닐알라닌 (Phe; F), 또는 다른 아미노산일 수 있다.
또한, 단백질은 하나이상의 글리칸(이에 부착된)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자연적 인간 알파 클로토 이소폼 1은 아미노산 106, 159, 283, 344, 604, 612, 및/또는 694에서 (당화를 통해) 부착된 글리칸을 가질 수 있다. 따라서, 본 개시의 단백질, 또는 이의 클로토 단백질 서열은 (당화를 통해) 이에 부착된 하나 이상의 동일한 (또는 비슷한) 글리칸을 가질 수 있다 (예, 동일한 아미노산 위치(들)에서). 바람직한 양태에서, 단백질은 동일한 아미노산 위치(들)에서 이에 부착된 동일한 또는 비슷한 (자연형) 글리칸 모두를 포함한다.
일부 양태에서, 단백질은 신호 펩티드 또는 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 자연적 클로토 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 단백질은 자연적이지 않거나 합성의 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 신호전달 서열은 N-말단 신호전달 서열 및/또는 클로토 단백질 서열에 대해 상류 (또는 N-말단)일 수 있다. 다른 양태에서, 신호전달 서열은 C-말단이거나 또는 다르게 위치할 수 있다. 바람직하게는, 신호전달 서열은 자연적 인간 알파 클로토 이소폼 1 신호전달 서열, 자연적 인간 알파 클로토 이소폼 2 신호전달 서열, SEQ ID NO: 71 또는 SEQ ID NO: 72에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 상동성이거나, 이를 포함하거나, 이를 가질 수 있다.
일부 양태에서, 단백질은 아미노산 태그를 포함할 수 있다. 태그는 C-말단 태그 및/또는 클로토 단백질 서열의 하류 (또는 이에 C-말단)일 수 있다. 다른 양태에서, 태그는 N-말단이거나 다르게 위치할 수 있다. 태그는 Fc-융합 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 태그는 IgG1-Fc 단백질 서열이거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 태그는 SEQ ID NO: 74에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 상동성이거나, 이를 포함할 수 있거나, 이를 가질 수 있다.
태그는 또한 또는 대안적으로 TEV-트윈스트랩 (TEV-twinstrep) 단백질 서열(예, 기술분야에 알려진 바와 같은)이거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 신호전달 서열은 SEQ ID NO: 75에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 상동성이거나, 이를 포함하거나, 이를 가질 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, 태그는 단백질로부터 절단될 수 있다. 다른 양태에서, 태그는 단백질의 일부로서 보유될 수 있다. 일부 양태에서, 태그는 단백질의 가용성 및/또는 (혈청) 반감기를 강화할 수 있다. 일부 양태에서, 태그는 단백질 정제 시 이용될 수 있다 (예, 정제 메커니즘의 일부로서).
일부 양태에서, 단백질은 클로토 단백질 서열과 아미노산 태그 사이에 위치한 링커 (예, 아미노산 링커)를 포함할 수 있다. 실례적으로, 링커는 1과 40개 사이의 아미노산, 바람직하게는 5와 20개 사이의 아미노산, 더욱 바람직하게는 8과 12개 사이의 아미노산, 가장 바람직하게는 약 10개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 링커는 GS 링커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 SEQ ID NO: 73에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 아미노산 서열 상동성이거나, 이를 포함하거나, 또는 이를 가질 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, 단백질은 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에 의해 결정되고 집행되는 바와 같은 CGMP 규정을 준수할 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질은 적어도 95% 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 순도, 건조 중량일 수 있다. 일부 양태에서, 클로토 단백질 시료는 약 1-100 ppm (parts per million) 미만의, 약 100-1000 ppb (parts per billion) 미만의, 또는 약 1-100 ppb 미만의 CHO 숙주세포 단백질 (host cell protein, HCP), 핵산, 및/또는 다른 세포 성분 또는 이들 사이에 위치한 임의의 값 또는 값의 범위를 포함할 수 있다.
핵산 및 발현 벡터
일부 양태는 핵산 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 양태는 발현 벡터 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 핵산은 본 명세서에 제시된 바와 같은 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 변이체를 암호화할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 핵산은 본 명세서에 개시된 바와 같은 클로토 단백질 서열, 선택적 (자연적이거나 자연적이지 않은) 신호전달 서열 [예, 클로토 단백질 서열의 N-말단 끝 (N-terminus) 또는 N-말단 (N-terminal)에서], 선택적 링커 서열 (예, GS 링커), 및/또는 아미노산 태그 (예, IgG1-Fc 또는 TEV-트윈스트랩)을 암호화할 수 있다.
일부 양태에서, 핵산은 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-1012, 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 모두 또는 부분집합을 포함하는 단백질을 발현할 수 있다. 단백질의 적어도 일부는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-1012, 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 모두 또는 부분집합에 대해 적어도 또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 예를 들어, 단백질의 적어도 일부가 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 75 중 하나의 모두 또는 적어도 일부 또는 이들 중 둘 이상의 조합에 대해 적어도 및/또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 모두 또는 적어도 일부에 대해 적어도 및/또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100% 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다.
일부 양태에서, 핵산의 적어도 일부는 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 101 중 하나의, 또는 이들 중 둘 이상의 조합에 대한 적어도 및/또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 가질 수 있는 핵산의 적어도 일부를 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 핵산은 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대한 적어도 및/또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 개시의 핵산 서열은 기술분야에 알려진 바와 같은 종결 코돈(예, TGA, TAG, TAA)을 포함할 수 있다.
세포주 및 제조 방법
본 개시의 양태는 세포주를 포함할 수 있다. 세포주는 CHO 세포, HEK 세포, HL-60 세포를 비롯한 임의의 적합한 세포 유형 또는 기술분야에 알려진 다른 세포주 를 포함할 수 있다. 실례적으로, 세포주는 CHO 세포 (예, 복수의 CHO 세포)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CHO 세포는 외인성 핵산(의 하나 이상의 카피)을 (각각) 함유할 수 있다. 핵산은 상동성 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 75 중 하나, 또는 이들 중 둘 이상의 조합, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 및/또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
핵산은 적어도 하나의 전이 유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산의 적어도 일부가 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 101 중 하나, 또는 이들 중 둘 이상의 조합, 바람직하게는 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대해 적어도 및/또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%의 핵산 서열 상동성을 가질 수 있다. 핵산은 플라스미드 또는 핵산의 다른 (구조적) 형태일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 외인성 핵산은 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 및/또는 글루타민 합성효소 (GS)를 비롯한 기능성 효소를 암호화할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, CHO 세포는 CHO-S 세포와 같은 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 결실 CHO 세포일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 핵산은 프로모터 (예, 기술분야의 통상적 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 약한 프로모터에서 강력한 프로모터까지)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 핵산은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85% 등의 핵산 서열 상동성을 갖는 전이 유전자와 관련된 (강력한) 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 전이 유전자는 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
편의를 위해, CHO 세포 및/또는 세포주는 본 개시 전체에 걸쳐 언급된다. 그러나, 다른 세포, 세포주 및/또는 숙주세포 (CHO 세포 외)가 본 개시의 범위 내에서 또한 고려될 수 있음이 숙지된다. 따라서, CHO 세포 및/또는 세포주에 대한 언급은 다른 알려진 세포, 세포주 및/또는 숙주 세포에 대한 언급 및/또는 이의 사용을 또한 고려한다.
형질주입
CHO 세포주를 제조하는 방법은 CHO 세포내로 외인성 핵산을 바람직하게는 형질주입, 또는 기술분야에 알려진 바와 같은 다른 기법을 통해 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 무혈청 생장에 최적화된 CHO 세포주의 세포 현탁액을 프로모터, SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 인간 알파 S-클로토 전이 유전자, 및 선별 (효소) 마커를 함유하는 핵산(플라스미드)의 삽입을 위한 숙주 세포주로 사용하였다. 전이 유전자는, 각각 인간 알파 가용성 클로토의 아미노산 1 내지 981, 29 내지 981, 또는 34 내지 981를 암호화한다. 특정 양태에서, 전이 유전자는 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대응하는 서열을 가졌다 (또는 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대해 적어도 85%의 핵산 서열 상동성을 가졌음). DHFR 결실 CHO 세포주 (CHO-S 세포주와 같은)의 경우에, 선별 (효소) 마커는 외인성 DHFR이었다. 다른 CHO 세포주의 경우에, 선별 (효소) 마커는 외인성 GS이었다.
생장, 선택 및/또는 유전자 증폭
일부 양태는 세포 (예, 형질 주입된 및/또는 CHO 세포)를 고체 배지상에서 및/또는 액체 배지에서 (예, 현탁 세포 배양액에서), 바람직하게는 무혈청 및/또는 동물 (또는 동물 유래) 단백질 (성분)이 없는 배지에서 생장시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포를 고체 생장 배지에서 일정 기간동안 평판배양 할 수 있다. 세포를 또한 또는 대안적으로 현탁 배양액 및/또는 액체 배지에서 생장시킬 수 있다. 액체 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 하이포크산틴 및 티미딘 (HT), 글루타민 등이 없을 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, 특정 기간 후 (예, 48 시간 후의 형질주입), 세포를 채취하고(예, 탈착됨), 선택적으로 원심 분리하며(예, 100×g에서 5분 동안), 및/또는 96-웰 부착 배양 플레이트 (예, 혈청 보충된, -HT 및/또는 -글루타민 배지를 함유하는) 같은 것 내로 씨딩(seeding)하였다 (예, 대략 2000 세포/웰에서). 또한, 배지는 특정 양태에서 MTX 및/또는 MSX를 포함할 수 있다. 형질주입 되지 않은 세포는 선택 후(예, -HT 및/또는 -글루타민 배지에서 MTX 및/또는 MSX에 노출 후) 7-14 일 이내에 사멸할 수 있다.
특정 양태에서, CHO 세포는 외인성 핵산 (예, 세포 당)의 적어도 약 2 내지 10 카피, 적어도 약 10 내지 20 카피, 적어도 약 20 내지 30 카피, 또는 적어도 약 30 내지 50 카피를 함유할 수 있다(함유하도록 선택될 수 있다). 따라서, 방법은 외인성 핵산 (예, 세포 당)의 적어도 약 2 내지 10 카피, 적어도 약 10 내지 20 카피, 적어도 약 20 내지 30 카피, 또는 적어도 약 30 내지 50 카피를 함유하는 CHO 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, MTX 및/또는 MSX(의 연속적으로 증가하는 수준)을 세포로 투여할 수 있다 (예, 약 1 nM - 1 μΜ, 약 10 - 100 nM 등의 농도에서).
외인성 DHFR이 형질 주입된 DHFR 결실 CHO 세포에서 (CHO-S 세포주와 같은) 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 유전자 증폭을 생장 배지에서 메토트렉세이트 (MTX)의 수준을 연속적으로 증가시킴으로써 완수하였다. 플라스미드가 DHFR을 함유하기 때문에, 이는 MTX (10 - 100 nM)에 노출에 대해 숙주 세포내에서 S-클로토 유전자 (단편)의 증폭을 허용한다. 또한, GS 유전자 발현 시스템을 사용하여 외인성 GS로 형질 주입된 CHO 세포를 증폭하였다 (예, MSX에 노출에 대한). 대안적으로, GS -/- 숙주 세포주를 또한 사용하였는데, 이는 MSX에 대한 필요성을 제거하였다. 이러한 단계는 S-클로토 유전자의 다수의 카피의 (예, 세포당 10 내지 30 카피 사이의 유전자) 생성과 그에 따른 형질전환 세포주에서 높은 수준의 S-클로토 단백질을 야기하였다.
현탁 배양액에서, 단백질은 일부 양태에서 CHO 세포로부터 액체 배지내로 분비될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 특정 CHO 세포 및/또는 세포주는 액체 배지 1 리터 당 200 - 500 mg의 농도의 단백질, 액체 배지 1 리터 당 500 - 2000 mg의 농도의 단백질, 액체 배지 1 리터 당 2000 - 5000 mg의 농도의 단백질, 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위 까지 (단백질의 농축 없이) 분비할 수 있다(또는 분비하도록 선택될 수 있다). 적어도 하나의 양태에서, 고생산 세포주(high producing cell line) (또는 현탁 배양액)를 선택할 수 있어서, (선택된 세포주의 선택된 현탁 배양액 또는 현탁 배양액의) 배지내 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질은 단백질의 농도는 농축 없이 적어도 200 mg/L, 바람직하게는 적어도 500 mg/L, 더욱 바람직하게는 적어도 1000 mg/L, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 2000 mg/L, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5000 mg/L이다.
그에 따른 S-클로토를 고생산(high producing)하고, 전이 유전자를 함유하는 콜로니의 한계 세포 희석(limited cell dilution)에 의한 서브 클로닝(sub-cloning)을 수행하여서 500 내지 2000 mg/L 범위내의 S-클로토를 세포 조건 배지 (cells conditioned media)내로 분비하는 S-클로토를 분비하는 CHO 세포주를 더 생산하였다. 모든 세포 구조물은 제한 효소 절단하였고 서열을 확인하였다.
일부 양태에서, CHO 세포는 적어도 10 리터, 바람직하게는 적어도 25 리터, 더욱 바람직하게는 적어도 50 리터, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 100 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 250 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 500 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 1,000 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 2,000 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 2,500 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5,000 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 10,000 리터의 부피 또는 작업 부피를 갖는 생물반응기에서 생장할 수 있다.
세포주 유지
선택적으로 세포 서브 클로닝으로 이어지는 증폭된 고생산 S-클로토 세포주 (예, DHFR/MTX 또는 GS/MSX 시스템에 의해 생성됨)를 위해, 스케일 업(scale-up) 및 최종 생물반응기 가동까지 동안 생산 세포주로 투여되는 농축된 배지 공급(concentrated media feeds)의 신중한 사용을 무혈청 및 동물 단백질 성분을 함유하지 않은 기저 배지(basal media)에서 수행했다.
고생산자 세포주(high producer cell line)의 스케일 업을 세포 현탁액에서 세포 접종 확장(cell inoculum expansion)에 의해 교반 플라스크(shake flasks) 또는 웨이브 백(Wave Bag) 시스템에서 마쳤고, 100L에 이어서 500L 용량의 생물반응기에서 생산된 세포의 연속적 접종이 이어졌다. 세포 생존율은 교반 플라스크, 웨이브 백, 또는 생물반응기에서 생장 사이클 전체에 걸쳐서 85%의 살아있는 세포 보다 높게 유지되었고; 이어서, 생성된 S-클로토(“고생산자”로 표기됨)의 1-3 g/L 까지의 수반되는 생성이 있는 CHO S 세포 생장의 안정기(plateau phase)동안 생물반응기에서 80% 이상의 생 세포수(viable cell counts)가 유지되었다.
단백질 생성
특정 양태는 포유류 (예, CHO) 세포에서 클로토 단백질의 치료학적 양의 생성에 강력한 프로모터 서열 및/또는 플라스미드의 높은 카피 수를 이용하는 재조합 DNA 전략을 이용할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 예를 들어, DHFR 결실 CHO 세포에서 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 유전자 증폭은 (연속적으로 증가하는 수준의) 메토트렉세이트 (MTX)의 제공 및/또는 사용을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 외인성 글루타민 합성효소 (GS) 유전자 함유 CHO 세포를 메티오닌 설폭시민 (MSX)으로 처리할 수 있다.
또한, 클로토 단백질은 하나 이상의 글리칸(이에 부착된)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자연적 인간 알파 클로토 이소폼 1 (SEQ ID NO: 1)은 아미노산 106, 159, 283, 344, 604, 612, 및/또는 694에서 부착된 (당화를 통해) 글리칸을 가질 수 있다. 본 개시의 클로토 단백질은 하나 이상의 이에 부착된 (당화를 통해) 동일한 (또는 비슷한) 글리칸을 (예, 동일한 아미노산(들)에서)가질 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, 단백질은 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에 의해 결정되고 집행되는 바와 같은 CGMP 규정을 준수할 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질은 적어도 95% 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 순도, 건조 중량일 수 있다. 일부 양태에서, 클로토 단백질 시료는 약 1-100 ppm (parts per million) 미만의, 약 100-1000 ppb (parts per billion) 미만의, 또는 약 1-100 ppb 미만의 CHO 숙주세포 단백질 (host cell protein, HCP), 핵산, 및/또는 다른 세포 성분 또는 이들 사이에 위치한 임의의 값 또는 값의 범위를 포함할 수 있다.
구조를 인간 체액(즉, 혈액, 혈청, 소변, 뇌척수액)으로부터 분리된 자연적 S-클로토 구조에 비하면, 생성된 S-클로토 단백질에 존재하는 글리칸 구조는 비슷하거나 동일할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 자연적인 것과 유사한 글리칸의 확인은 알맞은 자연적인 번역 후 변형(post-translation modifications, PTMs)이 S CHO 세포에서 생성된 S-클로토 단백질에서 생성되고 안정적으로 유지되는 것을 확인할 수 있다.
클로토 단백질의 가용성 및/또는 반감기 연장
개시된 것은 인간 S-클로토 단백질의 반감기를 연장시키고 이의 가용성을 증가시키는 방법과 조성물이다. 또한, 이러한 결과를 달성하도록 그렇게 생성된 단백질 구조물의 정제와 특징은 또한 본 개시의 대상이다. 생물학적 기질에서 (혈액, 뇌척수액, 소변, 또는 다양한 인간조직과 같은 바에서) 자연적 클로토 분자의 생물학적 반감기 또는 가용성 보다 증가된 생물학적 반감기 또는 증가된 가용성이 있는 그에 따른 인간 클로토 변이체 단백질 (신규한 조성물)을 얻기 위하여, 클로토 유전자 또는 핵산 구조물 (SEQ ID NOS: 76-96을 참고)의 서열에서 만들어진 핵산 변화 및/또는 이의 변화, 또는 클로토 단백질 (SEQ ID NOS: 1-70을 참고)의 아미노산 서열내 화학적 변형, 및/또는 클로토 단백질의 아미노산 서열에 대한 화학기, 펩티드, 또는 단백질의 첨가 또는 치환에 관한 관련 있는 정보는 본 개시에서 교시되었다. 이러한 신규한 조성물은 S-클로토 단백질의 변형에 대한 본 명세서에서 기술된 방법을 통해 만들어 질 수 있다.
융합 단백질 구조물을 S-클로토 단백질과 항체 (IgG)의 Fc 도메인을 결합함으로써 생성할 수 있다.
융합 단백질 구조물을 S-클로토 단백질과 인간 혈청 알부민 (human serum albumin, HSA)을 결합함으로써 생성하였다.
융합 단백질 구조물을 S-클로토 단백질과 인간 트랜스페린 (TF, transferrin)을 결합함으로써 생성하였다.
S-클로토 단백질을 XTEN®과 같은 전매 재조합 폴리펩티드와 결합함으로써 융합 단백질을 생성하였다.
신규한 S-클로토 단백질을 페길화(pegylation)를 통해 생성하였다.
전술한 및 다른 반감기 연장 방법론을 이용하여 S-클로토 단백질의 성능을 다음의 몇몇 방법으로 향상시켰다:
우수한 환자 편의성 및 준수 가능성을 제공하는 S-클로토 투여 간격 증가.
전체적으로 더 낮은 약물 사용 및 감소한 상품의 비용을 야기하는 감소된 투여 빈도.
모단백질 (parent protein)과 동일한 투여 간격에서 더 낮은 약물량(drug quantity).
투여 제제의 간소화 및 피하주사 제제(subcutaneous formulation)를 가능케 함.
더 긴 약물 노출 및 잠재적으로 더 나은 효능을 야기하는 모단백질과 동일한 투여 및 투여 간격을 이용한 더 높은 약물 수준.
S-클로토의 면역원성의 감소.
S-클로토의 Fc 도메인 융합 단백질 구조물의 생성
항체 Fc 도메인과 인간 혈청 알부민 (human serum albumin, HSA)을 인간 S-클로토 단백질의 반감기의 연장 및 이의 가용성의 증가에서 유효성 대해 검사하였다. Fc 융합은 항체의 Fc 부분에 펩티드, 단백질 또는 수용체 엑소도메인(exodomain)의 융합을 수반한다. Fc와 알부민 융합 모두는 펩티드 약물의 사이즈를 증가시킨 것 뿐만 아니라 연장된 단백질을 태아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor, FcRn)와 결합을 통한 인체의 자연적 재활용 메커니즘을 이용함으로써 연장된 반감기를 달성한다. 연장된 단백질을 FcRn 수용체로 결합시킨 후, 세포의 엔도솜(endosome)에서 융합 단백질의 분해가 예방된다. Fc 또는 알부민의 첨가에 기초한 융합은 3-16 일의 범위 내의 생물학적 반감기를 야기할 수 있으며, 이는 전형적인 페길화되거나 지질화된 펩티드에 대해 보고되어온 것보다 더욱 길다. 더욱 목적하는 약동학적 프로파일(pharmacokinetic profile)이 있는 바이오베터 약물(biobetter drug)을 만들기 위한 Fc 융합 단백질, 인간 혈청 알부민으로 융합, 카복시 말단 펩티드(carboxy-terminal peptide)로 융합, 및 다른 폴리펩티드 융합 접근법과 같은 단백질 융합 기술의 사용을 기술하는 리뷰를 위해, Strohl WR. Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters. Biodrugs. 2015;29(4):215-239을 참고할 수 있으며, 이 내용 전체는 구체적 참조로 본 명세서에 포함된다.
Fc 도메인을 본 발명의 모단백질 (S-클로토)에 이와 같이 첨가하여 Fc 수용체 (Fc receptor, FcRn)에 대한 결합 친화도(binding affinity)를 증가시켰다. FcRn은 혈관을 라이닝하는(lining) 내피 세포(endothelial cells)에서 리소좀(lysosomes)내부에 존재하고, 기능하여 순환에서 대부분의 단백질을 수명이 짧도록 만드는 분해로부터 항체를 구한다. FcRn과의 상호작용의 결과로서, 단백질은 수 일에서 수 주에 걸친 반감기를 가지며, 이는 이 새롭게 생성된 물질의 구성을 갖지 않는 생물의약품(biologics)보다 덜 빈번한 단백질 약물의 확장된 형태의 투여를 허용한다.
Fc와 알부민 사이의 주요 차이점은 HSA와 대조적으로 이량체 또는 단량체로서 Fc 융합 펩티드의 존재로 이끄는 HSA의 단량체 구조 (monomeric structure)에 대한 Fc의 이량체 특성(dimeric nature)이다. S-클로토에 대한 표적 수용체가 충분히 가깝게 함께 간격을 두거나 특히 인간 표적 기관에서 이들 스스로가 이량체일 경우, 펩티드 Fc 융합의 이량체 특성은 결합도 효과(avidity effect)을 생성할 수 있다. 이는 바람직할 수 있거나 표적에 의존적이지 않을 수 있다.
또한, S-클로토 단백질을 항체 Fc로의 융합은 본 개시에 교시되어 S-클로토의 가용성과 안정성을 향상시킨다. 또한, Fc 도메인의 S-클로토로 첨가는 인간 개체에 투여 시에 융합 단백질의 면역원성이 감소되도록 허용할 것이다.
S-클로토 단백질과 인간 혈청 알부민 (human serum albumin, HSA)의 컨쥬게이션
인간 IgG와 비슷한 66.5 kDa의 단백질 HSA는 19일 범위내 긴 평균 반감기를 가진다. ~50 mg/mL (~600 μM)의 농도에서, HSA는 인간 혈장에서 가장 풍부한 단백질이며, 이는 혈장 pH의 유지, 대사물질 및 지방산 수송, 및 혈압을 유지하는 기능을 비롯한 몇몇 기능을 가진다. 또한, 신장에 의한 단백질의 사구체 여과(glomerular filtration)에 대한 상한의 크기에 있는 HSA는 강한 음이온으로, 신장을 통한 이의 여과를 훨씬 더욱 지연시키도록 돕는다. 또한, IgG 처럼, HSA는 pH 의존적 방식에서 FcRn과 결합하고, IgG 결합의 부위와 상이한 부위에-이와 별개의 메커니즘을 통해-있음에도, IgG와 비슷하게 재활용되며, 이는 이의 확장된 반감기를 야기한다. 또한, HSA는 종양과 염증이 생긴 조직에서 축적되는 경향이 있으며, 이는 알부민으로 융합 또는 결합이 단백질 또는 펩티드를 이러한 부위로 표적하는 것을 잠재적으로 도울 수 있는 것을 시사한다.
선천적으로 짧은 반감기 특성이 있는 펩티드 또는 단백질의 혈청 반감기의 연장을 위한 이러한 분자의 HSA로의 융합을 초기 1990년 이래로 폭넓게 연구해오고 있다. 이 이후로, 혁신적이면서 잠재적인 바이오베터 분자로서 많은 상이한 펩티드와 작은 단백질이 HSA에 융합되어왔다. 마케팅(marketing)하도록 승인된 첫번째 HSA-펩티드 또는 단백질 융합 제품은 Human Genome Sciences에서 발견하고 GlaxoSmithKline에 의해 발전되고 판매된 DPP-4-저항성 GLP-1-HSA 융합 단백질인 Tanzeum® (유럽 연합에서 Eperzan®로 판매됨)이었다. Tanzeum® (알비글루티드(albiglutide))는 유럽 의약품 기구(European Medicines Agency, EMA)와 FDA에 의해 2014년 3월과 4월에 각각 승인되었다. HSA는 약리학적 활성(pharmacologically active) GLP-1의 반감기를 자연적 GLP-1에 대한 1-2 분으로부터 4-7일로 따라서 향상시켰는데, 이는 주 1회 투여를 허용한다. 7개의 다른 알려진 HSA 융합 단백질 제품 후보들은 지금 개발 중이거나 최근 개발되고 있다. 또한, Novozyme은 반감기 특성을 훨씬 길게 보유할 수 있는 “차세대” HSA-단백질 융합의 제작을 위한 개선된 FcRn 결합이 있는 변형된 버전의 재조합 HSA을 개발해오고 있다. 이는 FcRn에 대한 12배 더 큰 친화도를 보유하는 것으로 판명된 HSA의 K573P 돌연변이의 사용에 기초하였고, 이는 마우스와 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey) 모두에서 HSA에 야생형 분자보다 더 긴 반감기를 부여했다. 이러한 더 긴 반감기의 HSA의 돌연변이가 융합 단백질로서 더 사용되어 융합 단백질의 반감기를 향상시킬 것으로 예상된다.
본 명세서의 발명자는 그러므로, 우수한 환자 편의성 및 준수 가능성, 전체적으로 더 낮은 약물 사용, 및/또는 상품의 감소한 비용을 야기하는 감소된 투여 빈도와 같은 전략적 치료학적 이점을 초래하기 위해, 우리는 우리의 클로토 단백질을 야생형 HSA 또는 HSA의 돌연변이 형태로 융합시켜 인간 혈액, 뇌척수액, 및 다른 인간 생물학적 기질에서 현저히 연장된 반감기가 있는 클로토 융합 분자(들)을 생성시킬 수 있음을 개시한다. 또한, 모단백질과 같은 투여간격에서 더 낮은 약물량은 투여 제제를 간소화할 수 있고 피하주사 제제 또는 S-클로토의 면역원성의 감소를 가능하게 할 수 있다.
S-클로토 단백질과 인간 트랜스페린(transferrin, TF)의 컨쥬게이션
트랜스페린은 대단히 풍부한 혈청 당단백질로, 혈청에서 3-4 mg/mL로 발견되며, 이는 철분에 단단히 그러나 가역적으로 결합하고 조직으로 철분을 운반하도록 기능한다. 트랜스페린은 679개의 아미노산 잔기를 가지고, 크기는 약 80 kDa이며, 두개의 높은 친화도의 Fe3+ 결합 부위(high-affinity Fe3+-binding site)를 보유하는데, 하나는 N-말단 도메인에 있고 다른 하나는 C-말단 도메인에 있다. 인간 트랜스페린은 7-10 일 또는 10-12 일 것으로 보고된 반감기를 가진다. 전체 트랜스페린 풀(transferrin pool)의 약 2-8 %을 이루는 인간 트랜스페린의 당화되지 않은 형태(aglycosylated form)는 14-17일의 약간 긴 반감기를 갖는다. 인간 혈청에서 트랜스페린의 연장된 지속은 클라트린 의존성 트랜스페린 수용체 매개 메커니즘(clathrin-dependent transferrin receptor-mediated mechanism)덕분이며, 이는 수용체에 결합된 트랜스페린을 재활용하여 순환으로 돌려보낸다.
펩티드 및 단백질의 융합이 인간 트랜스페린에 N- 말단 및 C- 말단 끝으로 뿐만 아니라 트랜스페린의 두개의 주요 로브(lobe)를 함께 연결하는 중심에 위치한 경첩 부위(hinge region)로 만들어졌다. 트랜스페린의 N 말단 끝은 막혀 있지 않고 직접적으로 융합될 수 있다. C 말단 끝은 더욱 파묻혀 있고 가까운 이황화 결합에 의해 속박되어서, 단백질이 C 말단 끝으로 융합될 경우 가요성 링커(flexible linker)가 전형적으로 사용된다. 이 능력은 펩티드 라이브러리를 특정 표적에 대하여 만들고, 이어서 이러한 라이브러리로부터의 바인더(binder)를 당화되지 않은 트랜스페린(aglyco-transferrin) [N-말단, C-말단, 루프(loop), 또는 링커 영역(linker region)]으로 융합함으로써 확장되어서 연장된 반감기가 있는 치료학적 융합 단백질으로 개발될 것이다.
