CN111372613A - 放射免疫缀合物与其他药物联合治疗非霍奇金淋巴瘤 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及放射免疫缀合物与蛋白质或分子组合，用作药物，其中蛋白质或分子能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展，蛋白质或分子能够通过有丝分裂抑制进展，蛋白质或分子作为BCL2抑制剂，或者蛋白质或分子作为PARP抑制剂。这种药物可用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

Description

放射免疫缀合物与其他药物联合治疗非霍奇金淋巴瘤
技术领域
本发明涉及放射免疫缀合物与蛋白质或分子组合，用作药物，其中蛋白质或分子是能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子。这种药物可用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
背景技术
B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)来源于B淋巴细胞处于分化的各个阶段，从前体细胞到成熟阶段。目前，患有NHL的患者通过使用利妥昔单抗单克隆抗体的免疫疗法联合化学疗法进行治疗。
利妥昔单抗是针对CD20的嵌合IgG1 mAb，CD20是在大多数恶性和正常B细胞(从前淋巴细胞到浆膜前细胞)表面表达的33-37kDa的跨膜蛋白。利妥昔单抗的功效由多种细胞死亡机制介导，例如细胞凋亡，信号转导途径，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)以及补体依赖的细胞毒性(CDC)。
然而，仅利妥昔单抗的反应率是相当中等的，并且在许多周期的治疗后，该疗法对一些患者将失去疗效。例如，对利妥昔单抗和化学疗法产生抗药性的复发性滤泡性淋巴瘤(FL；NHL型)患者，以及在一线治疗后2年内经历疾病进展的患者最需要新的治疗方法。利妥昔单抗难治性FL患者或疾病进展早期的患者的5年总生存率分别为58％和50％，而所有FL患者的5年总生存率则约为90％。
放射免疫疗法(RIT)使用放射标记的抗体来结合放射和抗体的细胞毒性，对NHL的治疗具有显著疗效。两种抗CD20 mAb，分别用yttrium-90放射性标记的替伊莫单抗(Zevalin，美国光谱制药公司)和用碘131放射性标记的托西莫单抗(Bexxar，英国葛兰素史克公司)，分别在2002年和2003年被FDA批准用于NHL治疗。但是，在使用利妥昔单抗治疗数轮后，将使用Zevalin和Bexxar，剩余的循环利妥昔单抗可能会损害后续抗CD20治疗的疗效。
因此，靶向不同抗原的缀合物可能是理想的。Lutetium-177[177Lu]-lilotomabsatetraxetan(
Figure BDA0002501161310000021
以前称为177Lu-DOTA-HH1)是一种新型缀合物，其中鼠mAb利洛托单抗靶向在恶性B细胞上表达的CD37受体，而177Lu是一种β-发射子，平均β能量为0.133MeV(水中的平均β值和最大β范围：0.23mm和1.9mm)。CD37是一种31kDa跨膜蛋白，属于四跨蛋白家族。它对磷脂酰肌醇3’-激酶(PI3K)/AKT的生存途径和体液免疫具有二价作用。由于CD37在NHL细胞中高表达，因此它代表了一种靶向治疗的有吸引力分子。
177Lu-lilotomab目前在2b期临床试验中进行了试验，用于治疗复发的惰性B细胞NHL，其尤其在FL患者身上体现了可靠的安全性和有效性数据。增强177Lu-lilotomab的作用将非常有价值。
发明内容
本发明涉及一种组合物，该组合物包含放射免疫缀合物和蛋白质或分子，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab，所述蛋白质或分子能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展；一种组合物，该组合物包含放射免疫缀合物和蛋白质或分子，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab，所述蛋白质或分子能够通过有丝分裂抑制进展；一种组合物，该组合物包含放射免疫缀合物和蛋白质或分子，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab，所述蛋白质或分子能够抑制聚ADP核糖聚合酶(PARP)；以及一种组合物，该组合物包含放射免疫缀合物和BCL2蛋白抑制剂，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab。
这些组合物可以用作药物。
本发明的一个方面还涉及放射免疫缀合物与蛋白质或分子组合，用作药物，其中所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab，所述蛋白质或分子作为BCL2抑制剂，一个蛋白质或分子能够通过有丝分裂抑制进展，或者一个蛋白质或分子能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展。
本发明的一个方面还涉及放射免疫缀合物与蛋白质或分子组合，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab，所述蛋白质或分子能够抑制聚ADP核糖聚合酶(PARP)。对PARP的抑制降低了细胞修复受损DNA的能力并增加了细胞对电离辐射的敏感性。
所述药物可以针对非霍奇金淋巴瘤(NHL)，并且NHL可以选自转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴白血病、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、移植诱导的淋巴瘤。
本发明的一个实施方案是在联合疗法中的用途，其中组合物之后是用抗体疗法，免疫缀合物疗法或其组合同时或后处理。可以在组合物之后以单次施用或以重复施用方式进行抗CD20抗体治疗，并且抗CD20抗体可以是利妥昔单抗、obinutuzumab或奥法木单抗。
包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab，的放射免疫缀合物可以通过螯合接头连接，该螯合接头可以选自p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯，p-SCN-Bn-DTPA和CHX-A”-DTPA。
所述蛋白质或分子可以是参与G2/M细胞周期阻滞的蛋白质的抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，所述蛋白质或分子选自：MK-1775、PD-166285、AMG900、AT7519、AZD7762、CYC116、黄酮哌啶醇、GSK461364、Alisertib、BI2536、JNJ-7706621、LY2603618、NSC23766、NU6027、PHA-79388、甲苯磺酰基-L-精氨酸甲基酯(TAME)、BI6727(Volasertib)、ON-01910(Rigosertib)、HA-1077(Fasudil)、SCH727965(Dinaciclib)、LY2835219、LEE011、Salirasib、K-115(Ripasudil)、PD0332991(Palbociclib)。
所述组合物可以配制成药物组合物，其可以包含一种或多种药学上可接受的载体或佐剂。
具体实施方式
本发明的目的是鉴定涉及对放射免疫缀合物的治疗应答的分子机制，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，以便鉴定i)可从该治疗中获益最多的NHL型和ii)相关的联合伴侣。
因此，本发明涉及一种用于治疗特定的NHL型癌症的包含放射免疫缀合物的组合物，所述放射免疫缀合物例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.和/或212Pb-chHH1.1。
本发明还涉及一种组合物，其包含放射免疫缀合物，例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，以及另外的药物，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子。
另一方面涉及放射免疫缀合物和另外的药物的组合，用作药物，所述放射免疫缀合物例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，所述另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子。
放射免疫缀合物
本发明的放射免疫缀合物包含抗体和放射性核素。抗体和放射性核素可以通过接头链接。
单克隆抗体(mAb或moAb)利洛托单抗以前被称为tetulomab或HH1，而177Lu-lilotomab satetraxetan以前被称为177Lu标记的HH1抗体，或被称为177Lu-tetulomab或商品名Betalutin。
PCT/IB2012/057230和PCT/EP2011/051231中公开了HH1的具体变体，其通过引用并入本文，并且HH1的具体变体公开为包含在本发明中的具体实施例。HH1的可变序列在PCT/IB2012/057230的第30-31页(SEQ ID Nos：1-4)中公开。
因此，基于上述公开内容，可以调节包含在本发明的放射免疫缀合物中的HH1的变体。在本发明的一个优选实施方案中，HH1变体是HH1的鼠变体或嵌合变体。在本发明的另一个实施方案中，HH1变体是HH1的嵌合变体，chHH1.1，其为如PCT/IB2012/057230的实施例1中所公开的嵌合HH1同种IgG1，或chHH1.3H，其为具有R435H突变的嵌合HH1同种IgG3。
因此，177Lu-lilotomab可指其中抗体是鼠HH1的betalutin，但在另一个实施方案中也可指其中抗体是嵌合变体chHH1.1的betalutin。
177Lu-lilotomab satetraxetan是一种放射性免疫缀合物(RIC)，也称为抗体放射性核素缀合物(ARC)，其能够结合或靶向目标抗原。在当前情况下是该抗原CD37。satetraxetan是DOTA的衍生物，p-SCN-苄基-DOTA。
177Lu-lilotomab可以通过螯合接头连接。螯合接头选自：p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-苄基-TCMC和CHX-A″-DTPA。在螯合接头satetraxetan的一个实施方案中，也称为p-SCN-苄基-DOTA。在这个具体的实施方案中，177Lu-lilotomab是药物betalutin。
在本发明的一个实施方案中是放射免疫缀合物177Lu-chHH1.1。本发明的另一个实施方案是放射免疫缀合物212Pb-chHH1.1。在这个具体的实施方案中，p-SCN-苄基-TCMC是螯合剂。chHH1.1是HH1(利洛托单抗)抗体的嵌合IgG1版本。
因此，所述放射性核素可以是177Lu或212Pb。
因此，本发明的一个实施方案涉及放射免疫缀合物和另外的药物的组合，用于根据本发明的用途，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，所述另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中177Lu-lilotomab通过螯合接头连接。
本发明的另一个实施方案涉及放射免疫缀合物和另外的药物的组合，用于根据本发明的用途，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，所述另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中螯合接头选自p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯，p-SCN-Bn-DTPA、CHX-A”-DTPA和p-SCN-苄基-TCMC。
维奈托克阻断抗凋亡B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白，导致程序性细胞死亡。在某些淋巴恶性肿瘤中，Bcl-2的过表达有时显示与对化疗的耐药性增加有关。因此，BCL2抑制剂可以是维奈托克。
螯合剂p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯、p-SCN-Bn-DTPA、CHX-A”-DTPA优选用于177Lu的螯合，而p-SCN-苄基-TCMC优选用于212Pb的螯合。
本发明的另一实施方案涉及放射免疫缀合物和另外的药物的组合，用于根据本发明的用途，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，所述另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中螯合接头是satetraxetan，也称为p-SCN-苄基-DOTA。
给药途径和方式
放射免疫缀合物的施用指的是指静脉内输注或静脉内注射。更具体地，本发明的放射免疫缀合物和抗体可以通过连接至滴注室的外周插管直接在静脉内施用，该外周插管防止空气栓塞并允许估计进入患者的流速。在一个实施方案中，可以以重复方式施用放射免疫缀合物和/或抗体。
在另一个实施方案中，放射免疫缀合物之后施用的是单克隆抗体(或者免疫缀合物)，这两者均可以以重复的方式进行施用。
本发明的一个实施方案涉及本发明的放射免疫缀合物的用途，该放射免疫缀合物联合其它疗法一起施用，或除了其他疗法外，可以进行额外施用。
在本发明的一个实施方案中，其他疗法选自用利洛托单抗预处理，用退热药和抗组胺药进行预治疗、化学疗法、免疫检查点抑制剂、单克隆抗体疗法、手术、放射疗法和/或光动力疗法。
在本发明的另一个实施方案中，其他疗法是骨髓移植或干细胞移植和/或疗法。
在本发明的一个实施方案中是组合物在本发明中的用途，其中该用途用于联合疗法，其中该组合物之后是用抗体疗法、免疫缀合物疗法或其组合同时或后处理。可以在组合物之后以单次施用或以重复施用方式进行抗CD20抗体治疗。
抗CD20抗体可以是利妥昔单抗。抗CD20抗体也可以是obinutuzumab或奥法木单抗或利妥昔单抗生物类似药，如Rixathon或Truxima。
给药剂量
本发明中的放射免疫缀合物包含可用于治疗非霍奇金淋巴瘤的药物中的单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab satetraxetan。本发明的一个实施方案涉及以选自10MBq/kg，12.5MBq/kg，15MBq/kg，17.5MBq/kg，20MBq/kg，25MBq/kg，30MBq/kg，35MBq/kg，40MBq/kg，45MBq/kg和50MBq/kg中的一个浓度施用的177Lu-lilotomab satetraxetan。
在本发明的一个实施方案中，浓度为15MBq/kg。
在本发明的另一个实施方案中，浓度为17.5MBq/kg。
在本发明的另一个实施方案中，浓度为20MBq/kg。
能够通过G2/M检查点导致细胞周期进展的蛋白质或分子
能够通过G2/M检查点导致细胞周期进展的蛋白质或分子具有直接或间接影响G2/M检查点的能力。例如，这可以通过参与细胞周期转变的关键蛋白的磷酸化或去磷酸化来实现。
在本发明的一个实施方案中，蛋白质或分子导致较低的WEE-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化和通过G2/M检查点导致细胞周期进展或通过有丝分裂抑制进展。在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的组合物，其中所述蛋白质或分子导致较低的MYT-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化和通过G/M细胞周期阻滞导致细胞周期进展。在本发明的另一个实施方案中，蛋白质或分子导致更高的含CDK7的CAK激酶介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化。该蛋白质或分子也可以是AURORA激酶的抑制剂(AURA，AURB，AURC或Polo样激酶PLK1,2,3,4)。
该蛋白质或分子还可以是参与G2/M细胞周期阻滞的蛋白质的抑制剂，例如参与从G2到M期转变的蛋白质的抑制剂。然而，蛋白质或分子也可以是蛋白质的激活剂，而蛋白质是G2/M细胞周期转变中的限制因素。
包含放射免疫缀合物和蛋白质或分子的组合或组合物用于根据本发明的用途，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1单体，例如177Lu-lilotomab，所述蛋白质或分子能够通过G2/M检测点导致细胞周期进展或能够通过M期抑制细胞周期进展，所述组合或组合物可包含一个或多个蛋白质或分子。这些蛋白质或分子可选自：MK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、黄酮哌啶醇、GSK461364、JNJ-7706621、LY2603618、NSC23766、NU6027、PHA-793887、甲苯磺酰基-L-精氨酸甲基酯(TAME)、BI6727(Volasertib)、ON-01910(Rigosertib)、HA-1077(Fasudil)、SCH727965(Dinaciclib)、LY2835219、LEE011、Salirasib、K-115(Ripasudil)、PD0332991(Palbociclib)、BI2536、MLN8237(Alisertib)或蛋白质14-3-3抑制剂，例如双氟哌啶。
