JP2006519610A - 血管形成及び腫瘍成長を阻止するための核酸化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
図1は、B4ECv3タンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のEphB4リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図2は、B4ECv3NTタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のEphB4リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図3は、B2ECタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のEphrinB2リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図4は、B4ECv3−FCタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のEphB4リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図5は、B2EC−FCタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のEphrinB2リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図6は、B4EC−FC結合アッセイを示している(プロテインA−アガロースベース)。
図7は、B4EC−FC阻害アッセイを示している(溶液中の阻害)。
図8は、B2EC−FC結合アッセイを示している(プロテインA−アガロースベースのアッセイ)。
図9は、B4Ecv3に応答してのHUAECの化学走性を示している。
図10は、B2EC−FCに応答してのHHECの化学走性を示している。
図11は、B2ECに応答してのHHAECの化学走性を示している。
図12は、HUAECの細管形成に対するB4Ecv3の効果を示している。
図13は、HUAECの細管形成に対するB2EC−FCの効果を示している。
図14は、ヒトEphrinB2構築物の図式表示である。
図15は、ヒトEphB4構築物の図式表示である。
図16は、組換え可溶性EphB4ECタンパク質のドメイン構造を示している。ドメインの呼称は、次の通りである:L − リーダーペプチド、G − 球状(リガンド結合ドメイン)、C − Cysリッチドメイン、F1、F2 − III型フィブロネクチンリピート、H − Hisタグ。
図17は、EphB4ECタンパク質の精製及びリガンド結合特性を示している。A.精製EphB4由来の組換え可溶性タンパク質のSDS−PAAGゲル電気泳動(クーマシー染色)。B.EphrinB2−AP融合物の、Ni−NTAアガロースビーズ上に固定化されたEphB4由来の組換えタンパク質への結合。各タンパク質について、3つの独立の実験の結果を示してある。縦軸 − 420nmでの光学密度。
図18は、EphB4v3が化学走性を阻害することを示している。
図19は、EphB4v3が、マトリゲル上での細管形成を阻害することを示している。Aは、代表的実験におけるB4v3による細管形成の強い阻害を示している。Bは、B4v3により得られた管の長さの、濃度増大時の減少並びに接合点数の減少の定量(タンパク質なしの細胞との比較)を示している。結果は、二連のウェルを用いて独立して行った3つの実験からの平均値_S.D.として表してある。
図20は、可溶性EphB4が、MTSアッセイにより評価して、検出可能な細胞傷害性効果を有しないことを示している。
図21は、B4v3が、マトリゲルアッセイにおいて、内皮細胞による浸潤及び細管形成を阻害することを示している。(A)全浸潤細胞を検出するために(倍率20倍で写真撮影し又はマッソン三色染色法を使用)、A Bの上段左は、GFを含まないマトリゲルプラグの切片を示しており、Aの上段右は、GFを含むB4IgGを含む切片を示しており、そして下段左の切片はGFを含み、そして下段右は、B4v3の存在下でのGFを示している。内皮細胞の有意の浸潤は、GF含有マトリゲルでのみ見られる。上段右は、B4IgG(B4v3の二量体型を意味する)により誘導された多数の浸潤細胞を含む領域を示している。これらの図の上段左部分は、マトリゲルプラグの周辺に形成された細胞層に対応しており、これから細胞が、右下隅の方向に位置するプラグの中央に向かって浸潤する。これらのマトリゲルプラグの切片中の全細胞は、Scion イメージソフトウェアを用いて定量した。二連のプラグを用いた2つの実験から得られた結果を、平均値_S.D.として示してある。
図22は、EphB4由来の組換え可溶性タンパク質の存在下又は非存在下での、EphrinB2−Fc融合物による刺激に応答しての、PC3細胞中のEphB4レセプターのチロシンリン酸化を示している。
図23は、可溶性EphB4ECDの生存力及び細胞周期に対する効果を示している。A)2つのHNSCC細胞株の3日細胞生存力アッセイ。B)Aにおけるように処理したHNSCC−15細胞における細胞周期のFACS分析。これらの細胞の処理は、矢印で示したように、サブG0/G1及びS/G2期における蓄積を生じた。
図24は、B4v3が、マウス角膜ハイドロンマイクロポケットアッセイにおける新血管新生応答を阻害することを示している。
図25は、sB4v3を同時に注射すると、SCC15.B16、及びMCF−7が、マトリゲル及び成長因子の存在下で、これらの細胞のイン・ビボでの腫瘍成長を阻害することを示している。
図26は、可溶性EphB4が、3つの腫瘍型、B16メラノーマ、SCC15頭頸部癌、及びMCF−7乳癌におけるアポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成ことを示している。腫瘍を、成長因子及び可溶性EphB4を加えたマトリゲルと予備混合して皮下注射した。10〜14日後に、これらのマウスに、fitc−レクチン(緑)を静脈注射して、血管潅流を評価した。対照用PBSで処理した腫瘍は、大きい腫瘍密度及び強い血管形成応答を示した。sEphB4で処理した腫瘍は、生存力のある腫瘍細胞を有する領域内での腫瘍細胞密度の減少及び腫瘍血管形成の顕著な阻止、並びに腫瘍のネクローシス及びアポトーシスを示した。
図27は、前立腺細胞株におけるEphB4の発現を示している。A)EphB4モノクローナル抗体でプローブ検出した様々な前立腺癌細胞株、正常前立腺由来細胞株(MLC)及び急性骨髄芽球性リンパ腫細胞(AML)の全細胞溶解物のウエスタンブロット。B)ウエスタンブロットにより測定したPC−3細胞中のEphB4のリン酸化。
図28は、前立腺癌組織におけるEphB4の発現を示している。EphB4モノクローナル抗体は、代表的な前立腺癌凍結切片(上段左)又はアイソタイプ特異的な対照(下段左)を染色した。隣接するBPH組織は、EphB4モノクローナル抗体により染色された(上段右)。陽性シグナルは、腫瘍細胞における褐色である。間質及び正常上皮は、陰性である。腫瘍組織における染色された膜の位置に注意されたい(EphB4の膜貫通配置と一致する)。癌試料及び隣接するBPH組織から発現されたRNAの代表的QRT−PCR(下段右)。
図29は、前立腺癌細胞におけるEphB4の、腫瘍サプレッサー及びRXR発現によるダウンレギュレーションを示している。A)PC3細胞を、先端を切り詰めたCD4とp53又はPTEN又はベクターとで同時トランスフェクトした。24時間後に、CD4ソートした細胞を集めて、溶解させて、順次的に、EphB4及びβ−アクチン(標準化タンパク質)の発現についてのウエスタンブロットにより分析した。B)様々な安定細胞株のウエスタンブロット(A)。LNCaP−FGFは、FGF−8の安定なトランスフェクションクローンであるが、CWR22R−RXRは、RXRレセプターを安定に発現する。BPH−1を、良性の肥厚性前立腺上皮から樹立した。
図30は、前立腺癌細胞におけるEphB4の、EGFR及びIGFR−1によるダウンレギュレーションを示している。A)EGFR特異的インヒビターAG1478(1nM)で36時間処理した又はしてないPC3細胞のウエスタンブロット。減少したEphB4シグナルが、AG1478処理後に認められる。この膜を条片化して、影響されないβ−アクチンで再プローブ検出した。B)IGFR−1特異的中和抗体MAB391(2μg/ml;一晩)で処理した又はしてないPC3細胞の三連の試料のウエスタンブロット。この膜を、順次的に、EphB4、IGFR−1及びβ−アクチン抗体でプローブ検出した。IGFR−1シグナルは、予想されたMAB391処理によるシグナルの抑制を示している。
図31は、特異的EphB4 AS−ODN及びsiRNAの、発現及び前立腺細胞機能に対する効果を示している。A)EphB4完全長構築物を安定に発現している293細胞を利用して、siRNA472のEphB4発現を阻害する能力を評価した。細胞を、リポフェクタミン2000を利用して、50nM RNAiでトランスフェクトした。対照用siRNA(グリーン蛍光タンパク質;GFP siRNA)又はEphB4 siRNA 472でのトランスフェクションの40時間後の細胞溶解物のウエスタンブロットをEphB4モノクローナル抗体でプローブ検出し、細片化して、β−アクチンモノクローナル抗体で再プローブ検出した。B)EphB4 AS−10の、完全長のEphB4を一時的に発現する293における発現に対する効果。細胞を、AS−10又はセンスODNに6時間にわたってさらして、(A)におけるようにウエスタンブロットにより分析した。C)方法の節で記載したようにsiRNAで処理したPC3細胞の、48時間の生存力アッセイ。示したのは、三連の試料の平均±s.e.m.である。D)方法において記載したようにODNで処理したPC3細胞の、5日の生存力アッセイ。示したのは、三連の試料の平均±s.e.m.である。E)(A)におけるようにトランスフェクトされた50nM siRNAの存在下でのPC3細胞の移動の切屑アッセイ。示したのは、単層において切屑掻爬を行なった直後(0h)及び20時間の連続培養後に撮影した代表的な20倍の視野の顕微鏡写真である。多数の細胞が、20時間後に、対照用siRNAを用いた場合には切屑中に満ちたが、EphB4 siRNA 472を用いた場合には満ちなかった。F)示したのは、AS−10又はセンスODN(共に、10μM)で処理した細胞についての類似のアッセイである。G)方法で記載したようにsiRNA又は対照用siRNAでトランスフェクトしたPC3細胞のマトリゲル浸潤アッセイ。下部チャンバー中の5mg/ml フィブロネクチンに応答して、マトリゲルでコートされたインサートの下側へ移動する細胞を固定して、ギムザで染色した。示したのは、対照用siRNA及びsiRNA 472で処理した細胞の代表的顕微鏡写真である。細胞数を5つの別個の高倍率の視野で計数して、平均±s.e.m.を図中に示してある(右下)。
図32は、EphB4 siRNA 472の、細胞周期及びアポトーシスに対する効果を示している。A)示したようにsiRNAでトランスフェクトしたPC3細胞を、トランスフェクションの24時間後に、細胞周期状態について、方法に記載したようにフローサイトメトリーにより分析した。示したのは、細胞数対ヨウ化プロピジウム蛍光強度のプロットである。siRNA 472で処理した場合、対照用siRNAを用いた場合の1%と比較して、細胞集団の7.9%がアポトーシスを起こしている。B)PC3細胞のアポトーシスは、方法に記載したように、セル・デス・デテクションELISAplusキットにより検出される。405nmでの吸光度は、無核酸細胞画分中のヒストン及びDNA−PODの量に比例して増加している。示したのは、siRNA 472及びGFP siRNA(対照)の示した濃度での三連の試料の平均±s.e.m.である。
図33は、EphB4及びEphrinB2が、中皮腫細胞株において発現されることを、RT−PCR(A)及びウエスタンブロット(B)によって示している。
図34は、ephrinB2及びEphB4の発現を、中皮腫細胞におけるイン・シトゥーハイブリダイゼーションによって示している。チャンバースライド中で培養されたNCI H28中皮腫細胞株は、ephrinB2又はEphB4に対するアンチセンスプローブとハイブリダイズした(上段)。各ハイブリダイゼーションについての対照は、センスであった(下段)。陽性反応は、紺青色の細胞質染色である。
図35は、EphB4及びephrinB2の、中皮腫培養における細胞性発現を示している。悪性中皮腫の患者の胸膜浸出液に由来する一次細胞分離株及び細胞株NCI H28、NCI H2373及びNCI H2052の、ephrinB2及びEphB4についての免疫蛍光染色。緑色は、FITC標識二次抗体についての陽性シグナルである。免疫蛍光染色の特異性が、一次抗体のないシグナルの欠如(第一段)により示された。細胞核を、すべての細胞の位置を示すためにDAPI(青色)により対比染色した。示したのは、DAPIとFITC蛍光の組合せたイメージである。元の倍率は、200倍である。
図36は、ephrinB2及びEphB4の、中皮腫における発現を示している。悪性中皮腫生検の免疫組織化学。腫瘍の構造を示すためのH&E染色した切片;左下パネルは、一次抗体を含まないバックグラウンド対照である。EphB4及びephrinB2特異的染色は、褐色である。元の倍率は、200倍である。
図37は、EPHB4アンチセンスプローブ(A)及びEPHB4 siRNA(B)の、H28細胞の成長に対する効果を示している。
図38は、EPHB4アンチセンスプローブ(A)及びEPHB4 siRNA(B)の、細胞移動に対する効果を示している。
図39は、EphB4が、HNSCC一次組織及び転移において発現されることを示している。A)上段:方法で記載したようにEphB4モノクローナル抗体で染色して、腫瘍細胞に局在化されるDAB(褐色)で可視化した代表的保存用切片の免疫組織化学。濃い紫色の染色は、腫瘍細胞の存在を示している。右側欄は、EphB4ポリクローナル抗体(右上)で染色してDABで可視化したリンパ節転移の凍結切片である。対照(中段)を、ヤギの血清とインキュベートし、H&E(下段)は、染色されない間質に囲まれた転移フォーカスの位置を示している。B)EphB4(左欄)及びephrinB2(右欄)でプローブ検出したHNSCCの場合の一連の凍結切片のイン・シトゥーハイブリダイゼーション。run−off転写により生成されたDIG標識されたアンチセンス又はセンスプローブ。ハイブリダイゼーションシグナル(紺青色)が、アルカリホスファターゼ結合体化抗DIG抗体を利用して検出され、切片を、ニュークリア・ファースト・レッドで対比染色した。H&Eで染色された一連の切片を、腫瘍構造を説明するために示してある(左下)。C)腫瘍(T)、単純な正常組織(N)及びリンパ節生検(LN)よりなる患者試料のタンパク質抽出物のウエスタンブロット。試料を、4〜20%トリス−グリシンゲル中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びその後のナイロン膜上へのエレクトロブロットにより分画した。その後、膜を、EphB4モノクローナル抗体及びβ−アクチンMoAbを用いてプローブ検出した。化学発光シグナルを、オートラジオグラフィーフィルム上で検出した。示したのは、120kDに移動したEphB4特異的バンド及び40kDに移動したβ−アクチンである。このβ−アクチンシグナルを利用して、各試料のローディングとトランスファーを制御した。
図40は、EphB4が、HNSCC細胞株で発現され、EGFにより調節されることを示している:A)SCC細胞下部におけるEphB4発現の概観。順次的に、EphB4モノクローナル抗体でプローブ検出され、細片化され、そして図39Cにつき記載したように、β−アクチンモノクローナル抗体により再プローブ検出された全細胞溶解物のウエスタンブロット。B)特異的EGFRインヒビターAG1478の、EphB4発現に対する効果:0〜1000nM AG1478で24時間、10% FCS(左)を補った培地中で24時間又は1mM AG1478で4、8、12若しくは24時間(右)処理したSCC15の粗細胞溶解物のウエスタンブロット。示したのは、順次的に、EphB4及びβ−アクチンについてプローブ検出した膜である。C)SCC細胞株におけるEphB4発現に対するEGFRシグナリングの阻害の効果:10% FCSを含む成長培地中に維持した細胞を、24時間にわたって、1μM AG1478で処理し、その後、粗細胞溶解物を、細胞溶解物のウエスタンブロットにより分析し、その後、EGFR、EphB4、ephrinB2及びβ−アクチン抗体を用いてプローブ検出した。EGFRについての特異的シグナルは、170kDで、ephrinB2は37kDで、図1Cに記載したように、EphB4及びβ−アクチンに加えて検出された。β−アクチンは、ローディング及びトランスファーコントロールとして役立つ。
図41は、EphB4のEGFによる調節の機構を示している:A)EGFRシグナリング経路の図式表示(作用部位及び用いた特異的キナーゼインヒビターの名称を赤色で示している)。B)SCC15細胞は、示したように、EGF(10ng/ml)、3μM U73122又は5μM SH−5、5μM SP600125、25nM LY294002、――μM PD098095又は5μM SB203580を伴って又は伴わずに、更なる24インキュベーション前に24時間にわたって血清飢餓であった。N/Aは、等容の希釈剤(DMSO)のみを受けた培養物を示している。細胞溶解物を、EphB4モノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにかけた。β−アクチンシグナルは、タンパク質ローディング及びトランスファーの対照として役立つ。
図42は、特異的EphB4 siRNAが、EphB4発現、細胞の生存力を阻害して、細胞周期の休止を引き起こすことを示している。A)完全長のEphB4を安定に発現している293細胞を、リポフェクタミンTM2000を利用して、50nM RNAiによりトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後に、細胞を収穫し、溶解させて、ウエスタンブロットのために処理した。膜を、EphB4モノクローナル抗体を用いてプローブ検出し、細片化して、β−アクチンモノクローナル抗体をタンパク質のローディング及びトランスファーのための対照として用いて再プローブ検出した。負の試薬対照は、ごたまぜにしたグリーン蛍光タンパク質(GFP)配列に対するRNAiであり、対照は、リポフェクタミンTM2000単独でのトランスフェクションである。B)方法の節で記載したようにsiRNAで48時間処理したSCC細胞株のMTT細胞の生存力アッセイ。示したのは、三連の試料の平均+s.e.m.である。C)示したようにsiRNAをトランスフェクトしたSCC15細胞を、トランスフェクションの24時間後に細胞周期状態についてフローサイトメトリーによって方法に記載したように分析した。示したのは、細胞数対ヨウ化プロピジウム蛍光強度のプロットである。上段及び中段は、siRNAトランスフェクションの16時間後の細胞についてのプロットを示しており、下段は、トランスフェクションの36時間後の細胞についてのプロットを示している。特異的siRNA及び濃度を、各プロットについて示してある。Lipo=リポフェクタミンTM200擬似トランスフェクション。
図43は、特異的なEphB4 AS−ODNの、SCC細胞に対するイン・ビトロの効果を示している。A)EphB4完全長発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした293細胞を、トランスフェクションの6時間後に、示したようにアンチセンスODNで処理した。細胞溶解物を、AS−ODN処理の24時間後に集めて、ウエスタンブロットにかけた。B)SCC25細胞を、48ウェルプレートに、等しい密度で播種して、EphB4 AS−ODNで処理した(2日目及び4日目に、1、5及び10μMで)。細胞の生存力を、5日目にMTTアッセイにより測定した。示したのは、三連の試料の平均+s.e.m.である。EphB4タンパク質レベルの阻害において活性なAS−ODNは又、SCC15細胞の生存力の有効なインヒビターでもあったということに留意されたい。C)AS−10で36時間処理したSCC15細胞(下段)の、処理しなかった細胞(上段)と比較しての細胞周期分析。D)単層中に3mmの幅の中断を作るようにプラスチック製パスツールピペットで切屑掻爬したSCC15細胞の集密培養物。これらの細胞の、阻害性EphB4 AS−ODN(AS−10)及び非阻害性のAS−ODN(AS−1)の存在下で移動して傷を閉じる能力を、48時間後に評価した。ごたまぜにしたODNは、負の対照用ODNとして含まれている。未処理と記された培養は、ODNにさらされなかった。実験の開始時に、すべての培養は、等しい幅の、1μM EphB4 AS−10で見られるものに類似の切屑を48時間後に示した。赤色の角型括弧は、元の切屑の幅を示している。E)方法で記載した2チャンバーアッセイにおけるSCC15細胞の、20mg/ml EGFに応答しての移動。示したのは、未処理(NT)、AS−6及びAS−10処理した細胞及び10ng/ml タキソール(移動阻害の陽性対照)の代表的顕微鏡写真である。F)細胞数を、5つの個別の高倍率の視野で計数して、平均+s.e.m.をグラフに示してある。
図44は、EphB4 AS−ODNが、腫瘍成長をイン・ビボで阻害することを示している。EphB4 AS−10又は切屑掻爬したODN(20mg/kg/日)で処置(5×106細胞の移植後に処置開始)したBalb/CヌードマウスにおけるSCC15皮下腫瘍移植片の成長曲線。対照用マウスは、等容積の希釈剤(PBS)を受けた。示したのは、6マウス/グループの平均+s.e.m.である。*P=0.0001(スチューデントのt検定による、切屑掻爬したODN処置されたグループとの比較)。
図45は、EphrinB2が、KS生検組織において発現されるが、EphB4は発現されないことを示している。(A)ephrinB2及びEphB4に対するアンチセンスプローブ及び腫瘍構造を示すための対応するH&E染色した切片を用いるイン・シトゥーハイブリダイゼーション。ISHにおける紺青色は、ephrinB2についての陽性反応を示す。EphB2についてのシグナルは、カポジ肉腫生検において検出されなかった。対照的に、EphB4についてのISHシグナルは、扁平細胞癌細胞において強い。EphrinB2は又、KSにおいて、EphB4−AP融合タンパク質を利用して検出された(左下)。(B)ephrinB2の、EphB4/Fc融合タンパク質による検出。隣接する切片を、H&E(左)で染色して、腫瘍構造を示した。黒い矩形は、方法の節に記載したように、FITC標識された抗ヒトFc抗体により検出されたEphB4/Fc処理した切片(中断)で示された領域を示している。対照として、隣接切片を、ヒトFc断片で処理した(右)。この切片に結合するEphB4/Fcから生じる特異的シグナルは、腫瘍細胞の領域でのみ見られる。(C)ephrinB2とHHV8潜在性タンパク質LANA1の同時発現。二重標識共焦点免疫蛍光顕微鏡及びephrinB2(赤色)LANA1(緑色)又はEphB4(赤色)(凍結KS生検材料)に対する抗体は、直接、LANA1及びephrinB2のKS生検における同時発現を示す。同時発現は、黄色として見られる。生検の、核のヨウ化プロピジウム染色(赤色)を有する細胞における、PECAM−1に対する抗体による二重標識共焦点イメージ(緑色)は、腫瘍の血管の性質を示している。
図46は、HHV−8が、静脈内皮細胞において、動脈マーカーの発現を誘導することを示している。(A)HUVEC及びHUVEC/BC−1の培養物の、動脈/静脈マーカー及びウイルスタンパク質についての免疫蛍光。培養物を、チャンバースライド上で生育させて、ephrinB2(a,e,i)、EphB4(m,q,u)、CD148(j,v)、及びHHV−8タンパク質LANA1(b,f,m)又はORF59(r)の免疫蛍光検出のために、材料と方法に記載したように処理した。同じ視野の組み合わせたイメージ中の黄色は、ephrinB2とLANA又はephrinB2とCD148の同時発現を示している。生存力のある細胞の位置を、DAPI(青色)による核染色により第3欄に示した(c、g、k、o、s、w)。顕微鏡写真は、代表的視野のものである。(B)HUVEC及び2つのHHV−8感染培養物(HUVEC/BC−1及びHUVEC/BC−3)の、ephrinB2及びEphB4についてのRT−PCR。EphrinB2生成物(200bp)は、HUVEC/BC−1、HUVEC/BC−3に見られ、及びEphB4生成物(400bp)は、HUVECに見られる。見られるのは又、投入RNAの量及び完全性についての対照としての、β−アクチン RT−PCRでもある。