생명공학 회사 BioRexis Technologies, Inc.는 트랜스페린 융합 단백질 플랫폼을 개발하기 위해 2002년 설립되었는데, 이들은 이 플랫폼을 치료학적 플랫폼으로서 “트랜스 바디(Trans Body)” 플랫폼으로 명명하였다. 이들의 선도 분자(lead molecule) BRX-0585는 2형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus, T2DM)의 치료를 위한 트랜스페린-GLP-1 융합 단백질이었다. GLP-1의 트랜스페린으로 융합은 GLP-1의 반감기를 현저히 강화하는 것으로 입증되었다. BioRexis는 Pfizer에 의해 2007년 3월 인수되었다. 결정될 수 있는 한, 현재 임상에 있는 BioRexis 유래 융합 단백질은 없다. 클로토 단백질을 인간 트랜스페린으로 융합하여 클로토 융합 분자를 생성할 수 있고 이를 임상적으로 투여해서 생체내 인간 생물학적 기질에서 반감기 또는 안정성을 현저히 연장시킬 수 있다.
Amunix 제품인 XTEN과 S-클로토 단백질의 컨쥬게이션
XTEN®은 치료학적 탑재물(therapeutic payload)의 생체내 반감기를 연장하는 전매 재조합 폴리펩티드이다. XTEN은 자연적으로 발생한 친수성 아미노산으로 구성되며 생분해성(biodegradable)이다. 단백질, 펩티드, 및 합성 화합물과 같은 의약품은 화학적 컨쥬게이션 또는 유전학적 융합을 통해 XTEN화(XTENylated)될 수 있다. XTEN 단백질은 2차 구조 및 3차 구조가 없고 이들의 용액 거동(solution behavior)은 매우 큰 유체역학적 반경(hydrodynamic radius)이 있는 화학적으로 제조된 중합체와 유사하다. 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해, XTEN 단백질 중합체는 비슷한 분자량의 전형적인 구형 단백질(globular protein)보다 훨씬 크게 나타난다. XTEN의 팽창 효과(bulking effect)는 부착된 분자의 신청소율(renal clearance)을 상당히 감소시킴으로, 이들의 생체내 반감기를 상당히 증가시킨다. 현재의 발명에서, 클로토 단백질에 추가된 XTEN 중합체의 길이는 주문제작 되어서 부착된 클로토 단백질 탑재물의 약동학 뿐만 아니라 생체 분배(bio-distribution)를 최적화할 것이다.
XTEN은 따라서 우리의 S-클로토 단백질로 재조합적으로 융합되어 생체내 분자 반감기를 증가시킬 수 있다. 하나의 이점은 유전학적 S-클로토-XTEN 융합 구조물로 치료학적 모이어티(therapeutic moiety) 및 팽창 모이어티(bulking moiety) 모두를 포함하는 단일 분자의 특성화, 정제, 및 발현의 편의성을 갖는 분자가 생성되는 것이다. 재조합 융합은 XTEN화 성장 호르몬 (Somavaratan, Versartis 제품) 및 FVIII-XTEN (Biogen 제품)에 의해 예시된 바와 같은 동종 최고의 약동학을 가져온 치료학적 약물 제조자에 의해 성공적으로 이용되어 온 정확하게 정의된 위치에서 단백질 당 복수의 XTEN 사슬을 부착하는 것을 허용한다. 예를 들어, XTEN화 성장 호르몬(Somavaratan, Versartis)의 상이한 투여를 수용하는 아이들에서 수행한 약동학이 수용체 매개성 제거(receptor-mediated elimination)를 감소시켜 신장 청소율(kidney clearance)외에도 동종 최고의 반감기를 야기하는 Somavaratan 분자의 최적화를 보였다.
XTEN 단백질 중합체를 펩티드, 펩티도모방체(peptidomimetics), 및 다른 합성 분자로 화학적 컨쥬게이션을 위한 유리 중간체(free intermediate)로서 생성할 수 있다. 반응기 (티올, 아민)를 정확하게 정의된 위치에 시스테인 또는 리신 잔기를 XTEN을 암호화는 유전자로의 도입을 통해 삽입한다. Amunix는 파트너에게 제공될 수 있는 다양한 간격(various spacing)으로 1 내지 9 티올기를 함유하는 XTEN을 개발해왔 다. 따라서, 본 발명에서는, XTEN내의 아미노기 및 티올기로 직교의 컨쥬게이션(orthogonal conjugation)이 우리의 클로토-XTEN 분자의 생성을 용이하게 할 것이다.
단백질의 정제
클로토 단백질을 CHO 세포 (예, CHO 세포주의)의 세포 현탁 배양액으로부터 추출할 수 있다. CHO 세포를 생성하여 선택적으로 클로토 단백질을 분비시킬 수 있다 (예, 액체 배지내로). 또한, 세포가 이용한 배지내로 200 - 500 mg/L 까지의 S-클로토의 분비를 관찰하였다.
본 개시의 재조합 단백질의 정제를 기술분야에 알려진 또는 본 명세서에 기술된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 추출, 침전, 크로마토그래피 및/또는 전기영동을 수반하는 임의의 통상적인 절차에 의해 수행할 수 있다. 단백질의 정제에 이용될 수 있는 추가의 정제 절차는 표적 단백질에 결합하는 단일 클론 항체를 이용하는 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 일부 양태는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 IgG가 태그된 단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 재조합 단백질을 함유하는 미가공 제조물(crude preparation)을 적합한 단일클론 항체가 부동화된 컬럼을 통과시킨다. 불순물은 통과하는 반면, 단백질은 특정 항체를 통해 컬럼에 대개 결합한다. 컬럼을 세척한 후, 단백질을 pH 또는 이온 강도(ionic strength)를 변화시킴으로써 젤로부터 용출한다. 예를 들어, CHO-S 고생산자 세포주로부터 이용한 배지를 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 통해 농축시켰고; S-클로토 단백질을 친화도 크로마토그래피에 이어서 이온 교환 카트리지(ion exchange cartridge) 또는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 또한, 크기배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제할 수 있다.
대안적인 프로토콜에서, 하나 이상의 전- 또는 후- 친화도 정제 단계를 수행하였다. 이러한 단계는, 예를 들어, (초)원심분리, 투석, 멤브레인 및/또는 접선 유동 여과, 이온 교환과 같은 크로마토그래피 분리(chromatographic separation), (수성) 2상 추출 [(aqueous) two-phase extraction]과 같은 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction), 또는 다른 알려진 정제 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 후 정제 처리 단계를 특정 양태에서 수행하였다. 이러한 후 정제 처리 단계는, 예를 들어, 탠덤 음이온/양이온 비흡착 크로마토그래피 [tandem anion/cation flow-through chromatography (결합-및-용출 크로마토그래피(bind-and-elute chromatography)와 대조적임)], 멤브레인 여과 (예, 0.2 미크론, 0.1 미크론 등)에 의한 또는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 다른 수단에 의한 바이러스 및/또는 박테리아 제거를 포함할 수 있다.
클로토 단백질의 분석
단백질 순도를 SDS-PAGE 또는 기술분야에 알려진 다른 검정 또는 수단에 의해 입증할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 양태에서, 미리 만든 SDS-PAGE 젤 상에서 (4-15%, 10 웰; 카탈로그 no. 456-1083; BioRad) 클로토 단백질 시료 (50 μg)를 분획하였고, 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue stain)으로 염색하였다. 모든 시료를 사이가 빈 레인(lane) 또는 별도의 젤에서 러닝(running)하여 샘플 간 오염을 피했다. 쿠마시 블루 염색과 농도계 추적(densitometry tracing)에 의해, 또는 은 염색 가시화(silver stain visualization)에 의해, 또는 HPLC 또는 RP-HPLC에 의해 결정된 98% 초과의 S-클로토가 CHO S 조건 배지로부터 분리된 것으로 나타났다. 서열 정보를 획득하기 위해, 단백질 (환원 및 S-카복시메틸화 후)을 브롬화 시안(cyanogen bromide), 트립신, 및/또는 단백질분해효소 K 및 HPLC에 의해 분리된 펩티드로 단백질 화학의 알려진 방법에 따라서 절단할 수 있다. 이로써 제조된 시료를 아웃렛(outlet)에 연결된 온라인 자동 HPLC PTH 아미노산 분석기 (Applied Biosystems Model 120, ABI, 미국 캘리포니아 포스터 시티)가 있는 자동 기체상 마이크로시퀀싱(automatic gas phase microsequencing) 장치에서 (Applied Biosystems Model 470A, ABI, 상기 참조) 이어서 시퀀싱하였다.
또한, 단백질을 질량 분광적 방법(mass spectroscopic method)을 통해 분석하였다. 질량 분석법(mass spectrometry)을 위한 시료 제조에 관하여, 올바른 S-클로토 단백질로 분석을 제한하기 위해, 75 및 150 kDa 사이의 젤 밴드(gel band)만 분석을 위해 절제하였다. 젤 분획물을 소독한 날로 침연하였고(macerated) 내부 절단(in-gel digestion)을 했다. 젤 분획물을 80 μL의 50% 아세토니트릴 (acetonitrile, ACN)/50 mm 암모늄 하이드로젠 카보네이트(ammonium hydrogen carbonate)를 이용한 3회의 세척에 의해 탈색하였고, 100%의 CAN으로 세척하였다. 표적 α-클로토 펩티드로부터 시스테인 잔기가 없다면, 알킬화 단계는 생략하였다. 트립신 절단(tryptic digestion)을 50 mm 암모늄 하이드로젠 카보네이트(0.005 μg/μL)에서 60 μL의 트립신 [시퀀싱 등급이 변형된(sequencing grade modified), 카탈로그 no. V511A; Promega]으로 37°C에서 밤새 수행하였다. 이 과정은 25 μL을 수득하였고, 이 중 5 μL (S-클로토에 대해 1 μL)을 nanoLC (Dionex Ultimate 3000 UHPLC)에 연결된 Orbitrap 나노-ESI Q-Exactive 질량 분석기 (Thermo Scientific)에서, 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 텐덤 질량 분석법 [liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (MS/MS)]과 PRM 분석을 하였다. MS/MS 분석은 본 개시의 양태에 의해 생성된 인간 재조합 알파 S-클로토가 (인간 혈액, 혈청, 소변 또는 뇌척수액에서 발견되는 것과 실질적으로 비슷함 예, 대응하는 아미노산 서열에서 동일함)을 확인하였다.
상기의 정제 방법을 이용하여, CHO 숙주 세포 단백질 (HCP)을 오염시킨 수준을 결정하여 정제된 S-클로토 단백질에서 허용될 수 있도록 하였다. 최종 S-클로토 생성물에서, HCP는 1-100 ppm 미만으로 제거되었다. 98+% 순도의 S-클로토 단백질 생성물을 이용한 CHO S 생성 세포주 (세포 및/또는 액체 배지)로부터 분리하였다. 구체적으로, 인간 개체에서 임상적 투여에 적합한 분석적 프로파일(analytical profile)을 갖는 CGMP-등급 인간 알파 S-클로토를 생성하고 정제하였다. 예를 들어, 인간 재조합 알파 S-클로토의 분석적 프로파일이 ProteomeXchange Database에서 참조 번호 PXD002775에 의해 표기되어 있고, 이는 http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=PXD002775에서 찾을 수 있다. NIH 전체 S-클로토 단백질 데이터 세트(dataset)는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/단백질/Q9UEF7에 있다.
임상적 투여에 적합한 S-클로토에 대한 분석적 프로파일과 본 개시의 양태에서 수득한 것은 1 μg 당 0.1 ng (1 EU/μg)의 S-클로토 보다 작은 내독소(endotoxin) 수준을 포함하였다. 더욱이, 정제된 인간 재조합 S-클로토는 SDS PAGE에 의해 98% 이상의 순도를 갖는 것으로 또한 나타났다.
CHO S 세포 생성 S-클로토 상에 존재하는 글리칸 구조는 인간 체액 (예, 혈액, 혈청, 소변, 및 뇌척수액)으로부터 분리된 자연적 S-클로토상의 구조와 비교하여 동일하였다. 이는 S CHO 세포 생성 S-클로토 단백질에서 동일한 자연적 번역 후 변형(post-translation modifications, PTMs)이 생성되었고 안정하게 유지되었음을 확인하였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 생성 및 정제 방법을 사용하여, 인간 개체에서 임상적 투여에 적합한 분석적 프로파일을 가진 cGMP-등급 인간 S-클로토의 생성에 있어서 성공하였다.
치료학적 조성물
본 개시의 일부 양태는 치료학적 조성물과 같은 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 본 개시의 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 성분으로 구성된 운반체(vehicle) 또는 담체가 있는 재조합 가용성 알파 클로토 단백질 혼합물의 약제학적 유효량을 일반적으로 포함할 수 있다. 성분은 하나 이상의 응집 억제제(aggregation inhibitor), 완충액, 장성 조절제(tonicity modifier), 및 추가의 부형제(excipient)를 포함할 수 있다. 담체내 1차 용매는 사실상 수성이거나 수성이 아닐 수 있다. 조성물을 본 개시의 정제된 클로토 단백질을 약제학적으로 허용가능한 담체와 배합하여 제조할 수 있다.
통상의 기술자는 조성물에 포함될 다양한 성분의 배합을 임의의 적합한 순서로 할 수 있음을, 즉, 완충액을 첫번째로, 중간 또는 마지막으로 추가할 수 있고, 장성 조절제 또한 첫번째로, 중간 또는 마지막으로 추가할 수 있음을 이해할 것이다. 통상의 기술자에 의해 이러한 화학물질의 일부가 특정 배합에서는 양립될 수 없고, 따라서 비슷한 특성을 갖되 관련 있는 혼합물에서 양립할 수 있는 다른 화학물질로 용이하게 치환될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
응집 억제제는 부적절하거나 원치 않는 3원 복합체(ternary structure) 또는 4원 복합체(quaternary complex)에서 결합하는 폴리펩티드의 성향을 감소시킨다. 아미노산 L-아르기닌 및/또는, L-시스테인은 제제에서 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인의 응집을 오랫동안, 예를 들어, 2 년 이상 감소시키는 작용을 할 수 있다. 제제내 응집 억제제의 농도는 바람직하게는 약 1 mM 내지 1M 사이, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 200 mM 사이, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM 사이, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 75 mM 사이, 그 보다 더욱 바람직하게는 약 25 mM이다. 이러한 화합물은 상업적 공급자로부터 입수 가능하다.
본 개시의 조성물은 완충제(buffering agent)를 포함할 수 있다. 완충제는 목적하는 범위에서 pH를 유지한다. 본 개시의 약제학적 조성물에서 사용에 적합한 다양한 완충액은 히스티딘, 인산 칼륨, 알칼리 염, 인산 칼륨 또는 나트륨 또는 이들의 디하이드로젠 또는 하이드로젠 염, 구연산 나트륨 또는 구연산 칼륨 /구연산, 아세트산 나트륨/아세트산, 말레산, 아세트산 암모늄, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스), 디에탄올아민과 아세테이트의 다양한 형태, 및 기술분야에 알려진 임의의 다른 약제학적으로 허용가능한 pH 완충제를 포함하여 용액의 pH를 목적하는 범위내에서 유지한다. 또한, 이러한 완충제의 혼합물을 사용할 수 있다.
조성에서 유용한 완충제의 양은 사용된 특정 완충액과 용액의 pH에 주로 좌우된다. 예를 들어, 아세테이트는 pH 6 보다 pH 5에서 더욱 효율적인 완충액이어서, pH 6에서 보다 pH 5의 용액에서 더 적은 아세테이트가 사용될 수 있다. 바람직한 제제의 바람직한 pH는 4.0 내지 5.0의 범위 내에 있을 것이고, 염산, 구연산, 수산화나트륨, 또는 이의 염을 비롯한 pH 조절제(pH-adjusting agent)가 목적하는 pH를 수득하기 위해 또한 포함될 수 있다.
하나의 바람직한 완충액은 인산 나트륨인데, 그 이유는 이의 완충 용량(buffering capacity)이 pH 6.2에 있거나 이에 가깝기 때문이다. 그러나, 다른 완충액이 선택되어 임의의 바람직한 pH 완충이 달성될 수 있음이 인식될 것이다. 제제내 완충액의 농도는 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1M 사이에, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 200 mM 사이에 있다. 버퍼는 기술분야에 잘 알려져 있고 알려진 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상업적 공급자로부터 입수 가능하다.
약제학적 조성물의 pH가 생리적 수준에서 또는 이에 가까이 설정된 경우, 투여에 관한 환자의 편안함은 최대화된다. 특히, 바람직한 약 6.2 내지 7.4가 있는 pH 약 5.8 내지 8.4의 범위내에 있는 pH가 바람직하나, pH가 필요에 따라 조절되어 특정 제제에서 폴리펩티드의 안정성 및 가용성을 최대화할 수 있고, 이와 같이, 아직 환자가 참을 수 있는 생리학적 범위 밖의 pH가 본 개시의 범위내에 있음이 이해될 것이다.
본 개시의 제제는 하나 이상의 장성 조절제(예, 주사를 위한 환자의 혈액과 등장인 용액을 만들기 위함)를 더 포함할 수 있다. 장성 조절제는 용액의 삼투몰 농도에 기여하는 분자인 것으로 이해된다. 약제학적 조성물의 삼투몰 농도는 바람직하게는 유효 성분의 안정성을 최대화하고 또한 투여에 대한 환자의 불편함을 최소화하기 위하여 조절된다. 혈청이 대략 300+/50 킬로그램 당 밀리오스몰랄(milliosmolals per kilogram)인 경우, 약제학적 조성물이 혈청과 등장성이 되는 것, 즉, 동일하거나 비슷한 삼투몰 농도를 갖는 것이 일반적으로 바람직하며, 이는 장성 조절제의 추가에 의해 달성되고, 따라서 삼투몰 농도가 약 180 내지 약 420 밀리오스몰랄일 수 있음이 고려되나, 오스몰 농도가 특정 조건이 요구하는 만큼 높거나 낮을 수 있음이 이해될 것이다.
일반적으로 장성 조절제는 기술분야에 잘 알려져 있고 다양한 염, 아미노산, 또는 다당류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 아미노산의 제한적이지 않은 예시는 글리신을 포함한다. 적합한 다당류의 제한적이지 않은 예시는 수크로오스, 만니톨, 및 솔비톨을 포함한다. 하나 보다 많은 장성 조절제가 동시에 사용될 수 있음이, 예를 들어, 솔비톨과 글리신이 배합으로 사용되어 제제의 장성을 조절할 수 있음이 이해된다.
삼투몰 농도를 조절에 적합한 장성 조절제의 추가의 예시는 아미노산 (예, 아르기닌, 시스테인, 히스티딘 및 글리신), 염 (예, 염화 나트륨, 염화 칼륨 및 구연산 나트륨) 및/또는 당류 (예, 수크로오스, 글루코스 및 만니톨)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제내 장성 조절제의 농도는 바람직하게는 약 1 mM 내지 1M, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 200 mM 사이에 있다. 장성 조절제는 기술분야에 잘 알려져 있고 알려진 방법에 의해 제조되며 상업적 공급자로부터 입수 가능하다.
또한, 화학적 첨가물, 공용질(co-solute), 또는 공용매(co-solvent)로 또한 지칭되는 용액에 (또한 건조 또는 동결된 형태에)있는 동안, 폴리펩티드를 안정화하는 부형제는 약제학적 조성물에 또한 더해질 수 있다. 치료체가 아닌 것으로서 본 명세서에 정의된 부형제는 약제학적 조성물에 첨가되어 목적하는 효과, 예를 들어, 안정화, 등장성을 제공한다. 목적하는 부형제의 통상적인 속성은 수성 용해도(aqueous solubility), 비독성, 비반응성, 신체로부터 빠른 제거, 및 면역원성의 부재이다. 더욱이, 공정, 보관 및 환자에게 투여 시, 약물의 효능과 안전성을 유지하기 위하여 부형제는 단백질의 자연적인 형태를 안정화할 수 있어야 한다. 예시는 수크로오스, 락토오스, 글리세롤, 자일리톨, 솔비톨, 만니톨, 말토오스, 이노시톨, 트레할로오스, 글루코스를 비롯한 당/폴리올; 혈청 알부민(소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 인간 SA 또는 재조합 HA), 덱스트란, PVA, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose, HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC)를 비롯한 중합체; 다가 알코올 (예, PEG, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤), 디메틸설폭사이드(dimethysulfoxide, DMSO) 및 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF)을 비롯한 비수성 용매; 프롤린, L-세린, 글루타민산 나트륨, 알라닌, 글리신, 리신 하이드로클로라이드, 사르코신 및 감마-아미노부티르산(gamma-aminobutyric acid)을 비롯한 아미노산; Tween-80™ (폴리소르베이트 80), Tween-20™ (폴리소르베이트 20), SDS, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체를 비롯한 계면활성제; 인산 칼륨, 아세트산 나트륨, 황산 암모늄, 황산 마그네슘, 황산 나트륨, 트리메틸아민 N-옥사이드, 베타인, 금속 이온 (예, 아연, 구리, 칼슘, 망간, 및 마그네슘), CHAPS, 모노라우레이트, 2-O-베타-만노글리세레이트 (2-O-beta-mannoglycerate) 또는 임의의 상기의 조합물을 비롯한 기타 부형제;를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
개시의 제제내 하나 이상의 부형제의 농도는 바람직하게는 약 0.001 내지 5 중량 퍼센트, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 2 중량 퍼센트 사이이다. 부형제는 기술분야에 잘 알려져 있고 알려진 방법에 의해 제조되며 상업적 공급자로부터 입수 가능하다.
하나의 예시적 양태에서, 본 개시의 제제는 HEPES, MES, 또는 Tris-HCl를 이용하여 pH 7.3 내지 7.4으로 완충된 약 150 mM NaCl, 및, 선택적으로, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다.
하나의 예시적 양태에서, 본 개시의 제제는 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0에서, 약 25 내지 약 50 mg의 TNFR:Fc (에타너셉트(etanercept)), 약 10 mM 내지 약 100 mM의 L-아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM의 인산 나트륨, 약 0.75% 내지 약 1.25%의 수크로오스, 약 50 mM 내지 약 150 mM의 NaCl를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 제제에서 L-아르기닌은 L-시스테인 (약 1 내지 약 500 마이크로몰라)으로 대체될 수 있다. 또 다른 양태에서, pH는 약 pH 7.0일 수 있다. 다른 특정 양태에서, 본 개시의 제제는 약 pH 6.2에서 약 25 mg/ml의 TNFR:Fc, 약 25 mM의 L-아르기닌, 약 25 mM의 인산 나트륨, 약 98 mM의 염화 나트륨, 및 약 1%의 수크로오스를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시의 제제는 약 pH 6 내지 약 pH 7에서, 약 10 mM 내지 약 100 mM의 L-아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM의 인산 나트륨, 약 0.75% 내지 약 1.25%의 수크로오스, 약 50 mM 내지 약 150 mM의 NaCl에서 약 10 내지 약 100 mg/mL의 RANK:Fc를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시의 제제는 약 pH 6.2에서, 약 25 mM의 L-아르기닌, 약 25 mM의 인산 나트륨, 약 98 mM의 염화 나트륨, 및 약 1%의 수크로오스에서 50 mg/ml의 RANK:Fc를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시의 제제는 약 pH 6 내지 7에서 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인의 유효량, 약 10 mM 내지 약 100 mM의 L-아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM의 인산 나트륨, 약 0 내지 5%의 만니톨 및 0 내지 0.2%의 Tween-20™ (폴리소르베이트 20)을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시의 제제는 약 pH 6.0에서 Emab (항-CD22 특이 항체)과 같은 항체의 유효량, 약 25 mM L-아르기닌, 약 25 mM 인산 나트륨, 약 4%의 만니톨, 약 0.02%의 Tween-20™ (폴르소르베이트 20)을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유류를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 포유류는 조성물에서 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인으로 유익하게 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인은 조성물로 치료될 동종의 포유류로부터 유래된 것이다. 특정 양태에서, 포유류는 치료가 필요한 인간 환자이다. 조성물의 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인이 TNFR:Fc일 경우, 치료될 수 있는 질병 또는 질환의 예시는 류마티스 관절염, 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베게너병(Wegener's disease) (육아종성 림프종(granulomatosis)), 크론병(Crohn's disease) (또는 염증성 장 질병(inflammatory bowel disease)), 만성 폐쇄성 폐질병(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), C형 간염, 자궁내막증(endometriosis), 천식(asthma), 악액질, 건선(psoriasis), 및 아토피 피부염(atopic dermatitis), 또는 하나 이상의 클로토 유전자에서 변이가 있는 유전적 질환이 있는 개인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. TNFR:Fc로 치료될 수 있는 추가의 질병 또는 질환은 이의 관련된 부분이 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함된 WO 00/62790호, WO 01/62272호 및 미국특허 제2001/0021380호에서 기술된 이들을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 보관 전, 즉, 시간 0 에서, 개시에 따라서 조제된 폴리펩티드의 활성을 검사하는 단계, 한달 동안 37° C에서 조성물을 보관하는 단계 및 폴리펩티드의 안정성을 측정하는 단계, 및 시간 0 내지 한달 시점에서 안정성을 비교하는 단계를 포함하는 본 개시의 약제학적 조성물에서 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인에 대한 안정성의 가속화된 안정성 검사에 대한 방법을 제공한다. 이 정보는 초기에 좋은 안정성을 보이나, 장기간 잘 저장되지 않는 뱃치(batch) 또는 랏(lot)의 초기의 제거에 도움이 된다.
더욱이, 약제학적 조성물은 장기 보관을 제공해서 유효성분, 예, 폴리펩티드를 함유하는 Fc 도메인이 액체 또는 동결된 상태에서 보관의 과정동안 안정하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구 “장기” 보관은 약제학적 조성물이 3개월 이상 동안, 6개월 이상 동안, 1년 이상동안, 바람직하게는 2년 이상 보관될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 장기 보관은 약제학적 조성물이 2-8° C에서 액체로서 보관되거나, 예를 들어 -20° C 또는 그 보다 더 차가운 온도 (예, -20 ° C 또는 -80° C)에서 동결됨을 의미하는 것으로 또한 이해된다. 조성물이 1회 이상 동결 및 해동될 수 있음이 또한 고려된다. 장기 보관에 대한 용어 “안정한”은 약제학적 조성물의 활성 폴리펩티드가 보관의 초반에 조성물의 활성에 비하여 이의 활성의 20%, 또는 바람직하게는 15%, 또는 훨씬 더욱 바람직하게는 10%, 및 가장 바람직하게는 5% 넘게 잃지 않는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
하나 이상의 항산화제가 본 개시의 제제에 포함될 수 있다. 제제의 제조에 있어서 사용에 고려되는 항산화제는 글리신 및 리신과 같은 아미노산, EDTA 및 DTPA와 같은 킬레이트제, 및 솔비톨 및 만니톨과 같은 자유라디칼 제거제(free-radical scavenger)를 포함한다.
비경구 서방형 제제(parenteral slow-release formulation), 흡입 미스트(inhalant mist), 경구적 활성 제제(orally-active formulation), 또는 좌약을 비롯한 다른 효과적 투여 형태가 또한 구상된다. 이와 같이, 제제는 벌크 침식 중합체(bulk erosion polymer) (예, 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 공중합체, PLGA 중합체 배합물, PEG의 블록 공중합체, 및 젖산 및 글리콜산, 폴리(시아노아크릴레이트)); 표면 침식 중합체(surface erosion polymer) (예, 폴리(무수물) 및 폴리(오르토 에스테르)); 하이드로겔 에스테르 (예, 플루로닉 폴리올, 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 셀룰로오스, 히알루론산 유도체, 알지네이트, 콜라겐, 젤라틴, 알부민, 및 전분 및 덱스트란) 및 이의 조성물 시스템(composition system);과 같은 고분자 화합물의 미립자 조제물(particulate preparation) 또는 리포좀 또는 마이크로스피어(microsphere)의 조제물을 또한 수반할 수 있다. 이러한 제제는 본 발명의 단백질 및 유도체의 생체내 제거율(rate of in vivo clearance), 생체내 방출율(rate of in vivo release), 안정성, 및 물리적 상태에 영향을 줄 수 있다. 목적하는 단백질에 대한 최적의 약제학적 제제는 통상의 기술자에 의해 투여 경로 및 목적하는 투여량에 따라 결정될 수 있다. 예시적 약제학적 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042, 1435-1712 페이지에 개시되어 있으며, 이의 개시는 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함된다.