因此，蛋白质或分子可以是MK-1775。蛋白质或分子也可以是PD-166285。蛋白质或分子也可以是AMG900。蛋白质或分子也可以是AZD7762。该蛋白质或分子也可以是JNJ7706621。蛋白质或分子也可以是CYC116。蛋白质或分子也可以是AT7519。蛋白质或分子也可以是LY2603618。蛋白质或分子也可以是黄酮哌啶醇。蛋白质或分子也可以是GSK461364。蛋白质或分子也可以是NSC23766。蛋白质或分子也可以是NU6027。蛋白质或分子也可以是PHA-793887。蛋白质或分子也可以是甲苯磺酰基-L-精氨酸。蛋白质或分子也可以是甲基酯(TAME)。蛋白质或分子也可以是BI6727(Volasertib)。蛋白质或分子也可以是ON-01910(Rigosertib)。蛋白质或分子也可以是HA-1077(Fasudi)。蛋白质或分子也可以是SCH727965(Dinaciclib)。蛋白质或分子也可以是LY2835219。蛋白质或分子也可以是LEE011。蛋白质或分子也可以是Salirasib。蛋白质或分子也可以是K-115(Ripasudil)。蛋白质或分子也可以是PD0332991(Palbociclib)。蛋白质或分子也可以是14-3-3抑制剂。蛋白质或分子也可以是双氟哌啶。蛋白质或分子也可以是PLK1抑制剂BI2536。蛋白质或分子也可以是Aurora激酶抑制剂MLN8237(Alisertib)。
蛋白质或分子是PARP抑制剂(PARPi)
PARP抑制剂是一组酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)的药理抑制剂。该抑制剂可有效用于多种适应症，包括癌症。
根据本发明的用途的组合或组合物可包含一个或多个蛋白质或分子，该组合或组合物包含含有单克隆HH1抗体(例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1)的放射免疫缀合物和作为PARP抑制剂的蛋白质或分子。
这些蛋白质或分子可以选自奥拉帕尼(AZD2281、Ku-0059436)、维利帕尼(ABT-888)、鲁卡帕尼(AG-014699、PF-01367338)、塔拉唑帕尼(BMN 673)、AG-14361、INO-1001(3-氨基苯甲酰胺)、A-966492、PJ34 HCl、尼拉帕尼(MK-4827)、UPF 1069、ME0328、NMS-P118、E7449、吡啶甲酰胺、苯甲酰胺、尼拉帕尼(MK-4827)甲苯磺酸酯、NU1025、伊尼帕利(BSI-201)、AZD2461和BGP-15 2HCl。
因此，该蛋白质或分子可以是奥拉帕尼(AZD2281、Ku-0059436)。蛋白质或分子也可以是维利帕尼(ABT-888)。蛋白质或分子也可以是鲁卡帕尼(AG-014699、PF-01367338)。蛋白质或分子也可以是塔拉唑帕尼(BMN 673)。蛋白质或分子也可以是AG-14361。蛋白质或分子也可以是INO-1001(3-氨基苯甲酰胺)。蛋白质或分子也可以是A-966492。蛋白质或分子也可以是PJ34HCl。蛋白质或分子也可以是尼拉帕尼(MK-4827)。蛋白质或分子也可以是UPF1069。蛋白质或分子也可以是ME0328。蛋白质或分子也可以是NMS-P118。蛋白质或分子也可以是E7449。蛋白质或分子也可以是吡啶甲酰胺。蛋白质或分子也可以是苯甲酰胺。该蛋白质或分子也可以是尼拉帕尼(MK-4827)甲苯磺酸酯。蛋白质或分子也可以是NU1025。蛋白质或分子也可以是伊尼帕利(BSI-201)。蛋白质或分子也可以是AZD2461。蛋白质或分子也可以是BGP-152HCl。
根据本发明的用途的组合或组合物可包含一个或多个蛋白质或分子，该组合或组合物包含含有单克隆HH1抗体(例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1)的放射免疫缀合物和作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子。这些蛋白质或分子可以选自venetoclax(ABT-199、GDC-0199)、奥巴拉克甲磺酸盐(GX15-070)、HA14(1)、ABT-263(navitoclax)、ABT-737、TW-37，AT101、sabutoclax、WEHI-539、A-1155463、棉酚和AT-101、阿朴棉子酚、S1、2-甲氧基抗霉素A3、BXI-61、BXI-72、TW37、MIM1、UMI-77和藤黄酸。
因此，所述蛋白质或分子可以是venetoclax(ABT-199、GDC-0199)。蛋白质或分子可以是奥巴拉克甲磺酸盐(GX15-070)。蛋白质或分子也可以是HA14(1)。蛋白质或分子也可以是ABT-263(navitoclax)。蛋白质或分子可以是TW-37。蛋白质或分子也可以是AT101。蛋白质或分子也可以是sabutoclax。蛋白质和分子也可以是藤黄酸。蛋白质和分子也可以是WEHI-539。蛋白质和分子也可以是A-1155463。蛋白质和分子也可以是棉酚和AT-101。蛋白质和分子也可以是阿朴棉子酚。蛋白质和分子也可以是S1。蛋白质和分子也可以是2-甲氧基抗霉素A3。蛋白质和分子也可以是BXI-61。蛋白质和分子也可以是BXI-72。蛋白质和分子也可以是TW37。蛋白质和分子也可以是MIM1。蛋白质和分子也可以是UMI-77。
药物组合物
抗体、放射免疫缀合物和其他药物通常配置成药物组合物来治疗疾病。此类组合物针对诸如生理耐受性和保存期限的参数进行了优化。
因此，在本发明的一个实施方案中是将本发明的放射免疫缀合物和/或组合物配制成一种或多种药物组合物。
本发明的一个实施方案涉及如上所述的药物组合物，其还包含一种或多种其他治疗剂。在本发明的另一个实施方案中，所述一种或多种其他治疗剂选自诱导细胞凋亡的药剂。通常，缓冲溶液是药物组合物的重要元素，这种缓冲溶液在很大程度上保持了放射免疫缀合物的化学完整性，并且将这种缓冲溶液输入患者中在生理上是可接受的。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体和/或佐剂。可接受的药学载体包括但不限于无毒缓冲液、填充剂、等渗溶液等。更具体地，药学载体可以是但不限于生理盐水(0.9％)、半生理盐水、林格氏乳酸盐、5％葡萄糖、3.3％葡萄糖/0.3％盐水。生理上可接受的载体可以包含辐射稳定剂，例如抗坏血酸，其在储存和运输过程中保护放射性药物的完整性。
优选在制剂缓冲液中用作赋形剂的是磷酸二氢钠一水合物、氯化钠、重组人白蛋白、抗坏血酸钠、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和氢氧化钠。
优选地，制剂缓冲液中包括磷酸盐以在保存期限内保持最终产品的pH值。
优选地，在配制缓冲液中包括重组人白蛋白，作为利洛托单抗satetraxetan缀合物的稳定剂。白蛋白还充当放射防护剂。使用与衍生自酵母的人血清白蛋白在结构上相同的重组人白蛋白。生产过程中不涉及来自人类或动物的原材料。赋形剂是众所周知的，并用于供人类使用的药品中。
优选地，制剂中包含抗坏血酸钠，以充当辐射清除剂，以确保Betalutin在产品的保质期内的稳定性。
优选地，将DTPA作为赋形剂引入Betalutin制剂中，以螯合任何游离的177Lu3+离子并使该杂质从骨中的积累重新转移至快速的肾脏清除(Li等人，2001；Breeman等人，2003)。Betalutin在12mL中含有9.3μmolDTPA，而施加的最大无载体量(n.c.a)177Lu3+(>3,000GBq/mg)(6.9GBq)对应于少于15nmol Lu离子。DTPA的摩尔过量是Lu3+离子的1000倍多。此外，当考虑到大多数Lu3+离子(≥95％)与利洛托单抗satetraxetan螯合时，摩尔过量几乎是100,000倍。因此，预计DTPA会定量螯合所有游离的177Lu3+离子，因此在说明书中将177Lu-DTPA指定为放射化学杂质。
优选地，制剂缓冲剂是pH为6.9至7.0的水溶液，因此在药物和制剂缓冲剂之间不会出现不相容性。本发明的一个实施方案包括本发明的药物组合物和一种或多种另外的抗体或放射免疫缀合物。
本发明的一个方面涉及一种药物组合物，其包含(每mL)：0.75mg镥(177Lu)利洛托单抗satetraxetan，0.46mg乙酸铵和微量的HCl3。本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含(每mL)：30.86mg抗坏血酸钠，0.31mg DTPA，0.17mg NaOH，60.82mg重组人白蛋白，3.32mg磷酸二氢钠一水合物和4.34mg氯化钠，其中将pH调节至6.9-7.0。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含：14％的药物组合物(每mL)包含：0.75mg镥(177Lu)利洛托单抗satetraxetan，0.46mg乙酸铵和微量的HCl3。86％的药物组合物(每mL)包含：30.86mg抗坏血酸钠，0.31mg DTPA，0.17mg NaOH，60.82mg重组人白蛋白，3.32mg磷酸二氢钠一水合物和4.34mg氯化钠，其中将pH调节至6.9-7.0。
本发明还涉及本实施例的药物组合物，以及本文提出的剂量施用方式。这包括本发明的药物组合物用于治疗非霍奇金淋巴瘤的用途。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点、维奈托克导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，所述蛋白质或分子可制备成一种或多种药物组合物。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体或佐剂。
医学用途
需要用包含单克隆HH1抗体，例如177Lu-lilotomab satetraxetan、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1的放射免疫缀合物进行治疗的人患有CD37相关疾病，通常是B细胞淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
NHL是一组血癌，包括除霍奇金淋巴瘤以外的所有类型的淋巴瘤。症状包括淋巴结肿大、发烧、盗汗、体重减轻和疲倦感。其他症状可能包括骨痛、胸痛或发痒。有些形式发展缓慢，而有些形式则发展迅速。有几种类型的NHL。因此，本发明的另一个实施方案涉及淋巴瘤，其是选自以下的亚型：滤泡I-IIIA级、边缘区、小淋巴细胞、淋巴浆细胞性、弥漫性大B细胞淋巴瘤和套细胞。
因此，所述放射免疫缀合物，本发明的组合物和/或本发明的组合可以用作药物。该药物可用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
NHL可选自转化性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、移植诱导的淋巴瘤。
因此，对于根据本发明使用的组合物或对于根据本发明使用的组合，NHL可以是转化的滤泡性淋巴瘤。对于根据本发明使用的组合物或对于根据本发明使用的组合，NHL可以是弥漫性大B细胞淋巴瘤。本发明的一个实施方案是NHL套细胞淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL边缘区淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL慢性淋巴白血病。本发明的另一个实施方案是NHL皮肤T细胞淋巴瘤。本发明的一个实施方案是NHL淋巴浆细胞性淋巴瘤。本发明的一个实施方案是NHL边缘区B细胞淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL MALT淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL小细胞淋巴细胞性淋巴瘤。本发明的一个实施方案是NHL伯基特淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL间变性大细胞淋巴瘤。本发明的一个实施方案是NHL淋巴母细胞淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL外周T细胞淋巴瘤。本发明的另一个实施方案是NHL移植诱导的淋巴瘤。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中所述药物用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中所述用途用于联合疗法，其中组合物之后是用抗体疗法、免疫缀合物疗法或其组合同时或后处理。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，其中在组合物之后以单次施用或以重复施用方式进行抗CD20抗体治疗。所述抗CD20抗体可以是利妥昔单抗、obinutuzumab或奥法木单抗。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，其中蛋白质或分子导致WEE-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)磷酸化程度降低。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，其中蛋白质或分子导致MYT-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)磷酸化程度降低。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，其中蛋白质或分子导致含CDK7的CAK激酶介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化程度更高。
放射免疫缀合物和其它药物的组合可根据本发明来进行使用，其中所述放射免疫缀合物例如为177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，该另外的药物可以是：能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，其中所述蛋白质或分子是G2/M细胞周期阻滞的抑制剂，蛋白质或分子是能够通过有丝分裂抑制进展，蛋白质或分子是BCL2抑制剂，或者蛋白质或分子是PARP抑制剂。
能够通过G2/M检查点导致细胞周期进展的蛋白质或分子可以特异性地靶向参与CDK1 T14磷酸化的酶。能够通过G2/M检查点导致细胞周期进展的蛋白质或分子可以特异性地靶向参与CDK1 Y15磷酸化的酶。能够通过G2/M检查点导致细胞周期进展的蛋白质或分子可以特异性地靶向参与CDK1 Y161磷酸化的酶。
所述组合可以包含在相同的组合物中，或视为其中化合物分别施用的联合治疗。
某些类型的癌症具有特定的特征，使用放射免疫缀合物可能会有所帮助。这些包括抑制G2/M细胞周期阻滞的癌症类型。癌症类型也可能是抑制G1细胞周期阻滞的类型。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于治疗显示出抑制性CDK1磷酸化降低的非霍奇金淋巴瘤的包含177Lu-lilotomab satetraxetan的组合物。减少的抑制性CDK1磷酸化可以来自较低的WEE-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)磷酸化。减少的抑制性CDK1磷酸化可能来自较低的MYT-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)磷酸化。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤的包含177Lu-lilotomabsatetraxetan的组合物，其显示出更高的含CDK7的CAK激酶介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化。
综上
应该理解的是，以上结合根据本发明的化合物进行的任何讨论的特征和/或方面类似地适用于本文所述的方法。
以下提供以下附图和实施例以说明本发明。这些附图和实施例是说明性的，而不以任何方式解释为限制性的。
附图说明
图1显示了Ramos，DOHH2和Rec-1细胞在未标记的mAb中暴露18小时后所进行的凋亡测量(处理时间：x轴以下的条形)。
图2显示了Ramos，DOHH2和Rec-1细胞在6MBq/mL放射性标记的mAb中暴露18小时后所进行的凋亡测量(处理时间：x轴以下的条形)。
图3显示了Ramos，DOHH2和Rec-1细胞在6MBq/mL177Lu-lilotomab或177Lu-利妥昔单抗中暴露18小时至0小时之后在细胞周期时相中的分布(处理时间：x轴以下的条形)。
图4显示了Ramos，DOHH2和Rec-1细胞在40μg/mL利洛托单抗或利妥昔单抗中暴露18小时至0小时之后在细胞周期时相中的分布(处理时间：x轴以下的条形)。
