ES2295160T3 - Proteinas que presentan una fuerte inmunorreactividad y su procedimiento de produccion. - Google Patents
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Abstract
Preparación de proteínas inmuno reactivas para la utilización terapéutica o diagnóstica, caracterizada porque el porcentaje de moléculas inmuno reactivas, determinado en un ensayo Lindmo modificado según el ejemplo 3 es > 90 % con respecto al número total de moléculas inmuno reactivas y no inmuno reactivas, no diferentes desde el punto de vista de la química de las proteínas, en la que en la proteína inmuno reactiva se trata de un anticuerpo monoclonal, quimerizado o humanizado, que se liga a un epitopo sobre CD66.
Description
Proteínas que presentan una fuerte
inmunorreactividad y su procedimiento de producción.
La invención se refiere a preparaciones de
proteínas inmuno-reactivas, con preferencia en forma
purificada, que presentan un alto porcentaje de moléculas
inmuno-reactivas con respecto al número total de
moléculas. Estas proteínas se pueden obtener a través de
fermentación de una célula que expresa la proteína
inmuno-reactiva en un reactor de lecho fluidizado y
la obtención de la proteína a partir de la célula huésped o bien del
medio utilizado para el cultivo. Las preparaciones de proteína son
adecuadas en una medida excelente para la fabricación de
composiciones diagnósticas y terapéuticas.
Las proteínas de diagnóstico y terapéuticas se
pueden expresar tanto en sistemas celulares procariónticos (por
ejemplo, E. coli (Houston y col., patente US 5.132.405)) como
también en sistemas celulares eucariónticos (por ejemplo, Pichia
pastoris, Baby Hamster Kidney (BHK) Zellen, Chinese Hamster Ovary
(CHO-)Zellen, Hybridomen, transgenen Tieren und Pflanzen (Meade y
col., patente US 4.873.316)) y se pueden purificar por medio de
procedimiento químicos de proteínas.
Los sistemas celulares procariónticos permiten,
en virtud de los medios nutritivos poco exigentes y del crecimiento
rápido del microorganismo en sistemas de fermentación poco exigentes
una fabricación de coste favorable de proteínas menores, libres de
hidrato de carbono.
Para la fabricación de (glico)proteínas
complejas que llevan hidrato de carbono, deben utilizarse, sin
embargo, los sistemas celulares eucariónticos mencionados
anteriormente, que condicionan sistemas de fermentación costosos y
la utilización de medios de cultivos celulares caros. La naturaleza
de las preparaciones de (glico)proteínas a purificar está
influenciada en este caso de una manera muy decisiva por el medio de
cultivo celular empleado y por el sistema de fermentación empleado.
Sobre todo las diferencias en la glicosilación de la proteína, que
tienen una influencia sobre el tiempo del valor medio en el plasta
así como sobre determinadas funciones efectivas biológicas de las
preparaciones de (glico)proteínas purificadas, han sido
descritas en la literatura técnica (Stahl y col., PNAS, 73 (1976),
4045-4049).
Además de la influencia mencionada anteriormente
sobre la composición de hidrato de carbono, la cantidad porcentual
de (glico)proteínas activas funcionalmente en la preparación
purificada es un factor esencial, determinante de la calidad del
producto, que puede estar influenciada de la misma manera a través
del medio de cultivo de células, las condiciones de fermentación y
los procedimientos de purificación.
Como método opcional para la determinación de la
porción de moléculas radio marcadas funcionalmente activas (por
ejemplo, MAk con región-V fisiológicamente intacta)
se utiliza el ensayo de ligazón cuantitativa, descrito por primera
vez por Lindmo y col (Immunological Methods 72 (1984), 77) en el
exceso de antígeno. Este método permite determinan
cuantitativamente la porción de MAk radio marcada
inmuno-reactiva y apta para la ligazón después de
la purificación química de la proteína. Otros ensayos de ligazón,
como el ensayo de inmuno reactividad descrito por Seitz y col.
(European Journal of Nuclear Medicine 26 (1999), 1265), en el que se
describen inmuno reactividades de hasta 100%, permiten solamente
una determinación relativa de la porción inmuno reactiva de MAk
radio marcada en comparación con el patrón no marcado y, por lo
tanto, no son adecuados para la determinación de la fracción inmuno
reactiva absoluta. También el procedimiento cromatográfico de
afinidad, descrito por Jagoda y col (Journal of Immunological
Methods 173 (1994), 191-201) para la determinación
de la inmuno reactividad solamente se puede utilizar con
condiciones en virtud del porcentaje relativamente alto de ligazón
no específica en la columna de afinidad (10-20%)
para una determinación cuantitativa de la porción inmuno
reactiva.
Pero también el ensayo-Lindmo
utilizado por la mayoría de los autores solamente es adecuado, a
pesar de la reivindicación de los autores de la generalización del
método, para la evaluación de MAk radio marcada, cuya ligazón
proporciona una meseta distinta utilizando cantidades crecientes de
antígeno. Con MAk de baja actividad o en el caso de falta de
células, que expresen altas densidades de antígenos por célula, no
se consigue con frecuencia una meseta distinta. (Mattes, M. J.,
Int. J. Cancer: 61 (1995), 286-288). Incluso en
investigaciones, en las que se consigue una meseta definida, pueden
aparecer, después de la aplicación de los valores de las curvas de
saturación de acuerdo con el método previsto por Lindmo y col., dos
rectas que se cortan, cuyo punto de intersección puede conducir con
el eje-Y a diferentes inmuno reactividades (Mattes,
M. J., Int. J. Cancer: 61 (1995), 286-288, página
287, figuras 1 B y E). En el caso de utilización del método Lindmo
debe indicarse, por consiguiente, de una manera forzosa tanto la
porción reactiva máxima ligada específicamente como también el
valor extrapolado hasta el exceso infinito de antígeno. Cuando la
diferencia entre estos dos valores es > 10%, no se puede
considerar como admisible el valor extrapolado de la inmuno
reactividad (Mattes, M. J., Int. J. Cancer: 61 (1995), 286.288,
página 288).
Teniendo en cuenta los inconvenientes de los
métodos indicados anteriormente, la cantidad porcentual de moléculas
MAk funcionalmente activas en preparaciones purificadas preparadas
con procedimientos de fermentación convencionales, como
fermentadores agitados y módulos de fibras huecas, y con
procedimientos químicos de proteínas clásicos, que contienen,
además de columnas de proteínas-A, también columnas
de intercambio de iones y en muchos casos columnas cromatográficas
de gel, en el intervalo de 40 a 80%, cuando se utiliza el ensayo
Lindmo (Mattes, M. J. Int. J. Cancer: 61 (1995), 286.288; Jagoda y
col., Journal of Immonological Methods 173 (1994),
191-201; Morales y col., Nuclear Medicine &
Biology, Vol. 26 (1999), 275-179; Boven y col.,
Blood, 67, Nº 2 (1986), 429-435). En este caso
juega igualmente un papel importante el procedimiento de radio
marcación utilizado y el radioisótopo utilizado.
Esto significa que, condicionado por la
fabricación, entre el 20 y el 60% de las moléculas MAk de estas
preparaciones no transmiten la función diagnóstica o terapéutica
deseada.
Bryunck y col. (Br. J. Cancer 67 (1993),
436-440) describen la caracterización de un
anticuerpo monoclonal bis específico humanizado para la terapia de
tumores con un brazo específico para el antígeno carcino embrionario
(CEA) y un brazo dirigido hacia el quelato radio marcado
DTPA-^{90}Y. Los anticuerpos han sido purificados
a través de un procedimiento de cromatografía de inmuno afinidad
doble. Se describe una inmuno reactividad de 95% para la MAk bis
específica no marcada radioactivamente.
