JPH1059850A - 血小板由来増殖因子発現抑制剤 - Google Patents
血小板由来増殖因子発現抑制剤Info
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- JPH1059850A JPH1059850A JP9143539A JP14353997A JPH1059850A JP H1059850 A JPH1059850 A JP H1059850A JP 9143539 A JP9143539 A JP 9143539A JP 14353997 A JP14353997 A JP 14353997A JP H1059850 A JPH1059850 A JP H1059850A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＰＤＧＦの発現を抑制することができ、この発
現に起因する各種の疾患、特に間質性肺炎等の肺の線維
化を抑制、治療することができるＰＤＧＦ発現抑制剤を
提供。 【解決手段】血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のＢ鎖の
任意の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを
有効成分とするＰＤＧＦ発現抑制剤。
現に起因する各種の疾患、特に間質性肺炎等の肺の線維
化を抑制、治療することができるＰＤＧＦ発現抑制剤を
提供。 【解決手段】血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のＢ鎖の
任意の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを
有効成分とするＰＤＧＦ発現抑制剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血小板由来増殖因
子（Platelet derived growth factor, PDGF）の発現抑
制剤、より詳しくは、間質性肺炎治療剤として有用なＰ
ＤＧＦ発現抑制剤に関する。
子（Platelet derived growth factor, PDGF）の発現抑
制剤、より詳しくは、間質性肺炎治療剤として有用なＰ
ＤＧＦ発現抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】間質性肺炎における肺の線維化には、各
種のサイトカインの関与が提起されている。すなわち、
肺の線維化は傷害治癒過程と理解され、これに関与する
細胞群としては、間葉系細胞を構成する線維芽細胞、平
滑筋細胞、血球細胞由来のマクロファージ、リンパ球、
好中球、好酸球、好塩基球、上皮細胞としての肺胞上皮
細胞、気道上皮細胞、血管内皮細胞等が知られている。
炎症刺激下等において、これらの細胞はそれぞれ活性化
され、健康状態下とは異なった遺伝子の発現をきたし、
種々のサイトカイン等を発現し、また接着分子の変化発
現も惹起させる。
種のサイトカインの関与が提起されている。すなわち、
肺の線維化は傷害治癒過程と理解され、これに関与する
細胞群としては、間葉系細胞を構成する線維芽細胞、平
滑筋細胞、血球細胞由来のマクロファージ、リンパ球、
好中球、好酸球、好塩基球、上皮細胞としての肺胞上皮
細胞、気道上皮細胞、血管内皮細胞等が知られている。
炎症刺激下等において、これらの細胞はそれぞれ活性化
され、健康状態下とは異なった遺伝子の発現をきたし、
種々のサイトカイン等を発現し、また接着分子の変化発
現も惹起させる。
【０００３】これらの各種細胞により産生発現されるサ
イトカインとしては、例えばインターロイキン類（ＩＬ
−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８等）、ＣＳＦ
類（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等）、ＴＮ
Ｆ類、ＴＧＦ類、ＩＦＮ類、成長因子（ＥＧＦ、ＴＧ
Ｆ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ等）等が知られているが、これら
のうち、肺の線維化病変に重要な役割を演じているの
は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β等ではなく、ＰＤ
ＧＦであると報告されている〔例えば第３４回日本胸部
疾患、講演要旨集１９１頁、１９２頁（１９９４年
度）、第３５回日本胸部疾患、講演要旨集第２３２頁
（１９９６年度）等参照〕。
イトカインとしては、例えばインターロイキン類（ＩＬ
−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８等）、ＣＳＦ
類（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等）、ＴＮ
Ｆ類、ＴＧＦ類、ＩＦＮ類、成長因子（ＥＧＦ、ＴＧ
Ｆ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ等）等が知られているが、これら
のうち、肺の線維化病変に重要な役割を演じているの
は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β等ではなく、ＰＤ
ＧＦであると報告されている〔例えば第３４回日本胸部
疾患、講演要旨集１９１頁、１９２頁（１９９４年
度）、第３５回日本胸部疾患、講演要旨集第２３２頁
（１９９６年度）等参照〕。
【０００４】上記ＰＤＧＦは、当初ヒト血小板に見出さ
れた。これはＡ鎖（分子量約１６Ｋ）とＢ鎖（分子量約
１４Ｋ）からなる分子量約３０Ｋの強塩基性糖蛋白質で
あり、両鎖にはシステイン残基が８個ずつあり、両鎖の
ペプチド内及びペプチド間にＳ−Ｓ結合が存在し、熱に
安定な構造をとっている。ヒト血小板顆粒内に含まれる
主要なＰＤＧＦは、上記Ａ鎖とＢ鎖とのヘテロ２量体
（ＰＤＧＦ−ＡＢ）であり、これが約７０％を占め、残
りは大部分Ｂ鎖のホモ２量体（ＰＤＧＦ−ＢＢ）で、僅
かにＡ鎖のホモ２量体（ＰＤＧＦ−ＡＡ）も認められ
る。
れた。これはＡ鎖（分子量約１６Ｋ）とＢ鎖（分子量約
１４Ｋ）からなる分子量約３０Ｋの強塩基性糖蛋白質で
あり、両鎖にはシステイン残基が８個ずつあり、両鎖の
ペプチド内及びペプチド間にＳ−Ｓ結合が存在し、熱に
安定な構造をとっている。ヒト血小板顆粒内に含まれる
主要なＰＤＧＦは、上記Ａ鎖とＢ鎖とのヘテロ２量体
（ＰＤＧＦ−ＡＢ）であり、これが約７０％を占め、残
りは大部分Ｂ鎖のホモ２量体（ＰＤＧＦ−ＢＢ）で、僅
かにＡ鎖のホモ２量体（ＰＤＧＦ−ＡＡ）も認められ
る。
【０００５】上記Ａ鎖及びＢ鎖とも既にｃＤＮＡが発
見、単離されており、Ｂ鎖はＳＳＶのトランスホーミン
グ遺伝子ｖ−ｓｉｓの遺伝子産物と高い相同性を有して
おり、該Ｂ鎖遺伝子は、ｖ−ｓｉｓのプロトオンコジー
ンであるｃ−ｓｉｓそのものである。
見、単離されており、Ｂ鎖はＳＳＶのトランスホーミン
グ遺伝子ｖ−ｓｉｓの遺伝子産物と高い相同性を有して
おり、該Ｂ鎖遺伝子は、ｖ−ｓｉｓのプロトオンコジー
ンであるｃ−ｓｉｓそのものである。
【０００６】一方、従来より、アンチセンスオリゴヌク
レオチドを用いて遺伝子発現を抑制する技術及びその医
薬品への応用が提案、検討されている。
レオチドを用いて遺伝子発現を抑制する技術及びその医
薬品への応用が提案、検討されている。
【０００７】この遺伝子発現の抑制技術は、細胞内の標
的核酸配列に特異的に結合する物質、すなわちアンチセ
ンス物質を生体内に導入し、生体の遺伝情報の流れを遮
断して、目的とする蛋白の構成を特異的に抑制する技術
としてとらえられている。この遺伝子の発現抑制技術を
利用すれば、標的とする内在性又は外来性遺伝子の発現
を特異的に抑制することができ、該標的遺伝子の発現又
は不適切な発現の結果生じる疾患等の治療ができると考
えられている。しかもこの技術は、用いられるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドが、特に生体への害が極めて少
ないと考えられる点からも注目を浴びている。
的核酸配列に特異的に結合する物質、すなわちアンチセ
ンス物質を生体内に導入し、生体の遺伝情報の流れを遮
断して、目的とする蛋白の構成を特異的に抑制する技術
としてとらえられている。この遺伝子の発現抑制技術を
