ES2242189T3

ES2242189T3 - Columna esteril y apirogena copulada a una proteina con miras a la fijacion y extraccion de sustancias dadas de la sangre.

Info

Publication number: ES2242189T3
Application number: ES95920516T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Bohm; Franz A. Bieber; Jutta Muller-Derlich; Alan Barclay; Reiner Spaethe; Michael Bernhard; Christine Kraus
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2015-05-15
Also published as: JP3161604B2; DE69534187D1; CA2190268A1; EP0804734A1; EP0804734A4; DE69534187T2; AU691297B2; EP0804734B1; ATE294959T1; JPH09508976A; WO1995031727A1; AU2594495A; US5817528A; CA2190268C

Abstract

EN LA INVENCION SE PRESENTA UN METODO PARA LA PRODUCCION DE UNA COLUMNA ESTERIL Y SIN PIROGENES ACOPLADA A UNA PROTEINA PARA SU USO EN LA EXTRACCION DE UNA SUSTANCIA PREDETERMINADA DE LA SANGRE DE UN SER HUMANO. EL METODO ABROGA LA ESTERILIZACION DEL PRODUCTO ACABADO QUE CONTIENE LA PROTEINA MEDIANTE LA ADICION DE MATERIALES BRUTOS ESTERILES Y SIN PIROGENES EN TAL ETAPA DE PRODUCCION. CON EL METODO SE OBTIENE UNA SOLUCION PURIFICADA SIN PATOGENOS DE UNA PROTEINA QUE SE ENLAZA A UNA SUSTANCIA PREDETERMINADA DE LA SANGRE DE UN SER HUMANO TAL COMO LA LDL O INMUNOGLOBULINA. NORMALMENTE LA PROTEINA ES INMUNOGLOBULINA LDL ANTIHUMANA O INMUNOGLOBULINA IG ANTIHUMANA. CON EL METODO TAMBIEN SE OBTIENE UN MATERIAL DE MATRIZ DE UNA COLUMNA ESTERIL Y SIN PIROGENES TAL COMO UNA AGAROSA QUE SE ACTIVA QUIMICAMENTE BIEN UTILIZANDO CNBR Y TRIETILAMINA O BIEN UTILIZANDO 1,1'' CARBONILDIIMIDAZOL. EL MATERIAL DE MATRIZ ACTIVADA, ESTERIL Y SIN PIROGENES Y LA SOLUCION PROTEINICA PURIFICADA SIN PATOGENOS SE COMBINAN BAJO CONDICIONES ASEPTICAS PARA QUE SE PRODUZCA EL ACOPLAMIENTO DE LA PROTEINA AL MATERIAL DE MATRIZ Y EL MATERIAL DE MATRIZ ACOPLADO A LA PROTEINA SE INTRODUCE BAJO CONDICIONES ASEPTICAS EN UN RECEPTACULO ESTERIL Y SIN PIROGENES PARA FORMAR UNA COLUMNA ESTERIL Y SIN PIROGENES.

Description

Columna estéril y apirógena copulada a una proteína con miras a la fijación y extracción de sustancias dadas de la sangre.

Campo técnico

La invención se relaciona, en general, con columnas sobre las cuales se pasa sangre para eliminar substancias de la sangre. Concretamente, la invención se halla en el campo de los métodos para producir columnas estériles y libres de pirógenos copuladas a proteínas que se unen a substancias predeterminadas de la sangre y las eliminan.

Antecedentes

Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que determinados estados de enfermedad se asocian a la presencia de un exceso de substancias específicas en la sangre del paciente. Por ejemplo, en la hipercolesterolemia familiar (HF), los niveles de lipoproteína de baja densidad ("LDL") o de lipoproteína a (Lp(a)) en la sangre del paciente están muy elevados debido a un defecto genético en el receptor de la LDL. La elevación de la LDL da lugar a un rápido desarrollo de aterosclerosis en las arterias coronarias del paciente, que a su vez da lugar a un ataque cardíaco precoz y a muerte.

Para eliminar el exceso de LDL, se pasa el plasma de los pacientes con HF sobre columnas que contienen una matriz que se copula a anticuerpos que se unen específicamente al complejo LDL/colesterol y lo eliminan. Este procedimiento está descrito en las siguientes publicaciones: Stoffel, W. y col., Lancet II, pp. 1005-1007, 1981; Borberg, H. y col., J. Clin. Apheresis 4: 59-65, 1988; Gordon, B.R. y col., Transfusion 30: 327-332, 1990; Borberg, H. y col., Plasma Separation and Plasma Fractionation, pp. 266-271 (Karger, Basel 1983); Hombach, V. y col., Deutsche Med. Wochenschrift 111: 1709-1715, 1986; Borberg, H. y col., Arztl. Lab. 32: 57-62, 1986.

Se ha propuesto otro tipo de columna de eliminación de la LDL para eliminar de forma no específica el colesterol de la sangre de un paciente (EE.UU. 4.576.928, EE.UU. 4.637.994, Liposorber®, Sulflux®, Kaneka Corporation, Osaka, Japón). El adsorbente de la columna de Kaneka consiste en un gel duro poroso insoluble en agua sobre el cual se inmoviliza un compuesto sulfatado por una unión covalente.

También se ha propuesto eliminar la LDL por precipitación de LDL extracorpórea inducida por heparina (HELP™, Braun, Melsungen, Alemania).

Otra necesidad para la eliminación de substancias de la sangre de un paciente surge en ciertas enfermedades autoinmunes y otras. En general, se cree que los síntomas de enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritematosus sistémico (LES), la artritis reumatoide (AR), la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), la miastenia gravis y la vasculitis, están causados por auto-anticuerpos e inmunocomplejos circulantes (ICC) en la sangre del paciente que se dirigen contra los propios antígenos del paciente. Por lo tanto, se ha propuesto que la eliminación de una gran porción de las inmunoglobulinas del paciente, incluyendo los auto-anticuerpos y los ICC, puede dar lugar a una mejoría de los síntomas y posiblemente a una curación.

Se han copulado columnas a Proteína A de Staphylococcus aureus, la cual se une a ciertas subclases de IgG humana (Immunosorba®, Excorim®, Lund, Suecia). Normalmente, se consigue la eliminación de determinadas subclases de IgG por perfusión del plasma del receptor sobre estas columnas copuladas a Proteína A de S. aureus. Se han propuesto las columnas copuladas a Proteína A para uso en el tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunes, tales como el síndrome de Goodpasture, la granulomatosis de Wegener y el LES (manual EXCORIM® EM-32-101-B, 1989, Lund, Suecia; Bygren, P. y col., Lancet, 7 de Diciembre, pp. 1295-1296, 1985). Las columnas copuladas a Proteína A han sido también utilizadas para la eliminación de anticuerpos anti-HLA de pacientes hipersensibilizados que necesitan un trasplante de riñón (Dantal, J. y col., New England J. Med. 550: 7-14, 1994; Palmer, A. y col., The Lancet, 7 de Enero de 1989, pp. 10-12). Estos pacientes sufren típicamente del síndrome nefrótico idiopático (SNI). Comúnmente sufren una recaída poco después de un trasplante incluso del riñón del donante más compatible, excluyéndolos así prácticamente de la posibilidad de que se les trasplante cualquier tipo de riñón. Se describió la eficacia del tratamiento con la columna de Proteína A en varios pacientes con SIN (Dantal y col., antes citado; Palmer y col., antes citado). También se usaron columnas copuladas a Proteína A en el tratamiento de pacientes con inhibidores de anticuerpos para los factores de coagulación VIII o IX (Nilsson, I.M. y col., Blood 58: 38-44, 1981; Gjörstrup, P. y col., Vox. Sang. 61: 244-250, 1991).

También se ha implicado al interferon como posible substancia patogénica en la sangre de pacientes que sufren de enfermedades autoinmunes, alergia y rechazo de tejido trasplantado. Se ha propuesto que inmunoglobulinas anti-interferon copuladas a un soporte sólido podrían efectuar la eliminación del interferon de la sangre de tales pacientes (Skurkovich, S.V., EE.UU. 4.581.010; Skurkovich, S.V., EE.UU. 4.362.155; DE 32 39 360 C2; GB 2122496B; WO 82/03331).

Es también posible tratar determinadas enfermedades autoinmunes por eliminación de una porción significativa de las inmunoglobulinas del paciente usando una columna copulada a anticuerpos dirigidos contra la inmunoglobulina humana. El uso de tales columnas en el tratamiento de enfermedades autoinmunes ha sido descrito como sigue: Müller-Derlich, J. y col., Congress in Monte Carlo, Abril de 1992; Müller-Derlich, J. y col., IX Congress of The International Society for Artificial Organs, Julio de 1993; Müller-Derlich, J. y col., Ninth Scientific Congress of The European Society for Haemapheresis in Association with The British Blood Transfusion Society, Septiembre de 1993; Müller-Derlich, J. y col., XXIV Tagung der Gesellschaft für Immunologie, Septiembre/Octubre de 1993; Müller-Derlich, J. y col., Conference on Immunoglobulins Intravenous IgIV, Lisboa, Noviembre de 1993.

Otro ejemplo de la eliminación de substancias de la sangre de un paciente surge cuando el paciente tiene necesidad de un trasplante de órganos. En general, el órgano trasplantado debe ser inmunológicamente compatible con el receptor para evitar el rechazo hiperagudo del órgano del donante. Sin embargo, existe una escasez mundial de órganos humanos con calidad para trasplante y la necesidad de compatibilizar inmunológicamente el órgano del donante con el receptor complica aún más el cuadro.

Si se trasplanta el órgano de un donante contra el que el receptor ha formado previamente anticuerpos, se produce el rechazo hiperagudo del órgano del donante rápidamente después del trasplante. El rechazo hiperagudo se produce típicamente en un aloinjerto cuando el receptor ha preformado anticuerpos frente al tipo HLA del órgano del donante (humano a humano) y en un xenoinjerto (animal a humano) porque los humanos han preformado normalmente anticuerpos frente a los tejidos animales.

