JP2000201686A - 癌の血管新生を抑制するリボザイム及び癌治療用組成物 - Google Patents
癌の血管新生を抑制するリボザイム及び癌治療用組成物Info
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- JP2000201686A JP2000201686A JP11009457A JP945799A JP2000201686A JP 2000201686 A JP2000201686 A JP 2000201686A JP 11009457 A JP11009457 A JP 11009457A JP 945799 A JP945799 A JP 945799A JP 2000201686 A JP2000201686 A JP 2000201686A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌の遺伝子治療にリボザイムを利用するこ
と。 【解決手段】 特に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ｍＲ
ＮＡの切断を介して癌の血管新生を抑制する能力をもつ
リボザイム、そのリボザイムをコードする核酸分子、そ
の核酸分子を含むベクター、そのベクターを含む宿主細
胞、そのリボザイム又はベクターを含む癌治療用の医薬
組成物。
と。 【解決手段】 特に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ｍＲ
ＮＡの切断を介して癌の血管新生を抑制する能力をもつ
リボザイム、そのリボザイムをコードする核酸分子、そ
の核酸分子を含むベクター、そのベクターを含む宿主細
胞、そのリボザイム又はベクターを含む癌治療用の医薬
組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌の血管新生を抑
制する能力をもつリボザイムに関する。特に、血管内皮
成長因子ｍＲＮＡの切断を介して癌の血管新生を抑制す
るリボザイムに関する。本発明はまた、そのようなリボ
ザイムをコードする核酸分子、該分子を含むベクター、
該ベクターを含む宿主細胞、並びに該ベクターを含む癌
を治療するための医薬組成物に関する。
制する能力をもつリボザイムに関する。特に、血管内皮
成長因子ｍＲＮＡの切断を介して癌の血管新生を抑制す
るリボザイムに関する。本発明はまた、そのようなリボ
ザイムをコードする核酸分子、該分子を含むベクター、
該ベクターを含む宿主細胞、並びに該ベクターを含む癌
を治療するための医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管新生は、腫瘍の成長及び転移にとっ
て必須の過程であり、腫瘍間質での血管新生の抑制は新
しい抗癌治療のための有効な戦略の１つである。腫瘍で
の血管新生の抑制に関して種々の標的分子が報告されて
いる（S.Y. Chen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. US
A, 1996, 93:8502-8507）。血管内皮成長因子（以下
「ＶＥＧＦ」という）に対するモノクローナル抗体もま
た腫瘍の血管新生及び成長を抑制することが報告されて
いる（L.Claesson-Welsh et al., Proc. Nat'l. Acad.
Sci. USA, 1998, 95:5579-5583; Z.Wu et al., Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 1997, 236:651-654; M.S.
O'Reilly et al., Cell, 1997, 88:277-285）。
て必須の過程であり、腫瘍間質での血管新生の抑制は新
しい抗癌治療のための有効な戦略の１つである。腫瘍で
の血管新生の抑制に関して種々の標的分子が報告されて
いる（S.Y. Chen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. US
A, 1996, 93:8502-8507）。血管内皮成長因子（以下
「ＶＥＧＦ」という）に対するモノクローナル抗体もま
た腫瘍の血管新生及び成長を抑制することが報告されて
いる（L.Claesson-Welsh et al., Proc. Nat'l. Acad.
Sci. USA, 1998, 95:5579-5583; Z.Wu et al., Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 1997, 236:651-654; M.S.
O'Reilly et al., Cell, 1997, 88:277-285）。
【０００３】しかしながら、これらの抗血管新生戦略は
癌間質の血管新生に特異的でないため、生理学的血管新
生あるいは組織低酸素症からの回復のための標準的機序
に対し悪影響を及ぼす可能性がある。例えば、可溶性Ｖ
ＥＧＦ受容体flt-1によるＶＥＧＦの阻害の結果、ラッ
トにおいて卵巣黄体形成の完全抑制が生じたことが報告
されている（N. Ferrara et al., Nature Med., 1998,
4:336-340）。したがって、癌血管新生に特異的な分子
標的を同定し癌に対する有効な血管形成抑制療法を確立
することが必要である。
癌間質の血管新生に特異的でないため、生理学的血管新
生あるいは組織低酸素症からの回復のための標準的機序
に対し悪影響を及ぼす可能性がある。例えば、可溶性Ｖ
ＥＧＦ受容体flt-1によるＶＥＧＦの阻害の結果、ラッ
トにおいて卵巣黄体形成の完全抑制が生じたことが報告
されている（N. Ferrara et al., Nature Med., 1998,
4:336-340）。したがって、癌血管新生に特異的な分子
標的を同定し癌に対する有効な血管形成抑制療法を確立
することが必要である。
【０００４】ＶＥＧＦは３４〜４２ｋｄの二量体糖タン
パク質であり、内皮細胞の透過及び分裂活性を増加させ
（D.J. Gospodarowicz et al., Proc. Nat'l. Acad. S
ci.USA, 1989, 86:7311-7315;P.J. Keck et al., Scien
ce, 1989, 246:1309-1312）、腫瘍血管新生において重
要な役割を果たしている（K.H. Plate et al., Nature,
1992, 359:845-848）。ＶＥＧＦの過剰発現は種々の新
生物で立証されており（Y. Takahashi et al., Cancer
Res., 1995, 55:3964-3968; L.F. Brown et al., Hum.
Pathol., 1995, 26:86-91; R.A. Berkman et al., J. C
lin. Invest.,1993, 91:153-159;C.A. Boocock et al.,
J. Natl. Cancer Inst., 1995, 87:506-516; K. Suzuk
i et al., Cancer Res., 1996, 56:3004-3009）、特定
の種類の癌で予後の重要性を有している（K. Inoue et
al., Cancer, 1997, 79:206-213;M. Volm et al., Int.
J. Cancer, 1997, 74:64-68; P.J. Paley et al., Can
cer, 1997, 80:98-106; G. Gasparini et al., J. Nat
l. Cancer Inst., 1997, 89:139-147; A. Obermair et
al., Gynecol. Oncol., 1996, 63:204-209）。ＶＥＧＦ
ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって５つのＶＥＧ
Ｆイソフォーム、即ちＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４
５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６が生じ（E. Tis
cher et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:11947-1195
4; Z. Poltoraket al., J. Biol. Chem., 1997, 272;71
51-7158）、それらの各々は異なる生物活性を有してい
る（H.F. Dvorak et al., Am. J. Pathol., 1995, 146:
1029-1039）。ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥ
ＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６は細胞関連イソフォーム
（K.A. Houck et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:260
31-26037）であるが、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５
は可溶性分子として分泌される（J.E. Park et al., Mo
l. Biol. Cell, 1993, 4:1317-1326）。
パク質であり、内皮細胞の透過及び分裂活性を増加させ
（D.J. Gospodarowicz et al., Proc. Nat'l. Acad. S
ci.USA, 1989, 86:7311-7315;P.J. Keck et al., Scien
ce, 1989, 246:1309-1312）、腫瘍血管新生において重
要な役割を果たしている（K.H. Plate et al., Nature,
1992, 359:845-848）。ＶＥＧＦの過剰発現は種々の新
生物で立証されており（Y. Takahashi et al., Cancer
Res., 1995, 55:3964-3968; L.F. Brown et al., Hum.
Pathol., 1995, 26:86-91; R.A. Berkman et al., J. C
lin. Invest.,1993, 91:153-159;C.A. Boocock et al.,
J. Natl. Cancer Inst., 1995, 87:506-516; K. Suzuk
i et al., Cancer Res., 1996, 56:3004-3009）、特定
の種類の癌で予後の重要性を有している（K. Inoue et
al., Cancer, 1997, 79:206-213;M. Volm et al., Int.
J. Cancer, 1997, 74:64-68; P.J. Paley et al., Can
cer, 1997, 80:98-106; G. Gasparini et al., J. Nat
l. Cancer Inst., 1997, 89:139-147; A. Obermair et
al., Gynecol. Oncol., 1996, 63:204-209）。ＶＥＧＦ
ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって５つのＶＥＧ
Ｆイソフォーム、即ちＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４
５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６が生じ（E. Tis
cher et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:11947-1195
4; Z. Poltoraket al., J. Biol. Chem., 1997, 272;71
51-7158）、それらの各々は異なる生物活性を有してい
る（H.F. Dvorak et al., Am. J. Pathol., 1995, 146:
1029-1039）。ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥ
ＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６は細胞関連イソフォーム
（K.A. Houck et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:260
31-26037）であるが、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５
は可溶性分子として分泌される（J.E. Park et al., Mo
l. Biol. Cell, 1993, 4:1317-1326）。
【０００５】最近、本発明者らは、イソフォームＶＥＧ
Ｆ１８９が非小細胞肺癌で正常肺組織に比して有意に高
頻度に発現され、大腸癌では肝臓転移と予後の悪さに相
関していることを示した（Y. Oshika et al., Int. J.
Oncol., 1998, 12:541-544;T. Tokunaga et al., Br.
J. Cancer, 1998, 77:998-1002）。さらに、ＶＥＧＦ１
８９イソフォームの発現は重症免疫不全マウスへの大腸
癌の異種移植可能性と密接に関わっている（T. Tokunag
a et al., J. Natl. Cancer Inst., 1998, 90:48-4
9）。この細胞関連イソフォームＶＥＧＦ１８９は癌細
胞周辺により特異的に残留することが示唆されている
が、これは、可溶性イソフォームＶＥＧＦ１２１及びＶ
ＥＧＦ１６５と比べて細胞表面のプロテオグリカンとよ
り強い親和性を有していることによる。
Ｆ１８９が非小細胞肺癌で正常肺組織に比して有意に高
頻度に発現され、大腸癌では肝臓転移と予後の悪さに相
関していることを示した（Y. Oshika et al., Int. J.