利用すれば、標的とする内在性又は外来性遺伝子の発現
を特異的に抑制することができ、該標的遺伝子の発現又
は不適切な発現の結果生じる疾患等の治療ができると考
えられている。しかもこの技術は、用いられるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドが、特に生体への害が極めて少
ないと考えられる点からも注目を浴びている。
【０００８】しかるに、標的細胞の発現を有意に抑制で
きるアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択、すなわ
ち、所望の効果を奏し得るアンチセンス配列の選択乃至
決定は、これを事前に予測する確立された方法がなく、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの提供において、多大
の解決すべき問題を残している。例えば、翻訳開始部位
やその上流の非翻訳領域から選択する方法等、アンチセ
ンス配列の決定におけるいくつかの試みが提案されてい
るが、目的とする標的遺伝子により事情が相違し、結局
は、試行錯誤による選択によっているのが現状である
（特開平８−７０８９９号公報等参照）。
きるアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択、すなわ
ち、所望の効果を奏し得るアンチセンス配列の選択乃至
決定は、これを事前に予測する確立された方法がなく、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの提供において、多大
の解決すべき問題を残している。例えば、翻訳開始部位
やその上流の非翻訳領域から選択する方法等、アンチセ
ンス配列の決定におけるいくつかの試みが提案されてい
るが、目的とする標的遺伝子により事情が相違し、結局
は、試行錯誤による選択によっているのが現状である
（特開平８−７０８９９号公報等参照）。
【０００９】なお、アンチセンスＤＮＡによるＰＤＧＦ
の発現抑制によって、血管増殖の抑制から高血圧症の血
管障害等への応用が報告、示唆されている（第１６回日
本炎症学会プログラム予稿集、平成７年、８５頁）。こ
の報告に係わるアンセチンスＤＮＡは、ＰＤＧＦのＡ鎖
の特定の１６塩基長のアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチド（ＯＤＮ）であり、正常血圧ラットでは所望の
効果は奏されていない。
の発現抑制によって、血管増殖の抑制から高血圧症の血
管障害等への応用が報告、示唆されている（第１６回日
本炎症学会プログラム予稿集、平成７年、８５頁）。こ
の報告に係わるアンセチンスＤＮＡは、ＰＤＧＦのＡ鎖
の特定の１６塩基長のアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチド（ＯＤＮ）であり、正常血圧ラットでは所望の
効果は奏されていない。
【００１０】以上のように、アンチセンス技術は、種々
研究され、遺伝子治療分野及び医薬品開発分野で注目を
集めつつあるものの、ＰＤＧＦにおいて所望の発現抑制
が達せられたことはなく、勿論、間質性肺炎等の肺の線
維化病変に応用された例もない。
研究され、遺伝子治療分野及び医薬品開発分野で注目を
集めつつあるものの、ＰＤＧＦにおいて所望の発現抑制
が達せられたことはなく、勿論、間質性肺炎等の肺の線
維化病変に応用された例もない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＰＤＧＦの発現抑制効果を奏する所望のアンチセン
スオリゴヌクレオチド、特に間質性肺炎治療におけるそ
の利用を確立、提供する点にある。
は、ＰＤＧＦの発現抑制効果を奏する所望のアンチセン
スオリゴヌクレオチド、特に間質性肺炎治療におけるそ
の利用を確立、提供する点にある。
【００１２】かかる実情において、本発明者らは、鋭意
研究を重ねた結果、ＰＤＧＦのＢ鎖（ｃ−ｓｉｓ）の任
意の領域の配列から選択されたアンチセンス配列を有す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＤＧＦの発現
抑制効果を有することを見出し、本発明を完成した。
研究を重ねた結果、ＰＤＧＦのＢ鎖（ｃ−ｓｉｓ）の任
意の領域の配列から選択されたアンチセンス配列を有す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＤＧＦの発現
抑制効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、血小板由来増
殖因子のＢ鎖の任意の領域に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを有効成分とする血小板由来増殖因子発現
抑制剤に係るものである。
殖因子のＢ鎖の任意の領域に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを有効成分とする血小板由来増殖因子発現
抑制剤に係るものである。
【００１４】また、本発明は、血小板由来増殖因子のＢ
鎖の任意の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを含有する間質性肺炎治療剤に係るものである。
鎖の任意の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを含有する間質性肺炎治療剤に係るものである。
【００１５】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明において、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドには、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖のＤＮＡ配列か
ら転写されたｍＲＮＡの配列（センス配列）に相補的な
配列（アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチド
が包含され、これはアンチセンスＤＮＡ又はアンチセン
スＲＮＡであることができる。本発明におけるかかるア
ンセチンス配列は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の任意の領域に対す
るものであり、この任意の領域としては、アンセチンス
オリゴヌクレオチドが結合しやすい領域、すなわち二次
構造を取りにくい（一次構造を取りやすい）領域であれ
はいずれでもよい。
リゴヌクレオチドには、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖のＤＮＡ配列か
ら転写されたｍＲＮＡの配列（センス配列）に相補的な
配列（アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチド
が包含され、これはアンチセンスＤＮＡ又はアンチセン
スＲＮＡであることができる。本発明におけるかかるア
ンセチンス配列は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の任意の領域に対す
るものであり、この任意の領域としては、アンセチンス
オリゴヌクレオチドが結合しやすい領域、すなわち二次
構造を取りにくい（一次構造を取りやすい）領域であれ
はいずれでもよい。
【００１７】従って、この領域の配列に効果的にハイブ
リダイゼーションすることができる限り（かくしてＰＤ
ＧＦの遺伝子及び／又は蛋白の発現が抑制される）、本
発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その配列の
位置、長さ、修飾化、ミスマッチの存在等には何等限定
されるものではない。
リダイゼーションすることができる限り（かくしてＰＤ
ＧＦの遺伝子及び／又は蛋白の発現が抑制される）、本
発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その配列の
位置、長さ、修飾化、ミスマッチの存在等には何等限定
されるものではない。
【００１８】かかるＰＤＧＦ−Ｂ鎖の塩基配列は、既に
知られており（例えばヒトＰＤＧＦ−Ｂ鎖については、
Cell, Vol. 39, 1984, 89-97；Nature, Vol. 316, 22 A
