ES2592402T3

ES2592402T3 - Radioinmunoconjugados y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2592402T3
Application number: ES13195682.3T
Authority: ES
Inventors: Roy H. Larsen; Jostein Dahle; Øyvind S. Bruland
Original assignee: Nordic Nanovector AS
Current assignee: Thor Medical ASA
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2031-01-28
Also published as: BR112012018843A8; PL2528627T3; CN102762230B; RU2560587C9; KR101893720B1; DK2528627T3; CN102762230A; KR20130028051A; PT2528627E; CN104338154A; US20120301396A1; EP2705857B1; CA2786655C; DK2705857T3; BR112012018843B8; IL221091A; IL221091A0; MX342539B; EP2705857A2; JP2015057415A

Abstract

Un radioinmunoconjugado que une CD37 humano, que comprende: a) un anticuerpo anti-CD37 comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 4, b) un enlazador quelante y c) un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en 177Lu, 212Pb, 225Ac, 227Th y 90Y.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la invención.

Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST.

Alternativamente, se puede utilizar PSI-BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilizan los programas NBLAST, XBLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los

5 parámetros por defecto de los programas respectivos. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alternativamente, la identidad de secuencia se puede calcular después de haber alineado las secuencias, p. ej. por el programa BLAST en la base de datos EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST).

En general, para la alineación se puede utilizar la configuración predeterminada por defecto con respecto a, p. ej., "matriz de puntuación" y "penalización por hueco". En el contexto de la presente invención, puede ser ventajosa la

10 configuración predeterminada por defecto de BLASTN y PSI BLAST.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse utilizando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, sólo se cuentan coincidencias exactas.

Una forma de realización de la invención se relaciona con una secuencia que comparte un 80% de identidad de 15 secuencia con la secuencia de VH del anticuerpo HH1 (SEQ ID NO: 1) y/o la secuencia de VL (SEQ ID NO: 3).

Una forma de realización de la invención se relaciona con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con la secuencia de VH del anticuerpo HH1 (SEQ ID NO: 1) y/o la secuencia de VL (SEQ ID NO: 3).

Una forma de realización de la invención se relaciona con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que comparte al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia VH del anticuerpo HH1 (SEQ ID NO: 1)

20 y/o la secuencia de VL (SEQ ID NO: 3) tal como un 90% de identidad, un 91% de identidad, un 92% de identidad, un 93% de identidad, un 94% de identidad, un 95% de identidad, un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad.

Una forma de realización de la invención se relaciona con un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que comparte un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de VH del anticuerpo HH1 (SEQ ID

25 NO: 2) y/o la secuencia de VL (SEQ ID NO: 4).

Una forma de realización de la invención se relaciona con un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos con la secuencia de VH del anticuerpo HH1 (SEQ ID NO: 2) y/o secuencia de VL (SEQ ID NO: 4).

Una forma de realización de la invención se relaciona con un anticuerpo que comprende una secuencia que comparte al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de VH (SEQ ID NO: 2) y/o secuencia de VL

30 (SEQ ID NO: 4) del anticuerpo HH1 tal como un 90% de identidad, un 91% de identidad, un 92% de identidad, un 93% de identidad, un 94% de identidad, un 95% de identidad, un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad.

Variación Genética

La variación genética es provocada por la variación en el orden de las bases en los nucleótidos en los genes. Esta 35 variación determina mutaciones en los genes y, subsiguientemente, en las proteínas que codifican dichos genes.

Estas mutaciones pueden ser mutaciones o sustituciones tanto sentido como sentido erróneo.

Una forma de realización de la presente invención se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos aislada de la cadena VH (SEQ ID NO: 1) y/o de la cadena VL (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo monoclonal HH1 que comprende al menos 50, tal como 20, tal como 10, tal como 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2, tal como 1 mutaciones sentido.

40 Una forma de realización de la presente invención se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos aislada de la cadena VH (SEQ ID NO: 1) y/o de la cadena VL (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo monoclonal HH1 que comprende 0-50, tal como 1-50, tal como 0-20, tal como 1-20, tal como 0-10, tal como 1-10, tal como 0-5, tal como 1-5, tal como 3, tal como 1 mutaciones sentido.