La "reacción de rechazo hiperagudo" se produce cuando el propio sistema inmune del receptor ataca y destruye el órgano trasplantado en unos cuantos minutos a horas, típicamente en un plazo de 48 horas tras el trasplante. Incluso cuando el receptor recibe terapia inmunosupresora, no se mejora el rechazo hiperagudo.

El uso de un órgano de una especie animal, tal como el cerdo, no será práctica a menos que se encuentre un método para reducir mucho o evitar la reacción de rechazo hiperagudo. Se cree que la reacción de rechazo hiperagudo se produce como resultado de anticuerpos preformados en la sangre del receptor que reconocen y se unen a los xenoantígenos en el tejido del órgano del donante una vez el órgano trasplantado está colocado y es perfundido con la sangre del receptor. Estos anticuerpos preformados en la sangre del receptor son también conocidos como "anticuerpos heterófilos humanos", "anticuerpos naturales" o "anticuerpos xenorreactivos". Cuando los anticuerpos xenorreactivos se unen a las células endoteliales de los vasos sanguíneos del órgano del donante, estimulan la deposición de proteínas del complemento, que también se originan de la sangre del receptor. Se cree que la deposición de anticuerpos xenorreactivos/complemento inicia la ruta "clásica" de acción del complemento, que conduce finalmente a la destrucción del revestimiento de células endoteliales de los vasos sanguíneos del órgano del donante (en: Immunology, Eds.: Roitt, I.M. y col., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1989, Capítulo 13, páginas 13.1-13.16). La reacción de rechazo hiperagudo da lugar a necrosis del órgano del donante en un plazo de minutos a horas después del xenotrasplante. Se ha lanzado la hipótesis de que la necrosis del órgano del donante es el resultado de la "activación" de sus células endoteliales, que a su vez da lugar a hemorragia intersticial, inflamación, edema y trombosis de los vasos pequeños (Platt, J.L. y col., Immunology Today 11: 450-456, 1990; Magee, J.C. y col., Therapeutic Immunology 1: 45-58, 1994).

En intentos por evitar el rechazo hiperagudo cuando se trasplantaron órganos humanos con incompatibilidad ABO, se eliminaron los anticuerpos anti-A/anti-B preformados de la sangre de los receptores usando perfusión extracorpórea del plasma de los receptores sobre antígenos sintéticos del grupo sanguíneo A/B covalentemente unidos a sílice. Se describieron trasplantes de riñón y de médula ósea realizados con éxito usando este procedimiento (Bannett, A.D. y col., Transplant. Proc., 1987, XIX: 4543-4546; Bensinger, W.I. y col., Transplantation, 1982, 33: 427-429; Patente EE.UU. Nº 4.137.401; Patente Europea Nº 89311540.2).

Se han propuesto diversos procedimientos para eliminar anticuerpos xenorreactivos de la sangre de un receptor de un órgano animal. Por ejemplo, se podría perfundir la sangre del receptor a través de un órgano de la especie donante propuesta antes del trasplante de un órgano "fresco". Alternativamente, si la especie donante ha de ser un cerdo, se podría construir una "columna" de células endoteliales de cerdo aisladas, por ejemplo. Se podría perfundir el plasma del receptor sobre esta columna para eliminar los anticuerpos anti-cerdo antes del trasplante. (Bach, F.H., en: XENOTRANSPLANTATION, Eds.: Cooper, D.K.C. y col., Springer-Verlag, 1991, Capítulo 6).

También se ha propuesto la eliminación no específica de los anticuerpos de la sangre del receptor antes del xenotrasplante, con la esperanza de eliminar los anticuerpos xenorreactivos junto con el resto. Se puede eliminar la inmunoglobulina no específicamente por plasmaféresis. Sin embargo, la plasmaféresis convencional se asocia a efectos colaterales que la hacen impráctica para tratar a pacientes de trasplante de órganos.

Nilson, I.M. y col. describen una matriz de columna de proteína A-Sepharose libre de pirógenos y estéril acabada comercializada que está empaquetada en columnas esterilizadas con óxido de etileno (Nilson, I.M. y col., "A procedure for removing high titer antibodies by extracorporeal Protein-A-Sepharose adsorption in hemophilia: substitution therapy and surgery in a patient with hemophilia B and antibodies", Blood, Julio de 1981, Vol. 58, Nº 1, pp. 38-44).

EE.UU. 3.560.620 se relaciona con un método para la inducción de fibrinolisis en mamíferos y composiciones farmacéuticas para ello. EE.UU. 3.560.620 describe la preparación de una composición farmacéutica a partir de un componente farmacéuticamente activo y de excipientes, donde la composición farmacéutica está constituida por pequeñas moléculas orgánicas muy específicas. Los componentes de EE.UU. 3.560.620 son productos acabados que simplemente se mezclan, pero no interaccionan químicamente, para producir un nuevo producto de
reacción.

Lo que se necesita es un método para producir columnas estériles y libres de pirógenos copuladas a proteínas específicas para la eliminación de substancias predeterminadas de la sangre de pacientes que sufren de condiciones tales como elevación de LDL/colesterol, enfermedades autoinmunes y condiciones que requieren trasplante de órganos sólidos.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para producir una columna estéril y libre de pirógenos copulada a proteína que se une a una substancia predeterminada en la sangre humana, eliminando así esa substancia cuando se pasa el plasma del sujeto sobre la columna.

Las substancias predeterminadas que se han de unir y eliminar pueden ser, por ejemplo, lipoproteína de baja densidad ("LDL") y Lp(a) y complejos de colesterol asociados. Alternativamente, las substancias predeterminadas que se han de eliminar pueden ser inmunoglobulinas, tales como IgG, IgM, IgA e IgE e inmunocomplejos circulantes.

La proteína copulada puede ser una mezcla de anticuerpos policlonales, monoclonales o recombinantes dirigidos contra la LDL humana o la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos copulados pueden ser producidos en animales o pueden ser producidos recombinantemente como anticuerpos de doble cadena o de cadena única. Cuando los anticuerpos copulados se dirigen contra la inmunoglobulina humana, pueden unirse específicamente a la IgG, IgM, IgA o IgE humanas o a una mezcla de clases de inmunoglobulinas humanas.

Por consiguiente, es un objeto de esta invención proporcionar un método para producir una columna estéril y libre de pirógenos copulada a proteína que se une, y elimina así, a una substancia predeterminada de la sangre de un sujeto primate, sujetos humanos incluidos.

Es otro objeto de esta invención proporcionar un método para producir una columna estéril y libre de pirógenos copulada a anticuerpos que se unen específicamente a la LDL humana y la eliminan del plasma de un sujeto humano.

Es aún otro objeto de esta invención proporcionar un método para producir una columna estéril y libre de pirógenos copulada a anticuerpos anti-inmunoglobulina humana para uso en la eliminación de inmunoglobulinas e inmunocomplejos circulantes del plasma de sujetos primates, incluidos los sujetos humanos.

Un objeto adicional de esta invención es proporcionar un método para la producción a gran escala de columnas copuladas a proteína estériles y libres de pirógenos.

Dichos objetos son resueltos mediante un método para producir una columna estéril y libre de pirógenos que contiene un material de matriz que tiene una proteína copulada al mismo, cuya columna es útil para eliminar una substancia predeterminada de la sangre de un sujeto humano, cuyo método consiste en:

\bullet: disponer de una solución purificada de proteína que se une a dicha substancia predeterminada en la sangre humana, cuya solución está libre de patógenos;

\bullet: disponer de un material de matriz estéril y libre de pirógenos que está químicamente activado, donde se hace que dicho material de matriz sea estéril y esté libre de pirógenos mediante un procedimiento consistente en las siguientes etapas:

(a): lavar dicho material de matriz, en condiciones asépticas, con agua estéril y libre de pirógenos hasta que una prueba de carga biológica indique la presencia de cero bacterias entéricas, cero Pseudomonas aeruginosa, cero Staphylococcus aureus y menos de 1 bacteria aerobia/g y

(b): tratar con vapor dicho material de matriz a 115ºC a menos de 2 bares hasta obtener un valor de F_{0}=6;

\bullet: poner en contacto en condiciones asépticas dicho material de matriz activado con dicha solución de proteína, efectuando así la copulación de dicha proteína a dicho material de matriz, y

\bullet: empaquetar en condiciones asépticas dicho material de matriz que tiene dicha proteína copulada al mismo en un recinto estéril y libre de pirógenos en forma de columna para producir una columna estéril y libre de pirógenos.

Breve descripción de la figura

La Figura 1 es un gráfico de flujo del método para producir columnas estériles y libres de pirógenos copuladas a proteína.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona métodos para producir columnas estériles y libres de pirógenos copuladas a proteína para la eliminación de substancias predeterminadas de la sangre de un sujeto. Los métodos son llevados a cabo en condiciones asépticas usando materias primas estériles. El método de la presente invención evita el uso de métodos convencionales deletéreos para la esterilización de productos médicos.

Aquí, el término "columna" se define como un módulo de cualquier forma que tiene un material de matriz al que se pueden copular químicamente proteínas.

