DE69229597T2

DE69229597T2 - Wachstumsfaktor-ligand, der an den erbb-2-rezeptor bindet und die zellulären reaktionen induziert

Info

Publication number: DE69229597T2
Application number: DE69229597T
Authority: DE
Inventors: Marc Lippman; Ruth Lupu
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1991-01-14
Filing date: 1992-01-13
Publication date: 2000-05-04
Anticipated expiration: 2012-01-14
Also published as: NZ241292A; EP0574414B1; ATE182152T1; AU5601896A; DE69229597D1; JPH06505011A; DE69229597T4; KR930703359A; EP0574414A4; AU1227792A; CA2100549A1; WO1992012174A1; EP0574414A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Liganden-Wachstumsfaktorrezeptor-Wechselwirkungen sowie die zellulären Reaktionen, welche durch solche Wechselwirkungen induziert werden. Insbesondere wird ein Ligand beschrieben, welcher in der Lage ist, ausschließlich an das erbB-2-Transmembranprotein zu binden. Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich anti-Ligandenmoleküle, welche in der Lage sind, das erbB-2-Ligandenmolekül zu erkennen und zu binden, sowie Screeningtests für solche Liganden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen für den erbB-2-Liganden, die anti-Ligandenmoleküle und den Screeningtest. Weiterhin betrifft die Erfindung ein kloniertes Gen, welches in der Lage ist, den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.

Hintergrund der Erfindung

Liganden des transformierenden Wachstumsfaktors gehören zu einer Familie von wärme- und säurestabilen Polypeptiden, welche es Zellen ermöglichen, eine transformierte Morphologie anzunehmen und bei verankerungsunabhängigen Wachstumstests progressiv wachsende Kolonien zu bilden (DeLarco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4001-4005 (1978); Moses et al., Cancer Res. 41: 2842-2848 (1981); Ozanne et al., J. Cell. Physiol. 105: 163-180 (1980); Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3494-3498 (1980)). Eine proteinartige Substanz, welche durch p185 gebunden werden kann, die das Wachstum von p185-exprimierenden Zellen beeinflußt, ist aus der WO91/15230 bekannt. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und seine physiologischen Liganden, der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der transformierende Wachstumsfaktor α (TGFα), spielen eine wichtige Rolle bei der Wachstumsregulation von vielen normalen und bösartigen Zelltypen (Carpenter G., Annu. Rev.. Biochem. 56: 881-914 (1987)).
Eine Rolle, welche das EGF-Rezeptorsystem bei dem onkogenen Wachstum von Zellen spielen kann, liegt in dem autokrin stimulierten Wachstum. Wenn Zellen den EGFR exprimieren und EGF und/oder TGFα sezernieren, dann könnten solche Zellen ihr eigenes Wachstum stimulieren. Da einige menschliche Brustkrebs-Zellinien und Tumoren EGFR exprimieren (Osborne et al., J. Clin. Endo. Metab. 55: 86-93 (1982); Fitzpatrick et al., Cancer Res. 44: 3442-3447 (1984); Filmus et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 128: 898-905 (1985); Davidson et al., Mol. Endocrinol 1: 216-223 (1987); Sainsbury et al., Lancet i: 1398-1402 (1987); Perez et al., Cancer Res. Treat. 4: 189-193 (1984)) und TGFα sezernieren (Bates et al., Cancer Res. 46: 1707-1713 (1986); Bates et al., Mol. Endocrinol 2: 543-555 (1988)), wurde bei Brustkrebs ein autokriner wachstumsstimulierender Weg vorgeschlagen (Lippman et al., Breast Cancer Res. Treat. 7: 59- 70 (1986)).
Ein analoger autokriner wachstumsstimulierender Weg, welcher für den epidermalen Wachstumsiaktorrezeptor und seine Liganden vorgeschlagen wurde, kann ebenfalls über eine wachsende Liste von Onkogen-codierten Transmembranproteinen eingeschlagen werden, welche eine Struktur aufweisen, die an Wachstumsfaktorrezeptoren erinnert. Diese Liste schließt die Protoonkogene neu und sein menschliches Äquivalent erbB-2 oder HER2 (Bargmann et al., Nature 319: 226- 229 (1986); Coussens et al., Science 230: 1131-1139 (1985); Yamamoto et al., Nature 319: 230-234 (1986); c-kit (Yarden et al., EMBO 6: 341-351 (1987); ros (Neckameyer et al., Mol. Cell. Biol. 6: 1478-1486 (1986); met (Park et al., PNAS 84: 6379-6383 (1987); trk (Martin-Zanca et al., Nature 319: 743-748 (1986); und ret (Takahashi et al., Mol. Cell. Biol. 7: 1378-1385 (1987)) ein. Die erbB-2- und c-kit-Pro toonkogene codieren Faktoren, welche eine bemerkenswerte strukturelle Homologie mit EGFR zeigen (Yarden et al., Annu. Rev. Biochem. 57: 443-478 (1988)). Obwohl erbB-2 und sein verwandtes Onkogen neu mit EGFR verwandt sind, sind diese Proteine verschieden. Beispielsweise binden bekannte EGFR-Liganden wie z. B. EGF und TGFα nicht an den erbB-2- Rezeptor (King et al., EMBO 7: 1647 (1988); und Stern et al., EMBO 7: 995 (1988)).
Wenn gemäß dem autokrinen wachstumsstimulierenden Weg bösartige Zellen in der Lage sind, einen wirksamen Tumorwachstumsfaktor in vivo zu sezernieren, ist es plausibel, daß der Wachstumsfaktorligand, sehr ähnlich wie menschliches Choriongonadotropin oder α-Fetoprotein, in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden könnte und als ein Tumormarker und eine prognostische Variable verwendet werden könnte. Untersuchungen legen nahe, daß die TGFα-Aktivität in Körperflüssigkeiten von Krebspatienten nachgewiesen werden kann und daß deren Vorliegen eine wichtige Information liefern kann, was die Biologie des Tumors eines Patienten betrifft (Stromberg et al., J. Cell. Biochem. 32: 247-259 (1986); Twardzick et al., J. Natl. Cancer Inst. 69: 793-798 (1982); Sherwin et al., Cancer Res. 43: 403-407 (1983)). Eine Amplifizierung des erbB-2-Protoonkogens wurde in Brust-, Eierstock-, Magen-, Speicheldrüsen- und nicht kleinzelligen Karzinomen der Lunge gefunden (King et al., Science 229: 974 (1985); Slamon et al., Science 244: 707 (1989); Yokota et al., Lancet 1: 765 (1986); Fukushige et al., Mol. Cell. Biol. 6: 955 (1986); Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6497 (1985); Weiner et al., Cancer Res. 50: 421 (1990)). Es wurde gefunden, daß eine Amplifizierung und/oder Überexpression des erbB-2-Protoonkogens mit einer schlechten Prognose bei Brust-, Eierstock- und nicht kleinzelligen Lungenkarzinomen zusammenhängt (Slamon et al., Science 235: 177 (1986); Slamon et al., Science 244: 707 (1989); Guerin et al., Oncogene Research 3: 21 (1988); Wright et al., Cancer Res. 49: 2087 (1989); Kern et al., Cancer Res. 50: 5184 (1990); DiFiore et al., Science 237: 178 (1987)). Zusätzlich zu diesen klinischen Untersuchungen legen in vitro-Untersuchungen sehr stark nahe, daß eine Überexpression des erbB-2-Transmembranrezeptors (p185erbB-2) eine wichtige Rolle bei der Weiterentwicklung des Tumors spielen könnte (DiFiore et al., Science 237: 178 (1987); Hudziak et al., Proc. Natl. Sci. USA 84: 7159 (1987)).
Obwohl Liganden für EGFR bekannt sind, nämlich EGF und TFGα, wurden wenige Liganden für die Onkogen-codierenden Transmembranproteine wie z. B. erbB-2, ros, met usw. charakterisiert. Lupu et al., Science 249: 1552-1555 (1990), identifizierten ein Glykoprotein mit 30 Kilodalton (kDa) (gp30), welches TRFα in seiner Fähigkeit ähnelt, an den EGFR zu binden, EGFR zu phosphorylieren und eine Koloniebildung zu induzieren. Eine direkte Bindung des gp30 an p185erbB-2 wurde durch Bindungsverdrängungsexperimente bestätigt, was nahelegt, daß gp30 ein Ligand für p185erbB-2 ist, Somit identifizierten und charakterisierten Lupu et al. einen 30 kDa-Liganden, welcher sowohl den EGFR- als auch den erbB-2-Rezeptor bindet.
Derzeit ist kein Ligand bekannt, welcher an das erbB-2- Transmembranprotein (p185erbB-2) bindet, nicht aber mit EGFR reagiert. Ein solcher Ligand wäre wichtig, um die Funktion von p185erbB-2 zu verstehen, und könnte ein mögliches therapeutisches und diagnostisches Ziel für eine Neoplasie sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein im wesentlichen reines Protein, wobei das Protein: die Mab 4D5-abhängige Inhibition der erbB-2-überexprimierenden Zellen umkehrt; die antiproliferative Wirkung der löslichen extrazellulären erbB-2-Domäne (ECD) umkehrt; die Zellproliferation und die Koloniebildung der Zellen, welche erba-2 überexprimieren, hemmt; ein scheinbares Molekulargewicht, gemessen durch SDS PAGE, von ca. 75 kDa aufweist; in der Lage ist, die Phosphorylierung von p185erbB-2 zu induzieren; und EGFR nicht bindet. Verfahren zum Erhalten der gereinigten Liganden der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Die Erfindung betrifft zusätzlich anti-Ligandenmoleküle wie z. B. Antikörper oder Fragmente von Antikörpern und blockierende Peptide, welche an den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung binden. Ein Verfahren, um mit diesen anti-Ligandenmolekülen das Vorliegen von Zellen nachzuweisen, welche den erbB-2-Liganden exprimieren, wird ebenfalls offenbart. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erbB-2-Liganden, um Zellen nachzuweisen, die das p185erbB-2 Transmembranprotein exprimieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes DNA- Molekül, welches für ein Gen codiert, das in der Lage ist, den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, und Wirtszellen, welche ein solches rekombinantes DNA- Molekül enthalten.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur Behandlung einer Vielzahl von Krebsarten, welche mit einer Überexpression des erbB-2-Transmembranproteins verbunden sind, einschließlich Brust-, Eierstock-, Magen-, Lungen-, Prostata-, Speicheldrüsen- und Schilddrüsenkarzinomen, gerichtet.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proben, die von einer Affinitätssäule eluiert wurden, welche mit der extrazellulären p185erbB-2 Domäne gekoppelt war. Die extrazelluläre erbB-2-Domäne (ECD) wurde an Poly acrylamid-Hydrazid-Sepharosekügelchen (Sigma) gekoppelt. Nach gründlichen Wäschen der Kügelchen (5 Volumina) mit eiskalter 1,0 M HCl wurden die Kügelchen mit 0,5 M NaNO&sub2; (1 Volumen) aktiviert. Die Temperatur wurde für 15-20 Minuten bei 0ºC gehalten, dann wurden die Kügelchen auf einem Sinterglastrichter filtriert und mit eiskalter 0,1 M HCl gewaschen. Die Kügelchen wurden sofort mit 0,1 M Sulfaminsäure und dann mit eiskaltem Wasser gewaschen und in 0,2 M NaHCO&sub3;, pH 6,0 (10 Volumina) resuspendiert. Die Prozente der ECD, welche an die Sepharosekügelchen banden, lagen zwischen 90-98%. 1,0 ml des Gels wurden auf eine Econo- Säule (Biorad, Richmond, CA) geladen und mit ca. 100 Volumina der Kügelchen an PBS gewaschen. Nachdem die Säule gepackt war, wurden konditionierte Medien, die von menschlichen SK-Br-3-Brustkrebszellen stammten, mittels Schwerkraft durch die Kügelchen laufen gelassen (Flußgeschwindigkeit 30 ml/h). Die Säule wurde dann mit 5 Volumina PBS gewaschen und schrittweise mit 1,0 M Zitronensäure bei unterschiedlichen pHs (von 4,0 bis 2,0) eluiert. Gewöhnlich wurden von jeder pH-Lösung 10 Bettvolumina eingesetzt. Alle Fraktionen wurden auf PD10-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) entsalzt, bevor ihre biologische Aktivität getestet wurde. Aliquots der Ausgangsmedien und der Fraktionen, welche eine Aktivität enthielten, wurden durch eine 10% SDS- PAGE analysiert, worauf eine Silberfärbung folgte. Bahn 3 zeigt nichtkonzentriertes konditioniertes Medium von SK-Br- 3-Zellen. Bahn 2 stellt die Elution bei pH 3,0 dar, Bahn 1 stellt die Elution bei pH 3,5 dar. Die Größen sind in Kilodalton gezeigt.
Fig. 2 zeigt den Nachweis von phosphorylierten Proteinen aus Zellen, die in Gegenwart von gp30 oder p75 inkubiert wurden. Das Kontrollmedium enthielt diese Ligandenmoleküle nicht.
Fig. 2A: MDA MB-453-Zellen wurden bis zu einer 90%igen Konfluenz in Platten mit 24 Vertiefungen (Costar) wachsen gelassen. Die Zellen wurden für 20 Minuten bei 37ºC mit Kontrollmedium, welches 20 mM Hepes, pH 7,4, enthielt (Bahn 1), Kontrollmedium, welches 5 ng/ml gp30 enthielt (Bahn 2), Kontrollmedium, welches 4 ng/ml p75 enthielt (Bahn 3), Kontrollmedium, welches 8 ng/ml p75 enthielt (Bahn 4), und Kontrollmedium, welches 2 ng/ml p75 enthielt (Bahn 5), behandelt. Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden in 100 ul Probenpuffer lysiert, welcher 1% SDS, 0,1% β- Mercaptoethanol, 0,15 M Tris-HCl (pH 6,8), 10% Glycerol, 0,02% Bromphenolblau, 1 mM EDTA, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 24 mM Leupeptin enthielt. Nach 5 Minuten bei 95ºC wurden 50 ug des Proteins auf eine 7,5% SDS-PAGE geladen. Die Proteine wurden dann durch eine Elektrophorese nach einem modifizierten Verfahren nach Towbin et al., PNAS 76, 4350 (1987), auf eine Nitrocellulosemembran zum Immunoblotten (Hoeffer Scientific Instruments, California) überführt, wobei eine Elektrophorese-Transfereinheit von Hoeffer verwendet wurde (Hoeffer, Model-Nr. TE 22). Der elektrophoretische Transfer wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde bei 125 mA in einem Puffer durchgeführt, welcher 25 mM Glycin, 129 mM Tris (pH 8,3) und 20% Methanol enthielt. Nach dem Transfer wurde der Filter mit 5% BSA in Trisgepufferter Salzlösung, welche 0,5% Tween 20 enthielt, blockiert. Ein Antiphosphotyrosin-Antikörper (Amersham) reagierte mit den immobilisierten Proteinen in 5% BSA (Sigma RIA-Grad). Immunkomplexe wurden über einen Ziegenanti-Mäuse-Antikörper nachgewiesen, welcher mit alkalischer Phosphatase konjugiert war. Die Blots wurden dann mit einer Farbentwicklungssubstratlösung inkubiert, welche NBT und BCIP (Promega) enthielt.
Fig. 2B: MDA MB-453-Zellen wurden bis zu einer 80%igen Konfluenz in Platten mit 24 Vertiefungen (Costar) wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann zweimal mit PO&sub4;-freiem Kulturmedium, [PO&sub4;]-freiem MEM (GIBCO), mit 10% PO&sub4;-freiem dialysiertem fötalem Kalbsserum (FCS) und 2 mM Glutamin, gewaschen. Die Zellen wurden dann für 24 Std. in 3 ml/Ver tiefung an PO&sub4;-freiem Kulturmedium wachsen gelassen, anschließend wurde die Säule des Mediums auf 1,0 ml/Vertiefung eingestellt und 0,5 mCi [³²Pi]/Vertiefung wurden zugegeben, und die Zellen wurden für 6 Std. inkubiert. Die Zellen wurden für 20 Minuten bei 37ºC mit Kontrollmedium (Bahn 1), Kontrollmedium, das 2,0 ng/ml gp30 enthielt (Bahn 2), Kontrollmedium, das 4,0 ng/ml p75 enthielt (Bahn 3), Kontrollmedium, das 8,0 ng/ml p75 enthielt (Bahn 4), und Kontrollmedium, das 2,0 ng/ml p75 enthielt (Bahn 5), behandelt. Nach der Inkubation wurden die Kulturschalen über ein Eisbad gestellt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS bei 4ºC für 10 Minuten mit 200 ul/Vertiefung Lysepuffer (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1,0% Triton x-100, 1 mM EGTA, 5 mM EDTA, 10% Glycerol, 0,2 mM Natriumorthovanadat, 0,5 mM PMSF, 20 ug/ml Leupeptin und 5 mM ATP, End-pH 7,5) gewaschen. Das Zellysat wurde bei 10.000 g für 1 Minute bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 10 ul normalem Kaninchenserum (NRS) für 1 Std. bei 4ºC inkubiert, und die nichtspezifischen Komplexe wurden unter Verwendung von Protein A-Sepharose (Sigma) abgeschieden. Der Überstand wurde mit einem polyklonalen Antikörper gegen die C-terminale erbB-2-Sequenz inkubiert, Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7159 (1987). Die spezifischen Komplexe wurden mit Protein A-Sepharose (Sigma) gefällt, und die Pellets wurden dreimal mit Lysepuffer gewaschen, und das Pellet wurde dann in 50 ul Probenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% Glycerol, 0,1% Bromphenolblau und 5% beta- Mercaptoethanol) resuspendiert. Nach 5 Minuten bei 95ºC wurden die Proben auf eine 7,5% SDS-PAGE geladen.
Fig. 2C: MDA MB-468-Zellen wurden bis zu einer 80%igen Konfluenz in Platten mit 24 Vertiefungen (Costar) wachsen gelassen. Die Zellen wurden zweimal mit PO&sub4;-freiem Kulturmedium, [PO&sub4;]-freiem MEM (GIBCO), mit 10% PO&sub4;-freiem dialysiertem fötalem Kalbsserum (FCS) und 2 mM Glutamin, gewaschen. Die Zellen wurden dann für 24 Std. in 3 ml/Vertiefung an PO&sub4;-freiem Kulturmedium wachsen gelassen. Anschlie ßend wurde das Volumen des Mediums auf 1,0 ml/Vertiefung eingestellt, und 0,5 mCi an [³²Pi]/Vertiefung wurden zugegeben, und die Zellen wurden für 6 Std. inkubiert. Die Zellen wurden für 20 Minuten bei 37ºC mit Kontrollmedium (Bahn 2), Kontrollmedium, welches 10,0 ng/ml p75 enthielt (Bahn 1), Kontrollmedium, welches 4,0 ng/ml TGFα enthielt (Bahn 3), Kontrollmedium, welches 4,0 ng/ml EGF enthielt (Bahn 4), und Kontrollmedium, welches 2,0 ng/ml gp30 enthielt (Bahn 5), behandelt. Nach der Inkubation wurden die Kulturschalen über ein Eisbad gestellt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS bei 4ºC gewaschen. Dann wurden die Zellen bei 4ºC für 10 Minuten mit 200 ul/Vertiefung Lysepuffer (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1,0% Triton x-100, 1 mM EGTA, 5 mM EDTA, 10% Glycerol, 0,2 mM Natriumorthovanadat, 0,5 mM PMSF, 20 ug/ml Leupeptin und 5 mM ATP, End-pH 7,5) lysiert. Das Zellysat wurde für 1 Minute bei 4ºC bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 10 ul normalem Kaninchenserum (NRS) für 1 Std. bei 4ºC inkubiert, und die nichtspezifischen Komplexe wurden unter Verwendung von Protein A-Sepharose (Sigma) abgeschieden. Der Überstand wurde mit einem polyklonalen Antikörper gegen den EGFR (Oncogene Science, N. Y.) inkubiert. Die spezifischen Komplexe wurden mit Protein A-Sepharose (Sigma) gefällt, und die Pellets wurden dreimal mit Lysepuffer gewaschen, und das Pellet wurde dann in 50 ul Probenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% Glycerol, 0,1% Bromphenolblau und 5% beta- Mercaptoethanol) resuspendiert. Nach 5 Minuten bei 95ºC wurden die Proben auf eine 7,5% SDS-PAGE geladen.
Fig. 3 beschreibt die Wirkung von p75 auf das Wachstum von menschlichen Brustkrebszellen. SK-Br-3- und MDA 468- Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen in IMEM (Biofluids), das mit 5% FCS ergänzt war, plattiert (30.000 Zellen/Vertiefung). Nach 24 Std. wurde das Medium entfernt und durch serumfreies Kontrollmedium ersetzt, welches Fibronectin, Transferrin, Hepes, Glutamin, Spurenelemente und BSA (SFM+), oder SFM+ unter Zugabe von gereinigtem p75 (4 ng/ml), gereinigtem gp30 (2,0 ng/ml) oder mit EGF (10 ng/ml) enthielt. Die Zellen wurden bis zu einer 90%igen Konfluenz der Kontrolle wachsen gelassen und gezählt. Jede Gruppe wurde dreifach getestet. Die Ergebnisse sind als Wachstum in Bezug auf die Kontrolle gezeigt. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt, und die Ergebnisse waren reproduzierbar.
Fig. 4 zeigt die Wirkung von p75 auf die Koloniebildung in Weichagar von menschlichen Brustkrebszellen. SK-Br- 3-Zellen wurden in 35 mm-Gewebekulturschalen (Costar, Cambridge, MA) plattiert. Eine Bodenschicht von 1,0 ml IMEM (Biofluids), welche 0,6% Agar und 10% fötales Kalbsserum (FCS) enthielt, wurde hergestellt. Nachdem die Bodenschicht verfestigt war, wurden 10.000 Zellen pro Schale in einer 0,8 ml-Deckschicht zugegeben, welche die Zellen, 0,4% Bacto-Agar (Difco, Detroit, MI) mit nur 10% FCS und mit steigenden Konzentrationen an p75 (0-132 pM) und gp30 (0 -330 pM) enthielt. Alle Proben wurden dreimal laufen gelassen, und die Experimente wurden in einem FCS durchgeführt, das auf eine optimale Klonierungseffizienz hin getestet worden war. Die Zellen wurden 7-9 Tage bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Kolonien, die größer als 60 um waren, wurden in einem Koloniezählgerät gezählt. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt, und die Ergebnisse waren reproduzierbar.
Fig. 5 zeigt die Wirkung der löslichen extrazellulären p185erbB-2 Domäne auf die Koloniebildung in Weichagar von menschlichen Brustkrebszellen. SK-Br-3-Zellen wurden in 35 mm-Gewebekulturschalen (Costar, Cambridge, MA) plattiert. Eine Bodenschicht von 1,0 ml IMEM (Biofluids), welche 0,6% Agar und 10% FCS enthielt, wurde hergestellt, wodurch die Bodenschicht verfestigt war. Die Indikatorzelle, 10.000 Zellen pro Schale, wurden in einer 0,8 ml-Deckschicht zugegeben, welche die Probe, 0,4% Bacto-Agar (Difco, Detroit, MI) und 10% FCS enthielt. Die Proben waren p75 (0,15 ng/ml), lösliche rekombinante ECD (12 ug/ml) und p75 in Gegenwart von EDC. Alle Proben wurden dreifach laufen gelassen, und die Experimente wurden in FCS durchgeführt, das auf eine optimale Klonierungseffizienz hin getestet worden war. Die Zellen wurden 7-9 Tage bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Kolonien, die größer als 60 um waren, wurden in einem Koloniezählgerät gezählt. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt, und die Ergebnisse waren reproduzierbar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