Una mutación sentido erróneo (un tipo de mutación no sinónima) es una mutación puntual en el que se cambia un

45 solo nucleótido, dando como resultado un codón que codifica un aminoácido diferente (mutaciones que cambian un aminoácido por un codón de terminación se consideran mutaciones sin sentido, más que las mutaciones sentido erróneo). Una mutación sentido erróneo puede hacer que la proteína resultante sea no funcional.

Sin embargo, no todas las mutaciones sentido erróneo conducen a cambios apreciables en las proteínas. Un aminoácido puede ser reemplazado por un aminoácido de propiedades químicas muy similares, en cuyo caso la

50 proteína puede todavía funcionar normalmente; esto se denomina una mutación neutra, "tranquila" o conservadora.

Alternativamente, la sustitución de aminoácidos podría ocurrir en una región de la proteína que no afecta de manera significativa la estructura secundaria o función de la proteína. Cuando un aminoácido puede ser codificado por más de un codón (la denominada "codificación degenerada") una mutación en un codón puede no producir cambio alguno en la traducción; esto sería una mutación sinónima (una forma de mutación silenciosa) y no una mutación sin

5 sentido.

Una forma de realización de la presente invención se refiere a un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos de la cadena VH (SEQ ID NO: 1) y/o la cadena VL (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo monoclonal HH1 que comprende al menos 50, tal como 20, tal como 10, tal como 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2, tal como 1 mutaciones sentido erróneo.

10 Una forma de realización de la presente invención se refiere a un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos de la cadena VH (SEQ ID NO: 1) y/o la cadena VL (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo monoclonal HH1 que comprende 0-50, tal como 1-50, tal como 0-20, tal como 1-20, tal como 0-10, tal como 1-10, tal como 0-5, tal como 15, tal como 3, tal como 1 mutaciones sentido erróneo.

Una sustitución conservadora es una sustitución de un aminoácido con otro con propiedades similares en general de 15 tal manera que es probable que el funcionamiento general no resulte afectado seriamente.

Una forma de realización de la presente invención en esta memoria las mutaciones sentido erróneo, mutaciones o sustituciones conservadoras.

Una forma de realización de la presente invención se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos aislada o a una secuencia de polipéptidos con un 80% de identidad de secuencia con las secuencias de la cadena pesada variable

20 (SEQ ID NO: 2) y/o cadena ligera variable (SEQ ID NO: 4) de HH1, en donde la variación de la secuencia son sustituciones conservadoras.

Una forma de realización de la presente invención es la identidad de secuencia de 80% de identidad, tal como un 90% de identidad, un 91% de identidad, un 92% de identidad, un 93% de identidad, un 94% de identidad, un 95% de identidad, un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad y la variación de la

25 secuencia son sustituciones conservadoras.

Con el fin de mejorar la etapa de radiomarcaje puede ser beneficioso introducir lisina extra, p. ej. en la porción Fc de HH1. Esto podría reducir la probabilidad de fijar quelantes de unión de lisina en los sitios de combinación del antígeno en el anticuerpo, reduciendo con ello el riesgo de comprometer la inmunorreactividad durante el radiomarcaje.

30 Métodos para introducir lisina, p. ej. en la porción Fc de HH1 se conocen en la técnica, p. ej. de Hemminki et al., 1995. Una forma de realización de la presente invención se refiere al radioinmunoconjugado de la presente invención que ha sido modificado por 10 Lys en la porción Fc de HH1, tal como 8 Lys, tal como 6 Lys, tal como 5 Lys, tal como 4 Lys, tal como 3 Lys, tal como 2 Lys, tal como 1 Lys.

Tratamiento

35 El uso terapéutico de una disolución farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede ser para el tratamiento contra células malignas que expresan el antígeno CD37, incluyendo linfoma no Hodgkin y leucemia linfocítica crónica.

Otros usos podrían ser el tratamiento de enfermedades autoinmunes y el tratamiento de efectos relacionados con l trasplante. La terapia podría basarse en radiación de partículas beta o radiación de partículas alfa o una 40 combinación de éstas. La terapia podría administrarse como una monoterapia o en combinación con otras terapias, preferiblemente tratamientos estándares. Tales otras terapias pueden ser pre-tratamiento, cirugía, quimioterapia, inmunoterapia, terapia fotodinámica, radioinmunoterapia o una combinación de dos o más de éstos. Por administrarse se entiende infusión intravenosa o inyección intravenosa. Más específicamente, el radioinmunoconjugado de la presente invención se puede administrar directamente en una vena por una cánula

45 periférica conectada a una cámara de goteo que evita la embolia de aire y permite una estimación del caudal en el paciente.