El documento WO86/05202 describe un bio reactor
de lecho fluidizado y su utilización para el cultivo de células,
entre otras cosas de células de hibridoma para la obtención de
anticuerpos monoclonales. No se encuentra ninguna indicación en el
sentido de que a través del procedimiento se pueden obtener
anticuerpos con alta inmuno reactividad.
El documento
EP-A-0 727 480 describe un
procedimiento para la determinación de farmacocinética o bien toxico
cinética de substancias de ensayo con la ayuda de sistemas de
cultivo de células in vitro y como dispositivo adecuado para
ello un bio reactor de lecho fluidizado. No se encuentra ninguna
referencia a la utilización de este reactor de lecho fluidizado
para la obtención de anticuerpos monoclonales.
El documento WO 96/22310 describe la marcación
de un anticuerpo con un radio nuclido (1^{25}I). La fracción del
anticuerpo marcado inmuno reactivo se indica como 99%. No se publica
cómo se han purificado los anticuerpos descritos.
Waibel y col. (Nature Biotechnology 17 (1999),
897-901) describen preparaciones de anticuerpos de
cadenas individuales recombinantes, cuyo porcentaje de moléculas
inmuno reactivas se calcula por medio del ensayo Lindmo estándar y
se indica como 57-97%.
La excepción conocida en la literatura está
representada por el Granulozint descrito por Schubiger y col. (Eur.
J. Nucl. Med. 15: (1989), 605-608), en el que se
describe una inmuno reactividad de 93 o bien 40%, en función del
procedimiento de marcación respectivo. No obstante, esta MAk ha sido
preparada en forma de aszitas (comunicación personal). Este
procedimiento in vivo no cumple condiciones económicas ni
regulaciones modernas y debe considerarse aquí como excepción. Por
otro lado, hay que indicar aquí que el porcentaje de las moléculas
MAk que liga, en realidad, específicamente, es menor que el valor
determinado en el ensayo Lindmo. Esto está condicionado por la
ligazón no específica de MAk radio marcada en granulocitos
utilizados, por ejemplo, en el exceso de antígeno, a pesar de la
adición de un exceso molecular de 10.000 veces de MAk específica no
marcada (Schubiger y col., Euro J. Nucl. Med., 15 (1989),
605-608). Por lo tanto, el valor de inmuno
reactividad después de la substracción de la ligazón no específica
es > 90%.
En el caso de anticuerpos monoclonales
diagnósticos marcados radio activos, un inconveniente especial es
una inmuno reactividad reducida de la MAk, puesto que las moléculas
radio marcadas, que no ligan en la estructura específica de destino
circulan en la sangre, contribuyen al fondo no específico, son
absorbidas parcialmente en el hígado y dificultan la interpretación
de hallazgos de medicina nuclear. En el caso de anticuerpos
terapéuticos radio marcados, la porción de moléculas MAk no ligadas
al tejido de destino contribuye a la radiación no específica y no
deseada de tejido no de destino.
Por lo tanto, sobre todo para la preparación de
anticuerpos monoclonales radio marcados es de la máxima importancia
desarrollar procedimientos in vitro aceptables desde el punto
de vista económico y regulatorio, que permitan una fabricación de
preparaciones MAk con una porción inmuno reactiva lo más alta
posible.
Actualmente, solamente a través del empleo de
procedimientos costosos de cromatografía de inmuno afinidad y no
adecuados para una producción farmacéutica siguiente es posible
conseguir una porción inmuno reactiva muy alta. En este caso, las
moléculas funcionalmente activas se separan de las moléculas
funcionalmente inactivas, que no se diferencian de las moléculas
activas desde el punto de vista de la química de las proteínas, a
través de la ligazón de columnas de antígenos y de esta manera
también se concentran. A pesar del alto gasto en la fabricación de
los reactivos necesarios para la cromatografía de inmuno afinidad
así como a las pérdidas grandes en la purificación, el porcentaje
de MAk funcionalmente activa en tales preparaciones utilizadas para
fines de investigación es > 81%.
Para poder medir con seguridad tanto la porción
inmuno reactiva de MAk no marcada como también de MAk radio marcada
de una manera no influenciada por ligazones no específicas, se ha
desarrollado un "ensayo Lindmo modificado", que se ha descrito
en detalle en el ejemplo 3. En este ensayo Lindmo modificado, el
porcentaje de moléculas MAk que ligan de forma no específica (como
se encuentra, por ejemplo, según la radio marcación en la presencia
de un exceso de 10.000 veces de MAk fría, Schubiger y col., Euro J.
Nucl. Med. 15 (1989), 605-608) no influye sobre el
valor calculado de la inmuno reactividad.
En el marco de los trabajos para la optimización
de la fabricación del procedimiento de producción para el
anticuerpo monoclonal BW 250/183 (Eur. J., Nucl. Med. 14 (1988),
523-528 e Int. J. Cancer 36 (1985),
75-84) se ha encontrado de una manera sorprendente
la formación de un procedimiento de fermentación, que genera
sobrenadantes de cultivo celular, que contienen MAk, cuya inmuno
reactividad en el ensayo Lindmo modificado es, en general, >
95%.
A partir de estos sobrenadantes de cultivo
celular se pueden preparar, utilizando procedimientos de
purificación convencionales, preparaciones de MAk (llamadas también
GMP), que tienen una inmuno reactividad entre 80 y 90%. La pérdida
de inmuno reactividad que se puede observar aquí de aproximadamente
10% en el curso de la purificación está condicionada por la
pluralidad de etapas de cromatografía de columna.
Además, se ha conseguido desarrollar un
procedimiento de purificación "pobre de columna", que permite
fabricar preparaciones MAk (llamadas también GMP), que tienen en el
ensayo Lindmo modificado una inmuno reactividad, que no se
diferencia en una medida significativa de la inmuno reactividad de
las moléculas MAk no purificadas en el exceso de cultivo celular
(pérdida de aproximadamente 1-2%).
Estos procedimientos se pueden aplicar a una
pluralidad de MAk de diferente especificidad y composiciones
químicas de proteínas así como a otras proteínas inmuno reactivas y
conducen también en estos casos a resultados comparativamente
sorprendentes.
Por lo tanto, la invención se refiere a una
preparación de proteínas inmuno reactivas, en la que el porcentaje
de moléculas inmuno reactivas, determinado de acuerdo con el ejemplo
3 en un ensayo Lindmo modificado, es > 90% y con preferencia
> 95% con respecto al número total de moléculas, tratándose en la
proteína inmuno reactiva de un anticuerpo monoclonal, quimerizado o
humanizado, que se liga a un epitopo en CD66. Las proteinmuno
reactivas se pueden obtener a través de la preparación en cultivo
celular, especialmente de células huésped eucariónticas. Las
proteínas inmuno reactivas se pueden acoplar sin pérdida de
actividad con una marcación, especialmente con una marcación radio
activa.
Las proteínas inmuno reactivas en el sentido de
la presente invención son anticuerpos monoclonales, anticuerpos
quimerizados, humanizados.
Las preparaciones de proteína de acuerdo con la
invención se pueden obtener a través de fermentación en un reactor
de lecho fluidizado. En un reactor de lecho fluidizado de este tipo
crecen las células huésped cultivadas, por ejemplo células de
hibridoma u otras células eucariónticas, en densidad muy alta sobre
bolas de vidrio y se pueden alimentar de una manera óptima con
oxígeno y substancias nutritivas. Las células muertas se desprenden
de las bolas de vidrio y se retiran continuamente con el medio
recogido desde el sistema de fermentación. En este caso, las
cantidades de proteasas y de restos de células se pueden mantener
reducidas en el sistema de fermentación y se puede garantizar la
integridad de la proteína generada. Un ejemplo de un reactor de
fermentación de lecho fluidizado adecuado es el bio reactor Pilot B
500 (Papaspyrou Biotechnologie GmbH).
