KR20240035757A - 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체-표적화된 방사성 약제 - Google Patents

우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체-표적화된 방사성 약제 Download PDF

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앤드류 마자르
제임스 티. 하비
알. 키스 프랭크
하이메 사이먼
제이슨 로저스
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노쓰스타 메디칼 테크놀로지즈, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 표적화된 방사성 약제를 개시한다:

상기 화학식 I에서, Q+3은 3가 방사성 동위원소 이온이고; M은 양성자 (H+), 암모늄 이온 또는 알칼리 금속 이온이고; "g"는 1 내지 약 12인 수이고; 박스형 mAb MNPR-101은 화학적으로-결합된 사람화 mAb MNPR-101을 나타내고; Y-는 이온 전하의 균형을 맞추기 위해 필요한 양으로 존재하는 임의의 음이온이다. 약제학적으로 허용되는 희석제 중 용해 또는 분산된 화학식 I의 표적화된 방사성 약제의 치료진단적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 기재되어 있고, 바람직하지 않은 혈관형성, 종양 성장 및/또는 종양 전이를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 포유류 숙주의 치료 및/또는 진단 방법이 기재되어 있다. 방사성동위원소가 없는 화학식 I (화학식 III)과 유사한 표적화된 전구-방사성 약제 작제물이 또한 고려된다:

Description

우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체-표적화된 방사성 약제
설명
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 둘 다 2021년 5월 21일에 출원된 미국 출원 연속 번호 63/191,499 및 연속 번호 63/191,506에 대한 우선권을 주장하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되고, 본 명세서에 참조로서 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 화일의 명칭은 텍스트 화일이고, KB이고, 2022년에 작성되고; 명세서 제출과 함께 EFS-Web을 통해 제출되었다.
발명의 배경
방사성 약제는 전형적으로 표적화 모이어티(moiety) 또는 담체에 부착된 방사성동위원소를 포함한다. 방사성동위원소는 이를 분해하는 담체에 의해 표적으로 운반된다. 동위원소 분해 방식은 방사성 약제의 유형을 결정한다.
전형적으로, 감마 방출 동위원소를 사용하여 작제물의 운명을 검출하고, 진단 목적으로 사용한다. 입자 방사체를 사용한 작제물은 요법을 위해 바람직하다. 베타-방출 방사성핵종이 이전에 사용되었지만, 알파-방출 방사성핵종이 최근 몇해에 우수한 효능을 나타내었다.
알파-방출 방사성핵종은 짧은 입자 범위 및 높은 선형 에너지 이동 (LET) 때문에 부분적으로 사멸 세포에서 효과적이다. 포티(Poty) 등 [참조: J Nucl Med. 2018 Jun: 59(60):878-884]은 치료학적 방사성 약제에 대한 알파 방사체의 용도를 기재한다.
다른 알파 방사체와 비교하여 알파-방출 방사성핵종 악티늄-225 (Ac-225)의 상대적으로 긴 반감기는 암의 치료를 위한 치료학적 방사성동위원소로서 인기가 있는 이유 중 하나이다. 동위원소를 사용하는 작제물을 사용한 임상적 시도는 우수한 결과를 나타내었다. 약 10-일 반감기는 단클론성 항체의 생체내 생물학적 반감기에 대해 우수하게 일치하고, Ac-225 및 이의 딸(daughter)에 의해 생성된 다중 알파 방출은 높은 비율의 종양 세포 사멸의 원인이 된다. 그러나, Ac-225를 표적화 모이어티에 부착시키기 위해 필요한 화학은 부족하다.
Ac-225 이온은 문서화된 이온성 반경 112 pm을 갖는 +3의 원자가를 나타낸다. 이의 분극성 부족 때문에, Ac+3은 경질 및 연질 산 및 염기 (HSAB) [참조: Pearson, J Am Chem Soc 1963, 85:3533-3539] 이론에 따라서 "경질" 루이스 산으로서 분류되고, 따라서, 또한 "경질", 비-분극화할 수 있는, 음전기 루이스 염기, 예를 들면, 음이온성 산소 공여자를 선호하는 것으로 예측된다. 특정 이온의 경질/연질 산-염기 성질은 절대 (η) 화학적 경도의 개념을 사용하여 수량화될 수 있다. 이온의 절대 화학적 경도 (η)는 식 (η) = (I-A)/2로 제공되고, 여기서, I는 이온화 에너지이고, A는 관심 대상 종의 전자 친화도이다. 문헌을 참조한다 [참조: Parr and Pearson, J Am Chem Soc, 1983;105:7512-7516; and Pearson, Inorg Chem 1988; 27:734-740.]
Ac+3 및 La+3의 절대 화학적 경도는 각각 14.4eV 및 15.4eV로 계산된다. 연질 이온, 예를 들면, Au+, Ag+ 및 Cu+는 5.7 내지 6.3eV 범위의 절대 화학적 경도 값을 나타내는 반면, Sc+3 및 Al+3과 같은 통상 경질 이온은 24eV 초과의 절대 화학적 경도 값을 특징으로 한다. 문헌을 참조한다 [참조: Thiele et al., Cancer Biother Radio, 201833(8):336-348].
Ac+3의 큰 이온성 크기는 고 밀도의 큰 여러자리 킬레이터에 적합한데, 그 이유는 Ac(III)에 대해 가장 통상 사용되는 킬레이트가 8-12배위 사이 범위이기 때문이다. 악티늄은 다른 악티늄원소 및 희토류 원소와 유사하고, 킬레이트화제의 부재하에 용액 중 가수분해하여 [Ac(OH)3-x]x-를 형성할 수 있고; Ac-225의 서브-피코몰 농도는 하이드록사이드 종을 야기하고, 차례로 표면, 예를 들면, 반응 용기에 결합하는 방사성콜로이드를 형성한다.
Ac-225 분해 쇄에서 다수의 알파-입자의 방출은 Ac-225를 암 세포를 사멸시키는 특히 효과적인 동위원소가 되고, 또한 핵종 및 이의 분해 딸의 지시된 전달을 어렵게 한다. 운동량의 보존 때문에, 활발한 알파 입자의 방출은 반동 에너지를 딸 핵에 종종 >100 keV 전달하고, 이는 임의의 화학적 결합을 위한 결합 에너지보다 1000 배 더 큰 것이다. 이는 본래 전달 벡터의 킬레이터로부터 딸 핵종의 방출을 야기한다. 생체내 알파-방출 딸 핵종의 후속적인 재분배는 비표적화된 건강한 조직에 실질적으로 유해함을 야기할 수 있고, 치료학적 효과를 감소시킬 수 있다.
문헌[참조: Davis et al., Nuc Med Biol 1999, 26(5):581-589]에는 제한된 정보가 생체내 Ac-225 거동에 대해 존재한다는 것을 보고하였다. 예비 연구는 동물 모델에서 조직 흡수, 생물학적 분배, 및 종양 친화성에 대해 시트레이트에 복합화된 Ac-225를 평가하였다. 폴리아미노카복실레이트 킬레이터, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 또는 사이클로헥실 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (CHX-DTPA) 중 어느 하나에 복합화된 Ac-225를 이용하는 이전 연구는 복합화되지 않은 Ac-225와 비교하여 가변된 조직 친화성 및 상승된 혈액 청소를 나타내었다.
종양-함유 누드 마우스에 대한 생체역학 거동을 측정하기 위해 사용된 Ac-225-CHX-DTPA-단클론성 항체 (Mab) 복합물은 성공적인 시험관내 복합화를 나타내지만, 열악한 생체내 안정성을 나타내었다. 따라서, Ac-225가 방사선치료제 모델에서 유용하다는 것이 입증될 수 있는 반면, 잠재적으로 효과적인 킬레이터 및 생체내 이러한 Ac-225 복합물의 상대적 안정성에 관한 정보는 부족하다.
Ac-225 방사성-약제에 대한 최근 검토 논문 [참조: Robertson et al., Curr Radiopharm, 2018, 11(3):156-172]에는, 충분한 안정성을 갖고 Ac(III)에 결합하고 이의 딸 핵종의 방출을 또한 제어하는 킬레이트화제의 발견이 과제로 남아있음을 언급한다. 또한, 제한된 Ac-225 전반적 이용가능성 및 안정한 대안 핵종의 부재는 당해 동위원소의 연구를 신뢰할 수 있는 Ac-225 공급을 보장한 전세계 소수의 기관으로 제한하였다.
상기 검토 저술자는 데이비스(Davis) 등의 상기 논문을 포함하고, 정제된 Ac-225-복합물 각각에 대한 8일 과정에 걸친 생물학적 분배 프로파일이 92 kBq (2.5 mCi)의 각각의 복합물을 주사하여 평가되고, 대조군으로서 Ac-225-아세테이트 생물학적 분배와 비교함을 언급하였다.
복합화되지 않은 Ac-225가 대부분 간에 축적되고, 소량으로 뼈, 신장, 및 심장에 축적되기 때문에, 킬레이트의 높은 Ac-225 간 흡수는 생체내 불안정한 복합물을 나타낸다. 사이클로헥실디에틸렌트리아민-펜타아세트산 "a" 이성체 (CHX-A"-DTPA), 및 1,4,7,10,13-펜타아자사이클로-펜타데칸-N,N',N",N"',N""-펜타아세트산 (PEPA)은, Ac-225 아세테이트와 비교하여, 복합물의 간 흡수 Ac-225를 5.5 배 초과까지 감소시키고, 데이비스(Davis) 등의 데이터가 -CHX-A"-DTPA를 이의 생체내 안정성에 대한 가장 효과적인 시험된 킬레이터 복합물인 것으로 제시하였지만, 로버트슨(Robertson) 등의 검토 저술자는 "비-표적 조직 축적을 추가로 감소시키는 개선이 여전히 이루어질 수 있음"을 또한 기술하였다 [참조: Robertson et al., at page 164.]
이에, CHX-A"-DTPA는 Ac(III)의 부적합한 킬레이트화를 제공한다. 로버트슨 등이 언급한 초기 생체내 연구의 또다른 중요한 발견은, 185 kBq (5 mCi) 이상의 용량에서, 심각한 조직 손상을 주사-후 (p.i.) 1시간만큼 이르게 관찰하였고, 이는 궁극적으로 연구 동물 사망을 야기하고, 8일 p.i.까지 100% 사망률을 야기하기 때문에, Ac-225-CHX-A"-DTPA의 최대 허용 용량이 185 kBq (5 mCi) 미만이다.
표적화 분자에 대한 악티늄의 부착이 쉐인버그(Sheinberg) 연구 그룹에 의해 수행되었다 (참조: Sheinberg, Science 2001 Nov 16; 294(5546):1537-1540. doi: 10.1126/science.1064126). 선택된 킬레이터는 DOTA를 기초로 한 이관능성 분자였다. 그러나, 쉐인버그 그룹의 보고에서, 2-단계 방법을 사용하여 표적화 모이어티 상 충분한 Ac-225를 수득하였다. 추가로, Ac-225 출발 물질을 기초로 하는 수율은 매우 낮고, 동위원소의 10% 미만이 표적화 모이어티 내로 도입되었다. 동위원소의 90% 초과가 폐기되었다. 이러한 프로세스를 갖는 특이적 활성은 항체 mg당 약 50 내지 70 μCi의 범위였다. 분명하게, 더 높은 수율을 갖는 1-단계 프로세스가 바람직할 것이다.
쉐인버그(Scheinberg) 연구 그룹에 의한 가능한 킬레이터의 추가 연구 [참조: McDevitt et al., App. Radiat. Isot., 2002, 57(6):841-847]는 연구된 6개의 가능한 킬레이터를 에서 발견하고, 단지 DOTA 및 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라-프로피온 산 (DOTMP)만이 37℃에서 2시간 후 각각 방사화학 수율 (RCYs) >99 및 78%을 갖는 Ac-225의 임의의 복합화를 나타내었음을 나타낸다. 그러나, 혈청에서 후속적인 시험관내 안정성 검정은 Ac-225 DOTA 복합물이 10일 후 강건하고 >90% 온전하게 유지한 반면, Ac-225-DOMTMP 복합물은 신속하게 해리됨을 제시하였다.