생물학적 활성
효능을 평가하는 방법 및/또는 인간 재조합 알파 가용성 클로토의 효과적 투여 (나이 관련 질환 또는 대사성 질환을 보이는 환자, 개체, 또는 개인에게)를 결정하는 방법은 유기체 기반 검정(organismal-based assay) [예, 포유류 (예, 마우스, 랫트, 영장목, 또는 인간이 아닌 다른 포유류), 또는 다른 동물 (예, 제노푸스(Xenopus), 제브라피쉬(zebrafish), 또는 파리 예, 노랑 초라피(Drosophila melanogaster)) 또는 선충 (예, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans))을 비롯한 무척추동물(invertebrate)을 이용한]을 수행하는 단계를 (예비적으로) 포함할 수 있다. 클로토 단백질은 유기체로 1회 또는 요법 (정규적 또는 비정규적인)으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 적합한 횟수 (예, 1회, 2회 등)로 소정의 기간에 (예, 매월, 보름마다, 매주, 반주마다(semi-weekly), 매일 등) 투여될 수 있다. 유기체의 매개변수(예, 노화에 관련된 매개변수)는 이어서 평가될 수 있다. 관심 클로토 단백질은 참조(예, 대조 유기체의 매개변수)에 관한 매개변수의 변화를 유발하거나 야기할 수 있다. 다른 매개변수 (예, 독성, 제거, 및 약동학에 관련됨)는 또한 평가될 수 있다.
본 개시의 클로토 단백질은 나이 관련(age-related 또는 age-associated) 질환 또는 병태, 대사성 질환 또는 병태 등을 비롯한 특정 질환 또는 병태를 갖거나 보이는 동물 (모델)을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 질환 및 병태는 생리학에 대한 단백질의 효과가 관찰될 수 있는 감작 시스템(sensitized system)을 또한 제공할 수 있다. 예시적 질환은, 예를 들어, 신경제거(denervation), 불용성 위축(disuse atrophy), 대사성 질환 (예, db/db 마우스, ob/ob 마우스 등을 비롯한 비만 및/또는 당뇨 동물의 질환), 뇌 질환(cerebral disorder), 간 허혈(liver ischemia) 또는 다른 간 질환(liver disorder), 시스플라틴/택솔/빈크리스틴 모델, 다양한 조직 (이종이식편) 이식, 형질전환 골 모델, 통증 증후군(pain syndrome) (예, 염증성 및 신경병성 질환), 파라콰트(Paraquat), 유전독성(genotoxic), 산화적 스트레스 모델, 및 종양 (I) 모델을 포함한다.
본 개시의 S-클로토 단백질을 평가하기 위해, 단백질을 적합한 동물에 투여할 수 있고(적합한 치료기간 동안) 동물의 매개변수를 평가한다 (예, 10 내지 60분, 1 24시간, 1 내지 30일, 1 내지 12개월, 1 내지 5년, 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위와 같은 적합한 기간 후). 동물에게 임의로 또는 일반적으로 먹이를 줄 수 있다 (예, 일부 매개변수가 이러한 조건 하에서 평가될 수 있음에도, 열량 제한(caloric restriction) 없이). 전형적으로, 이러한 동물의 코호트(cohort)를 검정에 사용한다. 일반적으로, 검사 폴리펩티드(test polypeptide)가 열량 제한에 대해 비슷한 동물 개체의 표현형의 방향에서 매개변수에 영향을 끼치는 경우, 검사 폴리펩티드가 동물에서 수명 조절(lifespan regulation)을 유리하게 변경하는 것으로 나타낼 수 있다. 이러한 검사 폴리펩티드는 유기체에게서 열량 섭취를 박탈해야 하는 것 없이 열량 제한의 수명 조절 효과의 적어도 일부를 야기할 수 있다 (예, 이러한 효과의 부분집합).
검사될 매개변수(들)은 나이 관련 또는 질병 관련 매개변수(들) (예, 동물 모델과 관련된 질환의 증상)일 수 있다. 유리하게 나타난 검사 단백질은 폴리펩티드로 치료되지 않는 비슷한 참조 동물에 관한 증상의 개선(amelioration)을 야기할 수 있다. 질환 또는 노화에 관련된 다른 매개변수는 다음을 포함할 수 있다: 항산화 수준 (예, 항산화 효소 수준 또는 활성), 스트레스 저항성 (예, 파라콰트 저항성), 중심체온, 포도당 수준, 인슐린 수준, 갑상선 자극 호르몬 수준, 젖분비 호르몬 수준, 및 황체형성 호르몬(luteinizing hormone) 수준.
나이 관련 질환을 치료하는 본 개시의 S-클로토 단백질의 효과를 측정하기 위해, 감소된 클로토 발현을 갖는 동물을 사용할 수 있다 (예, 돌연변이 또는 결실된 클로토 유전자가 있는 마우스). 예를 들어, 검사 단백질을 돌연변이 마우스에 투여할 수 있고 나이 관련 매개변수를 모니터링 할 수 있다. 유리하게 나타난 검사 단백질은 단백질로 치료되지 않는 비슷한 참조 동물에 관련한 증상의 개선을 야기할 수 있다.
대사성 질환 또는 노화에 관련된 매개변수를 체중의 측정, 생식능력의 획득에 대한 조사, 혈당수준의 측정, 수명의 관측, 피부의 관측, 걷기와 같은 운동 기능의 관측 등에 의해 평가할 수 있다. 평가를 흉선 무게의 측정, 흉강(thoracic cavity)의 내부 표면상에 형성된 석회 결절(calcified nodule)의 크기 관측 등에 의해 또한 내릴 수 있다. 더욱이, 클로토 유전자 또는 클로토 단백질에 대한 mRNA의 정량 측정(quantitative determination)은 평가에 또한 유용할 수 있다.
여전히 다른 (생체내) 모델 및 유기체 검정은 대사성 매개변수, 예, 인슐린 질병, 2형 당뇨에 관련된 매개변수를 대해 동물을 평가하는 단계를 포함한다. 예시적 대사성 매개변수는 포도당 농도, 인슐린 농도, 및 인슐린 감수성을 포함한다.
검사 단백질이 수명 조절을 변경할 수 있는지 여부의 검정 있어서, 많은 나이 관련 매개변수 또는 바이오마커가 모니터링 되거나 평가될 수 있다. 예시적인 나이 관련 매개변수는 다음을 포함한다: (i) 세포 또는 유기체의 수명; (ii) 생물학적인 나이 의존적 발현 패턴을 갖는 세포 또는 유기체에서 유전자 전사물 또는 유전자 산물의 존재 또는 부재; (iii) 스트레스에 대한 세포 또는 유기체의 저항성; (iv) 세포 또는 유기체의 하나 이상의 대사성 매개변수 (예시적 매개변수는 순환 인슐린 수준, 혈당 수준; 지방 함량; 중심 체온 등등을 포함함); (v) 유기체에 존재하는 세포 또는 세포 집단의 증식 능력; 및 (vi) 세포 또는 유기체의 물리적 외관(physical appearance) 또는 행동.
용어 “평균 수명”은 유기체의 코호트의 평균적인 사망의 나이를 나타낸다. 일부 경우에서, “평균 수명”은 제어된 환경 조건하에서 유전적으로 동일한 유기체의 코호트를 사용하여 평가한다. 사고로 인한 사망은 제외한다. 평균 수명이 제어된 환경 조건하에서 결정될 수 없는 경우 (예, 인간에 대해), 충분히 큰 집단에 대한 신뢰할 수 있는 통계적 정보 (예, 보험 통계 표(actuarial table)로부터)를 평균 수명으로 사용할 수 있다.
두개의 이러한 유기체간 분자적 차이의 특성화, 예, 하나의 참조 유기체 및 S-클로토 단백질로 치료된 하나의 유기체는 유기체의 생리학적 상태의 차이를 드러낼 수 있다. 참조 유기체와 치료된 유기체는 전형적으로 동일한 (또는 실질적으로 동일한) 역연령(chronological age) 및/또는 성별이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 “역연령”은 수정(conception), 소정의 발생학적 또는 태아 단계, 또는, 더욱 바람직하게는, 출생과 같은 미리 선택된 사건 이래, 경과된 시간을 의미한다. 다양한 기준을 사용하여 비교 분석을 위한 유기체가 “동일한” 역연령인지 여부를 결정할 수 있다.
전형적으로, 요구되는 정확도(degree of accuracy)는 야생형 유기체의 평균 수명의 함수이다. 예를 들어, 선충 C. 엘레강스(C. elegans)에 대해, 일부 제어된 환경하에서 평균 약 16일 생존하는 실험용 야생형 균주 N2에 대해, 동일한 나이의 유기체는 동일한 일 수(number of days)동안 생존할 수 있다. 마우스에 대해, 동일한 나이의 유기체는 동일한 주 수(number of weeks) 또는 개월 수(number of months)동안 생존할 수 있고; 영장목 또는 인간에 대해, 동일한 년 수(number of years) (또는 2, 3, 또는 5 년 이내)로 생존할 수 있다; 등등. 일반적으로, 동일한 역연령의 유기체는 그 종의 야생형 유기체의 평균 수명의 15, 10, 5, 3, 2 또는 1% 이내의 시간동안 생존할 수 있다. 바람직하게는, 유기체는 성인 유기체이다 (예, 유기체는 적어도 평균적 야생형 유기체가 생식에 능한 나이로 발달한 시간동안 생존함).
유기체가 노화의 명시적인 물리적 특징을 보이기 전, 유기체 스크리닝 검정(organismal screening assay)을 수행할 수 있다. 예를 들어, 유기체는 동종의 야생형 유기체의 평균 수명의 10, 30, 40, 50, 60, 또는 70%만 생존하는 성인일 수 있다. 물질대사, 면역 적격성(immune competence), 및 염색체 구조에서 나이 관련 변화가 보고되어왔다. 본 명세서에 개시된 치료학적 조성물을 이용한 치료(예, (인간, 또는 포유류) 환자에 대해) 이전, 치료동안, 또는 치료후에, 검사 개체(예, 유기체 기반 검정)에서 임의의 이러한 변화를 평가할 수 있다.
열량 제한과 관련된 마커는 스크리닝 검정의 대상 유기체(또는 치료된 개체)에서 또한 평가할 수 있다. 이러한 마커가 나이와 관련된 것이 아님에도, 클로토 또는 클로토 관련 경로가 조절된 경우, 이들은 변경된 생리학적 상태를 나타낼 수 있다. 마커는 열량적으로 조절된 동물에서 풍부함이 변화하는 mRNA 또는 단백질 일 수 있다. 본 명세서에 기재된 동물의 세포로부터 유래된 세포 모델 또는 본 명세서에 기재된 동물 모델에 대한 유사체를 세포 기반 검정에 사용할 수 있다.
근위축주에 대해 검사 단백질의 효과를 평가하는 모델은 다음을 포함한다: 1) 신경제거, 예를 들어, 넓적다리 중앙(mid-thigh)에서 오른쪽 좌골 신경(sciatic nerve)을 절단함으로써 기인한 랫트 내측 비장근(medial gastrocnemius muscle) 질량 손실; 2) 부동화(immobilization) (예, 90도 굴곡(flexion)에서 고정된 오른쪽 발목 관절(ankle joint)에 의함)로부터 기인한 랫트 내측 비장근 질량 손실; 3) 하지 현수(hind limb suspension)로부터 기인한 랫트 내측 비장근 질량 손실; 4) 악액질 사이토카인(cachectic cytokine)인 인터루킨 -1 (interleukin-1, IL-1) 처리로부터 기인한 골격근 위축증(skeletal muscle atrophy); 및 5) 당질코르티코이드인 덱사메타손 처리로부터 기인한 골격근 위축증.
외인성 S-클로토의 투여
본 개시는 S-클로토 제제, 임상적 투여량, 및 투여 (예, S-클로토의 혈청 농도를 정상 및/또는 젊은(예, 18 - 30세) 사람(예, 임의의 만성적 병태가 없는)의 범위내로 증가시키고/거나 유지하기 위함)에 관한 것이다.
본 개시의 측면 또는 양태는, 예를 들어, (cGMP- 및/또는 임상적 등급) 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질 또는 단백질 단편 (이소폼 1의)을 이를 필요로 하는 (인간) 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 양태는 ((인간) 개체에서) 혈청 S-클로토 수준 또는 농도를 측정하는 것을 (예, 질량 분광법(Mass Spectroscopy, MS) 또는 ELISA에 의한)를 포함할 수 있다. 이러한 측정은 S-클로토 투여 전, 투여 후, 및/또는 투여 중에 나타날 수 있고, 필요에 따라 반복하여 혈청 S-클로토 수준 및/또는 혈청 S-클로토 수준의 감소, 분해, 물질대사율을 결정할 수 있다. MS는 기술분야에 잘 알려진 기법이다. MS를 사용하여 개체의 혈청에서 하나 이상의 (자연적 및/또는 재조합) 클로토 단백질의 수준을 식별하고 심지어 정량할 수 있다.
하나 이상의 추가의 단백질은 개체의 혈청에서 또한 측정할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 클로토 관련 및/또는 노화에 관련된 단백질 (예, FGF21, GDF-11, TIMP2, NAD+, CCL11, 테스토스테론 호르몬, 에스트로겐 호르몬 등) 및/또는 신장 기능 단백질 (예, KIM-1, 시스타틴-C, 크레아티닌, BUN, NGAL 등)을 혈청에서 클로토를 측정하는 것으로부터 별도로 측정할 수 있거나 클로토를 측정하는 것과 함께 측정할 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, 혈액 시료와 같은 혈청 시료를 수득한다. 기술분야에 알려진 바와 같은 체혈(blood draw)에 의해 시료를 수득할 수 있다. 바람직한 양태에서, 혈액 시료를 수득하는 손가락 단자(finger prick) 또는 다른 덜 침습적인 수단을 사용할 수 있다. 따라서, 혈액 시료를 좀 더 빈번하게 취할 수 있다 (예, 하루 종일 및/또는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 마다). MS를 사용하여 전체 클로토 단백질 혈청 농도 뿐만 아니라, 자연적 클로토 종 (예, 가용성 클로토, 절단된 클로토, 분비된 클로토 등) 및/또는 본 개시의 하나 이상의 클로토 단백질을 비롯한 다양한 알파 클로토 단백질 종의 혈청 농도를 측정할 수 있다. 일부 양태에서, 치료학적 재조합 클로토 단백질 투여 전, 클로토 수준을 측정할 수 있고, 투여 후 하루 종일 및/또는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 시간 마다 다시 클로토 수준을 측정할 수 있다.
양태는 이러한 개체내에서 정상인 젊은 사람의 S-클로토의 혈청 농도의 범위내로 S-클로토 농도를 유지하기 위한 이러한 속도를 결정하는 것 및/또는 치료 프로토콜을 계산하는 것 (예, 빈도, 양, 및/또는 S-클로토의 (차후의) 투여(들)의 지속을 포함함)을 또한 포함할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, S-클로토의 농도를 1 밀리리터의 혈청 당 대략 1000 피코그램의 (S-클로토) 단백질 (pg/mL)에서 유지할 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, S-클로토 투여 전략 (인간에서)은 S-클로토의 하나 이상의 약동학적 매개변수의 측정을 포함할 수 있다. 예를 들어, S-클로토 투여에 응하여, 측정을 혈청, 소변, 및 뇌척수액에서 S-클로토 수준의 그에 따른 생체내 변화로 만들어 질 수 있다. 일부 양태는 하나 이상의 임상적 지표에 대한 S-클로토 투여의 유효성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 병태, 질병, 및 질환에 대한 임상적 지표는 본 기술분야에 알려져 있고, 본 명세서에 더 기술되어 있다.
(인간) 개체(들)에서 임의의 일주기 리듬 효과를 설명하기 위해, 양태는 (기초선) S-클로토 수준 치수(들)를 측정하는 것을 또한 포함할 수 있다 [예, 시간 0 (임의의 외인성 S-클로토의 투여 전) 및/또는 전날의 상이한 시간에서 및/또는 치료 프로토콜 내내(예, S-클로토의 투여 전 및 투여 후)].
양태는 S-클로토 투여의 적합한 빈도, 양, 및/또는 지속을 결정하는 것을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 낮은 S-클로토 혈청 수준이 있는 개체(예, MS 또는 ELISA 면역학적 검정 정량에 의해 결정됨)는 개체 혈청 S-클로토 수준을 제1 소정의 수준으로 (예, 약 1000 pg/mL) 이르도록, 개체에서 혈청 S-클로토 농도(의 그에 따른 변화)를 (예, MS 또는 ELISA에 의해) 측정하도록, 혈청 S-클로토 수준의 감소, 분해, 또는 물질대사율 및/또는 수준을 결정하도록(제1 투여 후), 투여된 S-클로토의 반감기를 계산하도록, 및/또는 S-클로토의 제2의, 차후의 투여가 주어져야 할 (예, 혈청 S-클로토 수준을 제2 소정의 수준 보다 높게 유지하기 위하여) 빈도 및/또는 기간을 결정하도록 구성된 및/또는 조정된 클로토의 제1 투여를 (예, 정맥내, 진피내(intradermal), 복강내, 근육내, 피내(intracutaneous), 및/또는 피하주사 또는 다른 투여를 통해) 받을 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 제2 소정의 수준은 1 투여의 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 및/또는 5%일 수 있고/거나 이들 사이일 수 있다.
추가적 투여를 정상적인 동성의(sex-matched) 젊은 사람의 혈청 유지 수준의 개체 (장기적) S-클로토 혈청 수준 (예, 대략 1000 pg/ml)과 동일한 개체 (장기적) S-클로토 혈청 수준에서 생성에 적합한 기간에 걸쳐 줄 수 있다. S-클로토 투여 ((인간) 개체로)의 전체 소요시간은 1일 내지 5년, 또는 이 이상일 수 있다. 기간에 걸쳐 임상적 노쇠 점수(clinical frailty score) 및 다른 측정의 사용에 기초한 개체에서 또한 노쇠를 측정할 수 있고/거나 결정을 내릴 수 있다.
본 개시의 양태는 S-클로토 투여량을 증가시키는 것을 더 포함하여, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상의 정상 범위(1000 pg/ml) 보다 높은 S-클로토 수준의 증가를 유지할 수 있다.
특정 양태는 단일 일시적 주사 또는 연장된 (IV) 주사(예, 연장된 기간동안 점적(drip))에서 S-클로토 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 적어도 하나의 양태에서, 개체 당 1, 2, 2.5, 2.75, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 이상의 마이크로그램의 S-클로토를 치료당 투여할 수 있다. 바람직한 투여량을 기술분야에 알려진 하나 이상의 방법을 통해 계산할 수 있다. 하나의 이러한 방법은 상대성장 스케일링 방법(allometric scaling method)이다. 예를 들어, 랫트 실험에서, 투여당 0.01 mg의 S-클로토 /kg 체중을 사용하거나, 10 ug/kg을 사용하였다. 인간 상대성장 스케일링 된 당량(allometric scaled equivalent) 0.16을 이용하여, 실례적으로, 인간 등가 용량 (human equivalent dose, HED) = 10 ug/kg x 0.16 = 1.6 ug/kg. 따라서, 실례적으로, 70 kg의 인간 개인이 70 kg x 1.6 ug/kg = 112 ug을 필요로 할 것이고, 60 kg의 인간은 60 kg x 1.6 = 96 ug를 필요로 할 것이다.
참고문헌에 의해 본 명세서에 포함된 Reagan-Shaw (2008)에 의해 기술된 과정인 HED를 체표면적(body surface area)에 대한 정규화(normalization)를 이용하여 확인하였다. 상대성장 스케일링으로 명명된 이 과정은 상이한 종간의 상이한 물질대사율의 본질적 차이(basal difference)를 교정하고, 단순 용량 외삽 (simple dose extrapolation)보다 바람직할 수 있다. 실례적으로, HED가 0.4 mg/kg인 경우, 상대성장 스케일링을 사용하여, 인간 등가 용량은 개인의 체중이 70 kg일 경우, 0.4 mg/kg 또는 28 mg이 될 것이고, 또는 개인의 체중이 60 kg일 경우, 24 mg이 될 것이다.
다수의 요인들은 인간 내 S-클로토의 양 및/또는 생체 이용률(bioavailability) (재조합 단백질 투여 전 및/또는 후), 투여될 S-클로토의 전체 양 및/또는 농도, 및/또는 재조합 단백질 투여 후 혈청 수준 반응 (시간에 따른)을 결정, 측정, 및/또는 평가하는데 있어서 고려될 수 있거나 고려되는 중일 수 있다. 이러한 요인들은, 예를 들어, 희석제의 조성물, 투여 경로, 투여 부위, 개체의 조직 및 기관내로 분포, 개체의 물질대사율 또는 다른 비율, 약동학 (pharmacokinetics, PK), 약력학 (pharmacodynamics, PD), 독성학 (toxicology, Tox) 등등을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 양태에서, S-클로토의 (정상) 농도 (예, 건강한, 젊은 (18-30 세) 인간 성인에서)는 혈청내에서 대략 1000 pg/ml일 수 있다. 전형적인 성인은 대략 5 리터의 혈액 부피를 가질 수 있는데, 여성은 일반적으로 남성보다 적은 혈액 부피를 가진다. 대략 55%의 인간 혈액이 혈청으로 구성될 수 있다. 따라서, (5리터의 혈액 / 성인) x (0.55 혈청 / 1리터의 혈액) = 2.75 리터 (2750 ml)의 혈청/성인. 내인성 혈청 S-클로토가 없다고 가정하면, 총 혈액 혈청에서 최종 농도 1000 pg/ml를 달성하기 위해; 2750 ml X 1000 pg/ml = 2,750,000 pg (또는 2750 ng, 또는 2.75 μg)의 성인 개체 당 투여된 외인성 S-클로토.
가용성 클로토를 전형적인 건강한 수준보다 50% 높게 (예, 1500 pg/혈청 1ml 으로) 증가시키기 위해, 4.125 마이크로그램/개체의 투여량을 투여할 수 있다. 가용성 클로토를 정형적인 건강한 수준보다 100% 높게 (예, 2000 pg/혈청 1ml으로) 증가시키기 위해, 5.5 마이크로그램/개체의 투여량을 투여할 수 있다 등등.
정제된 재조합 S-클로토 단백질의 약제학적 유효량 및/또는 충분한 양을 투여해서 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 임의의 적합한 수준으로 상승시킬 수 있으며, 그 수준은 혈청 1 밀리리터 당 약 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000 20,000, 25,000, 30,000 40,000, 50,000, 75,000, 100,000 피코그램 이상의 가용성 클로토 단백질 보다 크거나, 이와 같거나, 또는 이들 사이일 수 있거나, 전형적인 건강한 수준의 혈청내 가용성 클로토 단백질 보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1200%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000%, 4000%, 5000% 이상 큰 것 보다 크거나, 이와 같거나, 또는 이들 사이일 수 있다.
일부 양태에서, 개체는 적합한 부피의 클로토 완충액 (예, 150 mM NaCl 및 10 mM HEPES pH 7.4) 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체내 약 0.01 mg/체중 1kg 보다 큰, 이와 같은, 또는 이 사이의 투여량에서 재조합 인간 S-클로토 단백질의 하나 이상의 (일시적) 정맥내, 진피내(intradermal), 복강내, 근육내, 피내(intracutaneous), 피하주사, 및/또는 다른 주사가 투여될 수 있다. 따라서, 160 파운드의 개체 (즉, 72.57 kg의 체중)는 투여당 약 0.73 mg의 S-클로토의 (일시적) 주사를 투여 받을 수 있다 (0.01 mg의 S-클로토/kg X 72.57 kg의 체중의 계산에 기초하여). 마찬가지로, 170 파운드의 사람은 투여당 0.77 mg의 S-클로토를 수용할 수 있다. 투여의 전체 횟수 및 빈도를, 예를 들어, 1000 pg/ml의 S-클로토 (0.000001 mg/혈청 1ml와 등가인)의 농도를 혈청에서 달성 및 결정에 기초하여 결정할 수 있다. 후자는 MS에 의해 또는 인간 S-클로토 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같이 확인될 수 있다.
다른 양태에서, 투여량은 약 0.0001 - 10 mg/체중 1kg, 0.0001 - 10 μg/체중 1kg, 0.0001 - 10 ng/체중 1kg, 0.0001 - 10 pg/체중 1kg, 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 범위 보다 크거나, 이와 같거나, 또는 이들 사이일 수 있다. 소변 및/또는 혈액은 하나 이상의 시점에서 수집될 수 있으며, 이 시점은 의학적 처치(medical procedure) 또는 제1 투여 (투여량)의 재조합 클로토 단백질 (예, 투여에 응하여 및/또는 시간에 따라서 혈청 S-클로토 수준 및 변화를 측정, 검사, 및/또는 결정하기 위해) 후, 약 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 40 분, 45 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 2.5 일, 3 일, 5 일, 7 일, 10 일, 14 일, 21 일, 4 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월 이상 보다 크거나, 작거나, 같거나, 및/또는 사이일 수 있다.
하나 이상의 양태는 S-클로토 활성 약물 제품의 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 병용물에서 고유한 제제의 생성 및/또는 (차후의) 투여를 포함한다. 담체는 IV 및/또는 일시적 주사에 적합할 수 있다. 양태는 약제학적으로 허용가능한 담체와 병용물에서 및/또는 S-클로토의 고유한 비활성 전구약물 제제의 생성 및/또는 (차후의) 투여를 또한 포함할 수 있다 (비활성 S-클로토가 생체내에서 활성화되어 동물 또는 인간 개체에서 생물학적으로 효과적인 S-클로토를 방출하도록). 이러한 전구약물 제제는 코팅 또는 시간 방출 제제를 포함할 수 있다.
인간에서 나이 관련 노쇠를 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 개시의 예시적 양태는 나이 관련 노쇠를 치료하기 위한 (예, 인간 또는 인간이 아닌 동물에서) 외인성 클로토 단백질의 투여에 관한 것이다. S-클로토는 근육 줄기세포(myogenic stem cell)를 구할 수 있고, 근육 회복을 개선시킬 수 있으며, 및/또는 인간 질병의 동물 모델에서 섬유증(fibrosis)을 억제할 수 있다. S-클로토는, 그러므로, 노쇠의 징후를 보이는 노화 인간 개체에서 근육 변성에 대응하는 유망한 치료제일 수 있다.
예를 들어, 본 개시는 정상 및/또는 젊은 (예, 18 - 30 세) 사람 (예, 임의의 만성적 병태가 없는)의 범위 내에 있는 S-클로토의 유지 혈청 농도(maintenance sera concentration)를 허약한 및/또는 나이든 (예, 60 - 95 세) 사람에서 유지하기 위한 S-클로토 제제, 임상적 투여량, 및 전자의 개체로 투여에 관한 것이다.
연장된 기간 동안의 클로토 치료는 노인, 노쇠한 자, 또는 다른 생리학적으로 노화하는 자에서 하나 이상의 노화 관련 지표 또는 병태를 회복시키고/거나 개선할 수 있다.
인간에서 근위축증을 치료(감소)시키기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 개시의 예시적 양태는 근위축증에 대응하는데 있어서 클로토 투여의 효과에 대한 안내를 제공하기 위한 분자적 지표와 상기 단백질의 동시 사용(concurrent use) 및 골격근 조직 질량에 의해 측정된 인간에서 근위축증을 치료(예, (이의 속도)를 감소시키기)하기 위한 외인성 클로토 단백질의 투여에 관한 것이다.
근위축증은 많은 신경 근육성, 물질대사성, 면역학적 및 신경학적 질환 및 질병뿐만 아니라, 기아, 영양 결핍, 물질대사 스트레스, 당뇨, 노화, 근위축증, 또는 근육병(myopathy)을 포함할 수 있다. 근위축증은 노화 과정 동안 일어날 수 있다. 근위축증은 근육의 감소된 사용 또는 미사용으로부터 또한 야기될 수 있다. 증상은 골격근 조직 질량의 감소를 포함한다. 인간 남성에서, 근질량은 50세와 80세 사이에 1/3이 감소한다. 근위축증의 일부 분자적 특징은 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligases)의 상향조절, 및 근원섬유 단백질(myofibrillar protein)의 감소를 포함할 수 있다. 이러한 단백질의 분해는, 예를 들어, 미오신의 특정 근육에서 (예, 액틴의 특정 구성요소인 3-메틸-히스티딘 생성물을 측정함으로써) 모니터링할 수 있다. 크레아틴 인산화효소(creatine kinase) (세포 손상 마커)의 방출을 또한 나타낼 수 있다.
노령에서 및/또는 인간 수명 전체에 걸쳐 정신 저하(mental decline) 및/또는 인지저하(cognitive decline)를 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 개시의 예시적인 양태는 (노화에 관련된) 인지 기능(들)의 감소를 개선하고/거나 이에 대응하기 위한 외인성 클로토 단백질의 투여에 관련된 것이다. 본 개시가 개시될 때, 외인성 클로토 단백질의 투여가 인간에서 인지 저하에 대응할 수 있을지에 대한 여부가 알려져 있지 않았었다. 그러나, 클로토의 전신성 과발현(systemic over-expression)이 있는 형질전환 마우스는 학습 및 기억의 복수의 검사에서 대조군보다 더 잘 수행했다. 마우스에서 클로토를 증가시키는 것은 시냅스 가소성(synaptic plasticity)의 형태인 장기 강화(long-term potentiation)를 또한 향상시켰고, 학습과 기억의 주요 기능이 있는 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR) 서브유닛(subunit)인 시냅스 GluN2B를 농후하게 하였다. GluN2B의 차단은 클로토 매개 효과를 무효로 하였다.