In der folgenden Beschreibung wird eine Vielzahl von Begriffen, die auf dem Gebiet der Liganden-Wachstumsfaktorrezeptor-Wechselwirkungen und der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, häufig benutzt. Um für ein klareres und in sich schlüssiges Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich des Umfangs, den solche Begriffe haben sollen, zu sorgen, werden die folgenden Definitionen angegeben.
Mutante. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Mutante" Derivate eines erbB-2-Liganden einschließen, bei welchen die Aminosäuresequenz des Proteins auf eine Weise modifiziert wurde, die aus einer Addition, Substitution, Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in oder von dem Wildtypprotein resultiert. Mit einer "biologisch aktiven Mutante" eines erbB-2-Liganden ist eine Mutante des Liganden gemeint, welche die gesamte oder einen Teil der biologischen Aktivität, insbesondere die Rezeptorbindungsaktivität, welche der Ligand besitzt, beibehält. Mutation kann ebenfalls als ein allgemeiner Begriff verwendet werden, um die Modifikation von irgendeiner DNA- oder RNA-Sequenz durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb dieser Sequenz zu bezeichnen.
Funktionelles Derivat. Mit einem "funktionellen Derivat" des erbB-2-Liganden der Erfindung ist ein Ligand gemeint, welcher eine biologische Aktivität besitzt, die im wesentlichen ähnlich mit der des Liganden ist, von welchem das Derivat abgeleitet wurde. Mit "im wesentlichen ähnlich" ist eine biologische Aktivität gemeint, welche qualitativ ähnlich, aber quantitativ verschieden von einer Aktivität ist, die ein normaler erbB-2-Ligand besitzt. Mit dem Begriff "eine biologische Aktivität, welche qualitativ ähnlich ist," ist ein Ligand gemeint, welcher mehr oder weniger die biologische Aktivität des natürlichen erbB-2-Liganden beibehält. Beispielsweise behält ein funktionelles Derivat des erbB-2-Liganden die p185erbB-2 Rezeptorbindungsaktivität bei. Der Begriff "funktionelles Derivat" soll biologisch aktive "Mutanten", "Fragmente" und "Varianten" des erbB-2-Liganden einschließen.
Fragment. Ein "Fragment" des erbB-2-Liganden soll sich auf ein Proteinmolekül beziehen, welches einen Teil der vollständigen Aminosäuresequenz des Wildtypliganden enthält. Mit einem "biologisch aktiven Fragment" eines Liganden ist ein Fragment des erbB-2-Liganden gemeint, welches die gesamte oder einen Teil der biologischen Aktivität beibehält, welche der Ligand besitzt. Wenn beispielsweise das Fragment einen Teil oder die gesamte Rezeptorbindungsaktivität beibehält, dann wird von einem solchen Fragment gesagt, daß es ein biologisch aktives Fragment des erbB-2- Liganden ist.
Variante. Eine "Variante" des erbB-2-Liganden soll sich auf einen Liganden beziehen, welcher in der Struktur und der biologischen Aktivität entweder dem nativen erbB-2- Liganden oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist, nicht aber mit einem solchen Molekül oder Fragment davon identisch ist. Eine Variante stammt nicht notwendigerweise von dem nativen Molekül und kann durch irgendeine aus einer Vielzahl von ähnlichen oder unterschiedlichen Zellinien erhalten werden. Der Begriff "Variante" soll ebenfalls genetische Allele einschließen. Vorausgesetzt, daß zwei erbB-2-Liganden eine ähnliche Struktur und biologische Aktivität besitzen, werden sie somit als Varianten angesehen, da der Begriff hierin selbst dann verwendet wird, wenn die Zusammensetzung oder die sekundäre, tertiäre oder quaternäre Struktur von einem der Liganden nicht mit der identisch ist, die bei dem anderen gefunden wird.
erbB-2-Ligand. Der Begriff "erbB-2-Ligand" soll sich auf ein Proteinmolekül beziehen, welches in der Lage ist, an ein erbB-2-Transmembranprotein (p185erbB-2) Zu binden, welches aber nicht an den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor bindet. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "erbB-2- Ligand" jegliches funktionelle Derivat des erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung einschließen. Die erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung können andere Protoonkogencodierte Transmembranproteine wie z. B. c-kit, neu, ros usw. binden, und somit ist der Begriff "erbB-2-Ligand" nicht auf Proteinmoleküle beschränkt, welche nur den erbB-2-Transmembranrezeptor binden. Ein Binden der erbB-2-Ligandenmoleküle der vorliegenden Erfindung kann zelluläre Reaktionen der Zellen induzieren, welche solche anderen Protoonkogene exprimieren, und kann somit verwendet werden, um Patienten zu behandeln und zu diagnostizieren, die bösartige Zellen aufweisen, welche diese anderen Protoonkogene exprimieren.