Cuando se ha de usar una columna en el procesamiento de la sangre de un sujeto humano, se entiende que la columna debe ser estéril y estar libre de pirógenos para minimizar la posibilidad de que substancias patógenas pudieran regresar al sujeto a través del efluente de la columna. Existe un problema importante que se presenta en la producción de una columna copulada a proteína estéril y libre de pirógenos. Este problema importante se basa en el hecho de que la columna terapéutica acabada no puede ser esterilizada por ningún medio práctico sin destruir su función. Los cuatro medios convencionales para esterilizar un producto médico son (1) saturación con óxido de etileno, (2) saturación con glutaraldehído, (3) irradiación gamma y (4) esterilización por vapor. La esterilización con óxido de etileno (EtO_{2}) implicaría la saturación del producto final con EtO_{2}, seguido de vaporización y evacuación del EtO_{2} gaseoso. La esterilización con EtO_{2} sólo puede ser usada para materiales sólidos y no para productos que contengan fluidos, tales como la solución tampón de la columna de la presente invención. La saturación con glutaraldehído causaría fijación y entrecruzamiento de la proteína copulada y disminuiría así su función de unión. Se esperaría que la irradiación gamma rompiera la estructura tridimensional de la proteína copulada y alterara el material de matriz de la columna. Más aún, algunos países, tales como Alemania, no permiten el uso de irradiación gamma en la preparación de productos farmacéuticos. La esterilización por vapor convencional a 121ºC durante 15 minutos a 2 X bares fundiría el material de matriz de la columna, haciéndolo inadecuado para el fin pretendido, y desnaturalizaría la proteína copulada, destruyendo así su actividad de unión.

El método de la presente invención resuelve el problema de la esterilización utilizando materias primas estériles y libres de pirógenos en cada etapa de producción. El método para obtener materias primas estériles y libres de pirógenos están descritos a continuación en cada etapa y con mayor detalle en los ejemplos experimentales.

La proteína copulada a la columna puede ser Proteína A de Staphylococcus aureus o Proteína G de Streptococcus, o anticuerpos producidos contra la LDL humana, o anticuerpos producidos contra la inmunoglobulina humana.

Los ejemplos de trabajo presentados a continuación van dirigidos a columnas que contienen material de matriz que tiene anticuerpos copulados al mismo. Como los anticuerpos son proteínas complejas que poseen actividades de unión específicas, se espera que los mismos métodos podrían ser eficazmente aplicados a la producción de columnas copuladas a Proteína A o a Proteína G.

Cuando la proteína que se ha de copular al material de matriz de la columna contiene anticuerpos, los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales producidos por medios bien conocidos en animales, tales como ovejas o conejos. Los inmunógenos pueden ser inmunoglobulina (Ig) humana o LDL humana. Alternativamente, los anticuerpos unidos a las columnas pueden ser anticuerpos monoclonales producidos por medios bien conocidos usando inmunoglobulina humana o LDL humana como antígeno. El procedimiento de cribado para escoger un anticuerpo apropiado frente a Ig humana podría basarse en la selectividad por la inmunoglobulina humana que se une a células endoteliales de cerdo. Una vez determinada la secuencia de un anticuerpo monoclonal apropiado, el anticuerpo podría ser producido recombinantemente como anticuerpo de cadena doble o sencilla.

Cuando se produce el anticuerpo que se ha de copular a la columna en un animal, es especialmente importante asegurarse de que se inactive cualquier virus presente en el suero del animal. El método de la presente invención proporciona métodos para inactivar virus manteniendo al mismo tiempo altos niveles de anticuerpo funcional. Un método es el tratamiento térmico. Para explicarlo brevemente, se mezcla el suero del animal con un estabilizador, se calienta a al menos una temperatura de 60º a aproximadamente 62ºC y se mantiene a esta temperatura durante al menos 10 horas. Este procedimiento de inactivación de anticuerpos fue validado por estudios que utilizaban diversos tipos de virus de ensayo que se sabe imitan un espectro de virus patógenos en su susceptibilidad a la inactivación fisicoquímica. Otros métodos son el tratamiento con solventes/detergentes y la filtración de virus.

Una vez se ha validado el suero del animal u otra fuente de anticuerpo como libre de patógenos, se purifica preferiblemente para seleccionar los anticuerpos apropiados destinados a la copulación al producto de la columna terapéutica. Adecuadamente, la etapa de purificación implica el paso de la solución de anticuerpo sobre una primera columna, aquí llamada una "precolumna", que contiene un material de matriz que tiene albúmina copulada al mismo y luego sobre una segunda columna, aquí llamada una "columna de trabajo". Cuando se han de purificar anticuerpos anti-LDL, el material de matriz de la precolumna tiene también IgG humana, así como albúmina, copulada al mismo.

Preferiblemente, la columna de trabajo contiene un material de matriz estéril y libre de pirógenos que tiene inmunoglobulina humana o LDL humana copulada al mismo en condiciones asépticas. Se usa una columna de trabajo con una capacidad de aproximadamente 450-900 ml.

El material de matriz de la columna es esterilizado por (1) una serie de lavados con agua estéril libre de pirógenos para reducir la carga biológica, seguido de (2) esterilización por vapor a 115ºC durante al menos 20 minutos a <2 bares (hasta F_{0}=6). Todos los procedimientos de esterilización son llevados a cabo en un aislador esterilizado con recintos de guantes, colocado en una sala limpia de clase 100.000.

Adecuadamente, la columna de trabajo para la purificación de anticuerpos contra la inmunoglobulina humana contiene un material de matriz que tiene inmunoglobulina humana copulada al mismo. Preferiblemente, se purifica una preparación de un pool de inmunoglobulina humana, tal como Gammagard®S/D (Baxter, Hyland Division) para obtener IgG humana y se copula la preparación de IgG humana purificada a una matriz estéril por medio de activación con bromuro de cianógeno. Se facilita un método alternativo para la copulación que utiliza 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) como agente activante. El proceso de activación y copulación es también llevado a cabo dentro del aislador esterilizado. Alternativamente, se puede copular una mezcla de inmunoglobulinas humanas, tales como IgG, IgM, IgA e IgE, a la matriz estéril.

Adecuadamente, para la purificación de anticuerpos contra la LDL humana, se copula la matriz de la columna de trabajo a LDL humana derivada por cromatografía de afinidad del plasma de sujetos humanos.

Se purifica entonces la solución de anticuerpos destinados a copulación con la columna terapéutica por pase sobre la precolumna a la que se unen las substancias no deseadas. Se pasa entonces el eluyente de la precolumna sobre la columna de trabajo, que une los anticuerpos deseados permitiendo que las substancias no deseadas fluyan al exterior de la columna. Se realiza adecuadamente el pase sobre la precolumna y la columna de trabajo por un sistema automático instalado en una sala limpia de clase 100.000. Se usan tampones estériles para todos los procesos.

Una vez se han unido los anticuerpos deseados a la columna de trabajo y las substancias no deseadas han fluido fuera de la columna, se deben eluir los anticuerpos deseados de la columna de trabajo. Se presentan cuatro obstáculos importantes en esta etapa. En primer lugar, los anticuerpos deseados deben ser eluidos en cantidad suficiente como para hacer que la producción de las columnas terapéuticas sea práctica y efectiva en cuanto a costes. En segundo lugar, los anticuerpos deseados deben ser eluidos en un estado funcional, es decir, que sus sitios de unión deben permanecer suficientemente inalterados, de tal forma que puedan aún unirse a sus epitopos sobre las inmunoglobulinas o la LDL humanas. En tercer lugar, la solución de anticuerpo eluida resultante no debe tener un agente químico tampón que pudiera unirse por sí mismo a la matriz de la columna activada en las etapas siguientes. En cuarto lugar, los anticuerpos deben ser estables en almacenamiento durante un tiempo prolongado en el tampón de elución. En el estado actual de la técnica de la purificación de proteínas, estos cuatro requerimientos son con frecuencia mutuamente excluyentes. Es decir, que las condiciones que eluyen una cantidad suficiente de la proteína pueden inactivar la proteína (Wilchek, M. y col., en: Methods in Enzymology, Volumen 104, "Enzyme Purification and Related Techniques", Ed.: W.B. Jakoby, 1984, Harcourt Brace Jovanovich, pp. 19-34). Más aún, un tampón que eluya de manera efectiva la proteína puede no ser un tampón adecuado para un posterior procesamiento, o puede no conducir a la estabilidad de la proteína durante su almacenamiento.

Afortunadamente, se descubrieron tres tampones de elución que cumplen los anteriores requerimientos. En el curso de descubrir un tampón de elución adecuado, se probó primeramente el tampón de glicina, ya que la glicina es ampliamente usada para cromatografía de afinidad estándar. Como la glicina es un aminoácido, contiene grupos amino. Se vio que, antes de la copulación del anticuerpo de oveja eluido a la matriz de la columna activada con CNBr, la glicina tenía que ser eliminada de la solución de anticuerpo, ya que, de otro modo, tanto las moléculas de anticuerpo como las de glicina se copularían posteriormente al material de matriz de la columna destinado al producto final. La ocupación de sitios de copulación activados por la glicina desplazaría los sitios de copulación de proteína y disminuiría así la capacidad de unión a inmunoglobulina o LDL de la columna. La eliminación del tampón de glicina requería un procedimiento de diálisis que lleva tiempo para substituir la glicina con tampón carbonato.

A continuación, para evitar los grupos amino, se probó un tampón de acetato (acetato de sodio 0,10 M/NaCl 0,150 M/HCl). Sin embargo, se vio que las columnas de trabajo perdían su capacidad de unión a lo largo del tiempo. Esto era debido a la incompleta elución del anticuerpo, que hacía que una alta proporción de los sitios de unión sobre la columna de trabajo quedaran permanentemente ocupados. Fortuitamente, se descubrieron dos tampones de elución a base de citrato adecuados, así como un mejor tampón acetato. Los tampones de elución preferidos son:

(1) Citrato monosódico 5 mM/ácido cítrico 10 mM, pH 2,8.

(2) Citrato monosódico 5 mM/ácido cítrico 63 mM, pH 2,2.

(3) Acetato de sodio 5 mM/ácido acético, pH 2,8.

Se pasa el tampón de elución sobre la columna de trabajo copulada a anticuerpos y se pasan los anticuerpos eluidos a través de filtros de esterilización en línea.

Preferiblemente, se usa una columna de trabajo con una capacidad de aproximadamente 450-900 ml. Después de haber pasado 3.000-8.000 ml de tampón de elución sobre la columna de trabajo, el eluato recogido contiene un 70-100% de los anticuerpos originalmente unidos a la columna.