클로토 조절 경로는 알츠하이머 질병 및 다른 형태의 치매의 진전을 지연시키는데 관련될 수 있다. 400명이 넘는 53세 이상의 건강한 남성 및 여성의 뇌 스캔은 특정 클로토 유전자 변이체의 단일 카피(copy)를 지니는 이들이 계획하기 및 결정 내리기를 다루는 더 큰 뇌 영역을 가진 것을 발견하였다. 이 그룹에 대한 추가의 검사는 확대된 우측 배외측 전두 피질(dorsolateral prefrontal cortex, rDLPFC)이 있는 이들이 일련의 정신적 과제(mental task)를 더 잘했다는 것을 발견하였다.
약 다섯 사람 중 한 명이 심장 및 신장 기능을 향상시키고, 평균적으로 인간 수명에 약 3년을 더하는 KL-VS로 알려진 대립유전자, 또는 유전자 변이체의 단일 카피를 유전 받는다. 그러나, 뇌 기능에 관해서는, 더 큰 rDLPFC을 갖는 것은 사람의 정신 검사 점수(mental test score)에서 12%의 향상만 차지하였고, 한편으로는, 사설이 지적하는 것처럼, KL-VS 대립유전자의 하나의 카피를 지니는 것이 rDLPFC의 구조 및 기능의 예상된 감소에 대하여 10년의 회복력(resilience)을 수여하는 것으로 보였다. 따라서, KL-VS 이형 접합성(heterozygosity)은 우측 배외측 전두 피질(dorsolateral prefrontal cortex, rDLPFC)에서 더 큰 용적과 관련되는 것으로 보인다.
rDLPFC이 집행 기능(executive function)에 중요하기 때문에, 연구자는 개인에서 작업 기억(working memory) 및 처리 속도를 또한 분석하였다. KL-VS 이형 접합성은 조사된 수명에 걸쳐 강화된 집행 기능과 관련될 수 있다. 요약하면, 결과는 클로토 유전자의 변이가 더 큰 뇌 용적 및 더 나은 기능과 관련됨을 시사할 수 있다.
본 개시의 예시적 양태는 생체내 클로토 수준 및/또는 (세포적, 분자적, 및/또는 하류) 효과를 증가시키기 위한 (예, 인간 수명 전체에 걸쳐 인지를 강화하고 인지 결함(cognitive deficit)에 대응하기 위한) 외인성 클로토 단백질의 투여와 관련된 것이다. 임상 등급의 S-클로토의 외인성 투여는 인지 기능을 (예, 인간에서) 보존하고/거나 향상시킨다.
인간 장수 및/또는 수명을 치료(연장)하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 개시의 예시적 양태는 평균적인 수명을 향상시키기 위한 연대순인 (예, 출생으로부터 나이가 동일한) 및 동성의 인간 개체로 외인성 클로토 단백질의 투여에 관련된 것이다. 클로토 투여로 획득된 평균적인 수명에 대한 결과 (인간 개체의 실험군)는 클로토 외인성 투여를 수여받지 않은 개인들 (대조군)에 대해 및/또는 충분히 큰 인간 집단에 대한 통계적 정보(예, 보험 통계 표로부터)와 확실히 비교할 수 있다.
다른 적응증(clinical indication)을 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 개시의 예시적 양태는 인간 노쇠(의 증가), 장수(의 저하), 세포 노화(의 저하), 근력(의 저하), 골손실 또는 골밀도(의 저하), 인지(의 저하), 근질량(의 저하), 체력(의 저하), 악력(의 저하), 각근력(의 저하) 등등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 나이 관련 또는 다른 나이에 관련되지 않은 병태를 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여에 관한 것이다. 본 개시는 또한 골염도(bone mineral density, BMD) (예, 여성에서 그러나 남성에서는 아님) 를 증가시키기 위한, 폐경기(menopause) 후 감소되는 BMD (예, 노인 여성에서)를 증가시키기 위한, (신경퇴행성) 골격근의 변성을 재생시키거나 감소시키기 위한, 보행 걸음걸이(walking gait)를 개선하기 위한, 공간 학습(spatial learning) 및 기억, 운동, 운동 자유도, 삶의 질, 박출 계수, 운동 변화(exercise change), 운동 개선(exercise improvement) 등등을 향상시키기 위한(또는 이들의 저하를 감소시키기 위한) S-클로토의 투여에 관한 것이다. 본 개시는 인지 저하(cognitive deterioration) 또는 건망증을 감소시키기 위한, 인지 능력을 증가시키기 위한, 인지 기능 및 시냅스 가소성을 향상시키기 위한, 학습, 학습 능력 또는 IQ의 저하를 감소시키기 위한, 학습, 학습 능력 또는 IQ를 증가시키기 위한 등등의 S-클로토의 투여에 더 관련한 것이다.
유전적 결함을 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 개시의 예시적 양태는 알려진 인간 유전적 결함을 치료하기 위한(예, 교정하기 위한) 외인성 S-클로토의 투여에 관한 것이다. 예를 들어, 가족성 종양 석회화증 (familial tumoral calcinosis) 및 클로토 돌연변이가 있는 13세의 여아가 보고되었다. 가족성 종양 석회화증은 FGF23 또는 GALNT3에서 돌연변이의 불활성화에 의한 이소성 석회화(ectopic calcification) 및 고인산혈증(hyperphosphatemia)에 의해 특성화되는 상염색체 열성(autosomal recessive)의 대사성 질병이다. FGF23는 인산의 신장 배출에 필요한 호르몬인 반면, GALNT는 FGF23의 성숙 및 분비에 기여하는 효소이다. 클로토 유전자내의 동형접합 돌연변이가 13세 여아에서 식별되었다. 클로토는 FGF23에 의해 이의 수용체로 내뿜어진 신호의 전달에 필요한 분비된 단백질을 암호화한다. 외인성 인간 재조합 S-클로토의 투여는 가족성 종양 석회화증에 관련된 기능부전 및 증상을 다루기 위한 고도로 표적된(highly targeted) 및 효과적인 치료법을 구성한다.
급성 신손상(acute kidney injury, AKI)을 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
이전에 급성 신부전 (acute renal failure, ARF)으로 불린 급성 신손상 (AKI)은 범위가 기능의 경미한 손실 (minor loss) 내지 부전에 이르는 신장 기능장애(renal dysfunction)의 갑작스러운 발생으로 보통 정의된다. AKI는 매년 대략 4%-7%의 입원한 환자에서 발달하는 통상적인 임상적 합병증(clinical complication)이고 예후는 좋지 않을 수 있다. AKI와 관련된 사망률은 20%-35%의 범위에 이른다. 신장 클로토 발현은 AKI후 억제되는 것으로 나타났다. 클로토의 아데노바이러스 유전자 전달 (adenoviral gene transfer)은 AKI에서 세포보호적(cytoprotective)일 수 있다.
급성 신손상(AKI)은 매년 대략 4.9% - 7%의 입원한 환자에서 보고되어왔다. AKI의 비율은 (입원한) 노인에서 60% 및 노인 또는 위독한 환자에서 20-30% 만큼 높을 수 있다. AKI는 증가된 사망, 재원일 수 (length of stay, LOS), 및 병원 비용과 또한 관련된다.
AKI는 신장 이식 또는 다른 수술, 급성 세뇨관 괴사 (acute tubular necrosis, ATN), 급성 간질 신장염(acute allergic interstitial nephritis, AAIN), 신장염 (예, 사구체신염(glomerulonephritis)), 신독성(nephrotoxicity) (예, 약물 유발성 신독성), 저혈압, 또는 다른 기여 요인(들)로부터 적어도 부분적으로 야기될 수 있다. 신장 이식 및 다른 수술들은 신장에 대한 급성 손상 또는 상해를 야기할 수 있고, 신장병 및/또는 신부전을 야기할 수 있다. 신독성은 AKI, ATN, AAIN, 신장염 등에 기여할 수 있다. 약물 (예, 임상적으로 투여된 약물, 처방 약물, 불법적인 약물, 또는 다른 약물)이 AKI의 모든 경우 중 15% 내지 25%에 관련되는 것이 보고되어왔다. 조영제(contrast media)는 단독으로 병원 획득 급성 신손상(hospital-acquired acute renal failure) (예, 조영제 유발성 급성 신손상(contrast-induced acute kidney injury, CIAKI)를 통해)의 모든 경우의 10%를 차지하며, 감소된 신장 관류(renal perfusion) 및 수술 후 신부전(postoperative renal insufficiency) 다음으로 병원내 신기능 저하(in-hospital renal function deterioration)의 세번째 주요 원인을 대표한다.
일부 경우에서, 약물 유발성 AKI는 항균제 유발 신독성(anti-microbial-induced nephrotoxicity) (항균제 치료로부터 야기되는)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 (그람-음성) 박테리아 감염은 파로모마이신(paromomycin), 토브라마이신(tobramycin), 겐타마이신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 카나마이신, 네오마이신 등등을 비롯한 하나 이상의 아미노글리코시드(aminoglycoside)로 치료될 수 있다. 아미노글리코시드는 신독성이 되는 것으로 나타났다. 도 4에 도시되는 바와 같이, 예를 들어, 통상적인 아미노글리코시드인 아미카신으로 치료된 거의 23%의 환자는 급성 신장병을 발달시켰고 아미카신으로 처리된 17% 이상의 환자는 퇴원하기 전 사망하였다. 겐타마이신, 및 토브라마이신을 포함하는 다른 아미노클리코시드도 신장병을 유발하였다 (또는 이와 관련되었거나 이에 기여되었다). 도 3a 및 3b에 도시되는 바와 같이, 2010년 다양한 연령군의 120만명이 넘는 성인 환자는 아미노글리코시드로 치료되었다. 다른 항균제는, 예를 들어, 페니실린, 암피실린, 세팔로스포린(cephalosporin), 술폰아미드, 시프로플록사신(ciprofloxacin), 반코마이신(vancomycin), 매크로라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline), 리팜핀(rifampin) 등등을 포함한다.
약물 유발성 신독성은 하나 이상의 비스테로이드 항염증 약물(non-steroid anti-inflammatory drug, NSAID)을 이용한 치료로부터 또한 야기될 수 있으며, 이 약물은 아스피린 (아세틸살리실산), 세레콕시브(celecoxib), 디클로페낙(diclofenac), 디플루니살(diflunisal), 에토돌락(etodolac), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토롤락(ketorolac), 나부메톤(nabumetone), 나프록센(naproxen), 옥사프로진(oxaprozin), 피록시캄(piroxicam), 살살레이트(salsalate), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin) 등등을 비롯한다.
약물 유발성 신독성은 하나 이상의 고리형산소화효소-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 저해제 (예, 발데콕시브(valdecoxib), 로페콕시브(rofecoxib), 세레콕시브(celecoxib) 등), 양성자 펌프(proton pump) 저해제 (예, 오메프라졸(omeprazole), 란소프라졸(lansoprazole) 등), 항경련제(anticonvulsants) (예, 페니토인(phenytoin), 발프로산(valproic acid) 등), 히스타민 H2 수용체 길항제 (예, 니자티딘(nizatidine), 라니티딘(ranitidine), 파모티딘(famotidine), 시메티딘(cimetidine) 등), 이뇨제(diuretics) [예, 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) 억제제, 루프 이뇨제(loop diuretics) (예, 부메타니드(bumetanide), 에타크린산(ethacrynic acid), 토르세미드(torsemide), 푸로세미드(furosemide) 등), 칼륨 보전 이뇨제(potassium-sparing diuretics) (예, 트리암테렌(triamterene), 스피로노락톤(spironolactone), 아밀로라이드(amiloride) 등), 티아지드 이뇨제(thiazide diuretics) (예, 인다파미드(indapamide), 클로르탈리돈(chlorthalidone), 메톨라존(metolazone), 메틸클로티아지드(methyclothiazide), 히드로클로티아지드(hydrochlorothiazide), 클로로티아지드(chlorothiazide), 벤드로플로메티아지드(bendroflumethiazide), 폴리티아지드(polythiazide), 히드로프루메티아지드(hydroflumethiazide)등)], 또는 파마브롬(pamabrom), 만니톨(mannitol) 등등과 같은 다른 이뇨제를 이용한 치료로부터 또한 야기될 수 있다.
약물 유발성 신독성은 신체에서 신경세포 및 근육 세포를 통한 나트륨의 유동에 영향을 줄 수 있고, 사용되어 과잉행동(hyperactivity), 성급한 말투(rushed speech), 부족한 판단력(poor judgment), 감소된 수면욕구, 공격성, 및 분노에 의해 흔히 특성화되는 양극성 장애(bipolar disorder)의 조증 삽화(manic episode)를 치료할 수 있는 리튬을 이용한 치료로부터 또한 야기될 수 있다. 리튬은 조증 삽화의 강도를 예방하거나 경감시키는 것을 도울 수 있다. 약물 유발성 신독성은 금, 수은, 구리, 또는 다른 원소 물질을 이용한 치료 또는 이에 대한 노출로부터 또한 야기될 수 있다.
약물 유발성 신독성은 피부경화증(scleroderma), 윌슨병(Wilson's disease) [소변을 통한 제거를 위한 축적된 구리에 결합함으로써], 시스틴뇨증(cystinuria) [시스테인보다 더 가용성인 혼합된 디설파이드를 수득하기 위해 시스테인에 결합함으로써]을 치료하는데 사용될 수 있는 킬레이터 종류(chelator class)의 약제인 (D-) 페니실라민(penicillamine), 직접 작용 평활근 이완제 (direct-acting smooth muscle relaxant) (예, 히드랄라진(hydralazine)), 연축 억제제(spasmolytics) [예, 단트롤렌(dantrolene), 히단토인 유도체(hydantoin derivative), 바클로펜(baclofen), 티자니딘(tizanidine), 다른 이미다졸 화합물 및 클로니딘(clonidine), 디아제팜(diazepam)과 같은 벤조디아제핀(benzodiazepine), 메토카바몰(methocarbamol), 메탁살론(metaxalone), 사이클로벤자프린(cyclobenzaprine), 카리소프로돌(carisoprodol)] 등등을 이용한 치료로부터 또한 유발될 수 있다.
다른 형태의 약물 유발성 신독성은 다음을 포함할 수 있다: 예를 들어, 조영제 유발성 신독성 [예, (요오드화) 조영제에 노출 후, 방사성 조영 유발성 신독성(radiocontrast-induced nephropathy, CIN)로 또한 알려진]; 마약 (오피오이드) 유발성 신독성 [예, 코카인, 헤로인 등과 같은 특정 마약(예, 오피오이드)의 사용 또는 남용 후]; 화학요법 유발성 신독성 [예, 시스플라틴(cisplatin); 카보플라틴(carboplatin); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 벤다무스틴(bendamustine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 테모졸로미드(temozolomide), melphalan(멜팔란) 등과 같은 알킬화제(alkylating agent); 미토마이신 C(mitomycin C), 벨로마이신(bleomycin), 안트라사이클린(anthracycline) 및 관련 약제 등과 같은 항종양성 항생제(antitumor antibiotic); 카페시타빈(capecitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트, 페메트렉시드(pemetrexed), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 젬시타빈(gemcitabine), 시타라빈(cytarabine) 등과 같은 대사 길항물질(antimetabolite); 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid); 토포테칸(topotecan); 에토포시드(etoposide); 텍산(taxane); 이리노테칸(irinotecan); 레날리도마이드(lenalidomide); 에리불린(eribulin); 삼산화비소(arsenic trioxide); 익사조밉(ixazomib); 등과 같은 암 치료제로 치료 후] 등등. 실로, 매우 다양한 신독성 약물이 AKI로 이어지는 신독성을 유발할 수 있다. 약물 유발성 신독성 (및 다른 형태의 AKI)은 치료되지 않는 경우, 생명을 위협할 수 있으며, 치료를 위한 막대한 비용을 (환자, 병원, 및 보험업자에게) 초래할 수 있다.
본 개시의 양태는 급성 신손상 (AKI) 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 (예방적으로)방법을 포함할 수 있다. 방법은 재조합 (가용성) 클로토 단백질을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다 (예, 소정의 기간 동안 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 역치 이상으로 상승시키고/거나 유지하기 위해서). 병태는 다음을 포함할 수 있다: (i) 급성 세뇨관 괴사 (ATN), 급성 간질 신장염 (AAIN), 신장염, 사구체신염, 및/또는 신독성; 또는 (ii) 신장 이식 또는 다른 수술, 급성 세뇨관 괴사 (ATN), 급성 간질 신장염(AAIN), 신장염, 사구체신염(glomerulonephritis), 신독성, 또는 저혈압으로부터 적어도 부분적으로 야기되는 AKI. 병태는 약물 유발성(예, 아미노글리코시드 유발성) 신독성을 포함할 수 있다. 단백질은 예방적으로, 예를 들어, 신장 이식, 신독소 투여, 또는 AKI를 야기하거나 이에 기여한다고 알려져 있거나 예상되는 다른 활동, 치료, 또는 사건 전에 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 단백질은 신장이식 또는 다른 수술, 아미노글리코시드 또는 다른 신독소 투여, 또는 AKI를 야기하거나 이에 기여한다고 알려져 있거나 예상되는 다른 활동, 치료, 또는 사건 후처럼, AKI에 응하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 신독소 또는 다른 약물은 다음을 포함할 수 있다: 예를 들어,
하나 이상의 아미노글리코시드 [예, 파로모마이신(paromomycin), 토브라마이신(tobramycin), 겐타마이신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 카나마이신, 및 네오마이신 등];
하나 이상의 항진균제 (예, 암포테리신 B, 플루시토신 등);
하나 이상의 조영제 [예, (요오드화) 방사성 조영제, 약 1.5:1의 분자비(molecule ratio)로 요오드를 갖는 고장성 조영제(high-osmolality contrast media, HOCM), 약 3:1의 분자비로 요오드를 갖는 저장성, 비이온성 조영제(low-osmolality, nonionic contrast media, LOCM), 및 약 6:1의 분자비로 요오드를 갖는 등장(등장성) 조영제(isosmolar (isoosmolality) contrast media, IOCM) 등];
하나 이상의 항레트로바이러스제 [예, 아데포비르(adefovir), 시도포비르(cidofovir), 테노포비르(tenofovir), 및 포스카네트(foscarnet) 등];
하나 이상의 암(또는 화학요법-) 치료제 [예, 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 알킬화제(alkylating agent) (벤다무스틴(bendamustine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 테모졸로미드(temozolomide), melphalan(멜팔란) 등과 같은), 항종양성 항생제(antitumor antibiotic) (미토마이신 C(mitomycin C), 벨로마이신(bleomycin), 안트라사이클린(anthracycline) 및 관련 약제 등과 같은), 대사 길항물질(antimetabolite)(카페시타빈(capecitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트, 페메트렉시드(pemetrexed), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 젬시타빈(gemcitabine), 시타라빈(cytarabine) 등), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 토포테칸(topotecan), 에토포시드(etoposide), 텍산(taxane), 이리노테칸(irinotecan), 레날리도마이드(lenalidomide), 에리불린(eribulin), 삼산화비소(arsenic trioxide), 또는 익사조밉(ixazomib) 등];
하나 이상의 비스포스포네이트(bisphosphonate), 또는 이의 유도체 [예, 졸레드로네이트(zoledronate)/졸레드론산, 이반드로네이트(ibandronate), 알렌드로네이트(alendronate), 알렌드로네이트/콜레칼시페롤, 에티드로네이트(etidronate), 리세드로네이트(risedronate)(선택적으로, 칼슘 카보네이트와), 파미드로네이트(pamidronate), 틸루드로네이트(tiludronate) 등]; 및/또는
코카인, 헤로인 등과 같은 하나 이상의 마약 (예, 오피오이드).
본 개시의 양태는 치료학적 재조합 (알파 가용성) 클로토 단백질 (예, 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 또는 이의 부분집합에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성이 있는)을 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 방법은 치료학적 클로토 단백질을 인간 또는 인간이 아닌 개체에 투여하는 단계를 포함하여, AKI 또는 AKI와 관련된 하나 이상의 병태를 치료하거나 예방 (예방적으로)할 수 있다. 방법은 개체에서 혈청 가용성 클로토 수준의 수준을 결정하는 단계, 개체에서 혈청 가용성 클로토 수준을 정상 수준의 소정의 수준 또는 백분율로 상승시키에 충분한 단백질의 제1 투여량을 계산하는 단계, 일시적 또는 점진적 투여와 같은 바에 의해 단백질의 제1 투여량을 개체에게 투여하는 단계, 제1 투여량의 투여 후처럼 개체의 혈청에서 가용성 클로토 감소율을 결정하는 단계, 차후의 투여 시간 및 양을 계산하는 단계, 및/또는 단백질의 차후의 양을 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
만성 신부전(Chronic Kidney disease, CKD)을 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
전체로서 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함된 Neyra and Hu, Potential application of klotho in human chronic kidney disease, Bone (2017)에서 기술된 바와 같이, 순환에서 가용성 클로토는 만성 신부전 (CKD) 2기 초기에 감소하기 시작하고 소변 클로토는 CKD 1기에서 아마 더 빨리 감소하기 시작할 것이다. 그러므로, 가용성 클로토를 신장 기능 저하의 초기 및 민감한 마커로서 제공할 수 있다. 더욱이, 전임상 동물 데이터는 클로토 결핍이 단지 바이오마커가 아니며, CKD 진행과 심혈관 질병 및 교란된 무기질 대사 (disturbed mineral metabolism)를 포함하는 신장외 CKD 합병증(extrarenal CKD complication)에 대한 병인(pathogenic factor)임을 뒷받침한다. 클로토 저하의 예방, 외인성 클로토의 공급, 또는 내인성 클로토 생성의 재활성화는 동물모델의 CKD에서 신장 섬유화(renal fibrosis)의 감쇠(attenuation), CKD 진행의 지연, 무기질 물질대사의 호전, 심장근육병증(cardiomyopathy)의 개선, 및 혈관 석회화의 완화와 모두 관련된다.
CKD는 ESRD의 높은 위험이 있는 신장 기능의 진행성 저하(progressive deterioration)에 의해 특성화된다. CKD 위험은 나이가 들수록 증가하고, 3기 이상의 CKD 사례의 약 절반이 N 70세 개체에서 발생한다. CKD는 가속화된 노화의 상태로서 보일 수 있다. 25세 내지 34세 투석 환자의 심혈관 질환에 의한 사망률에 대한 관련 위험은 N75세의 CKD가 아닌 환자와 비슷하다. 심혈관 질병은 CKD과 ESRD 환자에서 주된 사망 원인이다. CKD와 ESRD 환자는 낮은 신장 클로토 발현과 순환 클로토의 낮은 수준을 가진다. CKD의 초기에서 신장 클로토 결핍은 생존 가능한 세뇨관(viable renal tubule)의 손실 보다 클로토 발현의 억제에 주로 기인할 수 있다. 더욱이, 일부 투석 환자는 여전히 검출 가능한 순환 클로토를 갖는데, 이는 신장 클로토 발현이 완전히 억제되는 것이 아니며, 클로토가 이의 근원이 지금까지 명확하지 않음에도, 신장외 원천(들)로부터 올 수 있음을 시사한다. 신장 생성이 제대로 기능하지 않을 경우, 어떻게 이것이 상향조절 될 수 있는 것인지를 특성화 하는 것과 클로토의 신장외 원천을 밝히는 것은 다른 무엇보다도 중요하다.
본 개시의 외인성 클로토 단백질의 투여는 CKD에서 공병(comorbidity)의 부담을 예방하고, 지연시키고, 감소시키는 것을 도울 수 있다.
다른 성분(들)과 배합하여 S-클로토를 포함하는 조성물 및 치료
클로토는 다른 화합물 및/또는 성분과 상가적 물질(additive matter) 또는 상승적 물질(synergistic matter)로 또한 작용하여 하나 이상의 인간 건강 및 웰빙(well-being)의 측면에 영향을 끼칠 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가의 활성 화합물과 배합하여 및/또는 동반하는 치료학적 인간 재조합 가용성 알파 클로토 (S-클로토) 단백질을 포함하는 치료는 인간 환자에게 유익할 수 있다. 이러한 치료는 클로토 단백질 및/또는 다른 성분(들)이 치료학적 효과를 가질 수 있는 임의의 인간 병태에 대응적이거나 예방적일 수 있다. 이러한 병태는, 예를 들어, 나이 관련 병태, 대사성 병태, 만성 또는 급성 병태 등등을 포함할 수 있다. 특정 병태의 특정하나 제한적이지 않은 예시가 본 명세서에 개시된다.
S-클로토는 성장/분화 인자 11 (growth/differentiation factor 11, GDF-11)와 같은 다른 혈액 매개 항노화 화합물(blood borne anti-aging compound)과 함께 인체에서 존재할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 치료학적 S-클로토는 치료학적 GDF-11와 (예, 동시에, 연속적으로, 및/또는 배합하여) 공동 투여될 수 있다. 이러한 투여는 일부 양태에서 상가적인 또는 상승적인 항노화 또는 다른 효과를 가질 수 있다. 마찬가지로, CCL11에 대한 (중화) 항체 또는 CCL11의 억제제와 인간 개체로 S-클로토 공동 투여는 합심하여 작용해서 노화 또는 다른 병태에 대응할 수 있다[CCL11 (에오탁신-1으로 또한 알려짐)은 줄기세포 회춘(rejuvenation)의 음성 조절자(negative regulator)인 것으로 이해되기 때문]. S-클로토는 또한 또는 대안적으로 에오탁신-2 (CCL24) 및/또는 에오탁신-3 (CCL26)와 같은 다른 에오탁신과 공동 투여될 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 전환 성자 인자 β-1 (Transforming Growth Factor β-1, TGF-β1)에 대한 항체 또는 이의 억제제와 공동 투여될 수 있다. S-클로토 투여는 신장 및 다른 조직 섬유화로 이어지는 내인성 항세포상피 간엽 전환(anti-cellular epithelial-to-mesenchymal transition, anti-EMT)에 관여되는 TGF-β1 신호 경로의 작용을 방해할 수 있다. 항-EMT는 EMT를 저해하는 것이 암 세포에 전이하는 능력을 수여할 수 있는 암세포에서 또한 관련 있다-이 후자의 과정은 클로토에 의해 방해되는 것으로 이해된다. 따라서, S-클로토와 전환 성장 인자 β-1 (TGF-β1)의 억제제 또는 이에 대한 항체의 공동 투여는 상승적 또는 상가적 효과를 가질 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 인슐린 성장 인자-1 (Insulin Growth Factor-1, IGF-1)에 대한 항체 또는 이의 억제제와 공동 투여될 수 있다. 클로토는 세포내 인슐린/IGF-1 신호전달 연쇄반응을 저해하는 호르몬인 것으로 이해되며, 이 저해는 포유류내 세포 및 유기체 수준에서 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가시킨다; 수명을 연장시키기 위해 진화론적으로 보존되는 것으로 고려된 메커니즘. 따라서, S-클로토와 인슐린 성장 인자-1 (IGF-1)의 억제제 및 이에 대한 항체의 공동 투여는 상승적 또는 상가적 효과를 가질 수 있다.
많은 연구들이 클로토 α-Kl, FGF23, 및 1,25(OH)2D의 상호적으로 조절되는 양성/음성 피드백 작용 및/또는 클로토 β-Kl, FGF15/인간FGF19, 및 담즙산(bile acid)으로 구성된 담즙산/콜레스테롤 물질대사를 조절하는 유사 조절 네트워크(analogous regulatory network)를 수반하는 무기물 항상성(mineral homeostasis)의 포괄적인 조절 체계를 밝혔기 때문에; 일부 양태에서, S-클로토는 비타민 D (예, 비타민 D3) 또는 1,25-디히드록시비타민 D3 [1,25(OH)2D3], FGF-15, FGF-19, 및/또는 클로토 β와 배합으로 투여될 수 있다. 이러한 공동 투여는 체내의 많은 병태 및/또는 과정에서 상승적 또는 상가적 효과를 가질 수 있다. 일부 양태에서, S-클로토는 FGF-21와 배합하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 아세타졸아미드(acetazolamide), 메타졸아미드(methazolamide), 디클로페나미드(dichlorphenamide), 도르졸라미드(dorzolamide), 브린졸라미드(brinzolamide), 및/또는 토피라메이트(topiramate)와 같은 탄산무수화효소 억제제와 공동 투여될 수 있다. 이러한 배합 투여는 강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 및 다양한 다른 병태의 치료에서 유용할 수 있다. 다양한 조사는 증가된 골흡수(bone resorption)가 AS 및 RA의 특징이며 탄산무수화효소 억제제가 골흡수를 저해함으로써 항관절염제(antiarthritic) 역할을 하는 것을 나타내왔다. 뼈 수준에서, 상이한 메커니즘을 통해, S-클로토는 최근 파골세포 기능 조절제(osteoclast function modulator)로 식별된 TRPV5에 작용함으로써 골흡수와 인산 방출을 촉진한다. S-클로토 투여에 의해 야기된 1,25(OH)2D3의 증가된 수준은 파골세포 분화(osteoclast differentiation) 및 골흡수를 또한 촉진할 수 있고, 이로써 인산 방출을 촉진한다. 따라서, S-클로토와 탄산무수화효소 억제제의 공동 투여는 특히 AS 및 RA에서, 특히 뼈 건강 증진에 있어서, 상승적 또는 상가적 효과를 가질 수 있다.