2-단계 표지화 프로세스를 첫번째 이관능성 DOTA-NCS 리간드의 요구되는 방사성표지화, 이어서, mAb 접합 (pH 8.7, 37℃ 52분 동안)에 다시 이용하였다. 단지 9.8 ± 4.5%의 낮은 전반적 방사화학 수율에도 불구하고, 합리적인 특이적 활성 (4.1 ± 2.6 GBq/g, 또는 0.11 ± 0.07 Ci/g)을 성취하여 전임상적 치료학적 연구를 가능하게 하였다. 낮은 수율은 가열을 필요로 하는 DOTA-NCS의 첫번째 Ac-225 표지화 단계에 기인하고, 결과적으로, 이소티오시아네이트 링커의 분해는 다음 단계에서 열악한 mAb 접합을 야기하였다.
쉐인버그 그룹 및 동업자 [참조: McGuire et al., J. Nucl. Med., 2014, 55(9):1492-1498]는 이후에 Ac-225-DOTA-항체 작제물의 제제에 대한 1-단계 프로세스를 보고하였다. 당해 프로세스는 전형적인 최종 반응 pH 값 5.8를 갖는 DOTA-항체 작제물 및 Ac-225+3에 추가하여 방사선보호제로서 L-아스코르브산을 첨가한 2 M 테트라메틸 암모늄 아세테이트 완충제 (pH 7.5) 중에서 진행하였다. 2시간 동안 37℃까지 가열은, 이전 2-단계 방법 (6-12%)과 비교하여, 방사화학 수율 (80%)의 10-배 증가를 가능하게 하고, 30-배 초과까지의 특이적 활성 (120 GBq/g과 3.7-14.8 GBq/g을 비교함)을 갖는 생체접합체의 제제를 야기하였다. 성취한 최고 특이적 활성은 모든 25개의 항체에 대해 1 악티늄에 등가이다.
US 2004/0067924 A1 (Frank)는 Ac-225를 복합화하기 위한 12-원 마크로사이클릭 아민-기반 폴리아세테이트 및 폴리포스포네이트 킬레이트화제의 용도를 교시한다. DOTA-기반 킬레이트화제는 Ac-225의 킬레이트화에 유용한 것으로 밝혀졌다.
상기 특허 공보의 단락 [0082]는 하나의 도시된 DOTA 킬런트의 니트로벤질 그룹이 아닐린으로 환원될 수 있고, 이의 아민이 후속적으로 이소티오시아네이트로 전환되어 표적화 펩타이트 항체 또는 다른 실체에 연결하기 위한 이관능성 화합물을 형성할 수 있음을 언급한다. 언급된 PCTA (하기)의 이관능성 유사체는 연결 그룹을 아세테이트 탄소 중 하나에 부착하여 제조할 수 있다.
3,6,9,15-테트라-아자바이사이클로-[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-아세트산 (PCTA) 기반 킬레이트화제는 프랭크(Frank) 출원의 텍스트에 언급되고, 악티늄과의 결합 데이터를 나타내었다. 나타내고 이용된 PCTA 화합물은 킬레이트화 카복실 그룹 중 하나의 가능한 사용 이외에는 표적화 분자, 예를 들면, 펩티드 또는 항체에 연결에 적합하지 않았다. PCTA를 사용하는 표적화된 작제물에 대해서는 어떠한 개시도 없었다.
문헌[참조: Yapp et al., Mol Imaging June 2013 12(4):263-272]에는 종양 혈관계의 PET 스캔 연구에서 사용하기 위해 Cu-64 [Cu (II)-64]의 킬레이트화에 대해 PCTA, DPTA 및 1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-4,7,10-트리아세트산 (Oxo-DO3A)의 사용을 보고하였다. 킬레이트를 사이클릭 테트라펩티드 사이클릭-(RGDyK)에 사이클릭 펩티드의 첨가된 리신으로의 벤질이소티오시아네이트 연결을 통해 결합하였다.
조기 1-단계 프로세스가 사이먼(Simon)에 의한 WO 2011/011592 A1에 개시되어 있다. 당해 특허 출원은 첫번째 단계로서 킬레이터와 접합된 단백질의 제제를 교시한다. 과량의 킬레이트화제의 제거 후, 단백질-킬레이트화 접합체를 동위원소와 반응시켰다. 다시, DOTA-기반 킬레이터를, DOTA-기반 킬레이터가 Ac-225에 최상일 것이라는 당해 기술분야의 현재 생각을 나타내는 작업에 사용하였다.
시몬(Simon)의 개시내용에서의 방법은 고 농도의 아세테이트 이온 및 높은 킬레이터 대 항체 비 (CAR)의 사용을 요구하였다. 출발 반응을 10-12의 CAR 수를 수득하기 위해 항체당 100 킬레이터의 몰 반응물 비를 사용하여 수행하였다.
더 낮은 CAR 수를 갖는 접합체를 갖는 고 특이적 활성 Ac-225 작제물을 생성하는 것이 바람직하다. 이는 CAR 수가 증가함에 따라, 항체의 생물학적 표적화는 감소하기 때문이다. 따라서, 1-단계 프로세스가 Ac-225 및 DOTA 유형 킬레이터를 사용하여 교시되지만, 요구되는 CAR 수는 DOTA-유형 킬레이트화제를 사용하는 경우 높았다. Ac-225 작제물을 제조하기 위한 더 우수한 킬레이트화제가 명백하게 필요하다.
그럼에도 불구하고, 상기 논의된 Ac-225를 위한 킬레이트화제로서 DOTA를 이용할 경우 곤란한 점은 최근 2018년 문헌[참조: Thiele et al., Cancer Biother Radio, 2018 33(8):336-348]은, 이들의 검토 섹션을 위해 구문 "DOTA: 현재 금 표준(current gold standard)" (340에서)을 사용하였다. 상기 저술자의 DOTA 섹션의 마지막 문장은 다음과 같다: "전체로서, 이들 결점은 DOTA가 225Ac-TAT [225Ac 표적화된 알파 요법] 적용에서 사용하기 위해 이상적이지 않음을 나타내고, 225Ac를 위한 스캐폴드를 보다 적합하게 킬레이트화할 필요성을 강조한다."
표적화 모이어티에 대한 Ac-225의 부착과 연관된 화학은 사용자 및 저술자에게 문제점이었다. 분자에 대한 Ac-225의 더 우수한 부착 방법이 필요하다는 것이 분명하다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하도록 돕는다. 놀랍게도, 본 발명자들은 PCTA-기반 킬레이트화제가 온화한 조건하에 및 이전 "GOLD 표준"인 DOTA를 사용하는 경우 이전 보고된 것보다 더 낮은 CAR 수에서 Ac-225를 갖는 안정한 킬레이트를 형성함을 발견하였다. 추가로, 본 발명의 데이터는 딸 Bi-213 이온이 또한 PCTA-기반 킬레이트화제에 의해 유지되어 방사성 중 일부가 선택된 표적의 위치 이외로 이동하는 경우가 거의 없음을 나타낸다.
Bi-213은 Ac-225의 방사성 분해 산물인 반면, Bi-212는 우라늄-234 (U-234)의 단계-식 분해 후 납-212 (Pb-212)의 방사성 분해에 의해 생성되었다. Bi-212 및 Bi-213의 짧은 반감기는 방사성핵종 요법에서 이들 방사성핵종의 적용을 제한할 수 있다.
비스무트 동위원소, Bi-212 및 Bi-213은, 또한 방사성면역요법의 이용을 위한 후보자이다. 하나, 나머지 하나, 또는 둘 다의 동위원소를 이용하는 수개의 전임상적 연구를 공개하였다.
예시적으로, 문헌[참조: Park et al., Blood, 2020 116(20):4231-4239]는, 스트렙토비딘, 이어서, [213Bi]DOTA-비오틴에 융합된 항-CD20 항체로 처리된 라모스 림프종의 이종이식을 갖는 마우스에서 전임상적 연구를 보고하였다. 종양을 갖는 처리된 마우스가 두드러진 성장 지연을 나타내고, 비처리 대조군보다 약 4-배 더 연장된 생존 시간을 의미한다. 문헌 [참조: Yong et al., AIMS Med Sci, 2021, 2(3):228-245]에 의한 검토는, 표적화된 a-입자 요법 (TAT)에서 Pb-212/Bi-212를 사용하는 최근 작업, 예를 들면, HER2에 결합한 트라스트주맙, mAb에 연결된 킬레이터 2-(4-이소티오-시아나토벤질-1,4,7,10-테트라아자-1,4,7,10-테트라-(2-카바모닐메틸)사이클로도데칸 (TCMC)을 이용한 작업을 논의하였다. 문헌[참조: Mulford et al., J Nucl Med 2005, 46(1 Suppl):199S-204S]의 검토는 상기 비스무트 동위원소 중 하나 또는 나머지 하나를 이용하는 수개의 TAT 요법을 논의한다.
상기 용(Yong) 등에 의해 논의된 Bi-212 또는 Bi-213 대신에 전구체 Pb-212를 갖는 생체분자의 표지화는, Bi-212의 경우 60분 또는 Bi-213의 경우 46분과 비교하여, 10.6시간의 반감기를 갖는 접합체를 수득하는 이점을 갖는다. DOTA 킬레이터에 의해 복합화된 Pb-212를 갖는 잠재적 생체내 발생기(generator)를 제조하기 위한 이전 시도는, Bi의 약 36%가 베타 입자를 통해 Pb-212 분해하여 DOTA가 보유하지 않는 Bi-212를 형성한 결과로서 빠져나가는 것으로 보고되었기 때문에, 실패하였다. Pb-212의 분해에서 형성된 Bi-212는, 유리 비스무트 이온이 신장에서 위치를 확인하기 때문에, 담체에 결합되어 유지된다는 것이 중요할 수 있다. 문헌을 참조한다 [참조: Bartos et al., J Radioanal Nucl Chem, 2013 295:205-209].
지르코늄-89는 지르코늄이 하나의 원자가를 갖고, Zr-89가 감마 선 (909 keV) 및 또한 양전자를 약 397 keV에서 방출한다는 점에서 또다른 유용한 방사성동위원소이고, 둘 다의 방출은 진단제에서 유용하다. 의약에서 사용되는 다수의 단클론성 항체의 순환 반감기와 유사한 Zr-89의 반감기는 3.3일이다. 이들 동위원소는 방사성표지화에서 및 양전자 방출 단층촬영 (Immuno-PET)에서 mAbs의 평가에서 사용된다 [참조: Saleem et al., Sci World J 2014, Article ID 269605, 9 pages.] Zr-89의 최종 분해 산물은 안정한 비-방사성 동위원소인 이트륨-89이다.
본 발명에서 추가 유용한 동위원소는 인듐-111이다. 인듐은 또한 +3의 원자가를 갖고, In-111은 약 2.8일의 반감기를 갖는다. 인듐-111 분해는 진단적 스캔, 예를 들면, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 영상화에서 사용할 수 있는 0.171 MeV 및 0.245 MeV의 감마 선을 제공한다. In-111은 카드뮴-111로 분해되고, 이는 비-방사성이고 안정하다.
우로키나제 플라스미노겐 활성화제 (uPA) 시스템이 전이 진행에 중심이 되고, 이는 암 약물 개발을 위한 전도유망한 표적이 된다는 시험관내 및 생체내 연구로부터 유의한 체내 입증을 확립하였다 (참조: Mazar, et al., 1999 Angiogenesis 3:15-32). uPA에 추가하여, 이의 세포 표면 수용체 (uPAR)는 하기 이유 때문에 암 치료학적 및 진단 제제의 설계 및 개발을 위해 적합한 표적이다 (참조: Mazar, 2001 Anti-Cancer Drugs 12:397-400):
(a) uPAR은 전이 종양 세포 및 혈관형성 내피 세포 ("ECs") 상 선택적으로 발현되지만, 다른 세포 상에서는 그렇지 않음;
(b) uPAR은 현재 강력한 약물 개발 효과의 대상인 전이에 요구되는 수개 세포외 및 세포내 경로에서 중요한 참여자임; 및
(c) uPA 경로에 따라 수개의 상이한 포인트에서 간섭할 수 있음.
따라서, uPA 및 uPAR은 다수의 상이한 유형의 종양/암에 대해 유용한 진단제 및 치료제의 개발을 위한 전도유망한 표적이다.