La medición de la inmuno reactividad de las
preparaciones de proteína de acuerdo con la invención se realiza a
través del ensayo Lindmo modificado descrito en el Ejemplo 3. En la
realización de este ensayo es esencial que el material que contiene
antígeno se emplee en exceso, con el fin de ligar cuantitativamente
la proteína inmuno reactiva, por ejemplo la Mak. Por otro lado, es
importante que el material que contiene antígeno contenga una
cantidad suficiente de epitopos, para que se puedan omitir los
efectos de adsorción no específicos, condicionados por superficies
grandes. Así, por ejemplo, se prefieren densidades de epitopos de
> 10^{4} por célula fijada. El punto de lectura para la inmuno
reactividad es en este caso aquel punto, en el que una Mak de
control (del mismo isotipo que la Mak de ensayo, pero de región de
ligazón irrelevante) no muestra ninguna adsorción no específica
significativa.
A continuación se describen, además del
procedimiento de fermentación de acuerdo con la invención y del
procedimiento de purificación "pobre de columna" de acuerdo
con la invención, también las preparaciones de proteína obtenidas
de acuerdo con la invención así como su utilización ventajosa como
diagnóstico y terapéutico.
Los dos procedimientos de fabricación I y II de
acuerdo con la invención constan, respectivamente, de dos
secciones, que se pueden dividir en varias etapas individuales:
- 1.
- Descongelación de células a partir de un banco de células y cultivo, por ejemplo en botellas T
- 2.
- Expansión de las células, por ejemplo en cultivos de hiladores
- 3.
- Fermentación en el reactor de lecho fluidizado
- 1.
- Recogida del medio de cultivo de células, separación de las células, por ejemplo a través de micro filtración, filtración estéril y almacenamiento, por ejemplo a -20ºC.
- 2.
- Concentración, por ejemplo a través de precipitación en sulfato de amonio y centrifugación siguiente.
- 3.
- Disolución: inactivación del virus por medio de tratamiento con detergente; filtración estéril.
- 4.
- Cromatografía de afinidad con proteína A o sistema de afinidad comparable.
- 5.
- Concentración, por ejemplo a través de precipitación en sulfato de amonio y centrifugación siguiente.
- 6.
- Disolución; transformación por medio de cromatografía de gel.
- 7.
- Cromatografía de intercambio de aniones.
- 8.
- Concentración, por ejemplo a través de precipitación en sulfato de amonio y centrifugación siguiente.
- 9.
- Disolución; transformación por medio de cromatografía de gel.
- 10.
- Ajuste de la concentración final deseada del volumen.
- 11.
- Filtración estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Descongelación de células a partir de un banco de células y cultivo, por ejemplo en botellas T
- 2.
- Expansión de las células, por ejemplo en cultivos de hiladores
- 3.
- Fermentación en el reactor de lecho fluidizado
- 1.
- Recogida del medio de cultivo de células, separación de las células, por ejemplo a través de micro filtración, filtración estéril y almacenamiento, por ejemplo a -20ºC.
- 2.
- Descongelación del cultivo estéril y libre de células; recogida, seguida por micro filtración y ultra filtración.
- 3.
- Dilución.
- 4.
- Tratamiento con detergente.
- 5.
- Cromatografía de afinidad con proteína A o sistema de afinidad comparable.
- 6.
- Dilución y filtración estéril.
- 7.
- Adsorción de membrana de intercambio de aniones.
- 8.
- Filtración del virus por medio de ultra filtración.
- 9.
- Ultra filtración y diafiltración.
- 10.
- Filtración y dilución.
- 11.
- Filtración estéril.
Las etapas de fabricación individuales mostradas
anteriormente son conocidas metodológicamente por el técnico
(biólogos celulares/químicos de proteínas) y no requieren una
descripción más detallada. A pesar de todo, el procedimiento se
describe en detalle en el Ejemplo 2.
En el procedimiento de fabricación I solamente
es nueva la fermentación en el reactor de lecho fluidizado en
combinación con un procedimiento de purificación convencional.
De una manera sorprendente, la inmuno
reactividad de la MAk en sobrenadantes de cultivos de células no
purificados (botellas T, reactor de lecho fluidizado) es > 90%
en el ensayo Lindmo modificado. Después de la purificación
convencional se consiguen inmuno reactividades de > 80%.
En el procedimiento de fabricación II es nueva
la fermentación por medio del reactor de lecho fluidizado en
combinación con el procedimiento de purificación "pobre de
columna", en el que solamente se utiliza una cromatografía de
columna (cromatografía de afinidad en proteína A). Todas las demás
etapas representan etapas de filtración cuidadosas a través de
membranas o etapas de dilución sencillas. A pesar de todo, con el
procedimiento se cumplen los requerimientos establecidos por las
autoridades de autorización con respecto a la pureza química de la
proteína y el empobrecimiento/inactivación del virus.
Sorprendentemente, la inmuno reactividad de la
(glico) proteína a fabricar, por ejemplo de una Mak, es en todas
las etapas ensayadas (botellas T, reactor de lecho fluidizado,
proteína purificada) > 90% en el ensayo Lindmo modificado de
acuerdo con el Ejemplo 3, la mayoría de las veces incluso 95%, como
se muestra a modo de ejemplo en el Ejemplo 1 para la MAk BW
250/183. Según nuestros conocimientos con ninguno de los
procedimientos de fabricación in vitro descritos en el estado
de la técnica se han conseguido valores de inmuno reactividad
comparativos altos.
Se han encontrado valores de inmuno reactividad
similares altos con el procedimiento de acuerdo con la invención
para otras MAk, como por ejemplo la MAk BW 431/26 (selectiva para
CD66e) (Eur. J. Nucl. Med. 14 (1988) 523-528 e Int.
J. Cancer 36 (1985), 75-84), MAk BW 278/105
(selectiva para una subpoblación de FBI RAG) (J. Histochem.
Cytochem. 34 (1986), 209-214), MAk BW 575/931
(selectiva para N-CAM) (Pediatr. Hematol. Oncol. 6
(1989), 73-83) y MAk YTH 24.5 (selectiva para CD45)
(J. Immunol. 134 (1985), 3056-3061) y Leucocyte
Typing III: White Cell Differentiation Antigens (editores Mc
Michael y col.), Oxford University Press, Oxford, páginas
788-803) así como algunas de las Mak descritas en
la solicitud de patente alemana 197 44 531.4 (selectivas para el
complejo receptor VEGF/VEGF, pero ni ligan en VEGF ni en el
receptor VEGF solo). Estos hallazgos documentan que los
procedimientos de fabricación de acuerdo con la invención permiten
fermentar (glico) proteínas, que son inmuno reactivas
aproximadamente hasta 100% y purificarlas de una manera cuidadosa y
rápida, en el caso del procedimiento de fabricación II incluso sin
pérdidas apreciables de inmuno reactividad con un coste
favorable.
Por otro lado, los procedimientos de fabricación
se pueden emplear para la fabricación acorde con GMP de una
pluralidad de (glico) proteínas, que no tienen
partes-Fc, entre otros para la proteína de fusión
descrita por Bosslet y col. (British Journal of Cancer, 645 (1992),
234-238), en la que en lugar de la cromatografía de
afinidad de proteína A, se emplea un procedimiento alternativo de
cromatografía de afinidad (anti-idiotipo, columna
de lecitina, Proteína L, ácido de níquel, etc.).