図47は、HHV−8が、カポジ肉腫細胞における動脈マーカーの発現を誘導することを示している。(A)ephrinB2の様々な細胞溶解物についてのウエスタンブロット。SLK−vGPCRは、HHV−8 vGPCRを発現するSLKの安定なクローンであり、SLK−pCEFLは、空の発現ベクターでトランスフェクトした対照用の安定なクローンである。LANA又はLANAΔ440でトランスフェクトしたSLK細胞は、それぞれ、SLK−LANA及びSLK−Δ440である。タンパク質のローディング及びトランスファーの量は、これらの膜を、β−アクチンモノクローナル抗体で再プローブ検出することにより測定した。(B)KS−SLK細胞の、発現ベクターpvGPCR−CEFLによる一時的トランスフェクションは、FITCによる免疫蛍光染色(緑色)により示されたように、ephrinB2の発現を生じたが、対照用ベクターpCEFLは、何の効果も有しなかった。KS−SLK細胞(0.8×105/ウェル)を、リポフェクタミン2000を利用して、0.8μgのDNAでトランスフェクトした。24時間後に、細胞を固定して、ephrinB2ポリクローナル抗体及びFITC結合体化二次抗体で、方法に記載したように染色した。(C)HUVECの、vGPCRによる一時的トランスフェクションは、ephrinB2ルシフェラーゼ構築物からの転写を誘導する。8×103HUVEC(24ウェルプレート中)を、スーパーフェクトを利用して、0.8μg/ウェルのephrinB2プロモーター構築物でトランスフェクトした。該構築物は、翻訳開始部位に関して−2941〜−11の配列、又は2つの5’−欠失を、示したように、80ng/ウェルのpCEFL又はpvGPCR−CEFLと共に含んでいる。ルシフェラーゼを、トランスフェクションの48時間後に測定したが、誘導比率をグラフの右に示してある。pGL3Basicは、プロモーターレスのルシフェラーゼの対照用ベクターである。GPCRは、同時トランスフェクトされたβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導するので、ルシフェラーゼをタンパク質に対して標準化した。グラフ表示したのは、6つの複製物の平均+SEMである。示したのは、3つの同様の実験の一つである。
図48は、VEGF及びVEGF−Cが、ephrinB2発現を調節することを示している。A)ephrinB2の中和抗体による阻害。細胞を、完全生育培地中で培養して、抗体(100ng/ml)に36時間さらしてから集めて溶解してウエスタンブロットに供した。B)ephrinB2発現の誘導のために、細胞を、成長因子を欠く5%血清を含むEBM生育培地中で培養した。個々の成長因子を示したように加えて、これらの細胞を、36時間後に収穫した。タンパク質ローディング及びトランスファーの量を、これらの膜をβ−アクチンモノクローナル抗体で再プローブ検出することによって測定した。
図49は、特異的siRNAによるEphrinB2ノックダウンが、VEGFの存在下で成長したが、IGF、EGF又はbFGFの存在下では成長しなかったKS細胞及びHUVECにおける生存力を阻害することを示している。A)KS−SLK細胞を、ephrinB2及び対照に対する様々なsiRNAでトランスフェクトした。48時間後に、これらの細胞を収穫して、粗細胞溶解物を、4〜20%SDS−PAGEにて分画した。組織内で生成されたephrinB2に対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行なった。この膜を細片化して、β−アクチンモノクローナル抗体(Sigma)を利用して再プローブ検出して、等しいローディング及びトランスファーを示した。B)ephrinB2及びEphB4 siRNAの存在下でのKS−SLK培養物の3日細胞生存力アッセイ。1×105細胞/ウェル(24ウェルプレート中)を、グラフに示したように、0、10及び100ng/mlのsiRNAで処理した。培養物の生存力を、MTTアッセイによって、方法の節に記載したように測定した。示したのは、二連の試料の平均+標準偏差である。C)HUVE細胞を、フィブロネクチンでコートした8ウェルチャンバースライドに播種した。これらのHUVE細胞を、一晩、すべての生育補足物を含むEGM−2培地中で生育させた。後日、この培地を、示したように、VEGF(10ng/ml)又はEGF、FGF及びIGFを含む培地と交換した。37℃で2時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を利用して、ephrinB2、EphB4又は対照としてのグリーン蛍光タンパク質(GFP)に対する10nMのsiRNAを含むOpti−MEM培地中でトランスフェクトした。これらの細胞を、2時間インキュベートしてから、成長因子又はVEGFのみを含む新鮮な培地をそれぞれのウェルに加えた。48時間後に、これらの細胞を、クリスタルバイオレットで染色して、直ちにデジタルカメラで写真を10倍の倍率で撮影した。
図50は、可溶性EphB4が、KS及びECコード形成及びイン・ビボの血管形成を阻害することを示している。マトリゲルTMにおけるHUVECのコード形成アッセイ(上段)。対数増殖期の細胞を、一晩、示した濃度のEphB4細胞外ドメイン(ECD)で処理してから、マトリゲルTM上にプレートした。細胞をトリプシン処理して、0.5mlマトリゲルを含む24ウェルプレートにプレートした(1×105細胞/ウェル)。示したのは、示したように試験化合物の連続的存在下で、マトリゲルTM上にプレートしてから8時間後のコード形成の代表的な20倍の位相差視野である。元の倍率は、200倍である。KS−SLK細胞を、同様にして、マトリゲルTMにおけるコード形成アッセイにおいて処理した(中段)。下段は、イン・ビトロのマトリゲルTMアッセイを示している:成長因子及びEphB4 ECD又はPBSを含むマトリゲルTMプラグを、マウスの腹中領域の皮下に移植した。7日後に、これらのプラグを取り出して、切片化し、H&Eで染色して、マトリクス中への細胞移動を可視化した。大きい内腔を有する完全な血管が、対照において認められるが、EphB4 ECDは、殆ど完全に、細胞のマトリゲル中への移動を阻害した。
図51は、膀胱癌細胞株におけるEPHB4の発現(A)、及びEGFRシグナリング経路によるEPHB4発現の調節(B)を示している。
図52は、p53が、5637細胞におけるEPHB4の発現を阻害することを示している。
図53は、EPHB4 siRNA472による治療の際の膀胱癌細胞株(5637)の成長阻害を示している。
図54は、EPHB4 siRNA472をトランスフェクトした5637細胞のアポトーシス研究における結果を示している。
図55は、EPHB4アンチセンスプローブの、細胞移動に対する効果を示している。5637細胞を、EPHB4AS10(10μM)で処理した。
図56は、EPHB4 siRNAの、細胞浸潤に対する効果を示している。5637細胞を、siRNA472又は対照用siRNAでトランスフェクトした。
図57は、EphB4モノクローナル抗体の、G250による及びプルダウンアッセイにおける比較を示している。
図58は、EphB4抗体が、SCC15異種移植片腫瘍の成長を阻害することを示している。
図59は、EphB4抗体が、SCC15頭頚部癌において、アポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成を引き起こすことを示している。
図60は、EphB4抗体の全身投与が、腫瘍の退行へと導くことを示している。
図61は、ヒトのEphB4のゲノムヌクレオチド配列を示している。
図62は、ヒトのEphB4のcDNAヌクレオチド配列を示している。
図63は、ヒトのEphrinB2のゲノムヌクレオチド配列を示している。
図64は、ヒトのEphrinB2のcDNA配列を示している。
図65は、ヒトのEphB4のアミノ酸配列を示している。
図66は、ヒトのEphrinB2のアミノ酸配列を示している。
本開示は、部分的に、ephrin/ephrinレセプター経路によるシグナリングが、腫瘍形成に寄与するという発見に基づいている。出願人は、ephrinB2及びEphB4の腫瘍組織における発現を検出して、ephrin/ephrinレセプターによるシグナリングをブロックするための抗腫瘍治療剤を開発した。加えて、この開示は、EphB4及びEphrinB2の発現のアンチセンス又はRNAiベースの阻害のための核酸及び方法を提供する。従って、ある面において、この開示は、癌並びに血管形成と関連する病気及び望ましくない血管形成関連過程を治療するために使うことのできる多数の核酸化合物を提供する。
この開示は、ephrin及び/又はephrinレセプター(Eph)の遺伝子発現を阻害し又は減少させるための核酸治療剤及び方法に関係している。「阻害する」又は「減少させる」とは、その遺伝子の発現、又はEphrinB2及び/又はEphB4などの一種以上のタンパク質若しくはタンパク質のサブユニットをコードする核酸若しくは等しい核酸のレベルを、この開示の核酸治療剤の非存在下で認められるものよりも一層低く減じることを意味する。「遺伝子」とは、RNA例えばポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む(限定はしない)核酸をコードする核酸を意味する。
ある具体例において、この開示は、アンチセンス核酸に関係する。「アンチセンス核酸」とは、標的核酸に、RNA−RNA、RNA−DNA又はRNA−PNA(タンパク質核酸)相互作用によって結合して、その標的核酸の活性を変化させる非酵素的核酸化合物を意味する(総説としては、Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004及びWoolf等、米国特許第5,849,902号を参照されたい)。典型的には、アンチセンス分子は、そのアンチセンス分子の一本鎖連続配列に沿って、標的配列に対して相補的である。しかしながら、ある具体例においては、アンチセンス分子は、ループを形成することができ、ループを形成する基質核酸に結合する。従って、アンチセンス分子は、2つ(以上)の非連続的基質配列に対して相補的であってよく、又はアンチセンス分子の2つ(以上)の非連続的配列部分が、標的配列に相補的であってよく、又は両方であってよい。現在のアンチセンスストラテジーの総説としては、Schmajuk等、1999, J.Biol.Chem., 274, 21783-21789, Delihas等、1997, Nature, 15, 751-753, Stein等、1997, Antisense N.A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech.Genet.Eng.Rev., 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad.Pharmacol., 40, 1-49を参照されたい。
ある具体例において、この開示は、二本鎖RNA(dsRNA)及びRNAi構築物に関係する。用語「dsRNA」は、ここで用いる場合、RNA干渉(RNAi)の可能な二本鎖RNA分子を指し、これは、siRNA(例えば、Bass, 2001, Nature,411, 428-429; Elbashir等、2001, Nature, 411, 494-498; 及びKreutzer等、PCT公開No.WO00/44895;Zernicka-Goetz等、PCT公開No.WO01/36646;Fire, PCT公開No.WO99/32619;Plaetinck等、PCT公開No.WO00/01846;Mello及びFire, PCT公開No.WO01/29058;Deschamps-Depaillette, PCT公開No.WO99/07409;及びLi等、PCT公開No.WO00/44914参照)を含む。加えて、RNAiは、最初、二本鎖RNA(dsRNA)が遺伝子発現を特異的様式及び転写後様式でブロックする植物及び蠕虫において認められた現象に適用された用語である。RNAiは、遺伝子発現をイン・ビトロ又はイン・ビボで阻害する有用な方法を提供する。
ある具体例において、この開示は、酵素的核酸化合物に関係する。「酵素的核酸化合物」とは、基質結合領域において、特異的標的遺伝子に対する相補性を有し且つ標的核酸を特異的に開裂することに対して活性な酵素活性をも有する核酸化合物を意味する。この酵素的核酸化合物が分子間で核酸を開裂させることができ、それにより、標的核酸化合物を不活性化させることができるということは理解される。これらの相補性領域は、酵素的核酸化合物の標的核酸への十分なハイブリダイゼーションを可能にし、それ故、開裂を可能にする。100パーセントの相補性(同一性)が好ましいが、50〜75%ほどの低い相補性も、この開示において有用でありうる(例えば、Werner及びUhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann等、1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31参照)。これらの酵素的核酸は、塩基、糖、及び/又はリン酸基において改変することができる。ここに記載したように、用語「酵素的核酸」は、リボザイム、触媒性RNA、酵素的RNA、触媒性DNA、アプタザイム又はアプタマー結合性リボザイム、調節可能リボザイム、触媒性オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、DNAザイム、RNA酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、レッドザイム、オリゴザイム又はDNA酵素など語句と交換可能に用いる。これらの用語のすべては、酵素活性を有する核酸化合物を記述する。本願に記載した特定の酵素的核酸化合物は、この開示に限られるものではなく、当業者は、この開示の酵素的核酸化合物において重要であるすべては、それが、少なくとも一つの標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有すること及びそれが、その分子に核酸開裂活性及び/又は核酸連結活性を与える該基質結合部位の内部又は周囲にヌクレオチド配列を有することであることを認めるであろう(Cech等、米国特許第4,987,071号;Cech等、1988, 260 JAMA 3030)。
この開示の有用な核酸化合物(例えば、アンチセンス核酸、dsRNA及び酵素的核酸化合物)の標的は、Draper等、30WO93/23569;Sullivan等、WO93/23057;Thompson等、WO94/02595;Draper等、WO95/04818;McSwiggen等、米国特許第5,525,468号に開示されたようにして決定することができる。他の例には、次の病気関連遺伝子の発現の不活性化のPCT出願:WO95/23225、WO95/13380、WO94/02595が含まれる。ここで、それらの文献中で与えられた案内を繰り返すよりは、下記に、かかる方法の特定の実施例を与える(当分野のものに限られない)。
100ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は、自動化法を利用しては困難であり、かかる分子の治療コストは、非常に高価である。この開示においては、小さい核酸モチーフ(小さいは、約100ヌクレオチド長未満の、好ましくは約80ヌクレオチド長未満の、一層好ましくは約50ヌクレオチド長未満の核酸モチーフ(例えば、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、及びRNAi構築物)を指す)が、外因性送達のために好適に用いられる。これらの分子の単純な構造は、その核酸の、RNA構造の標的領域を侵襲する能力を増大させる。
改変を有する核酸化合物(例えば、塩基、糖及び/又はリン酸)は、それらの血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、それにより、それらの効能を増すことができる。当分野には、ヌクレアーゼ安定性及び効力の有意の増進を伴って核酸化合物に導入することのできる糖、塩基及びリン酸の改変を記載している幾つかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基例えば2’−アミノ、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−H、ヌクレオチド塩基の改変によって、安定性を増進させ及び/又は生物学的活性を増進させるために改変される(総説としては、Usman及びCedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman等、1994, Nucleic Acids Symp. Ser.31,163; Burgin等、1996, Biochemistry, 35, 14090を参照されたい)。核酸化合物の糖の改変は、当分野では多数記載されてきた(Eckstein等、PCT公開No.WO92/07065;Perrault等、Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken等、Science, 1991, 253, 314-317; Usman及びCedergren, Trends in Biochem.Sci., 1992, 17, 334-339; Usman等、PCT公開No.WO93/15187;Sproat, 米国特許第5,334,711号及びBeigelman等、1995, J.Biol.Chem., 270, 25702; Beigelman等、PCT公開No.WO97/26270;Beigelman等、米国特許第5,716,824号;Usman等、米国特許第5,627、053号;Woolf等、PCT公開No.WO98/13526;Thompson等、米国特許第60/082,404号(1998年4月20日出願);Karpeisky等、1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131; Earnshaw及びGait, 1998, Biopolymers (Nucleic acid Sciences), 48, 39-55; Verma及びEckstein, 1998, Annu.Rev.Biochem., 67, 99-134;及びBurlina等、1997, Bioorg.Med.Chem., 5, 1999-2010参照)。同様の改変を利用して、本開示の核酸化合物を改変することができる。
ある具体例において、本開示は、血管形成を阻止する方法及び血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。他の具体例において、本開示は、腫瘍の成長を阻止し又は低減させる方法及び癌を患っている個人を治療する方法を提供する。これらの方法は、その個人への、治療上有効な量の少なくとも一種の上記の核酸治療剤の投与を含む。これらの方法は、動物の特にヒトの治療及び予防処置において、特に目標とされている。
これらの主題の核酸化合物の送達方法は、当分野で公知である(例えば、Akhtar等、1992, Trends Cell Bio., 2, 139; 及びDelivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, Akhtar編、1995; Sullivan等、PCT公開No.WO94/02595参照)。これらのプロトコールは、事実上任意の核酸化合物の送達のために利用することができる。核酸化合物は、当業者に公知の様々な方法によって細胞に投与することができ、該方法には、イオン導入法によるリポソームへの封入、又は他のビヒクル例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル及び生体付着性ミクロスフェアへの組込みが含まれるが、これらに限られない。或は、この核酸/ビヒクルの組合せは、直接的注射により又は点滴ポンプの利用によって局所的に送達される。送達の他の経路には、経口投与(錠剤又は丸薬形態)及び/又は髄腔内送達(Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158)が含まれるが、これらに限られない。他のアプローチには、様々な輸送及びキャリアーシステムの利用例えば結合体及び生物分解性ポリマーの利用によるものが含まれる。薬物送達ストラテジーについての分かり易い総説としては、Ho等、1999, Curr.Opin.Mol.Ther., 1, 336-343及びJain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998及びGroothuis等、1997, J.Neuro Virol., 3, 387-400を参照されたい。核酸送達及び投与の一層詳細な説明は、Sullivan等、前出、Draper等、PCTWO93/23569、Beigelman等、PCT公開No.WO99/05094、及びKlimuk等、PCT公開No.WO99/04819に与えられている。
ヒトEphrinB2及びEphB4タンパク質の細胞外ドメインの可溶性誘導体は、EphrinB2の切り詰められた完全長の予想される細胞外ドメイン(B4ECv3、B2EC)又は、ヒト免疫グロブリンの定常領域(IgG1 Fc断片)との翻訳融合物例えばB2EC−FC、B4ECv2−FC及びB4ECv3−FCを表している。代表的なヒトEphrinB2構築物及びヒトEphB4構築物を、図14及び15に示してある。
1)EphrinB2及びEphB4の組換え可溶性誘導体を生成するための哺乳動物用発現ベクター
EphrinB2及びEphB4の組換え可溶性誘導体を発現させるためのプラスミドベクターは、pEF6/V5−His−TOPOベクター(Invitrogen)、pIG(Novagen)又はpRK5に基づくものであった。pEF6/V5−His−TOPOは、ヒトの伸長因子1a’エンハンサー/プロモーター及びブラスチシジン耐性マーカーを含む。pIGベクターは、CMVプロモーターの制御下でのヒトIgG1のFc部分とのタンパク質融合物の高レベル発現のためにデザインされ、pRK5は、一般的目的のCMVプロモーター含有哺乳動物用発現ベクターである。プラスミド構築物pEF6−B4EC−NTを生成するために、ヒトEphB4のcDNA断片を、オリゴプライマー 5'-GGATCCGCC ATGGAGCTC CGGGTGCTGCT-3'及び5'-TGGATCCCT GCTCCCGC CAGCCCTCG CTCTCATCCA-3'を利用するPCRによって増幅して、pEF6/V5−His−TOPOベクター中にTOPO−クローン化した。pEF6−hB4ECv3を、pEF6−B4ECNTから、プラスミドDNAをEcoRV及びBstBIで消化して、両端をクレノー酵素を用いて充填してベクターに再連結することによって誘導した。pEF6−B4EC−NTによりコードされる組換えEphB4誘導体は、エピトープ又は精製タグを含まないが、pEF6−hB4ECv3によりコードされる類似のB4ECv3タンパク質は、調整培地からの精製を容易にするV5エピトープタグ及び6×HisタグをそのC末端に含む。プラスミド構築物pEF6−hB2ECを、オリゴプライマー5'-TGGATCCAC CATGGCTGT GAGAAGGGAC-3'及び5'-ATTAATGGTGATGGT GAT GATGACTAC CCACTTCGG AACCGAGGATGTTGTTC-3'を利用するEphrinB2cDNAのPCR増幅及びpEF6/V5−His−TOPOベクター中へのTOPOクローニングにより生成した。プラスミド構築物pIG−hB2EC−FCを、オリゴプライマー5'-TAAAGCTTCCGCCATGG CTGTGAGAAGGGAC-3'及び5'-TAGGATCCACTTCGGA ACCGAGGATGTTGTT CCC-3'を利用するEphrinB2cDNAのPCR増幅、とその後のTOPOクローニング及びその結果生成したPCR断片を配列決定し、BamHI及びHindIIIで切断したpIGhIgG1 Fc融合ベクター中に連続サブクローン化することにより生成した。同様に、pIG−hB2EC及びpIG−hB4ECv3を、EphB4 ECD cDNAの部分を、オリゴプライマー5'-ATAAGCTTCC GCCATGGAGC TCCGGGTGCTG-3'及び5'-TTGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGC TCTCATC-3'を利用してPCR増幅し、BamHI及びHindIIIで切断したpIG hIgG1 Fc融合発現ベクター中に連続サブクローニングすることにより生成した。上記のベクターによりコードされたタンパク質の予想される配列を、図1〜5に示してある。
HEK293T(ヒト胎児腎臓系統)細胞を、10%透析済ウシ胎児血清及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン抗体を含むDMEM中に維持した。細胞を、5%CO2/95%空気の加湿した大気中で37℃に維持した。トランスフェクションを、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を利用して、製造業者のプロトコールに従って行なった。トランスフェクションの一日前に、293T細胞を、トランスフェクション時に80%集密に達するように高密度で播種した。1:3の比のプラスミドDNAとリポフェクタミン試薬を、Opti−MEMI低下血清培地(Invitrogen)中で、5分間希釈して、一緒に混合してDNA:リポフェクタミン複合体を形成した。各10cm培養皿に、10μgのプラスミドDNAを使用した。20分後に、上記複合体を、培養培地中の細胞に直接加えた。トランスフェクションの16時間後に、培地を吸引して、無血清DMEMで一回洗い、無血清DMEMで置き換えた。分泌されたタンパク質を、48時間後に、調整培地を集めることにより収穫した。調整培地を、10,000gで20分間の遠心分離により清澄化して、0.2μmフィルターにより濾過して、精製用に利用した。