S-클로토는 하나 이상의 질병 조절 항류마티스 약물 (disease-modifying antirheumatic drug, DMARD)- 중증 활성(severe active) 류마티스 관절염의 치료를 위한-과 배합하여 투여될 수 있다.
사이클로스포린이 클로토 mRNA 및 단백질을 감소시키고 사이클로스포린 유발성 신장 손상(cyclosporine induced-renal injury, CsA)으로 이어지는 산화적 스트레스를 증가시키기 때문에, S-클로토는 사이클로스포린(cyclosporine)과 배합하여 투여될 수 있다. 클로토 mRNA와 단백질의 관련된 감소 및 산화적 스트레스의 증가는 S-클로토의 외인성 공동 투여에 의해 대응될 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 로자탄(losartan) 및/또는 사이클로스포린과 공동 투여될 수 있다. 로자탄, 안지오텐신 II 유형 1(angiotensin II type 1, AT1) 수용체 차단제를 이용한 치료는 사이클로스포린과 보인 클로토 발현의 감소를 반전시켰다. 로자탄은 신장 조직학(renal histology) [사이클로스포린에 의해 야기된 세뇨관 간질 섬유화(tubulointerstitial fibrosis)를 감소시키는 로자탄이 있는] 공동 향상(concurrent improvement)을 또한 생성하였다.
일부 양태에서, S-클로토는 아미카신, 겐타마이신, 토브라마이신 등과 같은 하나 이상의 아미노글리코시드와 공동 투여될 수 있다. 아미노글리코시드가 (그람-음성) 병원체 감염(pathogen infection)을 치료하는데 사용되는 경우, 이러한 치료는 신독성 및/또는 급성 신손상 (AKI)의 예방에 유용할 수 있는데, 이는 감염을 치료하기 위한 아미노글리코시드의 사용을 크게 확장할 수 있다. AKI의 저지에 사용되어 온 베라파밀(verapamil) 및/또는 딜티아젬(diltiazem)과 S-클로토의 투여는 AKI로부터의 신장기능 장애(renal dysfunction)의 치료 및/또는 예방에서 치료학적일 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 테스토스테론 또는 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) 상향조절 화합물과 공동 투여될 수 있다. 최근의 보고는 성격, 정신적 웰빙(psychological well-being), 또는 기분에 대한 남성에서의 테스토스테론 치료의 유익한 효과가 관찰되지 않음을 나타낸다. 더욱이, 심혈관 건강, 성기능, 육체적 기능, 기분, 또는 인지기능에 대한 낮은 T(low-T)를 위한 테스토스테론 보충의 처방은 무작위 임상 시험(randomized clinical trial)으로부터 증거가 없는 것으로 고려되었다. 그러나, 테스토스테론 보충은 근력을 증가시키는 것으로 지속적으로 발견되었으나, 육체적 기능에 대한 유익한 효과를 갖지 않았다. 테스토스테론 및/또는 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) 상향조절 화합물과 배합한 S-클로토 투여는 노인인, 노쇠한, 또는 낮은 T의 남성에서 근력 및/또는 육체적 기능을 이러한 치료군에서 테스토스테론 또는 S-클로토가 단독으로 가질 수 있는 임의의 효과 이상으로 현저히 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 에스트로겐 또는 에스트로겐 호르몬 (예, 에스트라디올, 에스트리올, 에스트론 등)과 공동 투여될 수 있다. 이러한 공동 투여는 여성에서 (예, 월경의, 폐경기의, 또는 폐경 이행의 여성) 건강 지표를 향상시킬 수 있고/거나 불임, 다낭성 난소 질병 또는 질환(polycystic ovarian disease or disorder), 비만, 호르몬 불균형 및 관련 병태, 및/또는 다른 여성 건강 병태를 치료할 수 있다.
일부 양태에서, S-클로토는 하나 이상의 항정신제(nootropics)-머리가 좋아지는 약물(smart drug) 또는 인지기능 개선제(cognitive enhancer)로 또한 불림-과 공동 투여될 수 있다. 항정신 약물, 보충물, 및/또는 다른 물질은 인지 기능, 특히 집행 기능, 기억력, 창의성, 동기부여, 과제 현출성(task saliency) (과제를 수행하는 동기부여), 성취도 [특히 높은 노력도(degree of effort)를 요하는 지루한 과제에 대한]를 향상시킬 수 있고, 알츠하이머 질병, 파킨슨 질병, 헌팅턴 질병, 및 ADHD와 같은 질환에 기여할 수 있는 인지 또는 운동 기능 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 인지의 일부 측면을 향상시키는 것으로 알려진 가장 통상적으로 사용되는 약물의 종류는 각성제, 특히 전전두엽 피질(prefrontal cortex)에서 도파민 수용체 D1, 아드레날린 수용체 A2, 또는 이들 수용체 모두의 직접적인 작용제(direct agonist) 또는 간접적인 작용제(indirect agonist)로 작용함으로써 인간에서 인지 강화효과를 보이는 각성제의 종류이다. 각성제는 다음을 포함할 수 있다: 예를 들어, 특히 ADHD가 있는 개인에서 인지 기능의 범위[예, 억제성 조절(inhibitory control), 일화적 기억(episodic memory), 작업 기억(working memory), 및 주의력의 측면]에 유익한 암페타민 (예, 암페타민, 덱스트로암페타민, 리스덱스암페타민 등); 신체 기능(physical performance), 각성도, 반응 시간 등을 향상시킬 수 있는 1,3-디메틸아밀아민과 같은 디메틸아밀아민(dimethylamylamine, DMAA); 인지 기능의 범위[예, 작업 기억, 일화적 기억, 및 억제성 조절, 주의력의 측면, 및 계획 지연(planning latency)]를 향상시킬 수 있는 치환된 페네틸아민(phenethylamine)인 메틸페니데이트; 특히 잠이 부족한 개인에서 각성도를 증가시킬 수 있는, 추론 및 문제 해결을 용이하게 할 수 있는, 수면 무호흡(sleep apnea) 치료 후 남아있는 주간 졸림증(daytime sleepiness), 교대근무 수면장애(shift work sleep disorder), 및 기면증(narcolepsy) 등등을 치료할 수 있는 각성 촉진제(wakefulness promoting agent)로 기능할 수 있는 유제로익스(eugeroics) [예, 아르모다피닐(armodafinil), 모다피닐(modafinil) 등]; 각성도, 성취도, 및/또는 기억력을 증가시킬 수 있는 크산틴(xanthine) (예, 카페인 등); 니코틴 등등.
일부 양태에서, S-클로토는 기술분야에 알려진 하나 이상의 골다공증 및/또는 골감소증 약제와 공동 투여될 수 있다. 동물에서 클로토의 부재가 감소된 골염도로 이어질 수 있기 때문에, 클로토는 골염도 조절에서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 클로토 녹아웃 마우스(knockout mouse)는 시간에 따라 감소된 골염도를 보인다. 시간에 따라 감소된 골염도를 보이는 클로토 녹아웃 마우스와 같은, 클로토 녹아웃 동물에서 클로토 발현은 골손실을 구할 수 있다. 역학적 연구는 다양한 클로토 유전자 변이체와 골염도의 변화 사이의 연관성과 손 골관절염(hand osteoarthritis)의 유병률(prevalence)를 보여왔다.
S-클로토는 화학요법제와 같은 하나 이상의 항암 치료제 및/또는 예방제와 배합하여 투여될 수 있다. 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC)과 같은 폐암에서, 예를 들어, S-클로토 투여는 시스플라틴 및/또는 다른 화학요법에 대한 폐암 세포의 저항성에 영향을 끼칠 수 있다. 더욱이, S-클로토는 폐암, 위암, 췌장암 (선암종), 및 다른 형태의 암에서 잠재적인 종양 억제제로서 기능할 수 있다. S-클로토는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, HCC)의 치료를 위한 소라페닙(sorafenib) 화학요법과 병용하여 투여될 수 있다. 클로토의 과발현 뿐만 아니라 가용성 클로토 단백질을 이용한 치료는 생체내 및 실험관내 간세포 성장을 감소시킬 수 있다. S-클로토 공동 투여로 치료될 수 있는 다른 암 유형은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, HCC), 중추신경계(central nervous system, CNS) 암 [예, 뇌 (예, 신경교종(glioma), 두개인두종(craniopharyngioma), 수모세포종(medulloblastoma) 및 수막종(meningioma)), 척수, 및 다른 종양, 림프종 등], (전이성) 결장암 등등을 포함한다.
S-클로토는 화학요법제와 배합하여 또한 투여되어 암환자에서 화학요법 유발성 노쇠를 치료할 수 있다. 다른 알려진 치료 후, S-클로토는 또한 투여되어 암 환자에서 암 유발성 노쇠를 치료할 수 있다.
S-클로토는 신장투석 또는 다른 절차와 병용하여 투여될 수 있다. 노쇠가 투석에서 환자에 대한 좋지 않은 결과와 관련되기 때문에, S-클로토를 투여하여 투석 환자에서 노쇠를 치료할 수 있다.
충분한 양의 BDNF는 뇌에서 정상적인 신경 회로(neuronal circuit)를 발달하고 유지하는 것을 도울 수 있기 때문에, S-클로토는 하나 이상의 알츠하이머 질병 치료제 또는 예방제와, 또는 뇌 유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)와 배합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 중추 신경계(CNS)로 유입하는 클로토의 능력을 증가시키기 위해 혈관-뇌 장벽을 가로 지르는 클로토의 능력을 증가시키는 하나 이상의 분자와 배합하여 투여되어 CNS 관련 병태를 치료하거나 예방할 수 있다. 예를 들어, S-클로토나 BDNF도 혈관-뇌 장벽을 가로지는 것으로 알려져 있지 않다. 본 개시의 양태는 알츠하이머 질병을 치료하고/거나 알츠하이머 질병에 의해 영향을 받지 않는 개인에서 인지를 향상시키기 위해 CNS로 S-클로토 및/또는 S-클로토와 BDNF의 투여를 위한 혈관-뇌 장벽 전달 기법을 이용하는 것을 포함한다.
S-클로토는 지방산 산화와 자가포식(autophagy)을 포함하는 세포 ATP 공급을 보충하는 신호전달 경로를 양성적으로 조절하거나; 당신생(gluconeogenesis), 지질 및 단백질 합성을 포함하는 ATP를 소모하는 생합성 과정(ATP-consuming biosynthetic processes)을 음성적으로 조절하는 AMPK 활성 약물 또는 성분 또는 5' 아데노신 모노포스페이트 활성화 단백질 인산화 효소(5' adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)와 배합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 인슐린, 플로리드진(phloridzin) 또는 항산화제 티론과 같은 하나 이상의 항당뇨 약물과 배합하여 투여될 수 있고 이러한 병용 치료물은 당뇨성 질환에서 생성된 산화적 스트레스로부터의 신장 손상의 예방에서 가치를 가질 수 있다. 1형 당뇨병을 위한 다른 항당뇨 약물과 S-클로토의 공동 투여는 카스파제 3 절단의 저해로 이어지는 인테그린 β1-FAK/Akt 경로의 활성을 통해 β-cell 세포자살을 저해함으로써, β-세포를 보호할 수 있다.
S-클로토는 과체중 및 비만 개체에서 혈당 조절(glycemic control)과 혈관 기능 향상을 위한 메트포르민(metformin)과 같은 하나 이상의 2형 항당뇨 약물과 배합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 하나 이상의 혈압 약제, 칼슘 조절제, 또는 만성 신부전 (CKD)의 치료제 또는 예방제와 배합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 연조직 석회화(soft-tissue calcification)는 CKD에서 두드러진 특징이고 클로토는 인산뇨(phosphaturia)를 늘리고, 사구체 여과(glomerular filtration)를 보존하며, 혈관 연조직에 의한 인산 흡수를 직접적으로 저해함으로써 혈관 석회화를 개선시킬 수 있다.
PAI-1 저해 또는 결핍이 클로토 결핍 (kl/kl) 마우스의 수명을 연장시키는 동안 노화의 발달을 지연시키고 기관 구조와 기능을 보호하는 것으로 생각되기 때문에, S-클로토는 TM5441 또는 플라스미노겐 활성자 1(plasminogen activator 1, PAI-1)의 다른 억제제와 배합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 시르투인 (sirtuin 1, SIRT1) 또는 레스베라트롤(resveratrol)과 같은 SIRT1 활성 화합물 (SIRT1-activating compound, STAC)과 배합하여 투여될 수 있다. III 형 단백질 탈아세틸화 효소인 SIRT1은 세포 노화(senescence/aging) 및 염증의 조절에 관련되는 신규한 항노화 단백질인 것으로 생각된다. 산화 스트레스에 의해 야기된 폐 염증 시, SIRT1 수준 및 활성은 감소된다. 염증에 대한 SIRT1 매개 보호의 메커니즘은 염증, 이른 노화(premature senescence), 텔로미어 소모(telomere attrition), 분비 표현형(secretory phenotype)과 관련된 노화, 및 DNA 손상 반응의 조절과 관련된다. 염증과 관련된 만성 폐쇄성 질병, 심혈관 질병, 암, 및 2형 당뇨병의 진행에 개입하기위해, 다양한 식이성 폴리페놀(dietary polyphenol)과 약리학적 활성제(pharmacological activator)가 SIRT1을 조절하는 것으로 나타난다. 따라서, SIRT-1의 일부 또는 모든 건강상 이점은 S-클로토와 주어지는 SIRT1 및/또는 SIRTI 활성 화합물의 공통 투여에 의해 증대될 수 있다.
S-클로토는 FDA에 의해 승인된 하나 이상의 인간 세포, 조직, 및 세포 및 조직 기반 생성물(Cellular and Tissue-Based Products, HCT/Ps)과 배합하여 투여될 수 있다. 이러한 생성물은, 예를 들어, 보존된 제대 정맥(umbilical cord vein), 심막(pericardium), 양막(amniotic membrane) [안구 회복을 위해 단독으로(-추가된 세포 없이-)사용된 경우], 경막(dura mater), 심장 판막 동종이식편(heart valve allograft), 말초 제대혈 (peripheral cord blood) 또는 제대혈(umbilical cord blood)로부터 유래된 조혈모세포, 정액, 난모세포, 또는 배아를 제외한 하나 이상의 뼈[탈회골(demineralized bone)을 포함], 인대(ligament), 건(tendon), 근막(fascia), 연골(cartilage), 안구 조직(ocular tissue (각막 & 공막)), 피부, 혈관 이식편(vascular grafts (정맥 & 동맥))을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, HCT/P는 하나 이상의 줄기세포 거나 이를 포함할 수 있다. 손상된 신체의 조직 및 기관을 위한 줄기세포 치료는 계속해서 인기가 상승하고 있다. 줄기 세포와 배합한 치료학적, 재조합 클로토 단백질의 투여는 이를 필요로 하는 개체에게 놀라운, 기대하지 않은, 및 심지어 상승적 결과를 제공하였다.
본 개시의 양태는 인간 줄기세포와 배합하여 치료학적, 재조합 클로토 단백질을 포함하는 병용물을 더 포함한다. 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 또한 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 재생 의료(regenerative medicine)를 포함하거나 이로 분류되어 심각하거나 생명을 위협하는 질병 또는 병태를 치료하거나, 조정하거나, 반전시키거나, 또는 치료할 수 있으며, 이는 FDA에 의해 승인된 바와 같다. 예비적 임상 증거는 조성물 (약물)이 이러한 질병 또는 병태에 대한 충족되지 않는 의학적 필요성을 다루는 잠재력을 갖는 것을 나타낸다.
실례적으로, 줄기세포는 인간 제대 또는 태반으로부터 기인한 바와 같은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, huMSC 및 본 개시의 치료학적, 재조합 클로토 단백질을 포함하는 조성물은 AKI에서 일어나는 염증성 및 산화적 스트레스 반응을 약화시켰고/켰거나 노화에 관련된 단백질 및 microRNA의 발현을 감소시켰다.
S-클로토는 하나 이상의 노화 억제제와 배합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질은 Pin1-FOXM1 및/또는 다른 노화 억제제와 배합되어 이러한 치료를 받는 환자에서 결과를 향상시킬 수 있다.
S-클로토 다음 중 하나 이상과 배합하여 투여될 수 있다: 클로토 자극제 (Vit. D, 로자탄, 테스토스테론), GDF-11, 트리코스타틴 A 항균제 (GDF-11 자극제), TIMP-2, CCL-11 억제제/항체, 다사티닙, 니코틴아미드 리보시드 (nicotinamide mononucleotide, NAD+), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (nicotinamide mononucleotide, NMN) (NDA+), AMPK 자극제 (레스베라트롤, 아스피린, 살리실산염, 피토케미컬, DR), C60 풀러렌, 라파마이신, FGF 억제제, FOXO4-p53 간섭 펩티드 (예, FOXO4-DRI)와 같은 세놀리틱 약물/화합물(Senolytics drug/compound), 항세포자살 단백질 BCL-2와 BCL-xL의 억제제.
전술한 또는 다른 치료 또는 공동 투여 중 임의의 것은 단독 치료의 임의의 것에 대해 상가적 또는 상승적 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 전술한 것 중 하나 이상과 클로토 단백질의 공동 투여는 비슷한 농도에서 단독 성분 투여의 개별적인 결과의 합 보다 더 큰 치료 결과를 야기할 수 있다. 더욱이, 상승적 효과는 단독 성분 투여의 개별적 결과의 것과 비슷한 치료 결과를 포함할 수 있으나, 이는 더 낮은 농도에서다. 상승적 효과는 하나 이상의 성분의 최대 효과적 투여량(maximum effective dose)을 증가시키는 것, 하나 이상의 성분의 독성을 감소시키는 것, 또는 개별적 치료 결과의 단순한 상가적 효과 보다 임의의 다른 유익한 결과를 또한 포함할 수 있다. 더욱이, 개별적 성분의 성질 및 이해를 고려하면, 개별적 치료 결과의 상가적 효과는 이러한 상가적 효과가 예측되지 않거나 예상되지 않는 상승적 효과를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 병용 치료 또는 공동 투여는 클로토 단백질과 하나 이상의 추가의 유효 성분을 포함하는 병용물, 조성물, 또는 제제의 치료 또는 투여를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 유효 성분은 본 명세서에 기재된 성분, 약물, 물질, 치료 조성물 등 또는 기술분야에 알려진 다른 것들 중으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질과 하나 이상의 추가의 유효 성분은 주사할 수 있는 (예, 근육내, 정맥내 등), 삼킬 수 있는, 경피의, 흡입의, 국소의, 또는 다른 제제로 공동 조제될 수 있다.
대안적으로, 병용 치료 또는 공동 투여는 병용물, 조성물, 또는 제제로 배합되거나 조제된 하나 이상의 추가의 유효성분 및 클로토 단백질 없이 클로토 단백질과 하나 이상의 추가의 유효성분의 치료 또는 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질과 하나 이상의 추가의 유효 성분은 각각 별도의 주사할 수 있는 (예, 근육내, 정맥내 등), 삼킬 수 있는, 경피의, 흡입의, 국소의, 또는 다른 제제를 포함하거나 이에 있을 수 있다.
공동 투여가 둘 이상의 성분의 동시 투여 또는 둘 이상의 성분의 별개의 투여-바람직하게는 기간에 의해 분리된 별개의 투여-를 포함할 수 있음이 또한 인식될 것이다. 기간은 일부 양태에서 매우 작을 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가의 유효성분의 제2 성분이 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가의 유효성분의 제1 성분의 투여 후 실질적으로 곧바로 투여(예, 주사)될 수 있다. 대안적으로, 제1 투여 및 제2 투여는 1-60 초, 1-60 분, 1-24 시간, 1-7 일, 1-4 주, 1-12 개월 등등 또는 이들 사이의 임의의 값 도는 값의 범위의 기간에 의해 분리될 수 있다. 마찬가지로, 동시 투여는 둘 이상의 성분에 대해 오버래핑 투여 기간을 포함할 수 있다.
클로토 단백질 변이체
다양한 길이의 치료학적 S-클로토 단백질 (예, S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등)은 자연적 클로토 단백질에서 보이지 않는 다양한 유익한 효과 및/또는 결과를 이루기 위한 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 실례적으로, QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)을 사용하여 다양한 S-클로토 구조물의 핵산 서열을 변경할 수 있다. 기술분야에 알려진 다른 돌연변이를 유발하는 방법 및 키트를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 다양한 서브 클로닝 방법 및 키트가 기술분야에 알려져 있으며 시판 중이다.
본 개시의 적어도 하나의 양태에서, 단백질을 하나 이상의 C-말단 태그 및/또는 N-말단 태그로 변형한다. 이러한 태그는 기능하여 단백질의 혈청 및/또는 가용성 반감기를 연장할 수 있다 (하나 이상의 치료학적 또는 다른 환경에서). 태그는 단백질의 존재 또는 진단적 위치추정(diagnostic localization), 단백질의 분리 또는 제거, 단백질의 전달 또는 수송, 하나 이상의 표적에 대한 단백질의 결합(예, 단백질, 핵산, 세포 기관, 세포 구조적 성분(cellular structural component) 등), 효소적인 처리 또는 절단 등등을 위한 마커로서 또한 유용할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 단백질의 C-말단은 기술분야에 알려져 있고 본 명세서에 기술된 TEV-TwinStrep 및/또는 Fc-융합으로 태그할 수 있다. 추가의 설명을 논문 “Fusion proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters,” “What is the future of PEGylated therapies?” 및 “Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics,”에서 찾을 수 있으며, 각각의 전체가 구체적 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함되어 있다. 특정 양태에서, 링커 또는 링커 펩티드를 (자연적인 또는 변이체) 클로토 단백질 서열 및 태그 사이에 삽입하고/거나 위치시킬 수 있다.
일부 양태에서, 변형된 클로토 단백질은 대안적인 (예, 자연적인, 자연적이지 않은, 및/또는 합성적인) 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 자연적인 신호 펩티드 서열을 대안적인 신호 서열 또는 신호 전달 서열(signaling sequence, SS)로 대체하고/거나 추가할 수 있다. 일부 양태에서, 클로토 단백질의 자연적인 메티오닌 잔기를 제거할 수 있고 SS의 N-말단에서 메티오닌 잔기를 추가할 수 있다. 추가의 설명은 학위 논문 “Generation of high expressing CHO cell lines for the production of recombinant antibodies using optimized signal peptides and a novel ER stress based selection system,”에서 찾을 수 있으며, 이 전체가 구체적인 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함되어 있다. 특정 양태에서, 링커 또는 링커 펩티드를 (자연적인 또는 변이체) 클로토 단백질 서열과 대안적인 SS사이에 삽입하고/거나 위치시킬 수 있다.
일부 양태는 하나 이상의 아미노산 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시가 자연적으로 발생한, 합성의, 또는 다르게 구성되었는지 여부와 상관없이 개시된 클로토 단백질 내지 임의의 다른 아미노산 중 임의의 것에서 임의의 하나 이상의 자연적인 아미노산의 변이를 고려하는 것이 인식될 것이다.
S-클로토 C370S 단백질 변이체
인간에서, 클로토 유전자는 염색체 13q12 상에 위치한다. KL-VS로 알려진 변이체는 대략 코카시안(Caucasian)의 15%에 존재한다. 변이체는 6개의 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)으로 구성되며, 이 중 2개는 아미노산 치환 (즉, F352V와 C370S-페닐알라닌 352가 발린으로 바뀌고 시스테인 370이 세린으로 바뀜)을 야기한다. 시험관내 형질주입 검정은 클로토의 분비된 수준이 V352 변이체에 대해 6배 감소하였음을 보였고, 반면 이들은 S370 형태에 대해 거의 3배 증가되었다. 그러나, 인간 클로토 유전자에서 이러한 두개의 변이체가 함께 분리하고 1.6배의 범위에서 틀로토 분비를 증가시키는 KL-VS 일배체(haplotype)를 형성한다. 예를 들어, 지리적이고/거나 민족적으로 별개인 코호트로부터 취한 300 명이 넘는 개인의 스크리닝에서, 단 한 명의 개인도 V352 변이체 또는 S370 변이체 중 단 하나를 숨기는 것으로 발견되지 않았음이 보고되었다.
본 개시의 양태는 C370S 동형 변이체 (즉, F352V 변이체의 존재(또는 결실) 없음)를 갖는 재조합 S-클로토 단백질을 포함한다. 본 개시에 기술된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 C370S 변이체를 생성하고/거나 발현할 수 있다. 예를 들어, Fc 융합 및/또는 TEV-TwinStrep이 있거나 없는 S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등의 맥락에서 C370S 변이체를 생성하거나 발현할 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 길이에 대응할 수 있다.
양태는 S370 이형 접합의 또는 동형 접합의 변이체 구조물을 생성하는 것, 얻어진 구조물-S-클로토 C370S 단백질을(예, 형질주입을 통해) 암호화하는-을 적절한 발현 시스템(예, CHO 세포)으로 전달하는 것, 및/또는 S-클로토 S370 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. S370 클로토 단백질은 F352V/C370S 단백질 및/또는 야생형 F352/C370 단백질 보다 더 높은 수준에서 발현될 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 관리 검사를 하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 C370S 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 개체는, 예를 들어, KL-VS 변이체를 숨기거나 발현할 수 있다. 대안적으로, 개체는 변이체 유형 또는 다른 돌연변이의 야생형일 수 있다. 재조합 S-클로토 C370S 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가로 이어질 수 있다. 따라서, 치료학적, 재조합, S-클로토 C370S 단백질을 수용하는 개체에서 S-클로토의 순환 농도는 F352V 변이체가 존재하는 경우 관찰되는 희석 효과(dilutive effect)의 대상이 되지 않을 수 있다.
고인산혈증 가족성 종양 석회화증(Hyperphosphatemic Familial Tumoral Calcinosis, HFTC) 치료학적 치료
병든 인간 개인에서, HFTC는 S-클로토의 아미노산 (amino acid, AA) 위치 193-rs121908423-에서 히스티딘 (H)의 아르기닌 (R)으로 변이에 의해 야기된다. 임의의 이론에 국한됨 없이, HFTC 개인에서 H193R 변이는 S-클로토의 FGF23 및 FGFR1c와 3원 복합체를 형성하는 능력을 손상시키는 것으로 생각되며, 이는 KL 의존성 FGF23 신호전달을 손상시킨다. 결과적으로, 병든 개체는 피부와 피하조직(subcutaneous tissue)에서 고인산혈증과 막대한 칼슘 침전이 나타나는 중증의 대사성 질환을 나타낸다. 일부 환자는 피부 침습(skin involvement)의 부재 및 피질 과골증(cortical hyperostosis) 및 골막 반응(periosteal reaction)의 방사선학적 발견(radiographic findings)와 관련되는 장골(long bone)의 재발되는, 일시적인, 고통스러운 부종(swelling)이 나타난다.
본 개시의 양태는 H193를 갖는 S-클로토 단백질을 포함한다. H193 단백질은 본 명세서에 개시된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, H193 변이체는 Fc 융합 및/또는 TEV-TwinStrep이 있거나 없는 S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 대응하는 구성일 수 있다.
양태는 H193 이형 접합 또는 동형 접합 변이체 구조물을 생성하는 것, 얻어진 구조물-S-클로토 H193 단백질을 암호화하는-을 (예, 형질주입을 통해) 적절한 발현 시스템으로 전달하는 것 (예, CHO 세포), 및/또는 S-클로토 H193 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. H193 클로토 단백질은 R193 (또는 H193R) 단백질 보다 높은 수준에서 또한 발현될 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 관리 검사하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 H193 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체로 투여하는 것을 포함할 수 있다(예, HFTC 개인, HFTC로 진단된 개인, 또는 H193R (rs121908423) 또는 다른 변이체를 숨기는 환자). 대안적으로, 개체는 변이체 유형 또는 다른 돌연변이의 야생형일 수 있다. 재조합 S-클로토 H193 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가로 이어질 수 있다. 투여는 인간 HFTC으로 영향을 받은 개인내 인간 클로토 유전자에서 발견되는 H에서 R193로 점 돌연변이(point mutation)의 결과로서 HFTC 개인에서 전사되고 순환되는 R193 변이의 유해한 영향(deleterious effect)을 반전시키거나 대응할 수 있다. 따라서, S-클로토 H193의 순환 농도는 H193R 또는 HFTC 개인에서 관찰되는 효과에 대응하는 것을 도울 수 있다.