Además de la inmuno reactividad, se realizan en
las etapas de fabricación respectivas una pluralidad de controles
de calidad (esterilidad, contenido de ADN, contenido de proteínas,
especificidad, valor-pH, composición de la
proteína), que permiten ensayar las propiedades microbiológicas,
inmunológicas y químicas de la (glico) proteína (MAk) a fabricar.
No se describen aquí estos ensayos, puesto que son estado de la
técnica.
Además, la invención se explica en detalle a
través de los ejemplos siguientes en combinación con las figuras.
En este caso:
La figura 1 muestra la descripción de un reactor
de fermentación de lecho fluidizado.
El reactor (1) está parcialmente lleno con bolas
de soporte (4), por ejemplo bolas de vidrio sinterizado de poros
abiertos con un diámetro con preferencia de 0,4 a 0,7 mm, que han
sido sometidas a un tratamiento con ácido (por ejemplo, 2,5 N HCl y
5% de ácido nítrico) y que han sido esterilizadas después de la
neutralización a través de tratamiento con calor (por ejemplo,
220ºC, 6 h). El reactor contiene, además, un módulo de ventilación
(6), con el que se insufla una mezcla de gas (b) para la turbulencia
de las bolas de soporte en el reactor y se descarga de nuevo.
Además, el reactor está equipado con electrodos-pH,
electrodos de oxígeno, sondas de temperatura, etc. El medio es
recirculado con una velocidad de flujo, por ejemplo, de 450 a 500
ml/min. en un circuito (10). El circuito puede contener una entrada
de medio fresco (12), una bomba (14) y una válvula de toma de
muestras (16). A través del conducto se extrae medio para la
recogida de la proteína contenido en el mismo.
La figura 2 muestra curvas de resultados para
preparaciones de anticuerpos en un ensayo Lindmo modificado.
Las figuras 3 y 4 muestran escintigramas con
anticuerpos monoclonales marcados con TC-99m a
partir de preparaciones del estado de la técnica.
Las figuras 5 a 7 muestran escintigramas con
anticuerpos monoclonales marcados con TC-99m a
partir de preparaciones de acuerdo con la invención.
A continuación se indican los resultados de una
determinación típica de la inmuno reactividad para una MAk, en el
ejemplo para la MAk BW 250/183.
Se compara la inmuno reactividad de la MAk BW
250/183 (Eur. J. Nucl. Med. 14 (1988), 523-528),
medida con el ensayo Lindmo modificado (para la realización, ver el
Ejemplo 3), con fermentación convencional y purificación frente a
los dos procedimientos de fermentación y de purificación nuevos,
descritos aquí (procedimiento de fabricación I y procedimiento de
fabricación II), en cada caso antes del comienzo de la purificación
(sobrenadante de cultivo celular) y después de la terminación de la
purificación (producto final MAk purificado).
Las muestras, que contienen MAk, de los
sobrenadantes de cultivos celulares o bien de los productos finales
MAk purificados fueron tratados, como se describe con exactitud en
el Ejemplo 3 y se realizó el ensayo Lindmo modificado según las
indicaciones. Como control negativo se ha empleado una MAK del mismo
isotipo (IgG_{1}), de la misma cadena (k) de punto isoeléctrico
comparable y de especificidad irrelevante. El control positivo es
una carga de MAk BW 250/183 purificada a través de una columna de
antígeno a escala analítica con una inmuno reactividad de 91 a
94%.
A continuación se indican los resultados de las
determinaciones individuales de la inmuno reactividad de los
sobrenadantes de cultivos celulares así como de los productos
finales purificados MAk:
1. Procedimiento de fermentación convencional y
procedimiento de purificación convencional (estado de la
técnica)
La curva del resultado se representa en la
figura 1A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La curva del resultado se representa en la
figura 2B.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Fermentación en el reactor de lecho
fluidizado y en el procedimiento de purificación convencional o
procedimiento de purificación "pobre de columna"
(invención)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La curva del resultado se representa en la
figura 2C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La curva del resultado se representa en la
figura 2D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La curva del resultado se representa en la
figura 2E.
\newpage
Los resultados finales del Ejemplo 1 se resumen
en la tabla 6 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Inmuno reactividad de la MAk BW
250/183
\vskip1.000000\baselineskip
La inmuno reactividad de la MAk BW 250/183
depende claramente de las condiciones de fermentación y de
purificación. En la fermentación convencional se consigue, en
efecto, siempre ya típicamente hasta 80% de inmuno reactividad en
el sobrenadante celular, pero en el nuevo procedimiento de
fermentación por medio de reactor de lecho fluidizado, la inmuno
reactividad con 97% es claramente mayor.
También el procedimiento de purificación influye
en la inmuno reactividad de MAk. El nuevo procedimiento de
purificación "pobre de columna" es claramente más cuidadoso que
el procedimiento de purificación convencional (8% de caída de la
inmuno reactividad en el procedimiento convencional frente al 1% de
caída en el nuevo procedimiento de purificación "pobre de
columna").
Se han conseguido resultados similares de la
misma manera con otros MAk, por ejemplo con MAk BW 431/26 (Eur. J.
Nucl. Med. 14 (1988), 523-528 e Int. J. Cancer 36
(1985), 75-84), MAk BW 575/931 (Pediatr. Hematol.
Oncol. 6 (1989), 73-83), MAk YTH 24.5 (J. Immunol.
134 (1985), 3056-3061) y Leucocyte Typing III: White
Cell Differentiation Antigens (editores Mc Michael y col.), Oxford
University Press, Oxford, páginas 788-803), Mak BW
278/105 (J. Histochem. Cytochem. 34 (1986),
209-214), la MAk descrita en la solicitud de patente
197 44 531.4 así como en la proteína de fusión descrita en British
J. Cancer 645, 234-238, 1992 (ver Tabla 7).
\hskip0.3cmZKÜ: Sobrenadante de cultivo celular
\hskip0.3cmGME: Producto MAk purificado
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que se han encontrado hallazgos
comparables con todas las MAk sometidas a ensayo y con una (glico)
proteína muy compleja, la proteína de fusión (peso molecular del
tetrámero en condiciones nativas 50 kDA), se puede partir de que se
obtienen valores comparables con todas las MAk y (glico) proteínas
fermentables en sistemas procariónticos y eucariónticos y se pueden
generalizar los hallazgos ventajosos.
Tanto las cargas MAk purificadas de acuerdo con
procedimientos de fabricación convencionales como también de acuerdo
con los procedimientos de fabricación I y II han mostrado después de
la radio marcación acorde con el método descrito por Schwarz y
Steinstraesser (J. Nucl. Med. 28 (1987), 721), una inmuno
reactividad, que era idéntica a la de la proteína MAk purificada en
el marco de la exactitud del ensayo Lindmo modificado. Los datos se
resumen en la Tabla 8 siguiente:
Partes alícuotas de preparaciones de la MAk BW
250/183, que se produjeron o bien de cuerdo con el procedimiento de
fabricación convencional (fermentación de la carga en fermentadores
agitados, seguida por purificación química de proteína
convencional; inmuno reactividad 72%) o de acuerdo con el nuevo
procedimiento de fabricación II (reactor de lecho fluidizado,
seguido por el procedimiento de purificación "pobre de
columna"; inmuno reactividad 96%) acorde con GMP, fueron
marcadas de acuerdo con el método descrito por Schwarz y
Steinstraesser (J. Nucl. Med. 28 (1987), 721) con
Tc-99m. El porcentaje del isótopo ligado en la MAk
era en ambas preparaciones 99,9%. De estas preparaciones de MAk
idénticas desde el punto de vista radio químico se administraron a
pacientes con sospecha de enfermedades inflamatorias o bien
metástasis de la médula ósea una dosis de 10-20 mCi
i.v. Por medio de una cámara-\gamma se
registraron escintigramas de cuerpo entero en el intervalo de 2 a 25
horas después de la administración i.v. de la MAk radio marcada
desde el punto de vista frontal y dorsal.