Oncol., 1998, 12:541-544;T. Tokunaga et al., Br.
J. Cancer, 1998, 77:998-1002）。さらに、ＶＥＧＦ１
８９イソフォームの発現は重症免疫不全マウスへの大腸
癌の異種移植可能性と密接に関わっている（T. Tokunag
a et al., J. Natl. Cancer Inst., 1998, 90:48-4
9）。この細胞関連イソフォームＶＥＧＦ１８９は癌細
胞周辺により特異的に残留することが示唆されている
が、これは、可溶性イソフォームＶＥＧＦ１２１及びＶ
ＥＧＦ１６５と比べて細胞表面のプロテオグリカンとよ
り強い親和性を有していることによる。
【０００６】ところで、リボザイムは配列特異的にＲＮ
Ａ基質を切断する触媒性アンチセンスＲＮＡ(T.R. Cech
et al., Cell, 1981, 27:487-496)であり、癌遺伝子療
法の潜在的に有用なツールである（H. Kijima et al.,
Pharmac. Ther., 1995, 68:247-267; A. Irie et al.,
Int. J. Urol., 1997, 4:329-337）。ハンマーヘッド型
リボザイムがタバコ輪状斑紋ウイルスのサテライトＲＮ
Ａで最初に発見（J.M.Buzayan et al., Nature, 1986,
323:349-353; G.A. Prody et al., Science,1986, 231:
1577-1580）されたが、このリボザイムはシス作用的に
機能する。また、異常上皮成長因子受容体に対するハン
マーヘッド型リボザイムがin vivoで異常上皮成長因子
受容体導入遺伝子形質転換細胞の成長を効果的に抑制す
ることが示されている（H. Yamazaki et al., J. Natl.
Cancer Inst. , 1998, 90:581-587）。さらに、ＨＩＶ
やＣ型肝炎ウイルスの遺伝子、活性化ras癌遺伝子、ト
ランケートされたbcr-abl遺伝子のような特定の遺伝子
のリボザイム仲介の特異的切断及び機能抑制も報告され
ている（N. Sarver et al., Science, 1990, 247:1222-
1225; J. Ohkawa et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. US
A, 1993, 90:11302-11306; N. Sakamoto et al., J. Cl
in. Invest., 1996, 98:2720-2728; Y. Ohta et al., N
ucleic Acids Res., 1996, 24:938-942; D.S. Suyder e
t al., Blood, 1993, 82:600-605）。
Ａ基質を切断する触媒性アンチセンスＲＮＡ(T.R. Cech
et al., Cell, 1981, 27:487-496)であり、癌遺伝子療
法の潜在的に有用なツールである（H. Kijima et al.,
Pharmac. Ther., 1995, 68:247-267; A. Irie et al.,
Int. J. Urol., 1997, 4:329-337）。ハンマーヘッド型
リボザイムがタバコ輪状斑紋ウイルスのサテライトＲＮ
Ａで最初に発見（J.M.Buzayan et al., Nature, 1986,
323:349-353; G.A. Prody et al., Science,1986, 231:
1577-1580）されたが、このリボザイムはシス作用的に
機能する。また、異常上皮成長因子受容体に対するハン
マーヘッド型リボザイムがin vivoで異常上皮成長因子
受容体導入遺伝子形質転換細胞の成長を効果的に抑制す
ることが示されている（H. Yamazaki et al., J. Natl.
Cancer Inst. , 1998, 90:581-587）。さらに、ＨＩＶ
やＣ型肝炎ウイルスの遺伝子、活性化ras癌遺伝子、ト
ランケートされたbcr-abl遺伝子のような特定の遺伝子
のリボザイム仲介の特異的切断及び機能抑制も報告され
ている（N. Sarver et al., Science, 1990, 247:1222-
1225; J. Ohkawa et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. US
A, 1993, 90:11302-11306; N. Sakamoto et al., J. Cl
in. Invest., 1996, 98:2720-2728; Y. Ohta et al., N
ucleic Acids Res., 1996, 24:938-942; D.S. Suyder e
t al., Blood, 1993, 82:600-605）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、癌の血
管新生とVEGFとの関係についての研究を通して、VEGFイ
ソフォーム１８９が癌間質での血管新生及び癌の発達ま
たは進行にとって他のイソフォームよりも重要であるこ
と、またＶＥＧＦ１８９が正常組織に重大に悪影響を及
ぼすことなく癌遺伝子治療のための分子標的であると推
定した。本発明の目的は、癌細胞中で過剰産生されるVE
GF189の転写産物を特異的に切断するリボザイムを提供
することである。本発明の別の目的は、リボザイム又は
リボザイムをコードする核酸配列（DNA又はｃDNA）を含
むベクターを癌の治療（特に遺伝子治療）に使用するこ
とである。
管新生とVEGFとの関係についての研究を通して、VEGFイ
ソフォーム１８９が癌間質での血管新生及び癌の発達ま
たは進行にとって他のイソフォームよりも重要であるこ
と、またＶＥＧＦ１８９が正常組織に重大に悪影響を及
ぼすことなく癌遺伝子治療のための分子標的であると推
定した。本発明の目的は、癌細胞中で過剰産生されるVE
GF189の転写産物を特異的に切断するリボザイムを提供
することである。本発明の別の目的は、リボザイム又は
リボザイムをコードする核酸配列（DNA又はｃDNA）を含
むベクターを癌の治療（特に遺伝子治療）に使用するこ
とである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＶＥＧＦ
の異常イソフォーム（ＶＥＧＦ１８９）をエキソン６で
切断可能なハンマーヘッド型リボザイムを設計しin vit
roとin vivoでＶＥＧＦ１８９のリボザイム仲介切断の
有効性を評価した。その結果、ＶＥＧＦ１８９のリボザ
イム仲介特異的切断により、ヌードマウス内のヒト肺腺
癌異種移植片の血管新生と成長を抑制することを見出し
た。これにより、ＶＥＧＦ１８９に対するリボザイムが
癌の遺伝子治療に潜在的に有効であることが判明し、本
発明を完成するに至った。
の異常イソフォーム（ＶＥＧＦ１８９）をエキソン６で
切断可能なハンマーヘッド型リボザイムを設計しin vit
roとin vivoでＶＥＧＦ１８９のリボザイム仲介切断の
有効性を評価した。その結果、ＶＥＧＦ１８９のリボザ
イム仲介特異的切断により、ヌードマウス内のヒト肺腺
癌異種移植片の血管新生と成長を抑制することを見出し
た。これにより、ＶＥＧＦ１８９に対するリボザイムが
癌の遺伝子治療に潜在的に有効であることが判明し、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、癌の血管新生を抑制
する能力をもつリボザイムを提供する。 一実施態様において、前記抑制はＶＥＧＦｍＲＮＡの切
断、より具体的にはＶＥＧＦ１８９遺伝子エキソン６の
転写ｍＲＮＡのＧＵＣ配列の直後での切断によって引き
起こされる。また、好適にはリボザイムはハンマーヘッ
ド型である。別の実施態様において、本発明のリボザイ
ムは配列番号１に示す核酸配列又はリボザイム活性をも
つその改変配列を有する。さらに好適には、癌は肺癌で
ある。
する能力をもつリボザイムを提供する。 一実施態様において、前記抑制はＶＥＧＦｍＲＮＡの切
断、より具体的にはＶＥＧＦ１８９遺伝子エキソン６の
転写ｍＲＮＡのＧＵＣ配列の直後での切断によって引き
起こされる。また、好適にはリボザイムはハンマーヘッ
ド型である。別の実施態様において、本発明のリボザイ
ムは配列番号１に示す核酸配列又はリボザイム活性をも
つその改変配列を有する。さらに好適には、癌は肺癌で
ある。
【００１０】本発明はまた、核酸を転写するためのプロ
モーターの制御下にある、上記のリボザイムをコードす
る核酸分子を提供する。核酸分子はＤＮＡ又はｃＤＮＡ
である。より具体的には、核酸分子は配列番号２に示す
塩基配列又は転写によって活性リボザイムに導き得るそ
の改変配列を含む。本明細書中で使用する改変とは、核
酸配列中の１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付
加を意味する。本発明はさらに上記の核酸分子を含むベ
クターを提供する。ベクターはプラスミド、ウイルス、
コスミド、レトロトランスポゾンなどを含む。具体的例
示としてpHβ/V189Rz（実施例参照）を挙げることがで
きる。
モーターの制御下にある、上記のリボザイムをコードす
る核酸分子を提供する。核酸分子はＤＮＡ又はｃＤＮＡ
である。より具体的には、核酸分子は配列番号２に示す
塩基配列又は転写によって活性リボザイムに導き得るそ
の改変配列を含む。本明細書中で使用する改変とは、核
酸配列中の１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付
加を意味する。本発明はさらに上記の核酸分子を含むベ
クターを提供する。ベクターはプラスミド、ウイルス、
コスミド、レトロトランスポゾンなどを含む。具体的例
示としてpHβ/V189Rz（実施例参照）を挙げることがで
きる。
【００１１】本発明はさらにまた、上記のベクターを含
む宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核及び真核細胞、
例えば細菌細胞、ヒト細胞を含む哺乳類細胞である。本
発明はさらに、哺乳類の癌細胞内において血管新生を抑
制する能力をもつ上記リボザイム又は該リボザイムを発
現し得る上記ベクターの有効量を、医薬上許容され得る
担体とともに含む、癌治療用医薬組成物を提供する。一
実施態様において、癌は肺癌、特にヒト肺癌である。
む宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核及び真核細胞、
例えば細菌細胞、ヒト細胞を含む哺乳類細胞である。本
発明はさらに、哺乳類の癌細胞内において血管新生を抑
制する能力をもつ上記リボザイム又は該リボザイムを発
現し得る上記ベクターの有効量を、医薬上許容され得る
担体とともに含む、癌治療用医薬組成物を提供する。一
実施態様において、癌は肺癌、特にヒト肺癌である。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のリボザイムは、癌の血管