"suPAR"로서 당해 기술분야에 언급된 가용성 형태의 uPAR은 또한 유용한 표적이다. suPAR은 다수의 체액, 예를 들면, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 및 뇌척수액에서 검출되었다. 이후에, 순환하는 suPAR의 상승은 다수의 질환 상태에서 문서화되고, 면역계의 활성 상태를 반영한다 [참조: Wei et al., (October 2021) Front Med. 8:745838)].
uPAR은 단백질의 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 D1, D2 및 D3으로 지정된 3개의 세포외 도메인을 갖는다. 수개의 효소는 D1 및 D2 간의 이들 도메인을 절단하여 도메인 D2 및 D3을 suPAR로서 제공하는 것으로 보고되었다. 가용성 재조합 uPAR의 활성화는 도메인 D1 및 D2간의 키모트립신으로 시험관내 절단에 의해 문헌 [참조: Resnati et al. 1996 EMBO J 15(7):1572-1682 and 2002 Proc Natl Acad Sci, USA 99(3):1359-1364]에 논의된 잔기 88 (D2D388-274)에서 시작하는 카복실-말단 단편을 생성하여 성취할 수 있다. 당해 항-suPAR mAbs는 suPAR의 최소로 글리코실화된 이소타입을 발현하는 초파리 S2 세포에서 발현된 suPAR의 가용성 형태에 의해 유도되었다.
또한 면역글로불린 (Ig)으로 공지된 항체 (Ab)는, 박테리아 및 바이러스와 같은 면역원으로 불리는 유해 물질을 검출하는 경우, 신체 면역계에 의해 생성된 거대 Y형 단백질이다. 항체의 생성은 면역계의 주요 기능이고, 혈장 세포로 불리는 B 세포와 구별되는 B 세포 (B 림프구)로 불리는 백혈구의 유형에 의해 수행된다. 생성된 항체는 uPAR과 같은 암 세포 상의 것들과 같은 외부 인자 및 세포 표면 구조에 발현되는 항원으로 불리는 면역원의 특이적 부분에 결합된다.
항체는 중질 (약 150 kDa) 구상 혈장 단백질이다. 모든 항체의 기본 구조는 동일하다.
하기 논의된 바와 같이 낙타과를 제외하고는, 전형적인 포유류 항체는 4개의 폴리펩타이드 쇄: 서로 및 자체로 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함한다. 경쇄 (L)는 약 22,000 Da의 폴리펩타이드이고, 중쇄 (H)는 약 50,000 Da 이상의 질량을 갖는 더 큰 폴리펩타이드이다. 그리스 문자로 표시되는 5개의 유형의 Ig 중쇄가 존재한다: α, δ, ε, γ, 및 μ. 람다 (λ) 및 카파 (κ)로 칭명되는 Ig 경쇄의 2개의 유형이 존재한다.
각각의 항체 중쇄 및 경쇄는 N-말단 가변 영역, 이어서, 불변 영역을 포함한다. 가변 (V) 영역은 약 100 내지 110개의 아미노산으로 이루어지고, 하나의 항체를 또다른 것과 상이하다. 각각의 가변 영역은 4개의 프레임워크 영역으로 분리된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. CDR은 주로 면역원의 항원 영역에 결합된 서열이다.
분자 내 각각의 중쇄 및 경쇄의 나머지는 2개의 경쇄 하위유형 및 5개의 중쇄 하위부류로 정의되는 제한된 변형을 나타내는 불변 (C) 영역이다. 중쇄는 3개의 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 포함하는 반면, 경쇄는 단지 하나의 불변 영역 (CL)을 포함한다.
일부 중쇄 (α, δ, γ)는 또한 프롤린-풍부 힌지 영역를 포함한다. 이펙터 기능은 카복시-말단 도메인에 의해 중재된다. 힌지 영역이 부족한 ε 및 μ 중쇄는, 추가 도메인을 분자의 중간에 포함한다.
5개의 항체 유형 - IgG, IgM, IgA, IgD, IgE - (이소타입)은 중쇄 불변 영역의 유형에 따라서 분류되고, 분포되고, 체내에서 상이하게 기능한다. 특히 본원에 관심 대상이 되는 IgG 이소타입은, 4개의 사람 하위부류 (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)를 갖고, 각각은 상이한 중쇄를 포함한다. 이들은 매우 상동성이고, 힌지 영역 및 이들이 숙주 면역계를 활성화하는 범위가 주로 상이하다. IgG1 및 IgG4는 힌지 영역에서 2개의 쇄-간 디설파이드 결합을 포함하는 반면, IgG2는 4를 갖고, IgG3은 11을 갖는다. 본원에 논의되지 않는 이들 이소타입은 자체로 추가로 분리된다.
하기 개시된 본 발명은 치료학적 및 진단적 (치료진단) 사용 둘 다를 위해 특정 표적화 종 분자 및 단일 킬레이트화제를 사용하고, 이들 둘 다의 사용을 위해 단일 킬레이터-연결 표적화 시스템을 제공하는 것을 하기에 교시한다. 이러한 치료진단제는 표적화 종으로서 개발 및 제조에서 상당한 이득을 갖고, 킬레이트화 제조 단계는 구별되는 방사성동위원소의 표지화가 일반적일 수 있다. 이는 비표지화된 표적화된-킬레이터, 공통 안정성 및 벌크 약물 물질을 사용한 개발, 독성 연구에서 일부 시간 및 비용 이점을 제공한다.
발명의 요지
본 발명은, 3가 방사성 동위원소 이온, 예를 들면, Ac-225, Bi-212, Bi-213, Zr-89 및 In-111과, 및 또한 특정 표적화 종 분자와 놀랍게도 용이하게 안정한 금속 리간드 복합물을 만들어 방사선치료제를 또는 방사선진단제 (또는 일반적으로, 방사성 약제)를 형성하는 구조에 매립된 피리딘 환을 갖는 12-원 마크로사이클릭 아민을 포함하는 킬레이트화제의 용도에 관한 것이다. 이들 방사성 약제는 또한 방사선치료진단적 제제로서 언급될 수 있다.
킬레이트화제는 특정 표적화 종 분자에 결합하면서, 분자의 일부에 Q+3 이온의 킬레이트화를 가능하게 한다. 따라서, 킬레이트화제는 이의 표적에 도달하는 표적화 분자의 능력을 간섭하지 않는 표적화 분자의 부분에 결합한다. 표적화 종은 방사성 약제를 사멸되거나 이의 존재, 위치, 크기 및 형태 중 하나 이상이 결정되는 세포에 결합시킨다.
보다 특히, 표적화 종은 이의 킬레이트화된 3가 방사성 동위원소 이온, Q+3을 갖는 PCTA 킬레이터에 화학적으로-결합되어 화학식 I로 하기에 나타낸 일반 구조 화학식을 갖는 치료진단적 방사성 약제를 형성하고, 킬레이트화된 방사성 동위원소에 좌우되어, 표적화된 세포를 사멸시키거나 표적화된 세포를 결합시켜 결합된 세포의 존재, 위치, 크기 또는 형태 중 하나 이상을 신호전달하기 위해 치료학적으로 사용할 수 있다.
상기 화학식에서, M은 양성자 (H+), 암모늄 이온 또는 알칼리 금속 이온이다. 박스형 mAb MNPR-101은 ATCC 수탁 번호 PTA-8191을 갖는 사람화 마우스 단클론성 항체 ATN-658로부터 제조된 화학적으로-결합된 사람화 mAb MNPR-101 또는 이의 파라토프-함유 부분을 나타낸다. "g"는 mAb MNPR-101 또는 이의 파라토프-함유 부분의 각 분자당 킬레이트화된 PCTA-킬레이트화 3가 방사성 이온의 평균 수를 나타내고, 이의 평균 값의 수는 약 1 내지 약 12이다. 예시적인 킬레이트화된 Q+3 이온은 3가 Ac-225, Bi-213, Bi-212, Zr-89 또는 In-111을 포함한다. 임의의 음이온, Y-은, 이온 전하의 균형을 맞추기 위해 필요한 양으로 존재할 수 있다.
Q+3 이온과의 킬레이트화 반응을 첫번째로 수행하고, 이어서, 표적화 종 분자, T에 부착할 수 있다. 이는 동위원소가 2회 취급되기 때문에 2-단계 공정으로 언급된다. 대안적으로, 접합 반응 (킬레이트화제를 표적화 종에 부착시킴)을 첫번째로 수행하고, 이어서, Q+3 이온을 삽입할 수 있다. 이는 동위원소가 단지 1회 취급되고 바람직하기 때문에 1-단계 공정으로 언급된다. 악티늄-225은 바람직한 Q+3 이온이다.
본 발명에 따라서, 방사성 약제는 특정 단클론성 항체 (mAb) 또는 이의 파라토프-함유 부분을 3가 방사성 동위원소, Q+3 이온을 킬레이트화하는 킬레이트화제에 화학적으로-결합된 표적화 종 분자로서 사용한다. 보다 특히, 상기 mAb는 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 세포 표면 수용체 (uPAR) 자체에 및 이원 uPA-uPAR 복합물, 즉, uPAR, 및 uPAR 및 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 (uPA)로부터 형성된 복합물에 결합하는 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
사람화 항체 또는 이의 파라토프-함유 부분 (또는 항원-결합 단편)은 하기 구조적 요소를 포함한다. 사람화 항체는 IgG1 카파 경쇄 서브그룹 2 (VK2) 유형이다. 바람직한 mAb는 MNPR-101로 지정되고, 마우스 단클론성 ATN-658의 사람화 버젼이다. mAb ATN-658은 ATCC 수탁 #PTA-8191을 갖는 하이브리도마로 생성된다. 단클론성 항체 (mAb) MNPR-101은 이후에 상세하게 논의된다.
항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(A) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 잔기 서열의 각각의 순차적 조합을 갖는 3개의 CDR, CDR L1, CDR L2 및 CDR L3을 포함하는 VL 카파 쇄; 및
(B) 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 잔기 서열의 각각의 순차적 유형 1 조합을 갖는 3개의 CDR, CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하는 VH 쇄.
하나의 실시형태에서, 카파 쇄 가변 영역은 서열번호 1의 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 또다른 실시형태에서, 카파 쇄 가변 영역은 서열번호 2의 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 카파 쇄 불변 영역은 서열번호 7의 아미노산 잔기 서열을 갖는다.
하나의 실시형태에서, 중쇄 가변 (VH) 영역은 서열번호 8의 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 또다른 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 9의 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 중쇄 유형 1 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3 도메인과 함께)은 서열번호 14의 아미노산 잔기 서열을 갖는다.
약제학적으로 허용되는 희석제에 용해 또는 분산된 화학식 I의 표적화된 방사성 약제의 치료진단적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 고려된다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 희석제는 주위 온도에서 수성 액체이고, 비경구 투여를 위해 개조된다.
하나의 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은, 표적화된 방사성 약제의 표적화된 세포-사멸 (치료학적) 유효량을 숙주에게 투여함을 포함하는 바람직하지 않은 혈관형성, 종양 성장 및/또는 종양 전이를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 포유류 숙주의 치료 방법에 사용된다.
추가 실시형태에서, 고려되는 표적화된 방사성 약제는 진단제로서 사용된다. 이와 같이, 본 발명은 숙주에게 표적화된 방사성 약제의 표적 세포-결합 유효량을 투여하고, 이어서, 결합된 표적화된 방사성 약제에 의해 방출된 방사선을 검출하고 위치를 찾아내기 위해 숙주을 스캐닝하여, 바람직하지 않은 혈관형성, 종양 성장 및/또는 종양 전이를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 것으로 사료되거나 공지된 포유류 숙주를 검정하는 방법을 고려한다.
도면의 간단한 설명
도면은 본 개시내용의 일부를 형성한다.
도 1은 213Bi의 제제의 개발에서 225Ac를 통한 229Th에서 안정한 209Bi까지 방사성 분해 식을 나타내고, 이는 4개의 알파 입자 (α) 및 4개의 베타 선의 방출 (β) 뿐만 아니라 각각의 방사성핵종의 반감기를 문헌 [참조: Huang et al., Comput Math Method M, Vol. 2012, Article ID 153212, 6 pages]에 나타낸 분해 식에서 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 3가 방사성 동위원소, Q+3 이온을 킬레이트화하는 킬레이트화제, PCTA (하기 논의됨)에 화학적으로-결합된 종을 표적화하는 단클론성 항체 (mAb) 또는 이의 파라토프-함유 부분을 포함하는 표적화된 방사성 약제에 관한 것이다.