En una realización el radioinmunoconjugado se puede administrar de una manera repetida.

En una realización el radioinmunoconjugado podría administrarse de una manera repetida, pero con diferentes radionucleidos, p. ej., una radioinmunoterapia beta podría ser seguida por una radioinmunoterapia alfa, o viceversa.

50 Un aspecto de la presente invención se refiere al radioinmunoconjugado de la presente invención para uso en el tratamiento de malignidades de células B.

Una forma de realización de la presente invención se refiere al radioinmunoconjugado de la presente invención, para uso en combinación con o además de otras terapias.

En una forma de realización de la presente invención las otras terapias se seleccionan de pre-tratamiento, quimioterapia, terapia de anticuerpo monoclonal, cirugía, radioterapia y/o terapia fotodinámica.

En otra realización de la presente invención las otras terapias pueden ser trasplante de médula ósea o trasplante y/o terapia con de células madre.

5 En otra realización de la presente invención la otra terapia comprender pretratamiento terapéutico utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD20 y/o anti-CD37 antes del tratamiento con el radioinmunoconjugado de la presente invención.

Un aspecto de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones para uso en un método para el tratamiento de una neoplasia maligna de células B seleccionada de linfoma no

10 Hodgkin y leucemia linfocítica crónica, que comprende la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención.

En otra realización de la presente invención la dosificación de anticuerpo ser 1-1000 mg por paciente, más preferiblemente 5-50 mg por paciente, y 177Lu que asciende a 1 -200 MBq/kg, más preferiblemente a 10-100 MBq/kg de peso corporal.

15 Kits

Un aspecto de la presente invención se refiere a un kit para la producción del radioinmunoconjugado de la presente invención que comprende dos o más viales, en donde un vial contiene un conjugado que comprende un quelante enlazado a un anticuerpo monoclonal murino HH1; y un segundo vial que contiene el radionucleido.

Un kit puede requerir realizar algunos procesos, p. ej. que tenga lugar un radiomarcaje y/o purificación antes de la

20 infusión. Una forma de realización de la presente invención se refiere a un kit de la presente invención, en el que el contenido de uno o varios de los viales está liofilizado o en una disolución.

Mezclando los contenidos de los dos viales para generar el radioinmunoconjugado aparecerá el producto final. Por lo tanto, en otra realización de la presente invención el radioinmunoconjugado se puede generar mezclando el contenido de los dos viales.

25 Este producto puede necesitar purificación antes de su uso.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Radiomarcaje de HH1

Yodación: Los anticuerpos fueron marcados con 125I a través de yodación indirecta utilizando tubos de yodación prerevestidos IODOGEN (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con la descripción del fabricante.

30 Marcaje con 111In y 177Lu: Los anticuerpos se hicieron reaccionar en primer lugar con un quelante (p-SCN-Bn-DTPA

o p-SCN-Bn-DOTA).

El quelante DTPA o DOTA se disolvió en HCl 0,05 M, y después se añadió al anticuerpo, que se ajustó a pH aprox. 8 por lavado con tampón carbonato, en una relación de 5:1. A continuación, el pH se comprobó de nuevo y, en caso necesario, se ajustó. La disolución se agitó durante 60 min a temperatura ambiente, y después la reacción se

35 terminó añadiendo 50 μl de disolución de glicina 200 mM (por mg de anticuerpo). Para separar quelante libre, el anticuerpo conjugado se lavó 4-5 veces con PBS (PAA), y después se ajustó a pH 5 por lavado con acetato de amonio. 111In o 177Lu (Perkin Elmer, Boston, MA, EE.UU.) se añadió a continuación a 0,5 mg de DOTA-Ab y se agitó durante una hora a 42°C. Finalmente, el producto se purificó por elución en una columna de filtración en gel, p. ej. Sephadex G-25 PD10 (GE health) o similar. El rendimiento global de marcaje varió de 17% a 63%.

40 La calidad de los radioinmunoconjugados se midió utilizando células de linfoma y un método de Lindmo modificado. Se utilizaron concentraciones de células de hasta 108 células por ml para compensar la modesta actividad específica de conjugados de 111In. Para conjugados de 125In (que tienen una actividad específica más alta) fue suficiente con utilizar concentraciones de células de hasta 4*107 células por ml.