EphB4ECv3及びEphB4ECntを産生する安定な細胞株を生成するために、HEK293又はHEK293T細胞を、pEF6−B4ECv3又はpEF6−B4EC−NTプラスミド構築物で上記のようにトランスフェクトして、抗生物質ブラスチシジンを利用して選択した。トランスフェクションの24時間後に、細胞を低密度で播種した。翌日、細胞を10μg/mlのブラスチシジンで処理した。薬物選択の2週間後に、生存細胞をプールして、更に、単一細胞クローン拡大のために選択した。安定な細胞を樹立した後で、それらを、4μg/mlブラスチシジンにて維持した。調整培地を試験して、各組換えタンパク質の発現及び分泌を確認した。発現の特異性を、ウエスタンブロットにより、抗B4モノ及びポリクローナル抗体及びB2EC−AP試薬結合及び競合アッセイを利用して確認した。
HEK293細胞を、分泌型のEphB4エクトドメイン(B4ECv3)をコードするプラスミドを利用して一時的にトランスフェクトした。調整培地を収穫して、10mM イミダゾール、0.3M NaClを補い、20,000gで30分間遠心分離して細胞残骸及び不溶性粒子を除去した。80mlの得られた上清を、1mlのNi−NTA−アガロース(Qiagen)を含む前平衡化カラムに、10ml/時の流量で加えた。このカラムを10mlの50mM トリス−HCl、0.3M NaCl及び10mM イミダゾール(pH8)で洗った後、残留タンパク質を、3mlの0.25M イミダゾールを利用して溶出させた。溶出されたタンパク質を、20mM トリス−HCl、0.15M NaCl(pH8)に対して一晩透析した。B4ECv3の純度及び同定を、PAGE/クーマシーG−250及びウエスタンブロットにより、抗Eph.B4抗体を利用して確認した。最後に、B4ECv3の濃度を測定して、該タンパク質のアリコートを採って、−70℃に貯蔵した。
B4EC−FCタンパク質及びB2EC−FCタンパク質を、同様にして精製した。
A.結合アッセイ
10μlのNi−NTA−アガロースを、小型遠心分離機用チューブ内で、50μlの、結合緩衝液BB(20mM トリス−HCl、0.15M NaCl、0.1% ウシ血清アルブミンpH8)で希釈した示した量のB4ECv3と共にインキュベートした。振盪プラットフォーム上での30分間のインキュベーション後に、Ni−NTAビーズを、1.4mlのBBで2回洗い、その後、50μlのB2−APを終濃度50nMで加えた。結合を、30分間にわたって振盪プラットフォーム上で行なってから、チューブを遠心分離して、1.4mlのBBで一回洗った。沈殿したAPの量を、PNPPの添加後に、比色法により測定した。
溶液中での阻害。50μlのBBで希釈した種々の量のB4ECv3を、50μlの5nM B2EC−AP試薬(EphrinB2エクトドメインの胎盤アルカリホスファターゼとのタンパク質融合物)と予備インキュベートした。1時間のインキュベーション後に、未結合のB2EC−APを、膜と結合した完全長EphB4を発現する5,000のHEK293細胞で20分間沈殿させた。結合反応を、1.2mlのBBでの希釈とその後の10分間の遠心分離により停止させた。上清を捨てて、集めた細胞と結合したアルカリホスファターゼ活性を、パラニトロフェニルホスフェート(PNPP)基質を加えることにより測定した。
プロテインA−アガロースベースのアッセイ。10μlのプロテインA−アガロースを、50μlの、結合緩衝液BB(20mM トリス−HCl、0.15M NaCl、0.1%BSA pH8)にて希釈した示した量のB4EC−FCを含むエッペンドルフチューブ中でインキュベートした。振盪プラットフォーム上での30分間のインキュベーション後に、プロテインAアガロースビーズを、1.4mlのBBで2回洗ってから、50μlのB2ECAP試薬を終濃度50nMで加えた。結合を、30分間にわたって振盪プラットフォーム上で行なってから、チューブを遠心分離して、1.4mlのBBで一回洗った。沈殿したAPの比色反応を、PNPPの添加後に測定した(図6)。
溶液における阻害。B4ECv3については、上記を参照されたい。結果を、図7に示した。
細胞ベースの阻害。B4ECv3については、上記を参照されたい。
プロテインA−アガロースベースのアッセイ。B4EC−FCについては、上記を参照されたい。結果を、図8に示した。
ニトロセルロースベースのアッセイ。B4EC−FCについては、上記を参照されたい。
A.成長阻害アッセイ
ヒトの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(1.5×103)を、96ウェルプレート中で、100μlのEBM−2(Clonetic # CC3162)中にプレートする。24時間後に(0日目)、試験組換えタンパク質(100μl)を、各ウェルに、EBM−2培地中にて、2×所望濃度(5〜7濃縮レベル)で加える。0日目に、1枚のプレートを、0.5%クリスタルバイオレット(20%メタノール中)を用いて10分間染色し、水ですすぎ、風乾する。残りのプレートを、72時間にわたって、37℃でインキュベートする。72時間後に、プレートを、0.5%クリスタルバイオレット(20%メタノール中)で染色し、水ですすぎ、風乾する。この染色を、エタノール:0.1M クエン酸ナトリウムの1:1溶液を用いて溶出させ(0日目のプレート)、吸光度を540nmで、ELISAリーダー(Dynatech Laboratories)を用いて測定する。0日目の吸光度を、72時間のプレートから減算し、データを対照用増殖(ビヒクルで処理した細胞)のパーセンテージとしてプロットする。IC50(50%阻害を引き起こす薬物濃度)を、このプロットデータから計算する。
マトリゲル(10mg/mlの60μl;Collaborative Lab # 35423)を、氷冷した96ウェルプレートの各ウェル内に置く。このプレートを、室温に15分間置いてから、37℃で30分間インキュベートして、このマトリゲルを重合させる。その間に、HUVECを、EGM−2(Clonetic # CC3162)中で、2×105細胞/mlの濃度で準備する。この試験化合物を、2×所望濃度(5濃縮レベル)で、同じ培地中で準備する。細胞(500μl)と2×薬物(500μl)を混合して、200μlのこの懸濁液を、二連で、重合させたマトリゲル上に置く。24時間のインキュベーション後に、各濃度につき三連で写真を撮る(Bioquant製、イメージ・アナリシス・システム使用)。薬物の効果(IC50)を、未処理の対照に対して、形成されたコードの長さ及び接合数を測定することにより評価する。
移動を、48ウェルBoydenチャンバー及び8μm細孔寸法のコラーゲン被覆した(10μg/mlのラット尾のコラーゲン;Collaborative Laboratories)ポリカーボネートフィルター(Osmonics, Inc.)を利用して評価する。底部チャンバーのウェルに、27〜29μlのDMEM培地のみ(基線)又は化学誘引剤(bFGF、VEGF又はSwiss 3T3細胞調整培地)を含む培地を加える。頂部チャンバーには、45μlの、DMEM+1%BSAにて調製したHUVEC細胞懸濁液(1×106細胞/ml)を加える(試験化合物を伴うか又は伴わない)。5時間37℃でのインキュベーション後に、膜を、PBS中ですすぎ、固定して、Diff−Quick溶液にて染色する。このフィルターを、移動した細胞を有するスライド硝子上に表を下にして置き、頂部の細胞をキムワイプを用いて除去する。試験を、4〜6レプリカにて行い、各ウェルから5つの視野を計数する。陰性の未刺激の対照値を、刺激された対照及び薬物処理した値から減算し、データを平均移動細胞±S.D.としてプロットする。IC50を、プロットしたデータから計算する。
A.EphB4の球状ドメインは、内皮管形成アッセイにおいて、EphrinB2の結合及びEphB4由来の可溶性タンパク質の活性に必要である。
レセプターの可溶性組換え誘導体の抗血管形成活性に必要且つ十分であるEphB4の異所的部分のサブドメインを同定するために、EphB4ECの4つの組換え欠失変異体を生成して試験した(図16)。EphB4の細胞外部分は、EphB及びEphAレセプターファミリーの他のメンバーと同様に、N末端リガンド結合性球状ドメイン及びその後ろのシステインリッチなドメイン及び2つのIII型フィブロネクチン反復(FNIII)を含む。EphB4の完全な異所的部分を含む組換えB4−GCF2タンパク質に加えて、我々は、球状ドメイン及びCys−リッチドメイン(B4−GC);球状、Cys−リッチ及び第一のFNIIIドメイン(GCF1)並びに球状ドメインの欠失したECDバージョン(CF2)を含むEphB4ECの3つの欠失変異体を構築した。球状ドメインのみを含む切り詰められたEphB4ECタンパク質の幾つかのバージョンを生成する我々の試みは、3つのすべての構築物から発現されたタンパク質の分泌の欠如及び細胞内で発現された組換えタンパク質によるリガンド結合の不在のために成功しなかった。加えて、B4−GCF2のタグなしバージョン(GCF2−Fと呼ばれる)(追加の融合アミノ酸を含まないEphB4の完全な細胞外ドメインを含む)を、発現させ、精製し、ここに記載した実験の幾つかで利用した。
初期の実験は、可溶性EphB4が、血管形成経路の3つの主なステージに影響を与えるかどうかを確認するために行なわれた。これらは、可溶性EphB4の、HUV/AECによるイン・ビトロでの移動/浸潤、増殖及び管形成に対する効果を確立することにより行われた。可溶性EphB4にさらすことは、BoydenチャンバーアッセイにおけるbFGF及びVEGF誘導される移動の両方を、投与量依存様式で有意に阻害した(nMで有意性を達成)(図18)。マトリゲルで被覆されたウェル上のHUV/AECSによる管形成は、可溶性EphB4によって、投与量依存様式で、bFGF及びVEGFの存在下と非存在下において、有意に阻害された(図19)。我々は又、イン・ビトロで、nMの可溶性EphB4が、HUVECSに対して細胞傷害性であるかどうかを評価した。可溶性EphB4は、MTSアッセイにより評価して、これらの投与量では、検出可能な細胞傷害効果を有しないことが見出された(図20)。
可溶性EphB4が、血管形成をイン・ビボで直接阻害することができることを示すために、我々は、マウスマトリゲルプラグ実験を行なった。bFGF及びVEGFを補ったマトリゲルを、可溶性EphB4を伴って又は伴わないで、Balb/C nu/nuマウスに皮下注射して、6日間にわたって半固体プラグを形成した。成長因子を有しないプラグは、事実上、血管形成を有さず又は6日後に血管構造を有しなかった(図21)。対照的に、bFGF及びVEGFを補ったプラグは、広範囲の血管新生を有し及びプラグ中に血管を有した。μgの可溶性EphB4で処理したマウスから採取したプラグは、顕著に減少したプラグの血管新生を有し、成長因子を有しないプラグに匹敵した(図21)。更に、プラグの組織学的検査は、減少した血管の染色を示した(図21)。0μg/投与量での処理は、マトリゲルプラグにおける浸潤の量を、対照と比較して有意に阻害した(図21)。
我々は、可溶性EphB4が、Balb/C Nu/Nuマウスで成長したSCC15腫瘍の成長を阻害することを見出した(図23)。
可溶性EphB4のイン・ビボでの抗血管形成活性を更に調べるために、我々は、可溶性EphB4の投与の、マウスの角膜におけるbFGFにより誘導される新血管新生に対する阻害効果を研究した。角膜のマイクロポケットに移植されたハイドロンペレットは、血管形成を、典型的に無血管野で成長因子の存在下で誘導することができた。このマウスの角膜における血管形成応答は中位であり、血管蕾の出現は遅延し、そして新しい毛細血管は希薄でゆっくり成長した。移植7日目で、対照群と比較して、マウスの角膜でbFGFにより誘導された新血管新生は、可溶性EphB4処理した群において顕著に阻害された(図24)。
同じモデルを利用して、可溶性EphB4のイン・ビボでの効果を測定した。SCC15腫瘍を皮下に移植し、成長因子を伴い又は伴わないで、マトリゲルと共に予備インキュベートし、並びに単独で皮下に移植し、そしてマウスを毎日、1〜5μgの可溶性EphB4で処理した(皮下又は腹腔内投与)。
組織学的分析は、全SCC15腫瘍におけるネクローシスの中心領域の存在を示したが、それは、通常、生存力のある腫瘍細胞の縁に囲まれている。これらの中心ネクローシス領域は、しばしば、大きく、集密的であり、細胞の細部の喪失を示した。腫瘍部分領域のパーセンテージとして評価して、ネクローシスは、有意に(p<0.02)、可溶性EphB4処理群において、一層広範囲であった(処理群におけるネクローシス%対対照群)。可溶性EphB4処理した腫瘍の減少した容積が、このタンパク質の、腫瘍血管供給に対する効果のためであるのかどうかを測定するために、血管内の内皮細胞を、腫瘍部分で、抗血小板細胞接着性分子(PECAM−1;CD31)抗体を利用する免疫染色(図26)を利用して同定し及び微細血管の密度を評価した。微細血管密度は、対照及び可溶性EphB4処理した腫瘍において、腫瘍細胞の外側の生存力のある縁(十分規定された核を有する腫瘍周縁部に隣接する細胞の均質な層)におけるものと類似していた。微細血管密度は、有意に、可溶性EphB4処理した腫瘍において(対照用腫瘍より)、ネクローシスの中心領域と隣接する腫瘍細胞の一層低い生存力の内方領域であった。フィブリン沈着は(マッソン三色染色法により同定して)、可溶性EphB4処理した腫瘍において(対照用腫瘍より)、内方の生存力のある縁及び中心のネクローシスコアの血管の内部及び周辺で増大した。可溶性EphB4処理した腫瘍の外側の生存力のある縁において、血管内腔は、開放性を保持して赤血球細胞を含有したが、フィブリン沈着は、多くの血管において明白であった。可溶性EphB4は、試験した正常組織(肺、肝臓及び腎臓)の内皮に対してかかる効果を有しないことが見出された。
1)発現用構築物
可溶性の6×Hisタグ付きEphB4−ECD変異体を生成するための発現ベクターを構築するために、クローン化した完全長のヒトEphB4cDNAを、次のオリゴプライマーを利用するPCRによって増幅した:TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT(一般的なEphB4 N末端プライマー)及びGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGA TGATGAGCCGAAGGAGGGGTGGTGCA(B4−GC)、AGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGAT GATGGACATTGACAGGCTCAAATGGGA(B4−GCF1)又はTGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCAT(B4−GCF2)。その結果生成したPCR断片を、哺乳動物用発現ベクターpEF6/V5−His−TOPO(Invitrogen)中に、EF−1αプロモーターの制御下にTAクローン化した。発現された組換えタンパク質は、ヒトEphB4の成熟細胞外部分の次の断片をコードしている:アミノ酸1〜522位(GCF2)、1〜412位(GCF1)及び1〜312位(GC)。pEF6クローニングのためのB4−CF2欠失(δアミノ酸13〜183)PCR断片を生成するために、EphB4cDNAを、オリゴプライマーTACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT、CAGCTGAGTTTCCAATTTTGTGTTC、GAACACAAAATTGGAAACTCAGCTGACTGTGAACCTGAC及びGCGGCCGCCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTを利用する2ステップの重複PCRによって増幅した。
抗EphB4モノクローナル抗体mAB79及びmAB23を、成熟ヒトEphB4のアミノ酸1〜522を含むGCF2タンパク質に対してマウスにおいて生成して、ハイブリドーマ上清からプロテインAクロマトグラフィーにより精製した。抗ホスホチロシン抗体4G10を、UBI(ニューヨーク、Lake Placid)から得た。プロテインG−HRP結合体をBio-Radから購入した。
EphB4−ECD可溶性タンパク質を生成するために、培養ヒト胎児腎臓細胞HEK293Tを、対応するプラスミド構築物で、標準的なリン酸カルシウム法又はリポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)プロトコールを利用してトランスフェクトした。トランスフェクションの12〜16時間後に、成長培地(DMEM+10%ウシ胎児血清)を吸引して、細胞を無血清DMEMで一回洗い、無血清DMEMで置き換えた。分泌されたタンパク質を含む調整培地を72〜96時間後に収穫し、遠心分離により清澄化して、Ni−NTAアガロース(Qiagen)を利用するHisタグ付きタンパク質の精製に利用した。これらの組換えタンパク質の純度及び量を、SDS−PAAG電気泳動及びクーマシーブルー又は銀染色、ウエスタンブロッティング及びUV分光法により試験した。精製されたタンパク質を、20mM トリス−HCl、0.15M NaCl、pH8に対して透析して、−70℃に保存した。
すべての溶解物を、4℃で処理した。細胞を、20mM Hepes(pH7.4)、100mM 塩化ナトリウム、50mM フッ化ナトリウム、2mM EGTA、1mM オルトバナジン酸、1%(v/v)NP−40、0.5%(w/v)デオキシコール酸ナトリウム、1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(新たに添加)及び100U トラシロールを含む1mlの緩衝液中で溶解させた。溶解物を、掻きとってエッペンドルフチューブに入れ、50μlのバイオレッド、ホルマリンで固定したスタフィロコッカス・オーレウス(San Diego在、Calbiochem製)を加えた。30分間の混合の後に、これらの溶解物を、5分間、小型遠心分離機で、25,000gで遠心分離し、上清を、適当な抗体を含む新しいチューブに移した。溶解物を、抗体と1時間混合し、その後、50μlのプロテインA−セファロースビーズを加えて、これらのチューブの内容物を、1時間にわたって混合して、免疫沈降物を集めた。プロテインAビーズを、25,000gで30分間の遠心分離により集めた。これらの上清を捨てて、ビーズを1mlの溶解用緩衝液(デオキシコール酸を除いたもの)で3回洗った。
ヒトの前立腺癌細胞株PC3細胞を、10%透析済ウシ胎児血清及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質混合物を含むRPMI培地中に維持した。細胞を、5%CO2/95%空気の加湿大気中で37℃で維持した。典型的には、細部を、60mm皿中で、集密になるまで成長させて、EphB4レセプターを活性化するためのマウスEphrinB2−Fc融合物(RPMI中の1μg/ml)で10分間処理するか又は対照としての単純培地で処理した。可溶性EphB4 ECDタンパク質の種々の誘導体のEphB4レセプターの活性化に対する効果を研究するために、細胞の3つのセットを利用した。第一のセットにおいて、細胞を、様々なタンパク質(5種類のタンパク質;GC、GCF1、GCF2、GCF2−F、CF2)により、5μg/mlで20分間処理した。細胞の第二のセットにおいて、添加前に、タンパク質をephrinB2−Fcと1:5モル比(EphB4タンパク質:B2−Fc)で予備混合して、20分間インキュベートし、細胞に10分間適用した。第三の細胞のセットにおいて、細胞を、先ず、これらのタンパク質で、20分間、5μg/mlで処理し、培地を、1μg/mlのEphrinB2−Fcを含む新鮮な培地で置き換えて、更に10分間インキュベートした。
正常HUVECを、Cambrex(BioWhittaker)から得て、0.1mg/ml 内皮成長補助剤(ウシの脳の粗抽出物)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50U/ml)、2mモル/l グルタミン及び0.1mg/mlヘパリンナトリウムを補ったEBM2培地中に維持した。細胞のアリコートを、1〜3継代凍結保存した。すべての実験について、HUVECを、4継代以下で利用して、集密の皿から集めた。
マトリゲル(10mg/mlの60μl;Collaborative Lab, Cat. No. 35423)を、氷冷96ウェルプレートの各ウェル中に置いた。このプレートを、室温に15分間置いてから、37℃に30分間インキュベートして、マトリゲルを重合させた。その間、ヒトの臍帯静脈の内皮細胞を、EGM−2(Clonetic, Cat. No. CC3162)にて、2×105細胞/mlの濃度で調製した。この試験タンパク質を、2×所望濃度(5濃縮レベル)で、同培地中にて調製した。細胞(500μl)と2×タンパク質(500μl)を混合し、200μlのこの懸濁液を、二連で、重合したマトリゲル上に置いた。24時間のインキュベーション後に、各濃度につき三連の写真を、バイオクウォント・イメージ・アナリシス・システムを利用して撮った。タンパク質添加効果(IC50)を、未処理対照と比較して、形成されたコードの長さ及び接合数を測定することにより評価した。
HUVECのVEGFへの化学走性を、改変Boydenチャンバー(直径6.5mm、細孔寸法8μm、厚さ10μmのマトリゲルでコートされたポリカーボネート膜(BD Biosciences)、24ウェルプレート中のウェル貫通膜フィルターインサート)を利用して評価した。200μlのEBM中のHUVECの細胞懸濁液(2×105細胞/ml)を、上部チャンバー中に播種して、可溶性EphB4タンパク質を、刺激剤(VEGF又はbFGF)と同時に、チャンバーの下部コンパートメントに加え、それらの、ポリカーボネートフィルターを、100nM〜1μMの試験化合物を伴う又は伴わない20ng/mlのVEGFに応答して横切る移動を研究した。4〜24時間の37℃でのインキュベーション後に、このフィルターの上面を、綿棒で掻きとり、フィルターを固定してDiffQuickで染色した。10のランダムな視野(倍率200倍)を計数して、結果を、視野当たりの平均値として表した。負の未刺激対照の値を、刺激された対照及びタンパク質処理した試料の値から減算して、データを、平均移動細胞±S.D.としてプロットした。IC50を、プロットしたデータから計算した。
HUVEC(1.5×103細胞)を、96ウェルプレート中で、100μlのEBM−2(Clonetic, Cat. No. CC3162)中にプレートした。24時間後(0日目)に、試験組換えタンパク質(100μl)を、各ウェルに、2×所望濃度(5〜7濃縮レベル)で加えた(EBM−2中)。0日目に、一枚のプレートを、0.5%クリスタルバイオレット(20%メタノール中)で10分間染色し、水ですすいで、風乾した。残りのプレートを、72時間にわたって、37℃に維持した。72時間後に、プレートを、0.5%クリスタルバイオレット(20%メタノール中)で染色し、水ですすいで、風乾した。この染色を、1:1のエタノール:0.1Mクエン酸ナトリウムの溶液で溶出させて(0日目のプレートを含む)、吸光度を540nmで、ELISAリーダー(Dynatech Laboratories)を用いて測定した。0日目の吸光度を、72時間のプレートから減算して、データを、対照用増殖(ビヒクルで処理した細胞)のパーセンテージとしてプロットする。IC50値を、プロットしたデータから計算した。
イン・ビボの血管形成を、マウスにおいて、皮下組織から、試験試料を含むマトリゲルプラグ内への血管の成長としてアッセイした。マトリゲルは、因子を捕捉して、ゆっくりした放出及び周囲の組織への延長された曝露を可能にする固体ゲルを、身体温度で急速に形成する。4℃で液体形態のマトリゲル(8.13mg/ml、0.5ml)を、内皮細胞成長補助剤(ECGS)、試験タンパク質+ECGS又はマトリゲル+ビヒクル単独(0.25%BSAを含むPBS)と混合した。マトリゲル(0.5ml)を、雌のnu/nuマウス(6週齢)の腹部皮下組織に、正中線に沿って注射した。各群には、3匹のマウスがいた。これらの動物を、施設の及びNIHのガイドラインに従って世話した。6日目に、マウスを犠牲にして、プラグを回収し、組織学のために処理した。典型的には、上に重なる皮膚を取り除き、支持のための腹腔の裏打ちを保持することによりゲルを切り出して、PBS中の10%の緩衝されたホルマリンで固定して、パラフィン中に包埋した。3μmの切片を切って、H&E又はマッソン三色染色法で染色して、光学顕微鏡下で調べた。