3가 방사성 이온, Q+3은, 이원 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 (uPA)-우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체 (uPAR) 복합물 (uPA-uPAR)을 표적화하고 이에 결합하여 (이와 면역반응)하고, 또한 특히 uPA-uPAR 이원 복합물 형성을 간섭하지 않는 위치에서 uPAR에 결합하는 사람화 단클론성 항체에 화학적으로-결합된 (연결된) PCTA에 의해 킬레이트화된다. 본 발명의 고려되는 표적화된 방사성 약제는 하기 나타낸 화학식 I의 일반 구조 화학식을 갖는다:
상기 화학식에서, M은 양성자 (H+), 암모늄 이온 또는 알칼리 금속 양이온이다. 박스형 mAb MNPR-101은 ATCC 수탁 번호 PTA-8191을 갖는 사람화 마우스 단클론성 항체 ATN-658로부터 제조된 화학적으로-결합된 사람화 mAb MNPR-101 또는 이의 파라토프-함유 부분을 나타낸다. "g"는 mAb MNPR-101 또는 이의 파라토프-함유 부분의 각 분자당 킬레이트화된 PCTA-킬레이트화 3가 방사성 이온의 평균 수를 나타내고, 이의 평균 값의 수는 1 내지 약 12이다. 임의의 음이온, Y-는, 이온 전하의 균형을 맞추기 위해 필요한 양으로 존재할 수 있다.
사람화 항체 또는 이의 파라토프-함유 부분 (또는 항원-결합 단편)은 하기 구조적 요소를 포함한다. 사람화 항체는 IgG1 카파 경쇄 서브그룹 2 (VK2) 유형 단클론성 항체이다. mAb는 MNPR-101로 지정되고, ATCC 수탁 #PTA-8191을 갖는 하이브리도마에 의해 생성되는 마우스 단클론성 ATN-658의 사람화 버젼이다.
킬레이트화제의 일부 버젼은 피리딘-기반 12-원 테트라아자-마크로사이클릭 리간드 또는 PCTA로서 언급된다 (첫번째 공개됨: 2019년 4월 02일 chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/-doi/abs/10.1002/ejoc.201900280.
항체 분자당 결합된 킬레이터 수, g는, 다른 균질 단클론성 항체 제제의 일부 항체가 반응하지 않을 수 있는 반면, 다른 것은 잘 반응하기 때문에 평균 수이다. 항체 분자당 결합된 킬레이터의 평균 수는, 킬레이터로부터 이소티오시아네이트 그룹은 온전한 항체에 결합되는 경우, 1 내지 약 12, 바람직하게는 약 3 내지 약 12, 및 보다 바람직하게는 약 8 내지 약 10이다. 이의 파라토프-함유 부분 (또는 항원-결합 단편)이 표적화 종인 경우, 표적화 종 분자당 PCTA 킬레이터의 수는, 중쇄의 CH2 및 CH3 부분의 2개의 쌍이 부재하는 경우 이소티오시아네이트 그룹과 반응할 수 있는 더 소수의 반응할 수 있는 그룹, 예를 들면, 리신 아미노 그룹이 존재하기 때문에, 예를 들면, 약 1 내지 약 5만큼 소수인 경향이 있다.
바람직한 킬레이터는 당해 기술분야에 PCTA로서 언급된다. 특히 바람직한 형태의 PCTA에 대한 화학식은 킬레이터를 이관능성으로 되게 할 수 있는 반응되지 않은 이소티오시아네이트 연결 그룹이고, 하기 화학식 II에 나타내고, 여기서, M은 상기 기재된 바와 같다.
화학식 II의 킬레이터는 p-SCN-Bn-PCTA 명칭하에 Macrocyclics Inc. (텍사스주 댈러스 소재)에서 시판된다.
본 발명에서 고려되는 표적화 종은 단클론성 항체 (mAb) MNPR-101, 또는 이의 파라토프-함유 부분이다. 표적 세포에 결합되면, 3가 방사성 동위원소, Q+3 이온, 예를 들면, 바람직한 Ac-225 이온에 킬레이트화된 항체 및 이의 화학적으로-결합된 PCTA는, 원하지 않는 세포로 흡수될 수 있고, 이 시점에 Ac-225 또는 이의 딸 원자 중 하나는 분해되어 이의 세포독성 알파 입자를 원하지 않는 세포 내에 방출할 수 있다.
용어 "항체"는 Ig 분자의 단백질 분해 절단으로 생성되거나 또는 유전학적으로 또는 화학적으로 조작된 온전한 mAb MNPR-101 분자 뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편 (파라토프-함유 부분) 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. MNPR-101은 특히 uPa-uPAR 이원 복합물에 결합하는 (이와 면역작용하는) IgG1 κ mAb이다.
파라토프-함유 부분 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv를 포함하고, 이들 각각은 항원을 결합할 수 있다. 이들 단편은 온전한 항체 (Ab)의 Fc 단편이 부족하고, 치료학적으로 사용되는 경우, 순환으로부터 더 신속하게 제거되고, 온전한 항체보다 더 적은 비-특이적 조직 결합을 겪는 추가 이점을 갖는다.
온전한 Ig의 파파인 처리는 Fab 단편을 생성하고; 펩신 처리는 F(ab')2 단편을 생성한다. 이들 단편은 또한 당해 기술 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 유전적으로 또는 단백질 조작하여 생성할 수 있다.
Fab 단편 또는 부분은 함께 공유결합되고 특히 항원과 조합할 수 있는 Ig 중 (H) 쇄 및 Ig 경 (L) 쇄의 면역학적 활성 부분을 포함하는 Ig 분자의 부분으로 이루어진 이량체 단백질이다. Fab 단편은 전형적으로 당해 기술 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 실질적으로 온전한 Ig 분자을 파파인으로 단백질 분해 소화하여 제조한다. 그러나, Fab 단편은 또한 당해 기술 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 적합한 숙주 세포에서 Ig H 쇄 및 L 쇄의 목적하는 부분을 발현하여 제조할 수 있다.
F(ab')2 단편은 위치 카복시-말단에서 온전한 항체의 온전한 항체 힌지 위치까지 펩신 절단으로 형성될 수 있는 사량체이다. Fc 단편의 수개의 더 작은 부분은 또한 전형적으로 펩신 절단 동안 생성되는 반면, 파파인 절단은 전형적으로 단일 Fc 이량체를 생성한다.
Fv 단편은 함께 공유결합되고 특히 항원과 조합할 수 있는 Ig H 쇄 가변 (V) 영역 (VH) 및 Ig L 쇄 V 영역 (VL)의 면역학적 활성 부분을 포함하는 다량체 단백질이다. Fv 단편은 전형적으로 당해 기술 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 적합한 숙주 세포에서 Ig VH 영역 및 VL 영역의 목적하는 부분의 발현에 의해 제조된다.
H 쇄 및 L 쇄의 V 영역을 암호화하는 DNA 서열은 적어도 약 4개의 아미노산 잔기 (전형적으로 소 중성 아미노산)의 서열을 암호화하는 링커에 결찰된다. 이러한 융합에 의해 암호화되는 단백질은 본래 Ab의 특이성 및 친화도를 유지하는 관능성 가변 영역의 어셈블리를 가능하게 한다.
본원에서 고려되는 mAb는 KLH에 접합된 suPAR의 D2D3 도메인을 사용한 Balb/c 마우스의 면역화에 의해 생성되고, 이어서, 재조합 단백질을 사용하는 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 검정에 의해 측정되는 uPAR의 D2D3 도메인과 특이적 교차-반응성을 갖는 모 클론을 생성하는 후속적인 융합 연구를 후속하였다. 이들 모 클론은 제한된 희석에 적용하고, D2D3에 특이적인 mAb의 패널을 수득하였다. 이들 Abs의 4개의 성질을 하기 표에 요약하였다. 이소타입은 모든 클론을 IgG1, κ로서 확인하였다. uPAR에 대한 특이성을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. mAbs의 친화도를 직접 결합 검정을 사용하여 측정하였다. 나타낸 바와 같이, 5개의 mAbs 중 3개는 약 1 내지 약 5 nM의 친화도를 나타내었다.
mAb MNPR-101를 지시하는 본원에 사용된 mAb는 마우스 mAb ATN-658의 사람화 버젼이고, 이의 하이브리도마는 미국 특허 번호 8,101,726에 개시되고 주장된 ATCC 수탁 번호 PTA-8191를 갖는다. 또한 미국 특허 번호 8,101,726에 개시되고 주장된 마우스 mAb ATN-615는, ATCC 수탁 번호 PTA-8192를 갖는 하이브리도마에 의해 분비된다. mAb MNPR-101 파라토프 아미노산 잔기 서열 (CDR; 상보성 결정 영역; 가변 영역)은 ATN-658와 거의 동일 (약 95.8%)한 반면, 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)은 사람 IgG1 항체의 것이다.
MNPR-101을 생성하기 위한 ATN-658의 사람화는, 항체의 가변 영역의 서열과 조합되어 사람화되어 하나 이상의 공통 서열을 형성하는 문헌 [참조: Wu and Kabat, 1992 Mol. Immunol., 29(9):1141-1146] (이후 Kabat)에 기록된 사람 항체 아미노산 잔기 서열을 이용하는 Xoma HE™ 합성 플랫폼을 이용하였다. 이러한 공정은 수개의 단계로 수행된다:
(1) 저 위험 및 저 플러스 중등도 위험 HE™ 변종을 생성하는 XOMA Corp. (Emeryville, CA) 소유의 HE™ 방법을 사용하는 사람 조작된(Human Engineer)™ (HE™) ATN-658 경쇄 및 중쇄;
(2) HE™ 가변 (V) 영역 서열 코돈 최적화, 에너지 최소화 및 유전자 합성;
(3) 사람 감마-1 및 카파 불변 영역 모듈을 포함하는 4 HE™ V 영역을 XOMA 소유의 일시적 발현 벡터 내로 클론닝;
(4) HE™ 변종을 일시적으로 발현시킴;
(5) 사람화 항체를 정제하고, 이를 순도 및 내독소에 대해 특성규명함; 및
(6) 4 HE™ 변종의 친화도를 입증함.
상기 및 하기 논의된 구문 "저 위험"은 결합 친화도에 영향을 미칠 가능성이 없이 마우스-대-사람 아미노산 잔기 변화가 치료학적 면역원성의 주요한 감소를 야기하는지 여부에 관한 것이다. 두번째 구문 "고 위험"은 마우스-대-사람 아미노산 잔기 변화가 치료학적 면역원성의 거의 없는 실제 감소와 함께 결합 활성의 분해 또는 폐지를 야기하는 위치를 변형하는 것에 관한 것이다.
Xoma HE™ 플랫폼을 사용하는 mAb MNPR-101을 생성하는 ATN-658의 사람화는 "저 위험", "중등도 위험" 및 "고 위험" 치환에 의해 수행되고, 이는 하기 간행물, 특허 및 출원에 제시된다: 1) WO 93/11794 "변형된 항체 가변 도메인의 제조를 위한 방법 및 물질 및 이의 치료학적 용도"; 2) 미국 특허 5,766,886 "변형된 항체 가변 도메인"; 3) 미국 특허 5,770,196 "변형된 항체 가변 도메인 및 이의 치료학적 용도"; 4) 미국 특허 5,821,123 "변형된 항체 가변 도메인"; 5) 미국 특허 5,869,619 변형된 항체 가변 도메인, 및 6) 문헌: Studnicka et al. 1994 Protein Eng 7:805-814, 이의 개시내용 모두는 참조로서 포함된다.
마우스 mAb ATN-658의 가변 (V) 영역 아미노산 잔기 서열의 사람화
mAb ATN-658의 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드의 공통 아미노산 서열 (단일-문자 코드)은 패리(Parry) 및 마자르(Mazar)에 대해 미국 특허 번호 8,191,726에 제시되어 있고, 본원에서 반복되지 않고, 본원에 참조로서 포함된다. cDNA는 하이브리도마 발현 ATN-658로부터 추출되는 총 RNA로부터 제조되고, 가변 영역은 표준 기술을 사용하여 클로닝, 증폭 및 서열분석하였다.
상기 스투드닉카(Studnicka) 등에 의해 설정된 코스 후, 사람 V 카파 경쇄 서브그룹 2 (VK2) 및 사람 중쇄 서브그룹 1 (VH1) 공통 서열을 이용하였다. 동족 마우스 신호 서열을 보유하였다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역 각각에 대한 2개의 서열을 제조하였다. 단지 저 위험 변화를 포함하는 각각의 쇄에 대한 하나의 서열, 및 저 위험 및 중등도 위험 변화를 둘 다 포함하는 다른 서열을 VK2 및 VH1 영역에 대해 제조하고, 총 4개의 서열을 제공한다. 10 저 위험 및 1 중등도 위험 변화는 경쇄 프레임워크 서열 내로 도입되고, 11 저 위험 및 5 중등도 위험 변화는 중쇄 프레임워크 서열 내로 도입되었다. 저 위험 잔기 위치 변화, 용매에 노출되지만 항원 결합 또는 항체 구조에 기여하지 않는 것은, 결합 친화도에 영향을 주지 않거나 미미하게 영향을 주면서 면역원성을 감소시키는 경향이 있다.