Sorprendentemente en los escintigramas después
de la inyección con cargas de MAk, que tenían una inmuno reactividad
de > 90% (procedimiento de fabricación II) se han representado
de una manera más ventajosa con preferencia la médula ósea de forma
nítida y el bazo de una manera más o menos clara (ver el Ejemplo 3;
figuras GRAN 91, GRAN 81 y GRAN 71). En las cargas de MAk, que se
produjeron de acuerdo con un procedimiento de fermentación y
purificación convencional (inmuno reactividad
70-80%), se podría reconocer muy claramente, además
de una representación de la médula ósea, el hígado y el bazo (ver
Ejemplo 3: figuras GRAN 11 y GRAN 21). Por lo tanto, estas tomas
muestran un fondo más elevado, que se pone de manifiesto en un
ligero velado y una cierta falta de nitidez de los
escintigramas.
Como consecuencia, los tejidos normales de
epitopos negativos de pacientes, que contenían cargas MAk con una
inmuno reactividad > 90%, se cargaron esencialmente menos que de
pacientes, que fueron tratados con cargas MAk con una inmuno
reactividad < 80%. Estas observaciones en pacientes documentan la
importancia de la altura de la inmuno reactividad de una MAk
específica frente a granulocitos para la formación de la imagen
(escintigrafía) en la medicina nuclear. Pero no sólo para la
formación de la imagen, sino también para la terapia con rayos
\alpha y \beta, las cargas MAk con una inmuno reactividad >
90% mostraron ventajas claras. Así, por ejemplo, después de la
marcación de cargas MAk con una inmuno reactividad \geq 90% es
posible acoplar Re^{188/186}, Y90 o Astatina por medio de métodos
conocidos en la literatura, para efectuar una radiación preferida
de la médula ósea (Visser y col. J. Bucl. Med. 34 (1993),
1953-1963; Griffith y col., Cancer Res. 51 (1991),
4594-4602; Denora y col. Anticancer Res. 17 (1997),
1735-1744).
Así, por ejemplo, en el marco de un ensayo de
curación, fue tratado un colectivo de 19 pacientes con leucemia
mieloica acuda o crónica. A tal fin se marcaron cargas de la MAk BW
250/183 (inmuno reactividad > 90%) con Re^{188} (actividad
específica; 5-7.5 GBq/mg) y se aplicaron
6,5-12,4 GB1 i.v.
Las investigaciones dosimétricas suministraron
los datos que se resumen en la Tabla siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos muestran que es posible localizar por
medio de radio inmuno terapia con le MAk BW 250/183 marcada con
Re-188 (inmuno reactividad > 90%) altas dosis de
radio sobre la médula ósea y el bazo de pacientes con leucemia.
El colectivo de pacientes estaba constituido por
personas con un riesgo de recaída de 40-50% dentro
de 2 años. Sorprendentemente, la radio inmuno terapia no indujo
efectos secundarios significativos. A continuación se siguió una
terapia estándar que consistía en radiación de cuerpo entero de 12
Gray y administración de ciclofosfamida, Todos los 19 pacientes
pudieron alcanzar una remisión completa, lo que proporciona
indicaciones para un papel futuro de las radio inmuno terapia con
MAk BW 250/183 durante el tratamiento de leucemias en combinación
con terapias estándar. En este caso parece concebible que la radio
inmuno terapia sustituida a la radiación de cuerpo entero rica en
efectos secundarios.
Otra ventaja de la utilización de la MAk BW
250/183 con una inmuno reactividad > 90% consiste en que la
cantidad de MAk administrada de 1 mg por aplicación se pudo reducir
a 0,5 mg por aplicación. Esta reducción condujo a una frecuencia
HAMA
(anticuerpo-humano-anti-ratón),
que estaba por debajo del 2%, y, por lo tanto, no se desvía en una
medida significativa de los valores HAMA de fondo de las personas
normales.
Además, de una manera sorprendente se pudieron
descubrir también metástasis precoces en el RES (sistema retículo
endotelial) de la médula ósea con preparaciones MAk, que tenían una
inmuno reactividad \geq 90%, que no se podían verificar
claramente en el preparado con una inmuno reactivada de
aproximadamente 80% en virtud de la sobreradiación a través del
incremento de la actividad de los pulmones y del hígado.
Por lo tanto, en resumen, se puede establecer
que las ventajas sorprendentes con respecto a la calidad de la
imagen, la eficiencia del diagnóstico, la dosimetría y la eficiencia
terapéutica, que se obtienen a través de la utilización de cargas
altamente inmuno reactivas de la MAk BW 250/183 en combinación con
radiadores \alpha, \beta o \gamma, no eran previsibles ni
cualitativa ni cuantitativamente y abre el camino a un diagnóstico
más eficiente de procesos inflamatorios y de metástasis así como a
la terapia de leucemias y otras enfermedades del sistema hemato
poiético.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descongeló una ampolla del banco de células
de trabajo, que está alojada en nitrógeno líquido, y las células
que se encontraban allí se cultivaron en condiciones de cultivo de
células estándar (medio de cultivo de células sintético libre de
proteínas) en botellas-T. Después de que se alcanzó
un número total de 6-10 x 10^{7} células, se
cultivó posteriormente el contenido de 4 a 6
botellas-T en un recipiente hilador de 500 ml en
condiciones estándar de cultivo de células. Después de que se
alcanzó el número de células de 1,5-2 x 10^{8}
células, se transfirieron las células a dos recipientes hiladores
con 1000 ml de volumen cada uno y se continuó el cultivo. Después
de que se alcanzó el número de células de 1,2-1,5 x
10^{8} células, se inocularon las células en un reactor de lecho
fluidizado que contenía un medio de cultivo de células de 900 ml y
200 ml de portador Siran^{R}- (Bioreactor Pilot B 500, Papaspyrou
Biotechnologie GMBH, Technologiezentrum Jülich,
D-52428 Jülich) y se cultivaron de acuerdo con la
especificación de manipulación de la Fa. Papaspyrou Biotechnologie
durante 60 días a 36,5ºC. El contenido de oxígeno, el
valor-pH, la concentración de glucosa así el
contenido de MAk se controlaron a intervalos de 1 a 4 días. Durante
la fermentación se recogió continuamente el sobrenadante de cultivo
celular y se almacenó a 4ºC.
Se estableció el volumen del ultraconcentrado de
cultivo a preparar y se añadió lentamente bajo agitación 1,5 veces
la cantidad de solución de sulfato de amonio saturado. La suspensión
permaneció a 4ºC hasta tres días hasta que se obtuvo un
sobrenadante claro. Éste fue decantado, el precipitado fue
suspendido en la cantidad remanente del sobrenadante y fue
centrifugado a > 5000 g durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Los sedimentos se reunieron en una copa centrífuga
(\Rightarrow pasta de sulfato de amonio-MAk) y a
continuación se disolvieron con tampón inicial (1 a 4 partes de
tampón sobre una parte de sedimento).