A. Liganden des erbB-2-Transmembranproteins

Lupu et al., Science 249: 1552-1555 (1990) berichteten über die Identifizierung und Reinigung eines Wachstumsfaktors mit 30 Kilodalton (kDa), welcher von menschlichen MDA MB-231-Brustkrebszellen sezerniert wurde. Dieses Glycoprotein (gp30) wurde durch aufeinanderfolgende Niedrigaffinitäts-Heparin-Sepharose-Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie bis zu einer scheinbaren Homogenität gereinigt.
Das gp30-Glycoprotein bindet an den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und weist TGFα-ähnliche Eigenschaften auf. Zusätzlich stimulierte gereinigtes gp30 die Phosphorylierung von p185erbB-2 in Zellen, die erbB-2 überexprimieren, im Gegensatz zu TGFα und EGF, welche nicht mit p185erbB-2 wechselwirken.
Überraschend hemmte gp30 das Zellwachstum bei allen Zellen, die erbB-2 überexprimierten (Lupu et al., Science, 249: 1552 (1990)). Ein monoklonaler Antikörper (4D5) gegen die extrazelluläre Domäne von p185erbB-2 (Hudziak et al., Molec. Cell. Biol. 9: 1165 (1989)) war in der Lage, mit gp30 um die Bindung an p185erbB-2 zu konkurrieren, was zeigte, daß der gp30-Ligand die 4D5-Bindungsstelle erkannte und daran band.
Von dem 185 kd-Transmembranglycoprotein, welches als p185erbB-2 bekannt ist, nimmt man an, daß es ein Transmembränprotein ist, welches als ein Wachstumsfaktorrezeptor fungiert und durch ein Protoonkogen codiert wird. Die erbB- 2-Expression wird bei vielen Adenokarzinomen amplifiziert und wird insbesondere bei fast 30% der menschlichen Brustkrebsarten amplifiziert oder überexprimiert (Magurie et al., Seminars in Oncology 16(2): 148-155 (1989). Von Patienten mit Krebszellen, die erbB-2 überexprimieren, ist bekannt, daß diese viel kürzere krankheitsfreie Perioden und eine schlechtere Gesamtüberlebenschance aufweisen als Krebspatienten, die keine erbB-2-Überexpression zeigen. Demgemäß ist es wichtig, zwischen bösartigen Geschwüren zu unterscheiden, welche eine erbB-2-Überexpression zeigen, und jenen, die dieses nicht tun. Eine Diagnose von mit erbB-2 verbundenen Krebsarten stellt somit dem Mediziner einen Weg zur Verfügung, um eine wirksame Therapie zur Behandlung von bestimmten Krebstypen vorauszuwählen.
Der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung ist aufgrund der Spezifität für p185erbB-2 extrem wichtig. Überraschenderweise erkennt oder bindet der erbB-2-Ligand EGFR, einen in hohem Maße zu p185erbB-2 homologen Rezeptor, nicht. Dieses charakteristische Merkmal erlaubt die Gestaltung von diagnostischen und therapeutischen Mitteln, die spezifisch gegen Karzinomzellen gerichtet sind, welche erbB-2 überexprimieren.
Der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung ist ein Protein mit 75 Kilodalton (p75), obwohl die Erfindung jegliche funktionellen Derivate dieses Faktors einschließen soll. Der im wesentlichen gereinigte p75-Ligand konkurriert mit 4D5 (Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9: 1165 (1989)) und MOI93-Antikörpern um die p185erbB-2-Bindung und induziert eine Phosphorylierung von p185erbB-2. Bei Zellwachstumstests wurde die Zellproliferation und die Koloniebildung von Zellinien, welche erbB-2 überexprimierten, mit p75 gehemmt. Weiterhin kann p75 die antiproliferative Wirkung der löslichen extrazellulären erbB-2-Domäne umkehren.

B. Identifizierung von erbB-2-Liganden

Die Identifizierung der erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden, indem ein Radiorezeptortest verwendet wird, um konditioniertes Medium von einer Vielzahl von Zellen zu screenen. Jeglicher Zelltyp kann bei einem Screening verwendet werden, um Liganden-produzierende Zellen zu isolieren. Vorzugsweise werden erbB-2-überexprimierende Zellen verwendet.
Der Radiorezeptortest gemäß der vorliegenden Erfindung benutzt einen markierten Antikörper, welcher an die extrazelluläre Domäne von p185erbB-2 bindet. Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des erbB-2-Rezeptors gerichtet sind, sind wohlbekannt. Die bevorzugten Antikörper zur Identifizierung von erbB-2-Liganden der vorliegen den Erfindung sind 4D5 (Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9: 1165 (1989)) und MOI93 (Kasprzyk et al., American Assc. Cancer Res. Abstracts (1990)). 4D5 und MOI93 können von Genentech, CA bzw. Molecular Oncology Inc., MD erhalten werden.
Die Antikörper 4D5 und MOI93 erkennen und binden an dieselbe Bindungsstelle der extrazellulären Domäne von p185erbB-2, so daß der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung an einer Bindung des Rezeptors in Gegenwart dieser Antikörper gehindert wird. Somit können diese Antikörper in kompetitiven Bindungstests verwendet werden, um Zellinien zu identifizieren, welche den erbB-2-Liganden der Erfindung produzieren. Ein Fachmann wird anerkennen, daß andere Antikörper, welche unterschiedliche Bindungsstellen oder Epitope auf der extrazellulären Domäne erkennen, durch wohlbekannte Techniken erzeugt werden können, um eine Anzahl von Liganden zu identifizieren, die nicht vorher beschrieben wurden. Somit kann die Verwendung von unterschiedlichen Antikörpern, welche an verschiedenen Orten auf der extrazellulären Domäne von p185erbB-2 binden, für die Isolierung von einmaligen Liganden sorgen.
Bei dem Test der vorliegenden Erfindung wird konditioniertes Medium gemäß den üblicherweise angewendeten Verfahren hergestellt. Beispielsweise wird Medium aus einer Zellkultur von den Zellen abgetrennt und 100fach in einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit konzentriert (Yarden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3179-3183 (1989); Lupu et al., (zur Veröffentlichung in JBC eingereicht); und Bates et al., Cancer Res. 46: 1707-1713 (1986)).
Eine kompetitive Bindung des markierten Antikörpers an p185erbB-2 in Gegenwart von konditioniertem Medium stellt ein Verfahren zur Verfügung, um Zellen nachzuweisen, welche Liganden produzieren. Auf diese Weise wird der Ligand in dem konditionierten Medium mit dem markierten Antikörper um die Bindung an dem p185erbB-2-protein konkurrieren. Ein Überwachen der Menge der Markierung, welche an das erbB-2- Protein gebunden ist, entscheidet über das Vorliegen des Liganden. Beispielsweise zeigt eine Abnahme bei der Markierung, welche an dem erbB-2-Rezeptor befestigt ist, das Vorliegen des Liganden an.

C. Reinigung des erbB-2-Liganden

Gemäß dieser Erfindung kann der erbB-2-Ligand aus einer Zelle isoliert werden, welche den Liganden produziert. Jegliche Zelle, welche den Liganden produziert, kann gemäß den Verfahren, welche in dieser Erfindung beschrieben sind, als ein Ausgangsmaterial verwendet werden. Der Zelltyp wird typischerweise eine Zelle sein, welche den erbB-2-Rezeptor überexprimiert. Vorzugsweise wird SK-Br-3 verwendet, um den 75 kDa-erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung zu isolieren. Dieser Stamm ist den Fachleuten wohlbekannt und ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt (Zugriffsnummer ATCC, HTB 30). Jedoch kann jegliche Zelle, von welcher gefunden wird, daß sie den erbB-2-Liganden oder funktionelle Derivate davon enthält, verwendet werden, um einen solchen Faktor aus der Zelle und/oder ihrem Kulturmedium zu isolieren und zu reinigen. Die Liganden der vorliegenden Erfindung können beispielsweise aus einer Wirtszelle isoliert werden, welche einen rekombinanten Liganden exprimiert.
Der Ligand der vorliegenden Erfindung wird wahrscheinlich von der Zelle ausgeschieden. Demgemäß wird der Ligand normalerweise aus dem Kulturmedium gereinigt. Jedoch können zelluläre Extrakte als eine Quelle dienen, aus welcher der Ligand der vorliegenden Erfindung gereinigt werden kann. Typischerweise werden die Zellen, welche den gewünschten Liganden produzieren, in einem Medium kultiviert, welches dem Zellwachstum förderlich ist. Die Zellen werden entfernt, und der gewünschte Ligand wird aus dem Medium gereinigt.
Die Liganden der vorliegenden Erfindung können aus dem Kulturmedium oder der Zelle extrahiert und gereinigt werden, indem bekannte Proteinreinigungstechniken, die gewöhnlich eingesetzt werden, wie z. B. Extraktion, Fällung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration und dergleichen verwendet werden. Das am meisten bevorzugte Verfahren, um den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung zu isolieren,: besteht in einer Affinitätschromatographie, welche die extrazelluläre Domäne des erbB-2-Rezeptors verwendet, die an die Säulenmatrix gebunden ist.
Wie den Fachleuten klar sein wird, kann eine extrazelluläre Domäne, die von einem natürlichen Wirt erhalten wird, welcher das Protein produziert, verwendet werden, um den Liganden der vorliegenden Erfindung zu reinigen. Beispielsweise sind SK-Br-3-Zellen verwendet worden, um die extrazelluläre Domäne von p185erbB-2 zu reinigen (Alper et al., Cell Growth and Differentiation 1: 591-599 (1990)). Alternativ kann die gereinigte rekombinante extrazelluläre Domäne von p185erbB-2 in einer Affinitätschromatographie verwendet werden, um den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Man wird anerkennen, daß das gesamte p185erbB-2-Rezeptorprotein oder Teile eines solchen Proteins verwendet werden können, um den erbB-2-Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung zu reinigen, vorausgesetzt, daß das Protein, welches an die Säulenmatrix gebunden ist, die gewünschte erbB-2-Liganden-Bindungsstelle der extrazellulären Domäne enthält. Yamamoto et al., Nature 319: 230-234 (1986) beschreibt die Klonierung und Expression des p185erbB-2 Gens in voller Länge. Ein Plasmid, welches das erbB-2-Rezeptorgen enthält, kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD erhalten werden (Zugriffs- Nr. ATCC 57584).
Unter Verwendung eines Affinitätschromatographie-Reinigungsverfahrens wurde der erbB-2-Ligand aus dem Zellmedium im wesentlichen gereinigt. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "im wesentlichen rein" oder "im wesentlichen gereinigt" einen Liganden beschreiben, welcher im wesentlichen frei von irgendeiner Verbindung, die normalerweise mit dem Protein in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, d. h. im wesentlichen frei von verunreinigendem Protein und Kohlehydratbestandteilen ist. Der Begriff soll weiterhin einen Liganden der vorliegenden Erfindung beschreiben, welcher anhand eines oder mehrerer Reinheits- oder Homogenitätsmerkmale homogen ist, die von den Fachleuten verwendet werden. Beispielsweise werden im wesentlichen reine Ligandenproteine konstante und reproduzierbare Merkmale innerhalb der experimentellen Standardabweichungen für Parameter, wie z. B. die folgenden: Molekulargewicht, chromatographische Techniken und andere solche Parameter, zeigen. Der Begriff soll jedoch nicht künstliche oder synthetische Mischungen des erbB-2-Liganden mit anderen Verbindungen ausschließen. Der Begriff soll ebenfalls nicht das Vorliegen von kleineren Verunreinigungen ausschließen, welche die biologische Aktivität des Enzyms nicht stören und welche beispielsweise aufgrund einer unvollständigen Reinigung vorhanden sein können.