ugust 1985, 748-750；Molecular and Cellular Biolog
y, Vol. 10, 1990, 5496-5501等参照）、本発明の利用
の態様に従って、対象とする由来、起源（種）に対応す
る配列を利用するのが好ましい。
知られており（例えばヒトＰＤＧＦ−Ｂ鎖については、
Cell, Vol. 39, 1984, 89-97；Nature, Vol. 316, 22 A
ugust 1985, 748-750；Molecular and Cellular Biolog
y, Vol. 10, 1990, 5496-5501等参照）、本発明の利用
の態様に従って、対象とする由来、起源（種）に対応す
る配列を利用するのが好ましい。
【００１９】本発明で用いるアンセチンスオリゴヌクレ
オチドは、上記ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の任意の領域の配列を含
む約１５〜３０マー（mer）程度の連続したセンス配列
に対するアンチセンスＤＮＡとして例示することができ
る。
オチドは、上記ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の任意の領域の配列を含
む約１５〜３０マー（mer）程度の連続したセンス配列
に対するアンチセンスＤＮＡとして例示することができ
る。
【００２０】また、本発明で用いるアンセチンスオリゴ
ヌクレオチドは、例えばホスホジエステル結合のリン酸
基の酸素原子の一つを硫黄原子に代えたフォスフォロチ
オエート型（Ｓ−オリゴ）、同リン酸基の酸素原子をメ
チル基に置換したメチルフォスフォネート型（Ｍ−オリ
ゴ）、リン酸結合をα−結合に代えたα−オリゴ型、さ
らにアクリジンやポリリジンの結合による修飾等の種々
の形態とすることができる（Biochemistry, 27, 9113-9
121(1988)；Anti-Cancer Drug Design., 3, 117-127(19
88)；Nucleic Acids Res., 19, 747-750(1991)等）。
ヌクレオチドは、例えばホスホジエステル結合のリン酸
基の酸素原子の一つを硫黄原子に代えたフォスフォロチ
オエート型（Ｓ−オリゴ）、同リン酸基の酸素原子をメ
チル基に置換したメチルフォスフォネート型（Ｍ−オリ
ゴ）、リン酸結合をα−結合に代えたα−オリゴ型、さ
らにアクリジンやポリリジンの結合による修飾等の種々
の形態とすることができる（Biochemistry, 27, 9113-9
121(1988)；Anti-Cancer Drug Design., 3, 117-127(19
88)；Nucleic Acids Res., 19, 747-750(1991)等）。
【００２１】有効成分とするアンセチンスオリゴヌクレ
オチドの代表的配列としては、例えばＰＤＧＦ−Ｂ鎖の
エクソン４の領域、すなわちコドン９７〜１８０番目の
アミノ酸配列領域、特にコドン１０６から１１２番目の
アミノ酸配列に対応するアンチセンス配列（Ｋ）を例示
することができる。ヒトにおける該配列は、配列表に配
列番号：１として示す通りであり、マウスにおける配列
は、配列表に配列番号：２として示す通りである。
オチドの代表的配列としては、例えばＰＤＧＦ−Ｂ鎖の
エクソン４の領域、すなわちコドン９７〜１８０番目の
アミノ酸配列領域、特にコドン１０６から１１２番目の
アミノ酸配列に対応するアンチセンス配列（Ｋ）を例示
することができる。ヒトにおける該配列は、配列表に配
列番号：１として示す通りであり、マウスにおける配列
は、配列表に配列番号：２として示す通りである。
【００２２】また、エクソン１の領域、特に開始コドン
を含む領域に対するアンチセンス配列（Ｄ）、スプライ
シングサイトを含む領域、特にエクソン５とエクソン６
の間の領域に対するアンチセンス配列（Ｃ）が挙げられ
る。ヒト及びマウスにおける配列Ｄは、配列番号：３に
示す通りであり、マウスにおける配列Ｃは配列番号：４
に、ヒトにおける配列Ｃは配列番号：５に示す通りであ
る。
を含む領域に対するアンチセンス配列（Ｄ）、スプライ
シングサイトを含む領域、特にエクソン５とエクソン６
の間の領域に対するアンチセンス配列（Ｃ）が挙げられ
る。ヒト及びマウスにおける配列Ｄは、配列番号：３に
示す通りであり、マウスにおける配列Ｃは配列番号：４
に、ヒトにおける配列Ｃは配列番号：５に示す通りであ
る。
【００２３】さらに、アンチセンス配列（Ｄ）以外のエ
クソン１の領域に対するアンチセンス配列（Ｅ、Ｈ）、
エクソン２とエクソン３の間の領域に対するアンチセン
ス配列（Ａ）、エクソン５の領域に対するアンチセンス
配列（Ｆ）、エクソン４とエクソン５の間の領域に対す
るアンチセンス配列（Ｂ）、エクソン６の領域に対する
アンチセンス配列（Ｇ）、エクソン７の領域に対するア
ンチセンス配列（Ｉ）なども挙げられる。マウス及びヒ
トにおける配列Ｅは配列番号：６に、マウスにおける配
列Ｈは配列番号：７に、ヒトにおける配列Ｈは配列番
号：８に、マウスにおける配列Ａは配列番号：９に、ヒ
トにおける配列Ａは配列番号：１０に、マウスにおける
配列Ｆは配列番号：１１に、ヒトにおける配列Ｆは配列
番号：１２に、マウスにおける配列Ｂは配列番号：１３
に、ヒトにおける配列Ｂは配列番号：１４に、マウスに
おける配列Ｇは配列番号：１５に、ヒトにおける配列Ｇ
は配列番号：１６に、マウスにおける配列Ｉは配列番
号：１７に、ヒトにおける配列Ｉは配列番号：１８に、
それぞれ示す通りである。
クソン１の領域に対するアンチセンス配列（Ｅ、Ｈ）、
エクソン２とエクソン３の間の領域に対するアンチセン
ス配列（Ａ）、エクソン５の領域に対するアンチセンス
配列（Ｆ）、エクソン４とエクソン５の間の領域に対す
るアンチセンス配列（Ｂ）、エクソン６の領域に対する
アンチセンス配列（Ｇ）、エクソン７の領域に対するア
ンチセンス配列（Ｉ）なども挙げられる。マウス及びヒ
トにおける配列Ｅは配列番号：６に、マウスにおける配
列Ｈは配列番号：７に、ヒトにおける配列Ｈは配列番
号：８に、マウスにおける配列Ａは配列番号：９に、ヒ
トにおける配列Ａは配列番号：１０に、マウスにおける
配列Ｆは配列番号：１１に、ヒトにおける配列Ｆは配列
番号：１２に、マウスにおける配列Ｂは配列番号：１３
に、ヒトにおける配列Ｂは配列番号：１４に、マウスに
おける配列Ｇは配列番号：１５に、ヒトにおける配列Ｇ
は配列番号：１６に、マウスにおける配列Ｉは配列番
号：１７に、ヒトにおける配列Ｉは配列番号：１８に、
それぞれ示す通りである。
【００２４】これらの配列のうち、配列Ｋ（エクソン４
の領域）、配列Ｄ（エクソン１の領域）、配列Ｃ（スプ
ライシングサイトを含む領域）が好ましい。
の領域）、配列Ｄ（エクソン１の領域）、配列Ｃ（スプ
ライシングサイトを含む領域）が好ましい。
【００２５】なお、これらの代表的配列のアンチセンス
オリゴヌクレオチドの各々の塩基数とＰＤＧＦ−Ｂ鎖遺
伝子のどの部位に対する配列であるかの位置関係は図１
に示す通りである。
オリゴヌクレオチドの各々の塩基数とＰＤＧＦ−Ｂ鎖遺
伝子のどの部位に対する配列であるかの位置関係は図１
に示す通りである。
【００２６】本発明において有効成分とするアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、かかるアンチセンス配列から
なるＤＮＡ及び／又はＲＮＡであり、これ等は一般的な
手法、例えば市販の自動合成機を用いたフォスフォロア
ミダイトやハイドロジェンフォスフォネート等を用いる
固相合成法等により容易に合成することができる。
スオリゴヌクレオチドは、かかるアンチセンス配列から
なるＤＮＡ及び／又はＲＮＡであり、これ等は一般的な
手法、例えば市販の自動合成機を用いたフォスフォロア
ミダイトやハイドロジェンフォスフォネート等を用いる
固相合成法等により容易に合成することができる。
【００２７】また、上記各種の修飾化も常法に従って行
なうことができ、これらの修飾のための市販試薬も好適
に使用することができる。
なうことができ、これらの修飾のための市販試薬も好適
に使用することができる。
【００２８】かくして得られるオリゴヌクレオチドの精
製も常法に従うことができ、例えば、通常の高速液体ク
ロマトグラフィーやポリアクリルアミドゲル電気泳動、
溶媒抽出、塩析等による方法を適宜採用することができ
る（J. Am. Chem. Soc., 106, 6077(1984)；J. Org.