La cantidad de sedimento disuelto, alcanzada
para una proteína-A, se mezcló bajo agitación con
una solución acuosa de Triton X-100, 100 g/l, de
manera que la concentración final de Triton X-100
era 0,5% (50 ml de solución de Triton X-100 sobre
1000 ml de sedimento disuelto). El preparado se filtró estéril a
través de un filtro de inyección, 0,2 \mum. El preparado se dejó
estar durante 2 a 18 horas a 4ºC (\Rightarrow solución de MAk
inactivada de virus).
A continuación, se realizó inmediatamente el
fraccionamiento de la proteína-A. La aplicación de
la muestra se realizó en condiciones lo más asépticas posible y por
medio de una bomba, pudiendo corresponder la velocidad de flujo a
una a dos veces el volumen de las columnas por hora, de manera que
se garantizó un contacto entre MAk y proteína A de al menos 30
minutos. Después de la aplicación completa de las soluciones, se
lavaron las proteínas que no ligan con la
proteína-A y el Triton con tampón inicial de la
columna y se aclararon hasta que la extinción/transmisión del
caudal alcanzó de nuevo el valor de partida del tampón inicial
(duración: 0,5 a 3 horas). La elusión de la MAk se realizó con
tampón de elusión, pH 3,0. El eluato se recogió en un recipiente
refrigerado con copos de hielo (botella de vidrio pesada), en el que
se colocó aproximadamente 1/10) del volumen de las columnas de 2 M
Tris(HCl, pH 8,0. La elución se realizó hasta que se alcanzó
de nuevo aproximadamente el valor inicial del registrador
(\Rightarrow solución de MAk purificada).
Después de la determinación del volumen se
añadieron lentamente bajo agitación 1,5 veces la cantidad de
solución de sulfato de amonio saturado y se agitaron durante 60
minutos. A continuación, la suspensión permaneció a 4ºC hasta tres
días hasta que se obtuvo un sobrenadante claro. El preparado se
agitó y se centrífugo a > 5000 g durante 30 minutos a
temperatura ambiente. El sobrenadante se decantó y los sedimentos se
reunieron en una copa centrífuga (\Rightarrow pasta de sulfato de
aonio MAk) y se disolvieron concentrados lo más posible con
Tris/HCl-NaCl (1-3 partes de tampón
sobre 1 parte de sedimento).
La solución de proteína aclarada se aplicó
inmediatamente sobre una columna regenerada, equilibrada con tampón
Tris/HCl-NaCl, pH 7,5 con Sephadex
G-25. El volumen de la solución de proteína a
resalar debe ser como máximo 15% del volumen de las columnas. La
solución que procede de a columna se condujo a continuación a través
de una fotómetro de caudal y a continuación a través de un monitor
de pH/iones. Después de que la solución de MAk había sido aplicada
totalmente, se aclaró de nuevo la columna con tampón
Tris/HCl-NaCl, pH 7,5 a una velocidad de caudal en
la columna de aproximadamente 20 ml por cm^{2} y por hora. La MAk
que pasa al volumen de exclusión de la columna se acumuló en un
recipiente estéril de acuerdo con el perfil del registrador lineal
de UV hasta que se registró de nuevo en el registrador lineal
aproximadamente el valor de partida de la extinción/transmisión
(aproximadamente 95%). El monitor de pH/iones no puede mostrar
todavía ninguna modificación de la conductividad (\Rightarrow
solución de MAk no tamponada).
Se controló la conductividad de la solución y se
ajustó, dado el caso, a través de la adición de solución de cloruro
sódico, 10 g/l o agua para fines de inyección a la conductividad del
tampón.
El producto se aplicó sobre una columna
preparada de Q-Sepharose en condiciones lo más
asépticas posible con una velocidad de aplicación de 150 ml por
hora (por ml de Q-Sepharose de 2 a 5 mg de
proteína). La elución se realizó con tampón
Tris/HCl-NaCl, pH 7,5 a una velocidad de flujo de
aproximadamente 25 ml por cm^{2} y por hora. La solución que
procede de la columna se condujo a través de un fotómetro de caudal
y a continuación a través de un monitor de pH/iones. La MAk que
circula en el caudal de la columna se acumulo en un recipiente
estéril de acuerdo con el perfil del registrador lineal de UV hasta
que se registró de nuevo en el registrador lineal aproximadamente
el valor de partida de la extinción/transmisión (aproximadamente
95%)(\Rightarrow solución de MAk despirogenizada).
El valor-pH del eluato que
contiene MAk después de la cromatografía de intercambio de aniones
se ajustó a 1 N HCl o 1 N solución de hidróxido sódico a pH
6,9.
Después de la determinación del volumen se
añadió lentamente bajo agitación de nuevo 1,5 veces la cantidad de
solución de sulfato de amonio saturada y se agitó en el transcurso
de 60 minutos. A continuación se dejó estar la suspensión a 4ºC
durante la noche hasta que se obtuvo un sobrenadante claro. El
preparado se agitó y se centrifugó a 8525 g durante 60 minutos a
temperatura ambiente. El sobrenadante se decantó, los sedimentos se
reunieron en una copa centrífuga (\Rightarrow pasta de sulfato de
amonio MAk) y se disolvieron lo más concentrados posible con tampón
de fosfato de sodio-NaCl-sorbita, pH
7,2 (1 a 3 partes de tampón sobre 1 parte de sedimento).
La solución de proteína aclarada se aplicó
inmediatamente sobre una columna regenerada, equilibrada con tampón
de fosfato de sodio-NaCl-sorbita, pH
7,2 con Sephadex G-25 en condiciones lo más
asépticas posible (máximo 15% del volumen de la columna). La
solución que procede de la columna se condujo a través de un
fotómetro de caudal y a continuación a través de un monitor de
pH/iones. La columna se aclaró posteriormente con tampón de fosfato
de sodio-NaCl-sorbita, pH 7,2
(velocidad de caudal aproximadamente 20 ml por cm^{2} y por hora).
La MAk que circula en el volumen de exclusión de la columna se
acumuló en un recipiente estéril de acuerdo con el perfil del
registrador lineal de UV hasta que se registró de nuevo en el
registrador lineal aproximadamente el valor de partida de la
extinción/transmisión (aproximadamente 95%). El monitor de pH/iones
no puede mostrar ninguna modificación de la conductividad
(\Rightarrow solución a granel MAk, concentrada).
Se controló el valor pH de la solución y se
ajustó con 1 N HCl o 1 N solución de hidróxido sódico a pH 7,2.
Con la ayuda de los valores calculados para la
concentración de ratón-IgG y del volumen se diluyó
el "granel final" con tampón de fosfato
sódico-NaCl- sorbita, pH 7,2 a la concentración
final deseada.
El producto se filtró estéril a través de un
filtro de una vez de 0,2 \mum, se distribuyó en partes alícuotas
y se almacenó el "granel final" a -20ºC.
Se descongeló una ampolla del banco de células
de trabajo, que está alojada en nitrógeno líquido, y las células
que se encontraban allí se cultivaron en condiciones de cultivo de
células estándar (medio de cultivo de células sintético libre de
proteínas) en botellas-T. Después de que se alcanzó
un número total de 6-10 x 10^{7} células, se
cultivó posteriormente el contenido de 4 a 6
botellas-T en un recipiente hilador de 500 ml en
condiciones estándar de cultivo de células. Después de que se
alcanzó el número de células de 1,5-2 x 10^{8}
células, se transfirieron las células a dos recipientes hiladores
con 1000 ml de volumen cada uno y se continuó el cultivo. Después
de que se alcanzó el número de células de 1,2-1,5 x
10^{8} células, se inocularon las células en un reactor de lecho
fluidizado que contenía un medio de cultivo de células de 900 ml y
200 ml de portador Siran^{R}- (Bioreactor Pilot B 500, Papaspyrou
Biotechnologie GMBH, Technologiezentrum Jülich,
D-52428 Jülich) y se cultivaron de acuerdo con la
especificación de manipulación de la Fa. Papaspyrou Biotechnologie
durante 60 días a 36,5ºC. El contenido de oxígeno, el
valor-pH, la concentración de glucosa así el
contenido de MAk se controlaron a intervalos de 1 a 4 días. Durante
la fermentación se recogió continuamente el sobrenadante de cultivo
celular y se almacenó a 4ºC.