Los anticuerpos anti-Ig humana o anti-LDL humana recogidos son entonces copulados a un material de matriz estéril en condiciones estériles. Preferiblemente, el material de matriz es un material basado en carbohidratos, tal como Sepharose™. Otros materiales de matriz adecuados incluyen matrices autoclavables, tales como perlas, fibras y membranas compuestas de vidrio o polímeros sintéticos, tales como polimetacrilatos, poliestireno y poliamidas.

El procedimiento de copulación es llevado a cabo en un aislador esterilizado con recintos de guantes (clase 100) situado en una sal limpia de clase 100.000. Las partes internas de los aisladores son esterilizadas usando un procedimiento de nebulización de gas ultrasónico especial que emplea ácido peracético y peróxido de hidrógeno en ácido acético. Todos los materiales que entran o salen de los aisladores son estériles o están destinados a ser esterilizados por filtración.

Para llevar a cabo el procedimiento de copulación a escala práctica, se usa un recipiente de activación de acero inoxidable de gran tamaño para activar 1.800 ml de Sepharose en un lote en un aislador. Preferiblemente, se esteriliza el recipiente de acero inoxidable por nebulización de gas en el aislador. Alternativamente, el recipiente de acero inoxidable puede ser esterilizado por calor a 250ºC durante un mínimo de 2 horas.

El material de la matriz no puede ser esterilizado por calor por medios ordinarios, tales como la esterilización por vapor (121ºC, 15 minutos, 2 bares), ya que el material se fundiría. Este problema fue resuelto por una serie de prelavados con una solución estéril llevados a cabo en aisladores, hasta alcanzar una carga biológica muy baja. Se embotella entonces el material de la matriz de la columna prelavado y se trata con vapor a una temperatura inferior, según se describe en el Ejemplo 4 más adelante.

Se activa entonces el material de matriz estéril libre de pirógenos por incubación con una solución de bromuro de cianógeno según se describe en el Ejemplo 5 más adelante.

Una vez se ha activado el material de matriz de la columna, se copulan los anticuerpos a la columna por incubación con la matriz activada (Ejemplo 5).

Alternativamente, para la activación y la copulación simultáneas, se combina la solución de anticuerpo con 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) en el recipiente de reacción y se deja incubar durante la noche a temperatura ambiente (Ejemplo 5).

Una vez acabado el procedimiento de copulación, se lava extensamente el material de matriz que tiene anticuerpos copulados al mismo y se estudia en cuanto a éster de cianato, esterilidad y pirogenicidad. Se estudia también el material de matriz copulado en cuanto a la proteína unida total y en cuanto a la actividad de unión de la proteína copulada. Se introduce entonces el material de matriz copulado en condiciones asépticas en envueltas de vidrio silanizado estériles y despirogenadas para formar columnas copuladas a proteína estériles y libres de pirógenos.

Así, la presente invención proporciona métodos para producir columnas estériles y libres de pirógenos copuladas a proteína que conserva su actividad de unión deseada. Las columnas estériles y libres de pirógenos son adecuadas para uso en sujetos humanos que necesiten la eliminación de substancias predeterminadas de la sangre. Más aún, el método es práctico para producir las columnas a gran escala, preferiblemente al menos aproximadamente 40.000 columnas al año o más.

Se ofrecen los siguientes ejemplos experimentales a modo de ilustración de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Producción e inactivación vírica de soluciones de anticuerpos anti-Ig humana y anti-LDL humana

Se llevó a cabo la producción de plasma de oveja inmunizada según las Buenas Prácticas de Laboratorio aprobadas por el gobierno local de Heidelberg, Alemania. Se mantuvo el rebaño de ovejas machos sanas en un prado especial aislado de otros animales. Se suplementó su alimento a base de hierba natural aportando alimento nutricional adicional sin harina animal. Todas las ovejas fueron examinadas rutinariamente por un veterinario cualificado, que siguió procedimientos escritos para el cuidado de los animales. Se puso a la oveja recién introducida primeramente en cuarentena durante un mínimo de tres semanas y se estudió serológicamente (búsqueda de anticuerpos para Brucella melitensis, Leptospira, Listeria monocytogenes y el virus de la Enfermedad del Borde). Se hizo una prueba adicional para anticuerpos frente al virus Maedi Visna cada seis meses por un total de tres pruebas.

Se produjeron antisueros policlonales dirigidos contra la inmunoglobulina humana ínyectando a las ovejas un inmunógeno de IgG humana preparado a partir de un pool de fracciones plasmáticas humanas de inmunoglobulina (Gammagard S/D™, Baxter Hyland), junto con adyuvante completo de Freund.

Se produjeron antisueros policlonales dirigidos contra la LDL humana inyectando a las ovejas un inmunógeno compuesto por adyuvante completo de Freund y LDL purificada por cromatografía de afinidad del plasma de sujetos humanos. Se hizo un riguroso estudio selectivo de los sujetos que donaron LDL y se les monitorizó después de la donación en cuanto a virus importantes de origen sanguíneo. Más aún, el período de mantenimiento entre la recogida de la LDL y su primer uso fue de un mínimo de 6 meses. Así, cualquier LDL donada de sujetos que dieran positivo a virus durante este tiempo podía ser rechazada antes de la salida del producto.

Los animales recibieron inyecciones iniciales y de refuerzo de inmunógeno. Se obtuvo plasma de los animales inmunizados por plasmaféresis rutinaria usando un dispositivo separador de células equipado con conjuntos de tubos desechables estériles y libres de pirógenos. Se anticoaguló el plasma de las ovejas con ACD. Se imprimaron los conjuntos de tubos desechables con solución de cloruro de sodio estéril libre de pirógenos. Se recogió el plasma mediante un sistema de tubos cerrados en paquetes de transferencia estériles libres de pirógenos (Baxter/Fenwal) y se congelaron inmediatamente a aproximadamente -20ºC (rango -18ºC a -30ºC). Se guardó el plasma congelado hasta la siguiente etapa de procesado.

Alternativamente, se pudieron producir anticuerpos monoclonales contra inmunoglobulina humana inyectando primeramente ratones con un antígeno apropiado, tal como una cadena ligera kappa o lambda humana. Se pudieron producir anticuerpos monoclonales contra la LDL humana inyectando primeramente a los ratones una preparación purificada de LDL. Se pudieron fusionar entonces las células esplénicas de los ratones inmunizados con células de mieloma para formar hibridomas productores de anticuerpos (Köhler, G. y Milstein, C., 1975, Nature 256: 495-497).

Con objeto de seleccionar anticuerpos monoclonales para copularlos a una columna útil para preparar a un sujeto para un trasplante de un órgano de cerdo, se podrían cribar los anticuerpos monoclonales anti-Ig humana segregados en un ensayo de tipo ELISA de células endoteliales porcinas como sigue: (1) se prepararían placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos con un revestimiento de células endoteliales porcinas; (2) se incubarían las células endoteliales porcinas con inmunoglobulina humana para permitir que los anticuerpos humanos anti-cerdo se unieran a las células de cerdo; (3) se eliminaría por lavado la inmunoglobulina humana que no se une a las células de cerdo; (4) se incubarían medios acondicionados de hibridomas monoclonales individuales en los pocillos para permitir que los anticuerpos monoclonales se unieran a los anticuerpos humanos anti-cerdo, que a su vez se unirían a las células de cerdo en los pocillos; (5) se añadirían marcadores para los anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos de oveja anti-ratón conjugados con fluoresceína; (6) se considerarían los pocillos que fluorescieran brillantemente positivos para el contenido en un anticuerpo monoclonal que se une a inmunoglobulina humana, que a su vez se une a las células de cerdo.

Se podrían cribar los anticuerpos segregados anti-LDL humana en un ELISA basado en placas ELISA unidas a LDL.

De este modo, se identificarían uno o más anticuerpos monoclonales apropiados para producción a gran escala. Estos anticuerpos monoclonales podrían ser entonces purificados por cromatografía de afinidad, seguido de cromatografía de intercambio iónico, y copulados al material de matriz de la columna según se describe a continuación.

Una vez identificado y secuenciado el anticuerpo monoclonal apropiado, sería entonces posible producir anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos de cadena múltiple o única. En otra realización de la invención, estos anticuerpos recombinantes podrían copularse al material de matriz de la columna. Se podrían producir anticuerpos recombinantes de cadena múltiple según los métodos descritos en la Patente EE.UU. Nº 4.816.397 (Boss y col.). Se podrían producir anticuerpos recombinantes de una sola cadena según los métodos descritos en la Patente EE.UU. Nº 4.946.778 (Ladner y col.).

Cuando se producen los anticuerpos como monoclonales o por ingeniería genética, es posible controlar estrechamente su esterilidad. Sin embargo, cuando el anticuerpo que se ha de copular a la columna es producido en un animal, es especialmente importante asegurarse de que cualquier virus presente en el suero del animal quede inactivado.

En el caso de los antisueros policlonales producidos en ovejas antes descritos, se realizaron los siguientes procedimientos en condiciones asépticas usando instrumentos, productos plásticos y soluciones estériles y libres de pirógenos. Se recalcificó el pool plasmático por adición de 1-10 \mul de solución de CaCl_{2} (1 mol/l) por ml de suero y agitando a temperatura ambiente durante la noche. Se separó luego el coágulo plasmático por centrifugación.

Se preparó el suero animal para el tratamiento térmico inactivador de virus mezclando con un estabilizador consistente en sacarosa (30% p/p) y ácido ascórbico (5 mmol/l). Se introdujo entonces el suero estabilizado en bolsas vacías, se calentó a una temperatura de al menos 60º a aproximadamente 62ºC y se mantuvo a esta temperatura durante al menos 10 horas. Se filtró el suero tratado con calor en bolsas vacías a través de un filtro de transfusión de 20 \mum. Se sellaron las bolsas llenas asépticamente, se marcaron y se guardaron a -20ºC (rango de -18º-30º).