新生を抑制する能力を有し、特にそのような血管新生の
抑制は癌におけるＶＥＧＦの機能不全もしくは機能抑制
によって仲介される。すなわち、本発明のリボザイムは
ＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦ１８９に特異的である。本発明
のリボザイムはまた、癌において過剰発現されるＶＥＧ
Ｆの転写産物に主として作用することによって癌の成長
及び転移を阻止又は抑制するとともに、正常細胞には有
害な作用を及ぼさないという特徴を有する。
新生を抑制する能力を有し、特にそのような血管新生の
抑制は癌におけるＶＥＧＦの機能不全もしくは機能抑制
によって仲介される。すなわち、本発明のリボザイムは
ＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦ１８９に特異的である。本発明
のリボザイムはまた、癌において過剰発現されるＶＥＧ
Ｆの転写産物に主として作用することによって癌の成長
及び転移を阻止又は抑制するとともに、正常細胞には有
害な作用を及ぼさないという特徴を有する。
【００１３】一般に、リボザイムはＲＮＡの特定の部位
を認識するアンチセンス配列を含むＲＮＡ分子であり、
かつＲＮＡ切断性の酵素活性を有する。リボザイムには
２つのタイプ、すなわちハンマーヘッド型リボザイム及
びヘアピン型リボザイムが知られている。これらのタイ
プはともにアンチセンス活性とエンドリボヌクレオチダ
ーゼ活性を有するため、特定の標的ＲＮＡを識別してＲ
ＮＡの特定部位を特異的に切断することによって標的Ｒ
ＮＡを不活化することができる。ヘアピン型リボザイム
が特異的に認識する配列はNNNG/CN*GUCNNNNNNNN（配列
番号３；ここでN*Gは切断部位を示し、ＮはＧ、Ｕ、Ｃ
又はＡのいずれかである。）を有するすべてのＲＮＡ配
列である。一方、ハンマー型リボザイムはNUX（ここで
ＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡであり、ＸはＣ、Ｕ又はＡのいず
れかである。）を有するすべてのＲＮＡ配列を認識す
る。
を認識するアンチセンス配列を含むＲＮＡ分子であり、
かつＲＮＡ切断性の酵素活性を有する。リボザイムには
２つのタイプ、すなわちハンマーヘッド型リボザイム及
びヘアピン型リボザイムが知られている。これらのタイ
プはともにアンチセンス活性とエンドリボヌクレオチダ
ーゼ活性を有するため、特定の標的ＲＮＡを識別してＲ
ＮＡの特定部位を特異的に切断することによって標的Ｒ
ＮＡを不活化することができる。ヘアピン型リボザイム
が特異的に認識する配列はNNNG/CN*GUCNNNNNNNN（配列
番号３；ここでN*Gは切断部位を示し、ＮはＧ、Ｕ、Ｃ
又はＡのいずれかである。）を有するすべてのＲＮＡ配
列である。一方、ハンマー型リボザイムはNUX（ここで
ＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡであり、ＸはＣ、Ｕ又はＡのいず
れかである。）を有するすべてのＲＮＡ配列を認識す
る。
【００１４】本発明のリボザイムは、上記の癌血管新生
の抑制能力を有する限り、ヘアピン型、ハンマーヘッド
型のいずれでもよい。本発明の実施態様において、ハン
マーヘッド型リボザイムが好ましい。本発明のハンマー
ヘッド型リボザイムはＶＥＧＦｍＲＮＡのNUX（ここで
ＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡであり、ＸはＣ、Ｕ又はＡのいず
れかである。）という切断可能配列の後で基質ＲＮＡ鎖
を部位特異的に切断する。具体的には、ＶＥＧＦのなか
でも、とりわけＶＥＧＦ１８９に対して特異的であり、
ＶＥＧＦ１８９遺伝子エキソン６の転写ｍＲＮＡのＧＵ
Ｃ配列の直後で切断が起こる（図１のｂ参照）。本発明
のリボザイムの一例は以下の配列：5'-GCUCCAGCUGAUGAG
UCCGUGAGGACGAAACUUAUACCGG-3'（配列番号１）を含む。
の抑制能力を有する限り、ヘアピン型、ハンマーヘッド
型のいずれでもよい。本発明の実施態様において、ハン
マーヘッド型リボザイムが好ましい。本発明のハンマー
ヘッド型リボザイムはＶＥＧＦｍＲＮＡのNUX（ここで
ＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡであり、ＸはＣ、Ｕ又はＡのいず
れかである。）という切断可能配列の後で基質ＲＮＡ鎖
を部位特異的に切断する。具体的には、ＶＥＧＦのなか
でも、とりわけＶＥＧＦ１８９に対して特異的であり、
ＶＥＧＦ１８９遺伝子エキソン６の転写ｍＲＮＡのＧＵ
Ｃ配列の直後で切断が起こる（図１のｂ参照）。本発明
のリボザイムの一例は以下の配列：5'-GCUCCAGCUGAUGAG
UCCGUGAGGACGAAACUUAUACCGG-3'（配列番号１）を含む。
【００１５】このリボザイムは図1のｂに示されるよう
な構造を有しており、標的となる基質ＲＮＡ鎖と塩基対
を形成して結合する基質結合領域、切断に必須となる金
属イオン（Ｍｇイオン）が捕捉される活性中心領域、お
よびその他の領域から構成されている。基質結合領域は
基質ＲＮＡ鎖の配列に応じて変化可能であるが、活性中
心領域は比較的保存されており活性保持のために変異は
好ましくない。その他の領域も活性発現にとって重要と
考えられるが、この領域を切除して例えばT. Kuwabara
ら, BIO Clinica (1988), 13(7):23-28に記載されるよ
うなダイマー型ミニザイムとすることによってリボザイ
ム活性を維持又は増強することができる。これらの点
で、本発明のリボザイムは癌血管新生の抑制能力を有す
るという条件で配列番号１に示す配列の改変配列を含ん
でもよい。ここで改変とは、核酸配列中の１個以上のヌ
クレオチドの置換、欠失又は付加を意味する。
な構造を有しており、標的となる基質ＲＮＡ鎖と塩基対
を形成して結合する基質結合領域、切断に必須となる金
属イオン（Ｍｇイオン）が捕捉される活性中心領域、お
よびその他の領域から構成されている。基質結合領域は
基質ＲＮＡ鎖の配列に応じて変化可能であるが、活性中
心領域は比較的保存されており活性保持のために変異は
好ましくない。その他の領域も活性発現にとって重要と
考えられるが、この領域を切除して例えばT. Kuwabara
ら, BIO Clinica (1988), 13(7):23-28に記載されるよ
うなダイマー型ミニザイムとすることによってリボザイ
ム活性を維持又は増強することができる。これらの点
で、本発明のリボザイムは癌血管新生の抑制能力を有す
るという条件で配列番号１に示す配列の改変配列を含ん
でもよい。ここで改変とは、核酸配列中の１個以上のヌ
クレオチドの置換、欠失又は付加を意味する。
【００１６】本発明のリボザイムは周知の方法によって
化学的に合成することができる（例えばPromega社（米
国）のプロトコル）。あるいは、リボザイムはＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター、例えばＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼもしくはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモー
ターに作動可能に連結した該リボザイムをコードするＤ
ＮＡから、その転写を介して合成することができる。
化学的に合成することができる（例えばPromega社（米
国）のプロトコル）。あるいは、リボザイムはＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター、例えばＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼもしくはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモー
ターに作動可能に連結した該リボザイムをコードするＤ
ＮＡから、その転写を介して合成することができる。
【００１７】したがって、本発明はさらに、核酸を転写
するためのプロモーターの制御下にある、上記リボザイ
ムをコードする核酸分子にも関する。核酸分子はＤＮＡ
またはｃＤＮＡである。本発明の実施態様において、核
酸分子は下記の塩基配列：5'-GGCCATATTCAAAGCAGGAGTGC
CTGAGTAGTCGACCTCG-3'（配列番号２）を含む。本発明に
は、癌血管新生抑制活性をもつリボザイムを生成し得る
という条件で配列番号２の配列中、特に上述したような
リボザイムの活性中心領域以外の部位に対応する部分に
改変（１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加）
を含む配列も包含する。
するためのプロモーターの制御下にある、上記リボザイ
ムをコードする核酸分子にも関する。核酸分子はＤＮＡ
またはｃＤＮＡである。本発明の実施態様において、核
酸分子は下記の塩基配列：5'-GGCCATATTCAAAGCAGGAGTGC
CTGAGTAGTCGACCTCG-3'（配列番号２）を含む。本発明に
は、癌血管新生抑制活性をもつリボザイムを生成し得る
という条件で配列番号２の配列中、特に上述したような
リボザイムの活性中心領域以外の部位に対応する部分に
改変（１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加）
を含む配列も包含する。
【００１８】この核酸分子からのリボザイムの産生にお
いては、リボザイムをコードする核酸分子を作動可能に
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに連結して含むベクタ
ーを作製し、宿主細胞を形質転換し、リボザイムを発現
させる。リボザイムの発現はインビトロでもインビボで
も行うことができる。ベクターとしてプラスミド、ウイ
ルス、コスミド、レトロトランスポゾンなどの任意のベ
クターが使用可能であるが、特にヒトを含む哺乳類の癌
遺伝子治療に使用する場合には例えばアデノウイルスベ
クター（例えばアデノ関連１型ベクター又は２型ベクタ
ー；Chatterjeeら, (1992) Science 258:1485-1488）、
レトロウイルスベクター（例えば非病原性のワクシニア
ウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベク
ターなど；Leverら, (1989) J. Vitol. 63:4085-408
7）、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルス
ベクター等をベクターとして用いることができる。遺伝
子治療法については、例えばLarrick, J.W. とBurck,