图5显示了在6MBq/mL177Lu-lilotomab中暴露18小时之后的不同时间，Ramos，DOHH2和Rec-1细胞中CDK1及其磷酸化的表达。
图6显示了在暴露于6MBq/mL 177Lu-lilotomab 18小时后的不同时间，Ramos，DOHH2和Rec-1细胞中p345-Chk1，Wee-1，Myt-1和CDK7的表达。
图7显示了G2/M阻滞抑制剂对细胞增殖的影响。
图8显示了用177Lu-lilotomab+MK-1775或177Lu-lilotomab+PD-166285处理18小时后，Ramos，DOHH2和Rec-1细胞中p14-CDK1和p15-CDK1的表达。
图9显示了G2/M中已处理细胞数与G2/M中未处理细胞数之比。治疗为单独使用177Lu-lilotomab或与MK-1775或PD-166285联合使用。
图10显示了177Lu-lilotomab的拟议作用机理。
图11显示了RIT后Ramos，DOHH2和Rec-1细胞表面的CD133和CD44的定量(处理时间：x轴以下的条形)。
图12显示了使用Chou-Talalay方法计算的0.5μg/mL或1μg/mL的Humalutin与不同剂量的奥拉帕尼的结合指数。
图13显示了未经处理的(Minus_Betalutin)和经Betalutin处理的U2932(A，B)和RIVA(C，D)细胞的增殖，分别经1μg/mL(U-2932)和0.5μg/mL(RIVA)Betalutin处理(Plus_Betalutin)。播种后三天，将RealTimeGlo添加到培养基中，并从第3天(A，C)开始连续3天测量相对发光单位(RLU)。误差条描述重复样品的标准偏差。该测定法测量发光信号，该发光信号取决于存活细胞对MT细胞存活底物的持续降低以及NanoLuc荧光素酶的快速周转。B和D区显示相对于观察期(第3天)开始标准化的相对发光。
图14显示了分别在第3、4、5和6天(相对细胞生长)处理过的U-2932(2A)和RIVA(2B)的相对增殖。
图15显示了在第3、4、5和6天相对于未处理的对照细胞，已处理的U-2932(A，B)和RIVA(C，D)细胞的相对增值。在不含有Betalutin的情况下，当在10nM(A,B)处使用AG-14361时，AG-14361对U-2932或RIVA细胞的细胞增殖影响很小。AG-14361在1μM f.c(C)时增强了Betalutin在U-2932细胞中的增殖抑制作用，和在100nM f.c.(D)共同给药时，增强了Betalutin在RIVA细胞中的增殖抑制作用。
图16显示了在第3、4、5和6天相对于未处理的对照细胞，已处理的U-2932(A，B)和RIVA(C，D)细胞的相对增殖。在不含有Betalutin的情况下，在所有测试浓度下，鲁卡帕尼对U-2932或RIVA细胞的细胞增殖影响很小。鲁卡帕尼在1μM f.c(C)时增强了Betalutin在U-2932细胞中的增殖抑制作用，和在100nM f.c.(D)共同给药时，增强了Betalutin在RIVA细胞中的增殖抑制作用。
图17显示了U-2932(A)和RIVA(B)中的Betalutin和PARP抑制剂AG-14361(右柱)或鲁卡帕尼(中柱)组合的BLISS得分。左柱表示在所示日期测量的Betalutin单药治疗效果的两个标准偏差的任意截断值。
图18显示了使用Chou-Talalay方法计算的0.5μg/mL和1μg/mL的Humalutin与不同剂量的维奈托克的结合指数。
图19显示了G2/M阻滞抑制剂对体外细胞周期和体内肿瘤进展的影响。(A)确定暴露于177Lu-lilotomab或177Lu-lilotomab+1μM MK-1775(WEE-1抑制剂)或PD-166285(WEE-1和MYT-1抑制剂)时，G2/M细胞周期中Ramos，DOHH2，Rec-1和OCI-Ly8细胞与未处理的细胞(Ctrl；设置为1)的比。数据是三个独立实验的平均值±SD，一式三份。(B)携带Ramos肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠，接受i)一次静脉注射250MBq/kg或500MBq/kg的177Lu-lilotomab，ii)第1天至第5天后注射30mg/kg MK-1775(每天2次)，iii)第1天至第5天后注射250MBq/kg的177Lu-lilotomab和30mg/kg MK-1775(每天2次)的组合。根据异种移植后时间监测肿瘤生长(左图)，并建立Kaplan Meyer生存曲线(右图)(n＝6-9/组)。(C)携带OCI-Ly肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠，接受i)一次静脉注射250MBq/kg或500MBq/kg的177Lu-lilotomab，ii)第1天至第5天后注射30mg/kg MK-1775(每天2次)，iii)第1天至第5天后注射250MBq/kg的177Lu-lilotomab和30mg/kg MK-1775(每天2次)的组合，iv)未标记的mAb(0.5mg/kg)。根据异种移植后时间监测肿瘤生长(左图)，并建立Kaplan Meyer生存曲线(右图)(n＝6-8/组)
图20显示了与抑制剂G2/M细胞周期阻滞联合或不联合的177Lu-lilotomab对从患者活检组织生长而来的细胞的功效。(A)对DLBCL或FL患者活检中CD3-/CD20+细胞比例的荧光激活细胞分选分析。将细胞暴露于177Lu-lilolotmab 18小时，并在3天后(第4天)进行分析。(B)细胞暴露18个小时后，177Lu-lilotomab和MK-1775或PD-166285的理论(使用Bliss独立性数学模型)和实验性累加抗增殖作用。在治疗后的第1天或第4天进行分析。
图21：(A)仅使用所示剂量的Betalutin或使用Betalutin和JNJ-7706621来处理的U-2932和RIVA细胞的增殖潜力。给予未处理的对照细胞正常化的增殖潜能(也参见实施例2)。(B)柱状图，显示了指定组合的BLISS独立性评分(观察到的效应大小减去预期的加和效应大小)。浅灰色柱表示明显超过可加性的临界值，定义为比单独使用Betalutin的效果的标准偏差大两倍的超过值。
图22：(A，B)仅使用所示剂量的Betalutin或使用Betalutin和PLK1抑制剂GSK461364(A)或BI2536(B)处理的U-2932和RIVA细胞的增殖潜力。给予未处理的对照细胞正常化的增殖潜能(也参见实施例2)。(C，D)柱状图，描绘了指定组合的BLISS独立性评分(观察到的效应大小减去预期的加和效应大小)。每天右侧的柱表示明显超过可加性的临界值，定义为比单独使用Betalutin的效果的标准偏差大两倍的超过值。
图23：(A)仅使用所示剂量的Betalutin或使用Betalutin和Aurora B激酶抑制剂MLN8237(Alisertib)来处理的U-2932和RIVA细胞的增殖潜力。给予未处理的对照细胞正常化的增殖潜能(也参见实施例2)。(B)柱状图，显示了指定组合的BLISS独立性评分(观察到的效应大小减去预期的加和效应大小)。浅灰色柱表示明显超过可加性的临界值，定义为比单独使用Betalutin的效果的标准偏差大两倍的超过值。
图24：经0.5μg/mL，1μg/mL，或2μg/mL Betalutin处理或未处理的第3天至第6天之间的U-2932细胞的绝对(左图)和相对(右图)增殖曲线。误差棒表示标准偏差(n＝3)。
图25：用所示的Betalutin和BI2536(A)或GSK461364(B)的组合处理的U-2932细胞的平均效应(Fa)-组合指数图和剂量反应曲线。在第5天评估增殖，并标准化至未处理的对照细胞。误差棒表示标准偏差(n＝3)。
图26：用所示的Betalutin和MLN8237(Alisertib)组合处理的U-2932细胞的平均效应(Fa)-组合指数图和剂量反应曲线。在第5天评估增殖，并标准化至未处理的对照细胞。误差棒表示标准偏差(n＝3)。
图27：用所示的Betalutin和JNJ-7706621的组合处理的U-2932细胞的平均效应(Fa)-组合指数图和剂量反应曲线。在第5天评估增殖，并标准化至未处理的对照细胞。误差棒表示标准偏差(n＝3)。
图28：使用Betalutin和JNJ-7706621处理的U-2932细胞的三个独立实验的平均效应(Fa)-组合指数图。U-2932验证图如图27所示，该验证图用于与确认实验的图进行比较。拮抗作用(CI>1.1)，加性(CI 0.9-1.1)和协同作用(CI<0.9)的范围。灰色阴影的等级定义了非常强的协同作用(CI<0.1)，强协同作用(CI 0.3-0.1)，协同作用(CI 0.7-0.3)，中等协同作用(CI 0.85-0.7)的范围。
图29：单独使用维奈托克和humalutin以及两种治疗方法联合使用的药物反应曲线和拟合。
图30：单独使用奥拉帕尼和humalutin以及两种治疗方法联合使用的药物反应曲线和拟合。
具体实施方式
实施例1
在B细胞非霍奇金淋巴瘤中177Lu-lilotomab优于利妥昔单抗的优点包括调节辐射介导的G2/M细胞周期阻滞
材料和方法
一B细胞淋巴瘤模型，单克隆抗体和动物模型
A.细胞系
Ramos，DOHH2和Rec-1细胞系获自ATCC(美国典型培养物保藏中心)和ECACC(欧洲认证细胞培养物保藏中心)。Ramos，DOHH2和Rec-1细胞系表达CD20和CD37抗原，然后可以分别用利妥昔单抗和利洛托单抗靶向。在37％的含有95％空气/5％CO2的潮湿环境下，并且在加有10％热灭活的胎牛血清，100μg/mL L-谷氨酰胺和抗生素(0.1U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的RPMI中，细胞在2-10x105个细胞/mL之间生长。使用Mycotest测定法(LifeTechnologies)对细胞进行常规检测以检测支原体污染。
Ramos细胞系收集自一个3岁男孩的伯基特氏淋巴瘤。这些细胞的特征是IgMλ的表达和过表达c-Myc癌基因的t(8,14)易位的存在。
DOHH2细胞系是由一名患有难治性免疫母细胞型B细胞淋巴瘤的60岁男性的胸腔积液建立的，该难治性免疫母细胞型B细胞淋巴瘤由卵泡性中心母细胞型/中心性淋巴瘤(GC衍生的滤泡性淋巴瘤)发展而来的。该细胞系的特征在于IgGλ的分泌以及t(14；18)(q32；q21)和t(8；14)(q24；q32)易位的无胸腺的存在，导致c-Myc和Bcl-2。这种异常情况导致DOHH2细胞系是转化为FL(滤泡性淋巴瘤)的疾病，其又进展为转化为DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)。
REC-1细胞系是由一名DLBCL晚期的60岁男性的淋巴结或外周血建立的，DLBCL进展为套细胞淋巴瘤。该细胞系的特征在于过表达细胞周期蛋白D1的t(14；18)(q32；q21)的存在。
B.抗体
利妥昔单抗是一种嵌合抗CD20 IgG1，可识别表位(170)ANPS(173)和(182)YCYSI(186)，具有纳摩尔平衡解离常数。该单克隆抗体由欧洲的罗氏公司(瑞士巴塞尔)研制，商标名为
Figure BDA0002501161310000191
利洛托单抗是针对CD37受体表位206HLARSRH212的鼠类抗CD37 IgG1mAb，具有纳摩尔平衡解离常数。该mAb由Nordic Nanovector ASA(挪威奥斯陆)研制，商品名为镥-177[177Lu]-lilotomab satetraxetan(
Figure BDA0002501161310000192
以前称为177Lu-DOTA-HH1)。
西妥昔单抗(
Figure BDA0002501161310000193
默克公司，德国达姆施塔特)已被用作非特异性mAb。该mAb再次针对表皮生长因子受体(EGFR)，该表皮生长因子受体在许多癌症中高表达，但在NHL细胞中并未高表达。在该项目中，使用177Lu进行放射性标记，以单独研究177Lu的辐射诱导效应，因为它不结合所用的三种B细胞淋巴瘤模型中的任何一种。
C.动物模型
使用来自Envigo(Gannat，France)的无胸腺Nude-Foxn1小鼠(6周/雌性)和C.B-17/IcrHanHsd-Prkdc-scid小鼠(6周/雌性)。在开始用于实验前，使小鼠适应1周。将它们置于22℃和55％的湿度下，并进行12小时的明暗循环。将它们保持在无病原体的条件下，并随意提供食物和水。
二体外研究
A.单克隆抗体放射性标记
与p-SCN-苄基-DOTA缀合的MAb(利妥昔单抗，利洛托单抗和非特异性西妥昔单抗)是从Nordic Nanovector公司获得的，浓度为10mg/mL，并保持在4℃的温度下。从PerkinElmer获得177LuCl3，在8μL 0.05M HCl中的体积活度为370MBq，比活度大于740GBq/mg。放射化学纯度>97％，放射性核素纯度>99.94％。任意地，将mAb用177Lu标记，比活度为200MBq/mg。通常，将10mL 10mg/mL DOTA-mAb与25mL 0.25M NH4OAc(pH 5.5)混合，并在37℃下预热5分钟。向反应混合物(200MBq/mg)中加入1mL 177LuCl3，并在37℃下进一步温育45分钟。加入配制缓冲液(100μL)(PBS，7.5％BSA，1mM DTPA，pH 7.5)终止反应。用PD-10柱(GE医疗，英国白金汉郡)以PBS作为洗脱液纯化反应混合物。通过将1mL反应物施加到薄层色谱(TLC)上来确定放射化学纯度，并在包含1mL PBS的迁移小瓶中进行分离。将该条切成两半，并在γ检测器中测量每个部分的活性。通过将下部的值除以总值来获得放射性标记的产率。放射性标记的产率一般高于99％。以添加的177Lu的活性与所收集的177Lu-mAb的活性之比来确定产率。使用结合测定法测定177Lu-mAb的免疫反应性。通常，使用4个计数管，在200μL PBS/BSA(0.5％)中至少包含16×106个Ramos细胞。用20μg未标记的mAb处理两支试管。15分钟后，将10ng放射性标记的mAb加入4个试管中，并在室温下孵育1小时。在洗涤之前和之后(用0.5％的PBS-BSA洗涤3次)，使用γ计数器测量放射性。免疫反应性定义为放射性结合/总放射性之比(％)。
B.确定Ramos，DOHH2和Rec-1细胞表面CD20和CD37受体的数量
使用Scatchard结合测定法确定Ramos，DOHH2和Rec-1细胞表面CD20和CD37受体的数量。通常，将含有100μL培养基的试管中生长的1×106个Ramos，DOHH2和Rec-1细胞与递增量(0-6.25nM；平均比活度为200MBq/mg)的放射性标记的mAb(利洛托单抗或利妥昔单抗)在室温下孵育1小时。接下来对放射性进行γ计数，并用PBS洗涤细胞两次以除去未结合的放射性。接下来将细胞重悬于1mL培养基中，并将等分部分用于细胞编号，然后确定结合的放射性。确定结合放射性与游离放射性之间的比率。接下来将其表示为结合放射性的函数。
Scatchard方法可计算解离常数(Kd)和抗原总数。实际上，在放射标记的mAb浓度增加的情况下放置了一定数量的细胞。针对每种浓度计算结合/游离活性之比。最终，绘制斯卡查德图，其对应于结合活性与结合/游离活性之比的函数。知道每个孔中的细胞数量和mAb放射性标记的特征(每个mAb 177Lu的数量)，就可以计算出每个细胞的受体数量和Kd。
C.确定177Lu-mAb对B细胞淋巴瘤的治疗效果
使用克隆形成试验研究了177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗和177Lu-西妥昔单抗b的治疗效果。由于细胞处于悬浮状态，因此我们使用
Figure BDA0002501161310000211
培养基(H4435，Stemcell技术)开发了一种具有重组细胞因子和人类细胞EPO的甲基纤维素培养基的方案。浓度为1×106个Ramos和DOHH2细胞/mL在含有1mL RPMI培养基的12微孔板中生长，然后以递增的活性(0；0.5；1,2；4)和6MBq/mL 177Lu-标记的mAb(利洛托单抗，利妥昔单抗或无关的西妥昔单抗)在37℃/5％CO2的条件下孵育18小时。接下来，收集细胞，离心并用培养基洗涤两次，然后重悬于5mL RPMI培养基中并计数。将1500至45000个细胞与4.5mL
Figure BDA0002501161310000212
培养基混合并接种(1.5mL/培养皿)。每个培养皿所接种的细胞的数量在500到15000之间，取决于mAb和测试活性。接下来将培养皿放置12至16天以确定菌落的数量。对含有50个或更多细胞的菌落进行评分并计算存活分数。一式三份地重复所有实验至少三次。使用这种方法，未考虑可能在前18小时内杀死细胞的mAb或放射性标记的mAb的细胞毒性。
D.RIT后细胞应答涉及的分子机制
1.细胞周期分析
评估在12孔板中生长的1×106个Ramos，DOHH2或Rec-1细胞/mL的细胞周期阻滞，所述Ramos，DOHH2或Rec-1细胞暴露于0MBq/mL，2MBq/mL(数据未显示)和6MBq/mL的177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗和177Lu-西妥昔单抗或相应量(0μg/mL，15μg/mL和40μg/mL)的未标记mAb。在RIT的第0天，第2小时，第18小时，第1天，第2天，第3天收获细胞，然后在-20℃的70％乙醇中固定3小时，并用来自默克密理博的细胞周期试剂盒(含PI)试剂在室温下在黑暗中染色30分钟，然后使用