Se validó este proceso de inactivación vírica, así como los procesos posteriores, contaminando con tres virus modelo antes de cada etapa de producción y estudiando luego cualquier resto de virus infectivo. Estos 3 virus modelo (virus de la polio humano tipo 2, adenovirus humano tipo 2 y virus maedi visna ovino) representaban un espectro de virus humanos y animales con diferentes propiedades fisicoquímicas. El virus maedi-visna de la oveja es un lentivirus (retrovirus). Los adenovirus son grandes virus de ADN y, al igual que otros virus no envueltos, tienden a ser más resistentes que los virus envueltos a la inactivación fisicoquímica. El polivirus es un pequeño virus de ARN que es particularmente resistente a muchos procesos fisicoquímicos, incluyendo el uso de tampones de bajo pH, que se usan en varias etapas a continuación. En procedimientos que implican a productos de sangre humana, se contaminó con un herpesvirus en lugar de con el adenovirus. También se realizaron estudios de inactivación específicos en productos de sangre humana para el HIV.

Como nivel extra de precaución, se pueden emplear otros dos procedimientos de inactivación vírica, el tratamiento con solvente/detergentes y la filtración de virus. El tratamiento con solvente/detergentes pretende la inactivación de virus envueltos en lípidos. Se ajusta primeramente el pH de la solución del producto a pH 4,5. Se añaden entonces los solvente/detergentes Twen®80 (0,3%), Triton®X-100 (1,0%) y fosfato de tri-n-butilo (0,3%) a la solución del producto. Después de la adición de los reactivos solvente/detergentes, se agita la mezcla durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente.

La filtración de virus elimina virus por filtración de flujo tangencial. La membrana usada es Viresolve™180, de Millipore. El tamaño de poro de la membrana excluye moléculas mayores de 180 kD. Primeramente, se aclara la membrana con agua estéril para eliminar la solución de almacenamiento. Se autoclava luego durante 60 minutos a 121ºC. Antes de la filtración del virus, se equilibra la membrana con tampón de equilibración. Primeramente, se filtra un 90% del volumen de la solución de producto por filtración por flujo tangencial a través de la membrana. Siguiendo la filtración inicial, se realiza una diafiltración. Se diluye el 10% restante de la solución de producto con 1 parte en volumen de tampón de equilibración. Se realiza esta etapa de diafiltración 4 veces. Después de completarse la filtración, se limpia la membrana y se estudia en cuanto a su integridad por la "Prueba CORR".

Después de la etapa de inactivación del virus, se congela de nuevo el pool de suero como antes. La siguiente etapa en el procesamiento del pool de suero implica la circulación sobre dos columnas de vidrio conocidas como precolumna y columna de trabajo. En el caso del suero anti-LDL, la precolumna contiene Sepharose™ copulada a Ig humana y albúmina humana y la columna de trabajo se copula a LDL humana. En el caso del suero anti-Ig humana, la precolumna contiene Sepharose™ copulada a albúmina humana y la columna de trabajo se copula a Ig humana.

Ejemplo 2 Preparación de la precolumna y de la columna de trabajo

Todas las etapas fueron llevadas a cabo en condiciones asépticas.

Precolumna para anti-LDL: Se copularon seroalbúmina humana e IgIV (Gammagard®S/D, Baxter Hyland Division) a Sepharose™ esencialmente como se describe a continuación.

Precolumna para anti-Ig humana: Se copuló seroalbúmina humana a Sepharose™ esencialmente como se describe a continuación.

Columna de trabajo para anti-LDL: Se obtuvo LDL por cromatografía de afinidad a partir del plasma de sujetos como se ha descrito antes y se copuló a Sepharose™ como se describe a continuación.

Columna de trabajo para anti-Ig humana: Se disolvió una preparación de un pool de inmunoglobulina humana (Gammagard®S/D, Baxter, Hyland Division) en tampón (140 g de Gammagard®/100 ml de tampón). Se sometió el Gammagard™ disuelta a ultrafiltración para eliminar la glicina, ya que se vio que la glicina altera la separación cromatográfica de la IgG con respecto a la albúmina. Gammagard® contiene típicamente, por 10 g de liofilizado, 4.500 mg de glicina/100 ml. El objetivo era reducir el contenido en glicina a menos de 960 mg/l, lo que requería seis etapas de ultrafiltración. Para la ultrafiltración, se diluyó el Gammagard® con tampón estéril a 5.000 ml, se concentró la solución a 1.000 ml y se repitieron las etapas 5 veces más. Se pasó entonces la solución de Gammagard® a través de un filtro de esterilización de 0,2 \mum.

Se aisló IgG humana de Gammagard® usando dos etapas en gradiente de cromatografía de intercambio iónico (300 ml de Q-Sepharose™ Fast Flow empaquetada en una columna de XK50/30; altura de la columna aprox. 14 cm, diámetro 5 cm; Pharmacia) a 2-8ºC. Se estudió la pureza de la IgG aislada usando electroforesis en gel SDS.

La siguiente etapa consistía en copular la IgG al material de matriz de la columna. Sin embargo, se descubrió que el TRIS y la glicina residual en la solución de IgG purificada alteraban la copulación de IgG al material de matriz de la columna. Para resolver este problema, se ideó un procedimiento de ultrafiltración en 11 etapas para reducir el contenido en TRIS a menos de 211 \mug/l y el contenido en glicina a menos de 35 \mug/l. Se llevó el volumen de la solución de IgG a 5.000 ml con tampón de carbonato de sodio estéril a pH 9. Se concentró la solución por ultrafiltración con agitación constante a 1.000 ml y se repitió el procedimiento 10 veces. Después de la 10ª etapa, se redujo la solución a 2.000-2.500 ml. Se analizó entonces la solución en cuanto al contenido en proteína, TRIS y glicina y se esterilizó por filtración en un aislador. La solución estaba a un pH de 9 en esta etapa.

Alternativamente, se pudo copular una mezcla de inmunoglobulinas humanas, tales como IgG e IgM, a la matriz estéril.

Se esterilizó el material de matriz, se activó y se copuló a la solución proteica apropiada según se describe a continuación para la preparación de las columnas terapéuticas.

Resultados: Se copularon al menos 15 g (rango 10-20 g) de IgG humana a 350 g (rango 300-400 g) de material de matriz para conseguir suficiente capacidad de unión para la columna de trabajo.

Ejemplo 3 Purificación estéril de anticuerpos anti-Ig humana

Se descongeló el pool de suero pasteurizado del Ejemplo 1 y se le hizo circular sobre dos columnas de vidrio, una que contenía Sepharose CD4B copulada a albúmina (precolumna) y otra que contenía Sepharose CL4B copulada a IgG (columna de trabajo).

Se llevó a cabo el proceso de carga del suero y de lavado de la columna por un sistema cromatográfico automatizado cerrado (sistema BioPilot™, Pharmacia) en una sala limpia de clase 100.000 a una temperatura ambiente de 2º-8ºC. El sistema BioPilot™ estaba bajo control permanente de la carga biológica, se hicieron rondas CIP (procedimiento de limpieza in situ) rutinariamente y, durante los tiempos de pausa más largos, se llenaron la precolumna y la columna de trabajo con solución de azida de sodio al 0,1%.

Las conexiones del sistema a los recipientes del suero de oveja, los tampones estériles y los filtros estériles fueron preparados en condiciones asépticas con conjuntos de tubos de plástico desechables, estériles y libres de pirógenos especialmente diseñados.

Al comienzo de cada ronda, se puede diluir el suero hasta 5.000 ml con tampón PBS estéril. Se pasó entonces la solución del suero automáticamente sobre la precolumna, seguido de pase automático sobre la columna de trabajo.

Una vez los anticuerpos deseados se hubieron unido a la columna de trabajo y las substancias no deseadas hubieron fluido al exterior de la columna, se efluyeron los anticuerpos deseados de la columna de trabajo. Preferiblemente, después de haber pasado 3.000-8.000 ml de tampón de elución, el eluato recogido contenía un 70-100% de los anticuerpos originalmente cargados en las columnas.

Se consiguieron resultados óptimos sólo después de haber descubierto los tampones de elución preferidos. En las Tablas 1-3 siguientes, se muestran los experimentos de laboratorio usando diversos tampones de elución.

TABLA 1 Rendimiento de anticuerpo de oveja eluido usando diferentes tampones de elución

1

	\begin{minipage}[t]{148mm} El porcentaje de rendimiento se relacionaba con la cantidad de anticuerpo eluido con tampón acetato (Baxter) (100%).\end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{148mm} * A pesar de la elución efectiva de los anticuerpos, un mayor análisis mostró que los anticuerpos se agregaban en un corto período de tiempo. Por esa razón, se excluyeron ambos tampones de otros experimentos.\end{minipage}

TABLA 2 Estabilidad del anticuerpo aislado

2

3

	\begin{minipage}[t]{145mm} Distribución por tamaños del anti-IgG humana de oveja después de almacenar a 2-8^{o}C en diferentes tampones de elución.\end{minipage}
	Criterios para los anticuerpos almacenados:
	\Sigma monómeros más dímeros \geq 90%.
	Ác. ac. = Ácido acético.

TABLA 3 Capacidad de unión de Ig-columnas de trabajo Therasorb® tras regeneración

4

Resultados: Se vio que el tampón de glicina era inadecuado, ya que los grupos amino de la glicina en la solución de anticuerpo eluido se copulaban al material de matriz activado en la etapa de copulación siguiente. Por lo tanto, con el tampón de glicina, se requería una etapa de diálisis prolongada para intercambiar la glicina con el carbonato. La formulación de acetato original era también inadecuada (acetato de sodio 0,10 M/NaCl 0,150 M/HCl, pH 2,8). Utilizando tampón glicina o la formulación de acetato original, la cantidad de anticuerpo eluido de la columna de trabajo disminuyó a lo largo del tiempo, haciendo que el proceso fuera relativamente ineficaz y costoso. Sin embargo, se descubrieron tres formulaciones tampón que podían eluir eficientemente los anticuerpos deseados reteniendo al mismo tiempo su capacidad de unión. Más aún, la presencia de estos nuevos componentes tampón no afectó de forma adversa a las posteriores etapas de producción. Los tres tampones preferidos de elución y almacenamiento son:

(1) Citrato monosódico 5 mM/ácido cítrico 10 mM, pH 2,8.