La inmunorreactividad y la actividad específica para los radioinmunoconjugados se pueden ver en la Tabla 1.

45 Ejemplo 2 -Parámetros de unión

La constante de la tasa de asociación, ka, la constante de disociación en equilibrio, Kd, y el número medio de sitios de unión, Bmáx, se determinaron por un método de ajuste de curva de una sola etapa (Dahle et al. 2007). Se midieron los parámetros de unión para HH1 y rituximab y para tres líneas celulares diferentes de linfoma; células aji, Rael y Daudi (Tabla 2). La unión específica se midió como una función del tiempo y de la concentración de 50 anticuerpos, y la solución de la ecuación diferencial que describe la tasa neta de formación del complejo antígenoanticuerpo se ajustó a los puntos de datos experimentales utilizando la constante de la tasa de asociación,

ka, la constante de disociación en equilibrio, Kd y el número medio de sitios de unión, Bmáx, como parámetros. Se utilizaron cinco millones de células por ml, cuatro concentraciones de anticuerpo marcado con 125I (100 ng/ml, 1000 ng/ml, 5000 ng/ml y 10000 ng/ml) y 7 instantes de incubación (5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h y 2 h). Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS, y luego se contaron en un contador gamma.

5 Ejemplo 3 – Retención de anticuerpos unidos a células

La retención de anticuerpos unido a células se midió inmediatamente y 96 horas después del lavado después de la incubación de células Raji, Rael y Daudi con 111In-HH1, 111In-rituximab, 125I-HH1 y 125I-rituximab (Figura 1).

Un millón de células en 1 ml de medio RPMI 1640 con suero de ternero fetal al 10%, L-glutamina al 1% y penicilina/estreptomicina al 1% se incubaron con 1 μg/ml de HH1 marcado con 125I o 111In o rituximab durante una

10 hora, se lavaron dos veces con medio y se incubaron adicionalmente durante cuatro días. La actividad ligada a la célula se determinó inmediatamente después de lavar (Figura 1A) y después de cuatro días de incubación (Figura B) midiendo el número de células (analizador Vi Cell Viability Analizer, Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) y la cantidad de radiactividad con un detector gamma calibrado (detector Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, EE.UU.).

15 Ejemplo 4 -Tratamiento de células de linfoma in vitro con 177Lu-HH1 o 177Lu-rituximab

Experimento I: Unión de 177Lu-HH1 a células Daudi

Un ml de suspensión de células Daudi (1 millón de células/ml) se sembró en 24 tubos y la mitad de los tubos se bloquearon con 100 μg/ml de HH1 o rituximab y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se añadió a cada uno de los tubos 177Lu-HH1 o 177-Lu rituximab a una concentración final de 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 µg/ml y se

20 incubaron adicionalmente a 37°C. La actividad específica era de 91,6 kBq/g para 177Lu-HH1 y de 136,6 kBq/g para 177Lu-rituximab. La cantidad de actividad agregada se midió durante el periodo de incubación con un detector de rayos gamma (detector Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company). Después de 2 horas, se lavó la mitad de las células y se midió la actividad ligada a las células (Figura 2A), mientras que la mitad de las células se incubaron durante la noche (18 h) antes del lavado y la medición de la actividad ligada a las células (Figura 2B).

25 No hubo diferencias entre las células incubadas con HH1 y las células incubadas con rituximab después de 2 horas de incubación, mientras que la actividad ligada a la célula era dos veces mayor para las células incubadas con rituximab que para las células incubadas con HH1 después de incubación durante 18 horas (Figura 2). as Tablas 3 y 4 indican que HH1 radiomarcado satura el antígeno más rápido y en la concentración de anticuerpo más baja que rituximab. La unión no específica parece ser similar para los dos radioinmunoconjugados (RIC), y se incrementa al

30 aumentar la concentración de RIC en el medio.

El número máximo de 177Lu ligado específico era aproximadamente dos veces mayor para rituximab que para HH1. Sin embargo, a la dosis de 1 μg/ml, casi no había diferencias en el número de átomos radiactivos unidos específicamente.