아미노산 잔기 서열을 Blue Heron Biotech LLP, (워싱턴주 보셀)로 코돈 (차이니즈 햄스터 난소 세포) 및 발현 최적화를 위해 보냈다. 최적화된 DNA 서열을 받고, 유전자 합성을 위해 Blue Heron를 다시 보냈다.
일시적 발현 벡터 작제
코돈- 및 발현-최적화 저 위험 및 저 플러스 중등도 위험 사람 조작된(Human Engineer)™ 경쇄 및 중쇄를 사람 카파 및 감마-1 불변 영역 모듈을 포함하는 XOMA 소유의 일시적 항체 발현 벡터 내로 프레임-내 클로닝하였다. DNA 서열을 개시 발현 전에 입증하였다 (ELIM Biopharmaceuticals, Inc., 캘리포니아주 헤이워드).
사람 조작된™ ATN-658 항체의 생성
4개의 HE™ ATN-658 변종 (HE™ ATN-1, HE™ ATN-2, HE™ ATN-3 및 HE™ ATN-4로 언급됨)을 HEK293E 세포에서 일시적 형질감염에 의해 생성하였다. XOMA의 일시적 형질감염 접근은 2005 ASCB Annual Meeting에서 제시된 포스터에 상세하게 기재되어 있다.
간단히, 경쇄 및 중쇄를 2 리터 진탕 플라스크를 사용하여 IS293 배지 (Irvine Scientific, Irvine, CA)에서 성장된 XOMA의 현탁액-개조된 HEK293E 세포 내로 공동-형질감염하였다. 진탕 플라스크에서 24시간 후, 200 ml의 형질감염된 세포를 원심분리하고, 40 ml의 새로운 배지에 재현탁시키고, 인테그라(Integra) 플라스크 (Wilson Wolf Manufacturing, Inc., 미네소타주 뉴브라이턴)에 제조를 위해 이동시켰다. 7일 동안 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 인테그라 플라스크로부터 제거하고, 원심분리하고, 배양 상청액을 유지하였다. 배양 상청액 중 항체를 단백질 A 회전 컬럼 (Pro-Chem) 상에서 정제하고, PBS에 대해 투석하고, 농축하고, 멸균 여과하였다.
이들 4개의 항체의 가변 영역 구성 서열을 하기 표 1에 예시한다.
Figure pct00005
* 마우스 및 사람 V 영역 간의 저 또는 저 + 중등도 위험 변화 및 보존, 여기서, 마우스 아미노산 잔기는 매칭 하위유형으로부터 적어도 2개의 Kabat 사람 V 영역에서 임의의 제공된 위치에서 나타난다.
농도를 1.52의 흡광 계수를 사용하여 A280로 측정하였다. 단백질을 SDS-PAGE (4-20%)에 의해 순도에 대해 및 LAL 검정을 사용하여 내독소에 대해 분석하였다. 정제 결과는 모든 항체 제제가 농도 ≥ 1 mg/ml를 갖고, >90% 순도이고, 낮은 수준의 내독소 (< 1 EU/mg)를 갖는다는 것을 나타낸다.
Biacore 검정 방법에 의한 사람 조작된™ ATN-658 항체의 친화도의 평가
마우스 단클론성 항체 ATN-658 및 사람 조작된™ ATN-658 변종 항체의 반응운동학적 분석을 Biacore 2000® 표면 플라즈몬 공명 기기 분석기 (Uppsala, Sweden)에서 수행하여 항체-표면 상호작용에 기초한 센소그램을 생성하였다. 운동학적 측정을 포획 방법을 사용하여 수행하였다.
마우스 모 mAb ATN-658을 PBS 중에 2 ㎍/mL로 희석하고, 토끼 항-마우스 포획 표면 상에 주사하였다. HE™ 변종을 1 ㎍/mL로 희석하고, 단백질 A/G 표면 상에 주사하였다. 항체 주사를 최적화하여 항체 밀도 100-200 RU를 생성하였다.
가용성 uPAR (suPAR)의 6개의 일련의 3-배 희석물을 작동 완충제 (PBS) 중에 제조하고, 각각의 희석물을 삼중으로 무작위 순서로 25℃에서 주사하였다. 완충제 주사를 작동 내내 고르게 분배하였다. 샘플 주사를 블랭크 유동 세포 및 완충제 주사에 대해 이중-참조하여 임의의 벌크 이동 또는 비-특이적 결합에 대해 보정하였다. 데이터를 Biacore®으로부터 생체평가 소프트웨어로 분석하였다. 센서그램을 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 피팅하였다.
사람화 mAb MNPR-101
mAb ATN-658과 비교하여, 하나의 잔기를, mAb MNPR-101의 6개의 CDR에 도달할 때, mAb ATN-658의 CDR 서열 (CDR L1 및 CDR H2)과 비교하여, mAb MNPR-101에서 VK2 및 VH1 영역 각각의 하나의 CDR에서 변화시켰다. mAb MNPR-101의 파라토프 영역에 존재하는 각각의 가변 영역에 대한 상보성-결정 영역 (CDR)을 하기 표 2에 나타낸다.
*CDR L1: L 쇄의 첫번째 CDR; CDR H2: H 쇄의 2번째 CDR 등.
서열
mAb MNPR-101의 Fab 부분의 VL 및 VH 뿐만 아니라 CL 및 CH 영역에 대한 서열, 및 또한 둘 다의 쇄 (HE™ ATN-1)의 가변 영역의 저 위험 서열을 하기에 나타낸다.
SalI 제한 부위를 프레임 내에 및 중쇄 및 경쇄 각각의 암호화된 N-말단의 업-스트림에 위치시키고, XhoI 부위를 이들의 발현 벡터 내로 코딩 핵산을 삽입하기 위해 프레임 내에 및 각각의 쇄의 암호화된 C-말단으로부터 다운-스트림에 삽입하였다.
MNPR-101 생성
단클론성 항체 후보의 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드를 pUC19 플라스미드에 패키징하였다. 단클론성 항체를 암호화하는 cDNA 삽입물을 클로닝하고, 중쇄 및 경쇄를 발현 벡터 내로 삽입하였다.
서열 확인 후, DHFR-결핍 CHO 세포주 DUX B11을 경쇄 및 중쇄 포함 벡터 및 양이온성 리포좀 혼합물 (Lipofectamine® 2000; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 제네티신 (G418) 및 20 nM 메토트렉세이트 (MTX)의 존재하에 푸린-비함유 성장 배지를 사용하는 96 웰 디쉬에서 서브클로닝하였다.
선택 후, 모든 서브클론을 hIgG Bethyl ELISA 키트를 사용하여 스크리닝하였다. 3개의 바이알을 12개의 최상 서브클론 각각에 대해 냉동시켰다. 이어서, 상위 6개 최고 생성된 서브클론을 메토트렉세이트 (MTX), DHFR의 억제제의 양을 증가시켜 보충한 배지로 이동시켰다. MTX 농도를 선택 공정 동안 20 nM에서 1,000 nM로 순차적으로 증가시키고, 이어서, 1,500 nM MTX로 증가시켰다. 성장한 MTX-저항성 클론을 ELISA로 스크리닝하였다. 첫번째 일련의 증폭 후, 2개의 최고 발현 집단 서브클론을 1,000 nM MTX를 포함하는 배지에서 수득하였다. 이들 2개의 클론을 1,000 nM 및 1,500 nM MTX에서 서브클로닝하기 전에, 1,500 nM MTX까지 증폭시켰다. 이들 서브클론은 현재 6 웰 플레이트로 확장되고 있고, 다음 수일 내에 ELISA에 의해 스크리닝될 것이다. 이어서, 상위 2-3 최상 서브클론을 무혈청 배지에 적응시킨 후 Research Cell Bank의 생성을 위해 확장할 것이다.
결과
마우스 mAb ATN-658 및 상기 논의된 사람 조작된™ ATN-658 항체의 리간드-결합 속도를 한번 측정하였다. 개별적인 검정의 센서그램 결과는 모든 일시적으로-발현된 항체가 또한 mAb ATN-658와의 뿐만 아니라 그들 사이에서 유사한 친화도를 나타낸다는 것을 나타내었다. 2개의 VL 및 2개의 VH 쇄의 4개의 조합에 대한 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
항체 HE™ ATN-4를 MNPR-101로 다시 명명하였다.
본 발명의 또다른 측면은 화학식 III에 도시된 표적화된 전구-방사성 약제 작제물이고, 여기서, 킬레이터는 mAb MNPR-101 사람화 단클론성 항체에 화학적으로 결합되고, 여기서, M, 및 "g"는 상기한 바와 같다.
화학식 III의 표적화된 전구-방사성 약제 작제물은 방사성 실체의 배송 위험을 두려워하지 않고 상업적으로 이동할 수 있는 비-방사성 화학물질이다. 사용 위치에서 또는 근처에서 한번, 화학식 III의 표적화된 전구-방사성 약제 작제물은 적합한 배지 중 용해 또는 분산될 수 있고, 여기서, 3가 방사성 동위원소 이온, Q+3, 예를 들면, 225Ac+3 이온을 첨가할 수 있거나, 이미 존재하여 화학식 I의 상응하는 표적화된 방사성 약제를 형성한다.
용어 "전구-방사성 약제(pro-radiopharmaceutical)"는, 실체가 그 자체로 방사성이 아니고, 방사성 약제의 생체활성을 갖지 않는 것을 의미하기 위해 본원에 사용한다. 그러나, 킬레이트화시 3가 방사성 동위원소 이온, Q+3은, 생체활성 방사성 약제가 된다.
고려되는 표적화된 방사성 약제를 형성하기 위한 적합한 배지는 수성 배지이고, 예를 들면, 약제학적 조성물을 형성하기 위해 하기 논의된다. 그렇게 형성된 표적화된 방사성 약제는 전형적으로 이러한 조성물의 합성에 대해 하기 실시예에 논의된 바와 같이 포유류 숙주에게 투여하기 전에 킬레이트화되지 않은 방사성동위원소로부터 분리되고, 목적하는 경우 단리될 수 있다. 표적화된 방사성 약제의 농도를 또한 투여를 위해 목적하는 수준으로 조절할 수 있고, 염, 완충제 등을 표적화된 방사성 약제의 유효량을 포함하는 고려되는 약제학적 조성물을 형성하는 시점에서 혼합할 수 있다.
약제학적 조성물
약제학적으로 허용되는 희석제 중 용해 또는 분산된 고려되는 표적화된 방사성 약제의 치료진단적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물은 고려되는 치료 방법에서 이용된다. 하나의 실시형태에서, 치료진단적 유효량은 치료가 치료학적이기 때문에 표적화된 세포-사멸 유효량이다. 이러한 조성물은 생체내 포유류 숙주 동물 내로 투여되어 원하지 않는 표적화된 세포, 예를 들면, 암 세포 및 비정상 면역 세포에 결합되고 이를 사멸시킨다.
예시적인 원하지 않는 표적화된 세포는 바람직하지 않은 세포 이동, 침입, 증식, 면역 반응 또는 혈관형성에 연관된 세포를 포함한다. 예시적인 이러한 세포는 비정상 면역 세포 및, 암 세포, 예를 들면, 폐 암, 난소 암, 전립샘 암, 뇌 암, 방광 암, 두경부 암, 췌장 암 및 결장 암의 세포이다. 혈액 암, 예를 들면, CD33 마커를 발현하는 급성 골수성 백혈병, 및 HER2 마커를 발현하는 유방 암의 치료가 또한 고려된다.