マウスの角膜のマイクロポケットアッセイを、Kenyon等、1996により詳述されたものに従って行なった。簡単にいえば、90ngのbFGF(R&D)又は180ngのVEGF(R&D Systems, 米国、ミネソタ、Minneapolis在)及び40μgのシュークロースアルミニウムサルフェート(Sigma)を含むハイドロンペレット(ポリヒドロキシエチルメタクリレート[ポリHEMA]、Interferon Sciences, New Brunswick, 米国、ニュージャージー)を製造した。手術用顕微鏡を利用して、間質線状角膜切開術を外科用ナイフ(Bard-Parker no.15)を用いて、外側腹直筋の挿入と並行して麻酔した動物において行なった。基質内マイクロポケットを、改変したvon Graefeナイフ(2”30mm)を用いて切開した。単一ペレットを、移植して、角膜の縁へ向かって進ませた(bFGFペレットにつき0±7±1±0mm、VEGFペレットにつき0±5mm)。各成長因子についてのペレット位置の差異は、このモデルにおけるVEGFの比較的弱い血管形成刺激を仮定すると、必要であると決定された。次いで、抗生物質軟膏(エリスロマイシン)を、手術した眼に加えて、感染を防止し且つ表面の不規則を減少させた。その後の血管応答を、肢の血管系からペレットに向かって広がるのを測定して、新血管新生データの連続的周囲域及び提示した臨床写真をペレット移植の6日目に得たが、その日は、最大血管形成応答の日であることが見出された。
「マトリゲル」マトリクスで被覆された9mmの細胞培養インサート(細孔寸法8μm;Becton Dickinson, ニュージャージー、Franklin Lakes在)を、24ウェルプレート中にセットした。HUVEC細胞を、5×103細胞/ウェルの密度で、培養インサートの上層に播種して、無血清EBMで、EphB4 ECDの存在下で24時間培養した。対照群を同じ培地でEphB4を含まずに培養した。その後、0.5mlのヒトSCC15細胞株調整培地をこの培養インサートの下層に化学誘因剤として充填した。これらの細胞を、24時間にわたってインキュベートしてから、上層の残りの細胞を、綿棒でかき出し、下層の貫通した細胞を5%グルタルアルデヒドで固定してDiffQuickで染色した。マトリゲルマトリクス及び培養インサートの各8μmの細孔を通過した細胞の総数を、光学顕微鏡観察を利用して計数して、浸潤インデックス(細胞数/領域)として示した。
対数増殖期のSCC15頭頚部扁平上皮細胞癌細胞株(5×106細胞密度)を;EphB4 ECDを伴って又は伴わないで、ヒトbFGFの存在下又は非存在下で、無胸腺のBalb/cマウスに、マトリゲル(BD Bioscience)合成基底膜(1:1 v/v)と共に、皮下注射して、2週間以内に腫瘍を検査する。EphB4 ECD群における腫瘍容積は、移植後に、成長因子の存在下又は非存在下で、ビヒクル群のものより3倍小さかった。これらの群の間で、体重に差異はなかった。切除した腫瘍の切片の免疫組織化学的試験及びTUNEL陽性アポトーシス又はネクローシス、CD34免疫染色、及びBrdU増殖速度を、パラフィン除去、再水和及び内因性ペルオキシダーゼ活性の消滅後、及びプロテイナーゼKによる10分間の易透化の後に行なう。血管密度の定量的評価も又、行なう。EphB4 ECDの局所的腫瘍内送達又はIV送達も又、週に2回行なう。
すべての動物を、施設の動物保護委員会により承認されたプロトコールにて処理した。癌細胞(5×106)を、ヌードマウスの背中の皮下に接種した。腫瘍が約100mm3の寸法まで成長したとき(通常、12日を要する)、sEphB4を、一日一回、腹腔内又は皮下に注射し、腫瘍形成を2週間にわたってモニターした。腫瘍容積を、式a2xb(式中、a及びbは、それぞれ、最小及び最大直径である)に従って計算した。スチューデントのt検定を利用して、腫瘍容積を比較した(P<0.5を有意とみなした)。
腫瘍を、4%ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、5μmに切片化して、ヘマトキシリンエオシンで染色した。血管密度を、コンピューターベースのイメージアナライザーを利用して、半定量した(各群の3匹のマウスからの切片当たり5視野)。
A.EphB4の前立腺癌細胞株における発現
我々は、先ず、様々な前立腺癌細胞株におけるEphB4タンパク質の発現をウエスタンブロットにより試験した。我々は、前立腺癌細胞株が、120kDのEphB4の豊富さにおいて顕著な変動を示すことを見出した。これらのレベルは、PC3において比較的高く、PC3M(PC3の転移性クローン)において一層高くさえあったが、正常な前立腺由来の細胞株(MLC)は、EphB4の低い発現を示し又は発現を示さなかった(図27A)。我々は、次に、PC3細胞におけるEphB4の活性化状態を、リン酸化研究により調べた。我々は、正常培養条件下でさえ、EphB4が、そのリガンドephrinB2によって更に誘導されえても、リン酸化されることを見出した(図27B)。
EphB4が臨床的前立腺試料において発現されるかどうかを測定するために、前立腺癌の外科手術による標本からの腫瘍組織と隣接正常組織を試験した。これらの前立腺標本中のEphB4の組織学的分布を、免疫組織化学により測定した。明らかに、EphB4発現は、新生上皮に限られており(図28、左上)、間質及び正常前立腺上皮には存在しない(図28、右上)。前立腺組織の配列において、検査した32の前立腺癌の内の24が、陽性であった。我々は、EphB4mRNAが、臨床試料の正常及び腫瘍組織の両方で発現されることを、定量的RT−PCRによって見出した。しかしながら、腫瘍のEphB4mRNAレベルは、この例において、少なくとも正常の3倍高かった(図28、右下)。
PC3細胞は、PTEN発現を欠くこと(Davis等、1994, Science. 266:816-819)及び野生型p53機能を欠くこと(Gale等、1997, Cell Tissue Res. 290:227-241)が知られている。我々は、EphB4の比較的高い発現がp53及び/又はPTENと関係するかどうかを、野生型p53及び/又はPTENをPC3細胞に再導入することによって研究した。トランスフェクション効率及び希釈効果を補正するために、トランスフェクトされた細胞を、同時トランスフェクトした切り詰められたCD4マーカーにつきソートした。我々は、PC3細胞におけるEphB4の発現が、野生型p53又はPTENの再導入によって減少することを見出した。p53とPTENの同時トランスフェクションは、EphB4の発現を更に阻害することはなかった(図29A)。
我々は、以前に、前立腺癌細胞株において、RXRαがダウンレギュレートされることを見出した(Zhong等、2003, Cancer Biol Ther. 2:179-184)が、我々は、ここに、「正常な」前立腺(MLC)、前立腺癌(PC3)、及び転移性前立腺癌(PC3M)を見た場合に、EphB4発現が、逆発現パターンを有することを見出した(図27A)。我々は、RXRαがEphB4の発現を調節するかどうかを考えた。この関係を確認するために、EphB4の発現を、CWR22RとCWR22R−RXRα(RXRαを構成的に発現する)との間で比較した。我々は、RXRα過剰発現細胞株においてEphB4発現の控え目の減少を見出したが、FGF8は、EphB4発現に何の効果も有しない。初期の結果と一致して、EphB4は、「正常な」良性前立腺肥大細胞株BPH−1においては、見出されなかった(図29B)。
EGFR及びIGF−1Rは、共に、PC3細胞成長に対してオートクリン及びパラクリン作用を有することが示されている。我々は、EphB4発現が一層侵略的な細胞株において一層高いということを見出したので、EphB4発現が、これらのプロ生存成長因子と相関しうるということを仮定した。我々は、この関係を、EGFR及びIGF−1Rシグナリングを独立にブロックすることによって試験した。EphB4は、EGFRシグナリングをEGFRキナーゼインヒビターAG1478を利用してブロックした後に(図30A)又は、IGF−1R中和抗体を利用してIGF−1Rシグナリング経路を遮断した後に(図30B)、ダウンレギュレートされた。
我々の前立腺癌モデルにおけるこのEphB4の過剰発現の意義を規定するために、我々は、EphB4の比較的高い発現を有するPC3細胞に研究を集中した。EphB4発現を減少させるための2つのアプローチは、siRNA及びAS−ODNであった。多くのEphB4コード領域の異なるセグメントに相補的な種々のホスホロチオエート改変されたAS−ODNを、EphB4阻害の特異性及び効力につき試験した。完全長のEphB4発現ベクターAS−10で一時的にトランスフェクトした293細胞を利用することは、最も効果的であることが見出された(図31B)。類似のアプローチを、特異的siRNAの選択に適用した。EphB4 siRNA 472は、効果的に、EphB4タンパク質発現をノックダウンした(図31A)。siRNA472及びアンチセンスAS−10ODNは、共に、PC3細胞の生存力を、投与量依存様式で減少させた(図31C、D)。無関係のsiRNA又はセンスオリゴヌクレオチドは、生存力に何の効果も有しなかった。
PC3細胞は、マウスに同所注射した場合、局所的に侵略的に成長して、リンパ節転移を形成することができる。PC3細胞のイン・ビトロの移動に対するEphB4の役割を研究する努力において、我々は、創傷治癒アッセイを行なった。PC3細胞の単層に傷を導入した場合、次の20時間の経過において、細胞は、透明領域に移動した。しかしながら、細胞をsiRNA472でトランスフェクトして傷を導入した場合には、この移動は、有意に阻害された(図31E)。PC3細胞の、10μM EphB4 AS−10による12時間の予備処理は、同じ効果を生じた(図31F)。加えて、PC3細胞におけるEphB4発現のsiRNA472によるノックダウンは、二重チャンバー侵襲アッセイにより評価して、これらの細胞の、マトリゲルに浸潤する能力を、対照用siRNAと比較して多いに減じた(図31G)。
EphB4のノックダウンは、減少した細胞生存力を生じた(図31C)ので、我々は、これが、細胞周期に対する効果のためであるのかどうかを決定することを探求した。対照用siRNAでトランスフェクトした細胞と比較して、siRNA472は、サブG0及びS期フラクションの細胞の蓄積を生じた。このサブG0フラクションは、対照用siRNA処理した細胞と比較して、siRNA472処理した細胞において、1%〜7.9%増加し、S期フラクションは、14.9〜20.8%増加した(図32A)。細胞周期のサブG0及びG2での停止は、アポトーシスを示している。EphB4ノックダウンの結果としてのアポトーシスは、ELISAアッセイにより確認された。アポトーシスの投与量依存性の増加が、PC3細胞をsiRNA472でトランスフェクトした場合に認められたが、対照用siRNAでは認められなかった(図32B)。100nMでは、siRNA472でのトランスフェクトにおいて、対照用siRNAでトランスフェクトしたPC3細胞の15倍のアポトーシスがあった。
1)試薬
中和用IGF−1R抗体は、R&D Systems(ミネソタ、Minneapolis在)から得た。抗IGF−1R(β)、抗EGFR、抗EphB4(C−16)は、Santa Cruz Biotech(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。β−アクチンモノクローナル抗体は、Sigma Chemicals Co.(ミズーリ、St Louis在)から購入した。培地及びウシ胎児血清(FBS)は、Invitrogen(カリフォルニア、Carlsbad在)から得た。AG1478(4−(3’−クロロアニリノ)−6,7−ジメトキシ−キナゾリン)は、Calbiochem(カリフォルニア、San Diego在)から得た。
EphB4特異的アンチセンスホスホロチオエート改変オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)及びセンスODNを合成して、Qiagen(カリフォルニア、Alameda在)により精製した。これらの配列は:センス、5'-TCC-TGC-AAG-GAG-ACC-TTC-AC-3';AS1:5'-GTG-CAG-GGA-TAG-CAG-GGC-CAT-3';AS10:5'-ATG-GAG-GCC-TCG-CTC-AGA-AA-3'である。siRNAを、USC/Norris Comprehensive Cancer Center Microchemical Core laboratoryにて合成した。EphB4 siRNAの配列は、siRNA472 5'-GGU-GAA-UGU-CAA-GAC-GCU-GUU-3'及びsiRNA 2303 5'-cuc-uuc-cga-ucc-cac-cua-cuu-3'である。ごたまぜのGAPDHに対する負の対照用siRNAは、Ambion(テキサス、Austin在)から得た。
前立腺癌細胞株、PC3、PC3M、DU145、ALVA31、LAPC−4、LNCaP、CWR22R及び成人ヒト正常前立腺上皮細胞株MLC SV40、及びBPH−1を前記(7)のように得て培養した。安定な細胞株CWR22R−RXR、LNCaP−FGF8が樹立され、前記のように培養した(7、33)。
EphB4の細胞外ドメイン(ECD)を、pGEX−4T−1中にクローン化して、GST融合ECD(GST−ECD)を生成した。BL21大腸菌内にGST融合タンパク質として発現されたEphB4ECDを、アフィニティークロマトグラフィーにより精製して、GSTドメインをトロンビンにより開裂させた。モノクローナル抗体を生成して、そのモノクローナル抗体の感度及び特異性を、EphB4で安定にトランスフェクトされた293細胞の全細胞溶解物を用いるウエスタンブロットにより再確認した。
全RNAを、RNA STAT−60(Tel-Test, Inc.製、テキサス、Friendswood在)を利用して、前立腺癌標本及び隣接する正常標本から抽出した。定量的RT−PCRのために、第一鎖cDNAを、5μgの全RNAからSuperScriptIII(Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)を利用して合成した。定量的RT−PCRを、Stratagene MX3000P Systm(Stratagene, カリフォルニア、La Jolla在)にて、SYBR グリーンIブリリアントマスターミックス(Stratagene)を製造業者の指示に従って利用して行なった。EphB4及びβ−アクチン(標準化遺伝子として利用)についての最適化反応物は、各150nMのフォワードプライマー(β−アクチン、5'-GGA-CCT-GAC-TGA-CTA-CCT-A-3';EphB4、5'-AAG-GAG-ACC-TTC-ACC-GTC-TT-3')及びリバースプライマー(β−アクチン、5'-TTG-AAG-GTA-GTT-TCG-TGG-AT-3';5'-TCG-AGT-CAG-GTT-CAC-AGT-CA-3')であり、95℃で10分間のDNAポリメラーゼの変性/活性化後に、95℃で30分、60℃で1分、72℃で1分を40サイクル行なった。遺伝子特異的増幅の特異性を、単一の分離ピークの存在により確認した。すべての反応を、三連で、RTを利用して及び負の対照用テンプレートを用いずに行なった。
OCT包埋組織を、5μmに切片化して、リン酸緩衝した4%パラホルムアルデヒド中で固定した。切片を3×5分間PBS中で洗って、内因性ペルオキシダーゼを、PBS中の0.3%H2O2中での室温で10分間のインキュベーションによってブロックした。切片を、Eph4(C−16)抗体(1:50)と1時間室温でインキュベートしてから、PBS中で3回洗って、ロバの抗ヤギ二次抗体(Santa Cruz Biotech.)と1時間室温でインキュベートした。PBS中で3回洗った後に、ペルオキシダーゼ活性は、DAB基質溶液(Vector Laboratory, Inc. カリフォルニア、Burlingame在)中での室温で10分間のインキュベーションにより局在化された。切片を、ヘマトキシリンで20秒間対比染色し、脱水して、マウントした。染色の負の対照は、一次抗体についての正常ヤギ血清の代用であった。前立腺配列に対する免疫組織化学染色(BioMeda, カリフォルニア、Foster City在)を、ヤギABC染色システム(Santa Cruz Biotech.)を製造業者の指示に従って利用して行なった。
全細胞溶解物を、別途指示しない限り、前立腺インヒビターカクテル(Pierce, イリノイ、Rockford在)を補ったセル・リシス・バッファー(GeneHunter, テネシー、Basgvukke在)を利用して調製した。全タンパク質を、DC試薬システム(Bio-Rad, カリフォルニア、Hercules在)を利用して測定した。典型的には、20μgの全細胞溶解物を、4〜20%のトリス−グリシン勾配ゲル上で流した。これらの試料を、PVDF膜にエレクトロトランスファーして、非特異的結合を、5%脱脂乳を含むTBST緩衝液(0.5mMトリス−HCl、45mM NaCl、0.05%ツイーン−20、pH7.4)中でブロックした。膜を、先ず、一次抗体で一晩プローブ検出し、リストア(商標)ウエスタンブロットストリッピングバッファー(Pierce, イリノイ、Rockford在)を用いて細片化して、β−アクチンで再プローブ検出して、タンパク質の等量のローディング及びトランスファーを確認した。シグナルを、スーパーシグナルウエストフェムトマキシマムセンシティビティーサブストレート(Pierce)を利用して検出した。
60mm皿で成長中の細胞を、血清飢餓にし(1%FBSを補ったRPMI1640、24時間)又は正常条件下(10%FBS)にて培養してから、1μg/mlのマウスEphrinB2/Fcを伴って又は伴わないで10分間処理して、EphB4レセプターを活性化した。透明化した細胞溶解物を、EphB4モノクローナル抗体と一晩4℃でインキュベートした。抗原−抗体複合体を、100μlのプロテインG−セファロース(20mM リン酸ナトリウム、pH7.0中)の添加及び4℃で一晩のインキュベーションによって免疫沈降させた。免疫沈降物を、pTyr特異的抗体(Upstate, クローン4G10)を1:1000の希釈で利用し、その後、プロテインG−HRP(Bio-Rad)と1:5000希釈でインキュベートするウエスタンブロットにより分析した。免疫沈降効率をモニターするために、二連の膜を、EphB4特異的モノクローナル抗体でプローブ検出した。
PC3細胞を、CD4及び野生型p53(pC53−SN3)又はPTENベクター又は両方をコードするpMACS4.1で、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従って利用して同時トランスフェクトした。CD4のp53又はPTEN又はベクターに対するモル比は、1:3であり、全プラスミドは、90%集密の10cm2皿に対して24μgであった(60μgのリポフェクタミン2000使用)。トランスフェクションの24時間後に、単一細胞懸濁を生成して、製造業者のプロトコール(Miltenyi Biotec, ドイツ国)に従って切り詰めたCD4を表面マーカーとして利用してソートした。貯蔵した細胞を、1×SDSサンプリング用緩衝液中で溶解させて、ウエスタンブロットにより分析した。
PC3細胞を6ウェルプレートに播種し、80%集密になるまで培養して、2μg/mlの中和IGF−1Rモノクローナル抗体MAB391(Hailey等、2002, Mol Cancer Ther. 1:1349-1353)又は1nM AG1478、強力なEGFRインヒビター(Liu等、1999, J Cell Sci. 112(Pt 14):2409-2417)で24時間処理した。粗細胞溶解物を、ウエスタンブロットにより分析した。バンド密度を、Bio-Rad QuantityOne System ソフトウェアを用いて定量した。
PC3細胞を、48ウェルプレートに、約1×104細胞/ウェルの密度で播種した(総容積200ml)。培地を、細胞が付着した後に交換して、それらの細胞を様々な濃度(1〜10μM)のEphB4アンチセンスODN又はセンスODN(対照)で処理した。3日後に、培地を換えて、新鮮なODNを加えた。更なる48時間のインキュベーション後に、細胞生存力を、MTTにより前に記載されたように(36)評価した。EphB4siRNA(10〜100nM)を、2×104PC3細胞/ウェル(48ウェルプレート)に、2μlのリポフェクタミン(商標)2000を利用して製造業者の指示に従って導入した。トランスフェクションの4時間後に、これらの細胞を、成長培地(10%FBSを補ったRPMI1640)に戻した。生存力を、トランスフェクションの48時間後に、MTTにより評価した。
PC3細胞を、6ウェルプレートに播種して、集密になるまで培養した。10μMのAS−10又はセンスODN(対照)を、これらのウェルに、生存力アッセイについて記載されたように、単層に無菌のピペットチップで引っ掻くことにより傷を付ける12時間前に導入した。培地を、5%FBS及び新鮮なODNを補ったRPMI1640に交換した。創傷の12時間前に50nM siRNA472又はGAPDH陰性対照siRNAでトランスフェクトした集密培養物も又、検査した。治癒過程を、動的に調べて、顕微鏡アダプターを付けたNikon Coolpix 5000デジタルカメラを用いて記録した。
PC3細胞を、リポフェクタミン(商標)2000を利用して、siRNA472又は対照用siRNAでトランスフェクトし、6時間後に、0.5×105細胞を8μmマトリゲル予備被覆したインサート(BD Bioscience, カリフォルニア、Palo Alto在)にトランスフェクトした。これらのインサートを、5%FBS及び5μg/mlフィブロネクチンを補った(化学走性誘因剤として)RPMIを含むコンパニオンウェル中に置いた。22時間のインキュベーション後に、これらのインサートを取り出して、上面上の非浸潤性細胞を綿棒でかき出すことにより除去した。この膜の下面上の細胞を、100%メタノール中で15分間固定し、風乾して、2分間のギムザ染色により染色した。これらの細胞を、5つの別個の強力な分野において、光学顕微鏡下で計数した。アッセイを、各処理群につき、三連で、行なった。
PC3細胞の6ウェルプレート中での80%集密培養物を、siRNA472(100nM)で、リポフェクタミン(商標)2000を利用して処理した。トランスフェクションの24時間後に、細胞を、トリプシン処理して、PBS中で洗い、そして1時間にわたって、50μg/mlのヨウ化プロピジウム、0.1%クエン酸ナトリウム、0.1トリトンX−100及び20μg/mlのDnaseを含まないRnaseAを含む1mlの低張溶液中で4℃でインキュベートした。細胞を、USCフローサイトメトリーファシリティーにて線形モードで分析した。結果を、細胞周期の異なる位相即ちサブG0ピーク(アポトーシス)、G0/G1(DNA合成なし)、S(活性なDNA合成)、G2(予備有糸分裂)及びM(有糸分裂)で検出されたエレメントのパーセンテージとして示した。
アポトーシスを、細胞死検出用ELISAプラスキット(Roche, ニュージャージー、Piscataway在)を製造業者の指示に従って利用して研究した。簡単にいえば、24ウェルプレート中のPC3の80%集密培養物を、リポフェクタミン(商標)2000を利用して、様々な濃度(0〜100nM)のsiRNA472又は100nMの対照用siRNAでトランスフェクトした。16時間後に、細胞を剥離させて、1×104細胞を、200μl溶解用緩衝液中でインキュベートした。核を遠心分離によりペレット化して、モノ又はオリゴヌクレオソームを含む20μlの上清をELISA分析用に採取した。簡単にいえば、その上清を、抗ヒストン−ビオチン及び抗DNA−PODと、ストレプトアビジン被覆した96ウェルプレート中で2時間室温でインキュベートした。その色を、ABSTで発色させて、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, カリフォルニア、Sunnyvale在)にて読んだ。
悪性中皮腫(MM)は、最もしばしば胸膜及び腹膜腔の漿液性表面から生じる稀な新生物である。胸膜腔は、最も頻繁に冒される部位(>90%)であり、次が腹膜(6〜10%)である(Carbone等、2002, Semin Oncol. 29:2-17)。アスベスト曝露との強い関連があり、悪性中皮腫症例の約80%は、アスベストを摂取又は吸引した個人に起きている。この腫瘍は、特に、現在の治療に耐性であり、今日まで、これらの患者の予後は、劇的に悪い(Lee等、2000, Curr Opin Pulm Med. 6:267-74)。
悪性中皮腫細胞株におけるEphrinB2及びEphB4の発現は、様々な方法によて、RNA及びタンパク質レベルで測定された。RT−PCRは、4つの細胞株のすべてがEphrinB2及びEPHB4を発現することを示した(図33A)。これらの細胞株において、タンパク質発現を、ウエスタンブロットにより測定した。EphB4の特異的バンドが、120kDで見られた。加えて、EphrinB2は、試験したすべての細胞株において、37kDのバンドとしてウエスタンブロットにおいて検出された(図33B)。EphrinB2についての特異的バンドは、293ヒト胎児腎臓細胞において認められなかった(負の対照として含まれる)。
胸膜の悪性中皮腫と診断された患者の胸膜滲出液から培養された腫瘍細胞を単離して、EphB4及びEphrinB2の両者(1回継代)の陽性染色を示した(図35、下段)。これらの結果は、EphB4及びEphrinB2の中皮腫細胞株における同時発現を確認する。腫瘍細胞株において見られたこれらの結果が この病気状態における発現の真の反映であるかどうかを決定するために、腫瘍生検試料を、EphB4及びEphrinB2についての免疫組織化学的染色にかけた。両タンパク質に対する抗体は、これらの腫瘍細胞において陽性染色を示した。代表的データを、図36に示す。