말기 신장병 (End-Stage Renal Disease, ESRD)이 있는 CC 유전자형 환자에서 치료학적 치료
말기 신장병 (ESRD)이 있는 대략 350,000명의 환자는 이들의 만성적 혈액투석(chronic hemodialysis)의 첫 해에 예외적으로 높은 사망률을 겪는다. 비타민 D와 섬유아세포 성장인자 (FGF)-23 수준 모두 이러한 환자에서 생존과 연관된다(correlate). 임의의 이론에 국한됨 없이, 클로토는 동물 모델에서 가속화된 노화 및 조기 사망과 관련되어온 비타민 D/FGF-23 신호전달 경로내 단백질이다. 클로토 유전자에서 유전적 변이는 ESRD가 있는 개체에서 생존과 관련될 수 있다는 것이 가설로 세워져 왔다. 연구자들은 클로토 유전자내 12개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)과 ESRD 환자의 코호트에서 사망 사이의 연관성을 이들의 혈액 투석에 대한 첫 해 동안 검사하였다(n = 1307의 백인 및 아시아인). 하나의 태그 SNP, rs577912 (인트론 1에 위치한 클로토 유전자 서열내의 0.05 초과의 마이너 대립유전자 빈도 [minor allele frequency, MAF]가 있는 통상의 HapMap 변이체)의 CC 유전자형과 1년 사망률(1-yr mortality)에 대한 증가된 위험 사이에 의미 있는 연관성이 발견되었다(RR, 1.76; 95% CI, 1.19-2.59; p = 0.003). CC 유전자형이 있는 개인에서 이 효과는 활성화된 비타민 D 보충으로 치료되지 않은 환자들 사이에서 훨씬 더욱 나타났다 (HR, 2.51; 95% CI, 1.18-5.34; p = 0.005). HapMap 개체에서 유래된 림프아구 세포주(lymphoblastoid cell line)에서, CC 유전자형은 AA 또는 AC 유전자형에 비하여 16-21% 낮은 클로토 발현과 관련되었다. 그러나, 상기에 기술된 rs577912 SNP 뉴클레오티드 변화 중 아무것도 클로토 단백질의 아미노산 변화를 야기하지 않는다. 따라서, 이 기능적 SNP (rs577912)는 mRNA 수준에서 클로토 유전자 발현에 정량적으로 영향을 끼칠 수 있다.
본 명세서의 양태는 AA 또는 AC 유전자형으로부터 발현된 S-클로토 단백질을 포함한다. 단백질은 본 명세서에 기술된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 Fc 융합 및/또는 TEV-TwinStrep이 있거나 없는 S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 대응하는 길이일 수 있다.
양태는 AA 또는 AC 이형 접합 또는 동형 접한 구조물을 생성하는 것, 얻어진 구조물-S-클로토 단백질을 암호화하는-을 (예, 형질주입을 통해) 적절한 발현 시스템으로 전달하는 것 (예, CHO 세포), 및/또는 S-클로토 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. AA 또는 AC 동형 접합 또는 이형 접합 세포에서 발현된 클로토 단백질은 CC 세포에서 보다 더 높은 수준에서 발현될 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 관리 검사를 하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체[예, 낮은 내인성 S-클로토 단백질 발현을 갖는, rs577912, 하나의 태그 SNP에서 CC 변이를 숨기는, 및/또는 말기 신장병이 있는 (ESRD) 개인 또는 환자]에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 개체는 변이체 유형 또는 다른 돌연변이의 야생형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가로 이어질 수 있다. 투여는 병든 개인내 인간 클로토 유전자에서 발견되는 점 돌연변이(들)의 결과로서 개인에서 전사되고 순환되는 CC 변이의 유해한 영향을 반전시키거나 이에 대응할 수 있다. 따라서, S-클로토의 순환 농도는 CC 개인, 특히 말기 신장병(ESRD)이 있는 이들에서 관찰된 유해한 영향, 즉, 만성적 혈액투석을 겪는 ESRD 환자에서 첫 해의 사망률에 대응하는 것을 도울 수 있다.
방사선학적 손 골관절염(Osteoarthritis, OA) 및 골극(Osteophyte)의 치료학적 치료
골관절염 (OA)은 강력한 유전성 성분 있는 통상적인 복합적 질병(complex disease)이다. 연구자들은 클로토 유전자에서 4개의 추정되는 기능적 유전적 변이체와 상당한 여성 코카시안 집단 내 손 OA 사이의 연관성을 연구하였다. 연구자들은 SNP G-395A와 방사선학적 손 OA 및 골극 형성의 존재/부재 사이의 의미 있는 연관성을 발견하였다. 대립유전자 G는 각각 오즈 비 (odds ratio, OR) 1.44 (P=0.008, 95%의 신뢰구간(confidence interval, CI) 1.09-1.91) 및 1.36 (P=0.006, 95% CI 1.09-1.70)이 있는 방사선학적 손 OA와 골극에 대한 위험을 현저히 증가시켰다. 로지스틱 회귀 모델링(logistic regression modelling)으로부터, 유전자형 GG는 유전자형 AA와 비교하는 경우, 방사선학적 손 OA (OR=3.10, 95% CI 1.10-8.76) 및 골극 (OR=3.10, 95% CI 1.10-8.75) 모두에 대한 3배 넘게 증가된 위험을 보였다. 나이에 대한 조정(adjustment) 후, 유전자형 GG에 대한 OR은 방사선학적 손 OA에 대해 4.39 (P=0.006, 95% CI 1.51-12.74) 및 골극에 대해 4.47 (P=0.005, 95% CI 1.56-12.77)로 더 증가하였다. 연구자들은 클로토 유전자 내 하나의 변이체 (SNP G-395A)가 손 OA의 감수성(susceptibility)과 관련되고 연골 손상(cartilage damage)보다 골극 형성을 통해 작용하는 것으로 보이는 것을 또한 제안하였다.
본 개시의 양태는 SNP G395A를 갖는 구조물로부터 발현된 S-클로토 단백질을 포함한다. 얻어진 단백질은 본 명세서에 기술된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, A395 변이체는 Fc 융합 및/또는 TEV-TwinStrep이 있거나 없는 S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 대응하는 길이일 수 있다.
양태는 G395A 이형 접합 또는 동형 접합 구조물을 생성하는 것, 얻어진 구조물-S-클로토 단백질을 암호화하는-을 (예, 형질주입을 통해) 적절한 시스템으로 전달하는 것 (예, CHO 세포), 및/또는 S-클로토 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. A395 이형 접합 또는 동형 접합 세포에서 발현된 클로토 단백질은 G396 세포에서 보다 더 높은 수준에서 발현될 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 관리 검사하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체[예, 방사선학적 손 골관절염 (OA) 및/또는 골극 (을 발달시킬 위험에 처한) 및/또는 G395 SNP를 숨기는 개인 또는 환자]에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 개체는 변이체 유형 또는 다른 돌연변이의 야생형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가로 이어질 수 있다. 투여는 병든 개인에서 전사되고 순환되는 G395 SNP의 유해한 영향을 반전시키거나 이에 대응할 수 있다. 따라서, S-클로토의 순환 농도는 G395 개인, 특히 방사선학적 손 골관절염 (OA) 및/또는 공극을 발달시킬 위험에 처한 이들에서 관찰된 영향에 대응하는 것을 도울 수 있다. G-395A S-클로토 단백질의 투여는 그러므로, 환자 (예, G395 SNP를 숨기는 환자)에서 방사선학적 손 골관절염 (OA) 및 골극 형성의 위험을 감소시킬 수 있다.
대사 증후군(Metabolic Syndrome)의 치료학적 치료
대사 증후군 (metabolic syndrome, MetS)의 위험 및/또는 발생, 복부 비만(abdominal obesity), 고혈당증(hyperglycemia), 이상지질혈증(dyslipidemia) 및 고혈압(hypertension)을 포함하는 심장대사 위험 요인(cardiometabolic risk factor)의 군집(cluster)은 나이가 들수록 증가한다. 노년의 성인에서, MetS은 심혈관 질병 및 2형 당뇨병의 위험을 단지 증가시키는 것 뿐만 아니라, 인지 저하 및 장애와 또한 관련된다. 현재의 증거는 MetS가 부분적으로 유전성이며, 유전적 요인이 MetS의 발생 정도에 대한 환경적 요인보다 더 큰 역할을 하는 것을 시사한다. 연구자들은 90대의 중국인(Chinese nonagenarian)과 100세 이상의 중국인 (Chinese centenarian)의 집단 사이에서 G-395A 다형성 및 대사증후군 (MetS) 사이의 연관성을 발견하였다. 개체는 Project of Longevity and Aging in Dujiangyan (PLAD)로부터 기인하였다. 클로토 유전자의 프로모터 영역내 G-395A (rs1207568)의 유전자형 검사(genotyping)를 TaqMan 대립유전자 판별 검정(TaqMan allelic discrimination assay)을 이용하여 수행하였다. MetS는 International Diabetes Federation 기준에 따라 진단하였다. 포함된 것은 695명의 93.5±3.2세의 개체였다. G와 A 대립유전자 빈도는 각각 0.852와 0.148이였다. 전제 집단에서, MetS의 빈도는 GG와 GA+AA 유전자형 집단에서 각각 10.8 %와 5.9 %였다 (p =0.004). -395A 대립 유전자 보인자(carrier)는 전제 집단(오드 비[OR] 0.50, 95 % 신뢰 구간[CI] 0.25 내지 0.98)과 여성에서(OR 0.51, 95 % CI 0.24 내지 0.97) MetS의 현저히 낮은 위험을 가졌으나, 남성 (OR 0.42, 95 % CI 0.05 내지 3.85)에서는 그렇지 못했다. 전체 집단 및 여성에서, 클로토 G-395A SNP와 MetS 사이의 관계는 고혈압(각각 OR 0.48, 95 % CI 0.34 내지 0.67; OR 0.47, 95 % CI 0.31 내지 0.71) 및 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) (각각 OR 0.66, 95 % CI 0.39 내지 0.95; OR 0.54, 95 % CI 0.31 내지 0.98)에 대한 이의 영향 때문일 수 있다. 남성에서, 이 관계는 고혈압 (OR 0.47, 95 % CI 0.25 내지 0.90)과 저 HDL-C (OR 0.69, 95 % CI 0.27 내지 0.93)에 대한 이의 영향 때문일 수 있다. 연구자들은 90대의 중국인(Chinese nonagenarian)과 100세 이상의 중국인 (Chinese centenarian) 사이에서, 특히 여성에서 클로토 유전자의 -395A 대립 유전자 보인자가 MetS의 저위험과 상관되어 있다고 결론을 내렸다.
본 개시의 양태는 -395A 대립 유전자를 갖는 구조물로부터 발현된 S-클로토 단백질을 포함한다. 얻어진 단백질은 본 명세서에 기술된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, A395 대립유전자는 Fc 융합 및/또는 TEV-TwinStrep이 있거나 없는 S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 대응하는 길이일 수 있다.
양태는 -395A 이형 접합 또는 동형 접합 구조물을 생성하는 것, 얻어진 구조물-S-클로토 단백질을 암호화하는-을 (예, 형질주입을 통해) 적합한 발현 시스템(예, CHO 세포)으로 전달하는 것, 및/또는 S-클로토 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. A395 이형 접합 또는 동형 접합 세포로부터 발현된 클로토 단백질은 G396 세포에서 보다 더 높은 수준에서 발현될 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 검사를 하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체(예, 대사 증후군 (MetS) (을 발달시킬 위험에 처한) 및/또는 G395 SNP를 숨기는 개인 또는 환자)에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 개체는 변이체 유형 또는 다른 돌연변이의 야생형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준에서 유익한 증가로 이어질 수 있다. 투여는 병이 든 개인에서 전사 및 순환되는 G395 SNP의 유해한 영향을 반전시키거나 이를 대응할 수 있다. 따라서, S-클로토의 순환 농도는 G395 개인에서, 특히 대사 증후군(MetS)의 위험에 처한 이들에서, 관찰된 효과를 대응하는 것을 도울 수 있다. G-395A S-클로토 단백질의 투여는 그러므로, (MetS) 환자에서 (예, G395 SNP을 숨기는 환자, 노인에서, 및/또는 여성에서) 대사 증후군의 위험을 감소시킨다.
암의 치료학적 치료
S-클로토는 기저 Wnt 신호전달 활성(basal Wnt signaling activity)을 저해함으로써, 대장암(colorectal cancer, CRC)에 대한 종양 억제제로서 기능하는 것으로 생각된다. 더욱이, 수명 차이(life difference)와 관련된 클로토 유전자 변이체는 부티레이트 매개 Wnt 과활성을 억제할 수 있고, 따라서 CRC의 위험을 증가시킨다. 이 방식에서, 존재하는 클로토 변이체의 유형과 이의 상대적인 발현은 CRC 위험을 조절하기 위한 식이 요법으로부터 기인한 부티레이트의 수준과 상호작용하는 것으로 가정되어왔다. 더욱이, mTOR 신호 전달은 인간 노화와 또한 연계되어왔고, Wnt 및 mTOR 신호 전달 사이의 혼선(crosstalk)은 결장 종양형성 (colonic tumorigenesis)에 영향을 끼칠 수 있다.
KL-VS 변이체 또는 다른 구조물은 SNP (예, KL-VS 내에서)가 S-클로토에 영향을 끼치는데 책임이 있는 조사를 위한 운반체로서 역할을 하여, 부티레이트 매개 Wnt 과활성의 억제 및/또는 기저 Wnt 신호전달의 감소를-S-클로토 종양 억제와 관련 있는 후자의 Wnt 관련 활성-생성할 수 있다. 양태는 KL-VS 변이체의 종양 억제 작용에 영향을 주는 것으로 나타나는 적합한 아미노산 (예, S-클로토의 KL-VS 신장부(stretch)에서)을 조정하는 것을 포함한다. 본 개시의 양태는 6개의 SNP의 KL-VS 신장부에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 재조합 S-클로토 단백질을 포함한다. 단백질은 본 명세서에 기술된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되고/거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 Fc 융합 및/또는 TEV-TwinStrep이 이거나 없는 S-클로토 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 131-549 등등의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 대응하는 길이일 수 있다.
양태는 이형 접합 또는 동형 접합 변이체 구조물을 생성하는 것, 얻은 구조물-S-클로토 단백질을 암호화하는-을 (예, 형질주입을 통해) 적절한 발현 시스템으로 (예, CHO 세포)로 전달하는 것, 및/또는 S-클로토 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. 클로토 단백질은 야생형을 포함하는 다른 클로토 단백질보다 더 높은 수준에서 발현될 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 관리 검사를 하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체 (예, 대장암 (CRC) 또는 다른 종양을 발달시키는 있거나 이의 위험에 처한 환자)에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 개체는, 예를 들어, 감소된 Wnt 저해 활성이 있는 클로토 변이체를 숨기거나 발현할 수 있다. 대안적으로, 개체는 변이체 유형 또는 다른 돌연변이의 야생형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 이로운 증가로 이어질 수 있다.
노화에 관련된 병태의 치료학적 치료
연구자들은 클로토와 입원한 노인 환자의 임상적 상태의 지표로서 통상적으로 용인되는 생물학적 매개변수 사이의 관련성을 발견하였다. 연구자들은 노인 병동(geriatric ward)에 연속적으로 다니는 594명의 입원한 노인 환자(65-99 세)에서 KL 좌위의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) rs9536314, rs1207568, 및 rs564481를 유전자형 검사하였고, 이러한 KL 변이체와 생물학적인 양적 형질(quantitative trait)의 관련성을 공분산(covariance) 및 유전적 위험 점수 모델(genetic risk score model)의 분석을 이용하여 검사하였다. rs9536314와 헤모글로빈, 알부민, 및 고밀도 지질 단백질 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)의 혈청 수준의 의미 있는 연관성뿐만 아니라 rs564481과 헤모글로빈, 공복 인슐린(fasting insulin), 및 공복 혈당(fasting glucose)의 혈청 수준의 의미 있는 연관성을 관찰하였다. 성별이 구별된 분석(Gender-segregated analyses)은 이러한 연관성을 확인하였고, KL 유전자형과 HDL-C, 공복 혈당, 및 공복 인슐린 수준의 연관성이 여성 성별로부터 기인할 수 있고, 반면 헤모글로빈의 혈청 수준과의 관련성은 남성 성별로부터 기인할 수 있음을 시사하였다. KL 유전자형과 크레아틴 수준의 연관성은 여성에서 발견되었고, 반면 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1) 및 림프구 수(lymphocytes count, LC)와 연관성은 남성에서 발견되었다. 유전적 위험 점수 (genetic risk score, GRS) 모델은 KL SNP 및 헤모글로빈, 총 콜레스테롤, 및 HDL-C 사이에서 의미 있는 관련성을 더 확인하였다. GRS 표적 접근방식이 있는 성별이 구별된 분석은 여성에서 HDL-C, 공복 혈당, 및 공복 인슐린 수준과 관련성, 남성에서 헤모글로빈 및 LC와 관련성을 확인하였다. 발견은 크레아틴, IGF-1 수준, 및 LC에 제안된 일부 성별 차이가 있는 입원한 나이 든 환자에서 지질, 공복 혈당, 알부민 및 헤모글로빈의 혈청 농도와 같은 양적 형질에 KL 좌위가 영향을 끼칠 수 있는 것을 시사하였고, 따라서, 이는 나이 관련 질병 및 장수에 아마도 기여하는 유전적 요인 중 하나가 되었다.
본 개시의 양태는 본 명세서에 기술된 S-클로토 단백질을 포함한다. 양태는 적절한 클로토 구조물을 생성하는 것, 구조물-S-클로토 단백질을 암호화하는-을 적합한 발현 시스템(예, CHO 세포)으로 (예, 형질주입을 통해)전달하는 것, 및/또는 S-클로토 단백질을 일시적으로 발현하는 것을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 투여를 위한 발현된 단백질을 정제하는 것 (및 선택적으로 품질 관리 검사를 하는 것)을 포함할 수 있다. 양태는 치료학적 S-클로토 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체(예, 선택적으로 노인인 및/또는 노화 관련 병태, 낮은 내인성 S-클로토 단백질 발현, 및/또는 감소된 장수 또는 노화 관련 병태의 증상으로부터 고통받는 개인 또는 환자)에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가로 이어질 수 있다. 투여는 노화에 관련된 병태의 유해한 영향을 반전시키거나 이에 대응할 수 있고 및/또는 총 콜레스테롤, HDL-C, 공복 혈당, 공복 인슐린, 알부민, 크레아틴, IGF-1, 헤모글로빈, 및 림프구 수(예, 입원한 및/또는 노인 환자에서)의 혈청 수준과 같은 양적 형질에 양성적 치료 방식(positive therapeutic manner)으로 영향을 끼칠 수 있다.
본 명세서에서 기술된 치료의 하나 이상의 방법에서, 치료될 개인이 클로토 유전자에서 변이(예, 유전체적으로 암호화된 이형 접합 변이(들) 또는 동형 접합 변이)를 가질 수 있고, 치료 요법이 야생형 클로토 및/또는 본 명세서에 기술된 클로토의 임의의 하나 이상의 변이체-예를 들어, 개인에 의해 발현되는 돌연변이와 비슷한 변이체를 포함하는-를 포함하는 펩티드의 치료학적 투여량을 투여하는 것을 포함할 수 있음이 인식되어야 할 것이다. 대안적으로, 치료될 개인은 야생형 클로토를 암호화/발현할 수 있고, 치료 요법은 야생형 클로토 및/또는 본 명세서에 기재된 클로토의 임의의 하나 이상의 변이체를 포함하는 펩티드의 치료학적 투여량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 개인에 의해 발현되는 클로토의 자연적인 야생형 또는 돌연변이 형태에 상관없이, 치료 방법은 순환 및/또는 세포에 결합된 클로토 단백질의 저농도를(예, 대조군과 비교하여) 결정하는 것 및 순환 및/또는 세포에 결합된 클로토의 농도를 적어도 항상성 수준(homeostatic level)으로 실효적으로(operatively) 회복시키는 치료학적 투여량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이는 치료학적 농도를 투여하기 전, 클로토의 수준 (예, 유전자 발현 수준, 단백질 발현 수준, 순환 수준 등)을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로, 치료학적 투여량은 개인에서 결정된 클로토의 수준에 좌우될 수 있다. 일부 양태에서, 치료학적 투여량은 항성성 수준을, 예를 들어, 항상성 수준의 스칼라 곱(scalar multiple) [예, 1.5 배 더, 2 배 더, 3 배 더, 4 배 더, 5 배 더, 6 배 더, 7 배 더, 8 배 더, 9 배 더, 10 배 더, 15 배 더, 20 배 더, 25 배 더, 30 배 더, 40 배 더, 50 배 더, 75 배 더, 100 배 더, 500 배 더 1,000 배 더, 10,000 배 더 등]에 의한 바와 같이 초과할 수 있다.
더욱 특히, 나이 관련 병태를 위한 치료학적 치료는 하나 이상의 클로토 변이체의 치료학적 농도를 투여하는 것을 포함할 수 있음을 인식해야 할 것이다. 일부 구현에서, 이는 본 명세서에 개시된, 예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 펩티드와 같은 클로토 변이체 (또는 클로토 변이체의 배합물)의 치료학적 농도로 환자를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 나이 관련 병태가 나이 관련 병태를 갖는 개인에 의해 발현되고/거나 암호화된 클로토 변이체와 동일하거나 상이한 것으로 치료될 수 있음을 인식해야 할 것이다. 예를 들어, 나이 관련 병태로부터 고통받는 개인은 하나 이상의 클로토의 변이체 또는 야생형을 유전적으로 암호화하며, 개인은 야생형 및/또는 변이체 클로토 단백질을 항상성 수준에서 (대조군과 비교하여), 항상성 수준 보다 적게 발현할 수 있거나, 전혀 발현하지 않을 수 있다. 개인의 나이 관련 병태를 치료하는 것을 목표로 하는 치료학적 요법은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 클로토 변이체를 투여하는 것을 포함한다.
예방적 S-클로토 투여
전술한 것에 더하여, 본 개시의 양태는 치료학적 S-클로토 단백질 또는 이의 치료학적 유효량을 예방적 목적 및/또는 특정 건강 속성(health attribute)의 유지를 위해 이를 필요로 하는 개인 또는 개체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 S-클로토 단백질의 투여는 진단된 노화에 관련된 병태로부터 아직 고통받지 않는 선택적인 노화 환자에서 젊음을 유지하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 본 개시의 특정 양태가 환자에서 병태를 치료하는데 관련될 수 있고/거나 이를 포함할 수 있는 반면, 다른 양태는 하나 이상의 병태를 예방하는 것, 이의 발달을 저해하는 것, 및/또는 이를 예방적으로 다루는데 관련될 수 있고/거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, S-클로토는 하나 이상의 클로토 유전자에서 돌연변이가 있는 유전적 질환이 있는 사람에게 투여될 수 있다.
실시예
표 1은 HEK 및/또는 CHO 세포주에서 나열된 클로토 변이체의 발현 및 정제로부터 결과를 도시한다. 아래 표 1에 제공된 결과에서, 다음의 축약된 프로토콜을 이행하였다.
Fc 융합 단백질을 위해, 단백질 발현 벡터를 HEK293.sus 또는 CHO 내로 표준 ATUM 방법을 이용하여 형질 주입하였다. 간단히, 세포를 7일 동안 생장시켜 수확하였다. 세포 수를 노트 섹션(notes section)에 제시한다. 상청액 pH를 1M 헤페스(Hepes) pH 7.4로 조정하였고 아지드화 나트륨(sodium azide)을 추가하였다. KanCap A 수지를 사용하여 단백질을 포획하였다(capturing). 수지를 PBS로 세척하였다. 수지를 PBS 플러스 1M NaCl로 세척하였다. 수지를 PBS로 세척하였다. 단백질을 50mM 시트레이트 pH 3.5, 100mM NaCl로 용출하였다. 단백질을 1M 트리스(Tris) pH 8, 0.5M 아르기닌으로 즉시 중화하였다. SDS PAGE 젤 시료를 이 단계에서 제거하였다. 단백질을 PBS로 완충액 교환하였다(buffer exchange). 단백질을 OD280에 의해 정량하였고, 양과 농도를 계산된 흡광 계수(extinction coefficient)를 이용하여 결정하였다. 환원된 및 환원되지 않은 SDS-PAGE (Biorad 기준 트리스/글리신/SDS, 4-20%)을 사용하여 순도 및 근사한 분자량을 결정하였다. 응집 상태(Aggregation status)를 280nm에서 검출이 있는 HPLC에 의해 Sepax Zenix-C SEC-300, 3um, 300Å, 4.6*150mm 크기 배제 컬럼과 PBS 러닝 완충액 (PBS running buffer)을 이용하여 결정하였다. 필터 살균 후, 단백질을 분획으로서 부하하였고(shipping) 액체 질소에서 급속 냉동하였다(snap freezing). Fc 태그된 단백질에 대해, 정제의 이전 라운드(round)에서처럼, PBS 내로 탈염화 시 단백질의 손실이 관측되었음을-정제 전 및 후에 SDS-PAGE 상에서 러닝(running)한 시료로부터 결정된 바와 같은-유의해야한다. 이러한 단백질을 발현시키나, PBS내 실리카 HPLC 상에서 탈염 또는 검정 시 HPLC로부터 문제점이 발생하였다. 따라서, 완충액 선택은 최적화될 수 있다.
스트랩 태그된 단백질에 대해, 단백질 발현 벡터를 HEK293.sus 또는 CHO로 표준 ATUM 방법을 이용하여 형질 주입하였다. 간단히, 세포를 7일 동안 생장시켜 수확하였다. 상청액 pH를 1M 헤페스 pH 7.4로 조정하였고 아지드화 나트륨을 추가하였다. BioLock 비오틴 격리 시약(sequestration reagent)을 추가하였다. StrepTactin superflow 수지를 사용하여 단백질을 포획하였다. 수지를 100mM 트리스 pH 8, 150mM NaCl, 1mM EDTA로 세척하였다. 단백질을 100mM 트리스 pH 8, 150mM NaCl, 1mM EDTA 플러스 2.5mM 데스티오비오틴(Desthiobitin)으로 용출하였다. 단백질을 OD280에 의해 정량하였고, 양과 농도를 계산된 흡광 계수를 이용하여 결정하였다. 환원된 및 환원되지 않은 SDS-PAGE (Biorad 기준 트리스/글리신/SDS, 4-20%)를 사용하여 순도와 근사한 분자량을 결정하였다. 응집 상태를 280nm에서 검출이 있는 HPLC에 의해 Sepax Zenix-C SEC-300, 3um, 300Å, 4.6*150mm 크기 배제 컬럼과 PBS 러닝 완충액을 이용하여 결정하였다. 필터 살균 후, 단백질을 분획으로서 부하하였고 액체 질소에서 급속 냉동하였다. 스트랩 태그된 단백질에 대해, 시료가 용출 완충액(elution buffer)에서 검정되었음을 유의해야한다. 이 용출 완충액은 매우 '중성적(neutral)'이고 단백질에 유해하지 않다. 또한, SEC 컬럼에 대한 러닝 완충액은 PBS여서, 단백질이 검정 시 버퍼 교환을 겪었다. 7분 이상의 시간에서 흡광도는 작은 분자였다.
클로토 일시적 발현 프로파일
단백질 이름 OD280nm 농도. (mg/mL) 흡광 계수 분자량(Da) 역가
(mg/L)
자연적 클로토 ECD (34-981)-자연적SS-스트랩-HEK 2.01 0.95 246780 116615 6.18
자연적 클로토 ECD (34-981)-ATUMSS-스트랩-HEK 1.73 0.79 246780 113119 5.16
클로토 ECD 변이체-1(36-981)-ATUMSS-스트랩-HEK 0.89 0.41 246780 112893 2.64
자연적 분비된/이소폼 2 (34-549)-자연적스트랩-HEK 1.33 0.63 140510 66255 4.07
자연적 분비된/이소폼 2 (34-549)-ATUMSS-스트랩-HEK 2.84 1.27 140510 62760 8.24
분비된 변이체 (36-549)-ATUMSS-스트랩-HEK 1.40 0.62 140510 62534 4.04
클로토 ECD 변이체-2 (131-981)-ATUMSS-스트랩-HEK 1.12 0.52 221800 103079 3.40
자연적 클로토 ECD (34-981)-자연적SS-Fc-HEK 0.02 0.01 270075 138668 0.27
자연적 클로토 ECD (34-981)-ATUMSS-Fc-HEK 0.01 0.00 270075 135172 0.12
클로토 ECD 변이체-1(36-981)-ATUMSS-Fc-HEK -0.04 -0.02 270075 134946 -0.48
자연적 분비된/이소폼 2 (34-549)-자연적SS-Fc-HEK 0.03 0.02 163805 88308 0.43
자연적 분비된/이소폼 2(34-549)-ATUMSS-Fc-HEK 0.05 0.03 163805 84813 0.76
분비된 변이체 (36-549)-ATUMSS-Fc-HEK -0.01 -0.00 163805 84587 -0.08
클로토 ECD 변이체-2 (131-981)-ATUMSS-Fc-HEK -0.01 -0.01 245095 125132 -0.15
자연적 클로토 ECD (34-981)-자연적SS-스트랩-CHO 0.42 0.20 246780 116615 1.97
자연적 클로토 ECD (34-981)-ATUMSS-스트랩-CHO 0.28 0.13 246780 113119 1.30
클로토 ECD 변이체-1(36-981)-ATUMSS-스트랩-CHO 0.15 0.07 246780 112893 0.68
자연적 분비된/이소폼 2(34-549)-자연적SS-스트랩-CHO 0.26 0.12 140510 66255 1.24
자연적 분비된/이소폼 2(34-549)-ATUMSS-스트랩-CHO 0.36 0.16 140510 62760 1.61
분비된 변이체 (36-549)-ATUMSS-스트랩-CHO 0.22 0.10 140510 62534 0.98
클로토 ECD 변이체-2 (131-981)-ATUMSS-스트랩-CHO 0.19 0.09 221800 103079 0.86
자연적 분비된/이소폼 2 (34-549)-자연적SS-Fc-CHO 0.12 0.06 163805 88308 1.54
자연적 분비된/이소폼 2 (34-549)-ATUMSS-Fc-CHO 0.16 0.08 163805 84813 2.05
본 명세서에 개시되었으나, 표 1에 나타내지 않은 하나 이상의 다른 클로토 변이체에 외에도, 표 1에 개시된 클로토 변이체의 발현 및/또는 정제는, 일부 양태에서, 자연적 클로토의 발현 및/또는 정제에 대한 우위를 야기할 수 있음을 인식해야 할 것이다. 예를 들어, 클로토 변이체를 발현하고/거나 정제할 경우, 대안적 생성물의 수 및/또는 유형의 감소가 있을 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 자연적 클로토의 발현 수준에 비하여, 목적하는 클로토 변이체의 발현 수준의 증가가 있을 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 동등한 조건 및 방법 하에서 목적하는 클로토 변이체를 더 순도가 높은 형태로 발현하고/거나 정제한다 (예, 목적하는 클로토 변이체의 농도는 발현되었고/거나 정제된 부생성물의 수반되는 감소와 함께 증가됨).