K.L., (1991) Gene Therapy: Application of Molecula
r Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. U
SA；Kreigler, M. (1990) Gene Transfer and Expressi
on: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company,
USA；斎藤泉ら編，別冊実験医学ザ・プロトコールシリ
ーズ遺伝子導入＆発現解析実験法（1997）羊土社、等に
記載されており、ここに開示のベクター類、遺伝子導入
法、導入判定用レポーター遺伝子類は本発明においても
利用できる。
いては、リボザイムをコードする核酸分子を作動可能に
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに連結して含むベクタ
ーを作製し、宿主細胞を形質転換し、リボザイムを発現
させる。リボザイムの発現はインビトロでもインビボで
も行うことができる。ベクターとしてプラスミド、ウイ
ルス、コスミド、レトロトランスポゾンなどの任意のベ
クターが使用可能であるが、特にヒトを含む哺乳類の癌
遺伝子治療に使用する場合には例えばアデノウイルスベ
クター（例えばアデノ関連１型ベクター又は２型ベクタ
ー；Chatterjeeら, (1992) Science 258:1485-1488）、
レトロウイルスベクター（例えば非病原性のワクシニア
ウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベク
ターなど；Leverら, (1989) J. Vitol. 63:4085-408
7）、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルス
ベクター等をベクターとして用いることができる。遺伝
子治療法については、例えばLarrick, J.W. とBurck,
K.L., (1991) Gene Therapy: Application of Molecula
r Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. U
SA；Kreigler, M. (1990) Gene Transfer and Expressi
on: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company,
USA；斎藤泉ら編，別冊実験医学ザ・プロトコールシリ
ーズ遺伝子導入＆発現解析実験法（1997）羊土社、等に
記載されており、ここに開示のベクター類、遺伝子導入
法、導入判定用レポーター遺伝子類は本発明においても
利用できる。
【００１９】ベクターを用いてリボザイムを製造する場
合には、リボザイムをコードする核酸配列を強力なプロ
モーター、例えばlacプロモーター、SV40後期プロモー
ター、SV40前期プロモーター、ラムダプロモーター、等
の制御下に置くことができる。一方、癌遺伝子治療用の
ベクターでは、例えばレトロウイルスLTRもしくはヒトt
RNAvalプロモーター、アデノウイルスVA1プロモータ
ー、挿入pol IIIプロモーター、β−アクチンプロモー
ター、T7プロモーター、p7.5プロモーター、バキュロウ
イルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターの
制御下にリボザイムをコードする核酸配列が挿入され得
る。ベクターは慣用の選択マーカー遺伝子、レポーター
遺伝子（例えば薬剤耐性、栄養要求性、酵素類など）を
含むことができる。遺伝子導入法で公知のレポーター遺
伝子には、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
が含まれる。
合には、リボザイムをコードする核酸配列を強力なプロ
モーター、例えばlacプロモーター、SV40後期プロモー
ター、SV40前期プロモーター、ラムダプロモーター、等
の制御下に置くことができる。一方、癌遺伝子治療用の
ベクターでは、例えばレトロウイルスLTRもしくはヒトt
RNAvalプロモーター、アデノウイルスVA1プロモータ
ー、挿入pol IIIプロモーター、β−アクチンプロモー
ター、T7プロモーター、p7.5プロモーター、バキュロウ
イルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターの
制御下にリボザイムをコードする核酸配列が挿入され得
る。ベクターは慣用の選択マーカー遺伝子、レポーター
遺伝子（例えば薬剤耐性、栄養要求性、酵素類など）を
含むことができる。遺伝子導入法で公知のレポーター遺
伝子には、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
が含まれる。
【００２０】したがって、本発明はまた、核酸を転写す
るためのプロモーターとともにリボザイムをコードする
核酸分子を含むベクターも包含する。ここでリボザイム
は癌の血管新生を抑制する能力をもつものである。ワク
シニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター等において遺伝子導入用カセッ
トベクターが知られており、本発明で使用できる。本発
明の実施態様において、使用できるベクターはpHβ/V18
9Rz（後述の実施例参照）である。
るためのプロモーターとともにリボザイムをコードする
核酸分子を含むベクターも包含する。ここでリボザイム
は癌の血管新生を抑制する能力をもつものである。ワク
シニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター等において遺伝子導入用カセッ
トベクターが知られており、本発明で使用できる。本発
明の実施態様において、使用できるベクターはpHβ/V18
9Rz（後述の実施例参照）である。
【００２１】上記のように作製されるベクターはつい
で、宿主細胞に導入してリボザイムを生成することがで
きる。形質転換またはトランスフェクション用の宿主細
胞として原核細胞又は真核細胞、例えば細菌細胞、ヒ
ト、マウス、ラット等の哺乳類細胞を例示できる。例え
ば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウ
ム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション
法、リポフェクション法、ウイルスベクター法、マイク
ロインジェクション、DNA直接注射法などの方法によっ
てベクターを細胞に導入することができる。ベクターの
作製、形質転換およびトランスフェクションについて
は、Sambrookら, (1989) Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Pressに記載の手法を
利用することができる。
で、宿主細胞に導入してリボザイムを生成することがで
きる。形質転換またはトランスフェクション用の宿主細
胞として原核細胞又は真核細胞、例えば細菌細胞、ヒ
ト、マウス、ラット等の哺乳類細胞を例示できる。例え
ば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウ
ム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション
法、リポフェクション法、ウイルスベクター法、マイク
ロインジェクション、DNA直接注射法などの方法によっ
てベクターを細胞に導入することができる。ベクターの
作製、形質転換およびトランスフェクションについて
は、Sambrookら, (1989) Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Pressに記載の手法を
利用することができる。
【００２２】遺伝子治療では、本発明のリボザイム又は
ベクターを癌の治療に使用することができる。リボザイ
ムは例えばリポソーム内に封入して送達する所謂リポソ
ームデリバリーシステム、マイクロインジェクション、
DNA直接注射法、遺伝子銃などを利用して細胞内に導入
することが可能である。また、本発明のベクターはリボ
ザイムをコードする核酸分子が細胞内で安定に発現する
のに好ましい条件下で形質導入される。例えばウイルス
ベクター法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェク
ション、リポフェクション、DNA直接注射法などの方法
を使用できる。
ベクターを癌の治療に使用することができる。リボザイ
ムは例えばリポソーム内に封入して送達する所謂リポソ
ームデリバリーシステム、マイクロインジェクション、
DNA直接注射法、遺伝子銃などを利用して細胞内に導入
することが可能である。また、本発明のベクターはリボ
ザイムをコードする核酸分子が細胞内で安定に発現する
のに好ましい条件下で形質導入される。例えばウイルス
ベクター法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェク
ション、リポフェクション、DNA直接注射法などの方法
を使用できる。
【００２３】本発明により、標的癌細胞中でリボザイム
を転写産物として生成させることによって癌細胞中のVE
GF好ましくはVEGF189 ｍRNAの切断を介して癌の血管新
生を抑制し、その結果癌の進行や転移を阻止又は抑制す
ることができる。適用可能な癌としては、その細胞中で
VEGFとりわけVEGF189を過剰発現する癌、例えば肺癌、
食道癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、神経膠腫などに本発明
を適用できる。本発明の実施態様において、癌は肺癌で
ある。
を転写産物として生成させることによって癌細胞中のVE
GF好ましくはVEGF189 ｍRNAの切断を介して癌の血管新
生を抑制し、その結果癌の進行や転移を阻止又は抑制す
ることができる。適用可能な癌としては、その細胞中で
VEGFとりわけVEGF189を過剰発現する癌、例えば肺癌、
食道癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、神経膠腫などに本発明
を適用できる。本発明の実施態様において、癌は肺癌で
ある。
【００２４】したがって、本発明は哺乳類の癌細胞内に
おいて血管新生を抑制する能力をもつリボザイム又は該
リボザイムを発現し得るベクターの有効量を、医薬上許
容され得る担体とともに含む、癌の治療（特に遺伝子治
療）に使用するための医薬組成物を提供する。医薬上許
容され得る担体は、標準的医薬担体のいずれか、例えば
生理食塩水、緩衝液、滅菌水、乳化剤、水和剤などを含
む。組成物にはさらに、安定剤、保存剤、リボザイムを
活性化するために必要なＭｇ2+などの金属イオン、など
を含ませることができる。又、本発明の組成物には抗癌