細胞増殖におけるEphB4の役割を、EPHB4特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAを利用して試験した。培養H28のEPHB4アンチセンスでの処理は、細胞の生存力を減じた。EphB4発現の最も活性なインヒビターの一つは、EPHB4AS−10である(図37A)。EPHB4siRNA472のトランスフェクションは、同じ効果を生じた(図37B)。
1)細胞株及び試薬
NCI H28、NCI H2052、NCI H2373、MSTO 211H中皮腫細胞株及び293ヒト胎児腎臓細胞を、ATCC(バージニア、Manassas在)から得た。細胞を、10%の心臓不活性化ウシ胎児血清(FBS;Life Technologies, メリーランド、Gaithersburg在)及び抗体を補ったRPMI1640中に維持した。一次細胞を、中皮腫の患者の胸膜浸出液から得た。多数のEPHB4ホスホロチオエート改変アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。同様に、多くのEphB4特異的なsiRNAを生成させた。EPHB4に対して生成されたモノクローナル抗体を、ウエスタンブロットに利用した。EphrinB2及びEPHB4に対するポリクローナル抗体(C−16)(免疫組織化学的染色用)を、Santa Cruzから得た。
全RNAを、ランダムヘキサマー(Invitrogen)を利用することにより、逆転写した。EphB4及びEphrinB2のためのプライマーを、プライマー3ソフトウェアを用いてデザインした。すべてのプライマーの配列は、次の通りである:EPHB4フォワードプライマー及びEPHB4リバースプライマー(例えば、実施例2参照);EphrinB2フォワードプライマー及びEphrinB2リバースプライマー(例えば、実施例6参照);G3PDHフォワードプライマー、5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3';G3PDHリバースプライマー、5'-GGCATTGCTGCAAAGAAAGAG-3';CloneticsキットをPCRのために利用した。PCRを、ABI PCRシステム2700(Applied Biosystem)を用いて行なった。これらのPCR条件は、95℃で5分間とその後の、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で1分間の35サイクルであった。
EphrinB2及びEphB4 PCR生成物を、pGEM−T Easyシステム(Promega, ウィスコンシン、Madison在)を製造業者の記載に従って利用してクローン化した。これらのプライマー及びPCR生成物は、ephrinB2については、5'-tccgtgtggaagtactgctg-3'(フォワード)、5'-tctggtttggcacagttgag-3'(リバース)であったが、これらは、296bpの生成物を生じ、EphB4については、5'-ctttggaagagaccctgctg-3'(フォワード)、5'-agacggtgaaggtctccttg-3'であったが、これらは、297bpの生成物を生じた。確実性及びインサートの向きを、DNA配列決定により確認した。
細胞を、Labtech II 4ウェルチャンバースライド(Nalge Nunc International, イリノイ、Naperville在)で培養した。細胞をPBS(37℃)中で洗ってから、30分間、25℃で、4%(w/v)ホルムアルデヒド、5%(v/v)酢酸、及び0.9%(w/v)NaCl溶液中で固定した。固定後、スライドを、PBSですすいで、70%エタノール中に4℃で、更なる使用まで保存した。イン・シトゥーハイブリダイゼーション前に、細胞を脱水し、100%キシレン中で洗って残留脂質を除き、次いで、最後にPBS中で再水和した。細胞を、37℃で、0.1N HCl中の0.1%(w/v)ペプシンと20分間インキュベートし、1%ホルムアルデヒド中で10分間後固定することにより透過性にした。予備ハイブリダイゼーションを、30分間、37℃で、50%(v/v)脱イオンホルムアミドを含む4×SSC溶液中で行なった。スライドを、一晩、42℃で、25ngのアンチセンス又はセンスRNAプローブと、40%脱イオンホルムアミド、10%デキストラン硫酸、1×デンハート溶液、4×SSC、10mM DTT、1mg/ml酵母t−RNA及び1mg/ml変性して剪断したサケ精子DNA中(全容40μl)でハイブリダイズさせた。次いで、スライドを、37℃で、次のように洗った:2×SSCで2×15分、1×SSCで2×15分、0.5×SSCで2×15分、及び0.2×SSCで2×30分。ハイブリダイゼーションシグナルを、アルカリホスファターゼ結合体化抗DIG抗体(Roche)を製造業者の指示に従って利用して検出した。発色を、0.1M トリス−HCl、1mM EDTA(pH8.0)中で10分間、2回洗うことにより停止した。細胞を、Nuclear Fast Red(Vector Laboratories, カリフォルニア、Burlingame在)による核酸の対比染色により可視化して、スライドを、IMMU−MOUNT(Shandon, 英国、Astmoor在)にマウントした。
粗細胞溶解物を、細胞溶解緩衝液(10mMトリス、pH7.5、1mM EDTA、150mM NaCl、1%トリトンX−100、1mM DTT、10%グリセロール)中でのインキュベーションにより調製した。溶解物を、10,000×gで10分間の遠心分離により清澄化した。総タンパク質を、Bradfordアッセイ(Bio-Rad)により測定した。試料(20μgタンパク質)を、4〜20%トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル上で分画して、ポリビニリデンジフルオリド(PVDT)膜(Bio-Rad)にエレクトロブロッティングにより移した。膜を、5%脱脂乳によりブロックしてから、EphB4に対する抗体(1:5000希釈)と4℃で16時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体(1:100,000希釈)を、1時間、25℃で加えた。これらの膜を、SuperSignal West Femto Maximum sensitivity 化学発光基質(Pierce, イリノイ、Rockford在)を製造業者の指示に従って利用して発色させた。
ホルマリン固定した組織切片を、パラフィン除去して、10%ヤギ血清と共に−70℃で10分間インキュベートし、EphrinB2又はEphB4に対する一次ウサギ抗体(Santa Cruz Biotechnologies; 1:100)と共に4℃で一晩インキュベートした。イソタイプ特異的ウサギIgGを、対照として利用した。これらのレセプターに対する免疫反応性を、Vector Laboratoriesのアビジン−ビオチンキットを利用して示した。ペルオキシダーゼ活性を、ジアミノベンジジン(Sigma)細胞化学反応により示した。次いで、これらのスライドを、H&Eで対比染色した。
細胞を、Labtech II4ウェルチャンバースライドで培養して、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液pH7.4(PBS)中で4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した。これらのスライドを、PBS中で2回すすぎ、ブロッキング緩衝液(PBS中の0.2%トリトン−X100、1%BSA)にて20分間予備インキュベートした。次いで、これらのスライドを、EphB4又はephrinB2に対する抗体(PBS中で1:100希釈)と、ブロッキング緩衝液中で、4℃で16時間インキュベートした。3回洗った後、これらのスライドを、適当なフルオレセイン結合体化二次抗体(Sigma-Aldrich, ミズーリ、St.Louis在)とインキュベートした。核を、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドールジヒドロクロリドヒドレート(DAPI)で対比染色し、多数回PBSで洗浄し、Vectasheild 抗退色マウント溶液(Vector Laboratories)を用いてマウントした。イメージを、OlympusAX70蛍光顕微鏡及びSpot v2.2.2(Diagnostic Instruments Inc., ミシガン、Sterling Heights在)デジタルイメージングシステムを利用して得た。
細胞を、5×103/ウェルの密度で、48ウェルプレートに、0日目に、2%ウシ胎児血清(FCS)を含む適当な成長培地中に播種した。翌日、該培地を交換して、細胞を、様々な濃度(1〜10μM)のEphB4アンチセンスで処理した。4日目に、生存力を、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を終濃度0.5mg/mlで利用して評価した。細胞を、2時間インキュベートし、培地を吸引して、細胞を、酸性イソプロパノール(90%イソプロパノール、0.5%SDS及び40mM HCl)中に溶解させた。光学密度を、ELISAリーダーで490nmでイソプロパノールをブランクとして利用して読んだ(Molecular Devices, カリフォルニア)。
イン・ビトロの創傷治癒アッセイを採用した。簡単にいえば、細胞を、6cmプレート上に、完全培養培地に24時間播種してから、5%FBSを含む培地に切り替えた。EPHB4アンチセンス10(10μM)も又、処理したウェルに加えた。24時間後に、p−200ピペットマンチップを利用して傷を造り;プレートの中央に線を引いた。そのプレートを、0、12、24時間の時点で写真撮影した。この実験を、3回繰り返した。
上皮成長因子シグナリング経路による調節及び成長に有利な要因
頭頚部の扁平上皮細胞癌(HNSCC)は、世界で6番目に多い癌であり、毎年900,000症例が診断されると見積もられている。それは、幾つかの開発途上国におけるすべての悪性疾患の約50%を構成する。米国においては、毎年、新規の50,000症例と8,000人の死亡が報告されている。煙草の発癌物質がこの病気の第一の病因論的因子であり、アルコール消費、加齢、性及び人種的背景が寄与因子であると考えられている。
我々は、EphB4のヒト腫瘍組織における発現を、免疫組織化学により、イン・シトゥーハイブリダイゼーション及びウエスタンブロットによって研究した。先見の明により集められた20の腫瘍組織(IRB承認)を、EphBの他のメンバー及びEphAファミリーとは反応しない特異的なEphB4モノクローナル抗体を用いて評価した。EphB4発現は、すべての症例において認められる(染色強度は、変動する)。図39A(左上)は、代表的症例を示しており、EphB4が、H&E腫瘍構造によって示されるように、腫瘍領域のみで発現されることを示している(図39A左下)。間質においてはEphB4の染色がないことに注意されたい。第二に、リンパ節内の転移腫瘍部位は、陽性染色を示しているが、リンパ節の残りは、陰性である(図39、右上)。
原発性腫瘍、リンパ節転移物及び無関係の組織に由来する組織のウエスタンブロットを行なって、これらの部位におけるEphB4発現の相対的レベルを測定した。腫瘍及び正常隣接組織を、20症例につき集めたが、腫瘍につき陽性のリンパ節は、これら20症例中の9症例から収穫された。代表的症例を、図39Cに示す。EphB4発現は、これらの腫瘍試料の各々において認められた。同様に、すべての腫瘍陽性のリンパ節は、原発腫瘍以上にEphB4発現を示している。正常な隣接組織においては、発現は全く認められないか又は最少の発現が認められた。
腫瘍細胞に限られたEphB4の発現を示したが、我々は、次に、HNSCCにおけるEphB4発現のイン・ビトロモデルがあるかどうかを測定することを探求した。6つのHNSCC細胞株を、EphB4タンパク質の発現についてウエスタンブロットにより調べた(図40A)。これらの大部分は、強いEphB4発現を示し、それ故、その後の研究の基礎が確立された。EGFRはHNSCCに強く関連しているので、我々は、EphB4発現がEGFRの活性化と関係するのかどうかを尋ねた。EGFR陽性の細胞株であるSCC−15での予備実験は、EphB4の発現を阻害するための24時間の最適時間及び1mMの特異的EGFRキナーゼインヒビターAG1478の濃度を確立した。これらの細胞株のすべてを研究したとき、我々は、SCC−4では、EGFR発現が検出可能であるが強くはなく、それ以外のすべての株において、強いEGFRの発現に気付いた(図40C、上段)。EGFRインヒビターAG1478(図40B)に応答して、EphB4の全量の顕著な喪失が、ある種の細胞株(SCC−15及びSCC−25)において認められたが、他の株(SCC−9、−12、−13及び−71)においては認められなかった。従って、SCC−15及び−25は、EGFR活性により調節されるEphB4のモデルとして役立つが、SCC−9、−12、−13及び−71は、HNSCCにおけるEGFR活性と無関係のEphB4調節のモデルであり、他の因子例えばp53、PTEN、IL−6などからのインプットがありうる。我々は又、試験したすべての細胞株において、EphB4のリガンド即ちephrinB2の発現にも注意した。EphB4のように、幾つかの株において、ephrinB2発現は、EGFR活性により調節されているようであるが、それは、他の細胞株において独立している。
次に、我々は、siRNA又はAS−ODN法を利用して発現を除去することの効果を研究することによって、HNSCCにおけるEphB4発現の役割に関心を向けた。図42Aに示したように変化する程度にEphB4発現をノックダウンするEphB4配列に対する幾つかのsiRNAを開発した(表1)。生存力は、EphB4発現のブロックにおいて最も有効であるsiRNA50及び472でトランスフェクトされたSCC−15、−25及び−71細胞株において減少した(図42B)。EphB4 siRNA1562及び2302又はephrinB2 siRNA254では、生存力に対する効果は殆ど見られなかった。EphB4を発現しないSCC−4(図40A参照)においては、細胞性依存力の減少はなかったことに注意されたい。このsiRNA50及び472処理で見られた減少した細胞生存力は、細胞のサブG0における蓄積に帰することができ、アポトーシスを示すものである。この効果は、時間と投与量の両方に依存した(図42C及び表2)。対照的に、EphB4レベルの減少に有効でなく生存力に僅かな効果しか有しないsiRNA2302は、擬似的リポフェクタミン(商標)2000トランスフェクションと比較して、細胞周期に如何なる変化も生じなかった。
次に、我々は、EphB4が、HNSCCの移動に関与するかどうかを測定することを望んだ。移動にかかわることは、成長及び転移に関連を有しうる。移動を、創傷−治癒/掻き取りアッセイを利用して評価した。集密のSCC15及びSCC25培養物に、無菌のプラスチック製パスツールピペットを用いた単一の引っ掻きにより傷を付け、境界の明確な3mmのバンドが残った。試験化合物の存在下における、細胞の透明な領域への移動を評価して、24、48及び72時間後に定量した。細胞移動は、EphB4発現をブロックするAS−10に応答して、顕著に減少したが、不活性化合物、AS−1及びごたまぜにしたODNは、図43Dに示したように、殆ど又は全く効果を有しなかった。AS−10による移動の阻害は、Boydenダブルチャンバーアッセイを利用しても示された(図43E)。
細胞の生存力及び運動性を低下させるEphB4 AS−10の効果を、Balb/Cヌードマウス中のSCC15腫瘍異種移植片において測定した。マウスの、20mg/kg AS−10、センスODN又は等容のPBSの腹腔内注射による日々の治療を、腫瘍細胞移植の翌日に開始した。AS−10を受けたマウスにおける腫瘍の成長は、センスODN又はPBS希釈剤のみを受けたマウスと比較して、有意に遅延された(図44)。ODNに帰することのできる非特異的効果は、センスODN処理群とPBS処理群との間で差異がなかったので、認められなかった。
1)細胞株及び試薬
HNSCC−4、−9、−12、−13、−15、−25及び−71、並びに293ヒト胎児腎臓細胞は、ATCC(バージニア、Manassas在)から得た。細胞を、10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS;Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)及び抗生物質を補ったRPMI1640培地中に維持した。EGFR、EphB4(C−16)ポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotech(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。β−アクチンモノクローナル抗体は、Sigma Chemical Co.(ミズーリ、St.Louis)から購入した。EphrinB2及びEphB4ポリクローナル抗体及びそれらの対応するブロッキングペプチドは、Santa Cruz Biotechnology(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。AG1478(4−(3’−クロロアニリノ)−6,7−ジメトキシ−キナゾリン)は、Calbiochem(カリフォルニア、San Diego在)から得た。キナーゼインヒビターSH−5及びSP600125は、A.G. Scientific(カリフォルニア、San Diego在)から得た。PD98095、U73122、SB203580、LY294002及びWortmanninは、Sigma社より得た。
上記(例えば、実施例3)を参照されたい。
上記(例えば、実施例3)を参照されたい。
ホルマリン固定した組織切片をパラフィン除去して、10%ヤギ血清と−70℃で10分間インキュベートして、EphB4モノクローナル抗体と4℃で一晩インキュベートした。イソタイプ特異的なウサギIgGを対照として利用した。これらのレセプターについての免疫反応性を、Vector Laboratoriesのアビジン−ビオチンキットを利用して示した。ペルオキシダーゼ活性を、ジアミノベンジジン(Sigma)細胞化学反応により示した。次いで、これらのスライドを、0.12%メチレンブルー又はH&Eにより対比染色した。凍結切片について、OCT包埋組織を、5μmで切片化して、リン酸緩衝4%パラホルムアルデヒドにて固定した。切片を、3×5分間PBS中で洗い、内因性ペルオキシダーゼを、PBS中の0.3%H2O2中での室温で10分間のインキュベーションによりブロックした。切片を、Eph4(C−16)抗体(1:50)と1時間室温でインキュベートした後、PBS中で3回洗い、ロバ抗ヤギ二次抗体(Santa Cruz Biotech.)との一時間室温でのインキュベーションを行なった。PBS中での3回の洗浄後に、ペルオキシダーゼ活性は、DAB基質溶液(Vector Laboratories, Inc. カリフォルニア、Burlingame在)中での10分間室温でのインキュベーションにより局在化した。切片を、ヘマトキシリンで、20秒間対比染色し、脱水して、マウントした。染色についての負の対照は、正常ヤギ血清の、一次抗体の代用であった。前立腺配列(BioMeda, カリフォルニア、Foster City在)に対する免疫組織化学染色を、ヤギABC染色システム(Santa Cruz Biotech.)を製造業者の指示に従って利用して行なった。
上記(例えば、実施例3)を参照されたい。
Silencer(商標)siRNA構築用キット(Ambion, テキサス、Austin 在)を利用して、EphB4に対するsiRNAを合成した。簡単にいえば、GenBankデータベース中の他の配列に対する有意の相同性を示さない、5’−AAジヌクレオチドの下流に19bpを含む21bpの標的配列を同定した。センス及びアンチセンスのsiRNAの29量体のDNAオリゴヌクレオチドテンプレートを、USC Norris Microchemical Core Facilityにて合成した。アンチセンステンプレートは、標的配列に対応し、該配列の後ろには8bpの追加(5'-CCTGTCTC-3')が3’末端に続き、これは、Silencer(商標)siRNA構築用キットにより提供されたT7プロモータープライマーに対して相補的であった。センステンプレートは、5’−AAを含んだが、その後ろには、標的の19bpの相補配列が続き、その後ろには上記のようにT7の8bpの配列が続いた。
細胞を、5×103/ウェルの密度で、48ウェルプレートに、2%ウシ胎児血清(FCS)を含む適当な成長培地中に、0日目に播種した。細胞を、様々な濃度(1〜10μg/ml)のODNで、2日目及び4日目に処理した。5日目に、生存力を、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を利用して、以前に記載された(Masood等、'03)ように評価した。siRNAを伴う生存力について、2×104細胞/ウェルのSCC−4、−15、−25又は−71(48ウェルプレート中)を、2μlのリポフェクタミン(商標)2000を製造業者の指示に従って利用して、siRNA(10〜100nM)でトランスフェクトした。トランスフェクションの4時間後に、これらの細胞を、成長培地(10%FBSを補ったRPMI1640)に戻した。生存力を、トランスフェクションの48時間後に、MTTによって評価した。
6ウェルプレート中のSCC15細胞の80%集密培養物を、リポフェクタミン(商標)2000を利用して、siRNA472(100nM)でトランスフェクトした。トランスフェクションの16又は36時間後に、細胞をトリプシン処理して、PBS中で洗って、50μg/mlヨウ化プロピジウム、0.1%クエン酸ナトリウム、0.1トリトンX−100及び20μg/ml DNアーゼフリーのRNアーゼを含む1mlの低張溶液中で1時間4℃でインキュベートした。細胞を、リニアーモードで、USCフローサイトメトリー施設で分析した。結果を、細胞周期の異なる相即ちサブG0ピーク(アポトーシス)、G0/G1(DNA合成なし)、S(活性なDNA合成)、G2(有糸分裂前)及びM(有糸分裂)で検出されたエレメントのパーセンテージとして標示した。AS−ODN実験のために、これらの細胞を、5μM ODNに、処理前に、36時間さらした。
SCC15細胞を、6ウェルプレートに播種して、集密になるまで培養した。10μMのAS−1、AS−10、又はセンスODN(対照)を、これらのウェルに、生存力アッセイについて記載したように、単層を無菌のピペットチップで引っ掻くことにより傷付ける12時間前に導入した。培地を、5%FBS及び新鮮なODNを補ったRPMI1640に換えた。治癒過程を、動的に試験して、顕微鏡アダプター付きのNikon Coolpix 5000デジタルカメラを用いて記録した。
細胞移動アッセイを、以前に記載されたように(Masood ANUP 論文‘99)行なったが、但し、1μMのAS−10又はAS−6を、上側チャンバーに加えた。EGF(20ng/ml)を、下側チャンバーの化学誘因剤として利用した。10ng/mlのタキソールを負の対照として利用した。
SCC15(5×106細胞)を、5週齢の雄のBalb/C Nu+/nu+無胸腺マウスの背中の下部に皮下注射した。ODN(20mg/kg、総容積100μl)又は希釈剤(PBS)の日々の腹腔内注射よりなる処理を、腫瘍細胞移植の翌日に開始して、2週間続けた。マウスにおける腫瘍の成長を、以前に記載されたように(Masood CCR '01)して測定した。研究の終りに、マウスを犠牲にした。すべてのマウスを、研究所のマウスの世話を管理する南カリフォルニア大学動物保護及び利用委員会のガイドラインに従って維持した。
カポジ肉腫(KS)は、皮膚及び粘膜の最も一般的な多病巣性の血管増殖性疾患として現れ、その後、内臓に広がり(1)、この病気の顕著な特徴は、血管形成、浮腫、リンパ単核細胞の浸潤及び紡錘形状の腫瘍細胞の成長である。病理学的に、確立された病変は、広範なスリット様空間の血管ネットワークを示す。このKSの血管ネットワークは、基底膜の欠如及びこれらの血管を裏打ちする異常な紡錘形状の内皮細胞(腫瘍細胞)において、正常な血管と区別される。不完全な血管系は、アルブミン、赤血球及び単核細胞を含む血液成分の病変への蓄積を生じる(1)。このKS腫瘍は、内皮起源であり;該腫瘍細胞は、Ulex europeaus アグルチニン−1(UEA−1)のためのレクチン結合部位、CD34、EN−4、PAL−E(2)及び内皮細胞特異的なチロシンキナーゼレセプター、VEGFR−1(Flt−1)、VEGFR−2(Flk−1/KDR)、VEGFR−3(Flt−4)、Tie−1及びTie−2(3、RM及びPSG未公開データ)を含む多くの内皮マーカーを発現する。KS細胞は、LYVE及びポドプラニンを含むリンパ細胞関連タンパク質を同時発現する(4)。