Después de que se recogieron 18 l de medio de
cultivo celular, se realizó una separación de las células por medio
de microfiltración de flujo tangencial'', seguida por una filtración
estéril a través de un filtro de 0,2 \mum. La cosecha de cultivo
de células libre de células y estéril se almacenó a -20ºC hasta que
existió una cosecha de cultivo de células suficiente para la
purificación siguiente (cosecha de cultivo de células de
aproximadamente 250 l de medio de cultivo de células). Después de
alcanzar el tamaño de carga predeterminado, se descongeló la
cosecha de cultivo de células, se aclaró a través de microfiltración
y se concentró por medio de ultrafiltración de 10 a 150 veces. A
continuación se mezcló el ultraconcentrado con un volumen igual de
2 m el tampón inicial concentrado (pH 8,6) y se filtró estéril. En
condiciones estériles se añadió una solución estéril de Triton
X-100 (100 g de Triton/l) con una concentración
final de, 5% de Triton bajo agitación. Para la inactivación de
virus que contienen envoltura, se dejó estar la solución durante 4 a
18 horas a 4ºC.
A continuación se bombeó el ultraconcentrado
tratado con Triton a una columna de flujo rápido de proteína
A-Sepharose-4, que había sido
equilibrada previamente con 5 volúmenes de la columna de tampón
inicial. Las proteínas no ligadas y el Triton X-100
se lavaron con 5 volúmenes de la columna de tampón inicial desde la
columna. A continuación se lavó la MAk ligada en proteína A con el
tampón de elución (pH 2,30) desde la columna y se recogió en 130 ml
de tampón de neutralización (pH 8). A continuación se ajustó el pH
de la MAk recogida en el tampón de neutralización, en caso
necesario, con NaOH a pH 7-7,5, se diluyó con un
volumen igual de 2x tampón de absorción de membrana (pH 7,5) y se
filtró estéril. A continuación se bombeó la solución MAk en
condiciones estéril a través de un adsorbedor de membrana, que había
sido equilibrado previamente con WFI y con el tampón de adsorción
(pH 7,5). El caudal que contenía la MAk, que estaba liberado ahora
de pirógenos y ADN eventualmente contaminantes, se acumuló en un
recipiente estéril y se ajustó con un tampón (pH 7,5) a 500 \mug
MAk/mg. A continuación, se liberó la solución diluida de MAk a
través de ultrafiltración con un módulo de fibras huecas Viragard
de virus potencialmente contaminantes. El permeato que contenía la
MAk libre de virus fue concentrada a una concentración de
4-5 mg de MAk/ml y de diafiltró contra un tampón
final (pH 7,2). Después de la esterilización, de una dilución en el
tampón final y de una nueva esterilización se llenó la MAk como
producto a granel.
\vskip1.000000\baselineskip
Para poder determinar el contenido de
anticuerpos monoclonales inmuno reactivos en sobrenadantes de
hibridoma, se utilizó un ensayo de ligazón con exceso de antígeno
en combinación con un sistema ELIS sensible (1-2 ng
ratón-Ig/ml) para la determinación de la porción de
anticuerpos monoclonales no ligados. Este ensayo tiene
esencialmente dos ventajas frente al ensayo de inmuno reactividad
desarrollado por Lindmo:
a) Permite la determinación de la inmuno
reactividad tanto de MAk no purificada como también de MAk
purificada no-radiomarcada y radiomarcada.
b) Permite la determinación de la inmuno
reactividad en ausencia de enlace no específico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- A 100 ml de solución de formaldehído 37% se
añadieron
- 900 ml de agua bidestilada. En esta solución
se disolvieron con agitación
- 4 g de sodiodihidrogenofosfato y
- 6,5 g de
di-sodiohidrogenofosfato.
- El valor pH de la solución era 7,0.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
- 6,06 g Tris,
- 19,5 g ácido
cítrico-1-hidrato y
- 4,25 g hidróxido de sodio
- se disolvieron en 1 litro de agua
bidestilada
\vskip1.000000\baselineskip
- 10 g de caseína en
- 1 litro de PBS frío, pH 7,2 + Phenolrot
- se agitaron durante 30 minutos,
- a continuación se centrifugaron a 3000 rpm
y
- se filtró el sobrenadante a través de un
filtro de pliegues
- se ajustó el valor pH de la solución con
NaOH.
\vskip1.000000\baselineskip
- 60,75 g Tris y
- 0,1 g de cloruro de magnesio se disolvieron
en
- 1 litro de agua bidestilada.
\vskip1.000000\baselineskip
- La concentración de la solución de MUPO era 1
mg 4-MPU/4, ml de tampón de substrato.
\vskip1.000000\baselineskip
- 15 g de glicina y
- 2 g de SDS se disolvieron en
- 1 litro de agua bidestilada.
- se ajustó el valor pH de la solución con 5 N
NaOH.
- -
- Se cortaron tejidos de xenógrafos de tumos humano (MZ-STO 1, carcinoma de estómago), que expresan el epitopo del BW 250/183 ("antígeno de reacción cruzada no específica" (NCA-95)) expresado sobre la membrana de granulocitos con un molinillo en piezas de 2 a 5 mm y
- -
- se fijaron durante al menos 16 horas a temperatura ambiente en solución de formaldehído al 4% según Lilly.
- -
- Después de lavarlos, se pasaron los tejidos fijados a través de una red de acero noble inoxidable.
- -
- Las células fijadas se lavaron al menos 10 veces en PBS hasta que el sobrenadante era de alguna manera claro y a continuación
- -
- se lavaron 1 vez en formalina.
- -
- Esta preparación se almacenó a 4ºC en formalina según Lilly (1 parte de ACM y 1 parte de formalina según Lilly) y se designó como "ACM".
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- Se lavó el ACM al menos 10 veces con PBS y a continuación
- -
- se suspendió el gránulo y se incubó en 100 mM de glicina (4 veces el volumen del gránulo) durante 30 minutos a 4ºC.
- -
- A continuación se lavaron las células todavía 4 veces con PBS.
- -
- Se añadieron cantidades crecientes de ACM (0,1 a 50 mg) en minitubos de 1 ml y cada tubito con 500 \mul de sobrenadante de hibridoma, que contenía 25 ng MAk BW 250/183, fue incubado durante la noche a temperatura ambiente (rotación por encima de la cabeza).
- -
- Se incubaron controles negativos con 25 ng den anti-microplasma MAk BW 227/7, que poseía el mismo isotipo (IgG_{1}).
- -
- Se centrifugó el ACM,
- -
- se elimino el sobrenadante y
- -
- se analizaron las moléculas de ratón-IgG, que no se habían ligado al gránulo de ACM.
- -
- se incubaron placas de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos a temperatura ambiente con 50 \mul de antisuero de cabra-anti-ratón-IgG, 2,5 \mul/ml, por pocillo durante la noche.