Figure BDA0002501161310000213
流式细胞仪进行分析。然后计算G0/G1期，S期和G2/M期中的细胞百分比(三个实验一式三份的平均值)。
2.诱导细胞凋亡
评估在12孔板中生长的1×106个Ramos，DOHH2或Rec-1细胞/mL的诱导细胞凋亡，所述Ramos，DOHH2或Rec-1细胞暴露于0MBq/mL，2MBq/mL(数据未显示)和6MBq/mL的177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗和177Lu-西妥昔单抗或相应量(0μg/mL，15μg/mL和40μg/mL)的未标记mAb。在RIT的第0天，第2小时，第18小时，第1天，第2天，第3天收获细胞。在每个时间点，用来自默克密理博的细胞周期试剂盒(Annexin V试剂盒/7-ADD)试剂在室温下在黑暗中检测细胞凋亡30分钟，然后使用
Figure BDA0002501161310000221
流式细胞仪进行分析。
3.通过蛋白质印迹分析蛋白质表达
评估在12孔板中生长的1×106个Ramos，DOHH2或Rec-1细胞/mL的蛋白质表达，所述Ramos，DOHH2或Rec-1细胞暴露于0MBq/mL和6MBq/mL的177Lu-lilotomab18个小时。在RIT的第0天，第2小时，第18小时，第1天，第2天，第3天收获细胞。在每个时间点，冲洗细胞并在RIPA缓冲液(Santa Cruz)中于4℃孵育30分钟。离心细胞并收集上清液(含蛋白质)。使用12％聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE对蛋白质进行电泳，然后将其电转移到硝酸纤维素膜上。将印迹与抗-CDK1、抗-p-CDK1(Tyr15)(克隆10A11)、抗-p-CDK1(Thr14)、抗-p-CDK1(Thr161)、抗-CDK7、抗Wee-1(克隆D10D2)、抗Myt-1、抗-p-CHK1(Ser345)和抗-人GAPDH(1/1000，细胞信号技术，莱顿，荷兰)一抗一起进行孵育。洗涤印迹并与辣根过氧化物酶结合的抗小鼠Ig(115-036-072，Jackson ImmunoResearch)或与辣根过氧化物酶结合的抗兔1g(7074，Cell Signaling)一起孵育。根据生产商的说明(ClarityTMWestern ECL印迹底物，1705061，BioRad)，使用增强的化学发光方法对免疫印迹进行信号检测。使用PXi分析仪(Ozyme)测量蛋白质表达水平。
4.Wee-1和Myt-1抑制剂
用1μM选择性Wee-1激酶抑制剂MK-1775(Selleckchem，美国休斯敦)或1μM双重Wee-1/Myt-1抑制剂PD-166285(EMD Merck Millipore/Calbiochem，法国莫尔塞姆)处理细胞18个小时，或结合使用分别用于Ramos，Rec-1和DOHH2细胞的6MBq/mL，2MBq/mL和0.5MB/mL的177Lu-lilotomab来处理细胞18个小时。在培养开始后的不同时间，提取蛋白质以测量CDK1磷酸化水平，同时测定增殖，并在培养开始后的18小时和24小时评估细胞在G2/M中的百分比(实验进行3次，细胞周期分析除外)。
5.干细胞标志物的表达：CD44和CD33
评估在12孔板中生长的1×106个Ramos，DOHH2或Rec-1细胞/mL的干细胞标志物，所述Ramos，DOHH2或Rec-1细胞暴露于0MBq/mL和6MBq/mL的177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗和177Lu-西妥昔单抗18个小时。在RIT的第0小时，第2小时，第18小时以及第1天至第10天中的每一天收获细胞。在每个时间点，将细胞用4％PFA固定10分钟，用PBS洗涤两次，并在4℃下无菌保存在PBS中。用抗CD-133-FITC(克隆：AC133，Milteniy)和抗CD44-APC(克隆：IM7，Merck Millipore)检测干细胞标记物。0.5x 106个细胞在0.5％的PBS-BSA中饱和1小时。离心接下来的细胞，并与抗CD133-FITC(2μL)和抗CD44-APC(0.125μg)在室温黑暗中孵育1小时。最后，将细胞冲洗两次并使用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析。
E.细胞剂量测定
1.细胞对放射性的摄取和细胞编号
作为细胞剂量测定的第一步，确定了暴露于177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗18小时的Ramos，DOHH2和Rec-1细胞的放射性摄取。通常，将1×106个Ramos，DOHH2和Rec-1细胞/mL培养基以增加的活性(0MBq/mL；0.5MBq/mL；1MBq/mL；2MBq/mL；4MBq/mL和6MBq/mL)177Lu标记的mAb孵育18h。然后，将细胞用培养基洗涤两次，并以浓度为200×103个细胞/mL接种到12个微孔板中，该微孔板中含1mL培养基。在各个时间(2小时，18小时，24小时，48小时，72小时和144小时)，收集细胞，用PBS洗涤细胞两次，将细胞重悬于1mL PBS中，并进行伽马计数(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)。使用细胞计数器(Muse，Merck Millipore)将等分部分(8μL)用于细胞编号。计算每个细胞的活性(Bq/细胞)，并绘制成曲线图，表示每个时间(小时)的每个细胞(Bq/细胞)摄取的放射性。针对所有细胞系和每个mAb，一式三份进行实验，并重复至少3次。
2.烧瓶培养中的细胞几何形状和行为
在对Ramos细胞进行碘化丙锭染色和荧光显微镜分析之后，确定Ramos细胞的细胞和细胞核大小。对于细胞和细胞核，都确定了与最大和最小直径相对应的面积和大小。对于DOHH2和Rec-1细胞，用ScepterTM 2.0细胞计数器(Merck)确定细胞大小，并在Dapi染色和荧光显微镜分析后确定细胞核大小。
在细胞与放射性药物一起温育期间，细胞显示出在培养物中心积累并形成不同大小簇的趋势。由于培养孔内(分离的)细胞和簇的密度非常不均匀，因此基于光学显微镜获得的图片对这些参数进行了初步确定。获得四组照片，分别对应于用177Lu-利妥昔单抗和177Lu-lilotomab处理的Ramos和DOHH2细胞。在培养孔中确定了三个区域：中心区域，中途区域和边缘区域。对于每个区域，以及对于四种细胞/抗体组合中的每一种组合，为了测量每个区域中的细胞密度，分别以x50和x200的放大倍数拍摄了两张照片。
三体内研究
A.最大耐受活性(MTA)的测定
a.在无胸腺裸鼠中
给小鼠静脉内注射100μL NaCl中的177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗。评估了三种不同的活性：400MBq/kg、500MBq/kg或600MBq/kg(对于每种测试活性和每种mAb，n＝4)，另外还有177Lu-利妥昔单抗的300MBq/kg和350MBq/kg。然后每三天对小鼠称重以评估治疗的潜在毒性(终点为体重减轻高于20％或有任何疾病或不适迹象)。
b.在Scid小鼠中
在用177Lu-mAbs治疗的前一天，给小鼠腹腔内注射10mg/kg的鼠非特异性IgG2a(M7769，Sigma-Aldrich，Saint-Louis USA)。然后，向小鼠静脉内注射100μL NaCl中的177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗。评估了三种不同的活性，75MBq/kg、125MBq/kg或150MBq/kg(对于每种测试活性和每种单克隆抗体，n＝4)。最后，每三天对小鼠称重以评估治疗的潜在毒性(终点为体重减轻高于20％或有任何疾病或不适迹象)。
B.生存实验
a.在无胸腺裸鼠中
将重悬于100μL新鲜无血清培养基中的10x 106个Ramos NHL细胞皮下移植到小鼠的右侧腹中。当肿瘤体积达到100mm3至200mm3时，在异种移植后13天对小鼠进行治疗。在对照组中，向小鼠(n＝8/治疗组)静脉内注射100μL NaCl，利洛托单抗或利妥昔单抗mAb，其中注射量与RIT期间使用的量相同，且浓度较高(10mg/kg)。在RIT实验中，向小鼠(n＝6-9/治疗组)静脉内注射(100μL)177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗的mAb。
通过用游标卡尺测量肿瘤体积来评估肿瘤的生长(下式中的a，b，c代表三个直径)，每周测定动物体重两次或三次。
Figure BDA0002501161310000251
当肿瘤体积达到2000mm3或体重减轻超过20％或有不适或不适迹象时，采用CO2窒息或颈脱位法处死小鼠。
b.在Scid小鼠中
将100μL新鲜无血清培养基中的10x 106个DOHH2 NHL细胞皮下移植到小鼠的右侧腹中。在治疗前一天(皮下移植D+6)，向小鼠腹腔内注入10mg/kg非特异性IgG2a(M7769，Sigma-Aldrich,Saint-louis USA)。在异种移植后7天，对小鼠进行治疗(n＝7/治疗组)，在对照组中，向小鼠静脉内注射100μL NaCl，利洛托单抗或利妥昔单抗mAb，其中注射量与RIT期间使用的量相同，且浓度较高(10mg/kg)。在RIT实验中，向小鼠静脉内注射(100μL)177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗的MTA。通过用游标卡尺测量肿瘤体积来评估肿瘤的生长(下式中的a，b，c代表三个直径)，每周测定动物体重两次或三次。使用先前的公式计算肿瘤体积。肿瘤体积达到2000mm3或体重减轻超过20％或有疾病或不适迹象时，采用CO2窒息处死小鼠。
c.血液学毒性
治疗后第一个月每周两次从尾静脉采集血样(约12μL)。使用Scil Vet abc系统(SCIL Animal Care Co.，Altorf)对采集的血样进行分析，以确定血液学毒性。
C.体内放射量测定
1.生物分布实验
a)在无胸腺裸鼠中
在治疗实验中，将1000万个Ramos细胞皮下移植至小鼠。13天后，向小鼠静脉内注射用于存活实验的治疗实验。然后执行了两个方案。
-第一方案：用177Lu-lilotomab治疗25只小鼠。在治疗后的每个时间点(1小时，1天，2天，3天和6天)，对5只小鼠进行SPECT-CT成像，并对这些小鼠进行尸检。收集每个器官，称重，并通过γ计数测量其放射性吸收。该方案允许在离体计数和基于体内图像的生物分布之间进行比较。
-第二方案：向小鼠静脉内注射177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗(每次治疗5只小鼠)。在治疗后的不同时间(1小时，1天，2天，3天和6天)，对每只小鼠进行SPECT-CT成像，并在最后时间点对小鼠进行尸检。该方案用于进行体内生物分布(以减少尸检小鼠的数量)。
a.在Scid小鼠中
75只小鼠皮下异种移植了1000万个DOHH2细胞。6天后，向小鼠腹膜内注射10mg/kg的IgG2a(M7769，Sigma-Aldrich，Saint-Louis USA)。第二天，向小鼠静脉内注射用于177Lu-lilotomab，177Lu-利妥昔单抗或177Lu-西妥昔单抗的存活实验的治疗活性(每个放射性标记的mAb 25只小鼠)。然后，在治疗后的不同时间(1小时，1天，2天，3天和6天)，通过致命注射(2.5mL/kg)氯胺酮(26mg/mL)/美托咪定(0.30mg/mL)处死小鼠(n＝5小鼠/解剖时间)。最后，收集器官，称重并测量其放射性吸收。
对于每个器官，绘制了每克组织注射活性随时间变化的百分比(校正后的衰变)。
2.S因子测定
S因子S(t←s)对应于源区域s中每次放射性崩解在目标区域t中的平均吸收剂量。S因子考虑了物质的来源和组成对所有类型发射粒子的贡献。该项目中使用的S值是通过在177Lu的MOBY体素模型中通过蒙特卡洛模拟获得的。
四统计分析
这项统计分析是由蒙彼利埃ICM Val d'Aurelle的统计部门进行的。使用中位数、均值和标准差描述数据。在体内实验中，使用线性混合回归模型确定肿瘤生长与移植后天数之间的关系。使用Kaplan-Meier方法估计从异种移植日期到感兴趣事件的日期(即肿瘤体积为2000mm3)的存活率。对数秩检验用于比较各组之间的生存曲线。将体外数据(细胞周期和抑制剂作用)与非参数Kruskal-Wallis检验进行了比较。显著性水平设定为p<0.05。使用Stata软件v13.0(Stata Corporation College Station，美国)进行统计分析。
结果与讨论
这旨在体外研究涉及177Lu-lilotomab和177Lu-利妥昔单抗在Ramos，DOHH2和Rec-1细胞中的细胞毒性作用的分子机制。
已在暴露于177Lu-mAbs的细胞中研究了周期进展，细胞凋亡诱导，细胞信号蛋白表达和干细胞标志物表达。177Lu-西妥昔单抗用作非特异性抗体，即非特异性辐射的对照组。
A.凋亡诱导
由于凋亡的作用已在辐射引起的血液细胞死亡和对利妥昔单抗的细胞反应中得到了广泛的强调，因此在与未标记或放射性标记的mAb孵育后，我们测量了Ramos，DOHH2和Rec-1细胞的凋亡。DOHH2与利妥昔单抗的孵育伴随强烈的细胞凋亡诱导，并在18小时后达到稳定状态(52±1％)，一直持续到第2天。Ramos细胞的凋亡水平较低(在24h高峰时为22±3％)，Rec-1细胞的凋亡水平中等(在24h高峰时为42±12％)。利洛托单抗治疗后未诱导凋亡(图1)。
在用放射性标记的单克隆抗体处理的三种细胞系(图2)中诱导了凋亡。暴露于177Lu-利妥昔单抗后，在DOHH2细胞中检测到最高的凋亡水平(在72h高峰时间为97±3％)，而在Ramos细胞中观察到最低的凋亡水平(在72h高峰时间为56±12％)，在Rec-1细胞中观察到中等的凋亡水平(在72h高峰时间为79±16％)在DOHH2细胞中，三个177Lu-mAb的趋势相似。在Ramos细胞中，在暴露于177Lu-lilotomab和177Lu-西妥昔单抗后，凋亡在72笑死达到最高水平(分别为33±8％和27±10％)。在Rec-1细胞中，在暴露于177Lu-利妥昔单抗，177Lu-lilotomab和177Lu-西妥昔单抗后，在第72小时时，细胞凋亡峰值达到79±16％，67±18％和60±19％。
B.Ramos，DOHH2和Rec-1细胞系中的细胞周期效应
研究了暴露于0MBq/mL，2MBq/mL(数据未显示)和6MBq/mL177Lu-mAbs后，Ramos，DOHH2和Rec-1细胞在整个细胞周期中的分布。
1.暴露于放射性标记的mAb后
图3显示，对于未暴露的Ramos，DOHH2和Rec-1细胞，细胞周期阶段的分布为：G0/G1中为39-48％，S中为25-35％，G2/M中为23-40％。当细胞暴露于6MBq/mL的177Lu-lilotomab时，Ramos，DOHH2和Rec-，在24小时表现出G2/M细胞周期阻滞的细胞比例为64±16％，45±11％和44±11％。1个单元格。未经处理的细胞中相应的值分别为30％，30％和25％。此外，当细胞暴露于6MBq/mL的177Lu-利妥昔单抗时，Ramos，DOHH2和Rec-1细胞在24小时表现出G2/M细胞周期阻滞的细胞比例分别为56±13％，38±2％和40±11％。
2.暴露于未标记的mAb后
当三种细胞系暴露于40μg/mL利洛托单抗时(图4)，细胞在周期阶段的分布与未经处理的细胞的分布相似。此外，当细胞暴露于40μg/mL利妥昔单抗时，Ramos，DOHH2和Rec-1在18小时表现出G1/G0细胞周期阻滞的细胞比例分别为51±9％，52±9％和43±7％。未处理细胞的相应值分别为31±2％，35±6％和42±3％。
3.重点
评估了细胞对mAb或177Lu-mAb治疗的放射生物学反应：
-在三种细胞系中用利妥昔单抗治疗后诱导凋亡，但在利洛托单抗治疗后未诱导凋亡。
-177Lu-mAbs诱导了这三种细胞系的凋亡，其中放射敏感性DOHH2细胞系中的凋亡水平较高，而放射抗性Ramos细胞系中的凋亡水平较低。
-177Lu-lilotomab在放射敏感性DOHH2细胞系中诱导的凋亡与177Lu-利妥昔单抗一样多，而在其他两个细胞系中，诱导程度则较低。
-177Lu-mAbs导致与未经处理的细胞(x2)相比，G/M中的Ramos细胞数量增加，而在放射敏感性DOHH2细胞系(x1.1)中则没有发生这种增加(Rec-1位于两者之间；x1.7)。
-在用利妥昔单抗治疗Ramos(x1.6)和DOHH2(x1.5)细胞系后(未来治疗Rec-1细胞系)，在G1期观察到了细胞周期阻滞。
凋亡诱导与G2/M细胞周期阻滞成反比。确实，Ramos细胞系是最耐放射的模型，在用177Lu-mAbs处理后，对细胞凋亡的诱导较弱，但在G2/M中显示出最高的细胞积累。相反，放射敏感性最高的DOHH2细胞系在用177Lu-mAbs处理后显示出最高的细胞凋亡诱导水平，但在G2/M中表现出最低的阻滞作用。我们假设G2/M细胞周期阻滞是细胞放射敏感性的主要组成部分。研究了参与该阻滞的蛋白质。
C.参与G2/M细胞积累的蛋白质
CDK1激酶是参与G2/M过渡控制的主要蛋白质。该激酶分别受Myt-1和Wee-1激酶在其Thr14和Tyr15残基上的抑制磷酸化以及CDK激活激酶在Thr161上的激活磷酸化所严格控制。
研究了CDK1激酶的表达及其磷酸化(图5)。