Experimento II: Incubación durante dos horas con 177Lu-IgG: datos de crecimiento de las células Células Daudi se

35 incubaron con radioinmunoconjugados como en el experimento I (Figura 2A). El crecimiento de células Daudi después de 2 horas de incubación con 177Lu-HH1 o 177Lu-rituximab se midió mediante la siembra de 50.000 células de cada uno de los tubos en tres pozos en seis placas de 12 pocillos. La cantidad de células se midió durante varios instantes de los próximos 14 días utilizando un sistema de formación de imágenes automático (Clone Seleccionar Imager, GENTIX Ltd, Hampshire, Reino Unido). No hubo efecto de anticuerpo no marcado solo en el crecimiento

40 celular. Sin embargo, las células bloqueadas tratadas con anticuerpo marcado con 177Lu claramente no crecieron tan rápido como las células control no tratadas, lo que indica que existía un efecto de anticuerpo marcado con 177Lu no ligado o de anticuerpo marcado con 177Lu ligado inespecíficamente en las células (Figura 3).

El tratamiento de células no bloqueados con anticuerpo marcado con 177Lu resultó en un aumento en el retraso del crecimiento de 44% para las células tratadas con 10 μg/ml de 177Lu-HH1 (Figura 3 A) y de 31% para las células

45 tratadas con 10 μg/ml 177Lu-rituximab (Figura 3 B).

Para el tratamiento con 20 μg/ml, la diferencia entre los dos anticuerpos era incluso mayor, ya que no había crecimiento renovado de las células tratadas con 177Lu-HH1. Este resultado era inesperado, ya que las células fueron marcadas con la misma cantidad de anticuerpo (Figura 2 A).

Experimento III: Incubación durante dieciocho horas con 177Lu-IgG: datos de crecimiento de las células.

50 Células Daudi se incubaron con radioinmunoconjugados como en el experimento I (Figura 2 B). El crecimiento de células Daudi después de incubación durante 18 horas con 177Lu-HH1 o 177Lu-rituximab se midió mediante la siembra de 50.000 células de cada uno de los tubos en tres pocillos en seis placas de 12 pocillos. La cantidad de células se midió durante varios instantes los próximos 14 días utilizando un sistema de formación de imágenes automático (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, Reino Unido). No hubo efecto de anticuerpo no marcado

55 solo en el crecimiento celular.

imagen6

10% en hielo.

Subsiguientemente, las células se lavaron dos veces con PBS con FCS al 0,25% y se marcaron con IgG Fab'2 antiratón de conejo policlonal marcado con FITC (diluido en la relación 1:20) (Figura 6) durante 0,5 horas en hielo.

La fluorescencia del marcaje con FITC se detectó excitando con un láser de 488 nm en un citómetro de flujo.

5 Las células muertas y dobletes fueron identificadas y seleccionadas utilizando dispersión frontal, dispersión lateral y señales de yoduro de propidio. No hubo variación significativa entre los diferentes histogramas FITC de los diversos anticuerpos CD37 (Figura 6).

En conclusión, HH1 y los otros tres anticuerpos anti-CD37 IPO.24, ON.108 y 6D363 producen histogramas de citometría de flujo similares.

10 Experimento IV: La fracción de unión para HH1 y tres anticuerpos anti-CD37 comercialmente disponibles.

Para comparar la fracción de unión de HH1 con los anticuerpos O.N.108, IPO-24 o 6D263 (Santa Cruz

Biotechnology), utilizando células Daudi. Las suspensiones celulares, que representan un gran exceso de antígeno, consistentes en 60 millones de células Daudi en 0,2 ml de medio RPMI 1640 con suero de ternero fetal al 5% se bloquearon durante 15 minutos con HH1, O.N.108, IPO-24 o 6D263 anticuerpos (500 μg/ml) para justificar la union

15 no específica del anticuerpo. Otros paralelos se desbloquearon.

Posteriormente, se añadió anticuerpo HH1, O.N.108, IPO-24 o 6D263 marcado con 125I (5-10 ng/ml) y las células se incubaron durante 2 horas a 4°C con suave agitación. Después de ello, las células se centrifugaron y se lavaron 2 veces con PBS con FCS al 1%. Los sedimentos celulares se transfirieron a tubos limpios y se contaron utilizando un contador gamma.

20 La fracción de unión se determinó como la diferencia en la actividad para los viales desbloqueados y bloqueados frente a la actividad añadida. El HH1 mostró una fracción de unión mucho más alta en comparación con los otros anticuerpos CD37 (Tabla 5). En conclusión, HH1 mostró una inmunorreactividad mucho mayor contra células vivas en comparación con IPO.24, ON.108 y 6D363 cuando los anticuerpos fueron radiomarcados de manera similar.