다음의 실시예는 개시된 발명의 범위를 정의하는 청구항의 예시적 세트를 포함한다. 그러나, 본 명세서에 제공되는 바와 같이, 본 발명의 범위는 다음의 실시예 또는 전술한 설명에 의하기 보다 첨부된 청구항에 의해 나타난다.
1. 재조합 클로토 단백질(recombinant klotho protein)을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서, 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR) 결실 CHO 세포에서, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포에서, 또는 바람직하게는 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS) 결실 CHO 세포에서, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포에서, 재조합 클로토 단백질을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 단백질은 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 이에 부착된 하나 이상의 글리칸(glycan)을 포함하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CHO 세포는 프로모터, 바람직하게는 강력한 프로모터(strong promoter); SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성이 있는 폴리펩티드; 및 선택적으로, 기능성 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 효소; 또는 기능성 글루타민 합성효소 (GS) 효소;를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하고, 상기 재조합 클로토 단백질을 생성하는 단계는 상기 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 외인성 핵산을 상기 CHO 세포내로 바람직하게는 형질주입(transfection)을 통해 도입시키는 단계; 및 상기 CHO 세포를 액체 배지에서, 바람직하게는 무혈청 배지 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 배지(animal protein component-free medium)에서 생장시키는 단계로서, 상기 액체 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하는 것이고, 더욱 바람직하게는 상기 액체 배지는 하이포크산틴(hypoxanthine), 티미딘(thymidine), 및/또는 글루타민(glutamine)이 결핍된 것인, 단계;로부터 선택된 하나 이상의 단계를 더 포함하는, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 단백질은 단백질의 농축 없이 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 200 - 500 mg의 단백질 농도, 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 500 - 2000 mg의 단백질 농도, 보다 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 2000 - 5000 mg의 단백질 농도로 상기 CHO 세포로부터 상기 액체 배지내로 분비되는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX) 및/또는 메티오닌 설폭시민(methionine sulphoximine, MSX)의 유효량을 상기 액체 배지내로 바람직하게는 약 1 nM - 1 μM의 농도, 더욱 바람직하게는 약 10 - 100 nM의 농도로 도입시키는 단계를 더 포함하는, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 액체 배지에서 생장하는 살아있는 CHO 세포의 현탁 배양액을 선택하는 단계를 더 포함하고, 상기 선택된 현탁 배양액의 배지내 단백질의 농도는 단백질의 농축 없이 적어도 200 mg/L, 바람직하게는 적어도 500 mg/L, 더욱 바람직하게는 적어도 1000 mg/L, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 2000 mg/L, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5000 mg/L인 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 선택된 현탁 배양액의 살아있는 CHO 세포는 세포 당 외인성 핵산의 적어도 약 2 내지 10 카피(copy), 바람직하게는 적어도 약 10 내지 20 카피, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 내지 30 카피, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 내지 50 카피를 함유하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
9. 제4항에 있어서, 재조합 클로토 단백질을 함유한 추출물을 상기 CHO 세포, 액체 배지, 또는 이들 모두로부터 정제하는 단계를 더 포함하고, 상기 추출물은 바람직하게는 적어도 약 98%의 상기 단백질, 건조 중량; 및/또는 약 1-100 ppm 미만의 CHO 숙주 세포 단백질(host cell protein, HCP);을 포함하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 추출물을 정제하는 단계는 상기 단백질의 당화를 유지하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
11. 제4항에 있어서, 상기 CHO 세포를 생장시키는 단계는 적어도 10 리터, 바람직하게는 적어도 25 리터, 더욱 바람직하게는 적어도 50 리터, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 100 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 250 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 500 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 1,000 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 2,000 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 2,500 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5,000 리터, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 10,000 리터의 부피 또는 작업 부피(working volume)를 갖는 생물반응기에서 상기 CHO 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대해 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 핵산 서열 상동성을 갖는 전이유전자(transgene) 또는 cDNA를 포함하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
14. 세포주(cell line)로서, 복수의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포, 또는 바람직하게는 글루타민 합성효소(GS) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포를 포함하고, 상기 CHO 세포는 프로모터, 바람직하게는 강력한 프로모터(strong promoter)를 포함하는 외인성 핵산으로서, 폴리펩티드로서 상기 폴리펩티드의 적어도 일부가 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인 폴리펩티드; 및 선택적으로, 기능성 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 효소; 또는 기능성 글루타민 합성효소 (GS) 효소;를 암호화하는 외인성 핵산을 함유하는 것인, 세포주.
15. 제14항에 있어서, 상기 CHO 세포는 세포당 외인성 핵산의 적어도 약 2 내지 10 카피(copy), 바람직하게는 적어도 약 10 내지 20 카피, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 내지 30 카피, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 내지 50 카피를 함유하거나 함유하도록 선택된 것인, 세포주.
16. 제14항에 있어서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것인, 세포주.
17. 제14항에 있어서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대해 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 핵산 서열 상동성을 갖는 전이유전자(transgene) 또는 cDNA를 포함하는 것인, 세포주.
18. 현탁 세포배양액으로서, 액체 배지, 바람직하게는 무혈청 배지 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 배지로서, 상기 액체 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 액체 배지는 하이포크산틴, 티미딘, 및/또는 글루타민이 결핍된 것인, 배지; 및 상기 액체 배지에서 생장하는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 세포주로서, CHO 세포가 재조합 클로토 단백질을 포함하며 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하도록 하는, 세포주;를 포함하는, 현탁 세포배양액.
19. 제18항에 있어서, 상기 CHO 세포는 상기 단백질의 농축 없이 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 200 - 500 mg의 단백질 농도, 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 500 - 2000 mg의 단백질 농도, 그 보다 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 2000 - 5000 mg의 단백질 농도로 상기 단백질을 상기 액체 배지내로 분비하는 것이고/거나, 상기 단백질은 상기 단백질의 농축 없이 상기 액체 배지 1 리터 당 200 - 500 mg의 단백질 농도, 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 500 - 2000 mg의 단백질 농도, 그 보다 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 2000 - 5000 mg의 단백질 농도로 상기 액체 배지내에 존재하는 것인, 현탁 세포배양액.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 단백질은 이에 부착된 하나 이상의 글리칸(glycan)을 포함하는 것인, 현탁 세포배양액.
21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 배지는 메토트렉세이트 (MTX) 및/또는 메티오닌 설폭시민(MSX)의 유효량을 바람직하게는 약 1 nM - 1 μM의 농도, 더욱 바람직하게는 약 10 - 100 nM의 농도로 더 포함하는 것인, 현탁 세포배양액.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 현탁 세포배양액.
23. 재조합 클로토 단백질로서, 상기 단백질의 적어도 일부는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는, 재조합 클로토 단백질.
24. 제23항에 있어서, 상기 단백질은 IGF-1 및/또는 Wnt 신호전달 경로를 조절하고; β-글루쿠론산분해효소 (β-glucuronidase) 및/또는 시알산분해효소(sialidase) 활성을 보이며; p53/p21 신호전달 경로를 억제하고; 및/또는 H2O2 유발성 세포 노화(H2O2-induced cell senescence) 및 세포자살을 바람직하게는 상기 p53/p21 신호전달 경로의 억제를 통해 감소시키는, 재조합 클로토 단백질.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 단백질은 체액성 인자로 기능하고, 바람직하게는 산화적 스트레스, 성장인자 신호전달, 이온 항상성의 조절에서, 및/또는 하나 이상의 세포 표면상의 당단백질, 바람직하게는 하나 이상의 이온 채널 단백질 및/또는 성장인자 수용체, 바람직하게는 인슐린/인슐린 유사 성장 인자-1 수용체의 활성 조절에서, 바람직하게는 다면적 활성(pleiotropic activity)을 보이는, 재조합 클로토 단백질.
26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 적어도 일부는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 재조합 클로토 단백질.
27. 노화에 관련된 또는 다른 병태(condition), 질병(disease), 또는 질환(disorder)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
28. 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981의 적어도 하나의 부분집합에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 가용성 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
29. 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 가용성 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 약제학적 유효량은 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 수준으로 상승시키기는 것; 및 바람직하게는 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 역치 또는 이 이상으로 소정의 기간동안 유지하는 것;에 충분한 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 소정의 수준은 혈청 1 밀리리터 당 약 1000 피코그램 이상의 가용성 클로토 단백질인 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
33. 제31항에 있어서, 상기 소정의 수준은 혈청 1 밀리리터 당 약 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000 20,000, 25,000, 30,000 40,000, 50,000, 75,000, 또는 100,000 피코그램의 가용성 클로토 단백질; 및/또는 전형적인 건강한 수준의 혈청내 가용성 클로토 단백질의 보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1200%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000%, 4000%, 또는 5000% 큰; 이보다 큰, 이와 동일한, 또는 이 사이에 있는 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
34. 제31항에 있어서, 하기의 단계 중 하나 이상을 더 포함하는, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법: 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 결정하는 단계; 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 제1 소정의 수준으로 상승시키기에 충분한 상기 단백질의 약제학적 유효량을 계산하는 단계로서, 상기 제1 소정의 수준은 바람직하게는 혈청 1 밀리리터 당 약 1000 피코그램 이상의 가용성 클로토 단백질인 것인, 단계; 상기 개체의 혈청내 가용성 클로토 단백질 감소율 및/또는 물질대사율을 결정하는 단계; 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도가 제2 소정의 수준 이하가 될 차후의 투여 시간을 상기 소정의 비율에 기초하여 계산하는 단계; 및 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 상기 제2 소정의 수준으로부터 상기 제1 소정의 수준으로 상승시키기에 충분한 상기 단백질의 차후의 투여량을 계산하는 단계.
35. 제34항에 있어서, 상기 차후의 투여량의 단백질을 상기 개체에 투여하는 단계를 더 포함하는, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
36. 제31항에 있어서, 외인성 핵산을 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포내로 바람직하게는 형질주입을 통해 도입시키는 단계로, 상기 핵산은 바람직하게는 전이 유전자 또는 cDNA을 포함하고, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 76 내지 SEQ ID NO: 96 중 하나에 대해 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 핵산 서열 상동성을 갖는 것인, 단계; 상기 CHO 세포를 액체 배지에서, 바람직하게는 무혈청 액체 배지 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 액체 배지에서 생장시키는 단계로서, 상기 액체 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 액체 배지는 하이포크산틴, 티미딘, 및/또는 글루타민이 결핍된 것이며, 상기 CHO 세포는 바람직하게는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포, 또는 글루타민 합성효소 (GS) 결실 CHO 세포, 더욱 바람직하게는 GS -/- CHO 세포인 것인, 단계; 메토트렉세이트 (MTX) 및/또는 메티오닌 설폭시민(MSX)의 유효량을 바람직하게는 약 1 nM - 1 μM의 농도, 더욱 바람직하게는 약 10 - 100 nM의 농도로 상기 액체 배지내로 도입시키는 단계; 상기 액체 배지에서 생장하는 살아있는 CHO 세포의 현탁 배양액을 세포 선택 과정을 통해 선택하는 단계로서, 상기 선택된 현탁 배양액의 배지에서 상기 단백질의 농도는 단백질의 농축 없이 적어도 200 mg/L, 바람직하게는 적어도 500 mg/L, 더욱 바람직하게는 적어도 1000 mg/L, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 2000 mg/L, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5000 mg/L인 것인, 단계; 상기 CHO 세포에서 재조합 가용성 클로토 단백질을 생성하는 단계로서, 상기 단백질은 바람직하게는 상기 단백질의 농축 없이 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 200 - 500 mg의 단백질 농도, 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 500 - 2000 mg의 단백질 농도, 그 보다 더욱 바람직하게는 액체 배지 1 리터 당 2000 - 5000 mg의 단백질 농도로 상기 CHO 세포로부터 상기 액체 배지내로 분비되는 것인, 단계; 및 재조합 가용성 클로토 단백질을 함유한 추출물을 상기 CHO 세포, 액체 배지, 또는 이들 모두로부터 정제하는 단계로서, 상기 추출물은 바람직하게는 상기 재조합 가용성 클로토 단백질의 적어도 약 98%의 건조 중량; 및/또는 약 1-100 ppm 미만의 CHO 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함하는 것인, 단계; 중 하나 이상을 더 포함하고, 상기 추출물을 정제하는 단계는 바람직하게는 이에 부착된 하나 이상의 글리칸을 갖는 상기 단백질의 당화를 유지하는 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
37. 제31항에 있어서, 상기 소정의 기간은 적어도 약 6 시간, 바람직하게는 적어도 약 12 시간, 더욱 바람직하게는 적어도 약 18 시간, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 24 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 36 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 42 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 48 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 54 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 60 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 66 시간, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 72 시간인 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
38. 제31항에 있어서, 상기 소정의 기간은 약 1-120 일 이상인 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
39. 제31항에 있어서, 상기 소정의 기간은 약 6개월, 9개월, 또는 1년 이상인 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간, 인간이 아닌 동물, 또는 인간이 아닌 포유류인 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 약제학적으로 허용가능한 담체내에서 또는 이와 투여되는 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법: 노쇠 (Frailty); 골밀도 감소(bone density loss); 골염도 감소(bone mineral density loss); 체중 감소(weight loss); 근위축증(muscular atrophy); 근육 변성(muscular degeneration); 근질량 저하(decline in muscle mass); 근력 저하(decline in muscle strength); 악력 저하(decline in hand strength); 각근력 저하(decline in leg strength); 체력 저하(decline in physical fitness); 운동 저하(decline in movement); 운동 자유도 저하(decline in freedom of movement); 삶의 질 저하(decline in quality of life assessment); 박출 계수 저하(decline in ejection fraction); 운동능력 저하(decline in exercise capacity); 학습 저하(decline in learning); 학습능력 저하 (decline in learning capacity); 기억력 저하(decline in memory); 지능지수 저하(decline in intellectual quotient); 인지 저하(cognitive deterioration); 건망증(forgetfulness); 인지능력 저하(decline in cognitive capacity); 인지기능 저하(decline in cognitive function); 시냅스 가소성 저하(decline in synaptic plasticity); 시냅스 기능 저하(decline in synaptic function); 및세포 노화(cellular senescence).
43. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법: 만성 신부전 (chronic kidney disease, CKD); 다낭성 신종 (polycystic kidney disease, PKD); 상염색체 우성 다낭성 신종 (autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD); 급성 신손상 (acute kidney injury, AKI); 급성 세뇨관 괴사 (acute tubular necrosis, ATN); 급성 간질 신장염 (acute allergic interstitial nephritis, AAIN); 사구체신염(glomerulonephritis); 신장병(kidney disease); 신부전(renal failure);
비핍뇨성 신부전(nonoliguric renal failure); 알코올 중독(alcoholism); 고인산혈증(hyperphosphatemia); 근이영양증 (muscular dystrophy, MS); 1형 당뇨병(type 1 diabetes); 2형 당뇨병(type 2 diabetes); 심혈관 질병(cardiovascular disease, CVD); 심혈관 석회화(cardiovascular calcification); 뇌혈관 폐쇄부전증(cerebrovascular insufficiency); 혈관 석회화(vascular calcification); 관상동맥 질병(coronary artery disease); 혈압 이상(abnormalities in blood pressure); 염분 민감성 고혈압(salt-sensitive hypertension); 조직 석회화(tissue calcification); 석회성 죽상 경화반 부하(calcific atherosclerotic plaque burden); 석회증(calcinosis); 가족성 종양 석회화증(familial tumoral calcinosis); 암; 하나 이상의 종양; 미엘린 관련 질병 (myelin-related diseases); 탈수초 질병(demyelinating diseases); 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease); 신경혈관 질병(neurovascular diseases); 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy, PSP); 폼페병(Pompe disease); 니만-피크병(Niemann-Pick disease); 소교세포증(microgliosis); 파버병 (Farber disease, FD); 골량 질병(bone mass diseases); 골다공증(osteoporosis); 골감소증(osteopenia); 골감소증 (특피 골피질의 BMD 감소); 폐기종(pulmonary emphysema); 폐섬유종(pulmonary fibrosis); 피부 위축(skin atrophy); 흉선 위축(thymic atrophy); 신장 간질의 축적(accumulation of renal interstitial matrix); 사구체 경화증(glomerulosclerosis); 빈혈(anemia); 알부민뇨(albuminuria); 단백뇨(proteinuria); 불임(infertility); 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease); 파킨슨 질병(Parkinson's Disease); 치매(dementia); 혈관성 치매(vascular dementia); 근위축성 축삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS); 운동 뉴런 질병 (motor neuron disease, MND); 심박 세동(atrial fibrillation); 만성 폐쇄성 폐질병 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 섬유 근육통(fibromyalgia); 성년 개시 당뇨(adult onset diabetes); 관절염(arthritis); 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis); 골관절염(osteoarthritis); 녹내장(glaucoma); 백내장(cataracts); 황반 변성(macular degeneration); 다발성 경화증 (multiple sclerosis, MS); 루푸스(lupus); 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 악액질(cachexia); 비만(obesity); 비타민 D 관련 병태(vitamin D-related conditions); 골질병(bone diseases); 골재형성 (bone remodeling)을 통한 골질병; 줄기세포 손실(stem cell depletion); 뱃멀미(sea sickness); 우주 적응 증후군 (space adaptation syndrome, SAS); 매스꺼움(nausea); 및 현기증(vertigo).
44. 제30항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 유효 성분을 투여 또는 공동 투여(co-administering)하는 단계를 더 포함하는, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 유효 성분은 약물, 항체, 호르몬, 방사선 조영제(radiocontrast agent), 약제(medicament), 천연 화합물, 합성 화합물, 또는 약제학적 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는 방법.
46. 약제학적 조성물로서, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용가능한 담체;를 포함하는, 약제학적 조성물.
47. 약제학적 조성물로서, 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량으로, 상기 단백질의 적어도 일부는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 적어도 하나의 부분집합; 또는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부;에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 단백질의 적어도 일부는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 88%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 92%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 약제학적 조성물.
49. 제46항 내지 48항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 유효 성분을 더 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 노화에 관련된 또는 다른 병태, 질병, 또는 질환 치료에 있어서 사용하기 위한 약제학적 조성물: 노쇠 (Frailty); 골밀도 감소(bone density loss); 골염도 감소(bone mineral density loss); 체중 감소(weight loss); 근위축증(muscular atrophy); 근육 변성(muscular degeneration); 근질량 저하(decline in muscle mass); 근력 저하(decline in muscle strength); 악력 저하(decline in hand strength); 각근력 저하(decline in leg strength); 체력 저하(decline in physical fitness); 운동 저하(decline in movement); 운동 자유도 저하(decline in freedom of movement); 삶의 질 저하(decline in quality of life assessment); 박출 계수 저하(decline in ejection fraction); 운동능력 저하(decline in exercise capacity); 학습 저하(decline in learning); 학습능력 저하 (decline in learning capacity); 기억력 저하(decline in memory); 지능지수 저하(decline in intellectual quotient); 인지 저하(cognitive deterioration); 건망증(forgetfulness); 인지능력 저하(decline in cognitive capacity); 인지기능 저하(decline in cognitive function); 시냅스 가소성 저하(decline in synaptic plasticity); 시냅스 기능 저하(decline in synaptic function); 세포 노화(cellular senescence); 만성 신부전 (chronic kidney disease, CKD); 다낭성 신종 (polycystic kidney disease, PKD); 상염색체 우성 다낭성 신종 (autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD); 급성 신손상 (acute kidney injury, AKI); 급성 세뇨관 괴사 (acute tubular necrosis, ATN); 급성 간질 신장염 (acute allergic interstitial nephritis, AAIN); 사구체신염(glomerulonephritis); 신장병(kidney disease); 신부전(renal failure); 비핍뇨성 신부전(nonoliguric renal failure); 알코올 중독(alcoholism); 고인산혈증(hyperphosphatemia); 근이영양증 (muscular dystrophy, MS); 1형 당뇨병(type 1 diabetes); 2형 당뇨병(type 2 diabetes); 심혈관 질병(cardiovascular disease, CVD);심혈관 석회화(cardiovascular calcification); 뇌혈관 폐쇄부전증(cerebrovascular insufficiency); 혈관 석회화(vascular calcification); 관상동맥 질병(coronary artery disease); 혈압 이상(abnormalities in blood pressure); 염분 민감성 고혈압(salt-sensitive hypertension); 조직 석회화(tissue calcification); 석회성 죽상 경화반 부하(calcific atherosclerotic plaque burden); 석회증(calcinosis); 가족성 종양 석회화증(familial tumoral calcinosis); 암; 하나 이상의 종양; 미엘린 관련질병 (myelin-related diseases); 탈수초 질병(demyelinating diseases); 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease); 신경혈관 질병(neurovascular diseases); 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy, PSP); 폼페병(Pompe disease); 니만-피크병(Niemann-Pick disease); 소교세포증(microgliosis); 파버병 (Farber disease, FD); 골량 질병(bone mass diseases); 골다공증(osteoporosis); 골감소증(osteopenia); 골감소증 (특피 골피질의 BMD 감소); 폐기종(pulmonary emphysema); 폐섬유종(pulmonary fibrosis); 피부 위축(skin atrophy); 흉선 위축(thymic atrophy); 신장 간질의 축적(accumulation of renal interstitial matrix); 사구체 경화증(glomerulosclerosis); 빈혈(anemia); 알부민뇨(albuminuria); 단백뇨(proteinuria); 불임(infertility); 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease); 파킨슨 질병(Parkinson's Disease); 치매(dementia); 혈관성 치매(vascular dementia); 근위축성 축삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS); 운동 뉴런 질병 (motor neuron disease, MND); 심박세동(atrial fibrillation); 만성 폐쇄성 폐질병 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 섬유 근육통(fibromyalgia); 성년 개시 당뇨(adult onset diabetes); 관절염(arthritis); 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis); 골관절염(osteoarthritis); 녹내장(glaucoma); 백내장(cataracts); 황반 변성(macular degeneration); 다발성 경화증 (multiple sclerosis, MS); 루푸스(lupus); 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 악액질(cachexia); 비만(obesity); 비타민 D 관련 병태(vitamin D-related conditions); 골질병(bone diseases); 골재형성 (bone remodeling)을 통한 골질병; 줄기세포 손실(stem cell depletion); 뱃멀미(sea sickness); 우주 적응 증후군 (space adaptation syndrome, SAS); 매스꺼움(nausea); 및 현기증(vertigo).
51. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 신손상(acute kidney injury, AKI) 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
52. 급성 신손상(acute kidney injury, AKI) 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계로, 상기 단백질의 적어도 일부는 인간 알파 클로토 이소폼 1의 아미노산 잔기 1-981, 29-981, 34-981, 36-981, 131-981, 1-549, 29-549, 34-549, 36-549, 또는 131-549의 적어도 하나의 부분집합; 또는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나의 적어도 일부;에 대해 적어도 85%, 86%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 단계 를 포함하는, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 하나 이상의 추가의 유효 성분을 상기 재조합 가용성 클로토 단백질의 약제학적 유효량과 공동 투여하는 단계를 더 포함하는, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 단백질 및 하나 이상의 추가의 유효 성분은 배합물 또는 조성물로 조제되는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
55. 제53항에 있어서, 상기 단백질 및 하나 이상의 추가의 유효 성분은 별도의 조성물인 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
56. 제53항에 있어서, 상기 단백질 및 하나 이상의 추가의 유효 성분은 혼합된 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
57. 제53항에 있어서, 상기 단백질 및 하나 이상의 추가의 유효 성분은 공동 투여를 위해 구성되는 것이고, 상기 공동 투여는 동시의 투여; 또는 바람직하게는 기간에 의해 분리되는 별개의 투여;를 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
58. 제53항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 유효 성분은 약물, 항체, 호르몬, 방사선 조영제, 약제, 또는 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
59. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 병태는 급성 세뇨관 괴사 (ATN), 신장염(nephritis), 급성 간질 신장염 (AAIN), 사구체신염, 및/또는 신독성(nephrotoxicity); 또는 신장 이식 또는 다른 수술, 급성 세뇨관 괴사 (ATN), 신장염, 급성 간질 신장염 (AAIN), 사구체신염, 신독성, 또는 저혈압으로부터 적어도 부분적으로 야기된 AKI를 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
60. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 신독성은 약물 유발성 신독성(drug-induced nephrotoxicity)을 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
61. 제60항에 있어서, 상기 약물 유발성 신독성은 항균제 유발성 신독성(anti-microbial-induced nephrotoxicity)을 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
62. 제60항에 있어서, 상기 약물 유발성 신독성은 아미노글리코시드 유발성 신독성(aminoglycoside-induced nephrotoxicity)을 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
63. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 투여 단계는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법: 개체에서 혈청 가용성 클로토 수준을 결정하는 단계; 상기 개체에서 혈청 가용성 클로토 수준을 소정의 수준 또는 정상 수준의 백분율로 상승시키기에 충분한 단백질의 제1 투여량을 계산하는 단계; 상기 개체에게 상기 단백질의 제1 투여량을 바람직하게는 일시적 투여(bolus administration) 또는 점진적 투여(gradual administration)에 의해, 더욱 바람직하게는 주사에 의해 투여하는 단계; 바람직하게는 상기 제1 투여량의 투여 후, 상기 개체의 혈청에서 가용성 클로토 감소율을 결정하는 단계; 상기 단백질의 차후의 투여량의 시간 및/또는 양을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 시간 및/또는 양에 따라서 상기 단백질의 차후의 투여량을 상기 개체에 투여하는 단계.
64. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 투여 단계는 선택적으로 소정의 기간동안 상기 개체의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 소정의 수준 또는 임계 이상으로 상승 및/또는 유지시키기에 충분한 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 소정의 수준 또는 임계는 혈청 1 밀리리터 당 약 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000 20,000, 25,000, 30,000 40,000, 50,000, 75,000, 또는 100,000 피코그램의 가용성 클로토 단백질; 또는 혈청내 가용성 클로토 단백질의 전형적인 건강한 수준보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1200%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000%, 4000%, 또는 5000% 큰; 이보다 큰, 이와 동일한, 및/또는 이 사이에 있는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
66. 제64항에 있어서, 상기 소정의 기간은 적어도 약 6 시간, 12 시간, 18 시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 21일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 이상인 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
67. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 단백질은 예방적으로, 신장 이식 또는 신장독소의 투여 이전; 및/또는 신장 이식 또는 신장독소의 투여 이후에 투여되는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 신장 독소는 바람직하게는 파로모마이신(paromomycin), 토브라마이신(tobramycin), 겐타마이신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 카나마이신, 및 네오마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노글리코시드(aminoglycoside); 바람직하게는 암포테리신 B(amphotericin B) 및 플루시토신(flucytosine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항균제; 바람직하게는 요오드화 방사성 조영제 (iodinated radiocontrast media), 약 1.5:1의 분자비(molecule ratio)로 요오드를 갖는 고장성 조영제(high-osmolality contrast media, HOCM), 약 3:1의 분자비로 요오드를 갖는 저장성, 비이온성 조영제(low-osmolality, nonionic contrast media, LOCM), 및 약 6:1의 분자비로 요오드를 갖는 등장(등장성) 조영제[isosmolar (isoosmolality) contrast media, IOCM]로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조영제; 바람직하게는 아데포비르(adefovir), 시도포비르(cidofovir), 테노포비르(tenofovir), 및 포스카네트(foscarnet)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항레트로바이러스제(antiretroviral agent); 바람직하게는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 알킬화제(alkylating agent), 벤다무스틴(bendamustine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 테모졸로미드(temozolomide), melphalan(멜팔란), 항종양성 항생제(antitumor antibiotic), 미토마이신 C(mitomycin C), 벨로마이신(bleomycin), 안트라사이클린(anthracycline), 대사 길항물질(antimetabolite), 카페시타빈(capecitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트, 페메트렉시드(pemetrexed), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 젬시타빈(gemcitabine), 시타라빈(cytarabine), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 토포테칸(topotecan), 에토포시드(etoposide), 텍산(taxane), 이리노테칸(irinotecan), 레날리도마이드(lenalidomide), 에리불린(eribulin), 삼산화비소(arsenic trioxide), 또는 익사조밉(ixazomib)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암 (또는 화학요법-) 치료제; 바람직하게는 졸레드로네이트(zoledronate)/졸레드론산, 이반드로네이트(ibandronate), 알렌드로네이트(alendronate), 알렌드로네이트/콜레칼시페롤, 에티드로네이트(etidronate), 리세드로네이트(risedronate), 리세드로네이트 칼슘 카보네이트, 파미드로네이트(pamidronate), 및 틸루드로네이트(tiludronate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 비스포스포네이트(bisphosphonate), 또는 이의 유도체; 및/또는 바람직하게는 코카인 및 헤로인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마약 또는 오피오이드(opioid)를 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
69. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 단백질은 바람직하게는 F352V이 없고, 더욱 바람직하게는 F352이 있는 C370S; 및/또는 H193R 변이체 이외의 것 또는 H193을 포함하는 것인, 급성 신손상 또는 다른 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
70. 클로토 단백질을 암호화하는 유전자에서 동형 접합 또는 이형 접합 돌연변이를 갖는 노화 개인을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 70 중 하나에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그 보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드의 치료학적 농도를 투여하는 단계를 포함하는, 노화 개인을 치료하는 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는, 노화 개인을 치료하는 방법.