剤を含有させて標的癌細胞を攻撃することも可能であ
る。
おいて血管新生を抑制する能力をもつリボザイム又は該
リボザイムを発現し得るベクターの有効量を、医薬上許
容され得る担体とともに含む、癌の治療（特に遺伝子治
療）に使用するための医薬組成物を提供する。医薬上許
容され得る担体は、標準的医薬担体のいずれか、例えば
生理食塩水、緩衝液、滅菌水、乳化剤、水和剤などを含
む。組成物にはさらに、安定剤、保存剤、リボザイムを
活性化するために必要なＭｇ2+などの金属イオン、など
を含ませることができる。又、本発明の組成物には抗癌
剤を含有させて標的癌細胞を攻撃することも可能であ
る。
【００２５】本発明は、細胞中でVEGFとりわけVEGF189
を過剰発現する種々のタイプの癌、例えば肺癌、食道
癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、神経膠腫など、特にヒト肺
癌を含む哺乳類の肺癌の治療に適用できる。医薬組成物
内における本発明のリボザイム又はベクターの量は癌の
血管新生を抑制し癌の進行及び/又は転移を阻止又は抑
制し得る治療有効量である。本発明の医薬組成物を癌の
治療に使用するには、例えばリポソームデリバリーシス
テムなどの手法で実施することができる。
を過剰発現する種々のタイプの癌、例えば肺癌、食道
癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、神経膠腫など、特にヒト肺
癌を含む哺乳類の肺癌の治療に適用できる。医薬組成物
内における本発明のリボザイム又はベクターの量は癌の
血管新生を抑制し癌の進行及び/又は転移を阻止又は抑
制し得る治療有効量である。本発明の医薬組成物を癌の
治療に使用するには、例えばリポソームデリバリーシス
テムなどの手法で実施することができる。
【００２６】
【実施例】本発明をさらに具体的に説明するが、本発明
の範囲は以下の実施例によって制限されないものとす
る。 ＜実施例＞リボザイムの構築とＶＥＧＦ１８９のインビトロ切断 ＶＥＧＦ１８９ mRNAをそのエキソン６で特異的に切断
するハンマーヘッド型リボザイムを設計した（図１の
ｂ）。ＲＮＡ基質として使用するＤＮＡ鋳型とハンマー
ヘッド型リボザイムを、リボザイムＶ１８９Ｒｚについ
てのプライマー： (Rz1) 5'-TAATACGACTCACTATAGGCTCCAGCTGATGAGTCCGT-3'
（配列番号４）及び(Rz2) 5'-CCGGTATAAGTTTCGTCCTCACG
GACTCAT-3'（配列番号５）; ＶＥＧＦ１８９ＲＮＡ基質についてのプライマー： (S1) 5'-TAATACGACTCACTATAGAAGCGCAAGAAATC-3'（配列
番号６）及び（S2）5'-ACGCTCCAGGACTTATACCGGGATTTCTT
GCG-3'（配列番号７）をそれぞれ用いて３０サイクルの
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（変性９４℃、９０秒；
アニーリング６０℃、９０秒；伸長７２℃、９０秒）を
実施して合成した。Rz１及びRz２プライマー配列は、ハ
ンマーヘッド型リボザイム及びVEGF189ｍRNAに相補的な
配列に由来した（図１のｃ）。また、S1及びS2プライマ
ーは、VEGF189遺伝子のエキソン６とエキソン７に由来
した（図１のｄ）。
の範囲は以下の実施例によって制限されないものとす
る。 ＜実施例＞リボザイムの構築とＶＥＧＦ１８９のインビトロ切断 ＶＥＧＦ１８９ mRNAをそのエキソン６で特異的に切断
するハンマーヘッド型リボザイムを設計した（図１の
ｂ）。ＲＮＡ基質として使用するＤＮＡ鋳型とハンマー
ヘッド型リボザイムを、リボザイムＶ１８９Ｒｚについ
てのプライマー： (Rz1) 5'-TAATACGACTCACTATAGGCTCCAGCTGATGAGTCCGT-3'
（配列番号４）及び(Rz2) 5'-CCGGTATAAGTTTCGTCCTCACG
GACTCAT-3'（配列番号５）; ＶＥＧＦ１８９ＲＮＡ基質についてのプライマー： (S1) 5'-TAATACGACTCACTATAGAAGCGCAAGAAATC-3'（配列
番号６）及び（S2）5'-ACGCTCCAGGACTTATACCGGGATTTCTT
GCG-3'（配列番号７）をそれぞれ用いて３０サイクルの
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（変性９４℃、９０秒；
アニーリング６０℃、９０秒；伸長７２℃、９０秒）を
実施して合成した。Rz１及びRz２プライマー配列は、ハ
ンマーヘッド型リボザイム及びVEGF189ｍRNAに相補的な
配列に由来した（図１のｃ）。また、S1及びS2プライマ
ーは、VEGF189遺伝子のエキソン６とエキソン７に由来
した（図１のｄ）。
【００２７】不能化されたハンマーヘッド型リボザイム
（dis-V189Rz）もまた以下のプライマー： (Rz3) 5'-TAATACGACTCACTATAGGCTCCAGCTAATGAGTCCGT-3'
（配列番号８）を用いてＰＣＲ合成した。ｄis-V189Rz
は、V189Rz配列と比べて触媒コア中に単一の塩基変化
（G→A、図１のｂ）を含んでいる。また、Ｒｚ1、Ｒｚ
３及びＳ１はそれらの５’末端にＴ７プロモーター配列
を含んでいた（図１のｃ及びｄ）。
（dis-V189Rz）もまた以下のプライマー： (Rz3) 5'-TAATACGACTCACTATAGGCTCCAGCTAATGAGTCCGT-3'
（配列番号８）を用いてＰＣＲ合成した。ｄis-V189Rz
は、V189Rz配列と比べて触媒コア中に単一の塩基変化
（G→A、図１のｂ）を含んでいる。また、Ｒｚ1、Ｒｚ
３及びＳ１はそれらの５’末端にＴ７プロモーター配列
を含んでいた（図１のｃ及びｄ）。
【００２８】ＰＣＲ産物を３％複合アガロースゲル（２
％NuSieve、１％Seakem）（FMC Corp.、Rockland、ME）
を通して分画し、電気泳動し、フェノール/クロロホル
ム処理で精製した。溶出した生成物をＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ用の鋳型として用いた。切断実験のために、リボ
ザイムV189Rz又はdis−V189Rz及び３５塩基のVEGF189RN
A基質をT7 RNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、C
A）を用いるインビトロ転写によって合成し、α−
［32P］−UTP（110 TBq／mmol、Amersham Life Science
Inc．、 Arlington Height、IL）を用いてラベルし
た。その後、RNA基質とリボザイムを１２％ポリアクリ
ルアミドゲルを通して分画し、生成物を１％SDS、0.5M
CH3COONH4、1mM EDTAで溶出した。
％NuSieve、１％Seakem）（FMC Corp.、Rockland、ME）
を通して分画し、電気泳動し、フェノール/クロロホル
ム処理で精製した。溶出した生成物をＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ用の鋳型として用いた。切断実験のために、リボ
ザイムV189Rz又はdis−V189Rz及び３５塩基のVEGF189RN
A基質をT7 RNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、C
A）を用いるインビトロ転写によって合成し、α−
［32P］−UTP（110 TBq／mmol、Amersham Life Science
Inc．、 Arlington Height、IL）を用いてラベルし
た。その後、RNA基質とリボザイムを１２％ポリアクリ
ルアミドゲルを通して分画し、生成物を１％SDS、0.5M
CH3COONH4、1mM EDTAで溶出した。
【００２９】切断反応を、２pmolのV189Rz又はdis−V18
9Rz RNAと２pmolのVEGF189 RNA基質を混合し、９５℃で
２分間加熱し、次いで氷上で素早く冷却することによっ
て行った。個々の反応混合液を、異なる条件（Mg2+濃
度：0mM〜20mM；３７℃；16時間）下でインキュベート
した。切断生成物を変性９％TBEポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、オートラジオグラフィー（X−OMAT AR，
Eastman Kodak Company，Rochester，NY）で検出した。
9Rz RNAと２pmolのVEGF189 RNA基質を混合し、９５℃で
２分間加熱し、次いで氷上で素早く冷却することによっ
て行った。個々の反応混合液を、異なる条件（Mg2+濃
度：0mM〜20mM；３７℃；16時間）下でインキュベート
した。切断生成物を変性９％TBEポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、オートラジオグラフィー（X−OMAT AR，
Eastman Kodak Company，Rochester，NY）で検出した。
【００３０】抗VEGF189リボザイムを含む肺癌トランス
フェクタント V189Rz又はdis−V189Rzの非小細胞肺癌細胞へのトラン
スフェクションのために、PCRによって新規のリボザイ
ムDNA及び不能化リボザイムDNAを構築し、発現ベクター
ｐＨβApr−1（P. Gunning et al., Proc. Nat'l. Aca
d. Sci. USA, 1987, 84:4831-4835; S.Y. Ng et al., M
ol. Cell. Biol., 1985, 5:2720-2732)中に導入した。
フェクタント V189Rz又はdis−V189Rzの非小細胞肺癌細胞へのトラン
スフェクションのために、PCRによって新規のリボザイ
ムDNA及び不能化リボザイムDNAを構築し、発現ベクター
ｐＨβApr−1（P. Gunning et al., Proc. Nat'l. Aca
d. Sci. USA, 1987, 84:4831-4835; S.Y. Ng et al., M
ol. Cell. Biol., 1985, 5:2720-2732)中に導入した。
【００３１】即ち、PCRは、以下のプライマー対、即ちV
189Rzについて、(Rz4) 5'-GGGTCGACGCTCCAGCTGATGAGTCC
GT-3'（配列番号９）及び(Rz5) 5'-CCGGATCCCCGGTATAAG
TTTCGTCCTCACGGACTCAT-3'（配列番号１０）；dis−V189
Rzについて、プライマーRz4及び（Rz6） 5'-GGGTCGACGC
TCCAGCTAATGAGTCCGT-3'（配列番号１１）を用いて行っ
た。プライマーRz3及びRz5は各々SalI制限部位を含み、
プライマーRz4はその５’末端にBamHI部位を含んでい