Este resultado indica que HH1 tiene una interacción con el antígeno diferente a los otros tres anticuerpos.

25 Ejemplo 7 -Secuencia de ADN y de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada

La secuencia del gen y la proteína de las regiones variables del anticuerpo anti-CD37 HH1 es la siguiente:

La secuencia del gen VH αCD37 corresponde a SEQ ID NO: 1 y la secuencia de proteína VH αCD37 corresponde a SEQ ID NO: 2.

VH αCD37

imagen7

imagen8

durante la inmunoterapia con anticuerpos anti-CD20, así como en pacientes no tratados con rituximab.

Ejemplo 9 -Tratamiento de ratones SCID inoculados por vía intravenosa con células de linfoma de Daudi utilizando 177Lu-HH1.

Antecedentes

5 El tratamiento de pacientes con linfoma con actual radioinmunoterapia dirigida contra CD20 puede ser problemático en pacientes previamente tratados con rituximab debido a la deriva antigénica y al posible bloqueo del antígeno CD20. Por lo tanto, la radioinmunoterapia que fija como objetivo otros antígenos puede ser más eficaz. Mediante inyección intravenosa de células de linfoma humano en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID – siglas en inglés) los autores de la invención hicieron un modelo de tumor intravenoso. Cuando ratones SCID se

10 inoculan por vía intravenosa con células de linfoma de Daudi desarrollarán una parálisis de las patas traseras debido al crecimiento de las células tumorales Daudi.

Parte Experimental

A ratones SCID se les inyectaron por vía intravenosa 10 millones de células Daudi una semana antes de la

administración de 50 ó 100 MBq/kg de 177Lu-HH1, 50 µg de HH1, 50 µg de rituximab o NaCl. Los ratones fueron

15 monitorizados en cuanto a la parálisis de las patas traseras y la pérdida de peso corporal, así como recuento de leucocitos cada dos semanas. La interrupción de la supervivencia exenta de síntomas fue utilizada como punto final. Para preparar el anticuerpo radiomarcado, HH1 se marcó primero con p-SCN-Bn-DOTA y se purificó. Tras el intercambio de tampón, se añadió 177Lu (Perkin Elmer, Boston, MA, EE.UU.) al DOTA-HH1, y se agitó durante 40 minutos a 40°C. La actividad específica era de aproximadamente 3200 MBq/mkg para el producto final. Cada una de

20 las preparaciones se disolvió en disolución salina isotónica a un volumen de inyección total de 100 µl por animal.

Resultados

La mediana de la supervivencia libre de síntomas era de 26 días (intervalo de 21 a 33) para la disolución salina, 40 días (intervalo 23 a 44) para HH1 y 40 días (intervalo de 33 a 44) para rituximab (Figura 8). Para 50 kBq/kg de 177Lu-HH1, el 80% de los animales estaban vivos después de 79 días. Dos de los ratones en el grupo de 100 kBq/g

25 murieron antes que cualquiera de los animales en los grupos de disolución salina, y los recuentos de células de la sangre indicaron una radiotoxicidad. Un tercio de los animales en el grupo de 100 kBq/g murió el día 49. Los otros 40 animales (70%) estaban vivos en el día 79. La supervivencia de los ratones tratados con 177Lu-HH1 fue significativamente mayor que la supervivencia de los ratones tratados con NaCl, HH1 o Rituximab (p <0,005, Mann Whitney Log Rank Test)

30 Conclusión

Los datos demuestran que los grupos que recibieron 177Lu-HH1 en dosis de 50 ó 100 kBq/g de p. c. tenían una supervivencia considerablemente mejor que los grupos que recibieron disolución salina o inmunoterapia, ya sea con HH1 o rituximab. Los datos de toxicidad indican que la actividad debe mantenerse por debajo de 100 kBq/g de p.c. Estos datos indican que 177Lu-HH1 tiene propiedades relevantes para la radioinmunoterapia in vivo.

35 Ejemplo 10 -Biodistribución de 177Lu-HH1 en ratones inmunológicamente deficientes con xenoinjertos tumorales que expresan CD37.

Antecedentes

Anticuerpo HH1 marcado con lutecio-177 se evaluó en cuanto a la distribución in vivo en el tejido y focalización del tumor.