D. Klonieren der erbB-2-Ligandengene

Irgendeines aus einer Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um die erbB-2-Ligandengene der vorliegenden Erfindung zu klonieren. Ein solches Verfahren erfordert das Analysieren einer Shuttlevektorbibliothek von DNA-Inserts (die von einer Zelle stammen, welche den erbB-2-Liganden exprimiert) auf das Vorliegen eines Inserts hin, welches das Ligandengen enthält. Eine solche Analyse kann durchgeführt werden, indem Zellen mit dem Vektor transfiziert werden und dann auf eine Expression der Ligandenbindungsaktivität hin getestet werden. Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren dieser Gene erfordert ein Bestimmen der Aminosäuresequenz des erbB-2-Ligandenproteins. Um diese Aufgabe zu erfüllen, kann das gewünschte Ligandenprotein gereinigt und durch automatische Sequenziergeräte analysiert werden. Alternativ kann jedes Protein fragmentiert werden, wie beispielsweise mit Cyanbromid oder mit Proteasen wie z. B. Papain, Chymotrypsin oder Trypsin (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 (1982); Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983)). Obwohl es möglich ist, die gesamte Aminosäuresequenz dieser Proteine zu bestimmen, ist es bevorzugt, die Sequenz von Peptidfragmenten dieser Moleküle zu bestimmen.
Wenn eines oder mehrere geeignete Peptidfragmente sequenziert wurden, werden die DNA-Sequenzen untersucht, welche in der Lage sind, diese zu codieren. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu codieren (Watson, J. D., in: Molecular Biology of the Gene, 3. Ausgabe, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356- 357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um Sequenzen der Aminosäuren zu identifizieren, welche von Oligonukleotiden codiert werden, die den niedrigsten Grad an Degeneriertheit aufweisen. Dieses wird vorzugsweise erreicht, indem Sequenzen identifiziert werden, die Aminosäuren enthalten, welche nur durch ein einziges Codon codiert werden. Obwohl solche Aminosäuresequenzen gelegentlich nur durch ein einziges Oligonukleotid codiert werden können, kann die Aminosäuresequenz häufig durch irgendeines aus einer Gruppe von ähnlichen Oligonukleotiden codiert werden. Während alle Elemente der Gruppe Oligonukleotide enthalten, welche in der Lage sind, das Peptidfragment zu codieren und somit möglicherweise dieselbe Nukleotidsequenz wie das Gen enthalten, welches das Peptidfragment codiert, ist es wichtig, daß nur ein Element der Gruppe eine Nukleotidsequenz enthält, die mit der Nukleotidsequenz dieses Gens identisch ist. Da dieses Element innerhalb der Gruppe vorhanden ist und in der Lage ist, mit der DNA, selbst in Gegenwart der anderen Elemente der Gruppe zu hybridisieren, ist es möglich, die unfraktionierte Gruppe der Oligonukleotide auf dieselbe Weise einzusetzen, in welcher man ein einzelnes Oligonukleotid einsetzen würde, um das Gen zu klonieren, welches das Peptid codiert.
Auf eine Weise, die zu der oben beschriebenen genau analog ist, kann man ein Oligonukleotid (oder eine Gruppe von Oligonukleotiden) einsetzen, welche eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu der Oligonukleotidsequenz oder der Gruppe von Sequenzen komplementär ist, die in der Lage ist, das Peptidfragment zu codieren.
Ein geeignetes Oligonukleotid oder eine Gruppe von Oligonukleotiden, welche in der Lage sind, ein Fragment des gewünschten erbB-2-Ligandengens zu codieren (oder welche zu einem solchen Oligonukleotid oder zu einer Gruppe von Oligonukleotiden komplementär sind), wird identifiziert (unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren), sythetisiert und durch in der Technik wohlbekannte Mittel mit einer DNA- oder einer cDNA-Präparation, was von der Quelle des Gens abhängt, hybridisiert. Typischerweise wird die Isolierung von eukaryotischen Genen durch ein Screenen einer cDNA- Bibliothek durchgeführt, während eine DNA-Bibliothek verwendet wird, um prokaryotische Gene zu isolieren. Techniken der Nukleinsäurehybridisierung sind offenbart in Maniatis, T. et al., in: Molecular Cloning. a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Coldspring Harbor, NY (1989) und in Haymes, B. D. et al., in: Nucleic Acid Hybrization, a Practical Annroach, IRL Press, Washington, DC (1985). Die verwendete Quelle der DNA oder cDNA wird vorzugsweise im Hinblick auf die gewünschten Sequenzen angereichert worden sein. Eine solche Anreicherung kann am leichtesten von einer cDNA erhalten werden, die durch ein Extrahieren von RNA aus Zellen erhalten wurde, die unter Bedingungen kultiviert wurden, welche eine erbB-2-Ligandensynthese induzieren.
Techniken wie z. B. die oben beschriebenen oder ähnlich zu diesen haben erfolgreich die Klonierung von Genen für den menschlichen transformierenden Wachstumsfaktor alpha (Derynck et al., Cell 38(1): 287-298 (1984)), den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor aus Hühnern (Lax et al., Mol. Cell. Biol. 8 (5) 1970-1978 (1988)), menschliche Aldehyddehydrogenasen (Hsu, L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985)), Fibronectin (Suzuki, S. et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519-2524 (1985)), das Gen des menschlichen Östrogenrezeptors (Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)), den Gewebetyp- Plasminogenaktivator (Pennica, D. et al., Nature 301: 214- 221 (1983)) und der komplementären DNA von menschlicher (human term) alkalischer Phosphatase aus der Plazenta (Kam, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719 (1985)) ermöglicht.
Bei einem alternativen Weg der Klonierung der erbB-2- Ligandengene der vorliegenden Erfindung wird eine Bibliothek von Expressionsvektoren hergestellt, indem DNA oder cDNA aus einer Zelle, die in der Lage ist, einen solchen Liganden zu exprimieren, in einen Expressionsvektor kloniert wird. Die Bibliothek wird dann auf Elemente hin untersucht, die in der Lage sind, ein Protein zu exprimieren, welches an ein anti-Ligandenmolekül (Antikörper oder blockierendes Peptid) bindet und welches eine Nukleotidsequenz aufweist, die in der Lage ist, Polypeptide zu codieren, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie das erbB-2- Ligandenprotein der vorliegenden Erfindung oder Fragmente oder Varianten davon aufweisen.

E. Expression der erbB-2-Ligandengene

DNA-Moleküle, welche ein erbB-2-Ligandengen oder wenigstens Teile dieses Gens enthalten, können funktionsfähig mit einem Expressionsvektor verknüpft werden und in eine Wirtszelle eingeführt werden, um die Expression des Ligan den durch diese Zelle zu ermöglichen. Von zwei DNA-Sequenzen (wie z. B. einer Promotorteilsequenz und einer ein gewünschtes Ligandenprotein codierenden Sequenz) sagt man, daß sie funktionsfähig verknüpft sind, wenn die Natur der Verknüpfung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zu der Einführung einer Leserastermutation führt, (2) die Fähigkeit der Promotorteilsequenz stört, die Transkription der das gewünschte Protein codierenden Gensequenz zu steuern, oder (3) die Fähigkeit der gewünschten Proteingensequenz stört, durch die Promotorteilsequenz transkribiert zu werden.
Eine DNA-Sequenz, welche ein erbB-2-Ligandenprotein codiert, kann mit einer Vektor-DNA gemäß herkömmlichen Techniken verbunden werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Expression der gewünschten Fusionsproteine sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen. Eukaryotische Wirte umfassen Hefe (insbesondere Saccharomyces), Pilze (insbesondere Aspergillus), Säugetierzellen (wie z. B. menschliche oder Primaten-Zellen), entweder in vivo oder in einer Gewebekultur.
Hefe und Säugetierzellen bieten wesentliche Vorteile darin, daß sie ebenfalls posttranslationale Peptidmodifikationen einschließlich einer Glykosylierung durchführen können. Es existiert eine Anzahl von rekombinanten DNA-Strategien, welche Sequenzen starker Promotoren und Plasmide mit hoher Kopienzahl benutzen, welche zur Produktion der gewünschten Proteine in diesen Wirten benutzt werden können.
Hefe erkennt Leitsequenzen auf klonierten Säugetiergenprodukten und sezerniert Peptide, welche Leitsequenzen tragen (d. h. Präpeptide). Säugetierzellen sorgen für posttranslationale Modifikationen an Proteinmolekülen einschließlich einer richtigen Faltung oder einer Glykosylierung an den richtigen Stellen.
Säugetierzellen, die als Wirte nützlich sein können, umfassen Zellen eines fibroblastischen Ursprungs wie z. B. VERO oder CHO-K1 und ihre Derivate. Für einen Säugetierwirt sind mehrere mögliche Vektorsysteme zur Expression des gewünschten Fusionsproteins verfügbar. Eine breite Vielzahl von transkriptionalen und translationalen regulatorischen Sequenzen kann eingesetzt werden, was von der Natur des Wirtes abhängt. Die transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signale können aus viralen Quellen wie z. B. Adenovirus, Rinderpapilloma-Virus, Simian-Virus oder dergleichen stammen, wobei die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen verbunden werden, welches ein hohes Expressionsniveau aufweist. Alternativ können Promotoren aus Säugetierexpressionsprodukten wie z. B. Actin, Collagen, Myosin usw. eingesetzt werden. Regulatorische Transkriptionsinitiationssignale können ausgewählt werden, welche eine Repression oder Aktivierung ermöglichen, so daß die Expression der Gene moduliert werden kann. Von Interesse sind regulatorische Signale, welche temperaturempfindlich sind, so daß durch ein Ändern der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder welche einer chemischen Regulation, z. B. durch einen Metaboliten, unterliegen.
Die Expression des gewünschten Fusionsproteins in eukaryotischen Wirten macht die Verwendung von eukaryotischen regulatorischen Bereichen notwendig. Solche Bereiche werden im allgemeinen einen Promotorbereich einschließen, was ausreicht, um die Initiation der RNA-Synthese zu steuern. Bevorzugte eukaryotische Promotoren umfassen den Promotor des Mäuse-Metallothionein-I-Gens (Hamer, D. et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 : 273-288 (1982)); den TK-Promotor des Herpes-Virus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); den frühen SV40-Promotor (Benoist, C. et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)); den Hefe-gal4-Genpromotor (Johnston, S. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA 79: 6971-6975 (1982); Silver, P. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955 (1984)).
Wie weithin bekannt ist, wird die Translation der eukaryotischen mRNA an dem Codon initiiert, welches das erste Methionin codiert. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, sicherzustellen, daß die Verknüpfung zwischen einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, welche das gewünschte Fusionsprotein codiert, keine dazwischenliegenden Codons, welche in der Lage sind, ein Methionin zu codieren (d. h. AUG), enthält. Das Vorliegen solcher Codons führt entweder zu der Bildung eines Fusionsproteins (wenn das AUG-Codon in demselben Leseraster liegt wie die das gewünschte Fusionsprotein codierende DNA-Sequenz) oder einer Leserastermutation (wenn das AUG-Codon nicht in demselben Leseraster liegt wie die das gewünschte Fusionsprotein codierende Sequenz).
Die Expression des erbB-2-Ligandenproteins kann ebenfalls in prokaryotischen Zellen erreicht werden. Bevorzugte prokaryotische Wirte umfassen Bakterien wie z. B. E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia usw. Bakterielle Wirte von besonderem Interesse schließen E. coli K12 und weitere Enterobakterien (wie z. B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens) und verschiedene Pseudomonas-Spezies ein. Der prokaryotische Wirt muß mit dem Replicon und den Kontrollsequenzen in dem Expressionsplasmid kompatibel sein.
Um das gewünschte Ligandenprotein in einer prokaryotischen Zelle (wie z. B. E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streutomyces usw.) zu exprimieren, ist es notwendig, die das gewünschte Ligandenprotein codierende Sequenz mit einem funktionalen prokaryotischen Promotor funktionsfähig zu verknüpfen. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder, noch bevorzugter, regulierbar sein (d. h. induzierbar oder dereprimierbar). Beispiele von konstitutiven Promoto ren umfassen den int-Promator des Bakteriophagen λ und den bla-Promotor des β-Lactamase-Gens von pBR322 usw. Beispiele von induzierbaren prokaryotischen Promotoren umfassen den rechten und linken Hauptpromotor des Bakteriophagen λ (PL und ER), die trp-, recA-, lacZ-, lacI-, gal- und tac-Promotoren von E. coli, die α-Amylase (Ulmanen, I. et al., J. Bacteriol. 162: 176-182 (1985)), die s-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman, M. Z. et al., Gene 32: 11- 20 (1984)), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, T. J., in: The Molecular Bioloav of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)) und Streptomyces-Promotoren (Ward, J. M. et al., Mol. ·Gen. Genet. 203: 468-478 (1986)). Einen Überblick über die prokaryotischen Promotoren geben Glick, B. R. (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986)); und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442 (1984)).
Die richtige Expression in einer prokaryotischen Zelle macht ebenfalls das Vorliegen einer Ribosomen-Bindungsstelle stromaufwärts der gencodierenden Sequenz notwendig. Solche Ribosomen-Bindungsstellen sind z. B. offenbart in Gold, L. et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365-404 (1981)).
Die gewünschte proteincodierende Sequenz und ein funktionsfähig verknüpfter Promotor können in eine prokaryotische oder eukaryotische Empfängerzelle entweder als ein nichtreplizierendes DNA- (oder RNA-) Molekül eingeführt werden, welches entweder ein lineares Molekül oder bevorzugter ein geschlossenes kovalentes zirkuläres Molekül sein kann. Da solche Moleküle nicht in der Lage sind, eine autonome Replikation durchzuführen, kann die Expression des gewünschten Ligandenmoleküls durch die vorübergehende Expression der eingeführten Sequenz eintreten. Alternativ kann eine permanente Expression über die Integration der eingeführten Sequenz in das Wirtschromosom eintreten.
In einer Ausführungsform wird ein Vektor eingesetzt, welcher in der Lage ist, die gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellenchromosom zu integrieren. Zellen, welche die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können selektiert werden, indem ebenfalls einer oder mehrere Marker eingeführt werden, welche eine Selektion der Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann eine Auxotrophie bei dem Wirt (wie z. B. leu2 oder ura3, welche häufige auxotrophe Hefemarker sind), eine Biozidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle wie z. B. Kupfer, oder dergleichen komplementieren. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den DNA-Gensequenzen, welche exprimiert werden sollen, verknüpft werden oder durch Cotransfektion in dieselbe Zelle eingeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die eingeführte Sequenz in ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut, welcher in dem Empfängerwirt zu einer autonomen Replikation fähig ist. Irgendeiner aus einer breiten Vielzahl an Vektoren kann zu diesem Zweck eingesetzt werden. Wichtige Faktoren beim Auswählen eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors umfassen: die Leichtigkeit, mit welcher Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, gegenüber den Empfängerzellen, welche den Vektor nicht enthalten, erkannt oder selektiert werden können; die Anzahl an Kopien des Vektors, welche in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es erwünscht ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Spezies zu verschieben ("shuttle").
Irgendeines aus einer Reihe von Hefegenexpressionssystemen kann benutzt werden. Beispiele für solche Expressionsvektoren umfassen den Hefe-2-Mikron-Zyklus, die Expressionsplasmide YEP13, YCP und YRP usw. oder deren Derivate. Solche Plasmide sind in der Technik wohlbekannt (Botstein, D. et al., Miami Wntr. Symp. 19 : 265-274 (1982); Broach, J. R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445-470 (1981); Broach, J. R., Cell 28: 203-204 (1982)).
Für einen Säugetierwirt stehen mehrere mögliche Vektorsysteme zur Expression zur Verfügung. Eine Klasse von Vektoren benutzt DNA-Elemente, die autonom replizierende extrachromosomale Plasmide zur Verfügung stellen, die aus tierischen Viren wie z. B. Rinderpapilloma-Virus, Polyoma- Virus, Adenovirus oder SV40-Virus stammen. Eine zweite Klasse von Vektoren basiert auf der Integration der gewünschten Gensequenzen in das Wirtschromosom. Zellen, welche die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können selektiert werden, indem ebenfalls einer oder mehrere Marker eingeführt werden, welche eine Selektion der Wirtszellen erlauben, die den Expressionsvektor enthalten. Die Marker können für eine Prototrophie bei einem auxotrophen Wirt, eine Biozidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle, wie z. B. Kupfer oder dergleichen, sorgen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den DNA-Sequenzen, welche exprimiert werden sollen, verknüpft werden oder durch Cotransformation in dieselbe Zelle eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können ebenfalls für eine optimale Synthese der mRNA benötigt werden. Diese Elemente können Splice-Signale wie auch Transkriptionspromotoren, Verstärker und Terminationssignale umfassen. Die cDNA-Expressionsvektoren, welche solche Elemente enthalten, umfassen jene, die von Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983), und anderen beschrieben werden.
Bevorzugte prokaryotische Vektoren umfassen Plasmide wie z. B. jene, die zu einer Replikation in E. coli fähig sind, wie z. B. pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, πVX. Solche Plasmide sind beispielsweise offenbart in Maniatis, T. et al. (in: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Bacil lus-Plasmide umfassen pC194, pC221, pT127 usw. Solche Plasmide sind offenbart in Gryczan, T. (in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), S. 307- 329). Geeignete Streptomyces-Plasmide umfassen pIJ101 (Kendall, K. J. et al., J. Bacteriol. 169: 4177-4183 (1987)) und Streptomyces-Bakteriophagen wie z. B. φC31 (Chater, K. F. et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), S. 45-54). Eine Übersicht über Pseudomonas-Plasmide geben John, J. F. et al. (Rev. Infect. Dis. 8: 693-704 (1986)) und Izaki, K. (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742 (1978)).
Wenn der Vektor oder die DNA-Sequenz, welche das Konstrukt enthält, zur Expression vorbereitet wurde, kann das DNA-Konstrukt in einen geeigneten Wirt eingeführt (transformiert) werden. Verschiedene Techniken wie z. B. eine Protoplastenfusion, eine Calciumphosphatfällung, eine Elektroporation oder andere übliche Techniken können eingesetzt werden. Nach der Fusion werden die Zellen in einem Medium kultiviert und auf passende Aktivitäten hin gescreent. Die Expression der Sequenz führt zu der Produktion des rekombinanten erbB-2-Ligandenproteins der vorliegenden Erfindung.