Chem., 50, 390(1985) 等）。すなわち、本発明で用い
るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意のセンス配
列に対して所望のハイブリダイズを形成できる限り、そ
の合成法や由来等には何等の制限もない。
製も常法に従うことができ、例えば、通常の高速液体ク
ロマトグラフィーやポリアクリルアミドゲル電気泳動、
溶媒抽出、塩析等による方法を適宜採用することができ
る（J. Am. Chem. Soc., 106, 6077(1984)；J. Org.
Chem., 50, 390(1985) 等）。すなわち、本発明で用い
るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意のセンス配
列に対して所望のハイブリダイズを形成できる限り、そ
の合成法や由来等には何等の制限もない。
【００２９】また、本発明で用いるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの製造において採用され得る各種の操作、
例えば一部遺伝子の化学合成、同切断、削除、付加乃至
結合を目的とする酵素処理、同単離、精製、複製、選択
等は、いずれも常法に従うことができる〔例えば、分子
遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲ
テクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照〕。
ヌクレオチドの製造において採用され得る各種の操作、
例えば一部遺伝子の化学合成、同切断、削除、付加乃至
結合を目的とする酵素処理、同単離、精製、複製、選択
等は、いずれも常法に従うことができる〔例えば、分子
遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲ
テクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照〕。
【００３０】このようにして得られるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、ＰＤＧＦ発現抑制作用に優れ、これ
を有効成分とするＰＤＧＦ発現抑制剤、特に間質性肺炎
治療剤として有用である。
ゴヌクレオチドは、ＰＤＧＦ発現抑制作用に優れ、これ
を有効成分とするＰＤＧＦ発現抑制剤、特に間質性肺炎
治療剤として有用である。
【００３１】なお、かくして得られるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのＰＤＧＦ発現抑制作用は、例えばＰＤ
ＧＦをコードする遺伝子が存在する転写翻訳系に当該ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを添加して、ＰＤＧＦの
発現阻害を調べるか、又はＰＤＧＦをコードする遺伝子
に対応するｍＲＮＡが存在する系に当該アンチセンスオ
リゴヌクレオチドを添加して、ＰＤＧＦの発現阻害を調
べることにより確認できる。
ゴヌクレオチドのＰＤＧＦ発現抑制作用は、例えばＰＤ
ＧＦをコードする遺伝子が存在する転写翻訳系に当該ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを添加して、ＰＤＧＦの
発現阻害を調べるか、又はＰＤＧＦをコードする遺伝子
に対応するｍＲＮＡが存在する系に当該アンチセンスオ
リゴヌクレオチドを添加して、ＰＤＧＦの発現阻害を調
べることにより確認できる。
【００３２】上記有効成分は、これをそのまま医薬品と
して利用することもできるが、一般には、通常のこの種
ＤＮＡ試薬等の医薬品としての応用例に従って、遺伝子
導入用試薬や、適当な担体等を用いて各種の組成物にし
て実用することができる。
して利用することもできるが、一般には、通常のこの種
ＤＮＡ試薬等の医薬品としての応用例に従って、遺伝子
導入用試薬や、適当な担体等を用いて各種の組成物にし
て実用することができる。
【００３３】上記担体としては、有効成分に悪影響を与
えないことを前提として、この種医薬品に通常採用され
ている薬学的に許容される各種の賦形剤、等張化剤、溶
解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等から適宜選択
して使用でき、形態も特に限定されず公知の各種の形態
から適宜選択、決定できる。
えないことを前提として、この種医薬品に通常採用され
ている薬学的に許容される各種の賦形剤、等張化剤、溶
解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等から適宜選択
して使用でき、形態も特に限定されず公知の各種の形態
から適宜選択、決定できる。
【００３４】本発明の有効成分は、これによる処置が必
要な各種患者に対して、その形態に従い適宜適用され
る。その適用は処置を要する患部への直接適用とするこ
とができ、また血管内投与等の間接的適用とすることも
できる。特に、間質性肺炎等の肺の線維化の処置に当た
っては、例えば溶液形態である本発明有効成分を経気道
的に直接適用する方法を好ましく例示することができ
る。
要な各種患者に対して、その形態に従い適宜適用され
る。その適用は処置を要する患部への直接適用とするこ
とができ、また血管内投与等の間接的適用とすることも
できる。特に、間質性肺炎等の肺の線維化の処置に当た
っては、例えば溶液形態である本発明有効成分を経気道
的に直接適用する方法を好ましく例示することができ
る。
【００３５】さらに、本発明の医薬は、所望により、持
続性や膜透過性の向上を意図した封入素材、例えばリポ
フェクチンやリポソーム等、さらに各種の界面活性剤等
を利用した形態として実用することもできる。
続性や膜透過性の向上を意図した封入素材、例えばリポ
フェクチンやリポソーム等、さらに各種の界面活性剤等
を利用した形態として実用することもできる。
【００３６】本発明における有効成分の投与量は、患者
自体やその疾患状態等の条件に応じて適宜設定され、特
に制限されるものではないが、例えば約１〜１０ｍｇ／
患者を目安として上記条件に応じて適宜増減することが
できる。
自体やその疾患状態等の条件に応じて適宜設定され、特
に制限されるものではないが、例えば約１〜１０ｍｇ／
患者を目安として上記条件に応じて適宜増減することが
できる。
【００３７】かくして、本発明ＰＤＧＦ発現抑制剤は、
これを標的宿主の生体に投与適用することによって、所
望のＰＤＧＦ発現抑制を図ることができ、ＰＤＧＦの発
現或いはその不適切な発現に起因する各種の疾患及び病
態の治療を行なうことができる。殊に、本発明のＰＤＧ
Ｆ発現抑制剤は、間質性肺炎の治療に好適であり、該間
質性肺炎等における肺の線維化を抑制、治療することが
できる。
これを標的宿主の生体に投与適用することによって、所
望のＰＤＧＦ発現抑制を図ることができ、ＰＤＧＦの発
現或いはその不適切な発現に起因する各種の疾患及び病
態の治療を行なうことができる。殊に、本発明のＰＤＧ
Ｆ発現抑制剤は、間質性肺炎の治療に好適であり、該間
質性肺炎等における肺の線維化を抑制、治療することが
できる。
【００３８】なお、本発明においては、上記有効成分と
してのＰＤＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドを直接
生体に投与適用する代わりに、これを適当なプラスミド
ベクターに組み込んでアンチセンス組換え体を作成した
り、アデノウイルスやレトロウイルス等の適当なウイル
スベクターに組み込み、これ等を用いて標的宿主内で所
望のアンチセンスＲＮＡ、すなわち、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを発現させることもでき、かく
して同様の治療効果を奏することができる。
してのＰＤＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドを直接
生体に投与適用する代わりに、これを適当なプラスミド
ベクターに組み込んでアンチセンス組換え体を作成した
り、アデノウイルスやレトロウイルス等の適当なウイル
スベクターに組み込み、これ等を用いて標的宿主内で所
望のアンチセンスＲＮＡ、すなわち、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを発現させることもでき、かく