40 Proceso experimental

Marcaje de anticuerpos con radionucleidos El anticuerpo se marcó primero con el quelante de p-SCN-Bn-DOTA. DOTA se disolvió en HCl 0,05 M, se añadió al anticuerpo en una relación 5:1 y el pH se ajustó a 8-9 mediante lavado con tampón carbonato utilizando filtros de centrífuga Amicon (Millipore, EE.UU.) con un corte de peso molecular de 30 kDa.

45 El pH se comprobó de nuevo y si se ajustó en caso necesario. La disolución se agitó durante 60 min a temperatura ambiente, y después la reacción se terminó añadiendo 50 µl de disolución de glicina 200 mM (por mg de anticuerpo). Para separar quelante libre, el anticuerpo conjugado se lavó 4-5 veces con PBS (PAA) (utilizando Amicon y centrifugación), y después se ajustó a pH 5 por lavado con acetato de amonio. 177Lu (Perkin Elmer, Boston, MA, EE.UU.) se combinó luego con 0,5 mg de DOTA-HH1 en un tubo de polipropileno de 2 ml (Eppendorf, Alemania), y

50 se agitó durante una hora a 40°C. Las actividades específicas eran típicamente 25-120 MBq/kg para conjugados de 177Lu.

Inmunoreactividad

La calidad de los radioinmunoconjugados se midió utilizando células de linfoma y un método de Lindmo modificado. Se utilizaron concentraciones de células de hasta 108 células por ml. Los conjugados utilizados en los experimentos tenían inmunorreactividad por encima de 50%.

5 Biodistribución de radioinmunoconjugados

Biodistribuciones de 177LU-HH1 se determinaron en ratones macho BALB/c inmunológicamente deficientes (nu/nu) implantados con xenoinjertos tumorales de Daudi 1·1·1 mm tres semanas antes. Los preparados se administraron por inyección en la vena de la cola de 100 µl de disolución en cada uno de los animales. Actividad media de 500 kBq por ratón para 177Lu-HH1. Se utilizaron de cuatro a cinco animales por cada instante. Las autopsias se realizaron

10 después de dislocación cervical en diversos instantes después de la inyección. Se determinó el peso de cada una de las muestras de tejido y se midieron 177Lu mediante un detector gamma calibrado (detector Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, EE.UU.). Las muestras de los inyectados se utilizaron como referencias en los procesos de medición.

Resultados y discusión

15 La captación y la retención de HH1 marcado con 177Lu y en tejidos normales de ratones hembras BALB/c inmunológicamente deficientes (nu/nu) con xenoinjertos de Daudi se presentan en la Figura 7. No hubo signos de redistribución de nucleidos desde/a cualesquiera órganos después de la captación inicial de adioinmunoconjugados, lo que indica que los radioinmunoconjugados se mantuvieron estables.

La inyección de 177Lu-HH1 en ratones inmunológicamente deficientes con tumores mostró una baja absorción en los

20 huesos. Se sabe que 177Lu libre se acumula en el hueso, por lo que este resultado indica que el radioinmunoconjugado era estable in vivo. La absorción en los tumores era significativamente mayor que en otros órganos en instantes posteriores.

Esto indica que 177Lu tiene una semivida relevante para la radioinmunoterapia utilizando el anticuerpo HH1.

Los datos de biodistribución de 177LU-HH1 muestran una absorción de tejido normal y un aclaramiento relevantes y 25 una retención significativa en xenoinjertos tumorales que expresan CD37.

El anticuerpo HH1 parece ser muy adecuado para la radioinmunoterapia. El conjugado 177Lu-HH1 parece particularmente adecuado, ya que se obtuvieron relaciones de tejido tumoral a tejido normal favorables antes de que decayera una fracción más grande del radionucleido.

Tablas

30 Tabla 1

Inmunorreactividad y actividad específica para los radioinmunoconjugados.

Actividad específica 1

Radioinmunoconjugado IRF1 (%) Nº ej.