72. 제71항에 있어서, 상기 치료학적 농도를 투여하는 단계는 상기 유전자의 발현 수준에 의존하는 것인, 노화 개인을 치료하는 방법.
결론
전술한 상세한 설명이 구체적인 예시적 양태를 참조하나, 본 개시는 다른 구체적인 형태에서 이의 정신 또는 본질적인 특성에서 벗어나지 않고 구현될 수 있다. 따라서, 기술된 양태는 모든 측면에 있어서 단지 실례적인 것이고 제한적이지 않은 것으로서 고려될 것이다. 예를 들어, 관련 있는 기술분야 및 이 개시의 소지를 갖는 통상적 기술자에 발생할 수 있는 본 명세서에 기술되고/거나 도시된 진보적 특성들의 다양한 치환, 변형, 및/또는 변경, 및 본 명세서에 기술되고/거나 도시된 원리의 추가의 적용분야는 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 개시의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 양태를 기술하고/거나 도시할 수 있다. 이러한 치환, 변형, 및/또는 변경은 이 개시의 범위내에 있는 것으로 고려될 것이다.
본 발명의 범위는, 그러므로, 전술한 상세한 설명에 의하기 보다 첨부된 청구항에 의해 나타난다. 청구항에 나열된 제한은 청구항에서 사용된 언어에 기초하여 넓게 해석될 것이고 전술된 상세한 설명에서 기술된 특정한 실시예로 한정되는 것은 아니며, 실시예들은 한정적인 것이 아니며 철저한 것이 아닌 것으로 해석될 것이다. 청구항의 등가의 의미 및 범위내에서 오는 모든 변화들은 이들의 범위내에 포괄될 것이다.
특정 양태의 다양한 특징들이 본 개시의 다른 양태와 양립될 수 있고, 이와 합쳐질 수 있고, 이에 포함될 수 있고, 및/또는 이로 통합될 수 있음이 또한 인식될 것이다. 예를 들어, 본 개시의 특정 양태에 따른 시스템, 방법, 및/또는 제품은 본 명세서에 개시되고/거나 기술된 다른 양태에서 기술된 특징을 포함, 통합, 또는 다르게는 구성할 수 있다. 따라서, 본 개시의 구체적인 양태에 관한 특정 특징의 개시는 구체적인 양태에 대한 상기 특징의 적용분야 또는 포괄분야를 한정하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.
게다가, 특징이 특정한 양태에서 필요로 하는 것으로서 기술되지 않는 한, 다양한 양태에서 기술된 특징들은 선택적일 수 있고 본 개시의 다른 양태에 포함되지 않을 수 있다. 더욱이, 특징이 다른 특징을 이들의 조합에서 필요로 하는 것으로서 기술되지 않는 한, 본 명세서의 임의의 특징은 본 명세서에 개시된 동일하거나 다른 양태의 임의의 다른 특징과 합쳐질 수 있다. 특정 양태에서 특징이 선택적일 수 있는 반면, 특징이 이러한 양태에 포함되는 경우, 이들은 본 개시에 기술된 바와 같은 구체적인 구성을 갖는 것을 필요로 할 수 있음이 인지될 것이다.
마찬가지로, 청구항에서 나열된 및/또는 본 명세서에 기술된 임의의 방법 또는 과정에서 나열된 임의의 단계는 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있으며 다르게 (명백하게 또는 내재적으로) 명시되지 않는 한, 기술되고/거나 나열된 순서에 필연적으로 제한되는 것은 아니다. 그러나, 이러한 단계는 본 개시의 특정 양태에서 특정한 순서 또는 임의의 적합한 순서에서 수행되도록 또한 요구될 수 있다.
더욱이, 실시예의 측면이 불명료하게 되는 것을 피하기 위해, 실례적인 시스템, 방법, 제품 등등의 다양한 잘 알려진 측면이 본 명세서에 특히 상세하게 기술되지 않는다. 그러나, 이러한 측면들은 본 명세서에서 또한 고려된다
SEQUENCE LISTING <110> WNT Therapeutics, Inc. Tarsio, Joseph F. <120> Therapeutic Recombinant Klotho Protein and Compositions and Methods Involving the Same <130> 20781.1a <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1012 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg 20 25 30 Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro 35 40 45 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly 50 55 60 Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp 65 70 75 80 Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His 85 90 95 Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly 100 105 110 Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser 115 120 125 Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val 130 135 140 Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly 145 150 155 160 Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu 165 170 175 Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr 180 185 190 His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala 195 200 205 Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe 210 215 220 Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro 225 230 235 240 Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly 245 250 255 Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu 260 265 270 Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro 275 280 285 Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn 290 295 300 Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp 325 330 335 Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe 340 345 350 Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala 355 360 365 Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe 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cctgctggag cggctgcggg agctgggcgt gcagcccgtg 480 gtcaccctgt accactggga cctgccccag cgcctgcagg acgcctacgg cggctgggcc 540 aaccgcgccc tggccgacca cttcagggat tacgcggagc tctgcttccg ccacttcggc 600 ggtcaggtca agtactggat caccatcgac aacccctacg tggtggcctg gcacggctac 660 gccaccgggc gcctggcccc cggcatccgg ggcagcccgc ggctcgggta cctggtggcg 720 cacaacctcc tcctggctca tgccaaagtc tggcatctct acaatacttc tttccgtccc 780 actcagggag gtcaggtgtc cattgcccta agctctcact ggatcaatcc tcgaagaatg 840 accgaccaca gcatcaaaga atgtcaaaaa tctctggact ttgtactagg ttggtttgcc 900 aaacccgtat ttattgatgg tgactatccc gagagcatga agaataacct ttcatctatt 960 ctgcctgatt ttactgaatc tgagaaaaag ttcatcaaag gaactgctga cttttttgct 1020 ctttgctttg gacccacctt gagttttcaa cttttggacc ctcacatgaa gttccgccaa 1080 ttggaatctc ccaacctgag gcaactgctt tcctggattg accttgaatt taaccatcct 1140 caaatattta ttgtggaaaa tggctggttt gtctcaggga ccaccaagag agatgatgcc 1200 aaatatatgt attacctcaa aaagttcatc atggaaacct taaaagccat caagctggat 1260 ggggtggatg tcatcgggta taccgcatgg tccctcatgg atggtttcga gtggcacaga 1320 ggttacagca tcaggcgtgg actcttctat gttgactttc taagccagga caagatgttg 1380 ttgccaaagt cttcagcctt gttctaccaa aagctgatag agaaaaatgg cttccctcct 1440 ttacctgaaa atcagcccct agaagggaca tttccctgtg actttgcttg gggagttgtt 1500 gacaactaca ttcaagtaga taccactctg tctcagttta ccgacctgaa tgtttacctg 1560 tgggatgtcc accacagtaa aaggcttatt aaagtggatg gggttgtgac caagaagagg 1620 aaatcctact gtgttgactt tgctgccatc cagccccaga tcgctttact ccaggaaatg 1680 cacgttacac attttcgctt ctccctggac tgggccctga ttctccctct gggtaaccag 1740 tcccaggtga accacaccat cctgcagtac tatcgctgca tggccagcga gcttgtccgt 1800 gtcaacatca ccccagtggt ggccctgtgg cagcctatgg ccccgaacca aggactgccg 1860 cgcctcctgg ccaggcaggg cgcctgggag aacccctaca ctgccctggc ctttgcagag 1920 tatgcccgac tgtgctttca agagctcggc catcacgtca agctttggat aacgatgaat 1980 gagccgtata caaggaatat gacatacagt gctggccaca accttctgaa ggcccatgcc 2040 ctggcttggc atgtgtacaa tgaaaagttt aggcatgctc agaatgggaa aatatccata 2100 gccttgcagg ctgattggat agaacctgcc 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cccgcggctt ggatacctgg tggcccacaa cctgttgctc 720 gcgcatgcca aagtctggca cctgtacaac acctcgttcc ggccgaccca gggtggacaa 780 gtgtccatcg ccctgtcgtc acactggatc aacccgcgga gaatgaccga ccactccatc 840 aaggaatgcc agaagtccct cgatttcgtg ttgggctggt ttgccaagcc tgtgtttatt 900 gacggagact accccgagtc catgaagaac aacctgtcgt ctatcctgcc cgatttcact 960 gaatccgaga aaaagtttat caagggaacc gctgacttct tcgccctctg tttcggcccg 1020 accttgtcct tccaactgct cgatcctcat atgaagttcc ggcagctgga atcccctaac 1080 cttcgccagc tgctgtcctg gatcgacttg gaattcaacc acccgcagat cttcattgtc 1140 gagaacggct ggttcgtgtc cgggaccacc aagcgcgacg acgccaagta catgtattat 1200 ctcaaaaagt tcatcatgga aaccctcaag gccatcaaat tggatggcgt ggacgtgatc 1260 ggatatacgg cgtggagcct gatggacggt ttcgagtggc accgcggata cagcatccgc 1320 agaggactct tctacgtgga cttcctgtcg caagacaaga tgctgctgcc taagagcagc 1380 gcgctgttct accaaaagct cattgagaag aacgggttcc cgcccctgcc ggagaaccag 1440 cctctggaag ggaccttccc ttgcgacttc gcctggggag tggtcgacaa ctacattcaa 1500 gtgtcccagc ttactaagcc aatcagcagc ctgactaagc cataccac 1548 <210> 93 <211> 2838 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 ggcgacggcg cccagacctg ggcccgggtg tcgaggccgc cagcgcccga ggccgccgga 60 ctgttccagg gaaccttccc tgatgggttc ctctgggccg tgggctcagc cgcataccag 120 accgaggggg gctggcagca gcacggaaag ggcgccagca tatgggacac gttcacccac 180 cacccgctgg ctccgcccgg ggactccaga aacgcctcct tgcccctcgg tgctccttcg 240 ccactgcaac ccgcaaccgg cgacgtggcc agcgattcat acaacaacgt gttccgggac 300 accgaggccc tgagggaact gggagtgact cactaccgct tttcgatctc ctgggcacgc 360 gtgctcccga acggatcggc gggagtgccg aatcgcgagg gcctgcggta ctaccgacgg 420 ctgctggaaa ggctcagaga actgggcgtg cagcctgtcg tgactcttta ccactgggat 480 ctgccccaac ggctgcagga tgcttacggg ggatgggcca atagagccct ggctgatcac 540 ttccgcgact acgccgaatt gtgcttccgg cacttcggtg gccaagtcaa gtactggatt 600 accatcgaca acccatacgt cgtggcgtgg cacggatacg caaccggtcg gctggcccct 660 ggtattcgcg ggtccccgcg gcttggatac ctggtggccc acaacctgtt gctcgcgcat 720 gccaaagtct ggcacctgta caacacctcg ttccggccga cccagggtgg acaagtgtcc 780 atcgccctgt cgtcacactg gatcaacccg cggagaatga ccgaccactc catcaaggaa 840 tgccagaagt ccctcgattt cgtgttgggc tggtttgcca agcctgtgtt tattgacgga 900 gactaccccg agtccatgaa gaacaacctg tcgtctatcc tgcccgattt cactgaatcc 960 gagaaaaagt ttatcaaggg aaccgctgac ttcttcgccc tctgtttcgg cccgaccttg 1020 tccttccaac tgctcgatcc tcatatgaag ttccggcagc tggaatcccc taaccttcgc 1080 cagctgctgt cctggatcga cttggaattc aaccacccgc agatcttcat tgtcgagaac 1140 ggctggttcg tgtccgggac caccaagcgc gacgacgcca agtacatgta ttatctcaaa 1200 aagttcatca tggaaaccct caaggccatc aaattggatg gcgtggacgt gatcggatat 1260 acggcgtgga gcctgatgga cggtttcgag tggcaccgcg gatacagcat ccgcagagga 1320 ctcttctacg tggacttcct gtcgcaagac aagatgctgc tgcctaagag cagcgcgctg 1380 ttctaccaaa agctcattga gaagaacggg ttcccgcccc tgccggagaa ccagcctctg 1440 gaagggacct tcccttgcga cttcgcctgg ggagtggtgg acaactacat ccaggtcgat 1500 accactctga gccagttcac cgacctgaac gtgtacctgt gggacgtgca tcacagcaag 1560 aggctcatta aggtcgacgg agtggtcacc aagaagagaa agtcgtactg cgtggatttc 1620 gccgcaatcc agccacagat cgccctgctg caagagatgc acgtgaccca tttccgcttc 1680 tccctggatt gggccctgat tctcccgctg gggaaccagt cgcaagtgaa ccacactatc 1740 ctgcaatact accggtgcat ggcttccgag ctcgtccgcg tgaatatcac ccccgtggtg 1800 gcgctctggc agcctatggc cccgaaccag ggactgccac gactgctggc cagacaggga 1860 gcgtgggaaa acccgtacac agcactggcc tttgcggagt acgcccggct gtgcttccag 1920 gaacttgggc atcacgtcaa gctttggatt actatgaacg aaccctacac taggaacatg 1980 acttactcag ccggacataa ccttctgaag gcacacgccc tcgcttggca cgtgtacaac 2040 gaaaagttca gacacgctca gaacggaaag atttccatcg cgctgcaagc agactggatc 2100 gagcccgcct gccctttctc ccaaaaagac aaggaagtgg ccgaacgggt gctggaattc 2160 gacatcggat ggctggccga acccatcttc ggctccggcg attatccatg ggtcatgcgg 2220 gactggctca accagcgcaa caactttttg ctgccatact tcaccgaaga tgagaagaag 2280 ctgatccagg gcacctttga tttcctggcg ctgagccact acactacgat tctggtggac 2340 agcgaaaagg aggacccgat taagtacaac gactacctgg aagtccagga aatgaccgat 2400 attacttggc tgaactcacc tagccaagtg gcggtggtgc cttggggact gagaaaggtc 2460 ctcaactggc tcaaattcaa atacggagat ctgcccatgt acatcatctc caatgggatc 2520 gacgacggcc tgcatgctga ggacgatcag ctccgcgtgt actatatgca gaactacatt 2580 aacgaggcac tgaaggccca tattctggac ggcattaacc tctgcggtta ttttgcctac 2640 tcgttcaacg accggactgc cccccgcttc gggttgtacc gctacgccgc ggatcagttt 2700 gagccaaagg cctccatgaa gcattaccgc aagatcattg attccaatgg atttccgggc 2760 cccgaaaccc tcgaacggtt ctgtccggaa gagttcaccg tgtgtaccga gtgctccttc 2820 tttcacaccc gcaagagc 2838 <210> 94 <211> 1542 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 ggcgacggcg cacagacctg ggcccggttc tcacgccccc cggccccgga agccgccgga 60 ctgtttcagg gaaccttccc cgacggattc ctgtgggccg tgggtagcgc ggcgtaccag 120 actgagggcg gatggcagca gcacggaaag ggagcctcaa tttgggatac tttcactcat 180 catcccctcg ccccgccggg ggattcgcgg aacgcctccc tccccctggg tgctcctagc 240 ccgctgcagc cagccaccgg cgacgtggca tccgacagct acaacaacgt gttccgggac 300 accgaggccc tgagggaact gggagtgact cactaccgct tttcgatctc ctgggcacgc 360 gtgctcccga acggatcggc gggagtgccg aatcgcgagg gcctgcggta ctaccgacgg 420 ctgctggaaa ggctcagaga actgggcgtg cagcctgtcg tgactcttta ccactgggat 480 ctgccccaac ggctgcagga tgcttacggg ggatgggcca atagagccct ggctgatcac 540 ttccgcgact acgccgaatt gtgcttccgg cacttcggtg gccaagtcaa gtactggatt 600 accatcgaca acccatacgt cgtggcgtgg cacggatacg caaccggtcg gctggcccct 660 ggtattcgcg ggtccccgcg gcttggatac ctggtggccc acaacctgtt gctcgcgcat 720 gccaaagtct ggcacctgta caacacctcg ttccggccga cccagggtgg acaagtgtcc 780 atcgccctgt cgtcacactg gatcaacccg cggagaatga ccgaccactc catcaaggaa 840 tgccagaagt ccctcgattt cgtgttgggc tggtttgcca agcctgtgtt tattgacgga 900 gactaccccg agtccatgaa gaacaacctg tcgtctatcc tgcccgattt cactgaatcc 960 gagaaaaagt ttatcaaggg aaccgctgac ttcttcgccc tctgtttcgg cccgaccttg 1020 tccttccaac tgctcgatcc tcatatgaag ttccggcagc tggaatcccc taaccttcgc 1080 cagctgctgt cctggatcga cttggaattc aaccacccgc agatcttcat tgtcgagaac 1140 ggctggttcg tgtccgggac caccaagcgc gacgacgcca agtacatgta ttatctcaaa 1200 aagttcatca tggaaaccct caaggccatc aaattggatg gcgtggacgt gatcggatat 1260 acggcgtgga gcctgatgga cggtttcgag tggcaccgcg gatacagcat ccgcagagga 1320 ctcttctacg tggacttcct gtcgcaagac aagatgctgc tgcctaagag cagcgcgctg 1380 ttctaccaaa agctcattga gaagaacggg ttcccgcccc tgccggagaa ccagcctctg 1440 gaagggacct tcccttgcga cttcgcctgg ggagtggtcg acaactacat tcaagtgtcc 1500 cagcttacta agccaatcag cagcctgact aagccatacc ac 1542 <210> 95 <211> 2553 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 aacgtgttcc gggacaccga ggccctgagg gaactgggag tgactcacta ccgcttttcg 60 atctcctggg cacgcgtgct cccgaacgga tcggcgggag tgccgaatcg cgagggcctg 120 cggtactacc gacggctgct ggaaaggctc agagaactgg gcgtgcagcc tgtcgtgact 180 ctttaccact gggatctgcc ccaacggctg caggatgctt acgggggatg ggccaataga 240 gccctggctg atcacttccg cgactacgcc gaattgtgct tccggcactt cggtggccaa 300 gtcaagtact ggattaccat cgacaaccca tacgtcgtgg cgtggcacgg atacgcaacc 360 ggtcggctgg cccctggtat tcgcgggtcc ccgcggcttg gatacctggt ggcccacaac 420 ctgttgctcg cgcatgccaa agtctggcac ctgtacaaca cctcgttccg gccgacccag 480 ggtggacaag tgtccatcgc cctgtcgtca cactggatca acccgcggag aatgaccgac 540 cactccatca aggaatgcca gaagtccctc gatttcgtgt tgggctggtt tgccaagcct 600 gtgtttattg acggagacta ccccgagtcc atgaagaaca acctgtcgtc tatcctgccc 660 gatttcactg aatccgagaa aaagtttatc aagggaaccg ctgacttctt cgccctctgt 720 ttcggcccga ccttgtcctt ccaactgctc gatcctcata tgaagttccg gcagctggaa 780 tcccctaacc ttcgccagct gctgtcctgg atcgacttgg aattcaacca cccgcagatc 840 ttcattgtcg agaacggctg gttcgtgtcc gggaccacca agcgcgacga cgccaagtac 900 atgtattatc tcaaaaagtt catcatggaa accctcaagg ccatcaaatt ggatggcgtg 960 gacgtgatcg gatatacggc gtggagcctg atggacggtt tcgagtggca ccgcggatac 1020 agcatccgca gaggactctt ctacgtggac ttcctgtcgc aagacaagat gctgctgcct 1080 aagagcagcg cgctgttcta ccaaaagctc attgagaaga acgggttccc gcccctgccg 1140 gagaaccagc ctctggaagg gaccttccct tgcgacttcg cctggggagt ggtggacaac 1200 tacatccagg tcgataccac tctgagccag ttcaccgacc tgaacgtgta cctgtgggac 1260 gtgcatcaca gcaagaggct cattaaggtc gacggagtgg tcaccaagaa gagaaagtcg 1320 tactgcgtgg atttcgccgc aatccagcca cagatcgccc tgctgcaaga gatgcacgtg 1380 acccatttcc gcttctccct ggattgggcc ctgattctcc cgctggggaa ccagtcgcaa 1440 gtgaaccaca ctatcctgca atactaccgg tgcatggctt ccgagctcgt ccgcgtgaat 1500 atcacccccg tggtggcgct ctggcagcct atggccccga accagggact gccacgactg 1560 ctggccagac agggagcgtg ggaaaacccg tacacagcac tggcctttgc ggagtacgcc 1620 cggctgtgct tccaggaact tgggcatcac gtcaagcttt ggattactat gaacgaaccc 1680 tacactagga acatgactta ctcagccgga cataaccttc tgaaggcaca cgccctcgct 1740 tggcacgtgt acaacgaaaa gttcagacac gctcagaacg gaaagatttc catcgcgctg 1800 caagcagact ggatcgagcc cgcctgccct ttctcccaaa aagacaagga agtggccgaa 1860 cgggtgctgg aattcgacat cggatggctg gccgaaccca tcttcggctc cggcgattat 1920 ccatgggtca tgcgggactg gctcaaccag cgcaacaact ttttgctgcc atacttcacc 1980 gaagatgaga agaagctgat ccagggcacc tttgatttcc tggcgctgag ccactacact 2040 acgattctgg tggacagcga aaaggaggac ccgattaagt acaacgacta cctggaagtc 2100 caggaaatga ccgatattac ttggctgaac tcacctagcc aagtggcggt ggtgccttgg 2160 ggactgagaa aggtcctcaa ctggctcaaa ttcaaatacg gagatctgcc catgtacatc 2220 atctccaatg ggatcgacga cggcctgcat gctgaggacg atcagctccg cgtgtactat 2280 atgcagaact acattaacga ggcactgaag gcccatattc tggacggcat taacctctgc 2340 ggttattttg cctactcgtt caacgaccgg actgcccccc gcttcgggtt gtaccgctac 2400 gccgcggatc agtttgagcc aaaggcctcc atgaagcatt accgcaagat cattgattcc 2460 aatggatttc cgggccccga aaccctcgaa cggttctgtc cggaagagtt caccgtgtgt 2520 accgagtgct ccttctttca cacccgcaag agc 2553 <210> 96 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 aacgtgttcc gggacaccga ggccctgagg gaactgggag tgactcacta ccgcttttcg 60 atctcctggg cacgcgtgct cccgaacgga tcggcgggag tgccgaatcg cgagggcctg 120 cggtactacc gacggctgct ggaaaggctc agagaactgg gcgtgcagcc tgtcgtgact 180 ctttaccact gggatctgcc ccaacggctg caggatgctt acgggggatg ggccaataga 240 gccctggctg atcacttccg cgactacgcc gaattgtgct tccggcactt cggtggccaa 300 gtcaagtact ggattaccat cgacaaccca tacgtcgtgg cgtggcacgg atacgcaacc 360 ggtcggctgg cccctggtat tcgcgggtcc ccgcggcttg gatacctggt ggcccacaac 420 ctgttgctcg cgcatgccaa agtctggcac ctgtacaaca cctcgttccg gccgacccag 480 ggtggacaag tgtccatcgc cctgtcgtca cactggatca acccgcggag aatgaccgac 540 cactccatca aggaatgcca gaagtccctc gatttcgtgt tgggctggtt tgccaagcct 600 gtgtttattg acggagacta ccccgagtcc atgaagaaca acctgtcgtc tatcctgccc 660 gatttcactg aatccgagaa aaagtttatc aagggaaccg ctgacttctt cgccctctgt 720 ttcggcccga ccttgtcctt ccaactgctc gatcctcata tgaagttccg gcagctggaa 780 tcccctaacc ttcgccagct gctgtcctgg atcgacttgg aattcaacca cccgcagatc 840 ttcattgtcg agaacggctg gttcgtgtcc gggaccacca agcgcgacga cgccaagtac 900 atgtattatc tcaaaaagtt catcatggaa accctcaagg ccatcaaatt ggatggcgtg 960 gacgtgatcg gatatacggc gtggagcctg atggacggtt tcgagtggca ccgcggatac 1020 agcatccgca gaggactctt ctacgtggac ttcctgtcgc aagacaagat gctgctgcct 1080 aagagcagcg cgctgttcta ccaaaagctc attgagaaga acgggttccc gcccctgccg 1140 gagaaccagc ctctggaagg gaccttccct tgcgacttcg cctggggagt ggtcgacaac 1200 tacattcaag tgtcccagct tactaagcca atcagcagcc tgactaagcc ataccac 1257 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA_GS_linker1 <400> 97 gggggtggcg gaagcggtgg cggaggaagc 30 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA_GS_Linker_iso2 <400> 98 ggcgggggag ggtcgggcgg aggcggatcc 30 <210> 99 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA_ IgG1_noCH1_Fc_Fusion <400> 99 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtca gcaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagtcc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 100 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA_Synthetic_SS <400> 100 atggctcggc tgacagtcct ggccctgctg gctggtctgc tggcgtcctc gagggcc 57 <210> 101 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA_TwinStrep_tag <400> 101 ggcggagaaa acctttactt ccaatcctct gcctggagcc acccccagtt tgaaaagggc 60 ggcggctcag ggggcggatc cgggggatca tccgcctggt cccatccgca attcgagaag 120

Claims (10)

  1. SEQ ID NO: 40에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 상동성을 갖는, 합성 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 합성 단백질은 SEQ ID NO: 40에 대해 적어도 95% 아미노산 서열 상동성을 갖는 것인, 합성 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 합성 단백질은 급성 신손상, 만성 신부전, 또는 노화와 관련된 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 합성 단백질.
  4. 복수의 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포들을 포함하는 세포주로서,
    상기 CHO 세포들은, 프로모터를 포함하고 제1항 또는 제2항의 합성 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유하는 것인, 세포주.
  5. 제4항에 있어서, 상기 합성 단백질은 급성 신손상, 만성 신부전, 또는 노화와 관련된 병태, 질병, 또는 질환을 치료하는데 효과적인 것인, 세포주.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 CHO 세포들은:
    디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)-결실 CHO 세포들이되, 상기 외인성 핵산은 기능성 디히드로엽산 환원효소(DHFR)를 추가로 암호화하거나,
    글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS)-결실 CHO 세포들이되, 상기 외인성 핵산은 기능성 글루타민 합성효소 (GS) 효소를 추가로 암호화하는 것인, 세포주.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CHO 세포들은 세포 당 상기 외인성 핵산의 적어도 10 카피를 함유하거나 함유하도록 선택되는 것인, 세포주.
  8. 현탁 세포 배양액으로서,
    액체 배지, 무혈청 액체 배지, 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 액체 배지로서, 이때, 상기 액체 배지는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하는 것인, 액체 배지, 무혈청 액체 배지, 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 액체 배지; 및
    제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세포주로서, 상기 세포주는 액체 배지에서 성장하여 상기 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 재조합 클로토 단백질을 포함하는 것인, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세포주;를 포함하는, 현탁 세포 배양액.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 CHO 세포들은 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 농축 없이, 액체 배지 1 리터당 200 - 500 mg, 500 - 2000 mg, 또는 2000 - 5000 mg의 폴리펩티드 또는 단백질 농도로 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 상기 액체 배지 내로 분비하고; 및/또는
    상기 폴리펩티드 또는 단백질은, 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 농축 없이, 액체 배지 1 리터당 200 - 500 mg, 500 - 2000 mg, 또는 2000 - 5000 mg의 폴리펩티드 또는 단백질 농도로 상기 액체 배지 내에 존재하는 것인, 현탁 세포 배양액.
  10. 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 세포주를 성장시키는 단계를 포함하고, 상기 세포주는 액체 배지, 무혈청 액체 배지, 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 액체 배지에서 성장하고, 이때 상기 액체 배지는 탄소원, 질소원, 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보충물, 또는 첨가물을 포함하며, 상기 CHO 세포들은 상기 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 재조합 클로토 단백질을 포함하는 것인, 재조합 클로토 단백질을 제조하는 방법.
KR1020237028237A 2016-06-02 2017-06-02 치료학적 재조합 클로토 단백질 및 이를 수반하는 조성물및 방법 KR20230125857A (ko)

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