して同様の治療効果を奏することができる。
【００３９】
【実施例】以下、実施例及び試験例を挙げ、本発明をさ
らに詳しく説明する。
らに詳しく説明する。
【００４０】実施例１（アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの調製） マウスＰＤＧＦ−Ｂ鎖（ｃ−ｓｉｓ）の１０６−１１２
番目のアミノ酸配列に対応する配列番号：２に示すオリ
ゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ａ型）にて、ＴＥＴＤ試薬
（アプライドバイオシステムズ社製）により、ホスホジ
エステル結合のリン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に
置換したフォスフォロチオエート型（Ｓ−オリゴ）とし
て合成した。
ドの調製） マウスＰＤＧＦ−Ｂ鎖（ｃ−ｓｉｓ）の１０６−１１２
番目のアミノ酸配列に対応する配列番号：２に示すオリ
ゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ａ型）にて、ＴＥＴＤ試薬
（アプライドバイオシステムズ社製）により、ホスホジ
エステル結合のリン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に
置換したフォスフォロチオエート型（Ｓ−オリゴ）とし
て合成した。
【００４１】上記で合成したＳ−オリゴは、通常の方法
に従って逆相高速液体クロマトグラフィーにて単離精製
し、以下の試験に供した。
に従って逆相高速液体クロマトグラフィーにて単離精製
し、以下の試験に供した。
【００４２】また、上記配列のセンスオリゴヌクレオチ
ドを同様にして合成した。
ドを同様にして合成した。
【００４３】試験例１ マウスに経気道的にシリカビーズを投与すると肺に線維
化が起こることから、この実験系により本発明のアンチ
センスオリゴヌクレオチドの効果を、次の通り試験し
た。
化が起こることから、この実験系により本発明のアンチ
センスオリゴヌクレオチドの効果を、次の通り試験し
た。
【００４４】マウス（Ｃ５７ＢＬ／６．５週齢）を以下
の４群に群分けした。
の４群に群分けした。
【００４５】１群：シリカのみ投与 ２群：リポフェクチン（LIFE TECNOLOGIES, Gaithersbu
rg, MD, USA）のみ投与 ３群：シリカ＋リポフェクチン＋アンチセンスオリゴヌ
クレオチド投与 ４群：シリカ＋リポフェクチン＋センスオリゴヌクレオ
チド投与 まず、シリカの１６ｍｇ／８０μｌ生食溶液／１匹を、
マイクロピペットを使用して、経鼻的に投与（１群、３
群及び４群）して、肺の線維化を実験的に惹起させた。
rg, MD, USA）のみ投与 ３群：シリカ＋リポフェクチン＋アンチセンスオリゴヌ
クレオチド投与 ４群：シリカ＋リポフェクチン＋センスオリゴヌクレオ
チド投与 まず、シリカの１６ｍｇ／８０μｌ生食溶液／１匹を、
マイクロピペットを使用して、経鼻的に投与（１群、３
群及び４群）して、肺の線維化を実験的に惹起させた。
【００４６】上記シリカ投与の３時間後に、アンチセン
スオリゴヌクレオチド（実施例１で調製したＳ−オリゴ
型のもの）７μｌ（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）、ＰＢＳ７μ
ｌ及びリポフェクチン２６６μｌからなる供試薬剤の４
０μｌ（３群）、及び同様にセンスオリゴヌクレオチド
７μｌ、ＰＢＳ７μｌ及びリポフェクチン２６６μｌか
らなる対照薬剤の４０μｌ（４群）を、それぞれ直視下
に非侵襲的にマウスの気管支内に初回投与した。また、
２群には、上記薬剤の代わりにリポフェクチン単独の４
０μｌを同様にして投与した。
スオリゴヌクレオチド（実施例１で調製したＳ−オリゴ
型のもの）７μｌ（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）、ＰＢＳ７μ
ｌ及びリポフェクチン２６６μｌからなる供試薬剤の４
０μｌ（３群）、及び同様にセンスオリゴヌクレオチド
７μｌ、ＰＢＳ７μｌ及びリポフェクチン２６６μｌか
らなる対照薬剤の４０μｌ（４群）を、それぞれ直視下
に非侵襲的にマウスの気管支内に初回投与した。また、
２群には、上記薬剤の代わりにリポフェクチン単独の４
０μｌを同様にして投与した。
【００４７】試験開始より１週間後に、２〜４群には、
それぞれ同様に供試薬剤、対照薬剤及びリポフェクチン
単独を気管支内投与（２回目）した。
それぞれ同様に供試薬剤、対照薬剤及びリポフェクチン
単独を気管支内投与（２回目）した。
【００４８】試験開始２週間後に、各群マウスの肺を摘
出し、気管支肺胞洗浄（bronchialalveolar lavage：BA
L）し、ハイドロキシプロリン、病理所見について検討
した。
出し、気管支肺胞洗浄（bronchialalveolar lavage：BA
L）し、ハイドロキシプロリン、病理所見について検討
した。
【００４９】なお、ＢＡＬは生理食塩水にて気管支内を
洗浄し、５ｍｌを回収し、その総細胞数、細胞画分を検
討した。また、実験期間中、実験マウスには、ＳＰＦ
（無菌状態）で飼育し、自由摂餌させた。
洗浄し、５ｍｌを回収し、その総細胞数、細胞画分を検
討した。また、実験期間中、実験マウスには、ＳＰＦ
（無菌状態）で飼育し、自由摂餌させた。
【００５０】結果は次の通りであった。
【００５１】（１）肺組織中のハイドロキシプロリン
量：各群マウスの肺のハイドロキシプロリン量（μｇ）
を求めた棒グラフを図２に示す。
量：各群マウスの肺のハイドロキシプロリン量（μｇ）
を求めた棒グラフを図２に示す。
【００５２】図２より、肺の線維化を客観的に評価する
ために測定されたハイドロキシプロリン量の比較では、
シリカ単独投与群（１群）で８１９．５±１２４．６
（平均±ＳＤ）μｇ／肺、リポフェクチン単独投与群
（２群）で２８１．７±３１．７μｇ／肺、シリカ＋リ
ポフェクチン＋アンチセンスオリゴヌクレオチド投与群
（３群）で４９８．２±４１．３μｇ／肺、シリカ＋リ
ポフェクチン＋センスオリゴヌクレオチド投与群（４
群）で５１３．２±４２．１μｇ／肺となり、１群に比
べて、３群と４群とは有意に低下していた。また、２群
の測定値は、シリカの投与を受けていない正常マウスの
測定値と同等であった。
ために測定されたハイドロキシプロリン量の比較では、
シリカ単独投与群（１群）で８１９．５±１２４．６
（平均±ＳＤ）μｇ／肺、リポフェクチン単独投与群
（２群）で２８１．７±３１．７μｇ／肺、シリカ＋リ
ポフェクチン＋アンチセンスオリゴヌクレオチド投与群
（３群）で４９８．２±４１．３μｇ／肺、シリカ＋リ
ポフェクチン＋センスオリゴヌクレオチド投与群（４
群）で５１３．２±４２．１μｇ／肺となり、１群に比
べて、３群と４群とは有意に低下していた。また、２群
の測定値は、シリカの投与を受けていない正常マウスの
測定値と同等であった。
【００５３】（２）ＢＡＬ液中の細胞成分の解析：この
細胞成分の解析によれば、１群に比べて３群で、総細胞
数の有意な低下と、好中球の低下傾向を認めるに止まっ
ている。
細胞成分の解析によれば、１群に比べて３群で、総細胞
数の有意な低下と、好中球の低下傾向を認めるに止まっ
ている。
【００５４】（３）病理所見：結果を図３（１群）、図
４（３群）及び図５（４群）に示す。
４（３群）及び図５（４群）に示す。
【００５５】これらの図より、１群で見られているシリ
カビーズ投与による著名な炎症細胞の浸潤は、３群でほ
ぼ消失し、４群では軽症化していた。
カビーズ投与による著名な炎症細胞の浸潤は、３群でほ
ぼ消失し、４群では軽症化していた。
【００５６】（４）考察：以上の結果より、マウスのシ
リカにより惹起される間質性肺炎・肺線維化モデルに対
し、アンチセンスオリゴヌクレオチドをリポフェクチン
と共に経気道的に投与することにより、肺の線維化の指
標である肺組織中のハイドロキシプロリン量の有意な低
下、及び病理所見での病変の消失が認められた。
リカにより惹起される間質性肺炎・肺線維化モデルに対
し、アンチセンスオリゴヌクレオチドをリポフェクチン
と共に経気道的に投与することにより、肺の線維化の指
標である肺組織中のハイドロキシプロリン量の有意な低
下、及び病理所見での病変の消失が認められた。