(2) Citrato monosódico 5 mM/ácido cítrico 63 mM, pH 2,2, que resultó ser adecuado para la regeneración de las columnas de trabajo, pero menos adecuado para el almacenamiento de anticuerpos a largo plazo.

(3) Acetato 5 mM/ácido acético, pH 2,8.

Se valoró la estabilidad de los anticuerpos almacenados por la cantidad de monómeros y dímeros intactos en comparación con los fragmentos. Después de un período de almacenamiento de 77 días a 2-8ºC, el contenido de monómeros y dímeros en el tampón (1) era del 93%, en comparación con el 86% en la formulación de acetato previa (acetato de sodio 0,10 M/NaCl 0,150 M/HCl, pH 2,8).

La capacidad de unión de las columnas utilizadas aumentaba mucho, en un 33%-67%, mediante la regeneración con los tampones (1) o (2) anteriores.

Durante el proceso de elución, se pasaron los anticuerpos eluidos a través de filtros de esterilización (0,2 \muM) en línea y se recogieron en bolsas receptoras desechables, estériles y libres de pirógenos y se guardaron a 2-8ºC.

Con objeto de concentrar las soluciones de anticuerpos, se realizó una etapa ultrafiltración en una sala limpia de clase 100.000 con una membrana de 10.000 kD (serie Omega, poliéter sulfona de baja unión, Filtron Technology Corporation). Típicamente, se concentró la solución de anticuerpo aproximadamente 20-80 veces, o de aproximadamente 50-200 litros a aproximadamente 2,5 litros. Se tomaron muestras de los anticuerpos procesados en condiciones asépticas para monitorización durante el proceso después de la etapa de ultrafiltración.

En este punto, el eluato concentrado contenía aproximadamente un 74-97% de los anticuerpos originalmente unidos a la columna.

Ejemplo 4 Preparación del material de la matriz de la columna estéril libre de pirógenos

Se hizo que el material de la matriz de la columna fuera estéril y estuviera libre de pirógenos por una serie de prelavados, seguidos de esterilización por vapor. Se llevó a cabo el procedimiento en el interior de un aislador esterilizado.

Aproximadamente dos días antes de iniciar este procedimiento, se introdujo un material de masa de agarosa (Sepharose™ CL4B) asépticamente en un vaso de precipitados de 5 litros estéril y libre de pirógenos para que sedimentara por gravedad durante la noche. Al segundo día, se comprobó el volumen de la Sepharose™ para un mínimo de 2.100 ml de gel sedimentado (= 6 botellas @ 350 ml) por vaso de precipitados de 5 litros. Se reguló asépticamente el volumen de Sepharose™ y se dejó que volviera a sedimentar de ser necesario.

Trabajando con el aislador, se lavó cada lote de Sepharose™ con un volumen total de 21 litros mínimos de agua estéril y libre de pirógenos, en etapas de 4.500 ml cada una. Entre cada etapa, se secó completamente la Sepharose™ a vacío. Se introdujo entonces la suspensión lavada final en botellas de 500 ml y se cerraron éstas con tapones de caucho.

Se tomaron muestras para la determinación de la carga biológica. [Se realizó la prueba de la carga biológica en varios puntos del proceso de producción a H30, Figura 1]. Se requería que la prueba de la carga biológica mostrara que no había bacterias entéricas, que no había Pseudomonas aeruginosa y que no había Staphylococcus aureus; se estableció un límite de alerta de 1 bacteria aerobia/g o ml de muestra. Se evacuaron las botellas en condiciones asépticas usando una bomba de vacío manual y se cerraron herméticamente con tapones metálicos.

Se esterilizaron entonces las botellas de Sepharose™ lavada por vapor en las 72 horas siguientes a la anterior etapa de lavado. Se realizó la esterilización por vapor usando un autoclave de vapor validado a 115ºC durante un mínimo de 20 minutos a <2 bares. Se reguló el tiempo del ciclo automáticamente para que alcanzara un valor de F_{0} de 6. Después de la esterilización por vapor, se tomaron muestras para la determinación de la carga biológica y las pruebas de pirogenicidad. Se requería que la prueba de la carga biológica mostrara un máximo de 1 organismo productor de colonias/100 ml. La prueba de la pirogenicidad (prueba del lisado de amebocitos de Limulus) se basaba en la capacidad de las endotoxinas para causar la gelificación de la clara del huevo por un extracto de amebocitos. Se usó luego la prueba de la clara del huevo de Lowry para cuantificar la cantidad de endotoxina colorimétricamente a 660 nm. Se requería que el contenido en pirógenos estuviera por debajo de 0,25 UE/ml.

Ejemplo 5 Activación del material de matriz y copulación de anticuerpos

Se llevaron a cabo este procedimiento y otros procedimientos identificados anteriormente y en la Figura 1 dentro de un aislador esterilizado. Una de las principales dificultades en la utilización de aisladores para el trabajo aséptico es el proceso de esterilización del interior del propio aislador antes de comenzar el procedimiento aséptico. Un generador de vapor (La Calhene, Francia) calienta ácido peracético ("PAA") para formar un vapor y esteriliza así mediante el humo el aislador. Este método es seco, pero de acción lenta, debido a la menor actividad química y del agua y a problemas de mezcla de vapor/aire. Fortuitamente, se descubrió que una niebla nebulizada en vapor podría simplificar la esterilización del aislador reduciendo el tiempo y el esfuerzo del operador requeridos. En el método de la presente invención, el esterilizador líquido fue nebulizado en el aislador en la menor cantidad necesaria para obtener un vapor saturado y una condensación superficial. Durante la introducción y la exposición, se hizo circular al esterilizador en el aislador. El nebulizador operaba disgregando líquido en un recipiente mediante entrada de energía a frecuencias ultrasónicas. El nebulizador usado era Ultra Neb™ 99 (DE VILBISS). Se llenó el recipiente del nebulizador con 200-210 ml de ácido peracético y se conectó el tubo del nebulizador a la entrada del lado posterior del aislador. Se instaló el ventilador dentro del aislador en el embrague. Se cargó entonces el aislador con los materiales necesarios para la siguiente etapa según un patrón de carga validado. Se conectó el aire del exterior del tubo al sistema de aire usado. Se inició el proceso de nebulización con una presión en el interior del aislador de no más de 1 mm Hg. Se detuvo la nebulización cuando el contenido en PAA del nebulizador se redujo a 160 ml (captación de nebulización de 40 -50 ml). Esto fue seguido de un tiempo de mantenimiento de al menos 10 minutos. Después del período de mantenimiento, se lavó el aislador accionando el ventilador del aislador a sobrepresión del aislador (aproximadamente 4-5 mm Hg) y abriendo la abertura de salida. Para cada aislador individual, se validó un período mínimo de lavado (típicamente, un mínimo de 80-110 minutos).

Se usó un recipiente de activación de acero inoxidable para activar 1.800 ml de Sepharose™ CL4B en un lote dentro de un aislador. El recipiente de activación tuvo que ser esterilizado antes de su utilización. Al principio, se esterilizó el recipiente de acero inoxidable por calor a 250ºC-280ºC durante un mínimo de 2 horas. Sin embargo, este tratamiento creó tensiones entre el "scinter" y el cuerpo del recipiente de activación, que dieron lugar a manchas laxas o delgadas entre el "scinter" y el fondo. Por este tratamiento, el material del recipiente de activación se gastó rápidamente. Se usó en su lugar la esterilización por nebulización gaseosa.

Se instaló un aislador en una sala limpia de clase 100.000. Todos los materiales y el menaje de laboratorio fueron instalados en el aislador, cuyo interior fue entonces esterilizado por el procedimiento de nebulización ultrasónica antes descrito. Se instaló un recipiente de desechos lleno de hipoclorito de calcio para la inactivación del CNBr fuera del aislador. Se esterilizaron unidades de filtro estériles Pall™ y se instalaron en el aislador. Se usó un filtro para la filtración del agua estéril libre de pirógenos al aislador y se usó el otro para la eliminación de los líquidos de desecho al recipiente de desechos exterior.

Trabajando dentro del aislador, se lavó la Sepharose™ tres veces con agua estéril libre de pirógenos y se lavó luego y se resuspendió en acetona al 60%/agua. A continuación, se activó la Sepharose con CNBr y una solución de trietilamina (TEA). CNBr: 14-15 g de bromuro de cianógeno por 96 ml de acetona. Para la activación dentro del recipiente de acero inoxidable, se necesitaron 1.800 ml. TEA: 30 ml de trietilamina (grado analítico, Merck) en 66,2 ml de acetona al 87%. Se enfrió la suspensión de Sepharose™/acetona/agua a -18ºC y se añadió la solución de CNBr (aproximadamente 580-650 ml) en un flujo continuo a lo largo de 1 minuto. Se añadió entonces la solución de TEA (aproximadamente 580-650 ml) en un flujo continuo a lo largo de 2 minutos. Se alcanzó la temperatura de -10ºC cuando finalizó la reacción exotérmica (aproximadamente 45 segundos después de acabar la adición de TEA). Un minuto después de la adición de TEA, se añadió la solución de acetona/HCl. Acetona/HCl: 392 ml de agua estéril libre de pirógenos, 16,3 ml de HCl 5 N, 408 ml de acetona. Se activaron varias botellas de Sepharose™ una de cada vez de esta forma. Se usó la Sepharose™ activada para copulación en 3 horas, preferiblemente lo antes posible.

Se realizó una determinación de éster de cianato sobre la Sepharose™ activada usando el kit de ensayo Spectro-
quant® (Merck) antes de añadir los anticuerpos concentrados para estudiar la eficacia de la activación química.