CDK1水平在Ramos和Rec-1细胞中相当稳定，而在177Lu-lilotomab加入后48h和72h，CDK1水平在DOHH2中却降低了。在Ramos细胞中，存在持久的抑制性pTyr15和pThr14CDK1磷酸化水平，而在暴露于177Lu-lilotomab后18-24小时观察到短暂的低水平激活性pThr161磷酸化。Rec-1细胞显示出相似的结果，但是无法检测到pThr161-CDK1。相反，在DOHH2细胞中观察到了相反的情况。在暴露于177Lu-lilotomab后的24小时和48小时，Tyr15和Thr14的磷酸化水平分别下降。抑制性磷酸化水平的降低与激活性pThr161磷酸化表达的持续增加有关。
与Ramos细胞相比，DOHH2和Rec-1中CDK7的水平稳定或增加，其中CDK7的水平是参与CDK1的Thr161残基的磷酸化的复合物的一部分。同样，在Tyr15介导CDK1磷酸化导致G2/M停滞的Wee-1的表达在对照组和处理过的Ramos和Rec-1细胞之间在18小时到48小时之间具有可比性。相反，在DOHH2细胞中，基线很低，并且在治疗后24小时内无法检测到该基线。这些观察结果支持了我们先前关于暴露于177Lu-lilotomab的G2/M细胞周期阶段中Ramos而非DOHH2细胞积累的结果。细胞辐射后参与Wee-1和Myt-1活化的磷酸化CHK1(Ser345)的水平在Ramos和DOHH2细胞中在18小时至24小时之间有所增加，但在Rec-1细胞中一直保持稳定直到18小时才增加，接着逐渐减少。在治疗后18小时，所有三个细胞系中Myt-1的表达均降低，Myt-1是参与Thr14-CDK1磷酸化的激酶，这种磷酸化导致G2/M阻滞。
D.Wee-1和Myt-1抑制剂
由于Wee-1和Myt-1激酶似乎参与了暴露于177Lu-lilotomab的Ramos细胞的G2/M细胞周期相积累，因此，在用这些激酶的MK-1775和PD-166285药理学抑制剂处理细胞的同时，还结合177Lu-lilotomab处理细胞。MK-1775抑制Wee-1催化活性，并随后抑制pTyr15-CDK1磷酸化。PD-166285同时抑制Wee-1和Myt-1，并同时抑制Tyr15和Thr14上CDK1的磷酸化。
1.增殖研究
图7显示了开始治疗后6天，暴露于177Lu-lilotomab或单独暴露于抑制剂或暴露于177Lu-lilotomab和抑制剂的18小时的细胞数与未处理细胞数之比。选择用于用177Lu-lilotomab处理的活性，以与未处理的细胞相比，将三种细胞系的增殖降低至约50％。
在Ramos细胞中，两种抑制剂均诱导增殖降低至70％，而RIT与MK-1775或RIT与PD-166285的组合也导致相似的降低，至接近10％。增殖降低与使用177Lu-lilotomab或单独使用抑制剂的治疗有统计学上的差异(p＝0.0495)，但两种组合之间均未观察到差异(p＝0.5127)
对于DOHH2细胞，仅PD-166285被证明能以明显的降低(18％)的方式改变增殖。尽管在两种抑制剂存在下177Lu-lilotomab的抗增殖作用更为明显，但与单独使用抑制剂(p＝0.1213)或单独使用177Lu-lilotomab(p＝0.1213)相比，没有统计学上的差异。
对于暴露于抑制剂的Rec-1细胞，也观察到增殖的明显降低(p＝0.0495)。然而，与单独的抑制剂(p＝0.0495)或单独的暴露于177Lu-lilotomab(p＝0.0495)相比，只有177Lu-lilotomab和MK-1775的组合在统计学上降低了增殖。
2.CDK1的磷酸化
两种组合(RIT+MK1775或RIT+PD166285)的治疗功效证实了这三种细胞系中CDK1的磷酸化。
在暴露于177Lu-lilotomab的Ramos细胞中的pTyr15-CDK1和pThr14-CDK1的相对较高的持久水平随后在相应抑制剂存在下于第2小时和第18小时降低，随后再次增加(图8)。在DOHH2细胞中，对于pTyr15-CDK1，这种再次增加在18小时后不太明显，甚至观察不到；对于pThr14-CDK1，基础水平太低而无法调制和检测。对于Rec-1细胞，由于pThr14-CDK1的基础水平较低，因此抑制剂对磷酸化表达没有任何影响，而pTyr15-CDK1的表达则在治疗期间降低，并在48小时时升高。
3.抑制G2/M细胞周期阻滞
图9显示了单独用177Lu-lilotomab处理或联合MK-1775或PD-166285组合处理后，G2/M中的细胞数与未处理的细胞数量之间的变化。如先前所示，在用177Lu-lilotomab处理后，G/M期中的Ramos和Rec-1细胞的比例增加。当抑制剂与177Lu-lilotomab联合使用时，细胞在G2/M中的比例下降。在Ramos细胞中，经两种组合处理后，G2/M细胞的比例与未经处理的细胞的比例相似。对于Rec-1细胞，两种组合都减少了G2/M中一半的细胞比例。在DOHH2细胞中，由177Lu-lilotomab和PD-166285联合诱导的G2/M细胞比例的降低高于与MK-1775联合诱导的G/M细胞的比例。
4.重点
-两种组合均显示Ramos细胞的增殖强烈降低，这与CDK1磷酸化的减少相关，CDK1磷酸化导致G2/M细胞比例降低。没有观察到用177Lu-lilotomab和MK-1775或177Lu-lilotomab和PD-166285组合处理的细胞增殖的差异，表明在G2/M细胞周期阻滞中起作用的主要磷酸化是Ramos细胞系中的pTyr15-CDK1。
在DOHH2细胞中，两个抑制性磷酸化(p14和p15)的基础水平很弱。当使用抑制剂时，细胞增殖减少(特别是对于PD-166285)，但这没有统计学意义，并且其程度低于Ramos细胞系。
对于Rec-1细胞系，主要的抑制性磷酸化是P-Tyr15-CDK1。当抑制剂与177Lu-lilotomab结合时，MK-1775与PD-166285一样有效地减少了细胞增殖，从而证实了P-Tyr15-CDK1在Rec-1细胞应答中的重要性。
E.讨论
在这一部分中，我们研究了可以解释为什么177Lu lilotomab在DOHH2细胞中比在Ramos细胞中更有效的生物机制，Rec-1细胞表现出中介反应。此外，我们在第一部分中显示，尽管在Ramos和DOHH2细胞中均以不同程度观察到放射与利妥昔单抗之间的协同作用，而对于177Lu-lilotomab仅在DOHH2细胞中观察到协同作用。后一项结果得到了体内数据的支持，其中在DOHH2肿瘤异种移植模型中，177Lu-lilotomab与177Lu-利妥昔单抗一样有效，尽管未标记的利妥昔单抗比利洛托单抗更有效。
在用177Lu-mAbs处理后的放射敏感性DOHH2模型中，凋亡诱导更高
由于已知血液病会通过凋亡对辐射产生反应，因此在用未标记或放射性标记的mAb处理后，在Ramos，DOHH2和Rec-1细胞中测量了凋亡诱导。与先前的研究一致，显示利妥昔单抗在三种细胞系中诱导强烈的细胞凋亡诱导，而利洛托单抗则未显示出这种强烈的细胞凋亡诱导。但是，当对mAb进行放射性标记时，三种细胞系中的凋亡水平均增加了，但是大部分凋亡出现于DOHH2细胞，其凋亡水平与使用177Lu-lilotomab和177Lu-利妥昔单抗时类似。在Ramos细胞中和在Rec-1细胞之间，细胞凋亡水平较低。这些结果与体外和体内结果一致，表明177Lu-lilotomab和177Lu-利妥昔单抗在DOHH2模型中的治疗功效更高，并且这种治疗功效可以与观察到的细胞放射敏感性相关。
耐辐射Ramos模型的特征在于用177Lu-mAbs处理后G2/M中的细胞数量增加
由于凋亡紧密地处于细胞周期检查点的控制之下，因此分析了处理过的细胞在细胞周期阶段(G0/G1，S和G2/M)的分布。响应177Lu-mAb处理，与抗辐射的细胞系中未处理的细胞相比，G2/M中的细胞数量大大增加，而在最放射敏感最强的细胞系中则没有出现这种现象。在G2期，CDK1通过与细胞周期蛋白A2和B结合而被激活。进入M期时，细胞周期蛋白A2被降解，而CDK1-细胞周期蛋白B复合物仍然保留，其在有丝分裂后期将进一步降解。除了将CDK1与细胞周期蛋白结合外，当CDK1在Thr161上被磷酸化时，G2/M细胞周期的进展也会被促进。相反，Wee-1在Tyr 15上的磷酸化和/或Myt-1在Tyr 14上的磷酸化会阻断G2/M中的细胞。在放射敏感性DOHH2细胞中，用177Lu-lilotomab处理后，pTyr15-CDK1和pThr14-CDK1的磷酸化水平降低，而pThr161-CDK1的磷酸化水平升高。相反，在Ramos和Rec-1细胞中，pTyr15-CDK1和pThr14-CDK1的表达较高，而pThr161-CDK1的表达较低。这些蛋白质的磷酸化与细胞周期分析一致。然后，G2/M阻滞将成为影响细胞系放射敏感性的主要检查点。在细胞周期进展之前，G2/M阻滞使细胞有时间修复177Lu-mAb处理后带来的DNA损伤。在DOHH2细胞中，缺乏G2/M阻滞伴随着强烈的细胞凋亡诱导。为了证实G2/M阻滞的作用，使用了CD14在Thr14和Tyr15上的磷酸化抑制剂。使用了同时抑制Wee-1和Myt-1的Wee-1和PD-166285的特异性抑制剂MK-1775。这些抑制剂与177Lu-lilotomab组合使用。首先，由于在三种处理的细胞系中观察到CDK1磷酸化的减少，因此通过蛋白印迹法证实了对Wee-1和Myt-1激酶活性的抑制。随后，在所有细胞系中，与仅用177Lu-lilotomab处理的细胞相比，在用组合处理的细胞中G2/M的细胞百分比出现降低。接下来，这些抑制剂对暴露于177Lu-lilotomab的细胞的抗增殖作用在耐辐射的Ramos细胞系中表现出更明显的作用。结果证实了用放射性标记的mAb处理后，CDK1磷酸化对细胞应答的影响。
抑制G2/M细胞周期阻滞放射增敏抗辐射Ramos模型。
接下来，使用Bliss独立性数学模型来研究MK-1775或PD-166285对177Lu-lilotomab的反应的作用。计算了三种细胞系中两种组合(MK-1775或PD-166285)的理论治疗功效。并进行了实验曲线与理论曲线的比较。
理论功效RIT+抑制剂＝功效RIT+功效抑制剂-(功效RIT×功效抑制剂)
在Ramos细胞中显示了抑制剂与177Lu-lilotomab之间的协同作用(p＝0.0495)。在DOHH2和Rec-1细胞中，该组合仅表现为加和性。这可能可以通过以下事实来解释：在Rec-1细胞中，G2/M细胞周期阻滞没有那么明显，而在DOHH2细胞中则完全不存在。
最后，提出了图10中描述的177Lu-lilotomab的作用机理。
结论与观点
该项目旨在研究肿瘤细胞应答的分子机制。
在转化的滤泡性淋巴瘤临床前模型中，177Lu-lilotomab比利妥昔单抗更有效。177Lu-lilotomab对伯基特淋巴瘤细胞也有效，但需要更高剂量。此外，减少的CDK1介导的G2/M细胞周期阻滞表明可预测177Lu-lilotomab的疗效。使用Wee-1药理抑制剂(MK-1775)从G2/M细胞周期阻滞中释放出Ramos细胞和Rec-1细胞，使这些细胞对177Lu-lilotomab敏感。这些结果支持临床研究，表明177Lu-lilotomab在复发性惰性淋巴瘤中特别有效。最后，必须指出的是，在我们的实验方法中，由于我们使用了免疫缺陷小鼠，因此降低了免疫反应，尽管由于NK细胞在两种小鼠品系中均具有活性，所以可以预期会有ADCC效应。在临床环境中，可以使用可以激活ADCC的嵌合形式的利洛托单抗增强免疫反应。
处理后放射敏感性DOHH2细胞上存在干细胞标志物中
进行初步研究以确定处理后细胞如何存活。癌症干细胞被美国癌症研究协会描述为“构成具有自我更新和维持肿瘤的能力的自我维持细胞库”的细胞。为了更好地理解为什么放射标记的mAb处理即使在放射敏感性细胞系中也无法消灭培养皿中的肿瘤细胞，从开始处理到处理后的9天，分析了被处理细胞表面的癌症干细胞标志物的表达。
在越来越多的上皮肿瘤中已鉴定出多种癌症干细胞，上皮肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和头颈癌，其中大多数肿瘤表达细胞表面糖蛋白CD44。另一个细胞表面标志物，CD133糖蛋白定义了脑癌和结肠癌的肿瘤引发细胞。在淋巴瘤中，第一项研究可能表明套细胞淋巴瘤中存在CD45+/CD19-亚群，其存在高度致瘤性并在体内表现出自我更新能力。
为了进行初步研究，对用6MBq/mL 177Lu-lilotomab和177Lu-利妥昔单抗处理18h的细胞表面处的CD133和CD44的表达进行了调查研究。图11显示了在处理过的细胞表面上的受体数目与未处理过的细胞表面上的受体数目之间的比。
在暴露于177Lu-lilotomab或177Lu-利妥昔单抗的放射敏感性DOHH2细胞系中以及在Rec-1细胞中表达CD44和CD133的细胞比例在RIT后至多9天强烈增加，但在Ramos细胞中则没有。这些结果表明，在放射敏感性细胞系中进行RIT后，存活细胞的群体被修饰。假设是该群体对治疗有抵抗力，并允许重新形成肿瘤；在抗辐射细胞系中，该治疗未选择足够的干细胞群体以显示其细胞群体的修饰。
为了更进一步，确定这一新群体(CD133+/CD44+)是否比主要种群具有更高的抗放射性，并确定该新群体与主要群体之间的特征差异(培养时间，异种移植物生长，对治疗的反应……)，将是有趣的一件事。最后，另一个问题是要知道群体是否变为CD133+/CD44+，或者治疗是否选择了已经存在的CD133+/CD44+细胞。
RIT和Wee-1抑制剂联合用于临床
无论如何，考虑将这种组合(RIT+细胞周期阻滞抑制剂)用于临床治疗会很有趣。实际上，在所有细胞系中，该组合始终比单独的RIT具有更高的细胞增殖效率。在临床上，我们可以认为结果会相似。即使没有有关肿瘤放射敏感性的数据：
-如果肿瘤是抗放射线性的，则177Lu-lilotomab和细胞周期阻滞抑制剂的组合可增强177Lu-lilotomab的作用，并使肿瘤放射增敏；
-如果肿瘤是放射敏感性的，则至少由于作用的可加性，该组合也比单独的RIT更有效，但有效程度比以前的情况低。
此外，这种关联特别有趣，因为细胞周期进展所需的蛋白质抑制剂，例如CD4/CDK6，pan-CDK和Wee-1抑制剂，已引起血液肿瘤癌症治疗的兴趣，并在临床试验中进行了评估。特别是，MK-1775增强SRC抑制剂在伯基特淋巴瘤中的功效，而CHK1和Wee-1抑制剂的组合在套细胞淋巴瘤中具有协同作用。
此外，由于CHK1参与Wee-1和Myt-1磷酸化，因此临床试验正在评估CHK1药理抑制剂以使肿瘤细胞对DNA损伤敏感。但是，必须注意的是，在我们的实验模型中，暴露于177Lu-mAbs并不会修饰P-CHK1的表达。
蛋白14-3-3对细胞放射敏感性有影响吗？
其他蛋白可能被靶向以增强177Lu-lilotomab的作用。例如，蛋白14-3-3也可能是RIT期间靶向的理想候选者。已经研究了14-3-3蛋白在癌症中的关键作用，特别是在乳腺癌、肺癌和头颈癌中的作用。为了支持14-3-3的主要作用，14-3-3的高表达与乳腺癌患者的不良预后有关。
该蛋白与CDC25C的胞质螯合有关，并通过CDC25C阻止CDK1在第14和15位的非磷酸化而进入有丝分裂。此外，14-3-3还与磷酸化的蛋白Bad结合，以抑制其促凋亡功能，因为Bad通过使其Bcl-xL或Bcl-2失活而促进细胞色素C的释放，从而导致凋亡诱导。综上所述，在RIT治疗期间抑制14-3-3可以降低细胞周期阻滞，并增加凋亡诱导，驱动细胞对辐射损伤更为敏感。
为了支持这种反射，在研究中，研究了双氟哌啶(14-3-3拮抗剂)对人神经胶质瘤细胞的治疗功效。作者表明，这种14-3-3拮抗剂通过下调Bcl-2，上调Bax并激活caspase-9和caspase-3具有强烈的诱导胶质瘤细胞凋亡的作用。此外，与对照组相比，经处理的细胞在G2/M中显示出减少的细胞百分比，并且该抑制剂降低了肿瘤异种移植物的生长。
实施例2
测量177Lu-satetraxetan-lilotomab(Betalutin)与通过抑制细胞周期蛋白来调节细胞周期进展的不同药物结合的作用
材料和方法
细胞和试剂
在37％的含有5％CO2的潮湿环境下，将DLBCL细胞系U2932和RIVA保持在RPMI1640-GlutaMAX培养基(Gibco)中，该培养基中补充有15％的胎牛血清(Biowest)和1％的青霉素-链霉素(Gibco)。根据细胞密度，每周1：3-1：5将细胞分裂两次。通过将177Lu与p-SCN-苄基-DOTA结合的利洛托单抗在37℃下孵育20分钟来制备具有600MBq/mg比活性的Betalutin。实时Glo购自Promega。384孔板购自Greiner Bio-One。
Betalutin治疗
在振荡的情况下，在6孔细胞培养板上用Betalutin将终浓度为1μg/mL和2μg/mL的细胞处理18-20小时。处理后，将PBS加入细胞中，并沉淀细胞。首先将细胞重悬于1mL PBS中，然后在PBS中洗涤两次，最后在所需浓度的生长培养基中稀释。所有细胞系以2.5×106个细胞/mL的细胞浓度处理。
用细胞周期调节蛋白抑制剂进行治疗和实时Glo活力测定
在接种前一天进行细胞密度测量，并基于这些测量将2000个细胞接种到384孔板的每个孔中，并在其中预先装载了选定的药物，以产生100nM或1μM终浓度。无论细胞数如何，培养量均为25μl。对于实时Glo，将细胞活力底物和
Figure BDA0002501161310000361
酶在生长培养基中以1：500稀释，并向每个孔中添加25μL稀释试剂。所有试剂均平衡至37℃。在第一次测量发光之前，将细胞与反应混合物在37℃下温育1小时。加入试剂后，在72小时内根据需要重复进行测量。将浓度为200μg/mL的洋地黄皂苷添加到细胞中，以记录死细胞的背景发光。使用Tecan SPARK 10M酶标仪测量发光，积分时间设置为1秒。
数据分析