【００５７】この事実は、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが有効に作用して、ＰＤＧＦの産生抑制を介して、
シリカにより誘導される肺の炎症と線維化をほぼ完全に
抑制したと考えられる。
チドが有効に作用して、ＰＤＧＦの産生抑制を介して、
シリカにより誘導される肺の炎症と線維化をほぼ完全に
抑制したと考えられる。
【００５８】すなわち、本実験の結果は、ＰＤＧＦのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが、間質性肺炎、肺線維
化の治療薬として有効であることを強く示唆するもので
ある。
ンチセンスオリゴヌクレオチドが、間質性肺炎、肺線維
化の治療薬として有効であることを強く示唆するもので
ある。
【００５９】実施例２ 配列番号２、３、４、６、７、９、１１、１３、１５及
び１７に示すオリゴヌクレオチド（Ａ〜Ｋ）を、実施例
１と同様にして合成した。
び１７に示すオリゴヌクレオチド（Ａ〜Ｋ）を、実施例
１と同様にして合成した。
【００６０】試験例２ 構成的にＰＤＧＦ−Ｂ ｍＲＮＡを発現しているマウス
monocyte-macrophagecell line であるＪ７７４細胞を
材料として用い、これを以下の方法により、実施例２で
合成した種々のＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレ
オチドで６，１４，２２時間処理し、Ｊ７７４細胞のＰ
ＤＧＦ−Ｂ ｍＲＮＡレベルをスロットブロットハイブ
リダイゼーションで調べた。
monocyte-macrophagecell line であるＪ７７４細胞を
材料として用い、これを以下の方法により、実施例２で
合成した種々のＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレ
オチドで６，１４，２２時間処理し、Ｊ７７４細胞のＰ
ＤＧＦ−Ｂ ｍＲＮＡレベルをスロットブロットハイブ
リダイゼーションで調べた。
【００６１】（１）ＰＤＧＦアンチセンスオリゴヌクレ
オチド−リポフェクチン試薬コンプレックスの調製 SolutionＡ：５００μＭ ＰＤＧＦアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、０．０２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１
６４０（抗生物質不含）で５０倍希釈し、１０μＭを２
０μｌ調製した（１well分）。
オチド−リポフェクチン試薬コンプレックスの調製 SolutionＡ：５００μＭ ＰＤＧＦアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、０．０２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１
６４０（抗生物質不含）で５０倍希釈し、１０μＭを２
０μｌ調製した（１well分）。
【００６２】SolutionＢ：リポフェクチン試薬（LIFE T
ECHNOLOGIES）４μｌを、０．０２％ＢＳＡを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０（抗生物質不含）で５倍希釈し（１well
分）、室温で４５分放置した。
ECHNOLOGIES）４μｌを、０．０２％ＢＳＡを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０（抗生物質不含）で５倍希釈し（１well
分）、室温で４５分放置した。
【００６３】SolutionＡとSolutionＢを穏やかに撹拌混
和し、室温で１５分インキュベートした。１５分後、こ
の混合溶液に０．０２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４
０（抗生物質不含）を１６０μｌ添加した（総容量：２
００μｌ）。
和し、室温で１５分インキュベートした。１５分後、こ
の混合溶液に０．０２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４
０（抗生物質不含）を１６０μｌ添加した（総容量：２
００μｌ）。
【００６４】Ｊ７７４細胞を１０5cells／０．１８ｍｌ
／wellずつ９６well plateにまき、３７℃、５％ＣＯ2
インキュベーターで培養した。２４時間後に、５００rp
m、５分、２０℃で遠心し、培養上清を吸引除去した
後、ＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質不含）を用い、２０
０μｌ／wellで２回洗浄した。上述のＰＤＧＦ−Ｂアン
チセンスオリゴヌクレオチド−リポフェクチン試薬コン
プレックスをＪ７７４細胞に２００μｌ／wellずつ添加
した。１種類のＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレ
オチド−リポフェクチン試薬コンプレックスにつき２４
wellずつ用いた。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター
で６，１４，２２時間培養後、培養上清を捨てＩＳＯＧ
ＥＮ（ニッポンジーン）を５０μｌ／wellずつ添加し、
プロトコールに従いＲＮＡ溶液を調製した（従って、１
種類のＰＤＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドにつ
き、Ｊ７７４細胞は２．４×１０6cells で、ＩＳＯＧ
ＥＮは１．２ｍｌ使用した）。ＲＮＡ溶液の調製を以下
に概略する。
／wellずつ９６well plateにまき、３７℃、５％ＣＯ2
インキュベーターで培養した。２４時間後に、５００rp
m、５分、２０℃で遠心し、培養上清を吸引除去した
後、ＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質不含）を用い、２０
０μｌ／wellで２回洗浄した。上述のＰＤＧＦ−Ｂアン
チセンスオリゴヌクレオチド−リポフェクチン試薬コン
プレックスをＪ７７４細胞に２００μｌ／wellずつ添加
した。１種類のＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレ
オチド−リポフェクチン試薬コンプレックスにつき２４
wellずつ用いた。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター
で６，１４，２２時間培養後、培養上清を捨てＩＳＯＧ
ＥＮ（ニッポンジーン）を５０μｌ／wellずつ添加し、
プロトコールに従いＲＮＡ溶液を調製した（従って、１
種類のＰＤＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドにつ
き、Ｊ７７４細胞は２．４×１０6cells で、ＩＳＯＧ
ＥＮは１．２ｍｌ使用した）。ＲＮＡ溶液の調製を以下
に概略する。
【００６５】ＩＳＯＧＥＮ処理した細胞に、クロロホル
ムを添加し激しく撹拌後、遠心分離（12,000rpm,10mi
n.,４℃）し、上層を新しいチューブに移しイソプロパ
ノールを添加し、１２，０００rpm、１０min.、４℃で
遠心分離して得た沈殿に、８０％エタノールを添加しVo
rtex後、７，５００rpm、６min.、４℃で遠心し上清を
捨て沈殿を風乾し、蒸留水を加えＲＮＡ溶液を調製し
た。
ムを添加し激しく撹拌後、遠心分離（12,000rpm,10mi
n.,４℃）し、上層を新しいチューブに移しイソプロパ
ノールを添加し、１２，０００rpm、１０min.、４℃で
遠心分離して得た沈殿に、８０％エタノールを添加しVo
rtex後、７，５００rpm、６min.、４℃で遠心し上清を
捨て沈殿を風乾し、蒸留水を加えＲＮＡ溶液を調製し
た。
【００６６】（２）スロットブロットハイブリダイゼー
ション ＲＮＡ溶液８μｇ／１６μｌに、ホルムアミド３２μ
ｌ、ホルムアルデヒド１１．２μｌ、２０×ＳＳＣ（Na
Cl 175.32g、クエン酸ナトリウム88.23gを蒸留水に溶解
し１ｌとした後、オートクレーブ滅菌して調製）３．２
μｌを添加し撹拌後、６８℃、１５分インキュベートし
た。１５分後、３分間氷冷し、２０×ＳＳＣを１２４．
８μｌ加えた。
ション ＲＮＡ溶液８μｇ／１６μｌに、ホルムアミド３２μ