F. Reinigung des rekombinanten erbB-2-Liganden

Die erbB-2-Ligandenproteine dieser Erfindung können durch Fermentation des rekombinanten Wirtes, welcher die klonierten Ligandengene enthält, produziert werden. Der rekombinante Wirt wie z. B. Säugetierzellen, welche das klonierte Protein produzieren, können gemäß Techniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, kultiviert und geerntet werden.
Die rekombinanten erbB-2-Ligandenproteine der vorliegenden Erfindung können aus dem rekombinanten Wirt oder dessen Kulturmedium extrahiert und gereinigt werden, indem bekannte Proteinreinigungstechniken, die üblicherweise eingesetzt werden, wie z. B. Extraktion, Fällung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration und dergleichen verwendet werden. Biochemische Techniken, die eingesetzt werden, um die erbB-2-Ligandenproteine der vorliegenden Erfindung aus SK-Br-3 zu isolieren, sind von besonderem Interesse, wenn diese Proteine aus einem rekombinanten Wirt gereinigt werden.

G. Anti-Ligandenmoleküle

Die vorliegende Erfindung betrifft anti-Ligandenmoleküle, welche kovalent oder nichtkovalent an die erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung binden. Ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen die anti-Ligandenmoleküle der vorliegenden Erfindung Antikörper, blockierende Peptide und irgendein anderes Molekül, eine Verbindung, eine Chemikalie usw., die in der Lage ist, kovalent oder nichtkovalent an den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung zu binden.
Blockierende Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind "in der Lage, ein Molekül zu binden", wenn sie in der Lage sind, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren oder eine Affinität dazu aufzuweisen, so daß das blockierende Peptid an das Molekül bindet. Ein Beispiel eines blockierenden Peptids der vorliegenden Erfindung ist die extrazelluläre Domäne des erbB-2-Transmembranrezeptors. Typischerweise können Peptidfragmente der extrazellulären Domäne, welche an den erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung binden, verwendet werden, obwohl auch funktionelle Derivate eines solchen erbB-2-Transmembranrezeptors verwendet werden können. Solche Derivate können beispielsweise neu, c-kit, met oder irgendwelche Transmembrantyrosinkinasen einschließen, die eine Struktur aufweisen, welche der der Wachstumsfaktorrezeptoren ähnlich ist.
Die blockierenden Peptide der vorliegenden Erfindung können durch eine Anzahl an wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Synthetische Peptide können unter Verwendung von automatisierten Proteinsynthesegeräten konstruiert werden. Alternativ können die blockierenden Peptide der Erfindung durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt werden. Beispielsweise kann ein DNA-Molekül, das für das gewünschte Peptid codiert, funktionsfähig mit einem Promotor und anderen regulatorischen Sequenzen verknüpft werden, so daß eine Expression des Peptids in einem transformierten Wirt erhalten werden kann. Eine Vielzahl von Verfahren zur Produktion eines gewünschten blockierenden Peptids wird dem Fachmann leicht zugänglich sein.
Die Fachleute werden verstehen, daß das blockierende Peptid der vorliegenden Erfindung durch Standardtechniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, nachweisbar markiert oder mit therapeutischen Mitteln konjugiert werden kann. Beispiele für nachweisbare Markierungen werden nachstehend beschrieben, welche verwendet werden können, um die blockierenden Peptide der vorliegenden Erfindung nachweisbar zu markieren.
Der Begriff "therapeutisches Mittel", wie er hierin verwendet wird, soll sich auf irgendein Molekül, eine chemische Verbindung, ein Protein usw. beziehen, welches, wenn es in enger Assoziierung mit einer Zelle eingeführt wird, in der Lage ist, die Zelle zu töten, zu zerstören, ihr Wachstum oder ihre Reproduktion zu hemmen oder in anderer Weise ihre normale Physiologie oder den Metabolismus der Zelle auf eine Weise zu stören, die dem Überleben oder der Reproduktion der Zelle nicht förderlich ist. Beispiele für geeignete therapeutische Mittel umfassen cytotoxische Arzneimittel, Toxine, Isotope, endokrine Therapeutika und dergleichen. Bestimmte cytotoxische Arzneimittel, die verwendet werden können, sind Adriamycin, Cyclophosphamid, 5- Fluoruracil, Methotrexat, Cisplatin, Carboplatin, Vincri stin, VP-16, Bleomycin, Mitomycin C usw. Die Toxine können Ricin-A-, Diphtherie- und Pseudomonas-(Toxin) einschließen. Beispiele für geeignete Isotope umfassen P32, Indium, Yttrium und Iod. Beispiele für geeignete endokrine Therapeutika umfassen Diethylbestrol (DES), Tamoxifen und LHRHantagonisierende Arzneimittel.
Von einem Antikörper sagt man, daß er ein Molekül "binden kann" oder "gegen dieses gerichtet ist", wenn er in der Lage ist, mit dem Molekül spezifisch zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff "Epitop" oder "Bindungsstelle" soll sich auf den Bereich eines Antigens beziehen, welcher von einem Antikörper erkannt und gebunden werden kann. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop aufweisen. Ein "Antigen" ist in der Lage, ein Tier dazu zu veranlassen, einen Antikörper zu produzieren, welcher in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Die spezifische Reaktion, auf welche oben Bezug genommen wird, soll anzeigen, daß das Antigen auf eine hochselektive Weise mit seinem entsprechenden Antikörper und nicht mit der Vielzahl von anderen Antikörpern reagiert, welche durch andere Antigene hervorgerufen werden können. Das Antigen der vorliegenden Erfindung kann irgendein Ligand sein, der identifiziert wurde. Insbesondere kann der p75-erbB-2-Ligand verwendet werden, um antip75-Ligandenantikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
Der Begriff "Antikörper" (Ab) oder "monoklonaler Antikörper" (Mab), wie er hierin verwendet wird, soll intakte Moleküle wie auch deren Fragmente (wie z. B. Fab- und F(ab')&sub2;-Fragmente) einschließen, welche in der Lage sind, ein Hapten oder Antigen zu binden. Fab- und F(ab')&sub2;-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Blutkreislauf entfernt und können eine geringere nichtspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 42: 316-325 (1983)).
Die Antikörper, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch irgendeines aus einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Zellen, welche den erbB-2-Liganden (oder Fraktionen, Lysate usw. davon) produzieren, einem Tier verabreicht werden, um die Produktion von Seren zu induzieren, welche polyklonale Antikörper enthalten, die in der Lage sind, das Antigen zu binden. Da die Zellen; welche den erbB-2-Liganden produzieren, das Protein in das Kulturmedium ausscheiden, kann das Medium als eine Quelle für das erbB-2-Ligandenantigen verwendet werden. In einem bevorzugten Verfahren wird eine Präparation des erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung hergestellt und gereinigt, um diese im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen zu machen. Eine solche Präparation wird dann in ein Tier eingeführt, um polyklonale Antiseren mit einer größeren spezifischen Aktivität zu produzieren.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können monoklonale oder polyklonale Antikörper (oder Hapten-bindende Fragmente von diesen) sein. Solche monoklonalen Antikörper können hergestellt werden, indem die Hybridomtechnologie verwendet wird (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hyridomas, Elsevier, N. Y., S. 563-681 (1981)). Im allgemeinen beinhalten solche Verfahren ein Immunisieren eines Tiers mit im wesentlichen reinem erbB-2-Ligandenprotein.
Die Milzzellen des immunisierten Tieres werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomzellinie verschmolzen. Irgendeine geeignete Myelomzellinie kann gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden; jedoch kann eine geeig nete Stamm-Myelomzellinie (SP&sub2;O) verwendet werden, welche von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland erhältlich ist. Nach der Verschmelzung werden die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium gehalten und dann durch Grenzverdünnung kloniert, wie von Wands, J. R. et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)) beschrieben wird. Die Hybridomzellen, welche durch eine solche Selektion erhalten wurden, werden dann getestet, um Klone zu identifizieren, die Antikörper sezernieren, welche in der Lage sind, an den erbB-2-Liganden zu binden.
Man wird erkennen, daß Fab und F(ab')&sub2; und andere Fragmente des Antikörpers gemäß dem hierin offenbarten Verfahren zum Nachweis des erbB-2-Liganden in Proben auf dieselbe Weise wie der intakte Antikörper verwendet werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch eine proteolytische Spaltung hergestellt, wobei Enzyme wie z. B. Papain (um Fab-Fragmente herzustellen) oder Pepsin (um F(ab')&sub2;- Fragmente herzustellen) verwendet werden. Alternativ können Hapten-bindende Fragmente durch die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie oder durch synthetische Chemie hergestellt werden.
Ähnlich zu den blockierenden Peptiden können Antikörper mit den therapeutischen Mitteln konjugiert werden. Geeignete Beispiele der therapeutischen Mittel, welche mit den anti-Ligandenantikörpern der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf cytotoxische Arzneimittel, Toxine und Isotope: Beispiele von geeigneten therapeutischen Mitteln sind oben beschrieben.