KS病変の高度に血管的性質及びこれらの腫瘍細胞の可能な内皮細胞起源は、それぞれ静脈及び動脈内皮細胞のマーカーであるEphB4及びephrinB2の発現の研究を促進した。EphrinB2転写物は、KS生検の腫瘍細胞においてイン・シトゥーハイブリダイゼーションによって検出されたが、EphB4は検出されなかった(図45A)。ephrinB2アンチセンスプローブによる陽性シグナルとH&E染色により示された腫瘍細胞との比較は、ephrinB2発現が、腫瘍細胞を含む生検の領域に限られていることを示す。EphB4アンチセンスプローブを用いた場合のKSにおけるシグナルの欠如は、プローブの欠陥によるものではない。何故なら、それは、我々が、このタンパク質を発現することを示した扁平上皮細胞癌において転写物を検出したからである(18)。KS腫瘍組織におけるephrinB2の発現の更なる証拠は、FITC結合体化抗ヒトFc抗体により検出されるEphB4/Fcシグナルの腫瘍細胞への局在化によって与えられる。ephrinB2は、EphB4の唯一のリガンドであるので、この試薬は、ephrinB2の発現に特異的である(図45B、左)。二次試薬だけで処理した隣接切片は、特異的シグナルを示していない。二色共焦点顕微鏡観察は、ephrinB2陽性細胞におけるHHV−8の潜在性タンパク質、LANA1の存在を示し(図45C、左)、これは、それがこの動脈マーカーを発現している腫瘍細胞であって、腫瘍血管ではないことを示している。腫瘍生検のPECAM−1抗体での染色は、この腫瘍の高い血管性状を示した(図45C、右)。KS生検におけるephrinB2及びEphB4発現のこのパターンの普及率の予備的研究は、RT−PCR分析により行われた。6つの試料のすべては、ephrinB2について陽性であったが、2つだけは、EphB4について弱い陽性であった(データは、示さない)。
我々は、次に、HHV−8(KSの原因因子と思われる)が、内皮細胞で、ephrinB2の発現を誘導して、EphB4の発現を抑制することができるかどうかを尋ねた。生産的にHHV−8が感染するHUVECとBC−1リンパ腫細胞の共存培養は、内皮細胞の有効な感染を生じる(16)。多数回の洗浄後に残っている内皮細胞の付着した単層を、ephrinB2及びEphB4について、RT−PCR及び免疫蛍光によって調べた。HUVECは、EphB4静脈マーカーをRNAレベルで強く発現するが、ephrinB2を発現しない(図46B)。対照的に、HHV−8感染した培養物(HUVEC/BC−1及びHUVEC/BC−3)は、ephrinB2を発現するが、EphB4転写物は殆ど存在しない。
個々のウイルスタンパク質が、全ウイルスで見られるephrinB2の発現を誘導することができるかどうかを試験するために、KS−SLK細胞を、HHV−8 LANA又はLANAΔ440又はvGPCRで安定にトランスフェクトした。安定なクローンのウエスタンブロットは、vGPCRでトランスフェクトしたKS−SLKにおいて、SLK−LANA又はSLK−LANAΔ440と比較して、ephrinB2の5倍の誘導を示した(図47A)。ベクターのみ(pCEFL)をトランスフェクトしたSLKを、対照として利用した。SLK−vGPCR及びSLK−pCEFL細胞も、ephrinB2及びEphB4発現について、一時的にトランスフェクトされたKS−SLK細胞において免疫蛍光によって試験した。図47Bは、SLK−vGPCR細胞におけるephrinB2の、SLK−pCEFLと比べて一層高い発現を示している。SLK−vGPCRにおけるEphB4の変化は、SLK−pCEFLと比べて認められなかった。これは、明らかに、SLK−vGPCR細胞が、ephrinB2を、SLK−pCEFL細胞と比較して一層高レベルで発現したことを示している。これは、HHV−8のvGPCRがKSにおけるEphrinB2の誘導及び動脈表現型切替えに直接関与することを示唆している。我々は、HHV−8がHUVECにおいてephrinB2の発現を誘導することを示して以来、次に、これが転写効果により媒介されうるものであるかどうかを尋ねた。EphrinB2 5’−隣接DNA−ルシフェラーゼレポータープラスミドを、材料と方法に記載したように構築して、HUVEC中に一時的にトランスフェクトした。EphrinB2 5’−隣接DNA配列−2491/−11は、HUVEC細胞において、最少活性を有する(図47C)。これは、ephrinB2が動脈性であって静脈マーカーではないことと一致する。しかしながら、我々は、培養したHUVECは、RNAレベルで幾らかのephrinB2を発現しないことに注意した。HHV−8vGPCRの同時トランスフェクションは、対照用発現ベクターpCEFLと比べて約10倍、ephrinB2転写を誘導する。大体同じ誘導が、ephrinB2配列−2491/−11、−1242/−11、又は−577/−11を用いて見られ、これは、−1242/−11ルシフェラーゼ構築物により最大の活性が見られたけれども、−577と−11の間のエレメントがvGPCRへの応答を媒介するのに十分であることを示している。
我々は、次に、公知のKS成長因子が、ephrinB2発現のvGPCR媒介の誘導に関与しうるかどうかを尋ねた。SLK−vGPCR細胞を、オンコスタチン−M、IL−6、IL−8、VEGF又はVEGF−Cに対する中和抗体で36時間処理した。図48Aは、VEGFの中和が、ephrinB2のSLK−vGPCR細胞における発現を完全にブロックしたことを示している。ephrinB2の僅かであるが有意の減少が、VEGF−C及びIL−8の中和で見られた。オンコスタチン−M又はIL−6の中和では、認められる効果は見られなかった。VEGF及びVEGF−Cが、ephrinB2発現の誘導に対して完全であることを確認するために、我々は、HUVECを、VEGF、VEGF−C又はEGFで処理した。HUVECは、2つの異なる濃度の個々の成長因子(10ng、100ng/ml)を有する5%FBSを含むEBM−2培地において48時間成長させた。VEGF−A又はVEGF−Cのみが、ephrinB2発現を投与量依存様式で誘導した(図48B)。対照的に、EGFは、ephrinB2の発現に何の効果も有しなかった。
3つのephrinB2siRNAを、方法の節に記載したようにして合成した。KS−SLK細胞を、siRNAでトランスフェクトして、48時間後にephrinB2発現をウエスタンブロットにより測定した。EphrinB2 siRNA137又は254は、ephrinB2発現の約70%を阻害した(siRNA EphB4 50又はsiRNA GFPなどの対照用siRNAと比較して)。EphrinB2 63siRNAは、上記の2つのsiRNA EphrinB2より一層効果が弱かった(図49A)。
その後、最も効果的なephrinB2 siRNA(254)を利用して、ephrinB2の発現を阻止することが、KS−SLK又はHUVEC細胞の成長に対して何らかの効果を有するかどうかを測定した。KS−SLK細胞の生存力は、ephrinB2タンパク質レベルを阻害したのと同じsiRNAによって減少した(図49B)。KS−SLKは、高レベルのephrinB2を発現し、この結果は、ephrinB2発現の維持がこの状況において細胞生存力に絶対必要であることを示している。HUVECは、図48Bに示したように、VEGFにより刺激された場合を除いて、ephrinB2を発現しない。EphrinB2 siRNA264は、単独の成長因子としてのVEGFと共に培養されたHUVECの成長を、劇的に低下させる。対照的に、HUVECをIGF、EGF及びbFGFと培養した場合には、有意の効果は見られなかった。対照として、EphB4 siRNA 50は、何れかの培養条件においてHUVECに対して有害な効果を有しなかった(図49C)。KS及び一次内皮細胞の生存力の阻害に加えて、EphB4−ECDは、HUVEC及びKS−SLKにおけるコード形成並びにマトリゲル(商標)プラグアッセイにおけるイン・ビボの血管形成を阻害する(図50)。
1)細胞株及び試薬
ヒトの血管内皮細胞(HUVEC)を、Clonetics(カリフォルニア、San Diego在)から得て、EGM−2及びEGM−2MV培地(Clonetics)中にそれぞれ維持した。T1ヒト繊維芽細胞株を、Peter Jones博士(USC)から得た。BC−1及びBC−3ヒト胸膜浸出液リンパ腫細胞株並びにLANA1及びORF59に対するモノクローナル抗体は、Dharam Ablashi博士(Advanced Biotechnologies Inc., メリーランド、Columbia在)の好意的寄贈であった。KS−SLKを、古典的カポジ肉腫患者から分離した(15)。EphB4,ephrinB2、CD148、PECAM−1に対するポリクローナル抗体を、Santa Cruz Biotechnology(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。マウスEphB4/Fc’及びヒトの血管内皮成長因子(VEGF)、VEGF−C、インターロイキン(IL−)6、IL−8及びオンコスタチン−Mに対するモノクローナル抗体を、R&D Systems(ミネソタ、Minneapolis在)から購入した。発現ベクターpKSvGPCR−CEFL及びpCEFLは、Enrique Mesri博士(コーネル大学、ニューヨーク、New York在)の好意的寄贈であった。HHV−8潜在的関連核抗原(LANA)のための発現ベクターは、Matthew Rettig博士(Administration Greater Los Angeles Healthcare Systemのベテラン)から親切に提供された。
ヒトの皮膚のカポジ肉腫生検材料を、局所麻酔下で、同意した患者から、LAC/USC Medical Centerで、IRB承認された同意書式を使用して得た。生検を、全RNA、パラフィンブロック又は凍結組織ブロック(OCT中)のために処理した。全RNAを、グアニジンイソチオシアネート中でのホモジェナイゼーションにより抽出した(RNAzol:Tel-Test, Inc., テキサス、Frendswoods在)。cDNAを、ランダムヘキサマープライマーを利用する逆転写によって合成した(Superscript II; Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)。
イン・シトゥーハイブリダイゼーションのための表4に示したプライマーからのEphrinB2及びEphB4 PCR生成物を、pGEM−Tイージーシステム(Promega, ウィスコンシン、Madison在)を製造業者の使用説明に従って利用してクローン化した。その信頼性及び挿入向きを、DNA配列決定によって確認した。ヒトのephrinB2又はEphB4遺伝子のPCR生成物を含むpGEM−Tイージープラスミドを、SpeI又はNcoIにより線状化した。アンチセンス又はセンスジゴキシゲニン(DIG)標識したRNAプローブを、T7又はSP6プロモーターから、DIG RNA標識用キット(Roche, インジアナ、Indianapolis在)を利用するrun-off転写により転写した。RNAプローブを、スポットアッセイにより、DIG RNA標識用キットの指示書に記載されたようにして定量した。
上記(例えば、実施例3)を参照されたい。
HUVEC細胞を、50〜70%集密まで、ゼラチンコートされたLabtech II 4ウェルチャンバースライド(Nalge Nunc International, イリノイ、Naperville在)上でEGM−2中で成長させた。BC−1又はBC−3との共存培養は、Sakurada及び共同研究者(16)により記載されたように必須であった。簡単にいえば、BC−1又はBC−3細胞を、TPA(20ng/ml)で予備処理して、48時間にわたってウイルスを誘導してから、HUVEC培養物に、10:1の比で、2日間共存培養のために加えた。これらのHUVECをPBSで何回も洗って、付着したBC−1又はBC−3細胞を除去した。
TITANIUM(商標)1ステップRT−PCR用キット(Clontech, カリフォルニア、Palo Alto在)を、1×105細胞からのRT−PCRのために利用した。EphB4、ephrinB2及びβ−アクチンの増幅のためのプライマー対を、表4に示す。各PCRサイクルは、94℃で30秒の変性、60℃で30秒のプライマーアニーリング及び72℃で30秒の伸長よりなった。これらの試料を、30サイクルにて増幅した。PCR生成物を、1.5%アガロースゲル上で分離して、エチジウムブロミドで染色した。
KS−SLK細胞を、1×104/ウェルの密度で、48ウェルプレート中に、0日目に、2%ウシ胎児血清(FCS)を含む適当な成長培地中に播種した。翌日に、これらの培地を交換して、細胞を、0、10又は100nM siRNAで処理した。3日目に、生存力を、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を利用して以前に記載されたようにして(17)評価した。
Labtech II 4ウェルチャンバースライド上で培養した細胞またはKS生検材料の凍結切片を、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液(pH7.4)(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド中で30分間固定した。これらのスライドを、PBS中で2回すすぎ、ブロッキング緩衝液(PBS中の0.2%トリトン−X100、1%BSA)と20分間予備インキュベートし、その後、ブロッキング緩衝液中で、EphB4、ephrinB2、CD148、LANA1又はORF59に対する抗体(PBS中で、1:100希釈)とのインキュベーションを4℃で16時間行なった。3回洗った後で、これらのスライドを、適当なフルオレセイン又はローダミン結合体化した二次抗体(Sigma-Aldrich, ミズーリ、St.Louis在)とインキュベートした。核を、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドールジヒドロクロリドヒドレート(DAPI)で対比染色し、PBSで何回も洗い、Vectasheild抗退色性マウント用溶液(Vector Laboratories, カリフォルニア、Burlingame在)を用いてマウントした。イメージを、Olympus AX70蛍光顕微鏡及びSpot v2.2.2(Diagnostic Instruments Inc., ミシガン、Sterling Heights在)デジタルイメージングシステムを利用して得た。
粗細胞溶解物を、以前に記載されたように(17)調製し、定量し、分画して、膜にトランスファーした。膜を、ephrinB2に対する抗体(1:5000希釈)との4℃16時間のインキュベーション前に、5%脱脂乳でブロックした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した二次抗体(1:100,000希釈)を、1時間25℃で加えた。これらの膜を、SuperSignal West Femto Maximumセンシティビティー化学発光基質(Pierce, イリノイ、Rockford在)を製造業者の指示に従って利用して発色させた。膜を、Restore(商標)ウエスタンブロットストリッピングバッファー(Pierce)を利用して細片化し、EphB4又はβ−アクチンを用いて再プローブ検出した。
マトリゲル(商標)基底膜マトリクス(BD Biosciences Discovery Labware, マサチューセッツ、Bedford在)を、氷上で成長培地と混合して(3:1)、0.5mlの液体を、24ウェルプレート中に置いた。プレートの37℃で15分間のインキュベーションは、マトリゲル(商標)の重合を引き起こした。対数増殖期のHUVEC又はKS−SLKを、2又は8μg/mlのEphB4−ECD又はPBS(対照)で16時間処理してから、トリプシン処理してマトリゲル(商標)上にプレートした。マトリゲル(商標)上での培養を、組換え融合タンパク質の存在下で6時間続けた。培養物を、4%パラホルムアルデヒド中で30分間固定し、倒立位相差顕微鏡観察により評価した。
Silencer(商標)siRNA構築用キット(Ambion, テキサス、Austin在)を利用して、ephrinB2及びEphB4に対するsiRNAを合成した。簡単にいえば、5’−AAジヌクレオチドの下流に19bpを含む3つの21bpの標的配列を、ephrinB2cDNA(受入れ番号NM_004093)中に同定したが、これは、GenBankデータベース中の他の配列に対する有意の相同性を示さなかった。センス及びアンチセンスsiRNAの29量体のDNAオリゴヌクレオチドテンプレートを、USC Norris Microchemical Core Facilityにて合成した。アンチセンステンプレートは標的配列に対応し、その3’末端には8bpの追加(5'-CCTGTCTC-3')が続き、これは、Silencer SiRNA構築用キットにより提供されたT7プロモータープライマーに対して相補的であった。センステンプレートは、5’−AAを含んだが、その後ろには、標的の19bpの相補配列が続き、その後ろには上記のようにT7の8bpの配列が続いた。別々の反応において、これら2つのsiRNAオリゴヌクレオチドテンプレートは、T7プロモータープライマーにハイブリダイズした。これらのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの3’末端を、DNAポリメラーゼのクレノー断片により伸長させて、二本鎖siRNA転写テンプレートを造った。これらのセンス及びアンチセンスsiRNAテンプレートは、T7RNAポリメラーゼにより転写され、その結果生成したRNA転写物は、ハイブリダイズしてdsRNAを造った。このdsRNAは、5’末端一本鎖リーダー配列、19ntの特異的標的dsRNA及び3’末端UUよりなった。これらのリーダー配列を、該dsRNAを一本鎖特異的リボヌクレアーゼで消化することにより除去した。DNAテンプレートを、RNアーゼフリーのデオキシリボヌクレアーゼで処理することにより同時に除去した。
HUVECを、フィブロネクチンでコートした8ウェルチャンバースライド上に播種して、一晩、EGM−2(Cambrex, メリーランド、Walkersville在)中で成長させた。16時間後に、培地を、5%ウシ胎児血清(FCS)及びEGM−2BulletKit 補助剤bFGF、hEGF及びR3−IGF−Iを製造者により与えられた濃度で補ったEBM−2又は5%FCS及び10ng/ml rhVEGF(R&D Systems)を補ったEBM−2と交換した。37℃で2時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、リポフェクタミン2000(1μg/ml;Invitrogen)及び Opti-MEM-1 無血清培地(Invitrogen)中の10nMの特異的siRNAを利用してトランスフェクトした。2時間の Opti-MEM-1 中でのトランスフェクションの後に、上記のように補足された培地を、適当なウェル中で置き換えた。48時間後に、これらの細胞を、クリスタルバイオレットで染色して、直ちに、10倍の倍率で写真を撮影した。
ヒトのephrinB2の5’隣接DNA(−2491〜−11)を、翻訳開始部位に関して、BACPACクローンRP11−29716(BacPac Resources, Children's Hospital, カリフォルニア、Oakland在)から、標的領域内の広域のGCリッチ配列を克服するために、Advantage GC Genomic PCR キット(Clontech カリフォルニア、Palo Alto在)を利用して増幅した。プライマーを、クローニングのためのMluI部位を含むようにデザインした。増幅した生成物を、MluIで消化し、ゲル精製して、pGL3Basic(Promega, ウィスコンシン、Madison在)のマルチクローニング部位内のMluI部位に連結した。その結果生成したクローンの向きを、制限消化分析により確認した。正しいクローンを、pEFNB2-2491/-11lucと命名した。このクローンのKpnI又はSacIによる消化とその後の再環状化は、それぞれ、pEFNB2-1242/-11luc及びpEFNB2-577/-11lucを生じた。一時的トランスフェクションに用いるプラスミドDNAを、Mega Prepキット(QIAGEN, カリフォルニア、Valencia在)を利用して精製した。
EGM−2培地中に維持したHUVEC細胞(0.8×104細胞/ウェル、24ウェル中)を、0.5μg/ウェルのephrinB2プロモーター−ルシフェラーゼ構築物及び50ng/ウェルのpCEFL又はpKSvGPCR−CEFLで、Superfect 試薬(QIAGEN)を製造業者の指示に従って利用して、一時的に、同時トランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの48時間後に収穫して、ルシフェラーゼ細胞溶解緩衝液(Promega)により溶解させた。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を製造業者の指示に従って利用してアッセイした。pCEFL−vGPCRは、pCMV−Sport−βgal(Invitrogen)からβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導するので、ルシフェラーゼをタンパク質に対して標準化した。
上記(例えば、実施例1)を参照されたい。
図51は、EPHB4の膀胱癌細胞株における発現(A)及びEPHB4発現のEGFRシグナリング経路による調節(B)を示している。
図52は、p53のトランスフェクションが、5637細胞におけるEPHB4の発現を阻害することを示している。
図53は、EPHB4 siRNA472での処理における膀胱癌細胞株(5637)の成長阻害を示している。
図54は、EPHB4 siRNA472でトランスフェクトされた5637細胞のアポトーシス研究における結果を示している。
図55は、EPHB4アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示している。5637細胞は、EPHB4AS10(10μM)で処理された。
図56は、EPHB4 siRNAの細胞浸潤に対する効果を示している。5637細胞は、siRNA472又は対照用siRNAでトランスフェクトされた。
EphB4を発現する細胞株を、合成ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチドで処理して、24時間後に収穫した。細胞溶解物を調製して、EphB4の未処理対照細胞と比較した相対的量について、ウエスタンブロット分析によりプローブ検出した。
KS SLK、内因性の高レベルのephrinB2を発現する細胞株。細胞生存力を、固定した投与量の各オリゴヌクレオチド(5UM)を利用して試験した。遺伝子発現のダウンレギュレーションを、完全長のephrinB2を安定に発現するように遺伝子工学処理された細胞株293を利用して行なった。EphrinB2を発現するKS KLKを利用して、50nMの固定した投与量で試験したRNAiプローブに応答しての生存力をも試験した。タンパク質発現レベルを、完全長EphrinB2を安定に発現する293細胞を利用して、固定した50nMのRNAiプローブでの24時間の処理の後に細胞溶解物において測定した。
図57は、EphB4モノクローナル抗体のG250による及びプルダウンアッセイにおける比較の結果を示している。
図58は、EphB4抗体が、マトリゲル及び成長因子の存在下で、SCC15細胞のイン・ビボでの腫瘍成長を阻害することを示している。
本明細書中で言及したすべての刊行物及び特許は、各刊行物又は特許が、特に、個別的に援用されることが示されたかのように、参考として、そっくりそのまま、援用する。
Claims (91)
- 単離された核酸化合物であって、少なくとも、EphB4転写物に生理的条件下でハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる部分を含む、当該単離された核酸化合物。
- EphB4転写物が、図62に示したヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の単離された核酸化合物。
- 図62に示した核酸配列の500ヌクレオチド以下よりなる領域に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸化合物。
- 前記の領域が、図62に示した配列の少なくとも8個の隣接するヌクレオチドを有する、請求項3に記載の核酸化合物。
- 前記の領域が、図62に示した配列のコード配列内にある、請求項3に記載の核酸化合物。
- 約14〜50ヌクレオチド長である、請求項1に記載の核酸化合物。
- 一本鎖である、請求項1に記載の核酸化合物。
- 二本鎖である、請求項1に記載の核酸化合物。
- 適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含むDNA分子である、請求項1に記載の核酸化合物。
- 適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含むRNA分子である、請求項1に記載の核酸化合物。
- DNA鎖及びRNA鎖を含み、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項1に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物である、請求項1に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物が、約15〜30ヌクレオチド長である、請求項12に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物を、表6に列記した配列から選択する、請求項12に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物が、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項12に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート、及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択する少なくとも一つのヌクレオチド間結合を有する、請求項15に記載の核酸化合物。