在开始治疗后的每一天的测量中，通过将经处理细胞的发光信号除以对照细胞的发光信号来计算生长抑制[表1]。值1表示与对照细胞相比，生长无变化，值越高表示促进生长，值越低表示抑制生长。
为了评估药物单独[[-]Betalutin]及其与Betalutin[[+]Betalutin]的效果，我们计算了每个样本的Z值(ZdrugX＝1-(+)Betalutin药物X/(-)Betalutin药物X)，其中(+)Betalutin药物X和(-)Betalutin药物X分别是存在和不存在Betalutin时药物X的测量发光强度值。尽管每个板之间的总体信号强度有所不同，但分别计算每个板的Z得分值可以比较各个板的结果。在连续四天中的某天，其Z评分比单独Betalutin的平均效果高2倍STDEV的药物(Z对照＝1-(+)Betalutin对照/(-)Betalutin对照)被视为命中[Z评分表2]。
为了确定大于Betalutin与药物之间的叠加效果，我们计算了预期的叠加效果并将其与测得的效果进行比较(Bliss独立性测试；预期的叠加效果：FBetalutin&药物g＝FBetalutin+F药物–FBetalutin x F药物)。连续四天中某天的评分(“测得的效果-预期的叠加效果”)比单独使用Betalutin的平均效果高2倍STDEV的药物被视为命中[Bliss评分表2]。
结果
表1.单独或联合使用Betalutin和细胞周期抑制剂处理后，U2932和RIVA细胞的生长抑制。Dy＝治疗开始后的天数。
U2932
Figure BDA0002501161310000371
U2932
Figure BDA0002501161310000372
RIVA
Figure BDA0002501161310000373
RIVA
Figure BDA0002501161310000374
Figure BDA0002501161310000381
表2.Betalutin和细胞周期抑制剂组合的协同作用概述。Bliss＝协同作用通过Bliss方法表示。Z分数＝协同作用由Z分数方法指示。Bliss+Z分数＝协同作用通过两种方法表示。
Figure BDA0002501161310000382
结论
通过特异性抑制剂抑制细胞周期调节酶，例如WEE1、CHK1、CDK和AURORA激酶，可显著增强Betalutin在两种侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系中的细胞增殖抑制作用。
因此，抑制细胞周期调节酶与Betalutin是研究治疗难治性B细胞淋巴瘤的一种新颖而有希望的途径。
实施例3-Humalutin和奥拉帕尼的组合可能具有协同作用
目标
外部束辐射与PARP抑制剂奥拉帕尼的联合治疗可能是协同的。在本实施例中，目的是研究作为媒介物以选择性地向肿瘤细胞传递辐射的放射免疫缀合物Humalutin(用177Lu标记的chHH1.1-satetraxetan)与PARP抑制剂奥拉帕尼的组合是否也具有协同作用。
材料和方法
细胞系
使细胞在补充有Glutamax(Gibco，Paisley，UK)，10％热活化FBS(Gibco)和1％青霉素-链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基和DMEM培养基中生长。将细胞在37℃和5％CO2下培养。每周两次用预热的培养基将细胞悬液以1：3、1：4或1：5稀释，并在实验开始前2-4天稀释，以确保它们在实验开始时呈指数增长。
表1：使用的细胞系，细节和培养条件。
Figure BDA0002501161310000391
177Lu标记的chHH1.1-satetraxetan
将螯合剂p-SCN-Bn-DOTA(satetraxetan，Macrocyclics，TX，美国)溶解在0.005MHCl中，以6：1的比例添加到抗体中，并使用碳酸盐缓冲液将pH值调节至大约8.5。在37℃下孵育45分钟后，通过添加50mL每mg Ab的甘氨酸溶液终止反应。为了除去游离的satetraxetan，使用Vivaspin 20离心管(Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根)用0.9％的NaCl洗涤结合抗体4-5次。在用177Lu标记之前，使用0.25M乙酸铵缓冲液将pH调节至5.3±0.3。将约200MBq的177Lu(ITG，德国加兴)添加到0.25mg satetraxetan-chHH1中，并在37℃下孵育15至30分钟。使用即时薄层色谱法评估了缀合物的放射化学纯度(RCP)，且放射化学纯度高于95％。将比活设定为600MBq/mg(根据需要用冷chHH1-satetraxetan稀释)。
Humalutin的免疫反应部分
使用Ramos细胞和单点修饰Lindmo方法测量放射免疫缀合物的免疫反应性。使用的细胞浓度为7500万个细胞/mL。缀合物的免疫反应性高于70％。
细胞毒性研究
用Humalutin，奥拉帕尼或两者的组合处理细胞，然后将细胞接种到96孔板中。在处理后的每个时间点，将细胞用Alamar Blue(赛默飞世尔公司，DALL1100)孵育4小时，并使用多板读数器Fluoroskan ascent FL进行荧光测量以评估细胞增殖和活力。所有实验一式两份，每次实验用到两个样本。将数据标准化为未处理的对照。使用对数刻度转换和非线性拟合(顶部为100％，底部为0％)来计算IC50。
用Humalutin治疗
在细胞培养瓶中将细胞与0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL或5μg/mL的Humalutin一起孵育，并在37℃/5％CO2下孵育。18-20小时后，将细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。使用校准的γ检测器(Cobra II自动γ检测器，Packard Instrument Company，美国梅里登)测量洗涤后的细胞结合活性。在洗涤后，使用用于流式细胞术的Guava ViaCount细胞分散试剂(默克公司，德国达姆施塔特)测量细胞浓度和活力，并在Guava EasyCyte12HT(默克公司，德国达姆施塔特)中进行测量，以确定细胞在温育中的存活程度。将细胞接种在96孔板中。
用奥拉帕尼治疗
将细胞接种到96孔板中，该板预先用0.2mL培养基中的1至100μM奥拉帕尼包被，并在37℃/5％CO2下温育72小时，然后使用alamar blue细胞活力测定法测量细胞毒性作用。
用Humalutin和奥拉帕尼治疗
将细胞与0μg/mL、0.5μg/mL、或1μg/mL的Humalutin一起孵育，然后按照与前述相同的步骤分别用humalutin和奥拉帕尼进行处理。使用的奥拉帕尼浓度为1μM至100μM。
统计
使用Compusyn软件将Chou-Talalay模型用于协同计算。计算出各个治疗的R(拟合优度)，在体外培养实验中R应大于0.90，以使用计算出的组合指数(CI)。CI表示协同作用：0-0.9被认为是协同作用。如WO2006004917A2中所述使用协同作用分级。
结果与讨论
单独使用Humalutin和奥拉帕尼
在不同细胞系中，对Humalutin和奥拉帕尼的敏感性有所不同(表2)。对奥拉帕尼最敏感的是Rec-1和SDUHL4，而DOHH2和Granta 519的耐药性最高。对Humalutin最敏感的细胞系是Granta 519和SUDHL4，而最抗放射的是WSU-DLCL2和Rec-1。
表2.接种后72小时的孵育时间后，Humalutin和奥拉帕尼的IC50值。
Figure BDA0002501161310000411
Humalutin和奥拉帕尼的组合
通过Chou Talalay方法计算得到的组合指数(CI)显示了大多数细胞系的协同作用(图12)。U2932和Granta 519在所有奥拉帕尼浓度下均表现出非常强的协同作用。其余细胞系显示不同程度的协同作用，具体取决于所用奥拉帕尼的剂量。另外，对于所测试的其中一种奥拉帕尼浓度，SUDHL4表现出中等拮抗作用。重要的是要注意，在某些细胞系中，单独治疗的R值低于0.9，这意味着应谨慎考虑Chou Talalay方法计算得到的结果。未来还会重复进行这类实验，以使得独立治疗的R值可以更高。
Granta 519是一种部分丧失ATM功能的MCL，仅对奥拉帕尼的敏感性较低，而Humalutin和奥拉帕尼的协同作用很强。另一方面，DLBCL细胞系U2932对Humalutin不太敏感，但与奥拉帕尼的协同作用非常强。这些结果值得在动物模型中进行进一步研究，以研究在体内是否可以看到相同的协同作用。
结论
在所有测试的细胞系中均观察到了Humalutin和PARP抑制剂奥拉帕尼之间的协同作用，并在奥拉帕尼浓度较低的情况下具有较强的协同作用。结果表明，使用放射免疫疗法进行治疗可以使淋巴瘤对PARP抑制剂变得敏感。有必要在动物模型中进行进一步的研究。
实施例4-Betalutin和PARP抑制剂AG-14361和Rucaparib的组合可以逆转侵袭性ABC样弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系U-2932和RIVA中的Betalutin耐药性
目标
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种非霍奇金淋巴瘤(NHL)的侵袭性形式。申请人目前正在开发一种潜在的针对复发性NHL的靶向抗体-放射性核素缀合物(ARC)Betalutin疗法。U-2932和RIVA是两种活化的B细胞样DLBCL细胞系，在临床相关剂量下均显示出对Betalutin治疗的耐药性。本发明人在先前的实施例中发现，使用外部束辐射和PARP抑制剂奥拉帕尼的组合治疗可以是协同的。在当前的研究中，发明人旨在研究作为媒介物以选择性地向肿瘤细胞传递辐射的放射免疫缀合物Betalutin与所选择的其它PARP抑制剂的组合是否也能逆转对Betalutin治疗的抗药性。为此，在去除过量的Betalutin之前，使用(或不使用)Betalutin对细胞进行预处理，然后将经预处理的细胞接种到预先装有来自赛莱克癌症化合物文库的精选药物的384孔板上。我们的目标是确定药物是否与Betalutin协同作用以降低活力，该活力通过Real Time Glo测得。
材料和方法
细胞系
在37％的含有5％CO2的潮湿环境下，将DLBCL细胞系U2932和RIVA保持在RPMI1640-GlutaMAX培养基(Gibco)中，该培养基中补充有15％的胎牛血清(Biowest)和1％的青霉素-链霉素(Gibco)。在实验开始前，每周1：7将细胞分裂两次并稀释2-4天，以确保它们在实验开始时呈指数增长。
表1：使用的细胞系
Figure BDA0002501161310000421
用177Lu标记chHH1.1-satetraxetan
将螯合剂p-SCN-Bn-DOTA(satetraxetan，Macrocyclics，TX，美国)溶解在0.005MHCl中，以6：1的比例添加到抗体中，并使用碳酸盐缓冲液将pH值调节至大约8.5。在37℃下孵育45分钟后，通过添加50mL每mg Ab的甘氨酸溶液终止反应。为了除去游离的satetraxetan，使用Vivaspin 20离心管(Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根)用0.9％的NaCl洗涤结合抗体4-5次。在用177Lu标记之前，使用0.25M乙酸铵缓冲液将pH调节至5.3±0.3。将约200MBq的177Lu(ITG，德国加兴)添加到0.25mg satetraxetan-chHH1中，并在37℃下孵育15至30分钟。使用即时薄层色谱法评估了缀合物的放射化学纯度(RCP)，且放射化学纯度高于95％。将比活设定为600MBq/mg(根据需要用冷chHH1-satetraxetan稀释)。
Betalutin的免疫反应部分
使用Ramos细胞和单点修饰Lindmo方法测量放射免疫缀合物的免疫反应性。使用的细胞浓度为7500万个细胞/mL。缀合物的免疫反应性高于70％。
细胞毒性研究
Betalutin治疗
用Betalutin将细胞在6孔板中振荡处理18个小时，U2932的终浓度为1μg/mL，RIVA的终浓度为0.5μg/mL。处理后，将PBS加入细胞中，并沉淀细胞。首先将细胞重悬于1mL PBS中，然后在PBS中洗涤两次，最后在生长培养基中稀释至终浓度为2.5×106个细胞/mL。
Real Time Glo活力测定
在接种前一天进行细胞密度测量。基于这些测量，使用自动机将细胞以每孔3000个细胞的密度以25μl的培养体积接种到384孔板中(导致起始滴度：120000个细胞/mL)。为了使用Real Time Glo(Promega，美国威斯康星州)测量细胞活力，将细胞活力底物和
Figure BDA0002501161310000432
酶在生长培养基中按1：500稀释，然后用自动机将25μL稀释试剂分配到每个孔中。所有试剂均平衡至37℃。在第一次测量发光之前，将细胞与反应混合物在37℃下孵育1小时。加入试剂后72小时内，根据需要重复进行测量。使用Tecan SPARK 10M酶标仪(Tecan，SUI)测量发光，积分时间设置为1秒。
板设置
筛选是在384孔板上进行的，其中包括从SelleckChem(Selleckchem，美国德克萨斯州)获得的选定PARP抑制剂(DMSO中的10mM储备液)。为了包括无药对照，将药物组(表2)在两块板上划分。由于先前观察到细胞在板边缘的孔中生长不良，因此未使用两个最外面的行和列。如前所述，筛选中使用了三种不同的药物浓度，U2932为10nM和1μM，RIVA为10nM和100nM。
表2：
Figure BDA0002501161310000431
Figure BDA0002501161310000441
数据分析
使用Bliss独立性测试确定协同作用的候选者命中。将每种药物在每种浓度下的效果计算为与对照细胞Fa＝(1-(RLU药物/avgRLU对照)相比死细胞的分数，对单独使用Betalutin的效果进行类似的计算Fb＝(1-(avgRLUBetaltuin/avgRLU对照)。通过以下等式，我们发现了药物+Betalutin组合的预期加和效应：预期效应(E)Fab＝(Fa+Fb-Fa*Fb)。我们从测得的效应中减去了这种预期的效应(M)Fab＝(1-(RLU药物+Betalutin/avgRLU对照)得到一个值(Diff)Fab，代表测量的效应与组合的预期加和效应之间的差异。将该值标准化为单独药物的存活分数：(Diff)Fab#＝(Diff)Fab/(1-Fa)。此外，为了测量孔间差异的大小，我们计算了每个板上48个对照孔中仅Betalutin效果的标准差：(STDEV)Fb＝(RLUBetalutin/RLU对照)-(averageRLUBetaltuin/averageRLU对照)。(Diff)Fab#值比Betaluti处理的对照(STDEV)Fb的标准差高两倍的药物被计为命中。
结果与讨论
仅Betalutin
U-2932和RIVA细胞对Betalutin的敏感性不同。与RIVA细胞相比，U-2932细胞对Betalutin的耐药性更高(图1)。用1μg/mL[600MBq/mg]处理的U-2932细胞的增殖率也超过未处理的U2932细胞水平的80％以上(图1A)。RIVA细胞对Betalutin的敏感性高于U-2932，但在整个4-6天的观察期内(处理0.5μg/mL[600MB/mg])，RIVA细胞的增殖率也超过未处理细胞的40％以上(图13B)。
图14显示了在各天相对于未处理的细胞的增殖率标准化的Betalutin处理的细胞的相对增殖(发光)。
单独使用AG-14361或Rucaparib并与Betalutin组合
单独给予浓度为10nM的AG-14361处理U-2932或RIVA细胞时，没有生长抑制作用，也没有增强Betalutin的生长抑制作用(图15A，图15C)。相反，AG-14361分别以1μM和100nM的浓度抑制U-2932和RIVA细胞的增殖。AG-14361与Betalutin的组合显示出比单独的AG-14361更强的生长抑制作用(图15B，图15D)。单独用测试浓度的Rucaparib处理U-2932或RIVA细胞没有生长抑制作用(图16)。Rucaparib与Betalutin的组合显示比单独使用Betalutin的生长抑制作用强(图16B，图16D)。
所测试的PARP抑制剂(RIVA 100nM；U2932 1μM)与Betalutin组合的最终生长抑制作用大于其预期的加和效应。AG-14361表现出最强的组合效应，在第4、5和6天得分最高，其效应量大于单独用Betalutin处理的细胞的两个标准差(BLISS测试，图17)。
结论
Betalutin与PARP抑制剂AG-14361的组合克服了ABC样弥漫性大B细胞淋巴瘤的两种细胞系中Betalutin的耐药性，并导致了超过预期的加和效应的生长抑制，表明具有协同作用。Betalutin和Rucaparib的组合也可以增加生长抑制作用，其程度要大于预期的加和效应，但在测试浓度下的功效要低于AG-14361。
这些结果表明，PARP抑制剂与Betalutin放射免疫疗法的联合治疗可以提高Betalutin耐药性侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤的敏感性。有必要在动物模型中进行进一步研究。
实施例5Humalutin和维奈托克的组合可能具有协同作用
目标