H. Tests zum Nachweisen des erbB-2-Liganden

Die anti-Liganderunoleküle einschließlich Antikörpern, Fragmenten von Antikörpern oder blockierenden Peptiden der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um das Vor liegen des erbB-2-Liganden nachzuweisen. Somit können die Antikörper (oder Fragmente von diesen) und die blockierenden Peptide in der Histologie und der Biopsie eingesetzt werden, um eine erbB-2-Ligandenexpression in einem Patienten nachzuweisen, welcher an Brust-, Leber-, Eierstock-, Lungen-, Darmkarzinomen und dergleichen leidet. Ein solcher Nachweis kann erreicht werden, indem irgendeiner aus einer Vielzahl von Tests verwendet wird. Beispielsweise ist es durch ein radioaktives Markieren der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, den erbB-2-Liganden durch die Verwendung von Radioimmuntests nachzuweisen. Eine gute Beschreibung eines Radioimmuntests (RIA) findet man in Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, von Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), mit besonderem Bezug auf das Kapitel mit dem Titel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Alternativ können Fluoreszenz-, Enzym- oder andere geeignete Markierungen eingesetzt werden. Nachweisbar markierte blockierende Peptide können in einer analogen Weise verwendet werden, um den erbB-2-Liganden nachzuweisen.
Alternativ kann der Nachweis des erbB-2-Liganden durch in vivo-Abbildungstechniken erreicht werden, in welchen die markierten Antikörper, Fragmente davon oder blockierenden Peptide einem Patienten gegeben werden und das Vorliegen des Brust-, Eierstock-, Leber-, Lungen- oder Darmkarzinoms, welches den erbB-2-Liganden exprimiert, nachgewiesen wird, ohne daß vorher irgendeine Gewebeprobe entnommen wird. Solche in vivo-Nachweisverfahren haben den Vorteil, daß sie weniger invasiv sind als andere Nachweisverfahren und darüber hinaus in der Lage sind, das Vorliegen von Antigenexprimierenden Zellen in einem Gewebe nachzuweisen, welches nicht leicht aus dem Patienten entnommen werden kann.
Gemäß den oben diskutierten Tests können Antikörper, Fragmente davon oder blockierende Peptide unter Verwendung von irgendeinem aus einer Vielzahl von Markierungen und Markierungsverfahren markiert werden. Beispiele von Markierungstypen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Enzymmarkierungen, Radioisotopmarkierungen, nichtradioaktive Isotopmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Toxinmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen.
Beispiele von geeigneten Enzymmarkierungen umfassen Malatdehydrogenase, Staphylokokkennuklease, delta-5-Steroidisomerase, Hefealkoholdehydrogenase, alpha-Glycerolphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta- Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6- Phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase usw.
Beispiele von geeigneten Radioisotopmarkierungen sind den Fachleuten leicht ersichtlich. Geeignete nichtradioaktive Isotopmarkierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind dem Durchschnittsfachmann ebenfalls bekannt.
Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarkierungen umfassen eine Fluoresceinmarkierung, eine Isothiocyanatmarkierung, eine Rhodaminmarkierung, eine Phycoerythrinmarkierung, eine Phycocyaninmarkierung, eine Allophycocyaninmarkierung, eine o-Phthalaldehydmarkierung, eine Fluorescaminmarkierung usw.
Beispiele von geeigneten Toxinmarkierungen umfassen Diphtherietoxin, Ricin und Choleratoxin. Beispiele von Chemilumineszenzmarkierungen umfassen eine Luminalmarkierung, eine Isoluminalmarkierung, eine Markierung mit einem aromatischen Acridiniumester, eine Imidazolmarkierung, eine Markierung mit einem Acridiniumsalz, eine Oxalatestermarkie rung, eine Luciferinmarkierung, eine Luciferasemarkierung, eine Äquorinmarkierung usw.
Die Durchschnittsfachleute werden andere geeignete Markierungen kennen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die Bindung dieser Markierungen an Antikörper oder Fragmente davon kann erreicht werden, indem Standardtechniken verwendet werden, die den Durchschnittsfachleuten gewöhnlich bekannt sind. Typische Techniken werden von Kennedy, J. H. et al. (Clin. Chim. Acta 70: 1-31 (1976)) und Schurs, A. H. W. M. et al. (Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977)) beschrieben. Kopplungstechniken, welche in dem letzteren erwähnt werden, sind das Glutaraldehydverfahren, das Periodatverfahren, das Dimaleinimidverfahren, das m-Maleinimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren.
Der Nachweis der Antikörper, der Fragmente von Antikörpern oder der blockierenden Peptide kann durch die Verwendung von Trägern verbessert werden. Wohlbekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Natur des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder in einem gewissen Ausmaß löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, solange wie das gekoppelte Molekül in der Lage ist, an ein Antigen zu binden. Somit kann die Konfiguration des Trägers kugelförmig sein, wie bei einem Kügelchen, oder zylindrisch, wie auf der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder der äußeren Oberfläche eines Stabes. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, wie z. B. ein Blatt, ein Teststreifen usw. Die Fachleute werden viele andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörpern und blockierenden Peptiden feststellen oder werden in der Lage sein, dasselbe durch den Einsatz von routinemäßigen Experimenten festzustellen.
Die bindenden Moleküle (anti-Ligandenmoleküle) der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zur Verwendung in einem immunometrischen Test angepaßt werden, welcher auch als ein "Zweistellen"- oder "Sandwich"-Test bekannt ist. Bei einem typischen immunometrischen Test wird eine Menge an nichtmarkiertem Antikörper oder Fragment des Antikörpers an einen festen Träger gebunden, welcher in der zu testenden Flüssigkeit (d. h. Blut, Lymphe, verflüssigter Stuhl, Gewebehomogenat usw.) unlöslich ist, und eine Menge des nachweisbar markierten löslichen Antikörpers wird zugegeben, um einen Nachweis und/oder eine Quantifizierung des ternären Komplexes zu erlauben, welcher aus dem Festphasenantikörper, dem Peptidantigen und dem markierten Antikörper gebildet wird. Es wird dem Fachmann klar sein, daß ein markiertes blockierendes Peptid ebenfalls anstelle von oder in Kombination mit dem Antikörper, welcher in dem Test gemäß der Erfindung verwendet wird, verwendet werden kann.
Typische immunometrische Tests umfassen "Vorwärts"- Tests, bei welchen der Antikörper oder das blockierende Peptid, die an die feste Phase gebunden sind, zuerst mit der Probe, welche getestet wird, in Kontakt gebracht werden, um das Antigen aus der Probe durch Bildung eines binären Antikörper-Antigenkomplexes oder eines Komplexes aus blockierendem Peptid und Antigen an der Festphase zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe, einschließlich nichtumgesetztem Antigen, wenn ein solches vorliegt, zu entfernen, und dann mit der Lösung in Kontakt gebracht, welche eine unbekannte Menge des markierten Antikörpers oder des markierten blockierenden Peptids (welche als ein "Reportermolekül" fungieren) enthält. Nach einer zweiten Inkubationsperiode, um zu ermöglichen, daß das markierte Molekül mit dem Antigen, welches durch den nichtmarkierten Antikörper oder das blockierende Peptid an den festen Träger gebunden ist, einen Komplex bildet, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nichtumge setzten markierten Antikörper zu entfernen. Dieser Typ des Vorwärts-Sandwichtests kann ein einfacher "Ja/Nein"-Test sein, um zu bestimmen, ob erbB-2-Ligandenantigen vorhanden ist, oder kann quantitativ ausgestaltet werden, indem der Anteil des markierten Antikörpers oder des markierten blockierenden Peptids mit dem verglichen wird, der für eine Standardprobe erhalten wird, welche bekannte Mengen des Antigens enthält. Solche "Zweistellen"- oder "Sandwich"- Tests werden von Wide auf den Seiten 199-206 von Radioimmune Assay Method, herausgegeben von Kirkham und Hunter, E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970 'beschrieben.
In einem weiteren Typ von "Sandwich"-Test, welcher ebenfalls nützlich sein kann, um das erbB-2-Ligandenantigen nachzuweisen, werden die sogenannten "simultanen" und "Rückwärts"-Tests verwendet. Ein simultaner Test beinhaltet einen einzigen Inkubationsschritt, da der Antikörper oder das blockierende Peptid, welche an den festen Träger gebunden sind, und der markierte Antikörper oder das blockierende Peptid beide gleichzeitig zu der Probe, welche getestet wird, zugegeben werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe und des nichtkomplexierten markierten Antikörpers oder Peptids zu entfernen. Das Vorliegen von markiertem Antikörper oder blockierendem Peptid, welche mit dem festen Träger verbunden sind, wird dann so bestimmt, wie es in einem herkömmlichen "Vorwärts"-Sandwichtest bestimmt würde.
Bei dem "Rückwärts"-Test folgt der schrittweisen Zugabe einer Lösung des markierten Antikörpers oder des markierten blockierenden Peptids zu der flüssigen Probe die Zugabe von nichtmarkiertem Antikörper oder nichtmarkiertem blockierendem Peptid, welche an einen festen Träger gebunden sind, nachdem eine geeignete Inkubationsperiode durchlaufen wurde. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase in üblicher Weise gewaschen, um sie von dem Rest der Probe, welche getestet wird, und der Lösung des nichtumgesetzten markierten Antikörpers oder blockierenden Peptids zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers oder des markierten blockierenden Peptids, welche mit einem festen Träger verbunden sind, wird dann wie bei den "simultanen" und "vorwärts"-Tests bestimmt.
Wie oben erklärt wurde, machen es die immunometrischen Tests auf das erbB-2-Ligandenantigen nötig, daß das bestimmte bindende Molekül mit einem "Reportermolekül" markiert wird. Diese Reportermoleküle oder Markierungen, wie sie oben identifiziert sind, sind im Stand der Technik üblich und wohlbekannt. Bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung sind Enzymmarkierungen eine bevorzugte Ausführungsform. Zur Verwendung als eine Markierung in jedem denkbaren immunometrischen Test ist kein einziges Enzym ideal. Statt dessen muß man bestimmen, welches Enzym für ein bestimmtes Testsystem geeignet ist. Kriterien, die für die Auswahl der Enzyme wichtig sind, sind die Wechselzahl des reinen Enzyms (die Anzahl von Substratmolekülen, welche pro Enzymstelle pro Zeiteinheit zu dem Produkt umgewandelt werden), die Reinheit der Enzympräparation, die Nachweisempfindlichkeit seines Produkts, die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Nachweises der Enzymreaktion, das Fehlen von störenden Faktoren oder von einer enzymähnlichen Aktivität in der Testflüssigkeit, die Stabilität des Enzyms und seines Konjugats, die Verfügbarkeit und die Kosten für das Enzym und sein Konjugat und dergleichen. Eingeschlossen in die Enzyme, welche als bevorzugte Markierungen bei den immunometrischen Tests der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Peroxidase, alkalische Phosphatase, beta- Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase, Glycoamylase, Malatdehydrogenase und Glucose-6-Phosphatdehydrogenase.
Zusätzlich sind die Materialien zur Verwendung in den Tests der Erfindung ideal zur Herstellung eines Kits geeignet. Ein solches Kit kann ein Trägermittel enthalten, wel ches in Kompartimente unterteilt ist, um in enger Umgrenzung ein oder mehrere Behältermittel wie z. B. Ampullen, Teströhrchen und dergleichen aufzunehmen. Jedes der Behältermittel enthält eines der separaten Elemente, die in dem Verfahren verwendet werden.
Beispielsweise kann eines der Behältermittel ein durch Immunabsorption gebundenes Peptidfragment enthalten. Ein solches Fragment kann an ein separates Festphasen-Immunabsorptionsmittel oder direkt an die inneren Wände eines Behälters gebunden sein. Ein zweiter Behälter kann einen nachweisbar markierten Antikörper oder ein blockierendes Peptid in lyophilisierter Form oder in Lösung enthalten. Der Träger kann ebenfalls zusätzlich eine Vielzahl von Behältern enthalten, welche jeweils unterschiedliche, vorher bestimmte und bekannte Mengen des Antigens enthalten. Die letzteren Behälter können dann verwendet werden, um eine Standardkurve anzufertigen, von welcher aus die Ergebnisse extrapoliert werden können, die von der Probe erhalten wurden, welche die unbekannte Menge des Antigens enthielt.

I. Verwendungen der anti-Ligandenmoleküle

Die anti-Ligandenmoleküle der vorliegenden Erfindung haben eine Vielzahl von therapeutischen und diagnostischen Anwendungen. Beispielsweise können die therapeutischen Anwendungen eine Krebstherapie bei einem Patienten beinhalten, von dem vermutet wird, daß er an Krebs leidet. Insbesondere können die anti-Ligandenmoleküle der vorliegenden Erfindung wie z. B. Antikörper oder blockierende Peptide verwendet werden, um Patienten zu behandeln, welche Adenokarzinomzellen aufweisen, die den erbB-2-Liganden produzieren und/oder die erbB-2-Rezeptorproteine überexprimieren.
Ein Typ der Behandlung kann die Verwendung des Antikörpers, welcher mit einem therapeutischen Mittel konjugiert ist, beinhalten. Ein blockierendes Peptid, welches an ein therapeutisches Mittel gekoppelt ist, kann in einer analogen Weise verwendet werden. Durch ein Verabreichen einer wirksamen Menge des anti-Liganden, welcher an das therapeutische Mittel gekoppelt ist, an einen Patienten können die Adenokarzinomzellen in dem Patienten, welche den erbB-2- Liganden und/oder einen erbB-2-Rezeptor exprimieren, im Wachstum gehemmt oder getötet werden, wodurch eine Behandlung für Krebs zur Verfügung gestellt wird. Normale und bösartige Zellen, welche EGFR überexprimieren, werden von der Verabreichung des Mittels des anti-Liganden-Therapeutikum-Konjugats an den Patienten nicht beeinträchtigt. Somit kann die Behandlung eines Patienten mit dem anti-Ligandenkonjugat erbB-2-überexprimierende Krebszellen in vivo selektiv hemmen oder zerstören.
Gemäß dem Verfahren der Krebsbehandlung der Erfindung ist der konjugierte anti-Ligand in der Lage, aufgrund der Verbindung der Karzinomzellen mit dem erbB-2-Liganden Karzinomzellen zu erkennen und zu binden. Ohne darauf beschränkt zu sein, kann der Mechanismus der Bindung an die Krebszelle die Erkennung des erbB-2-Liganden, welcher auf der Zelloberfläche lokalisiert ist, beinhalten oder auf der Expression und/oder Sekretion des Liganden beruhen.
Wenn der konjugierte anti-Ligand an die Adenokarzinomzelle gebunden hat oder sich in enger Assoziierung damit befindet, wobei er mit dem Liganden wechselwirkt, ist das therapeutische Mittel in der Lage, diese Zelle zu hemmen oder zu töten. Auf diese Weise ist die Therapie der vorliegenden Erfindung für ein bestimmtes Ziel, d. h. Krebszellen, welche mit dem erbB-2-Liganden assoziiert sind, selektiv. Normale Zellen und andere Zellen, die nicht mit dem erbB-2- Liganden assoziiert sind (Zellen, welche den erbB-2-Ligan den nicht exprimieren oder binden), werden größtenteils durch diese Therapie nicht beeinträchtigt.
Alternativ können die anti-Liganden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Induzierung der Adenokarzinomzellproliferation zu verhindern oder zu hemmen. Beispielsweise werden Krebszellen, welche den p185erbB-2. Rezeptor enthalten, in Gegenwart niedriger Konzentrationen des erbB-2-Liganden zur Proliferation angeregt werden. Ein Verhindern, daß der erbB-2-Ligandenwachstumsfaktor mit seinem Rezeptor wechselwirkt, kann ein Mittel zur Verfügung stellen, um einen Krebspatienten zu behandeln.
Gemäß dem Verfahren des Hemmens der zellulären Proliferation der vorliegenden Erfindung ist der anti-Ligand in der Lage, an den erbB-2-Liganden zu binden. Ein Binden des ausgeschiedenen erbB-2-Liganden in vivo bildet einen Liganden-anti-Liganden-Komplex und kann somit die Liganden- Rezeptor-Wechselwirkung entweder sterisch oder anderweitig verhindern oder hemmen. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Behandlung zur Verfügung, um die Proliferation von Adenokarzinomzellen in einem Patienten zu verhindern oder zu hemmen, indem eine wirksame Menge eines anti-Liganden an einen solchen Patienten verabreicht wird.
Man wird anerkennen, daß eine Vielzahl von anderen therapeutischen Anwendungen der anti-Liganden der vorliegenden Erfindung vorstellbar ist. Solche Therapien können die Verwendung von anderen bekannten Behandlungstechniken in Kombination mit den anti-Liganden der Erfindung beinhalten. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf die beschriebene therapeutische Behandlung beschränkt sein, und diese wurde somit nur zur Veranschaulichung angegeben.
Weiterhin kann die Verabreichung einer wirksamen Menge der anti-Liganden der vorliegenden Erfindung, welche ausreicht, um eine Adenokarzinomzelle zu hemmen oder zu töten, in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren variieren, welche den Typ der bösartigen Zelle, das Körpergewicht des Patienten, den Typ des therapeutischen Mittels, das verwendet wird, und dergleichen einschließen. Die Fachleute werden anerkennen, daß die Menge, welche nötig ist, um eine bestimmte bösartige Zelle in vitro oder in vivo zu hemmen oder zu töten, leicht mit minimalem Versuchsaufwand bestimmt werden kann.
Diagnostische Anwendungen der anti-Ligandenmoleküle der vorliegenden Erfindung können beispielsweise den Nachweis des erbB-2-Liganden in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, umfassen. Solche Proben können Körpergewebe, Körperflüssigkeiten (wie z. B. Blut, Urin, Tränenflüssigkeit, Speichel, Serum und Cerebrospinalflüssigkeit), Fäzes, Zellextrakte und dergleichen sein.
Gemäß dem Verfahren des Nachweisens von erbB-2-Liganden wird der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung in vitro in das Zellkulturmedium ausgeschieden. Ein weiterer Wachstumsfaktor, TGFα, welcher ebenfalls in vitro sezerniert wird, wurde in den Körperflüssigkeiten von Krebspatienten identifiziert. Folglich kann der Wachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung (erbB-2-Ligand) in Körperflüssigkeiten, Stuhl usw. von einem Krebspatienten nachgewiesen werden.
Ein Testen auf den erbB-2-Liganden der Erfindung in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, kann somit ein Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs zur Verfügung stellen. Das bedeutet, der Nachweis des erbB-2- Liganden in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, zeigt das Vorliegen von den erbB-2-Liganden exprimierenden Zellen in einem Patienten an. Weiterhin kann der Test, da der anti-Ligand für den erbB-2-Liganden spezifisch ist, eine Information bezüglich der Biologie des Tumors eines Patienten liefern. Beispielsweise ist von Krebspatienten mit Adenokarzinomzellen, welche den erbB-2-Rezeptor überexprimieren, bekannt, daß diese eine viel kürzere krankheitsfreie Zeit und eine schlechtere Gesamtüberlebenschance haben als Krebspatienten, die keine erbB-2-Überexpression zeigen. Der Nachweis des erbB-2-Liganden-Wachstumsfaktors kann somit als ein prognostischer Test dienen, welcher dem Mediziner erlaubt, eine wirksamere Therapie zur Behandlung des Patienten auszuwählen.