- 改変されたアンチセンス核酸化合物が、少なくとも一つの2’−O−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求項15に記載の核酸化合物。
- 核酸化合物が、RNAi構築物である、請求項1に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、dsRNAであり、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項18に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、ヘアピンRNAであり、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項18に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物の二本鎖部分が、約21〜23ヌクレオチド長である、請求項18に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、表7に列記した配列から選択する配列を有するRNA鎖を含み、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分含む、請求項18に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分含む、請求項18に記載の核酸化合物。
- 改変されたRNAi構築物が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート、及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択する少なくとも一つのヌクレオチド間結合を有する、請求項23に記載の核酸化合物。
- 改変されたRNAi構築物が、少なくとも一つの2’−O−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求項24に記載の核酸化合物。
- 酵素的核酸である、請求項1に記載の核酸化合物。
- 酵素的核酸が、リボザイムである、請求項26に記載の核酸化合物。
- 酵素的核酸が、DNA酵素である、請求項26に記載の核酸化合物。
- 生理的条件下で細胞と接触させた場合に、5マイクロモルの濃度で、該細胞におけるEphB4の発現を、50%以上阻害する、請求項1に記載の核酸化合物。
- 単離された核酸化合物であって、生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる部分を含む当該単離された核酸化合物。
- EphrinB2転写物が、図64に示したヌクレオチド配列を有する、請求項30に記載の単離された核酸化合物。
- 図64に示した核酸配列の500ヌクレオチド以下よりなる領域と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸化合物。
- 前記の領域が、図64に示した配列の少なくとも8個の隣接するヌクレオチドを有する、請求項32に記載の核酸化合物。
- 前記の領域が、図64に示したコード配列内にある、請求項32に記載の核酸化合物。
- 約14〜50ヌクレオチド長である、請求項30に記載の核酸化合物。
- 一本鎖である、請求項30に記載の核酸化合物。
- 二本鎖である、請求項30に記載の核酸化合物。
- DNA分子であり、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項30に記載の核酸化合物。
- RNA分子であり、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項30に記載の核酸化合物。
- DNA鎖及びRNA鎖を含み、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項30に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物である、請求項30に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物が、約15〜30ヌクレオチド長である、請求項41に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物を、表8に列記した配列から選択する、請求項41に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物が、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項41に記載の核酸化合物。
- アンチセンス核酸化合物が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート、及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択する少なくとも一つのヌクレオチド間結合を有する、請求項44に記載の核酸化合物。
- 改変されたアンチセンス核酸化合物が、少なくとも一つの2’−O−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求項44に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物である、請求項30に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、dsRNAであり、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項47に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、ヘアピンRNAであり、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項47に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物の二本鎖部分が、約21〜23ヌクレオチド長である、請求項47に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、表9に列記した配列から選択する配列を有するRNA鎖を含み、適宜、少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項47に記載の核酸化合物。
- RNAi構築物が、少なくとも一つの主鎖又は塩基部分を含む、請求項47に記載の核酸化合物。
- 改変されたRNAi構築物が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート、及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択する少なくとも一つのヌクレオチド間結合を有する、請求項52に記載の核酸化合物。
- 改変されたRNAi構築物が、少なくとも一つの2’−O−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求項52に記載の核酸化合物。
- 酵素的核酸である、請求項30に記載の核酸化合物。
- 酵素的核酸が、リボザイムである、請求項55に記載の核酸化合物。
- 酵素的核酸が、DNA酵素である、請求項55に記載の核酸化合物。
- 生理的条件下で細胞と接触させた場合に、5マイクロモルの濃度で、該細胞におけるEphrinB2の発現を、50%以上阻害する、請求項30に記載の核酸化合物。
- 核酸化合物及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物であって、該核酸化合物を、下記よりなる群から選択する、当該医薬組成物:
(a)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(b)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。 - 核酸化合物を、RNAi構築物及びアンチセンス核酸化合物よりなる群から選択する、請求項59に記載の医薬組成物。
- 細胞におけるEphB4の発現を阻害する方法であって、該細胞を、有効量の請求項1に記載の核酸化合物と接触させることを含む当該方法。
- 核酸化合物を、RNAi構築物及びアンチセンス核酸化合物よりなる群から選択する、請求項61に記載の方法。
- 細胞におけるEphrinB2の発現を阻害する方法であって、該細胞を、有効量の請求項30に記載の核酸化合物と接触させることを含む当該方法。
- 核酸化合物を、RNAi構築物及びアンチセンス核酸化合物よりなる群から選択する、請求項63に記載の方法。
- 患者における腫瘍の成長速度を低下させる方法であって、該腫瘍の成長速度を低下させるのに十分な量の核酸化合物を投与することを含み、該核酸化合物を、下記よりなる群から選択する、当該方法:
(a)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(b)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。 - 腫瘍が、EphB4及び/又はEphrinB2を発現する少なくとも一つの癌細胞を含む、請求項65に記載の方法。
- 癌を患っている患者を治療する方法であって、該患者に、下記よりなる群から選択する核酸分子を投与することを含む当該方法:
(a)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(b)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。 - 核酸化合物が、アンチセンス核酸化合物である、請求項67に記載の方法。
- 核酸化合物が、RNAi構築物である、請求項67に記載の方法。
- 核酸化合物を、製薬上許容しうるキャリアーと配合する、請求項67に記載の方法。
- 癌細胞が、匹敵する組織からの非癌性細胞と比較して一層高レベルのEphB4を発現する、請求項67に記載の方法。
- 癌細胞が、匹敵する組織からの非癌性細胞と比較して一層高レベルのEphrinB2を発現する、請求項67に記載の方法。
- 腫瘍が、転移性腫瘍である、請求項67に記載の方法。
- 腫瘍を、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病よりなる群から選択する、請求項67に記載の方法。
- 腫瘍が、血管形成依存性腫瘍である、請求項67に記載の方法。
- 腫瘍が、血管形成非依存性腫瘍である、請求項67に記載の方法。
- 癌細胞を阻害する少なくとも一種の追加の抗癌化学療法剤を、核酸化合物と相加的又は相乗的様式で更に含んでいる、請求項67に記載の方法。
- 血管形成関連疾患を患っている患者を治療する方法であって、該患者に、血管形成を阻害するのに十分な量の核酸化合物を投与することを含み、該核酸化合物を下記よりなる群から選択する当該方法:
(a)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(b)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。 - 核酸化合物が、アンチセンス核酸化合物である、請求項78に記載の方法。
- 核酸化合物が、RNAi構築物である、請求項78に記載の方法。
- 核酸化合物を、製薬上許容しうるキャリアーと配合する、請求項78に記載の方法。
- 血管形成関連疾患を、血管形成依存性の癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、毛細管拡張症、血友病患者関節、血管線維腫、傷肉芽化、傷の治癒、毛細血管拡張性乾癬硬皮症、化膿性肉芽腫、冠状動脈側枝、虚血肢血管形成、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新血管新生、骨折、脈管形成、及び造血よりなる群から選択する、請求項78に記載の方法。
- 血管形成を阻害する少なくとも一種の追加の抗血管形成剤を、核酸化合物と相加的又は相乗的様式で更に含んでいる、請求項78に記載の方法。
- 癌を治療するための医薬の製造における、請求項1に記載の核酸化合物の利用。
- 癌を治療するための医薬の製造における、請求項30に記載の核酸化合物の利用。
- 血管形成関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1に記載の核酸化合物の利用。
- 血管形成関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項30に記載の核酸化合物の利用。
- 癌を患っている患者を治療する方法であって、下記を含む当該方法:
(a)EphB4及び/又はEphrinB2を発現する複数の癌細胞を有する腫瘍を患者において同定し;そして
(b)該患者に、下記よりなる群から選択する核酸化合物を投与する:
(i)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(ii)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。 - 癌を患っている患者を治療する方法であって、下記を含む当該方法:
(a)EphB4及び/又はEphrinB2の遺伝子の遺伝子増幅を有する複数の癌細胞を有する腫瘍を患者において同定し;そして
(b)該患者に、下記よりなる群から選択する核酸化合物を投与する:
(i)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(ii)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。 - EphrinB2又はEphB4発現のインヒビターによる治療に適した腫瘍を同定する方法であって、該方法は、腫瘍細胞において、下記の特徴の少なくとも一つを検出することを含み:
(a)EphB4タンパク質及び/又はmRNAの発現;
(b)EphrinB2タンパク質及び/又はmRNAの発現;
(c)EphB4遺伝子の遺伝子増幅;及び
(d)EphrinB2遺伝子の遺伝子増幅、
特徴(a)〜(d)の少なくとも一つを有する腫瘍細胞が、EphrinB2又はEphB4発現のインヒビターによる治療に適している、上記の方法。 - EphrinB2又はEphB4発現のインヒビターを、下記よりなる群から選択する、請求項60に記載の方法:
(i)生理的条件下でEphB4転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphB4の発現を低下させる核酸化合物;及び
(ii)生理的条件下でEphrinB2転写物にハイブリダイズして、細胞におけるEphrinB2の発現を低下させる核酸化合物。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023224096A1 (ja) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、tcr/car-t細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法 |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6887674B1 (en) | 1998-04-13 | 2005-05-03 | California Institute Of Technology | Artery- and vein-specific proteins and uses therefor |
AU2002951409A0 (en) * | 2002-09-16 | 2002-09-26 | North Western Adelaide Health Services | Methods for regulating cancer |
AU2003268345A1 (en) | 2002-09-24 | 2004-04-19 | The Burnham Institute | Novel agents that modulate eph receptor activity |
JP2006521111A (ja) | 2003-03-12 | 2006-09-21 | バスジーン セラピューティクス, インコーポレイテッド | 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物及びその応用 |
US7381410B2 (en) | 2003-03-12 | 2008-06-03 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
CN102718867A (zh) | 2004-03-12 | 2012-10-10 | 瓦斯基因治疗公司 | 结合ephb4、抑制血管发生和肿瘤生长的抗体 |
JP4960859B2 (ja) | 2004-03-12 | 2012-06-27 | バスジーン セラピューティクス,インコーポレイテッド | 血管形成及び腫瘍成長を阻害するためのポリペプチド化合物 |
JP2007320850A (ja) * | 2004-08-24 | 2007-12-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗エフリンb2抗体 |
EP1799867A2 (en) * | 2004-09-23 | 2007-06-27 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for detecting and treating tumors |
EP1799713B1 (en) * | 2004-09-23 | 2014-11-05 | VasGene Therapeutics, Inc. | Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
DE102004054016A1 (de) * | 2004-11-09 | 2006-05-11 | Robert Bosch Gmbh | Steuergerät zum Steuern und/oder regeln mindestens einer Fahrzeugfunktion |
EP2189469B1 (en) * | 2004-11-18 | 2015-09-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Multicistronic siRNA constructs to inhibit tumors |
WO2006074392A2 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-13 | Genentech, Inc. | Cancer prognostic, diagnostic and treatment methods |
DE602006017964D1 (de) | 2005-01-27 | 2010-12-16 | Burnham Inst La Jolla | Ephb-rezeptorbindende peptide |
FR2889200B1 (fr) | 2005-07-27 | 2008-01-04 | Inst Vaisseaux Et Du Sang Ass | Systeme marqueur cellulaire/ligand, ou le marqueur est du type eph, materiau cellulaire comprenant ce systeme, procede de preparation et utilisation proangiogenique |
AU2006294873A1 (en) * | 2005-09-23 | 2007-04-05 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Use of EphrinB2 directed agents for the treatment or prevention of viral infections |
RU2451031C2 (ru) | 2006-01-20 | 2012-05-20 | Дженентек, Инк. | Антитела к эфрину в2 и способы их применения |
EP2056845B1 (en) | 2006-08-08 | 2017-10-11 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides |
US20110052667A1 (en) * | 2007-06-28 | 2011-03-03 | Sylgen Laboratories, Inc. | Compositions and methods for inhibiting angiogenesis and tumorigenesis |
WO2009023185A1 (en) * | 2007-08-13 | 2009-02-19 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Cancer treatment using humanized antibodies that bind to ephb4 |
PL2492355T3 (pl) * | 2007-11-29 | 2015-09-30 | Molecular Health Gmbh | Receptor erytropoetyny ochronny dla tkanki (nepor) i sposoby zastosowania |
US8357501B2 (en) | 2007-11-29 | 2013-01-22 | Molecular Health Gmbh | Tissue protective erythropoietin receptor (NEPOR) and methods of use |
JP5689413B2 (ja) | 2008-05-21 | 2015-03-25 | ライニッシュ フリードリッヒ−ウィルヘルムズ−ユニバーシタット ボン | 平滑末端を有する5’三リン酸オリゴヌクレオチドおよびその使用 |
US20120207743A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-16 | Allergan, Inc. | Inhibiting Aberrant Blood Vessel Formation Using Retargeted Endopeptidases |
EP2508530A1 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-10 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags |
EP2712870A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-02 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Novel RIG-I ligands and methods for producing them |
JP2015071566A (ja) * | 2013-10-03 | 2015-04-16 | 住友ベークライト株式会社 | Fgf4遺伝子増幅腫瘍の医薬組成物 |
JP7057975B2 (ja) * | 2016-12-14 | 2022-04-21 | 国立大学法人信州大学 | 殺細胞効果を有するキメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球 |
WO2020146723A1 (en) * | 2019-01-10 | 2020-07-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Functional analysis of cancer cells |
EP4105328A1 (en) * | 2021-06-15 | 2022-12-21 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Antisense-oligonucleotides for prevention of kidney dysfunction promoted by endothelial dysfunction by ephrin-b2 suppression |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000030673A1 (en) * | 1998-11-20 | 2000-06-02 | Genentech, Inc. | Uses for eph receptor antagonists and agonists to treat vascular disorders |