Tras la activación, se lavó rápidamente la Sepharose™ en el recipiente de activación cinco veces en agua estéril libre de pirógenos. Esta etapa tuvo que ser realizada rápidamente para evitar la hidrólisis de grupos activos. Se transfirió entonces la solución de anticuerpo esterilizado por filtración al recipiente de activación y se agitó durante 2 horas. Al cabo de 2 horas, se lavó la suspensión de Sepharose™ 2 veces con soluciones alternantes de pH 2,8 (rango 2,2-3,0) y PBS. Se resuspendió suavemente la Sepharose™ en PBS y se lavó repetidamente usando un total de 60 litros (rango 50-200 litros) de NaCl al 0,9% por lote de recipiente de activación (aproximadamente 1.800 ml de Sepharose™). La masa de la Sepharose™ copulada a anticuerpo fue entonces introducida en botellas estériles y tapada con un tapón metálico. Se guardaron las botellas a 2-8ºC hasta la siguiente etapa de producción. Se vio que las botellas podían ser guardadas durante hasta 12 semanas.

Se estudiaron los filtros usados en cuanto a su integridad. [Se realizaron las pruebas de integridad del filtro varias veces en el proceso de producción, a saber, en H17 y H31, Figura 1]. Después de finalizar la activación y la copulación, se sometió el sobrenadante de la suspensión a otra prueba de cianuro para el cianuro residual.

A continuación, se llevó a cabo un lavado adicional con NaCl al 0,9% estéril para alcanzar un contenido en proteína no copulada en el sobrenadante inferior a 10 ng por ml. Se determinaron las cantidades de proteína unida y no unida por métodos estándar. Usando los anteriores procedimientos, era posible obtener al menos 50-100 g de anticuerpo copulado a 1.800 ml de Sepharose™ (rango 1.800-2.000 ml).

Se estudió cada lote en cuanto al contenido en proteína usando el reactivo "BCA" (ácido bicinconínico) y la absorción a 562 nm (Smith y col.,Anal. Biochemie 1985).

Un método alternativo para la activación y la copulación se basa en el uso de 1,1'-carbonildiimidazol (CDI). Este método funcionará para materiales de matriz tales como celulosa, agarosa o poliestireno, que tienen grupos hidroxilo o carboxilo a los que se pueden copular los anticuerpos. Se usa un solo recipiente de reacción para la activación simultánea del material de matriz y la copulación de los anticuerpos al material activado. El tampón de reacción es 0,1 mol/l de NaHCO_{3}, pH 8,1-8,2. Se añade CDI al recipiente de reacción a una concentración final de 6,2 mg/ml (38,2 mmol/l). Se añade la solución proteica a concentraciones de entre 400 \mug/ml y 1.000 \mug/ml. Se lleva a cabo la totalidad de la reacción a temperatura ambiente, incluyendo la incubación del material de matriz con CDI y solución de anticuerpo durante la noche durante aproximadamente 12-20 horas, preferiblemente 15 horas. Se saturan entonces los posibles grupos activos residuales lavando el material de matriz copulado a anticuerpo con 0,1 mol/l de etanolamina en 0,1 mol/l de NaHCO_{3}, pH 8,0. Finalmente, se usa un lavado con 0,1 mol/l de tampón NaOAc, pH 4,0, para destruir cualquier grupo activo libre residual. Se determina la cantidad de anticuerpo copulado al material de matriz usando el ensayo de proteínas BCA. El rendimiento de anticuerpo copulado al material de matriz depende de la razón de proteína a material de matriz en la mezcla de reacción. Con una baja razón de anticuerpo a material de matriz, se puede hasta el 100% del anticuerpo. El aumento de la razón de anticuerpo a material de matriz da lugar a cantidades absolutas mayores de anticuerpo copulado, hasta alcanzar una meseta. Después de este punto, el aumento de la razón de anticuerpo a material de matriz en la mezcla de reacción da lugar a porcentajes menores de anticuerpo copulado, probablemente debido a saturación del área superficial del material de matriz con proteína.

Ejemplo 6 Acabado del producto final

Se limpiaron las envolturas de las columnas de vidrio con vidrio sinterizado, se secaron, se silanizaron y se despirogenaron y se adaptaron después a sus montajes de conexión dentro de un aislador esterilizado.

Se introdujo la Sepharose™ copulada a proteína lavada en las envolturas de las columnas de vidrio dentro del aislador esterilizado. Se tomaron muestras para el análisis de metales pesados, para el análisis de partículas y para las pruebas de pirogenicidad y esterilidad.

Ejemplo 7 Anticuerpos monoclonales como alternativas a los anticuerpos policlonales unidos a columnas

El objeto de los siguientes experimentos era demostrar la reducción de las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM e IgA en el plasma humano usando un dispositivo de inmunoadsorción consistente en anticuerpos monoclonales covalentemente copulados a un soporte sólido. Adicionalmente, se tuvo que valorar la eliminación de las cuatro subclases de IgG.

Materiales

- Sepharose® CL-4B, Pharmacia.

- Filtros Ultrafree®-CL (límite de peso molecular nominal: 10 kD, Millipore®.

- columnas vacías Mobicol® con membrana de 10 \mum, MoBitec®.

- Anticuerpo monoclonal anti-cadena ligera \kappa humana (isotipo IgG_{1}, Maus), Biozol®.

- Anticuerpo monoclonal anti-cadena ligera \lambda humana (isotipo IgG_{1}, Maus, Biozol®.

- Kit de subclases de IgG, ICN.

- Anticuerpo IgG, IgM, IgA, incl. tampón y diluyente, Beckman.

- Solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") (pH 7,2), Baxter.

- Tampón acetato (pH 2,8), Baxter.

- Glicina (pH 2,8), Baxter.

Métodos

Se consiguió la unión de inmunoglobulinas humanas de las clases IgG (incluyendo las subclases 1-4), IgA e IgM, así como de anticuerpos xenorreactivos (IgG e IgM humanas anti-células porcinas), con una mezcla relativamente simple de anticuerpos monoclonales específicos para las cadenas ligeras \kappa de las inmunoglobulinas humanas y las cadenas ligeras \lambda de las inmunoglobulinas humanas. Se realizaron los experimentos a pequeña escala con 300 \mul de Sepharose® copulada a anticuerpo.

Copulación de anticuerpos a Sepharose® CL-4B

Se concentró una mezcla de los dos tipos de anticuerpos monoclonales (5 mg de cada uno) por centrifugación en filtros Ultrafree®-CL (2.000 g, 8ºC) a una concentración de 2 mg/ml. Antes de copular, se ajustó el pH de la solución de anticuerpo a 9,0 con tampón de hidrógeno carbonato de sodio, pH 11. La activación de Sepharose® CL-4B con bromuro de cianógeno fue realizada como se ha descrito antes. A continuación, se copularon los anticuerpos a Sepharose® durante la noche a 2-8ºC. Para la copulación, se usaron 10 mg de anticuerpos por 250 mg de Sepharose®. Después de la copulación, se lavó la Sepharose® cinco veces con tampón acetato, pH 2,8, y tampón PBS, pH 7,2, alternativamente para eliminar por lavado los anticuerpos no unidos.

Procesamiento del plasma

Después de la transferencia de la Sepharose® copulada a anticuerpo a una columna Mobicol® vacía (66,5 mm x 105 mm, volumen: 0,30 ml de medio empaquetado), se cargó plasma humano sobre ella. Se incubó el plasma durante 30 min. A continuación, se eliminó el plasma por lavado con 10 veces el volumen de la columna de PBS (3 ml).

Cuantificación de las inmunoglobulinas

Se realizó la cuantificación de las inmunoglobulinas (IgG 1-4, IgA, IgM) en plasma no tratado y en plasma procesado por medio de inmunodifusión radial ("RID").

Cuantificación de anticuerpos xenorreactivos

Se midió la reducción de anticuerpos xenorreactivos por medio de un inmunoensayo (ELISA) de células endoteliales porcinas (CEP) como describen Platt, J.L. y col., Trasplantation 49: 1000-1001, 1990. Resumiendo, se aislaron células endoteliales aórticas porcinas y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía un 20% de suero de ternera fetal (Ryan, U.S. y col., J. Tissue Cult. Methods 1986, 3). Se cultivaron las células hasta su confluencia en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc™). Se lavaron las células de los pocillos en PBS y se fijaron en 200 \mul de solución fría de glutaraldehído (0,1%) a 4ºC durante 5 minutos, seguido de lavado en solución salina equilibrada de Hank (HH). Se bloquearon los sitios de unión inespecífica de las células incubando las células en HH que contenía un 1% de seroalbúmina bovina ("BSA") durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Los sueros de control positivo eran un pool de suero humano (PSH). Se añadieron 50 \mul de los sueros control y de ensayo a los pocillos y se incubó durante 1 hora a 4ºC (para el ELISA de la IgM) o a 37ºC (para el ELISA de la IgG), seguido de 3 lavados en HH. Se añadieron 50 \mul del anticuerpo secundario a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El anticuerpo secundario para el ELISA de la IgM era anti-IgM humana de cabra conjugado a fosfatasa alcalina; el anticuerpo secundario para el ELISA de la IgG era anti-IgG humana de cabra conjugado de forma similar. Después de lavar, se reveló la reacción del marcador en dietanolamina (0,1 M con 0,5 x 10^{-3} M de MgCl_{2}) con substrato de fosfatasa (1 mg/ml de fosfato de p-nitrofenilo). Se añadió el revelador/substrato a 100 \mul/pocillo y se incubaron las placas en obscuridad a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, o hasta que el control positivo dio una lectura de absorbancia de 1-1,5 a 405 nm. Se leyeron las placas a 405 nm en un lector de placas ELISA estándar.

Resultados TABLA 4 Cuantificación de inmunoglobulinas

5

Se realizó la cuantificación por radioinmunodifusión (RID). Se estandarizaron los sueros estándar empleados según la World Health Organization.

Volumen de plasma procesado: 500 \mul.

Volumen de Sepharose®: 300 \mul.