J. Verwendungen des erbB-2-Liganden

Der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung kann sowohl diagnostisch als auch therapeutisch verwendet werden. Insbesondere kann der erbB-2-Ligand verwendet werden, um in einem Patienten Adenokarzinomzellen nachzuweisen, welche das erbB-2-Rezeptorprotein überexprimieren. Die Behandlung eines solchen Patienten, um das Wachstum dieser Zellen zu hemmen oder diese zu zerstören, kann ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden.
Die Expression des erbB-2-Protoonkogens, welches ein 185 kDa-Transmembranprotein codiert, dient als ein Marker, um einen besonderen invasiven bösartigen Zelltyp zu identifizieren. Da der erbB-2-Rezeptor ein Transmembranprotein ist, ist seine extrazelluläre Domäne für eine Wechselwirkung mit ihrem Liganden auf der Zelloberfläche zugänglich. Folglich kann der Ligand der vorliegenden Erfindung, welcher spezifisch an p185erbB-2 bindet, benutzt werden, um Zellen nachzuweisen, welche den erbB-2-Rezeptor exprimieren. Überraschenderweise reagiert der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung nicht mit dem EGFR und ist somit für den erbB-2-Rezeptor spezifisch. Daher ist der erbB-2-Ligand der Erfindung in der Lage, bestimmte Krebszellen in einem Patienten nachzuweisen, und er kann keine normalen Zellen oder bösartigen Zellen erkennen, die den erbB-2-Rezeptor nicht überexprimieren. Dieses Charakteristikum ist dafür wichtig, daß ein früher Nachweis von erbB-2-überexprimie renden bösartigen Zellen eine Prognose und Behandlung für den Patienten anzeigen kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Diagnose mit dem erbB-2-Liganden den Nachweis von p185erbB-2 überexprimierenden Krebszellen in einem Patienten. Der Nachweis solcher Zellen in einem Patienten kann durch irgendeinen aus einer Vielzahl von in vitro-Tests oder von in vivo- Abbildungstechniken erreicht werden. Beispiele für diese in vitro- und in vivo-Techniken sind in dem Abschnitt H bei der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen offenbart. Die Materialien zur Verwendung bei den in vitro-Tests und den in vivo-Abbildungstechniken, welche den erbB-2- Liganden benutzen, sind ebenfalls ideal für die Herstellung eines Kits geeignet.
Ein Fachmann wird erkennen, daß gemäß diesen Tests eine Vielzahl von Markierungen und Markierungsverfahren verwendet werden kann. Beispiele von Markierungstypen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Enzymmarkierungen, Radioisotopmarkierungen, nichtradioaktive Isotopmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Toxinmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen. Die Bindung dieser Markierungen an das erbB-2-Ligandenprotein kann unter Verwendung von Standardtechniken erreicht werden, die den Durchschnittsfachleuten gewöhnlich bekannt sind.
Der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, der an Krebs leidet. Behandlungstherapien mit dem erbB-2-Liganden sind spezifisch gegen Zellen gerichtet, welche den erbB-2- Liganden der vorliegenden Erfindung binden können. Auf diese Weise können bösartige Zellen, welche den erbB-2- Rezeptor überexprimieren, durch das Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung in ihrem Wachstum gehemmt oder zerstört werden.
Man wird anerkennen, daß eine Anzahl von therapeutischen Anwendungen des erbB-2-Liganden dieser Erfindung vorstellbar ist. Somit soll die vorliegende Erfindung nicht auf die beschriebenen therapeutischen Behandlungen beschränkt sein, und diese sind somit nur zur Veranschaulichung angegeben.
Ein Aspekt der Krebsbehandlung unter Verwendung des erbB-2-Liganden dieser Erfindung betrifft die Verwendung von Konjugaten des Liganden mit einem therapeutischen Mittel. Die erbB-2-Ligandenkonjugate der Erfindung können an die Adenokarzinomzelle binden, welche den erbB-2-Rezeptor überexprimiert. Wenn das erbB-2-Ligandenkonjugat an die Zelle gebunden ist, ist das therapeutische Mittel in der Lage, diese Zelle zu töten oder ihr Wachstum zu hemmen.
Auf diese Weise dient die Verabreichung einer wirksamen Menge des Ligandenkonjugats an einen Patienten als eine Behandlung, die bestimmte Typen von Krebszellen in vivo zerstören oder ihr Wachstum hemmen kann. Normale und bösartige Zellen, welche EGFR exprimieren, werden durch die Verabreichung des Konjugats aus dem Liganden und dem therapeutischen Mittel dieser Erfindung nicht beeinträchtigt.
Ein zweiter Aspekt der Behandlung unter Verwendung des erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung betrifft die inhibitorischen Wirkungen des Wachstumsfaktors. Überraschenderweise wirkt der erbB-2-Ligand der vorliegenden Erfindung in ausreichenden Konzentrationen als ein Inhibitor, welcher in der Lage ist, die Proliferation von Adenokarzinomzellen zu hemmen oder zu unterdrücken. Jede aus einer Vielzahl von Krebszellen kann mit dem erbB-2-Liganden der vorliegenden Erfindung in ihrem Wachstum gehemmt werden, vorausgesetzt, daß der erbB-2-Ligand mit der Zelle wechselwirken kann. Typischerweise werden bösartige Zellen, welche den erbB-2-Rezeptor überexprimieren, gehemmt. Solche Zellen können Brust-, Lungen-, Eierstock-, Magen-, Schild drüsen-, Prostata- oder Speicheldrüsen-Karzinomzellen einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Zellen, die von dem erbB-2-Liganden der Erfindung nicht beeinträchtigt werden, umfassen normale Zellen und bösartige Zellen, welche das Protoonkogen, welches für den erbB-2-Rezeptor codiert, nicht überexprimieren.
Eine in vitro- oder in vivo-Inhibition der Tumorzellen kann erreicht werden, indem eine wirksame Menge des erbB-2- Liganden der vorliegenden Erfindung verabreicht wird. Ein Fachmann wird erkennen, daß die Menge, welche ausreicht, um das Zellwachstum zu hemmen, in Abhängigkeit von dem Zelltyp, dem Körpergewicht des Patienten, dem Typ des verwendeten therapeutischen Mittels usw. variiert. Diese Variablen können leicht von den Fachleuten mit geringem Versuchsaufwand bestimmt werden.

Beispiel 1

Identifizierung der Liganden

Ein 4D5-Radiorezeptortest wurde verwendet, um konditioniertes Medium, das von verschiedenen menschlichen Zellinien stammte, auf das Vorliegen von p185erbB-2-Bindungsaktivität hin zu screenen. Das konditionierte Medium wurde gesammelt, wie von Bates et al., Cancer Res. 46: 1707-1713 (1986), beschrieben wird. Kurz gesagt, wurden die Medien 100fach in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle (YM5-Membran) (Amicon, Danvers, MA) konzentriert. Wenn sie aufgeklart und konzentriert waren, wurden die Medien bei -20ºC gelagert, wobei während der folgenden Tage fortlaufend Sammlungen durchgeführt wurden. Die konzentrierten Medien wurden unter Verwendung von Spectraphore-3-Schläuchen (Spectral Medical Industries, Los Angeles, CA) gegen 100 Volumina 0,1 M Essigsäure über einen Zeitraum von zwei Tagen bei 4ºC dialysiert. Das Material, das während der Dialyse ausgefällt wurde, wurde durch Zentrifugation bei 4000 Upm für 30 min bei 4ºC entfernt; Proteaseinhibitoren wurden zugegeben, wie von Bates et al., Cancer Res. 46: 1707-1703 (1986), beschrieben wird.
Ein monoklonaler Antikörper, 6E9, (Fendly, B. M. et al., Cancer Res. 50: 1550-1558 (1990)) gegen die extrazelluläre Domäne yon p185erbB-2, welcher nicht mit gp30 um die p185erbB-2-Bindung konkurriert, wurde als eine Kontrolle verwendet, um die Möglichkeit auszuschließen, daß das erbB- 2-Onkoprotein oder der Teil von diesem, welche von den Zellen in ihr Wachstumsmedium ausgeschieden werden, den 4D5- Test stören könnte. Die ausgeschiedene extrazelluläre erbB- 2-Domäne würde mit der Bindung von sowohl 4D5 als auch 6E9 an p185erbB-2 konkurrieren, wogegen ein erbB-2-Ligand ausschließlich mit 4D5 konkurrieren würde. Jeglicher Antikörper, der gegen die extrazelluläre p185erbB-2-Domäne gerichtet ist, kann anstelle von 6E9 als ein Kontrollantikörper verwendet werden, vorausgesetzt, daß der Kontrollantikörper die 4D5- oder MOI93-Bindung nicht stört, d. h., daß der Kontrollantikörper und der Testantikörper nicht an dieselbe Bindungsstelle auf der extrazellulären Domäne binden.
Bindungstests wurden wie beschrieben (Lupu et al., Science 249: 1552 (1990)) durchgeführt. Proliferierende SK- Br-3-Zellen wurden mit iodierten anti-erbB-2-Antikörpern (4D5 oder 6E9) in Gegenwart mehrerer Konzentrationen an konditioniertem Medium inkubiert. Medien, die von SK-Br-3-, MCF-7-, HS578T-, MDA MB-453-, BT-549-, MDA MB-468- und MDA MB-157-Brustkrebszellen wie auch mehreren nichtbösartigen und transformierten Brustepithelzellen (die untersuchten Zellinien waren nichtbösartige Brustepithel-184-Zellen, unsterblich gemachte 184A1N4-Zellen und Onkogen-transformierte 184A1N4T (SV-40)-, 184A1N4H (ras)-, 184A1N4M (myc)-, 184A1N4TH (SV-40, myc)- und 184A1N4MH (myc, ras)-Zellen) stammten, wurden ausgewertet. Konditionierte Medien von MDA MB-231-Zellen wurden als eine positive Kontrolle verwendet, da von diesen Zellen bekannt war, daß sie gp30 sezernieren.
Nur eines der 15 verschiedenen getesteten Medien, das von den SK-Br-3-Zellen, zeigte eine Fähigkeit, mit 4D5 um die p185erbB-2 Bindung zu konkurrieren.