ｌ、ホルムアルデヒド１１．２μｌ、２０×ＳＳＣ（Na
Cl 175.32g、クエン酸ナトリウム88.23gを蒸留水に溶解
し１ｌとした後、オートクレーブ滅菌して調製）３．２
μｌを添加し撹拌後、６８℃、１５分インキュベートし
た。１５分後、３分間氷冷し、２０×ＳＳＣを１２４．
８μｌ加えた。
【００６７】予め２０×ＳＳＣに浸しておいたＴＲＡＮ
ＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥ（PALLBIOSUPORT, DIV.）
を、５００μｌ／slotの１０×ＳＳＣで洗浄した後、Ｐ
ＤＧＦ−Ｂ用には、１４０μｌ／slotずつ、β−Ａｃｔ
ｉｎ用には、４０μｌ／slotずつ添加した。
ＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥ（PALLBIOSUPORT, DIV.）
を、５００μｌ／slotの１０×ＳＳＣで洗浄した後、Ｐ
ＤＧＦ−Ｂ用には、１４０μｌ／slotずつ、β−Ａｃｔ
ｉｎ用には、４０μｌ／slotずつ添加した。
【００６８】それぞれ試料溶液を添加後、３００μｌ／
slotの１０×ＳＳＣで２回洗浄した。ＢｌｏｔしたＴＲ
ＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥは、ＵＶ照射後、Ｅｘ
ｐｒｅｓｓＨｙｂｓｏｌｕｔｉｏｎ（CLONTECH Laborat
ories, Inc.）を用い、６８℃でプレハイブリダイゼー
ション後、32ＰでラベルしたＰＤＧＦ−Ｂ ＤＮＡｐｒ
ｏｂｅ又はβ−Ａｃｔｉｎ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅでハイ
ブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション終了
後、ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄後、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで５０℃、４０分間洗浄した。洗浄
したＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥは、ＧＳ−５
２５ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｏｃｋ中のＥ
ｘｐｏｓｕｒｅｐａｄに固定し、ＳｃｒｅｅｎにＥｘｐ
ｏｓｅした後、ＧＳ−５２５ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａ
ｇｅｒＳｙｓｔｅｍを用い、ＰＤＧＦ−ＢｍＲＮＡレベ
ルを測定し、β−Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡレベルに対し補
正した。
slotの１０×ＳＳＣで２回洗浄した。ＢｌｏｔしたＴＲ
ＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥは、ＵＶ照射後、Ｅｘ
ｐｒｅｓｓＨｙｂｓｏｌｕｔｉｏｎ（CLONTECH Laborat
ories, Inc.）を用い、６８℃でプレハイブリダイゼー
ション後、32ＰでラベルしたＰＤＧＦ−Ｂ ＤＮＡｐｒ
ｏｂｅ又はβ−Ａｃｔｉｎ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅでハイ
ブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション終了
後、ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄後、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで５０℃、４０分間洗浄した。洗浄
したＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥは、ＧＳ−５
２５ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｏｃｋ中のＥ
ｘｐｏｓｕｒｅｐａｄに固定し、ＳｃｒｅｅｎにＥｘｐ
ｏｓｅした後、ＧＳ−５２５ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａ
ｇｅｒＳｙｓｔｅｍを用い、ＰＤＧＦ−ＢｍＲＮＡレベ
ルを測定し、β−Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡレベルに対し補
正した。
【００６９】（３）結果：図６に、スロットブロットハ
イブリダイゼーションの結果を示した。縦軸は、ＰＤＧ
Ｆ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポフェク
チンの代わりに蒸留水を添加したＪ７７４細胞における
ＰＤＧＦ−Ｂ／β−Ａｃｔｉｎの比を１００％とした時
の各ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドで処
理したＪ７７４細胞におけるＰＤＧＦ−Ｂ／β−Ａｃｔ
ｉｎの比率の％を示している。この図より１４時間イン
キュベートした時に、強い抑制を示すＰＤＧＦ−Ｂアン
チセンスオリゴヌクレオチドが多いことが分かった。
イブリダイゼーションの結果を示した。縦軸は、ＰＤＧ
Ｆ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポフェク
チンの代わりに蒸留水を添加したＪ７７４細胞における
ＰＤＧＦ−Ｂ／β−Ａｃｔｉｎの比を１００％とした時
の各ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドで処
理したＪ７７４細胞におけるＰＤＧＦ−Ｂ／β−Ａｃｔ
ｉｎの比率の％を示している。この図より１４時間イン
キュベートした時に、強い抑制を示すＰＤＧＦ−Ｂアン
チセンスオリゴヌクレオチドが多いことが分かった。
【００７０】６，１４，２２時間処理の結果を総合的に
比較すると、ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオ
チド−ＣとＤが、ＫよりもＰＤＧＦ−Ｂ ｍＲＮＡレベ
ルの強い抑制を示すことが分かった。また、ＰＤＧＦ−
Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド−Ｃ，Ｄと同時に、
ミスマッチ−Ｃ，Ｄ及びセンス−Ｃ，Ｄを用いたスロッ
トブロットハイブリダイゼーションの結果から、ＰＤＧ
Ｆ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド−Ｃ，Ｄの作用
は、オリゴヌクレオチドの毒性によるものではないと判
断した。従って、ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌク
レオチド−ＣとＤを選択し、in vivo における効果につ
いて検討中である。ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌ
クレオチド、ミスマッチ及びセンス−ＣとＤの配列は、
図７に示した。
比較すると、ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオ
チド−ＣとＤが、ＫよりもＰＤＧＦ−Ｂ ｍＲＮＡレベ
ルの強い抑制を示すことが分かった。また、ＰＤＧＦ−
Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド−Ｃ，Ｄと同時に、
ミスマッチ−Ｃ，Ｄ及びセンス−Ｃ，Ｄを用いたスロッ
トブロットハイブリダイゼーションの結果から、ＰＤＧ
Ｆ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド−Ｃ，Ｄの作用
は、オリゴヌクレオチドの毒性によるものではないと判
断した。従って、ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌク
レオチド−ＣとＤを選択し、in vivo における効果につ
いて検討中である。ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌ
クレオチド、ミスマッチ及びセンス−ＣとＤの配列は、