Tiempo de procesamiento del plasma: 30 min.

Tal como se muestra en la Tabla 4, todas las clases de inmunoglobulinas y todas las subclases de IgG (1-4) se redujeron por los anticuerpos monoclonales copulados.

TABLA 5

Cuantificación de anticuerpos xenorreactivos

Parámetro	Inmunoaféresis	Reducción [%]
Anti-IgG porcina humano	Antes de IA	0,0
	Después de IA	9,7
Anti-IgM porcina humano	Antes de IA	0,0
	Después de IA	no detectable

Volumen de plasma procesado: 500 \mul.

Volumen de Sepharose®: 300 \mul.

Tiempo de procesamiento del plasma: 30 min.

El anti-IgG porcina se redujo en aproximadamente un 10%. La reducción del anti-IgM porcina no era detectable.

Discusión

Se vio que es posible reducir las inmunoglobulinas en el plasma humano no sólo por medio de anticuerpos policlonales, sino también monoclonales, copulados a un soporte sólido. Para conseguir una reducción de todas las inmunoglobulinas plasma, independientemente de su tipo y especificidad, se eligieron anticuerpos monoclonales que se esperaba las reconocieran y se unieran a todas ellas. Los dos anticuerpos de ratón (isotipo IgG_{1}) empleados eran específicos para las cadenas ligeras \kappa de las inmunoglobulinas humanas y para las cadenas ligeras \lambda de las inmunoglobulinas humanas, respectivamente. También se podían haber escogido anticuerpos monoclonales de otras especificidades epitópicas o isotipos, o anticuerpos recombinantes.

Los resultados muestran claramente que las cuatro subclases de IgG se reducían por la columna de anticuerpos monoclonales (tabla 4). Las subclases de IgG 1, 2, 3 y 4 disminuyeron cada una en aproximadamente un 30%. Como resulta obvio por la tabla 5, la reducción de anticuerpos xenorreactivos pudo ser determinada sólo para la IgG, pero no para la IgM, ya que el inmunoensayo para la determinación de la IgM es menos sensible que para la IgG.

La relativamente baja reducción de inmunoglobulinas no era sorprendente, ya que el experimento fue realizado a pequeña escala analítica, es decir, con una pequeña columna de anticuerpos (300 \mul de Sepharose®) y sólo se realizó un ciclo de plasma. Para fines clínicos, columnas mayores de anticuerpos monoclonales y la realización de varios ciclos de procesamiento del plasma darían lugar a una reducción satisfactoria de las inmunoglobulinas y de los anticuerpos deseados.

Claims

1. Un método para producir una columna estéril y libre de pirógenos que contiene un material de matriz que tiene una proteína copulada al mismo, siendo dicha columna útil para eliminar una substancia predeterminada de la sangre de un sujeto humano, cuyo método consiste en:

\bullet: disponer de una solución purificada de proteína que se una a dicha substancia predeterminada en la sangre humana, cuya solución está libre de patógenos;

\bullet: disponer de un material de matriz estéril y libre de pirógenos que esté químicamente activado, donde se hace que dicho material de matriz sea estéril y esté libre de pirógenos mediante un procedimiento consistente en las siguientes etapas:

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha solución de proteína es seleccionada entre el grupo consistente en Proteína A de Staphylococcus aureus, Proteína G de Streptococcus, anticuerpos anti-inmunoglobuli-nas humanas y anticuerpos anti-lipoproteína de baja densidad humana (anti-LDL).

3. El método de la reivindicación 1, donde dicha substancia predeterminada que se ha de eliminar de la sangre humana es seleccionada entre el grupo consistente en inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E (IgE), lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína a (Lp(a)).

4. El método de la reivindicación 1, donde dicha solución de proteína consiste en anticuerpos, siendo seleccionados dichos anticuerpos entre el grupo consistente en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y anticuerpos recombinantes producidos por ingeniería genética.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicho material de matriz de la columna es seleccionado entre el grupo consistente en perlas, fibras y membranas.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicho material de matriz de la columna es seleccionado entre el grupo consistente en vidrio, carbohidratos, polimetacrilatos y poliamidas.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicho material de matriz de columna es una agarosa.

8. El método de la reivindicación 1, donde dicha solución de proteína deriva de suero animal, que libera de patógenos mediante las etapas consistentes en:

(a) añadir a dicho suero un estabilizador consistente en un carbohidrato y un antioxidante, formando así una mezcla de suero estabilizada;

(b) calentar dicha mezcla de suero estabilizada a un rango de temperatura de al menos 60ºC a 62ºC;

(c) mantener dicho rango de temperatura durante al menos 10 horas, y

(d) filtrar dicha mezcla de suero estabilizada a través de un filtro de 20 \mum a un recipiente estéril y libre de pirógenos.

9. El método de la reivindicación 8, donde dicho carbohidrato es sacarosa a una concentración del 30% p/p y dicho antioxidante es ácido ascórbico a una concentración de 5 mmol/l.

10. El método de la reivindicación 1, donde dicha solución de proteína consiste en anti-lipoproteína de baja densidad (LDL) humana y donde dicha solución de proteína es purificada por las etapas consistentes en:

(a) obtener una primera columna estéril y libre de pirógenos que contenga un primer material de matriz que tenga albúmina humana e inmunoglobulina humana copuladas al mismo;

(b) pasar dicha solución de proteína sobre dicha primera columna en condiciones asépticas, eliminando así cualquier substancia no deseada que se una a dicho primer material de matriz;

(c) obtener una segunda columna estéril y libre de pirógenos que contenga un segundo material de matriz que tenga LDL humana copulada al mismo;

(d) pasar dicha solución de proteína de la etapa (b) sobre dicha segunda columna en condiciones asépticas, efectuando así la unión de dichos anticuerpos anti-LDL humana a dicho segundo material de matriz, y

(e) eluir dichos anticuerpos anti-LDL humana con un tampón ácido.

11. El método de la reivindicación 1, donde dicha solución de proteína consiste en anticuerpos anti-inmunoglobulina (Ig) humana y donde dicha solución de proteína es purificada por las etapas consistentes en:

(a) obtener una primera columna estéril y libre de pirógenos que contenga un primer material de matriz que tenga albúmina humana copulada al mismo;

(b) pasar dicha solución de proteína sobre dicha primera columna, eliminando así cualquier substancia no deseada que se una a dicho primer material de matriz;

(c) obtener una segunda columna estéril y libre de pirógenos que contenga un segundo material de matriz que tenga Ig humana copulada al mismo;

(d) pasar dicha solución de proteína de la etapa (b) sobre dicha segunda columna, efectuando así la unión de dichos anticuerpos anti-Ig humana a dicho segundo material de matriz, y

(e) eluir dichos anticuerpos anti-Ig humana con un tampón ácido.

12. El método de la reivindicación 10 ó de la reivindicación 11, donde dicho tampón ácido es seleccionado entre el grupo consistente en:

citrato monosódico 5 mM/ácido cítrico 10 mM, pH 2,8, y citrato monosódico 5 mM/ácido cítrico 63 mM, pH 2,2.

13. El método de la reivindicación 10 ó 11, donde dicho tampón ácido consiste en acetato 5 mM/ácido acético, pH 2,8.

14. El método de la reivindicación 1, donde dicha matriz estéril y libre de pirógenos es activada en condiciones asépticas por las etapas consistentes en:

(a) disponer de un recipiente de activación estéril y libre de pirógenos,

(b) suspender dicha matriz en acetona en dicho recipiente de activación para formar una solución de matriz/acetona,

(c) enfriar dicha solución de matriz/acetona a -18ºC,

(d) añadir una solución de CNBr,

(e) añadir una solución de trietilamina, haciendo así que se alcance una temperatura de -10ºC en el recipiente de activación, y

(f) añadir una solución de acetona/HCl, finalizando así el proceso de activación.

15. El método de la reivindicación 14, donde dicha etapa de contacto es realizada en condiciones asépticas por las etapas consistentes en:

(a) añadir dicha solución purificada de proteína a dicho recipiente de activación para formar una suspensión,

(b) agitar dicha suspensión durante 2 horas,

(c) lavar dicha suspensión con soluciones alternantes ácidas y neutras,

(d) lavar dicha suspensión con al menos 50 litros de solución salina tamponada con fosfatos (PBS) por 1.800 ml de suspensión y

(e) resuspender dicha suspensión en PBS.

16. El método de la reivindicación 1, donde dicho material de matriz estéril y libre de pirógenos es activado y contacta con dicha solución de proteína en condiciones asépticas por las etapas consistentes en:

(a) disponer de un recipiente de activación estéril y libre de pirógenos,

(b) combinar en dicho recipiente de activación dicho material de matriz estéril y libre de pirógenos con 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) y con dicha solución de proteína,

(c) incubar dicho material de matriz con dicho CDI y dicha solución de proteína a 19ºC-24ºC durante 12 a 20 horas, efectuando así la copulación de dicha proteína a dicho material de matriz,

(d) lavar dicho material de matriz con 0,1 mol/l de etanolamina en 0,1 mol/l de NaHCO_{3}, pH 8,0, saturando así los grupos activos residuales en dicho material de matriz, y

(e) añadir a dicho material de matriz 0,1 mol/l de tampón NaOAc a pH 4,0, destruyendo así los grupos activos libres residuales en dicho material de matriz que tiene dicha proteína copulada al mismo.

17. El método de la reivindicación 16, donde, en la etapa (b), dicho CDI se combina a una concentración final de aproximadamente 38,2 mmol/l en un tampón de reacción consistente en 0,1 mol/l de NaHCO_{3}, a pH 8,1-8,2, y dicha solución de proteína se combina a una concentración de 400-1.000 \mug/ml.

18. Un método para hacer que un material de matriz de columna sea estéril y esté libre de pirógenos por las etapas consistentes en:

(b): tratar con vapor dicho material de matriz a 115ºC a menos de 2 bares hasta obtener un valor de F_{0}=6.