표적화된 세포-사멸 유효량을 제공하기 위해 투여되는 표적화된 방사성 약제 Q+3 이온의 양은 보통 환자 및 암 상황에서 종양 부하와 같은 질환의 중증도에 따라 가변적이다. 그러나, 약 80 내지 약 120 kBq/kg 체중 격월 (두 달에 한번, 약 60-일 간격)은 전형적으로 긍정적인 결과를 나타낸다. 동일한 투여 용법을 갖는 약 100 kBq/kg 체중의 3개의 주기의 사용으로, 일부 환자에서 완전 완화를 야기하는 전립샘 암 환자에서 펩티드모방체 표적화 종에 연결된 DOTA-기반 킬레이트화제를 이용하는 225Ac-PSMA-617를 사용한 긍정적인 결과를 제공한다는 것을 보고하였다. 문헌을 참조한다[참조: Kratochwil et al., J Nucl Med 2016 57(12):1941-1944; Langbein et al., J Nucl Med 2019 60:13S-19S; and Eder et al., Pharmaceuticals 2022 15:267]. 이러한 용량(dosage)을 사용하여 다른 상태의 치료학적 치료를 위한 용량에 대한 기반을 제공할 수 있다.
진단적 목적을 위해, 숙주에게 표적화된 방사성 약제의 표적 세포-결합 (진단적) 유효량인 치료진단적 양을 투여한다. 이후에 숙주를 방사성약제가 표적화된 세포에 결합되도록 약 1시간 내지 수일, 보다 일반적으로 약 1 내지 약 4시간 동안 유지한다. 유지 시간은 수개의 인자, 예를 들면, 사용되는 3가 동위원소의 분해 속도 및 표적화된 방사성 약제의 청소 속도에 좌우될 수 있다. 이후에 유지된 숙주 포유류를 양전자 방출 (PET 스캔)을 위해 PET 스캔에 의해 또는 감마 선 검출기 (예를 들면, SPECT 스캔)에 의해 스캔하여 표적 세포-결합 표적화된 방사성 약제에 의해 방출된 방사선을 검출하고 위치를 찾아내고, 이에 의해, 하기 중 하나 이상을 확인한다: 1) 표적화된 세포가 숙주에 존재함, 2) 표적화된 세포의 숙주 신체 내 위치, 3) 크기 및 가능하게는 4) 표적화 종에 의해 결합된 세포의 매쓰의 형태.
투여되는 표적화된 방사성 약제의 진단적으로-유효량은 성인을 위해 약 0.5 내지 약 6 mCi 및 적합하게는 어린이를 위해 더 적게 제공하기 위해 전형적으로 충분한 방사성동위원소이다. In-111은 전형적으로 평균 성인 (70 kg)에게 정맥내 투여를 위해 약 111 MBq (3 mCi) 내지 약 222 MBq (6 mCi)로 사용된다. 환자는 Zr-89를 약 0.5 내지 약 2 mCi로 정맥내 투여에 의해 전신 PET 스캔을 위해 투여받을 수 있다.
고려되는 표적화된 방사성약제 약제학적 조성물이 주사로서 비경구 투여를 위해 의도되기 때문에, 이러한 조성물은 전해질을 포함하여야 하고, 바람직하게는 수령자로서 의도되는 포유류 종의 대략적인 생리학적 삼투질농도 및 pH 값을 갖는다. 표적화된 방사성약제 약제학적 조성물 중 단일 전하 전해질 이온의 바람직한 농도는 약 0.5 내지 약 1.5% (w/v), 보다 바람직하게는 약 0.8 내지 약 1.2% (w/v), 가장 바람직하게는 약 0.9% (w/v)의 농도이다. 약 0.9% (w/v) 농도는 사람을 위해 대략적으로 등장성인 용액에 상응하기 때문에 특히 바람직하다. 추가 바람직한 실시형태에서, 화학용해 약제학적 조성물 중 전해질은 염화나트륨이다.
이러한 수준에서 전해질은 표적화된 방사성약제 약제학적 조성물의 삼투질농도를 증가시킨다. 따라서, 전해질 농도의 범위를 명시하기 위한 대안으로서, 삼투질농도는, 부분적으로, 조성물의 전해질 수준을 특성규명하기 위해 사용될 수 있다. 조성물의 삼투질농도는 약 100 mOsm/kg 초과 및 약 520 mOsm/kg 미만이고, 보다 바람직하게는 조성물의 삼투질농도는 약 250 mOsm/kg 초과이고, 가장 바람직하게는 약 300 내지 약 500 mOsm/kg인 것이 바람직하다.
수성 비히클 중 표적화된 방사성 약제의 최대 용해도를 수득하고 생물학적 조직과의 양립성을 보장하기 위해 표적화된 방사성약제학적 조성물의 pH 값이 약 4 내지 약 9인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 pH 값은 약 5 내지 약 8이고, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 7.5이다.
표적화된 방사성약제 약제학적 조성물의 pH 값은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 수단으로 조절 또는 조정될 수 있다. 조성물은 완충될 수 있거나, pH 값은 산 또는 염기 등을 부가하여 조정될 수 있다.
고려되는 표적화된 방사성약제 약제학적 조성물이 비경구 투여 경로를 위해 의도되는 때문에. 멸균성이고, 예를 들면, 미국 약전 (USP) <71>에 부합할 것이 요구되고, 추가로, 무시할만한 수준의 발열 물질을 포함하여, USP <85> (리물루스 아메보사이트 용해물 검정) 또는 USP <151> (토끼 발열원 시험), 또는 실질적으로 등가의 요구사항에, 1mL당 10 이하 (NMT)의 내독소 단위 (EU)와 등가의 발열원 또는 내독소 수준에서 부합하는 것이 추가로 바람직하다. 또한, 약제학적 조성물은 USP <788>에 정의된 미립자 물질 함량 제한 요구사항 (즉, 용기당 NMT 3000 미립자 10 마이크론 초과 크기, 및 NMT 300 미립자 25 마이크론 초과 크기) 또는 실질적으로 동일한 요구사항에 부합하여야 한다. 각각 USP로부터의 참조는 본원에 참조로서 포함된다.
고려되는 표적화된 방사성약제학적 조성물이 투여될 수 있는 예시적인 포유류 동물 숙주는 영장류, 예를 들면, 사람, 유인원, 예를 들면, 침팬지 또는 고릴라, 원숭이, 예를 들면, 시노몰구스 원숭이 또는 마카크, 실험 동물, 예를 들면, 래트, 마우스 또는 토끼, 반려 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 말, 또는 식용 동물, 예를 들면, 소 또는 수소 또는, 양, 새끼양, 돼지, 염소, 라마 등을 포함한다.
고려되는 약제학적 조성물은 보통 포유류 숙주에게 수주 또는 수개월 동안 다수회 투여된다. 언급된 바와 같이, 일반적인 투여 용법은 격월로 수행된다. 투여 사이의 숙주의 스크리닝은 업데이트를 제공하고, 이로부터 담당 의사는 추가 치료에 관련된 결정을 할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일련의 3개의 두 달에 한번 100 kBq/kg의 상이한 Ac-225-함유 표적화된 방사성 약제의 조성물의 각각의 약 60-일 간격 투여는 일부 전립샘 암 환자에서 완전 완화를 생성하였다.
비경구 조성물의 제형은, 예를 들면, 문헌에서 논의된다 [참조: Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania; 1975 and Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980].
주사가능 제제를 위해, 예를 들면, 멸균 주사가능 수성 현탁액을 공지된 기술에 따라서 적합한 분산 또는 습윤 화합물 및 현탁 물질을 사용하여 제형화할 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 또한 비독성 비경구 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균 주사가능 용액 또는 현탁액, 예를 들면, 1,3-부탄디올 중 용액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 주위 온도에서 수성 액체이고, 예를 들면, 물, 링거 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액, 포스페이트-완충 염수이다. 액체 약제학적 조성물은, 예를 들면, 비경구 투여에 적합한 용액을 포함한다. 표적화된 방사성 약제의 멸균 물 용액 또는 표적화된 방사성 약제의 물, 에탄올, DMSO 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 용매 중 멸균 용액은 비경구 투여에 적합한 액체 조성물의 예이다.
멸균 용액은 표적화된 방사성 약제 성분을 목적하는 용매 시스템에 용해시키고, 수득한 용액을 막 필터를 통해 통과시켜 이를 멸균시키거나 또는 대안적으로 멸균 화합물을 사전 멸균된 용매 중에 멸균 상태하에 용해시켜 제조할 수 있다.
실시예
실시예 1
2개의 이관능성 킬레이터를 Macrocyclics(텍사스주 댈러스 소재)로부터 구입하였다. 2개의 구조를 하기에 나타낸다. 이들은 DOTA 및 PCTA로 언급될 것이다.
단클론성 항체 (MNPR-101)와의 접합 반응을 금속-비함유 바이알에서 수행하고, 유리기구를 산 세척하여 잠재적 금속 오염을 제거하였다. 반응을 2 mg의 항체 및 증가하는 몰 반응물 비의 이관능성 킬레이트화제로 수행하였다.
단클론성 항체 (mAb) MNPR-101은 Monopar Therapeutics Inc.의 미국 특허 번호 8,101,726의 ATCC 수탁 번호 PTA-8191을 갖는 mAb ATN-658의 사람화 버젼이다. mAb MNPR-101 파라토프 아미노산 잔기 서열 (CDR; 상보성 결정 영역)은 ATN-658과 동일한 반면, Fc 부분은 사람 IgG1 항체의 것이다.
PCTA 킬레이터에 대해, 몰 반응 비는 1, 3, 5, 10 및 20이었다. DOTA 킬레이터에 대해, 몰 반응 비는 3, 10, 25, 50 및 100이었다. 용액의 pH를 1 M Na2CO3로 9.2로 조정하였다. 반응을 37℃에서 1.5시간 동안 작동하였다.
6,000 달톤 분자량 컷-오프를 갖는 Bio-Rad 10DG 중력-공급 컬럼을 사용하여 접합체를 정제하였다. 컬럼을 15 mL의 0.1M NaCl 중 0.1 M HEPES 완충제로 세정하였다. 완충제의 pH는 7.3이었다. 반응 바이알의 총 함량을 컬럼의 상부에 도입하고, 2 mL 튜브에 수집하였다. 동일한 완충제를 사용한 다중 0.5 mL 용리물을 또한 개별 튜브에서 포획하였다. 각각의 분획의 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 단백질 함유 분획을 결정하였다. 전형적으로, 단백질을 합한 4 분획으로 용리하였다. 합한 분획의 단백질 함량을 Pierce BCA 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 제조된 단백질 접합체의 농도는 약 1 mg/mL였다.
각각의 접합체의 분석을 크기 배제 HPLC로 수행하였다. 컬럼은 IGM Tosoh (TSKgelG3000SWx1; Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA)였다. 이동상은 포스페이트-완충된 염수이고, 유동 속도는 1 mL/분이었다. 280 nm에서 UV 검출기를 사용하였다. HPLC 결과는 고 순도 접합체와 일치하는 약 8-분 체류 시간을 갖는 조기-용리 피크를 나타내었다. 접합체의 체류 시간은 항체에 킬런트 첨가와 일치하는 더 높은 비의 이관능성 킬레이터를 사용하여 약간 감소하였다.
실시예 2
접합체를 12 및 25의 킬런트 대 단백질 몰 반응 비를 제외하고는 실시예 1의 방법으로 제조하였다. 전형적인 반응 수율은 약 30%이다. 따라서, 약 4 및 8의 평균 CAR 수가 반응에 대해 예상된다.
Ac-225를 ORNL (Oak Ridge National Laboratory, 테네시주 오크리지)로부터 입수하였다. 반응 바이알은 0.2 M HCl를 사용하여 용해시킨 고체 Ac-225를 포함하였다. 이전 섹션에서 기재된 동일한 4개의 접합체를 사용하여 Ac-225 킬레이트를 제조하였다. 50 μCi의 Ac-225 대 50 μg MNPR-101-PCTA 킬런트 접합체의 비를 사용하고, 100% 수율인 경우, 특이적 활성은 1 mCi/mg일 것이다. 반응을 100 μL 용적으로 작동하였다. 상기 용적은 0.2M HCl, 60 μL 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충제 중 약 4 μL Ac-225, 및 36 μL MNPR-101-PCTA 또는 -DOTA 접합체를 포함하였다. 반응을 pH 5.8 및 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅하였다.
반응의 방사화학 수율을 50 μL 분취량의 반응물을 완충제 중 3 mL로 희석하고, 30 kDa Amicon® 필터를 통해 통과시켜 측정하였다. 소, 비-킬레이트화 Ac-225 이온은 필터를 통과하는 반면, 접합체는 필터에 의해 유지된다. 샘플을 Ac-225의 첫번째 딸 (Fr-221)을 사용하여 45분 후 Ge 검출기 상에서 카운트하였다. 추가로, 샘플을 Ac를 이의 딸과 함께 밤새 (약 18시간) 평형화 후 용량 칼리브레이터를 사용하여 카운트하였다. 킬레이트화의 결과를 하기에 나타낸다.