た。SalI及びBamHIで制限エンドヌクレアーゼ消化後、P
CR産物を、β−アクチンのプロモーター領域とネオマイ
シン耐性遺伝子とを含む真核生物発現プラスミドｐＨβ
Apr−1(H. Yamazaki et al.,J. Natl. Cancer Inst. 19
98, 90:581-587)にサブクローニングした。
189Rzについて、(Rz4) 5'-GGGTCGACGCTCCAGCTGATGAGTCC
GT-3'（配列番号９）及び(Rz5) 5'-CCGGATCCCCGGTATAAG
TTTCGTCCTCACGGACTCAT-3'（配列番号１０）；dis−V189
Rzについて、プライマーRz4及び（Rz6） 5'-GGGTCGACGC
TCCAGCTAATGAGTCCGT-3'（配列番号１１）を用いて行っ
た。プライマーRz3及びRz5は各々SalI制限部位を含み、
プライマーRz4はその５’末端にBamHI部位を含んでい
た。SalI及びBamHIで制限エンドヌクレアーゼ消化後、P
CR産物を、β−アクチンのプロモーター領域とネオマイ
シン耐性遺伝子とを含む真核生物発現プラスミドｐＨβ
Apr−1(H. Yamazaki et al.,J. Natl. Cancer Inst. 19
98, 90:581-587)にサブクローニングした。
【００３２】74歳の男性患者から樹立したヒト肺腺癌細
胞系OZ-6細胞を、ペニシリン（１００μg／ml）とスト
レプトマイシン（１００μg／ml）を補充した１０％牛
胎仔血清（IBL，Fujioka，Japan）含有のダルベッコ改
良イーグル必須培地（DMEM）中に維持した。リポフェク
ション法（Lipofectin, Gibco BRL, Rockville, MD）に
よってV189Rz又はdis-V189Rzでのトランスフェクション
を行った。プラスミド含有細胞を、６００μg／mlのG41
8（Gibco BRL）を補充したDMEM中で４〜６週間にわたっ
て選択し、V189Rz(OZ-6/VR)トランスフェクタント又はd
is-V189Rz(OZ-6/DVR)トランスフェクタントを単離し
た。
胞系OZ-6細胞を、ペニシリン（１００μg／ml）とスト
レプトマイシン（１００μg／ml）を補充した１０％牛
胎仔血清（IBL，Fujioka，Japan）含有のダルベッコ改
良イーグル必須培地（DMEM）中に維持した。リポフェク
ション法（Lipofectin, Gibco BRL, Rockville, MD）に
よってV189Rz又はdis-V189Rzでのトランスフェクション
を行った。プラスミド含有細胞を、６００μg／mlのG41
8（Gibco BRL）を補充したDMEM中で４〜６週間にわたっ
て選択し、V189Rz(OZ-6/VR)トランスフェクタント又はd
is-V189Rz(OZ-6/DVR)トランスフェクタントを単離し
た。
【００３３】トランスフェクタント中でのVEGF189 ｍRN
Aの発現 OZ−６、OZ-6/VR及びOZ-6/DVRからグアニジンイソシア
ネートとフェノール／クロロホルムを用いる一段階法
（P. Chomczynski et al., Anal. Biochem. 1987, 162:
156-159）によって全細胞RNAを抽出した。トランスフェ
クトされた細胞がpHβ/V189RzまたはpHβ/dis-V189Rzを
産生していることが、pHβApr-1由来プライマー： (pHβ-S1) 5'-CTAGCGGCCTAAGGACTCGG-3'（配列番号１
２）及び(pHβ-S2) 5'-TCACTGCATTCTAGTTGTGG-3'（配列
番号１３）を用いるRT-PCR、並びに断片を含むオリゴヌ
クレオチド： (pHβ-pb) 5'-GCGAGAATAGCCGGGCGCGCTG-3'（配列番号１
４）とのハイブリダイゼーションによって確認された。
VEGF189 ｍRNAのレベルは従来記載されるとおりRT-PCR
によって決定した（Y. Oshika et al., Int. J. Onco
l., 1998, 12:541-544; T. Tokunaga et al., Br. J. C
ancer, 1998, 77:998-1002）。
Aの発現 OZ−６、OZ-6/VR及びOZ-6/DVRからグアニジンイソシア
ネートとフェノール／クロロホルムを用いる一段階法
（P. Chomczynski et al., Anal. Biochem. 1987, 162:
156-159）によって全細胞RNAを抽出した。トランスフェ
クトされた細胞がpHβ/V189RzまたはpHβ/dis-V189Rzを
産生していることが、pHβApr-1由来プライマー： (pHβ-S1) 5'-CTAGCGGCCTAAGGACTCGG-3'（配列番号１
２）及び(pHβ-S2) 5'-TCACTGCATTCTAGTTGTGG-3'（配列
番号１３）を用いるRT-PCR、並びに断片を含むオリゴヌ
クレオチド： (pHβ-pb) 5'-GCGAGAATAGCCGGGCGCGCTG-3'（配列番号１
４）とのハイブリダイゼーションによって確認された。
VEGF189 ｍRNAのレベルは従来記載されるとおりRT-PCR
によって決定した（Y. Oshika et al., Int. J. Onco
l., 1998, 12:541-544; T. Tokunaga et al., Br. J. C
ancer, 1998, 77:998-1002）。
【００３４】この実験で使用したプライマー類はエキソ
ン４（センス）とエキソン７（アンチセンス）に結合し
て、VEGF189については２０４ｂｐのｃDNA断片を生成
し、VEGF165については１３２ｂｐの断片を生成した。
この方法では、VEGF189のPCRはVEGF165のPCRと競合した
ため、VEGF189とVEGF165の比例的濃度を種々のサンプル
間で定量的に比較することができた。また、全細胞RNA
（１５μｇ、GeneScreen Plus, NEN Life Science Prod
ucts,Boston, MA）を用いるノーザンブロッティングに
よって、VEGF遺伝子発現を評価した。
ン４（センス）とエキソン７（アンチセンス）に結合し
て、VEGF189については２０４ｂｐのｃDNA断片を生成
し、VEGF165については１３２ｂｐの断片を生成した。
この方法では、VEGF189のPCRはVEGF165のPCRと競合した
ため、VEGF189とVEGF165の比例的濃度を種々のサンプル
間で定量的に比較することができた。また、全細胞RNA
（１５μｇ、GeneScreen Plus, NEN Life Science Prod
ucts,Boston, MA）を用いるノーザンブロッティングに
よって、VEGF遺伝子発現を評価した。
【００３５】ヌードマウスでのリボザイム−トランスフ
ェクタントの成長 親細胞系OZ-6及びトランスフェクタントOZ-6/VR、OZ-6/
DVRをヌードマウス（雌、８週齢、BALB/cA-nu、Clea Ja
pan Inc., Japan）にマウス１匹あたり１×１０5細胞ま
たは５×１０5細胞を皮下接種した。細胞の成長速度
を、投与後の腫瘍損傷のサイズを測定することによって
評価した。最大腫瘍サイズが約３ｃｍに達したとき、全
マウスをペントバルビタールによる深麻酔下で犠牲に
し、それらの腫瘍を切除した。実験動物を含む全ての実
験は実験動物中央研究所（神奈川）の飼育／使用指針に
従って行なった。
ェクタントの成長 親細胞系OZ-6及びトランスフェクタントOZ-6/VR、OZ-6/
DVRをヌードマウス（雌、８週齢、BALB/cA-nu、Clea Ja
pan Inc., Japan）にマウス１匹あたり１×１０5細胞ま
たは５×１０5細胞を皮下接種した。細胞の成長速度
を、投与後の腫瘍損傷のサイズを測定することによって
評価した。最大腫瘍サイズが約３ｃｍに達したとき、全
マウスをペントバルビタールによる深麻酔下で犠牲に
し、それらの腫瘍を切除した。実験動物を含む全ての実
験は実験動物中央研究所（神奈川）の飼育／使用指針に
従って行なった。
【００３６】異種移植片の血管分布 切除された腫瘍を２０℃、２４時間１０％ホルマリンで
固定した。厚さ３μｍのパラフィン包埋切片を脱パラフ
ィン化し、抗原−回復を0.01Ｍクエン酸緩衝液中、１２
１℃、５分間オートクレーブにかけることにより行っ
た。メタノール中0.3％Ｈ2Ｏ2を用いて２０℃、30分間
内因性ペルオキシダーゼをブロックした後、切片をマウ
スＣＤ３４に対するラットモノクローナル抗体（1:20,
Hycult Biotechnology, Uden, Netherlands）と一緒に
２０℃、60分間インキュベートした。その後、ビオチン
結合抗ラットＩｇＧ（1:200, Amersham Life Science,
Buckinghamshire, UK）を添加し、２０℃、６０分間反
応した。生成物を視覚化するために、チラミドシグナル
増幅を行った。即ち、切片を第一西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（1:800, Dak
o, Carpinteria, CA）、ビオチン−チラミド（Dako）及
び第二HRP結合ストレプトアビジン（Dako）と一緒に２
０℃、各ステップ15分間連続的にインキュベートした。
生成物は3,3'-ジアミノベンジジン発色団（1:50, Dak
o）で視覚化した。核はヘマトキシリンで逆染色した。
固定した。厚さ３μｍのパラフィン包埋切片を脱パラフ
ィン化し、抗原−回復を0.01Ｍクエン酸緩衝液中、１２
１℃、５分間オートクレーブにかけることにより行っ
た。メタノール中0.3％Ｈ2Ｏ2を用いて２０℃、30分間
内因性ペルオキシダーゼをブロックした後、切片をマウ
スＣＤ３４に対するラットモノクローナル抗体（1:20,
Hycult Biotechnology, Uden, Netherlands）と一緒に
２０℃、60分間インキュベートした。その後、ビオチン
結合抗ラットＩｇＧ（1:200, Amersham Life Science,
Buckinghamshire, UK）を添加し、２０℃、６０分間反
応した。生成物を視覚化するために、チラミドシグナル
増幅を行った。即ち、切片を第一西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（1:800, Dak
o, Carpinteria, CA）、ビオチン−チラミド（Dako）及
び第二HRP結合ストレプトアビジン（Dako）と一緒に２
０℃、各ステップ15分間連続的にインキュベートした。
生成物は3,3'-ジアミノベンジジン発色団（1:50, Dak
o）で視覚化した。核はヘマトキシリンで逆染色した。
【００３７】統計分析 ヌードマウスに形成された腫瘍のサイズの統計的比較は
MacintoshのSPSSソフトウエア、バージョン6.1（SPSS I
nc., Chicago， IL）を使用するScheffeの多重比較試験