図７に示した。
【００７１】
【００７２】配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： GTCTATGAGG CGCCGGGAGA T 21
【００７３】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： ATCGATGAGG TTCCGCGAGA T 21
【００７４】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： AGCAGCGATT CATGCCGACT CC 22
【００７５】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： TGGGAAGGCA GCTTACCTCG CTGCT 25
【００７６】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CTAGAAAGGT GGTTACCTCG CTGCT 25
【００７７】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： AGAGCGCCCA GCAGCGATTC AT 22
【００７８】配列番号：７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： TCGGGTCAGT CTGTCTATCT AC 22
【００７９】配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： GCGAGTCCGT CGGTCCGTCT GC 22
【００８０】配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： GGTCCGATTT ACCTACGGAG TC 22
【００８１】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： GATTCCATTT ACCTCCGGGG TC 22
【００８２】配列番号：１１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： GAGGTGGTCC TCCAAGGTCA CTGTG 25
【００８３】配列番号：１２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CAGGTGGTCT TCCAGCGTCA CCGTG 25
【００８４】配列番号：１３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： ATCTTTCTCA CCTGGAGGAC AA 22
【００８５】配列番号：１４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： ATCTTTCTCA CCTGGAGGAC AG 22
【００８６】配列番号：１５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CGCCTTGTCA TGGGTGTGCT TA 22
【００８７】配列番号：１６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CGTCTTGTCA TGCGTGTGCT TG 22
【００８８】配列番号：１７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CAACATTATC ACTCCAAGGA CC 22
【００８９】配列番号：１８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CAATATTATC TACTCCAAGG CC 22
【図１】本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの代表的配列がＰＤＧＦ−Ｂ鎖遺伝子のどの部位に対
する配列であるかの位置関係を示す図である。図中の番
号を付した部位はエクソンを示す。
ドの代表的配列がＰＤＧＦ−Ｂ鎖遺伝子のどの部位に対
する配列であるかの位置関係を示す図である。図中の番
号を付した部位はエクソンを示す。
【図２】試験例１に従って求められた各群マウスの肺組
織中のハイドロキシプロリン量を示すグラフである。
織中のハイドロキシプロリン量を示すグラフである。
【図３】試験例１において、１群の肺組織の病理的所見
を観察した生物の生態を示す写真である。
を観察した生物の生態を示す写真である。
【図４】試験例１において、３群の肺組織の病理的所見
を観察した生物の生態を示す写真である。
を観察した生物の生態を示す写真である。
【図５】試験例１において、４群の肺組織の病理的所見
を観察した生物の生態を示す写真である。
を観察した生物の生態を示す写真である。
【図６】試験例２におけるスロットブロットハイブリダ
イゼーションの結果を示すグラフである。
イゼーションの結果を示すグラフである。
【図７】ＰＤＧＦ−Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド、ミスマッチ及びセンスＣ並びにＤの配列を示す図で
ある。
ド、ミスマッチ及びセンスＣ並びにＤの配列を示す図で
ある。
Claims (7)
- 【請求項１】血小板由来増殖因子のＢ鎖の任意の領域に
対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とす
る血小板由来増殖因子発現抑制剤。 - 【請求項２】任意の領域がエクソン４の領域である請求
項１記載の血小板由来増殖因子発現抑制剤。 - 【請求項３】任意の領域がエクソン１の領域である請求
項１記載の血小板由来増殖因子発現抑制剤。 - 【請求項４】任意の領域がスプライシングサイトを含む
領域である請求項１記載の血小板由来増殖因子発現抑制
剤。 - 【請求項５】任意の領域がエクソン２とエクソン３の間
の領域、エクソン５の領域、エクソン４とエクソン５の
間の領域、エクソン６の領域又はエクソン７の領域であ
る請求項１記載の血小板由来増殖因子発現抑制剤。 - 【請求項６】アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番
号１〜１８で示されるものから選ばれるものである請求
項１記載の血小板由来増殖因子発現抑制剤。 - 【請求項７】間質性肺炎治療剤である請求項１〜６のい
ずれかに記載の血小板由来増殖因子発現抑制剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9143539A JPH1059850A (ja) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | 血小板由来増殖因子発現抑制剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-148090 | 1996-05-17 | ||
| JP14809096 | 1996-05-17 | ||
| JP9143539A JPH1059850A (ja) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | 血小板由来増殖因子発現抑制剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1059850A true JPH1059850A (ja) | 1998-03-03 |
Family
ID=26475244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9143539A Pending JPH1059850A (ja) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | 血小板由来増殖因子発現抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1059850A (ja) |
-
1997
- 1997-05-16 JP JP9143539A patent/JPH1059850A/ja active Pending
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