상기 표는 PCTA 접합체 둘 다에 대해 정량적 수율을 나타낸 반면, DOTA 접합체는 훨씬 더 적은 수율을 갖고, 12:1 및 25:1 접합체 간의 상당한 차이가 있다. 놀랍게도, 심지어 낮은 CAR 수에도, PCTA 접합체는 고 수율을 나타낸다.
PCTA로부터 형성된 킬레이트의 특이적 활성은 1,000 μCi/g인 반면, DOTA로부터 제조된 접합체로부터 킬레이트에 대한 특이적 활성은 약 216 내지 284 μCi/g의 범위였다. DOTA 및 PCTA 간의 이러한 헤드-대-헤드 비교는 Ac를 킬레이트화하기 위한 DOTA 킬레이터와 비교하여 PCTA 킬레이터의 우세를 나타낸다.
이동상으로서 포스페이트-완충된 염수를 갖는 크기 배제 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 상기 샘플의 순도를 측정하기 위해 사용하였다. HPLC 데이터는 여과 방법과 실질적으로 동일한 결과를 제공하였다.
실시예 3
12:1의 킬런트 대 항체 출발 반응 비로 실시예 2의 MNPR-PCTA 접합체를 Ac-225로 킬레이트화하였다. 이는 반응이 정량적인 경우 1 mCi/mg의 특이적 활성을 생성힐 것이다. 동일한 킬레이트화 반응을 25:1의 킬런트 대 항체 몰 반응 비를 사용하여 MNPR-101의 DOTA 접합체로 수행하였다. 추가로, 킬런트 첨가가 없는 소 혈청 알부민을 음성 대조군으로 사용하였다.
반응 각각의 총 용적은 150 μL였다. 각각의 반응을 실시예 2의 여과 방법을 사용하여 수율에 대해 측정하였다. 보유액의 활성 백분율을 반응의 수율로서 사용하였다.
병행 연구에서, 상기 반응은 35 μL의 0.1M 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 (DTPA)를 추가로 포함하여 수행하고, 반응을 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 이 시점에서, 여과 방법을 다시 사용하여 수율 또는 순도를 측정하였다. 둘 다의 연구 결과를 하기 표에 나타낸다.
MNPR-PCTA(12)는 99.1%의 초기 수율을 가졌다. DTPA 접종 후, 킬레이트화는 단지 약 1%의 활성만을 손실한다. 대조적으로, MNPR-DOTA (25)는 단지 8.9%의 초기 수율을 갖고, DTPA 접종 후 5.6%로 감소되었다. 추가로, 대조군 BSA는 단지, 단백질과 연관된 활성 (비-특이적 결합) 3.4 %는 DTPA 세척 후 1.3%로 감소된다는 것을 나타내었다. 데이터는 Ac-225를 킬레이트화하는 능력 측면에서 심지어 더 낮은 CAR 비에서도 PCTA이 DOTA를 능가한다는 것과 일치한다. 추가로, 네이키드 BSA와의 결합의 부족은 비-특이적 결합이 문제가 되지 않음을 나타낸다.
실시예 4
MNPR-101 (MNPR) 및 PCTA 간의 접합체는 Ac-225를 효과적으로 킬레이트화하는 것을 나타내었다. 헤드-대-헤드 비교에서, Ac-225는 DOTA 접합체를 사용한 것보다 PCTA 접합체에 대해 훨씬 더 효과적으로 킬레이트화되었다.
Ac-225를 ORNL로부터 입수하였다. 이들 반응을 위해 사용된 접합체는 상기 실시예 2 및 3에서 제조하고 기재되어 있다. 소 혈청 알부민 (BSA)을 이에 부착된 임의의 킬레이터 부재 음성 대조군 단백질로서 사용하였다. MNPR-PCTA(12)는 12:1의 PCTA 대 항체의 출발 몰 반응 비를 사용한 PCTA로 만들어진 MNPR-101 접합체를 언급한다. MNPR-DOTA(25)는 25의 킬레이터 대 항체의 출발 몰 반응 비를 사용한 MNPR-101의 접합체를 언급한다.
반응을 표적화하여 1 mCi/mg를 생성하고, 이는 항체 내로 Ac의 100% 도입을 추정한다. 반응을 150 μL 용적으로 수행하고, pH 5.8 및 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅하였다. 반응 후, 35 μL 분취량의 각각의 반응물을 35 μL의 1M 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 (DTPA)와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 정치하였다.
용액을 시간의 함수 (1, 24 및 72시간)로서 상기 기재된 여과에 의해 단백질과 연관된 백분율 Ac-225에 대해 시험하였다. 초기 연구의 결과를 시간의 함수로서 단백질과 연관된 Ac-225 퍼센트로서 하기 표에 나타낸다.
백분율은 총 (필터 + 여과물)와 비교하여 필터 중 활성의 상대적 양을 지정한다. MNPR-PCTA(12)는 DTPA로 1 및 24시간 인큐베이션 후 항체 (필터 상)에 부착된 99% 및 98%의 최상 결과를 제공하였다. 순도를 72시간 후 73%로 저하시켰다. 첨가되는 방사선보호제가 없고, Ac-225는 고 방사선 용량을 용액에 제공함을 주의하였다. 동위원소가 단백질과 연관되어 남아있다는 사실은 높은 정도의 안정성을 나타낸다.
대조군 (BSA) 및 MNPR-DOTA(25) 둘 다는 단백질과 연관된 활성의 상당히 더 낮은 백분율을 갖는다. 용액의 고 분해능 감마 분광법 분석은 표 1의 여과 결과와 일치하였다.
12:1의 출발 킬레이터 대 항체 몰 반응 비를 사용한 PCTA와 접합된 항체 MNPR-101은 고 수율 및 고 특이적 활성으로 Ac-225를 재현가능하게 킬레이트화하는 것을 나타내었다 (1,000 μCi/mg). 과량의 DTPA 중 물질의 인큐베이션은, 심지어 제형이 임의의 방사선보호제를 포함하지 않는 경우에도, 높은 정도의 안정성을 나타내었다. 25:1의 리간드 대 단백질 몰 비의 출발 비를 갖는 DOTA와 접합된 동일한 항체와 헤드-대-헤드 비교는 훨씬 더 낮은 수율을 제공하고, 이는 Ac-225를 킬레이트화하는 경우 DOTA보다 PCTA의 이점을 나타낸다. 네이키드 BSA를 낮은 양의 비-특이적 결합을 나타내는 대조군으로서 사용하였다.
실시예 5
화학식 I로 나타낸 mAb MNPR-101에 결합된 PCTA에 의해 킬레이트화된 Ac-225를 포함하는 표적화된 방사성 약제를 상기한 바와 같이 제조하였다. 킬레이터 대 항체의 출발 몰 비는 12 대 1이었다. 50 μCi의 Ac-225을 50 μg의 MNPR-PCTA 접합체와 합하고, pH 값을 암모늄 아세테이트로 60분 동안 37℃에서 5.8로 조정하였다. 반응물의 총 용적은 100 μL였다.
25 μL 용적의 반응 혼합물을 크기 배제 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피에서 분석하였다. 이동상은 pH = 7.4에서 0.1 M 포스페이트 완충제이고, 유속은 1 mL/분이었다. 검출은 280 nm에서 UV 흡수에 의한 및 또한 방사측정 검출기에 의한 검출이었다.
UV 및 방사측정 검출기의 평가는 단백질을 사용한 방사성 공-용리를 나타낸다. 크기 배제 컬럼은 크기에 기초한 화학 물질을 분리한다. Ac-225의 용액으로부터 대부분의 방사성이 이의 방사성 딸에 유래되기 때문에, 본 발명자들은 후기 시점에 용리되는 단백질에 부착되지 않는 방사성 금속을 예상할 것이다. 소 분자와 일치하는 체류 시간을 갖는 방사성 신호가 없다.
이러한 결과는 방사성 Ac-225 딸, 예를 들면, Bi-213를 킬레이트화하는 MNPR-PCTA 접합체와 일치한다. 이론에 결부시키는 것은 아니지만, PCTA 접합체의 우수한 결합 성질이 Ac-225 뿐만 아니라 딸, 예를 들면, Bi-213도 또한 결합하는 킬레이터의 결과인 것으로 고려된다.
비스무트 이온은 매우 불용성이고, 비스무트 및 악티늄 이온 둘 다를 포함하여 침전시킬 수 있다. PCTA 킬레이트화 관능성에 의해 비스무트 침전의 방지는 Ac-225의 킬레이트화시 도울 수 있다.
mAb MNPR-101에 연결된 킬레이트화제로서 DOTA를 사용하는 유사한 크기 배제 컬럼 연구는 상이한 결과를 나타낸다. 따라서, DOTA가 사용되는 경우, 온-라인 방사선 검출기는 단백질과 연관된 매우 작은 신호를 나타내고, 단백질에 부착되지 않은 방사성 금속을 지시하는 후기-용리 피크에서 대부분의 활성을 나타낸다.
실시예 6
PCTA 접합체를 사람화 mAb MNPR-101와 함께 하기 2개의 다른 예시적인 마우스 단클론성 항체와 병행하여 제조하고: mAb ATN-616 및 mAb ATN-292. 12 및 75의 킬레이터 대 단백질 몰 비를 사용하여 Ac-225의 후속적인 킬레이트화를 최적화하였다.
MNPR-101 및 ATN-616을 PCTA와 12:1의 몰 반응 비로 접합한 반면, ATN-292를 75:1 과량으로 접합하였다. 용액의 pH 값을 1 M NaH2CO3 및 0.2 M HCl로 9.2로 조정하였다. 반응을 37℃에서 1.5시간 동안 수행하였다.
그렇게 형성된 접합체를 Bio-Rad 10DG 중력-공급 컬럼 (6,000 달톤 (Da) 분자량 컷-오프)을 사용하여 정제하고, 여기서, 각각의 접합체를 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충제, pH 5.77로 용리하였다. 용리된 분획 (0.5 mL)을 1.5 mL 금속-비함유 튜브에서 수집하고, UV 흡광도 280 nm에서 측정하였다. 3 또는 4개의 분획을 용리액 중 단백질의 농도에 좌우되어 합하고, Amicon® 농축기 (30 kDa)를 사용하여 재농축하였다. 합한 분획을 Pierce™ BCA 검정 키트 (Thermofisher; 최종 단백질 농도는 약 2-3 mg/mL임)를 사용하여 분석하였다.
크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 접합체 순도를, 상기한 바와 같이, 포스페이트-완충된 염수 용매 및 1 mL/분의 유속으로 분석하였다. HPLC 결과는 예상되는 약 8-분 피크를 네이키드 항체로부터 관찰하고, 이관능성 킬레이터 PCTA의 첨가와 일치하는 접합체의 체류 시간 (Rt)을 감소시킴을 나타낸다.
결과는, 더 큰 ΔRt는 더 높은 수의 항체에 결합된 킬레이트화제와 연관성이 있다는 점에서, 접합체 및 각각의 네이키드 mAb(들) 사이에 관찰된 체류 시간 (ΔRt)의 증가가 접합체의 Ac-225를 킬레이트화하는 후속적인 능력에 관련된다는 것을 제시하였다. 3개의 접합체 및 네이키드 항체 간의 체류 시간의 차이를 하기에 나타낸다.
실시예 7
고체 Ac-225를 포함하는 반응 바이알은 ORNL로부터 입수하고, 0.2 M HCl을 사용하여 용해시켰다. 실시예 6으로부터 3개의 접합체를 사용하여 Ac-225 킬레이트를 제조하였다. 모든 반응에 대한 100 μCi의 Ac-225 대 100 μg mAb-PCTA 킬런트 접합체의 비를 사용하고, 이에 따라, 100% 수율인 경우, 특이적 활성은 1 mCi/mg일 것이다. 반응을 0.2 M HCl 중 대략 10 μL Ac-225, 60 μL 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충제, 및 40 μL mAb-PCTA 접합체를 포함하는 약 110 μL 용적에서 수행하고, 각각의 단백질 농도에 좌우되고 이에 대해 정규화하였다. 반응을 pH 5.7 및 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅하였다.