における分散分析によって行った。
MacintoshのSPSSソフトウエア、バージョン6.1（SPSS I
nc., Chicago， IL）を使用するScheffeの多重比較試験
における分散分析によって行った。
【００３８】結果 （１）インビトロでのリボザイムによるVEGF189イソフ
ォームの切断 VEGF189、VEGF145及びVEGF206はエキソン６を含んでい
たが、VEGF121及びVEGF165はエキソン６を含んでいなか
った（図１のａ）。初代非小細胞肺癌標本（Y.Oshika e
t al., Int. J. Oncol., 1998, 12:541-544）でも、ま
たヒト肺腺癌細胞系OZ-6でもVEGF145又はVEGF206の発現
は検出できなかった。そのため、VEGF189イソフォーム
（V189Rz、図１のｂ）のエキソン６のGUCにターゲッテ
ィングしてVEGF189 ｍRNAを特異的に切断するハンマー
ヘッド型リボザイムをPCRによって構築した。また、触
媒コアに一塩基置換（G→A、図１のｂ）をもつ不能化リ
ボザイム（dis-V189Rz）をPCRによって作製した（図１
のｄ）。
ォームの切断 VEGF189、VEGF145及びVEGF206はエキソン６を含んでい
たが、VEGF121及びVEGF165はエキソン６を含んでいなか
った（図１のａ）。初代非小細胞肺癌標本（Y.Oshika e
t al., Int. J. Oncol., 1998, 12:541-544）でも、ま
たヒト肺腺癌細胞系OZ-6でもVEGF145又はVEGF206の発現
は検出できなかった。そのため、VEGF189イソフォーム
（V189Rz、図１のｂ）のエキソン６のGUCにターゲッテ
ィングしてVEGF189 ｍRNAを特異的に切断するハンマー
ヘッド型リボザイムをPCRによって構築した。また、触
媒コアに一塩基置換（G→A、図１のｂ）をもつ不能化リ
ボザイム（dis-V189Rz）をPCRによって作製した（図１
のｄ）。
【００３９】10mM Mg2+と一緒に３７℃、18時間VEGF189
合成基質及びV189Rzをインキュベートしたときには、３
５塩基の該基質が切断されて２６塩基の５’末端断片と
９塩基の３’末端断片を生成した（図２のａ）。V189Rz
の切断活性はMg2+濃度依存的に増加した（図２のｂ）。
一方、dis-V189Rzは、高濃度のMg2+の存在下であって
も、VEGF189合成基質を切断しなかった（図２のｃ）。
切断生成物は反応の開始30分以内で視覚で検出され、18
時間まで漸増した。V189Rzは10mM Mg2+の存在下、３７
℃、18時間で基質：リボザイムの比（モル比）２：１、
４：１および１０：１で効果的に基質を切断した。上記
の結果は、リボザイムV189Rzが酵素と同様にVEGF189基
質の切断を触媒することを示している。
合成基質及びV189Rzをインキュベートしたときには、３
５塩基の該基質が切断されて２６塩基の５’末端断片と
９塩基の３’末端断片を生成した（図２のａ）。V189Rz
の切断活性はMg2+濃度依存的に増加した（図２のｂ）。
一方、dis-V189Rzは、高濃度のMg2+の存在下であって
も、VEGF189合成基質を切断しなかった（図２のｃ）。
切断生成物は反応の開始30分以内で視覚で検出され、18
時間まで漸増した。V189Rzは10mM Mg2+の存在下、３７
℃、18時間で基質：リボザイムの比（モル比）２：１、
４：１および１０：１で効果的に基質を切断した。上記
の結果は、リボザイムV189Rzが酵素と同様にVEGF189基
質の切断を触媒することを示している。
【００４０】（２）肺腺癌細胞系での抗VEGF189リボザ
イムV189Rzのインビボ作用 構築した発現プラスミドpHβ/V189Rz又はpHβ/dis-V189
RzをOZ-6に導入し、６００μｇ/mlのG418による選択後
に安定なトランスフェクタントOZ-6/VR、OZ-6/DVRを樹
立した。RT-PCRによって、それらのトランスフェクタン
ト中にpHβ/V189Rz又はpHβ/dis-V189Rzの発現を確認し
た（図３のａ）。VEGF165 ｍRNAに対するVEGF189の発現
レベルは、親細胞系（48.3％）と比較してOZ-6/VR（9.6
％）で減少したが、OZ-6/DVR（51.5％）では減少しなか
った（図３のｂ）。ノーザンブロッティング分析によっ
て評価されるように、総VEGF遺伝子発現レベルはトラン
スフェクタントOZ-6/VR及びOZ-6/DVRでともに有意に減
少しなかった。細胞培養では、これらのトランスフェク
タントは親細胞系OZ-6と比較して類似の形態学的特徴を
示した（図３のｃ）。上記トランスフェクタントの成長
速度は親細胞系のものと有意な違いはなかった。
イムV189Rzのインビボ作用 構築した発現プラスミドpHβ/V189Rz又はpHβ/dis-V189
RzをOZ-6に導入し、６００μｇ/mlのG418による選択後
に安定なトランスフェクタントOZ-6/VR、OZ-6/DVRを樹
立した。RT-PCRによって、それらのトランスフェクタン
ト中にpHβ/V189Rz又はpHβ/dis-V189Rzの発現を確認し
た（図３のａ）。VEGF165 ｍRNAに対するVEGF189の発現
レベルは、親細胞系（48.3％）と比較してOZ-6/VR（9.6
％）で減少したが、OZ-6/DVR（51.5％）では減少しなか
った（図３のｂ）。ノーザンブロッティング分析によっ
て評価されるように、総VEGF遺伝子発現レベルはトラン
スフェクタントOZ-6/VR及びOZ-6/DVRでともに有意に減
少しなかった。細胞培養では、これらのトランスフェク
タントは親細胞系OZ-6と比較して類似の形態学的特徴を
示した（図３のｃ）。上記トランスフェクタントの成長
速度は親細胞系のものと有意な違いはなかった。
【００４１】（３）ヌードマウスにおける抗VEGF189リ
ボザイムV189Rzによるヒト肺癌 成長の抑制 腫瘍形成に対するV189Rzの作用を決定するために、肺癌
トランスフェクタント及び親細胞をヌードマウスにマウ
スあたり１×１０5細胞又は５×１０5細胞を皮下接種し
た。１×１０5個のOZ-6/VR細胞の接種後、16週間の観察
期間内にマウスに腫瘍は形成されなかったのに対して、
同数の親細胞又はOZ-6/DVRを接種した全てのマウスには
腫瘍が形成された（表１）。
ボザイムV189Rzによるヒト肺癌 成長の抑制 腫瘍形成に対するV189Rzの作用を決定するために、肺癌
トランスフェクタント及び親細胞をヌードマウスにマウ
スあたり１×１０5細胞又は５×１０5細胞を皮下接種し
た。１×１０5個のOZ-6/VR細胞の接種後、16週間の観察
期間内にマウスに腫瘍は形成されなかったのに対して、
同数の親細胞又はOZ-6/DVRを接種した全てのマウスには
腫瘍が形成された（表１）。
【００４２】
【表１】
【００４３】８週間の期間腫瘍形成を観察したが、５×
１０5OZ-6/VR細胞を接種した４匹のマウスのうち２匹に
小さな白色の腫瘍が認められた（図４のａ）。OZ-6/VR
腫瘍（64.2mm3）はOZ-6腫瘍（1413.5mm3）よりも有意に
小さかった（p＜0.05、Scheffeの多重比較試験；図４の
ａ）。抗マウスCD34を用いる免疫組織化学的に評価した
間質の血管分布は、OZ-6/VR腫瘍ではOZ-6腫瘍と比べて
顕著に減少した（図４のｂ）。
１０5OZ-6/VR細胞を接種した４匹のマウスのうち２匹に
小さな白色の腫瘍が認められた（図４のａ）。OZ-6/VR
腫瘍（64.2mm3）はOZ-6腫瘍（1413.5mm3）よりも有意に
小さかった（p＜0.05、Scheffeの多重比較試験；図４の
ａ）。抗マウスCD34を用いる免疫組織化学的に評価した
間質の血管分布は、OZ-6/VR腫瘍ではOZ-6腫瘍と比べて
顕著に減少した（図４のｂ）。
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The Central Institute for Experimental Animals <120> Ribozymes for inhibiting vascularization in cancers and compositions for gene therapy of cancers <130> P98-0651 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This shows a sequence of anti-VEGF189 ribozyme. <400> 1 gcuccagcug augaguccgu gaggacgaaa cuuauaccgg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggccatattc aaagcaggag tgcctgagta gtcgacctcg 40 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: This a sequence recognized by hairpin ribozymes. <400> 3 nnngcngucn nnnnnnn 17 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of ribozyme V189Rz. <400> 4 taatacgact cactataggc tccagctgat gagtccgt 38 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of ribozyme V189Rz. <400> 5 ccggtataag tttcgtcctc acggactcat 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of VEGF189 RNA substrate. <400> 6 taatacgact cactatagaa gcgcaagaaa tc 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of VEGF189 RNA substrate. <400> 7 acgctccagg acttataccg ggatttcttg cg 32 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:This is a primer for PCR of dis-V189Rz. <400> 8 taatacgact cactataggc tccagctaat gagtccgt 38 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of V189Rz. <400> 9 gggtcgacgc tccagctgat gagtccgt 28 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of V189Rz. <400> 10 ccggatcccc ggtataagtt tcgtcctcac ggactcat 38 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR of dis-V189Rz. <400> 11 gggtcgacgc tccagctaat gagtccgt 28 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer from pHβApr-1. <400> 12 ctagcggcct aaggactcgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: This is a primer for PCR from pHβApr-1. <400> 13 tcactgcatt ctagttgtgg 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:This is an oligonucleotide for hybridization with pHβ/V189Rz or pHβ/dis-V189Rz. <400> 14 gcgagaatag ccgggcgcgc tg 22