外部束辐射与BH3模拟性维奈托克的联合治疗可能是协同的。在本实施例中，目的是研究作为媒介物以选择性地向肿瘤细胞传递辐射的放射免疫缀合物Humalutin(用177Lu标记的chHH1.1-satetraxetan)与BH3模拟性维奈托克的组合是否也具有协同作用。
材料和方法
细胞系
使细胞在补充有Glutamax(Gibco，Paisley，UK)，10％热活化FBS(Gibco)和1％青霉素-链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基和DMEM培养基中生长。将细胞在37℃和5％CO2下培养。
每周两次用预热的培养基将细胞悬液以1：3、1：4或1：5稀释，并在实验开始前2-4天稀释，以确保它们在实验开始时呈指数增长。
表1：使用的细胞系，细节和培养条件。
Figure BDA0002501161310000461
用177Lu标记chHH1.1-satetraxetan
将螯合剂p-SCN-Bn-DOTA(satetraxetan，Macrocyclics，TX，美国)溶解在0.005MHCl中，以6：1的比例添加到抗体中，并使用碳酸盐缓冲液将pH值调节至大约8.5。在37℃下孵育45分钟后，通过添加50mL每mg Ab的甘氨酸溶液终止反应。为了除去游离的satetraxetan，使用Vivaspin 20离心管(Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根)用0.9％的NaCl洗涤结合抗体4-5次。在用177Lu标记之前，使用0.25M乙酸铵缓冲液将pH调节至5.3±0.3。将约200MBq的177Lu(ITG，德国加兴)添加到0.25mg satetraxetan-chHH1中，并在37℃下孵育15至30分钟。使用即时薄层色谱法评估了缀合物的放射化学纯度(RCP)，且放射化学纯度高于95％。将比活设定为600MBq/mg(根据需要用冷chHH1-satetraxetan稀释)。
Humalutin的免疫反应部分
使用Ramos细胞和单点修饰Lindmo方法(1，2)测量放射免疫缀合物的免疫反应性。使用的细胞浓度为7500万个细胞/mL。缀合物的免疫反应性高于70％。
细胞毒性研究
用Humalutin，奥拉帕尼或两者的组合处理细胞，然后将细胞接种到96孔板中。在处理后的每个时间点，将细胞用Alamar Blue(赛默飞世尔公司，DALL1100)孵育4小时，并使用多板读数器Fluoroskan ascent FL进行荧光测量以评估细胞增殖和活力。所有实验一式两份，每次实验用到两个样本。将数据标准化为未处理的对照。使用对数刻度转换和非线性拟合(顶部为100％，底部为0％)来计算IC50。
用Humalutin治疗
在细胞培养瓶中将细胞与0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL或5μg/mL的Humalutin一起孵育，并在37℃/5％CO2下孵育。18-20小时后，将细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。使用校准的γ检测器(Cobra II自动γ检测器，Packard Instrument Company，美国梅里登)测量洗涤后的细胞结合活性。在洗涤后，使用用于流式细胞术的Guava ViaCount细胞分散试剂(默克公司，德国达姆施塔特)测量细胞浓度和活力，并在Guava EasyCyte12HT(默克公司，德国达姆施塔特)中进行测量，以确定细胞在温育中的存活程度。将细胞接种在96孔板中。
用维奈托克治疗
将细胞接种到96孔板中，该板预先用0.2mL培养基中的0μM，0.5μM，1μM，2μM，和2.5μM维奈托克包被，并在37℃/5％CO2下温育72小时，然后使用alamar blue细胞活力测定法测量细胞毒性作用。
用Humalutin和维奈托克治疗
将细胞与0μg/mL、0.5μg/mL、或1μg/mL的Humalutin一起孵育，然后按照与前述相同的步骤分别用humalutin和维奈托克进行处理。维奈托克浓度为0μM，0.5μM，1μM，2μM，和2.5μM。
统计
使用Compusyn软件将Chou-Talalay模型用于协同计算。计算出各个治疗的R(拟合优度)，在体外培养实验中R应大于0.90，以使用计算出的组合指数(CI)。CI表示协同作用：0-0.9被认为是协同作用。如WO2006004917A2中所述使用协同作用分级。
结果与讨论
单独使用Humalutin和维奈托克
在不同的细胞系中，对humalutin和维奈托克的敏感性有所不同(表2)。对这两种疗法最敏感的细胞系是Granta 519，而对这两种疗法最有抵抗力的细胞系是U2932。
表2.接种后72小时的孵育时间后，Humalutin和维奈托克的IC50值。
Figure BDA0002501161310000481
Humalutin和维奈托克的组合
通过Chou Talalay方法计算得到的组合指数(CI)显示了所有细胞系的协同作用。
大多数细胞系表现出非常强到强的协同作用，并且在维奈托克浓度较低的情况下趋于增强协同作用。对于Granta 519和SUDHL4细胞系，观察到最高的协同作用。值得注意的是，U2932是对两种治疗方法最有抵抗力的细胞系，但对组合显示出强大的协同作用。这些结果表明，放射治疗可以使DLBCL和MCL细胞对BH3模拟物敏感。
结论
在所有测试的细胞系中均观察到了Humalutin与BH3模拟性维奈托克之间的协同作用，并且在维奈托克浓度较低的情况下趋于增强协同作用。结果表明，使用放射免疫疗法进行治疗可以使淋巴瘤对BH3模拟物变得敏感。
实施例6-Betalutin与MK-1775和PD-166285组合
目标
在不同细胞系，动物模型和B细胞来源的人类肿瘤活检物中，体外研究177Lu-lilotomab satetraxetan(Betalutin)与G2/M检查点抑制剂MK-1775和PD-166285的组合。
材料和方法
细胞系
从ATCC/ECACC和DSMZ获得了Ramos(伯基特氏淋巴瘤，BL)，DOHH2(转化的滤泡性淋巴瘤，FL)和Rec-1(套细胞淋巴瘤)细胞系。从瑞士贝林佐纳的肿瘤研究所获得了OCI-Ly8(DLBCL)细胞系。在37％的含有95％空气/5％CO2的潮湿环境下，细胞在添加有10％热灭活的胎牛血清，和抗体(0.1U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的RPMI培养基中。使用美国生命技术公司(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)的Mycotest测定法对支原体污染进行了常规测试。
抗体放射性标记
与p-SCN-苄基-DOTA(Macrocyclics，美国德克萨斯州普莱诺)结合的利洛托单抗(Nordic Nanovector，挪威奥斯陆)用177Lu(177Lu-mAbs)标记，比活为200MBq/mg。
动物和肿瘤异种移植物
将来自Envigo(Gannat，France)的无胸腺Nude-Foxn1小鼠(此后为无胸腺小鼠)(6周/雌性)置于22℃和55％的湿度下，并进行12小时的明暗循环，在无病原体的条件下，随意提供食物和水。适应1周后，将10×106个Ramos或OCI-Ly8细胞重悬于100μL新鲜无血清培养基中，然后皮下注射至无胸腺小鼠腹侧。所有动物实验均按照法国政府指南和用于实验动物研究的INSERM标准进行(协议B34-172-27)。它们得到了针对动物实验的蒙彼利埃坎特罗克研究中心伦理委员会(IRCM/INSERM)和朗格多克·鲁西永地区伦理委员会(CEEA LRFrance No.36)的批准(参考编号：1094)。
用肿瘤异种移植物治疗小鼠
异种移植后第13天，携带100-200mm3 Ramos的无胸腺小鼠，或异种移植后第8天，携带100-200mm3 OCI-Ly8细胞肿瘤的小鼠接受一次静脉注射(100μL)：i)250MBq/kg或500MBq/kg的177Lu-lilotomab；ii)2.5mg/kg利妥昔单抗或利洛托单抗；iii)注射后第1天至第5天通过强饲法(每天两次)注射250MBq/kg的177Lu-lilotomab+30mg/kg MK-1775；iv)注射后第1天至第5天通过强饲法(每天两次)注射30mg/kg MK-1775。每个治疗组包括6至9只小鼠。
通过用游标卡尺测量肿瘤体积来评估肿瘤的生长。每周测定动物体重两次。当肿瘤体积达到2000mm3或体重减轻超过20％或有不适或不适迹象时，采用CO2窒息处死小鼠。
细胞周期分析
评估1×106个Ramos，DOHH2，Rec-1和OCI-Ly8细胞中的细胞周期，Ramos，DOHH2，Rec-1和OCI-Ly8细胞在12孔板中生长，并暴露于0MBq/mL和6MBq/mL的177Lu-lilotomab或暴露于略微高估的相应范围(0μg/mL和40μg/mL)的lilotoma或利妥昔单抗18小时。在第0小时，第2小时，第18小时，第1天，第2天，第3天收获细胞，然后在-20℃的70％乙醇中至少固定3小时。在室温下，在黑暗中，使用碘化丙啶，用
Figure BDA0002501161310000501
细胞周期分析试剂盒(默克密理博公司，法国莫尔斯海姆)染色30分钟后，使用
Figure BDA0002501161310000502
流式细胞仪分析细胞周期分布。计算G0/G1期，S期和G2/M期中的细胞百分比(三个实验一式三份的平均值)，并评估了WEE-1和MYT-1激酶抑制剂对细胞周期的影响。
单独用177Lu-lilotomab治疗人体活检或MK-1775或PD-166285联合使用177Lu-lilotomab治疗人体活检
从CHU de Montpellier Plateforme CRB/Hemodiag获得了DLBCL或FL患者的冷冻人体活检。通常，将细胞解冻并在含有95％空气/5％CO2的湿润环境中于37℃在12孔板中以0.5x106个细胞/mL的浓度生长。培养基由RPMI培养基，50ng/mL CD40L(他标签；R&D系统)和5μg/mL抗his-tag抗体(R&D系统，英国阿宾登)组成，所述RPMI培养基补充有20％热灭活胎牛血清，抗生素(0.1U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。5小时后，将它们用用量不断增加的177Lu-lilotomab(0MBq/mL至6MBq/mL)处理18个小时，其中177Lu-lilotomab与或不与MK-1775或PD-166285(1μM)结合。孵育结束时，通过流式细胞仪分析50％的细胞，收集剩余的细胞，离心并用培养基洗涤两次，然后再接种到12孔板中3天多。3天后，收集细胞并通过流式细胞术分析。使用了活/死固定死细胞染色剂(Fisher Scientific)，抗CD45，抗CD3，抗CD19，抗CD20和抗CD10 mAb(BD Pharmigen，Le pont de Claix，法国)和抗Kappa mAb(DAKO，Les Ulis，法国)然后通过流式细胞仪进行分析，以确定存活的肿瘤和非肿瘤细胞的数量和比例。
结果与讨论
177Lu-lilotomab诱导的G2/M阻滞的G2/M检查点释放细胞抑制剂
如果用177Lu-lilotomab处理细胞，则这些细胞将会被阻滞在细胞周期的G2/M期，正如图19A中所有细胞系所示，G2/M中处理/未处理细胞的增加。与在所有四个细胞系中单独暴露于177Lu-lilotomab的细胞相比，与MK-1775或PD-166285和177Lu-lilotomab的共孵育导致G2/M细胞的分数降低(图19A)。我们的体外数据表明，对177Lu-lilotomab的抗性主要与辐射后细胞在细胞周期的G2/M期中的阻滞有关。阻滞在Ramos细胞中很强，然后在U2932，Rec-1细胞，OCI-Ly8中逐渐降低，而在DOHH2细胞中则不明显。G/M细胞周期阻滞可能与177Lu-lilotomab观察到的强凋亡诱导有关，而利妥昔单抗诱导的细胞凋亡主要涉及G1阻滞。
在细胞周期的G2期，CDK1活性(控制G/M过渡的主激酶)被A型和B型细胞周期蛋白激活。含有CDK7的CAK激酶，一种由CDK7、cyclin H和MAT1组成的三元蛋白质复合物，在Thr161(位于激活环中)处的CDK1磷酸化促进了G2/M细胞周期的进展。相反，WEE-1和MYT-1分别在Tyr15和Thr14上使CDK1磷酸化，从而阻断G2/M中的细胞。CDK1细胞可以通过蛋白质磷酸酶介导的这些残基的去磷酸化作用而从该区域释放。这些激酶通过DNA修复途径和抑制DNA修复过程中细胞周期进展的细胞周期检查点参与DNA损伤反应。在放射敏感性DOHH2细胞中，与177Lu-lilotomab孵育后，Tyr15和Thr14处的CDK1磷酸化降低，而Thr161处的CDK1磷酸化增加。相反，在Ramos、Rec-1、OCI-Ly8、U2932细胞中，Tyr15和Thr14处的CDK1磷酸化保持较高水平，而在Ramos和Rec-1细胞中进行测量时，Thr161处的磷酸化水平较低。
G2/M检查点的抑制剂可使Ramos和OCI-Ly8肿瘤异种移植物对177Lu-lilotomab敏感
在Ramos肿瘤异种移植物中，与单使用250MBq/kg 177Lu-lilotomab相比，组合使用250MBq/kg 177Lu-lilotomab和MK-1775明显延迟了肿瘤的生长(p＝0.001)(图19B)。中位生存期从40天显著增加到了47天(p＝0.0156)。
在OCI-Ly8异种移植物中，利洛托单抗(或MK-1775，p＝0.625)与对照组相比无治疗效果(p＝0.475)。放射性标记后，177Lu-lilotomab(250MBq/kg)显著改善了肿瘤生长延迟(p＝0.015)和中位生存期(p＝0.0062)。当177Lu-lilotomab(250MBq/kg)与MK-1775治疗联合使用时，这一点得到了增强，因为与单单使用177Lu-lilotomab(p＝0.05)相比，肿瘤生长延迟得到了大大地改善。必须注意的是，联合使用与单独使用500MBq/kg 177Lu-lilotomab一样有效(p＝0.7070)(图19C)。
与G2/M检查点抑制剂组合可改善177Lu-lilotomab在DLBC和FL人体活检中的治疗性细胞毒性
对活细胞进行细胞表面标志物(CD3-和CD20)的流式细胞仪分析，其中所述活细胞从4位患者活检组织中分离出并暴露于177Lu-lilolotmab或177Lu-lilotomab+MK-1775或177Lu-lilotomab+PD-166285 18个小时(图20A)。我们观察到，就FL而言，对CD3阴性(CD3-)和对CD20阳性的初始细胞比例(27.1-29.9％)要比DLBC的相应初始细胞比例(0.36-0.52％)高。在第4天，177Lu-lilotomab减少了所有肿瘤中肿瘤细胞的比例(图20A)。
已显示，G2/M细胞周期阻滞抑制剂对177Lu-lilotomab细胞毒性的影响取决于细胞在整个细胞周期中进展的能力。然后，在暴露结束时(第1天)或3天后(第4天)进行分析(图20B)。对于这4次活检，我们考虑了单独使用MK-1775(或PD-166285)和177Lu-lilotomab的细胞毒性作用之间的加和效应，计算出理论上的增殖速率。已显示出MK-1775和PD-166285通过协同细胞毒性机制增加了177Lu-liotomab的细胞毒性(图20B)。
结论
我们在体外和体内证实了在Ramos和OCI-Ly8异种移植模型中以及在4例人体活检组织中，通过使用WEE-1和MYT-1抑制剂，Tyr15和Thr14处CDK1磷酸化在G2/M细胞周期阻滞和细胞死亡中的作用。具体而言，WEE-1抑制(通过MK-1775)使Ramos、Rec-1和OCI-Ly8细胞对177Lu-lilotomab敏感，而伴随的WEE-1和MYT-1抑制(通过PD-166285)没有加和效应。当考虑从人类活组织检查中分离出的CD3-/CD20+细胞时，观察到相似的趋势。这表明增加的放射敏感性主要由WEE-1活性决定。对于在活组织检查中获得的结果，必须牢记，放射敏感性与增殖指数密切相关，而这是从活检组织中分离出来的细胞的局限性。
177Lu-lilotomab与G2/M细胞周期阻滞抑制剂的组合将增强其治疗功效，并可减少放射性的注入量。
实施例7-细胞周期激酶抑制剂增强177Lu-Lilotomab satetraxetan在治疗侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系中的作用
目标
我们较早报道了人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系对用177Lu-Lilotomabsatetraxetan(Betalutin)治疗的敏感性差异(请参阅示例2)。U-2932和RIVA是活化的B细胞样亚型的两种侵略性DLBCL细胞系，这两种侵略性DLBCL细胞系在临床相关剂量下显示出对Betalutin治疗的耐药性。我们已经研究了作为媒介物以选择性地向肿瘤细胞传递辐射的放射免疫缀合物Betalutin与所选择的有丝分裂细胞周期激酶抑制剂的组合是否也能逆转对Betalutin治疗的抗药性。为此，在去除过量的Betalutin之前，使用(或不使用)Betalutin对细胞进行预处理，然后将经预处理的细胞接种到预先装有来自癌症化合物文库(赛莱克)的精选药物的384孔板上。使用发光测定法(RealTimeGlo)监测生存力。在筛选中，我们确定了与Betalutin结合使用时，在抑制增殖方面具有更多加和效应的药物(实施例2和4)。在此实施例中，在扩展的剂量反应实验中测试了选定的候选命中，以评估与Betalutin的协同相互作用。
材料和方法