- -
- A continuación se aspiró el antisuero de conejo-anti-ratón-IgG y se lavaron las placas 4 veces con 0,05 M tampón de Tris-citrato, pH 7,4 (un proceso de lavado = 200 \mul solución de lavado por pocillo pipetados y aspirados).
- -
- Las placas de microtitulación fueron secadas invertidas sobre celulosa durante la noche.
- -
- Soldadas con patrones secos, el tiempo de almacenamiento de las placas de microtitulación pretratadas de esta manera es al menos 6 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Se pipetaron 200 \mul de solución de bloqueo por pocillo y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 60 minutos.
- -
- A continuación se aspiró la solución de bloqueo.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Se aplicaron 50 \mul de los sobrenadantes de ACM, que deben ser analizados con respecto al número de las moléculas de ratón-IgG no ligadas, por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos.
- -
- A continuación se lavaron las placas de microtitulación 3 veces, como se ha descrito anteriormente, con solución de lavar.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Se diluyeron 50 \mul de un anticuerpo de cabra-anti-ratón-IgG acoplado con fosfatasa alcalina, diluido 1:250, se aplicaron por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- -
- Las placas de microtitulación se lavaron 3 veces con solución de lavar, como se ha descrito anteriormente.
- -
- Se aplicaron 50 \mul de solución MUP por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- -
- La reacción del substrato se detuvo después de a incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos a través de la adición de 100 \mul de solución Stopp.
- -
- A continuación se midió la fluorescencia: la longitud de onda de excitación era 355 nm y la longitud de onda de emisión era 460 nm.
La sensibilidad de este ensayo está en el
intervalo de 1 a 2 nm de ratón-IgG/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
IR[%] = 100% -
[100% x (Conc. Mak. en el sobrenadante/Conc. de salida
Mak)]
El cálculo de la inmuno reactividad se realiza
en el punto de lectura. Este punto se encuentra en el volumen ACM
(eje-X de la curva de desarrollo ELISA), en el que
precisamente todavía no existe una caída del valor de la meseta del
control no específico (ligazón no específica).
Las cargas de MAk utilizadas para la marcación
con Tc-99m se diferencian en virtud del
procedimiento de fabricación en su inmuno reactividad. Los datos
se resumen en la Tabla 10 siguiente:
Claims (15)
1. Preparación de proteínas inmuno reactivas
para la utilización terapéutica o diagnóstica, caracterizada
porque el porcentaje de moléculas inmuno reactivas, determinado en
un ensayo Lindmo modificado según el ejemplo 3 es > 90% con
respecto al número total de moléculas inmuno reactivas y no inmuno
reactivas, no diferentes desde el punto de vista de la química de
las proteínas, en la que en la proteína inmuno reactiva se trata de
un anticuerpo monoclonal, quimerizado o humanizado, que se liga a un
epitopo sobre CD66.
2. Preparación de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque las proteínas inmuno reactivas llevan
una marcación, especialmente una marcación radioactiva seleccionada
a partir de ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}RE, ^{9o}Y y
Astatina.
3. Preparación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque las proteínas
inmuno reactivas han sido generadas a través de preparación en
cultivo celular, especialmente a través de la expresión en células
huésped eucariónticas recombinantes.
4. Preparación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque en CD66 se trata
de CD66 a, b, c, e y con preferencia de CD 66 e.
5. Preparación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque en la proteína
inmuno reactiva se trata de un anticuerpo monoclonal, seleccionado
a partir de BW 431/26, BW 250/183.
6. Procedimiento para la fabricación de una
preparación de proteínas inmuno reactivas para la utilización
terapéutica o diagnóstica, caracterizado porque comprende una
fermentación en reactor de lecho fluidizado de una célula huésped,
que expresa la proteína inmuno reactiva, en un medio de cultivo
adecuado y la obtención de la proteína a partir de la célula
huésped y/o a partir del medio de cultivo, en el que el porcentaje
de moléculas inmuno reactivas, determinado en un ensayo Lindmo
modificado según el ejemplo 3 es > 81% con respecto al número
total de moléculas inmuno reactivas y no inmuno reactivas, no
diferentes desde el punto de vista de la química de las proteínas,
en el que en la proteína inmuno reactiva se trata de un anticuerpo
monoclonal, quimerizado o humanizado, que se liga a un epitopo sobre
CD66, sobre CD45, sobre N-CAM, sobre FVIIIRAG y/o
sobre el complejo receptor VEGF/VEGF, y que no se liga ni a VEGF ni
al receptor VEGF.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque se utiliza una célula
huésped eucarióntica.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la proteína inmuno
reactiva se obtiene a través de un procedimiento de purificación
pobre de columna a partir de la célula huésped y/o del medio de
cultivo, en el que como etapa de cromatografía de columna se realiza
solamente una cromatografía de afinidad.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la proteína inmuno
reactiva se obtiene a través de un procedimiento de purificación
convencional a partir de la célula huésped y/o del medio de
cultivo, en el que como etapas de cromatografía de columna se
utiliza una cromatografía de afinidad, una cromatografía de gel y
una cromatografía de intercambio de aniones.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el porcentaje de
moléculas inmuno reactivas, determinado en un ensayo Lindmo
modificado según el ejemplo 3 es > 90% con respecto al número
total de moléculas inmuno reactivas y no inmuno reactivas, no
diferentes desde el punto de vista de la química de las proteínas,
en el que en la proteína inmuno reactiva se trata de un anticuerpo
monoclonal, quimerizado o humanizado, que se liga a un epitopo sobre
CD66, sobre CD45, sobre N-CAM, sobre FVIIIRAG y/o
sobre el complejo receptor VEGF/VEGF, y que no se liga ni a VEGF ni
al receptor VEGF.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque la preparación se
fabrica de acuerdo con el procedimiento de fabricación I, que
comprende las etapas:
- -
- recogida del medio de cultivo celular y separación de las células,
- -
- concentración,
- -
- disolución, activación del virus por medio de tratamiento con detergente, filtración estéril,
- -
- cromatografía de afinidad,
- -
- concentración,
- -
- disolución transformación por medio de cromatografía del gel,
- -
- cromatografía de intercambio de aniones,
- -
- concentración,
- -
- disolución transformación por medio de cromatografía del gel,
- -
- ajuste de la concentración final deseada del volumen,
- -
- filtración estéril.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque la preparación se
realiza de acuerdo con el procedimiento de fabricación II, que
comprende las etapas:
- -
- recogida del medio de cultivo celular, separación de las células, filtración estéril y almacenamiento,
- -
- descongelación, recogida, realizada por micro filtración y ultra filtración,
- -
- dilución,
- -
- tratamiento con detergente,
- -
- cromatografía de afinidad,
- -
- dilución y filtración estéril,
- -
- adsorción de membrana de intercambio de iones,
- -
- filtración del virus por medio de ultra filtración,
- -
- ultra filtración y diafiltración,
- -
- filtración y dilución,
- -
- filtración estéril.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque en la proteína
inmuno reactiva se trata de un anticuerpo monoclonal, seleccionado
a partir de BW 431/26, BW/250/183, YTH 24.5 y
BW 278/105.
BW 278/105.
14. Utilización de preparaciones de proteína de
acuerdo con una de las reivindicaciones a 5 como soporte de
rayos-y, como por ejemplo Yc-99m,
para la fabricación de un medio para la diagnosis de procesos
inflamatorios y de procesos que eliminan médula ósea, por ejemplo
metástasis de carcinomas de próstata, carcinomas de mama y
linfomas.
15. Utilización de preparaciones de proteína de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, como soporte de
rayos \alpha y \beta para la fabricación de un medio para la
terapia de enfermedades del sistema hematopoiético, con preferencia
de leucemias.
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