【図面の簡単な説明】
【図１】VEGF ｍRNA イソフォーム及び抗VEGF189リボザ
イム（V189/Rz）の構造を示す。a)VEGF206、VEGF189及
びVEGF145はエキソン６を含んでいた。VEGF206及びVEGF
145は非小細胞肺癌細胞系OZ-6では検出されなかった。
ｂ）V189/Rzはエキソン６のGUCトリプレットのところで
切断するように設計された。不能化リボザイムdis-V189
/Rzはハンマーヘッド構造の触媒コアに単一のG→A変化
を含んだ。ｃ）リボザイム用の相補的DNA鋳型を合成す
るために用いたPCRプライマー。ｄ）インビトロ切断反
応の基質RNA用の相補的DNA鋳型を合成するために用いた
PCRプライマー。e）発現プラスミドpHβ/V189Rz及びpH
β/dis-V189Rzの概略図。
イム（V189/Rz）の構造を示す。a)VEGF206、VEGF189及
びVEGF145はエキソン６を含んでいた。VEGF206及びVEGF
145は非小細胞肺癌細胞系OZ-6では検出されなかった。
ｂ）V189/Rzはエキソン６のGUCトリプレットのところで
切断するように設計された。不能化リボザイムdis-V189
/Rzはハンマーヘッド構造の触媒コアに単一のG→A変化
を含んだ。ｃ）リボザイム用の相補的DNA鋳型を合成す
るために用いたPCRプライマー。ｄ）インビトロ切断反
応の基質RNA用の相補的DNA鋳型を合成するために用いた
PCRプライマー。e）発現プラスミドpHβ/V189Rz及びpH
β/dis-V189Rzの概略図。
【図２】インビトロでの切断反応を示す写真である。a)
抗VEGF189リボザイム（V189Rz）はVEGF189合成基質を効
果的に切断した。ｂ）この切断活性はMg2+濃度依存的に
増加した。ｃ）不能化リボザイム（dis-V189Rz）は高濃
度のMg2+の存在下でさえVEGF189基質を切断しなかっ
た。
抗VEGF189リボザイム（V189Rz）はVEGF189合成基質を効
果的に切断した。ｂ）この切断活性はMg2+濃度依存的に
増加した。ｃ）不能化リボザイム（dis-V189Rz）は高濃
度のMg2+の存在下でさえVEGF189基質を切断しなかっ
た。
【図３】親細胞系OZ-6およびトランスフェクタントOZ-6
/VR、OZ-6/DNVRにおけるVEGF189 ｍRNAの発現レベルを
示す写真である。a)RT-PCR分析によりリボザイム発現ベ
クターpHβ/V189Rz又はpHβ/dis-V189Rzの導入が確認さ
れた。VEGF189転写体レベルはOZ-6/VR中で有意に減少し
た。ｂ）トランスフェクタントOZ-6/VR及びOZ-6/DVRは
親細胞系OZ-6と同様の形態学的特徴を示した。
/VR、OZ-6/DNVRにおけるVEGF189 ｍRNAの発現レベルを
示す写真である。a)RT-PCR分析によりリボザイム発現ベ
クターpHβ/V189Rz又はpHβ/dis-V189Rzの導入が確認さ
れた。VEGF189転写体レベルはOZ-6/VR中で有意に減少し
た。ｂ）トランスフェクタントOZ-6/VR及びOZ-6/DVRは
親細胞系OZ-6と同様の形態学的特徴を示した。
【図４】ヌードマウスにおける腫瘍成長を示す写真であ
る。a)OZ-6細胞は大きい赤色（血管）の腫瘍を全てのマ
ウスに形成した。しかし、12週間の観察期間中に１×１
０5OZ-6/VR細胞を接種したマウスでは、腫瘍形成は観察
されなかった。５×１０5OZ-6/VR細胞の接種後12週間で
２つの小さな白色（非血管）腫瘍が観察された。ｂ）腫
瘍の血管分布はマウスCD34（内皮マーカー）に対する免
疫組織化学的染色によって評価した。OZ-6/VRに由来の
小さな腫瘍はOZ−6腫瘍と比べて顕著に減少した血管分
布を示した。
る。a)OZ-6細胞は大きい赤色（血管）の腫瘍を全てのマ
ウスに形成した。しかし、12週間の観察期間中に１×１
０5OZ-6/VR細胞を接種したマウスでは、腫瘍形成は観察
されなかった。５×１０5OZ-6/VR細胞の接種後12週間で
２つの小さな白色（非血管）腫瘍が観察された。ｂ）腫
瘍の血管分布はマウスCD34（内皮マーカー）に対する免
疫組織化学的染色によって評価した。OZ-6/VRに由来の
小さな腫瘍はOZ−6腫瘍と比べて顕著に減少した血管分
布を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８６ 1/19 1/19 ４Ｃ０８７ 1/21 1/21 5/10 9/16 9/16 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 CA01 CA04 CA05 CA09 CA11 CA12 CA20 DA03 EA04 FA02 GA13 GA18 HA11 HA13 HA14 HA17 4B050 CC01 CC03 DD20 EE10 LL01 LL03 4B065 AA93X AB01 AC14 BA05 BB01 BC01 BD50 CA27 CA44 CA46 4C057 BB02 BB05 DD01 MM02 MM04 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA22 BA35 CA53 CA59 DC30 MA01 MA66 NA13 NA14 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA01 MA66 NA13 NA14 ZB26
Claims (14)
- 【請求項１】 癌の血管新生を抑制する能力をもつリボ
ザイム。 - 【請求項２】 前記抑制が血管内皮成長因子（ＶＥＧ
Ｆ）ｍＲＮＡの切断によるものである請求項１に記載の
リボザイム。 - 【請求項３】 ＶＥＧＦ１８９遺伝子エキソン６の転写
ｍＲＮＡのＧＵＣ配列の直後で切断する請求項２に記載
のリボザイム。 - 【請求項４】 ハンマーヘッド型である請求項１〜３の
いずれかに記載のリボザイム。 - 【請求項５】 配列番号１に示す核酸配列又はリボザイ
ム活性をもつその改変配列を有する請求項４に記載のリ
ボザイム。 - 【請求項６】 癌が肺癌である請求項１〜５のいずれか
に記載のリボザイム。 - 【請求項７】 核酸を転写するためのプロモーターの制
御下にある、請求項１〜６のいずれかに記載のリボザイ
ムをコードする核酸分子。 - 【請求項８】 ＤＮＡ又はｃＤＮＡである請求項７に記
載の核酸分子。 - 【請求項９】 配列番号２に示す塩基配列又は転写によ
って活性リボザイムに導き得るその改変配列を含む請求
項７又は８に記載の核酸分子。 - 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれかに記載の核酸
分子を含むベクター。 - 【請求項１１】 pHβ/V189Rzである請求項１０に記載
のベクター。 - 【請求項１２】 請求項１０又は１１に記載のベクター
を含む宿主細胞。 - 【請求項１３】 哺乳類の癌細胞内において血管新生を
抑制する能力をもつ請求項１〜６のいずれかに記載のリ
ボザイム又は該リボザイムを発現し得る請求項１０又は
１１に記載のベクターの有効量を、医薬上許容され得る
担体とともに含む、癌治療用医薬組成物。 - 【請求項１４】 癌が肺癌である請求項１３に記載の医
薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11009457A JP2000201686A (ja) | 1999-01-18 | 1999-01-18 | 癌の血管新生を抑制するリボザイム及び癌治療用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11009457A JP2000201686A (ja) | 1999-01-18 | 1999-01-18 | 癌の血管新生を抑制するリボザイム及び癌治療用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000201686A true JP2000201686A (ja) | 2000-07-25 |
Family
ID=11720827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11009457A Pending JP2000201686A (ja) | 1999-01-18 | 1999-01-18 | 癌の血管新生を抑制するリボザイム及び癌治療用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000201686A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004515752A (ja) * | 2000-09-15 | 2004-05-27 | バイオジェネックス ラボラトリーズ | ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの向上 |
-
1999
- 1999-01-18 JP JP11009457A patent/JP2000201686A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004515752A (ja) * | 2000-09-15 | 2004-05-27 | バイオジェネックス ラボラトリーズ | ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの向上 |
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