25 μL 분취량의 각각의 킬레이트화 반응을 0.5 mL 분획을 Bio-Rad 10DG 중력-공급 컬럼 상에서 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충제를 사용하여 용리하여 정제하였다. Ac-표지화된 접합체가 3-4개의 "피크 분획"에서 용리하는 것을 예상하고, 이는 컬럼 상 유지되는 활성에 대해 합계되어 방사화학 수율을 측정한다. 최소 5시간 후 (이의 딸과의 Ac 평형화를 허용함), 분획 및 각각의 컬럼을 용량 칼리브레이터 (Capintec, 세팅 #086) 상에서 측정하였다. 용량 칼리브레이터에서 측정한 각각의 킬레이트의 중력-공급 분획으로부터 결과를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00018
각각의 반응으로부터 피크 분획을 Ac-225 딸 동위원소를 유지하는 킬런트의 능력을 측정하기 위해 정제-후 24시간 및 48시간 시점에서 측정하였다. 시간의 함수로서 증가하는 피크 활성을, 킬런트가 효과적으로 딸 동위원소를 제어하지 못하는 입증로서 제공한다. 그러나, 활성이 Ac-225 분해와 일치하는 속도로 감소하는 경우, 킬런트가 Ac-225 및 이의 딸을 유지할 수 있다는 입증을 제시한다. 하기 표에 관찰된 결과는, 각각의 피크 활성이 시간의 함수로서 방사성 증가를 나타내지 않기 때문에, Ac-225 딸을 효과적으로 제어하는 3개의 킬레이트화 시스템의 입증을 제공한다.
실시예 8
각각의 킬레이트화 반응의 20 μL 샘플을 280 nm에서 UV 흡수를 통한 검출 방법 및 방사측정 검출기로 등용매 방법 (1X PBS 용매, pH 7.4)을 사용하는 HPLC를 통해 분석하였다. 1 mL 분획을 1분당 수집하고, 평형화시키고 (>5시간), 이어서, 와이드 윈도우를 갖는 NaI 검출기 상에서 측정하였다.
실시예 5에서 관찰되는 바와 같이, HPLC 결과는 3개의 반응으로부터 단백질을 사용한 방사성 공-용리를 나타내었다. 소분자와 일치하는 체류 시간을 갖는 방사성 신호는 없고, 추가로 PCTA 킬레이터가 Ac-225 및 이의 딸에 결합된다는 추론을 뒷받침한다. 각각의 반응 수율의 결과를 하기 표에 나타낸다:
반응의 피크 수율이, 용량 칼리브레이터로 분석하는 경우, 실시예 7에 기재된 바와 같이 각각 80.6%, 77.0%, 및 75.5%를 나타내지만, 이들 동일한 반응은, HPLC 정제 및 NaI 검출을 사용하여 분석되는 경우, 각각 96.2%, 92.7%, 및 97.8%의 반응 수율을 나타낸다. 이러한 변화는 크기-배제 컬럼 상 잔류하는 활성을 측정하는 능력의 부족으로부터 기인하는 것으로 이해되고, 따라서, Bio-Rad 중력-공급 컬럼 및 용량 칼리브레이터 값으로부터 더 보존적 수율을 관찰한다.
기재된 방법 및 결과는 당해 이관능성 킬레이터, PCTA를 제시하고, 이는 사람화 mAb MNPR-101과 함께 뿐만 아니라, 또한 다른 항체, 예를 들면, 2개의 마우스 단클론성 항체 mAb ATN-616 및 mAb ATN-292과 함께 Ac-225에 결합하여 딸 분해 산물, 예를 들면, Bi-213을 유지하는 놀라운 능력을 나타낸다.
실시예 10
고려되는 PCTA-MNPR-101 킬레이터-표적화 종을 사용한 In-111의 킬레이트화 특성 및 안정성의 초기 연구. 따라서, PCTA-MNPR-101 (12:1로 생성됨)을 수성 용액 중에 9.2의 pH 값에서 (1M NaHCO3 및 HCl) 새로 제조하고, 이는 단백질 분석으로 4.0 mg/mL를 포함하며, 이를 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 접합체 (220.0 μL MNPR-101-PCTA)를 0.1M 암모늄 아세테이트를 사용하는 용리로 PD10 컬럼을 통해 통과시 정제하였다. 접합체를 포함하는 샘플을 수집하고, 30 kDa Amicon® 농축기를 사용하여 농축하였다 (4000 rpm 20분 동안).
3개의 수성 킬레이트화 반응을 설정하고, 각각은 10 mCi/mg의 표적 특이적 활성에 대해 약 200 μCi의 활성을 갖는다. 각각을 캐나다 온타리오주 오타와에 소재하는 BWXT Medical로부터 입수한 In-111 클로라이드와 혼합하였다. 모든 반응물을 4℃에서 저장하고, 24, 48 및 72시간 후 안정성에 대해 검정하였다.
이러한 정황에서 안정성은 경시적으로 방사성 이온 킬레이트화의 유지이다. 안정성을 비교를 위해 중력 공급 SEC 컬럼 (PD10 6,000 달톤 컷오프), HPLC 및 TLC로 측정하였다.
3개의 수성 킬레이트화 반응을 설정하고, 각각 10 mCi/mg의 표적 특이적 활성에 대해 약 200 μCi의 활성을 갖는다. 이들은 하기와 같다:
1) 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 4℃에서 72시간 동안 저장하였다.
2) 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 4℃에서 24시간 동안 저장하였다.
3) 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이팅하였다. 4℃에서 48시간 동안 저장하였다.
이러한 초기 연구의 결과를 하기 표에 나타낸다.
이러한 초기 연구의 결과를 상대적으로 고 수율의 킬레이트화를 10 mCi/mg 표적화된 특이적 활성에서 수득하였음을 나타내었다. 상태는 또한 수율을 증가시키도록 최적화할 수 있다. 3개의 상이한 분석 방법 각각은 킬레이트가 형성됨을 나타내었다. 인듐-111의 반감기가 약 2.8일인 경우, 합리적인 킬레이트화된 In-111 안정성을 관찰하였다.
본원에 인용된 특허, 특허 출원 및 간행물 각각은 참조로서 포함된다. 관사 하나 ("a" 또는 "an")의 사용은 하나 이상을 포함하는 것을 의도된다.
상기한 설명 및 실시예는 예시적인 것으로서 의도되고, 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 본 발명의 취지 및 범위 내에 또한 다른 변형이 가능하고, 당해 기술분야의 숙련가에게 용이하게 그자체로 제시될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NORTHSTAR MEDICAL TECHNOLOGIES, LLC MONOPAR THERAPEUTICS, INC. <120> UROKINASE PLASMINOGEN ACTIVATOR RECEPTOR-TARGETED RADIOPHARMACEUTICAL <130> 9975-131 <140> PCT/US22/30272 <141> 2022-05-20 <150> US 63/191,499 <151> 2021-05-21 <150> US 63/191,506 <151> 2021-05-21 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mAb MNPR-101 VL <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Tyr Gly His Ser Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mAb MNPR-101 CDR H1 <400> 10 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mAb MNPR-101 HC CDR H2 <400> 11 Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Ile Gln 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mAb MNPR-101 HC CDR H3 <400> 12 Ser Ile Tyr Gly His Ser Val Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mAb MNPR-101 HC Signal Sequence <400> 13 Met Gly Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 14 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mAb MNPR-101 HC Constant Region Sequence <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 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Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (26)

  1. 하기 화학식 I을 갖는 표적화된 방사성 약제(radiopharmaceutical):

    상기 화학식 I에서,
    Q+3은 3가 방사성 동위원소 이온이고;
    M은 양성자 (H+), 암모늄 이온 또는 알칼리 금속 이온이고;
    "g"는 mAb MNPR-101 또는 이의 파라토프-함유 부분의 각 분자당 킬레이트화된 PCTA-킬레이트화 3가 방사성 이온의 평균 수를 나타내는, 1 내지 약 12인 평균 값의 수이고;
    박스형 mAb MNPR-101은 화학적으로-결합된 단클론성 IgG1 카파 경쇄 서브그룹 2 (VK2) 유형 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내고, 이의 카파 쇄 가변 영역 (VL)은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 잔기 서열의 각각의 순차적 조합을 갖는 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3을 포함하고; 이의 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 잔기 서열의 각각의 순차적 유형 1 조합을 갖는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하고;
    Y-는 이온 전하의 균형을 맞추기 위해 필요한 양으로 존재하는 임의의 음이온이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VL이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 서열을 갖는, 표적화된 방사성 약제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카파 쇄 불변 영역 (LC)이 서열번호 7의 아미노산 잔기 서열을 갖는, 표적화된 방사성 약제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 (VH) 영역이 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 잔기 서열을 갖는, 표적화된 방사성 약제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 유형 1 불변 영역이 (CH1, CH2 및 CH3 도메인과 함께) 서열번호 14의 아미노산 잔기 서열을 갖는, 표적화된 방사성 약제.
  6. 약제학적으로 허용되는 희석제 중 용해 또는 분산된 제1항에 따른 표적화된 방사성 약제의 치료진단적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 희석제가 주위 온도에서 수성 액체이고, 비경구 투여를 위해 개조되는, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물이 상기 의도되는 포유류 종 숙주 수령자의 혈액에 등장성인, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 의도되는 포유류 종 숙주 수령자가 사람인, 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 평균 약 3 내지 약 12까지 결합하는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, Q+3이 Ac-225, Bi-212, Bi-213, Zr-89 또는 In-111 이온인, 표적화된 방사성 약제.
  12. 제6항의 약제학적 조성물을 숙주에게 투여함을 포함하는, 바람직하지 않은 혈관형성, 종양 성장 및/또는 종양 전이를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 포유류 숙주의 치료 방법으로서, 상기 치료진단적 유효량은 상기 표적화된 방사성 약제의 표적화된 세포-사멸 유효량인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태가 암인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암이 폐 암, 난소 암, 전립샘 암, 뇌 암, 방광 암, 두경부 암, 췌장 암 또는 결장 암 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 포유류 숙주가 사람인, 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 투여가 반복되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 표적화된 방사성 약제가 상기 포유류 숙주에게 약 80 내지 약 120 kBq/kg 체중을 제공하기 위해 충분한 양으로 투여되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 투여가 반복되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 투여가 약 60-일 간격으로 반복되는, 방법.
  20. 바람직하지 않은 혈관형성, 종양 성장 및/또는 종양 전이를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 상태를 갖는 포유류 숙주의 검정 방법으로서,
    a) 제6항의 약제학적 조성물을 상기 숙주에게 투여하는 단계로서, 상기 치료진단적 양은 상기 표적화된 방사성 약제의 진단적 유효량인, 단계;
    b) 상기 방사성 약제를 상기 표적화된 세포에 결합시키기 위해 약 1시간 내지 수일의 기간 동안 상기 숙주를 유지하는 단계; 및
    c) 상기 표적 세포-결합 표적화된 방사성 약제에 의해 방출된 방사선을 검출하고 위치를 찾아내기 위해 상기 유지된 숙주를 스캐닝하는 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태가 암인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암이 폐 암, 난소 암, 전립샘 암, 뇌 암, 방광 암, 두경부 암, 췌장 암 또는 결장 암 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 포유류 숙주가 사람인, 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 투여가 반복되는, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 표적화된 방사성 약제가 약 0.5 내지 약 6.0 mCi의 양으로 상기 사람에게 투여되는, 방법.
  26. 킬레이터가 mAb MNPR-101 사람화 단클론성 항체에 화학적으로 결합된 화학식 III으로 도시된 표적화된 전구-방사성 약제(pro-radiopharmaceutical) PCTA 킬레이트 작제물:

    상기 화학식 III에서,
    M은 양성자 (H+), 암모늄 이온 또는 알칼리 금속 이온이고;
    "g"는 mAb MNPR-101 또는 이의 파라토프-함유 부분의 각 분자당 PCTA-킬레이트 분자의 평균 수를 나타내는, 약 1 내지 약 12인 평균 값의 수이고;
    박스형 mAb MNPR-101은 화학적으로-결합된 단클론성 IgG1 카파 경쇄 서브그룹 2 (VK2) 유형 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내고,
    여기서, VK2 가변 영역 (VL)이 서열번호 1의 아미노산 잔기 서열을 갖고, 카파 쇄 불변 영역 (LC)이 서열번호 7의 아미노산 잔기 서열을 갖고;
    이의 중쇄 가변 영역 (VH)이 서열번호 8의 아미노산 잔기 서열을 갖고, 중쇄 유형 1 불변 영역이 (CH1, CH2 및 CH3 도메인과 함께) 서열번호 1의 아미노산 잔기 서열을 갖는다.
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