(MBq / mg) 125I-HH1 66 ± 17 (39-92) 75 ± 15 (51-104) 17 111In-HH1 66 ± 14 (51-78) 22 ± 12 (9-32) 3 177Lu-HH1 56 92 1 125I-rituximab 62 ± 6 (54-68) 69 ± 30 (34-118) 6 111In-rituximab 45 16 1 177Lu-rituximab 60 137 1

1 Media ± DE (intervalo)

Tabla 2

El número medio de antígenos (Bmáx) en células Raji, Rael y Daudi, la constante de disociación en equilibrio (Kd) y la constante de la tasa de asociación (ka) para los anticuerpos rituximab y HH1. Anticuerpo Línea celular Bmáx (Ag/célula) Kd (nM) ka (nM/h)

imagen9

Tabla 5

Encuadernación fracción de cuatro anticuerpos anti-CD37. Anticuerpo IRF HH1 50% ON108 24% IPO-24 16% 6D263 21%

Referencias

Bernstein ID, Eary JF, Badger CC, Press OW, Appelbaum FR, Martin PJ, Krohn KA, Nelp WB, Porter B, Fisher D, 5 Miller R, Brown S, Levy R, Donnall Thomas E. High dose radiolabelled antibody therapy of lymphoma. Cancer Res. 1990, 50(3 Suppl), 1017s-1021s.

Brechbiel MW. Bifunctional chelates for metal nuclides. Q J Nucl Med Mol Imaging 2008, 52 (2), 166-173.

Buchegger F, Antonescu C, Delaloye AB, Helg C, Kovacsovics T, Kosinski M, Mach JP, Ketterer N. Long-term complete responses after 131I-tositumomab therapy for relapsed or refractory indolent non-Hodgkin’s lymphoma. 10 Br J Cancer. 2006, 94(12), 1770-6.

Dahle, J., Krogh, C., Melhus, K. B., Kaalhus, O., Larsen, R. H. and Stokke, T. A one-step method for determining the maximum number of bound antibodies, and the affinity and association rate constant of antibody binding. Nuclear Medicine Communications. 2007, 28, 742-747.

Gordon LI, Molina A, Witzig T, Emmanouilides C, Raubtischek A, Darif M, Schilder RJ, Wiseman G, White CA.

15 Durable responses after ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy for CD20+ B-cell lymphoma: long-term followup of a phase 1/2 study. Blood. 2004, 103(12), 4429-31.

Grosmaire LS, Hayden-Ledbetter MS, Ledbetter JA, Thompson PA, Simon SA, Brady W. B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules. documento US 2007/0059306 A1.

Heather A. Jacene, Ross Filice, Wayne Kasecamp, and Richard L. Wahl. Comparison of 90Y-Ibritumomab 20 Tiuxetan and 131I-Tositumomab in Clinical Practice. J Nucl Med. 2007, 48, 1767-1776.

Heider KH, Borges E, Ostermann E. Anti CD37 antibodies. documento WO 2009/019312.

Henriksen G, Funderud S, Hoff P. Bi-labelled antibody and Bi-labelled streptavidin. Comparison of targeting efficiacy of a lymphoma cell line in vitro. J Labelled Compds Radiopharm. 1997, 34(12), 1039-1046.

Hemminki A., Hoffrén A-M., Takkinen K., Vehniäinen M., Mäkinen M-L., Pettersson K., Teleman O., Söderlund H., 25 Teeri T.T.. Introduction of lysine residues on the light chain constant domain improves the labeling properties of a recombinant Fab fragment. Protein Engineering. Vol. 8, No. 2, pp. 185-191, 1995.

Liu S. Bifunctional coupling agents for radiolabeling of biomolecules and target-specific delivery of metallic radionuclides.Adv Drug Deliv Rev. 2008, 60 (12), 1347-1370.

Ngo NT, Brodie C, Giles C, Horncastle D, Klammer M, Lampert IA, Rahemtulla A, Naresh KN. The significance of 30 tumour cell immunophenotype in myeloma and its impact on clinical outcome. J Clin Pathol. 2009, 62(11), 1009

15.

Press OW, Eary JF, Appelbaum FR, Martin PJ, Badger CC, Nelp WB, Glenn S, Butchko G, Fisher D, Porter B, Matthews DC, Fisher LD, and Bernstein ID Radiolabeled-antibody therapy of B-cell lymphoma with autologous bone marrow support. N Engl J Med. 1993, 329(17), 1219-24.Press OW, Leonard JP, Coiffier B, Levy R,

35 Timmerman J. Immunotherapy of Non-Hodgkin’s lymphomas.

Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2001, 221-40.

Smeland E, Funderud S, Ruud E, Kiil Blomhoff H, Godal T. Characterization of two murine monoclonal antibodies reactive with human B cells. Their use in a high-yield, high-purity method for isolation of B cells and utilization of such cells in an assay for B-cell stimulating factor. Scand J Immunol. 1985, 21(3), 205-14.

40

Claims

imagen1