WO2001072765A1 (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | ALTERATION OF CELLULAR BEHAVIOR BY ANTISENSE MODULATION OF mRNA PROCESSING |
WO2002081494A1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-10-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication |
WO2002096927A2 (en) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Ribozyme based treatment of female reproductive diseases |
WO2003004057A1 (en) * | 2001-07-03 | 2003-01-16 | The Hospital For Sick Children | Ephrin and eph receptor mediated immune modulation |
Family Cites Families (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
JPH04218000A (ja) | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
DE69233421T2 (de) | 1991-06-21 | 2006-02-23 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, Parkville | Neuartige rezeptor-typ tyrosinkinase und deren verwendung |
US5635177A (en) | 1992-01-22 | 1997-06-03 | Genentech, Inc. | Protein tyrosine kinase agonist antibodies |
US6331302B1 (en) * | 1992-01-22 | 2001-12-18 | Genentech, Inc. | Protein tyrosine kinase agonist antibodies |
WO1993015201A1 (en) | 1992-01-22 | 1993-08-05 | New England Deaconess Hospital | Novel protein tyrosine kinases |
HU221343B1 (en) | 1992-10-28 | 2002-09-28 | Genentech Inc | Use of anti-vegf antibodies for the treatment of cancer |
US5824303A (en) | 1992-11-13 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | Eck receptor ligands |
AU685765B2 (en) | 1992-11-13 | 1998-01-29 | Amgen, Inc. | (Eck) receptor ligands |
US5512591A (en) | 1993-02-18 | 1996-04-30 | President And Fellows Of Harvard College | Treatments for diseases characterized by neovascularization |
ES2152753B1 (es) | 1993-03-29 | 2001-09-01 | Ct Investig Energeticas Ciemat | Animales transgenicos para la determinacion de agentes que estimulan o reprimen la hiperproliferacion epidermica y el crecimiento del pelo |
US5801154A (en) * | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US6303769B1 (en) * | 1994-07-08 | 2001-10-16 | Immunex Corporation | Lerk-5 dna |
US5864020A (en) * | 1994-07-20 | 1999-01-26 | Genentech, Inc. | HTK ligand |
AU3144195A (en) | 1994-07-26 | 1996-02-22 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Human brain specific kinase |
US5795734A (en) | 1994-09-19 | 1998-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | EPH receptor ligands, and uses related thereto |
DE69532857T2 (de) | 1994-10-27 | 2005-04-28 | Genentech Inc., San Francisco | Neurotrophischer AL-1 Faktor, einer Ligand verwandt mit dem EPH Tyrosine Kinase Receptor |
US6057124A (en) | 1995-01-27 | 2000-05-02 | Amgen Inc. | Nucleic acids encoding ligands for HEK4 receptors |
WO1996026958A2 (en) | 1995-02-27 | 1996-09-06 | President And Fellows Of Harvard College | Eph RECEPTOR LIGAND ELF-2 |
GB9508538D0 (en) | 1995-04-27 | 1995-06-14 | Zeneca Ltd | Quinazoline derivatives |
PT848755E (pt) | 1995-09-08 | 2003-12-31 | Genentech Inc | Proteina relacionada com o vegf |
US6346398B1 (en) * | 1995-10-26 | 2002-02-12 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for the treatment of diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor |
US5837534A (en) | 1995-11-14 | 1998-11-17 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Smooth muscle 22α promoter, gene transfer vectors containing the same, and method of use of the same to target gene expression in arterial smooth muscle cells |
AUPN727795A0 (en) | 1995-12-22 | 1996-01-18 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | A novel receptor-type tyrosine kinase and use thereof |
US6696557B1 (en) * | 1996-04-19 | 2004-02-24 | Genentech, Inc. | AL-2 neurotrophic factor nucleic acid |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
AU3251797A (en) | 1996-07-05 | 1998-02-02 | Mount Sinai Hospital Corporation | Oligomerized receptors which affect pathways regulated by transmembrane ligands for elk-related receptor tyrosine kinases |
UA73073C2 (uk) | 1997-04-03 | 2005-06-15 | Уайт Холдінгз Корпорейшн | Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція |
ES2273415T3 (es) | 1997-04-07 | 2007-05-01 | Genentech, Inc. | Anticuerpos anti-vegf. |
WO1998045708A1 (en) | 1997-04-08 | 1998-10-15 | Sugen, Inc. | Study and treatment of diseases related to specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases |
US6440954B1 (en) | 1997-04-18 | 2002-08-27 | President And Fellows Of Harvard College | Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation |
US6555321B1 (en) | 1997-08-19 | 2003-04-29 | Vanderbilt University | Methods for determining cell responses through EphB receptors |
CA2308126A1 (en) | 1997-10-02 | 1999-04-15 | Leukosite, Inc. | Modulation of lerk-2-mediated cell adhesion |
WO1999045026A1 (en) | 1998-03-05 | 1999-09-10 | Chiron Corporation | Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule |
US6864227B1 (en) | 1998-04-13 | 2005-03-08 | California Institute Of Technology | Artery-and vein-specific proteins and uses therefor |
US6887674B1 (en) | 1998-04-13 | 2005-05-03 | California Institute Of Technology | Artery- and vein-specific proteins and uses therefor |
CA2246664A1 (en) | 1998-10-02 | 2000-04-02 | Universite Paris 7 | Vascular specific regulatory elements contained in the desmin 5' flanking region |
AUPP674898A0 (en) | 1998-10-27 | 1998-11-19 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | A method of treatment |
US6150162A (en) * | 1998-12-17 | 2000-11-21 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of CD44 expression |
US6770633B1 (en) * | 1999-10-26 | 2004-08-03 | Immusol, Inc. | Ribozyme therapy for the treatment of proliferative skin and eye diseases |
US7205113B2 (en) | 2000-01-06 | 2007-04-17 | The Hospital For Sick Children | Methods of modulation of the immune system |
AU2001259063A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
EP1274730A2 (en) | 2000-04-21 | 2003-01-15 | Amgen, Inc. | Integrin/adhesion antagonists |
US6271030B1 (en) * | 2000-06-14 | 2001-08-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of C/EBP beta expression |
US6277640B1 (en) * | 2000-07-31 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of Her-3 expression |
CA2417982A1 (en) | 2000-08-03 | 2002-02-14 | The University Of Utah Research Foundation | Manipulation of arterial-venous identity |
US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
WO2002026827A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Novartis Ag | Extracellular polypeptides of eph b receptors and ephrin b ligands and the corresponding nucleic acid molecules |
US7136808B2 (en) * | 2000-10-20 | 2006-11-14 | Microsoft Corporation | Detection and correction of errors in german grammatical case |
JP2004529614A (ja) | 2000-11-20 | 2004-09-30 | カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 動脈平滑筋及び静脈平滑筋並びにそれらの利用 |
CZ302719B6 (cs) * | 2000-12-01 | 2011-09-21 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití |
AU2002243623A1 (en) | 2001-01-26 | 2002-08-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of imaging and targeting vasculature |
CA2437194A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-08-08 | Mount Sinai Hospital | Methods for regulating the kinase domain of ephb2 |
EP1364066A2 (en) | 2001-02-02 | 2003-11-26 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for identifying functional nucleic acids |
US6919313B2 (en) | 2001-03-30 | 2005-07-19 | President & Fellows Of Harvard College | Protein waving a PDZ and a RGS domain |
EP1386004A4 (en) * | 2001-04-05 | 2005-02-16 | Ribozyme Pharm Inc | MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID |
ES2372321T3 (es) | 2001-06-20 | 2012-01-18 | Genentech, Inc. | Composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de un tumor de pulmón. |
DE60233509D1 (de) | 2001-06-20 | 2009-10-08 | Fibron Ltd | Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon |
JP3876656B2 (ja) * | 2001-07-13 | 2007-02-07 | 住友金属工業株式会社 | 管用ねじ継手 |
JP2005531281A (ja) * | 2001-11-02 | 2005-10-20 | ファイザー・プロダクツ・インク | 肺癌の治療および診断 |
US20060241027A1 (en) | 2002-02-07 | 2006-10-26 | Hans-Peter Hauser | Hiv inhibiting proteins |
CA2485373A1 (en) | 2002-05-10 | 2003-11-20 | Medimmune, Inc. | Epha2 monoclonal antibodies and methods of use thereof |
US20040091486A1 (en) | 2002-05-10 | 2004-05-13 | Kinch Michael S. | EphA2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof |
WO2005051307A2 (en) | 2003-11-20 | 2005-06-09 | Medimmune, Inc. | Epha2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof |
US20040110150A1 (en) * | 2002-12-10 | 2004-06-10 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of Ephrin-B2 expression |
AU2003254641A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
AU2002951409A0 (en) | 2002-09-16 | 2002-09-26 | North Western Adelaide Health Services | Methods for regulating cancer |
AU2003260169B9 (en) * | 2002-09-16 | 2011-06-09 | The Queen Elizabeth Hospital Research Foundation Inc. | Methods for regulating cancer |
EP1560931B1 (en) * | 2002-11-14 | 2011-07-27 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional sirna |
US7250289B2 (en) * | 2002-11-20 | 2007-07-31 | Affymetrix, Inc. | Methods of genetic analysis of mouse |
JP2006521111A (ja) | 2003-03-12 | 2006-09-21 | バスジーン セラピューティクス, インコーポレイテッド | 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物及びその応用 |
US20070207952A1 (en) | 2003-03-24 | 2007-09-06 | Sequoia Pharmaceuticals | Long Acting Biologically Active Conjugates |
JP2006523240A (ja) | 2003-04-11 | 2006-10-12 | メディミューン,インコーポレーテッド | EphA2、低増殖性細胞障害ならびに上皮および内皮の再構成 |
WO2004091375A2 (en) | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Medimmune, Inc. | Epha2 and non-neoplastic hyperproliferative cell disorders |
AU2004291026A1 (en) | 2003-06-06 | 2005-06-02 | Medimmune, Llc | Use of EphA4 and modulator of EphA4 for diagnosis, treatment and prevention of cancer |
US7576052B2 (en) | 2003-10-17 | 2009-08-18 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods and compositions for modulating adipocyte function |
JP4960859B2 (ja) | 2004-03-12 | 2012-06-27 | バスジーン セラピューティクス,インコーポレイテッド | 血管形成及び腫瘍成長を阻害するためのポリペプチド化合物 |
EP1799713B1 (en) | 2004-09-23 | 2014-11-05 | VasGene Therapeutics, Inc. | Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000030673A1 (en) * | 1998-11-20 | 2000-06-02 | Genentech, Inc. | Uses for eph receptor antagonists and agonists to treat vascular disorders |
WO2001072765A1 (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | ALTERATION OF CELLULAR BEHAVIOR BY ANTISENSE MODULATION OF mRNA PROCESSING |
WO2002081494A1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-10-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication |
WO2002096927A2 (en) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Ribozyme based treatment of female reproductive diseases |
WO2003004057A1 (en) * | 2001-07-03 | 2003-01-16 | The Hospital For Sick Children | Ephrin and eph receptor mediated immune modulation |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6010001284, Annals of Oncology, 200302, Vol.14, p.220−226 * |
JPN6010001285, BMC Molecular Biology, 2001, Vol.2, p.15−23 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023224096A1 (ja) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、tcr/car-t細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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