Beispiel 2

Charakterisierung und Reinigung des erbB-2-Liganden

Da die SK-Br-3-Zellen einen erbB-2-Liganden zu sezernieren schienen, war unser nächster Schritt, zu bestimmen, ob der mögliche Ligand eine Heparinbindung zeigte, was mit der Sekretion von gp30 konsistent wäre. Es wurde keine p185erbB-2 Bindungsaktivität nachgewiesen, nachdem das Medium von SK-Br-3-Zellen durch Heparinchromatographie aufgearbeitet wurde, was nahelegt, daß entweder gp30 in dem Medium nicht vorhanden war oder, da SK-Br-3-Zellen die extrazelluläre p185erbB-2-Domäne (ECD) in das Kulturmedium freisetzen, daß die ECD die Heparinbindung stören könnte oder, gebunden an die extrazelluläre Domäne, von der Säule abgewaschen werden könnte.
Unser nächster Schritt war, einen Reinigungsvorgang zu entwickeln, welcher die p185erbB-2 ECD nicht stören würde. Eine rekombinante extrazelluläre p185erbB-2 Domäne (ECD) (erhalten von der Genentech Inc., CA) wurde an eine Polyacrylamid-Hydrazid-Sepharose-Affinitätschromatographiematrix gekoppelt (Avromeas et al., Scand. J. Immunol. 8: 7 (1978)). Das Molekulargewicht dieser extrazellulären Domäne beträgt ungefähr 94 Kilodalton.
Die Kopplung wurde getestet, indem die Bindung eines iodierten 4D5-Antikörpers an die Säule gezeigt wurde. Andere Antikörper wie z. B. MOI93 können ebenfalls verwendet werden. Konzentrierte konditionierte Medien von SK-Br-3- Zellen wurden auf die Säule geladen, und eine Elution des erhaltenen Materials wurde schrittweise mit 1,0 M Zitronensäure über einen pH-Bereich von 4,0 bis 2,0 hinweg durchge führt, um die Dissoziation der erbB-2-ECD und des mutmaßlichen Liganden zu ermöglichen. Die Fraktionen wurden in dem 4D5-Bindungstest auf ihre p185erbB-2-Bindungseigenschaften hin getestet.
Eine einzige Reinigung ergab ein scheinbar homogenes Polypeptid mit 75 Kilodalton bei einem Elutions-pH von 3,0 -3,5. Die Homogenität der Probe wurde durch eine Analyse auf einer SDS-PAGE (Laemmli U. K., Nature 227 : 680 (1970)) durch Silberfärbung (Morissey, J. H., Anal. Biochem. 177: 307 (1981)) bestätigt (Fig. 1). Diese Präparation war die Quelle, die für weitere Experimente verwendet wurde.
Um zu bestätigen, daß das 75 kDa-Polypeptid (p75), welches von der ECD-Affinitätssäule bei einer Elution des konditionierten SK-Br-3-Mediums bei pH 3,0 - 3,5 erhalten wurde, tatsächlich ein Ligand für das erbB-2-Onkoprotein war, verwendeten wir zwei unabhängige Tests. Wir bestätigten zuerst mit dem 4D5-Radiorezeptortest, daß p75 (eluiert bei pH 3,0-3,5) spezifisch an den erbB-2-Rezeptor in SK- Br-3-Zellen bindet, während das Material aus anderen Chromatographiefraktionen oder dem Durchfluß keine solche Aktivität zeigte (Tabelle 1). Die Bindung des iodierten 6E9- Antikörpers an p185erbB-2 wurde durch p75 nicht verändert, was nahelegt, daß das eluierte Material nicht p185erbs-2 ECD war. Tabelle 1
Tabelle 1. Bindung der Chromatographiefraktionen von konditioniertem Medium von SR-Br-3-Zellen (p75) an p185erbB-2 und EGFR. SK-Br-3- und MDA-MB-468-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen in 5% FCS IMEM (Biofluids) plattiert (100.000 Zellen/Vertiefung). Bindungsstudien wurden wie beschrieben durchgeführt (Lupu et al., Science 249: 1552-1555 (1990)). 50 ml 100x konditioniertes Medium von SK-Br-3-Zellen wurden auf eine Affinitätschromatographiesäule mit extrazellulärer p185erbB-2 Domäne geladen. Der Durchfluß und Fraktionen, welche mit 1 M Zitronensäure (pH- Gradient von 4 bis 2) eluiert wurden, wurden gesammelt. Nach einer Neutralisation (pH 7,4) und einem Entsalzen mit PBS wurden die Fraktionen auf eine p185erbB-2 und EGFR-Bindungsaktivität hin getestet. Ein iodierter 4D5-Antikörper wurde verwendet, um die p185erbB-2 Bindung bei den SK-Br-3- Zellen festzustellen, und ein iodierter EGF wurde verwendet, um die EGFR-Bindung bei MDA-MD-468-Zellen festzustellen. Die Ergebnisse sind als Prozent der Bindung der Kontrolle (keine Behandlung) gezeigt. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt, und die Standardabweichung (SD) betrug in allen Fällen weniger als 15%.
Da gp30 als ein Ligand identifiziert wurde, welcher sowohl EGFR als auch p185erbB-2 gemeinsam ist, testeten wir ebenfalls die Aktivität von allen eluierten Fraktionen der konditionierten SK-Br-3-Medien in einem EGFR-Bindungstest unter Verwendung von MDA MB-468-Zellen und iodiertem EGF. In diesem Test verdrängten EGF und gp30, welche als Kontrollen verwendet wurden, die Bindung des iodierten EGF auf eine dosisabhängige Weise. Im Gegensatz dazu zeigte keine der eluierten Fraktionen, die von den konditionierten SK- Br-3-Medien stammte, eine Aktivität, was zeigt, daß p75 nicht an den EGFR bindet (Tabelle 4).
Da p75 mit dem erbB-2-Onkogenprodukt wechselwirkte, untersuchten wir als nächstes, ob p75 p185erbB-2 aktivierte. Wir untersuchten die Fähigkeit von p75, p185erbB-2 zu phosphorylieren, wobei menschliche MDA MB-453-Brustkrebszellen verwendet wurden, welche das erbB-2-Onkoprotein überexprimieren, aber keine nachweisbaren Spiegel an EGFR exprimieren. Zuerst bestimmten wir, daß p75 die Tyrosinphosphorylierung in MDA MB-453-Zellen aktivierte, wobei ein monoklonaler anti-Phosphotyrosin-Antikörper in einer Western-Blot- Analyse verwendet wurde (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)) (Fig. 2A). Die Spezifität der. Tyrosinphosphorylierung für p185erbB-2 wurde bestätigt, indem MDA MB-453-Zellen mit [³²Pi] markiert wurden und das p185erbB-2 onkoprotein mit einem polyklonalen Antikörper, welcher mit der C-terminalen Domäne von p185erb32 reagiert, aber keine Kreuzreaktivität mit EGFR zeigt, einer Immunpräzipitation unterzogen wurde (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7159 (1987)) (Fig. 2B). Keine Phosphorylierung wurde beobachtet, wenn die MDA MB-453-Zellen mit EGF behandelt wurden. Bei Kontrollexperimenten wurde phosphorylierter EGFR aus MDA MB-468-Zellen mit einem anti- EGFR-Antikörper nach einer Behandlung mit gp30, EGF und TGF α gefällt. p75 induzierte jedoch bei diesen Zellen keine Phosphorylierung des EGFR (Fig. 2C). Diese Beobachtungen unterstützten die Hypothese einer ausschließlichen Wechselwirkung zwischen p75 und seinem Rezeptor p185erbB-2.

Beispiel 3

Zelluläre Reaktion auf den erbB-2-Liganden

Wir untersuchten die biologischen Wirkungen von p75 in Brustkrebszellen, wobei verankerungsabhängige und verankerungsunabhängige Wachstumstests verwendet wurden. p75 hemmte die Zellproliferation der überexprimierenden Zellen SK- Br-3, BT-474 und MDA MB-453 um 70-80% bei einer Konzentration von 4 ng/ml (die Konzentration des p75-Polypeptids wurde durch den 4D5-Bindungstest bestimmt). Keine Inhibition wurde bei den MDA MB-468-Zellen beobachtet, welche den EGFR überexprimieren, oder bei den MCF-7-Zellen, welche weder p185erbB-2 noch EGFR überexprimieren gp30, das als eine Kontrolle verwendet wurde, hemmte die Proliferation von SK-Br-3- und MDA MB-468-Zellen (Fig. 3). In einem verankerungsunabhängigen Wachstumstest hemmte p75 die Koloniebildung in Weichagar von SK-Br-3- und MDA MB-453-Zellen um 60-70%.
Da p75 bei unseren Anfangsexperimenten das Wachstum von Brustkrebszellen hemmte, spekulierten wir, daß p75 entweder ein inhibitorischer Ligand war oder daß die inhibitorische Funktion von p75 aus einer Hyperstimulation des erbB-2- Rezeptors resultierte. Wir beobachteten, daß p75 bei sehr niedrigen Dosen, 3,3 pM (0,25 ng/ml), eine das Wachstum stimulierende Wirkung auf SK-Br-3 aufwies (Fig. 4). Die proliferativen Wirkungen von gp30 bei äquimolaren Konzentrationen waren ähnlich zu jenen von p75 (Fig. 4). Als eine zusätzliche Kontrolle wies EGF bei Konzentrationen von 1-100 nM keine wesentlichen Wirkungen auf das Wachstum der SK-Br-3-Zellen auf. Die Ergebnisse, welche mit p75 erhalten wurden, sprachen gegen die Möglichkeit eines inhibitorischen Liganden. Dosisabhängige paradoxe Wirkungen von Wachstumsfaktoren auf die Zellproliferation sind in der Literatur berichtet worden.
Niedrige Konzentrationen an gp30 stimulierten das Wachstum von SK-Br-3-Zellen, während hohe Konzentrationen das Wachstum hemmten (Lupu et al., Science 249: 1552 (1990)). Die EGFR-überexprimierenden Brustkrebszellen MDA MB-468 wie auch die A431-Krebszellen werden durch hohe Dosen von EGF im Wachstum gehemmt, werden aber durch sehr niedrige Dosen von EGF stimuliert (Kawamoto et al., J. Biol. Chem. 249: 7761 (1984); Ennis et al., Molec. Endocr. 3: 1830 (1989)). Es wurde ebenfalls berichtet, daß Zellen, die den Östrogenrezeptor überexprimieren, durch physiologische Dosen von Östrogen im Wachstum gehemmt werden (Kushner et al., Molec. Endocr. 4: 1465 (1990)).

Beispiel 4

Wechselwirkung von p75 mit der extrazellulären PlgSerbB-2 Domäne

In zusätzlichen Experimenten haben wir die Wechselwirkung von p75 und der löslichen extrazellulären p185erbB-2 Domäne untersucht. Wie man erwartet haben könnte, hemmte die Zugabe der löslichen p185erbB-2 ECD zu SK-Br-3-Zellen deren Koloniebildung in Weichagar. Die inhibitorische Wirkung dieser ECD kann entweder auf einer Dimerisierung der löslichen Domäne mit dem zellulären p185erbB-2 Rezeptor beruhen oder auf einer Bindung und Neutralisation von p75, das für deren Wachstum essentiell ist und daher zu einer Hemmung der Zellproliferation führt. ECD hemmte die Koloniebildung ausschließlich bei jenen Zellen, die p185erbB-2 überexprimierten (Fig. 5). Keine Inhibition wurde bei MDA MB-468- und MCF-7-Zellen beobachtet. Um den Mechanismus zu verstehen, durch welchen die erbB-2-ECD die Koloniebildung von SK-Br-3-Zellen hemmte, wurden wachstumsstimulierende Dosen von p75 zu ECD-behandelten Zellen zugegeben. Die inhibitorische Wirkung der ECD wurde durch die Zugabe von stimulierenden Dosen von p75 umgekehrt, was nahelegt, daß für p185erbB-2 komplizierte regulatorische Wege existieren können (Fig. 5).

Zusammenfassung

Kurz gesagt, haben wir ein neues Polypeptid mit 75 kDa identifiziert, welches an den p185erbB-2-Rezeptor bindet. Die Wirkungen von p75 auf Zellen mit sehr hohen erbB-2- Spiegeln waren ähnlich zu den berichteten Wirkungen des anderen bekannten Liganden, gp30. Im Gegensatz zu gp30 scheint p75 für den p185erbB-2-Rezeptor spezifisch zu sein. Weiterhin haben wir einen Beweis geliefert, daß Zellen, die den erbB-2-Rezeptor überexprimieren, ebenfalls einen seiner Liganden, welcher für ihre Proliferation benötigt wird, sezernieren können, was somit eine autokrine Schleife impliziert. Wir glauben, daß eine Manipulation dieses und anderer erbB-2-Liganden eine wichtige biologische Wirkung auf das Wachstum von menschlichen Neoplasmen haben könnte.
Modifikationen der oben beschriebenen Arten zur Durchführung der Erfindung, die für die Fachleute in der Medizin, Immunologie, Hybridomtechnologie, Pharmakologie und/oder verwandten Gebieten offensichtlich sind, sollen innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche liegen.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, welche in dieser Beschreibung erwähnt wurden, zeigen den Kenntnisstand der Fachleute an, an welche diese Erfindung gerichtet ist.
Obwohl die vorstehende Erfindung in gewissem Detail zur Veranschaulichung und anhand eines Beispiel zwecks eines klaren Verständnisses beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der angefügten Ansprüche praktiziert werden können.

Claims

1. Ein im wesentlichen reines Protein, wobei das Protein:

die antiproliferative Wirkung der löslichen extrazellulären erbB-2-Domäne (ECD) umkehrt;

einem Protein entspricht, das durch Elution von konditionierten SK-BR-3-Krebszellen-Medien von einer ECD- Affinitätssäule bei pH 3,0-3,5 erhältlich ist;

die Zellproliferation und Koloniebildung von Zellen hemmt, welche erbB-2 überexprimieren;

ein scheinbares Molekulargewicht, gemessen durch SDS- PAGE, von ungefähr 75 kDa aufweist;

in der Lage ist, die Phosphorylierung von p185erbB-2 zu induzieren; und

EGFR nicht bindet.

2. Eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Hemmen des Wachstums von Zellen, die den Onkogen-erbB-2-Rezeptor überexprimieren, welche eine Menge des im wesentlichen reinen Proteins gemäß Anspruch 1 umfaßt, die wirksam ist, um das Wachstum der Zellen zu hemmen.

3. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Zellen Adenokarzinomzellen sind.

4. Eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Stimulieren des Wachstums von Zellen, die den Onkogen-erbB-2-Rezeptor überexprimieren, welche eine Menge des im wesentlichen reinen Proteins gemäß Anspruch 1 umfaßt, die aus reichend ist, um das Wachstum der Zellen zu stimulieren.

5. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei die Zellen Adenokarzinomzellen sind.

6. Ein Antikörper, welcher das Protein aus Anspruch 1 spezifisch bindet.

7. Eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Hemmen des Wachstums von Zellen, welche den Onkogen-erbB-2-Rezeptor überexprimieren, umfassend ein Behandeln der Zellen mit einer Menge des Antikörpers gemäß Anspruch 6, welche wirksam ist, um das Wachstum der Zellen zu hemmen.

8. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei der Antikörper mit einem therapeutischen Mittel konjugiert ist.

9. Eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Stimulieren des Wachstums von Zellen, welche den Onkogen-erbB-2- Rezeptor überexprimieren, umfassend ein Behandeln der Zellen mit einer Menge des Antikörpers gemäß Anspruch 6, welche ausreichend ist, um das Wachstum der Zellen zu stimulieren.

10. Das Verfahren aus Anspruch 9, wobei der Antikörper mit einem therapeutischen Mittel konjugiert ist.

11. Ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Zellen, welche das Protein gemäß Anspruch 1 exprimieren, in einem Patienten, umfassend:

a. In-Kontakt-Bringen einer Probe, die von dem Patienten erhalten wurde, mit einem nachweisbar markierten Antikörper, welcher das Protein spezifisch bindet, für ein Zeit, die ausreicht, damit eine Bindung zwischen dem Antikörper und dem Protein stattfinden kann; und

b. Nachweisen des Vorliegens des Proteins, das an den Antikörper gebunden ist, in der Probe.

12. Ein Verfahren zum Herstellen eines im wesentlichen reinen Proteins gemäß Anspruch 1, umfassend:

a. Herstellen einer cDNA-Bibliothek, welche der mRNA aus einer Zellinie entspricht, die das Protein exprimiert, und Selektionieren von Klonen aus der Bibliothek auf der Grundlage der Fähigkeit, mit Sonden zu hybridisieren, welche einen Teil der Sequenz des Proteins codieren;

b. Transformieren einer Wirtszelle mit DNA aus den Selektionsklonen;

c. Wachsenlassen der transformierten Wirtszelle in Kultur; und

d. Gewinnen des Proteins aus der Kultur.

13. Ein Verfahren zum Erhalten eines isolierten DNA-Moleküls, welches das Protein aus Anspruch 1 codiert, umfassend:

a. Konstruieren von DNA-Sonden, welche einen Teil der Sequenz des Proteins codieren;

b. Konstruieren einer cDNA-Bibliothek aus einer mRNA, welche aus einer Zellinie extrahiert wurde, die das Protein exprimiert;

c. Selektionieren der cDNA-Klone, welche DNA enthalten, die mit den DNA-Sonden hybridisiert; und

d. Isolieren der DNA aus den selektionierten Klonen.

14. Ein isoliertes DNA-Molekül, welches durch das Verfahren aus Anspruch 13 erhalten wurde.