细胞系
在37％的含有5％CO2的潮湿环境下，将DLBCL细胞系U2932和RIVA保持在RPMI1640-GlutaMAX培养基(Gibco)中，该培养基中补充有15％的胎牛血清(Biowest)和1％的青霉素-链霉素(Gibco)。在实验开始前，每周1：7将细胞分裂两次并稀释2-4天，以确保它们在实验开始时呈指数增长。
表1：使用的细胞系
Figure BDA0002501161310000531
用177Lu标记利洛托单抗
将螯合剂p-SCN-Bn-DOTA(satetraxetan，Macrocyclics，TX，美国)溶解在0.005MHCl中，以6：1的比例添加到抗体中，并使用碳酸盐缓冲液将pH值调节至大约8.5。在37℃下孵育45分钟后，通过添加50mL每mg Ab的甘氨酸溶液终止反应。为了除去游离的satetraxetan，使用Vivaspin 20离心管(Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根)用0.9％的NaCl洗涤结合抗体4-5次。在用177Lu标记之前，使用0.25M乙酸铵缓冲液将pH调节至5.3±0.3。将约200MBq的177Lu(ITG，德国加兴)添加到0.25mg satetraxetan-chHH1中，并在37℃下孵育15至30分钟。使用即时薄层色谱法评估了缀合物的放射化学纯度(RCP)，且放射化学纯度高于95％。将比活设定为600MBq/mg(根据需要用冷chHH1-satetraxetan稀释)。
Humalutin的免疫反应部分
使用Ramos细胞和单点修饰Lindmo方法测量放射免疫缀合物的免疫反应性。使用的细胞浓度为7500万个细胞/mL。缀合物的免疫反应性高于70％。
细胞毒性研究
Beetalutin治疗
在没有振荡的情况下，在6孔细胞培养板上用终浓度为1μg/mL的Betalutin处理U2932细胞，以及用终浓度为0.5μg/mL的Betalutin处理RIVA细胞达18个小时。处理后，将PBS加入细胞中，并沉淀细胞。首先将细胞重悬于1mL PBS中，然后在PBS中洗涤两次，最后在生长培养基中稀释至终浓度为2.5×106个细胞/mL。
Real Time Glo活力测定
在接种前一天进行细胞密度测量。基于这些测量，使用自动机将细胞以每孔3000个细胞的密度以25μl的培养体积接种到384孔板中(导致起始滴度：120000个细胞/mL)。为了使用Real Time Glo(Promega，美国威斯康星州)测量细胞活力，将细胞活力底物和
Figure BDA0002501161310000541
酶在生长培养基中按1：500稀释，然后用自动机将25μL稀释试剂分配到每个孔中。所有试剂均平衡至37℃。在第一次测量发光之前，将细胞与反应混合物在37℃下孵育1小时。加入试剂后72小时内，根据需要重复进行测量。使用Tecan SPARK 10M酶标仪(Tecan，SUI)在37℃下测量发光，积分时间设置为1秒。
板设置
筛选是在384孔板上进行的，其中包括从SelleckChem(Selleckchem，美国德克萨斯州)获得的选定细胞周期激酶抑制剂(DMSO中的10mM储备液)。为了包括无药对照，将药物组(表2)在两块板上划分。由于先前观察到细胞在板边缘的孔中生长不良，因此未使用两个最外面的行和列。在初次的筛选中使用了三种不同的药物浓度，U2932为10nM和1μM，RIVA为10nM和100nM。在验证筛选实验中，以1nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM、160nM、320nM、640nM和1280nM的浓度使用药物。对于JNJ-7706621和Betalutin的其他组合实验，将细胞如上所述用Betalutin预处理，在新鲜培养基中稀释并接种到384孔板中。然后使用Tecan D300e微型分配器(Tecan，SUI)将JNJ-7706621添加到细胞中。
表2：
Figure BDA0002501161310000551
数据分析
使用Bliss独立性测试确定药物相互作用的候选者命中。将每种药物在每种浓度下的效果计算为与对照细胞Fa＝(1-(RLU药物/avgRLU对照)相比死细胞的分数，对单独使用Betalutin的效果进行类似的计算Fb＝(1-(avgRLUBetaltuin/avgRLU对照)。通过以下等式，我们发现了药物+Betalutin组合的预期加和效应：预期效应(E)Fab＝(Fa+Fb-Fa*Fb)。我们从测得的效应中减去了这种预期的效应(M)Fab＝(1-(RLU药物+Betalutin/avgRLU对照)得到一个值(Diff)Fab，代表测量的效应与组合的预期加和效应之间的差异。将该值标准化为单独药物的存活分数：(Diff)Fab#＝(Diff)Fab/(1-Fa)。此外，为了测量孔间差异的大小，我们计算了每个板上48个对照孔中仅Betalutin效果的标准差：(STDEV)Fb＝(RLUBetalutin/RLU对照)-(averageRLUBetaltuin/averageRLU对照)。(Diff)Fab#值比Betaluti处理的对照(STDEV)Fb的标准差高两倍的药物被计为命中。
使用Compusyn软件将Chou-Talalay模型用于协同计算。计算出各个治疗的R(拟合优度)，在体外培养实验中R应大于0.90，以使用计算出的组合指数(CI)。CI表示协同作用：0-0.9被认为是协同作用。如WO2006004917A2中所述使用协同作用分级。
结果与讨论
我们先前报道了两种侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系U-2932和RIVA对Betalutin治疗的抵抗性(实施例2；图13-14)。在这里，我们使用这些细胞系模型来测试单使用细胞周期激酶抑制剂或细胞周期激酶抑制剂联合使用Betalutin所带来的功效。
将U-2932和RIVA细胞用或不用Betalutin预处理18个小时，洗涤细胞并将细胞接种到预先印有细胞周期激酶抑制剂的微量滴定板中。在第3天添加RealTimeGlo，以监控从第3天到第6天的增殖能力。将第5天和第6天的发光读数用于对单一和联合治疗的效应大小进行比较统计分析。在这些时间点，用Betalutin进行的单次治疗分别抑制U-2932和RIVA细胞的增殖能力不到10％和约50％。
用剂量分别为10nM和100nM的pan-CDK/AURA/AURB抑制剂JNJ-7706621单处理U-2932或RIVA细胞没有生长抑制作用(图21A)。用1μM的JNJ-7706621处理后5天，U-2932细胞的生长被抑制了约40％。用Betalutin预处理U-2932，使得U-2932的联合生长的抑制作用超过60％。BLISS分析表明，该组合的生长抑制作用明显大于单个药物的预期加和作用(图3B)。显著性被评定为效应大小大于单独的Betalutin治疗效果的标准偏差的两倍。
U-2932或RIVA细胞对PLK1的抑制高度敏感(图22)。在最高测试浓度下(U-2932；1μM；RIVA100 nM)，两种测试的PLK1抑制剂GSK461364和BI2536均以超过90％的比例阻止增殖。在10nM浓度下测试时，两种细胞系中GSK461364(图22A)的效力均低于BI2536(图22B)。在该筛选测定中，单独的BI2536抑制增殖超过80％。BLISS分析显示，对于两种细胞系，Betalutin和GSK461364联合治疗的生长抑制作用均明显大于单个单一治疗的预期加和效应(图22C)。Betalutin和BI2536治疗的组合中发现了相似的结果，但仅在U-2932细胞中更为明显(图22D)。
当以10nM加入时，Aurora B激酶抑制剂MLN8237(Alisertib)不足以抑制U2932或RIVA细胞的增殖(图23A)。在两种药物浓度较高的细胞系中，生长抑制都很明显，在RIVA细胞中约60％(第6天，100nM)，在U-2932细胞中约40％(第6天，1μM)。通过与Betalutin共同治疗，两种细胞系的生长抑制均得到增强。在RIVA细胞中，浓度为100nM的MLN8237和Betalutin的组合所获得的效应要比预期的组合加和效应大得多(图23B)。
综上所述，在两个对Betalutin治疗有抗性的U-2932和RIVA细胞中进行的有限筛选确定了一些实例，在这些实例中，Betalutin与选定的细胞周期激酶抑制剂的联合治疗所带来的效应比预期的联合加和效用大。这些实例支持以下结论，即细胞周期激酶抑制剂可以增强Betalutin的治疗效果。
验证筛选
为了验证初始筛选的结果，我们在抵抗力最强的细胞系U-2932中进行了精细的组合治疗筛选。在此，单独测试三种不同剂量的Betalutin，或者将这三种剂量不同的Betalutin与11种不同剂量的选定的细胞周期激酶抑制剂一同进行测试。连续四天记录剂量反应曲线，并使用Chou-Thalaly定理测试第5天联合治疗的协同作用。
将U-2932细胞用浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL或2μg/mL的Betalutin预处理18小时，然后将经Betalutin预处理的细胞接种至微孔板中，该微孔板按照12步梯度预刷有终浓度在0nM至1280nM范围内的细胞周期激酶抑制剂。使用未经Betalutin处理的细胞作为对照。在第三天添加RealTimeGlo，每天读取发光，直到第六天。Betalutin预处理具有剂量依赖性的生长抑制作用，但即使在最高剂量下，与未处理的细胞相比，预处理过的细胞仍可保持约70％的增殖潜能(图24)。
单单用PLK1抑制剂BI2536或GSK461364对U-2932细胞进行处理，在抑制剂浓度高于40nM时，几乎完全阻止了增殖(图25。证实了初步筛选的结果，U-2932细胞对BI2536的敏感性高于GSK461364。分种别对所有三Betalutin剂量和BI2536(范围1-20nM)或GSK461364(范围1-40nM)的组合计算了CI。仅在浓度为40nM时，Betalutin和BI2536的协同作用才明显(图25A；r＝0.87)。在浓度为20nM和40nM时，Betalutin和BI2536的协同作用明显(图5B；r＝0.98)。
用浓度高达160nM的Aurora B激酶抑制剂MLN8237(Alisertib)单次处理U-2932细胞会损害增殖(图26)。浓度高于160nM的MLN8237的加入会逆转抑制作用，这可能是由于抑制了抗增殖功能的第二个靶标所致。计算Betalutin和MLN8237的组合的组合指数在10nM到80nM之间。在20nM至80nM范围内，所有测试的Betalutin浓度与MLN8237的组合的协同作用均很明显(r＝1.00)。
与初次筛选的结果相似，较低浓度的JNJ-7706621不会抑制U-2932细胞的增殖(图27)。浓度低于160nM时，生长损伤不明显，最高测试剂量(1280nM)时，生长损失达到30％。相反，Betalutin预处理与pan-CDK抑制剂JNJ-7706621的组合在JNJ-7706621剂量大于160nM时具有很强的生长抑制作用，而在剂量为640nM时达到近80％的抑制作用。计算剂量在80至1280nM范围内的JNJ-7706621与0.5μg/mL、1μg/mL或2μg/mL Betalutin组合的组合指数。发现所有测试组合均具有协同作用(图27；r＝1.00)。
在另外两个独立的实验中证实了这一结果。在此处，用浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL和2.5μg/mL(确认1)或1μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL的Betalutin(确认2)预处理U-2932细胞。将细胞在新鲜培养基中稀释而不是洗涤，然后一式三份接种在微量滴定孔上。然后使用Tecan D300e分配器以100nM、266nM、707nM、1800nM和5000nM的终浓度添加JNJ-7706621。如之前的实施例一样，使用RealTimeGlo评估增殖，并计算第5天读取的所有数据点的组合指数(图28)。除了两种组合(r＝0.99和r＝0.96)以外，其他所有组合中均观察到Betalutin和JNJ-7706621的协同相互作用。这些例外表现出加和效应，并以最大效应量发生。
结论
全面的验证实验确认了主筛选的结果。此外，对Betalutin和受试细胞周期激酶抑制剂不同组合的集体作用进行统计分析，从而确定了明显具有协同作用的药物浓度范围。这些结果强烈支持以下这一点，即添加针对CDK、PLK1和/或Aurora激酶的细胞周期激酶抑制剂可以增强Betalutin的治疗效果，从而逆转侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤的细胞系模型中的耐药性。
实施例8：Humalutin和维奈托克砸在DLBCL细胞系中的协同作用
目标
当前的研究旨在探讨作为媒介物以向选择性地向肿瘤细胞传递辐射的抗CD37放射免疫缀合物Humalutin(177Lu-chHH1.1)与BCL-2抑制剂维奈托克的组合在治疗后5天测量细胞存活率时是否具有协同作用。先前的研究表明，在治疗3天后测量细胞存活率时，在不同的套细胞淋巴瘤(MC)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中具有强大的协同作用。当前的研究集中在3种DLBCL细胞系上：SUDHL-4、SUDHL-6和U2932。
材料和方法
细胞系
细胞在RPMI 1640培养基中生长，RPMI 1640培养基补充有Glutamax(Gibco，Paisley，UK)，10％-20％热活化FBS(Gibco)和1％青霉素-链霉素(Gibco)。将细胞在37℃和5％CO2下培养。每周两次用预热的培养基将细胞悬液以1：3至1：5稀释，并在实验开始前2-4天稀释，以确保它们在实验开始时呈指数增长。
表1：使用的细胞系，细节和培养条件。
Figure BDA0002501161310000591
用177Lu标记chHH1.1-satetraxetan
将螯合剂p-SCN-Bn-DOTA(satetraxetan，Macrocyclics，TX，美国)溶解在0.005MHCl中，以6：1的比例添加到抗体中，并使用碳酸盐缓冲液将pH值调节至大约8.5。在37℃下孵育45分钟后，通过添加50mL每mg Ab的甘氨酸溶液终止反应。为了除去游离的satetraxetan，使用Vivaspin 20离心管(Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根)用0.9％的NaCl洗涤结合抗体4-5次。在用177Lu标记之前，使用0.25M乙酸铵缓冲液将pH调节至5.3±0.3。将约200MBq的177Lu(ITG，德国加兴)添加到0.25mg satetraxetan-chHH1中，并在37℃下孵育15至30分钟。使用即时薄层色谱法评估了缀合物的放射化学纯度(RCP)，且放射化学纯度高于95％。将比活设定为600MBq/mg(根据需要用冷chHH1-satetraxetan稀释)。
Humalutin的免疫反应部分
使用Ramos细胞和单点修饰Lindmo方法测量放射免疫缀合物的免疫反应性。使用的细胞浓度为7500万个细胞/mL。缀合物的免疫反应性高于70％。
细胞毒性研究
用Humalutin，维奈托克或两者的组合处理细胞，然后将细胞接种到96孔板中。在处理后的每个时间点，将细胞用Alamar Blue(赛默飞世尔公司，DALL1100)孵育4小时，并使用多板读数器Fluoroskan ascent FL进行荧光测量以评估细胞增殖和活力。所有实验一式两份，每次实验用到两个样本。将数据标准化为未处理的对照。通过Graphpad Prism 8软件(Graphpad软件，美国加州圣地亚哥)使用对数刻度转换和非线性拟合(顶部为100％，底部为0％)来计算IC50。
用Humalutin治疗
在细胞培养瓶中将细胞与0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL或5μg/mL的Humalutin一起孵育，并在37℃/5％CO2下孵育。18-20小时后，将细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。使用校准的γ检测器(Cobra II自动γ检测器，Packard Instrument Company，美国梅里登)测量洗涤后的细胞结合活性。在洗涤后，使用用于流式细胞术的Guava ViaCount细胞分散试剂(默克公司，德国达姆施塔特)测量细胞浓度和活力，并在Guava EasyCyte12HT(默克公司，德国达姆施塔特)中进行测量，以确定细胞在温育中的存活程度。将细胞接种在96孔板中。接种后的120个小时进行Alamar blue活力测量。
用维奈托克治疗
将细胞接种到96孔板中，该板预先用0.2mL培养基中的0μM，0.5μM，1μM，2μM，和2.5μM维奈托克包被，并在37℃/5％CO2下温育120个小时，然后使用alamar blue细胞活力测定法测量细胞毒性作用。
用Humalutin和维奈托克治疗
将细胞与0μg/mL(对照)、0.5μg/mL、或1μg/mL的Humalutin一起孵育18至20个小时。
将细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。使用校准的γ检测器(Cobra II自动γ检测器，Packard Instrument Company，美国梅里登)测量洗涤后的细胞结合活性。在洗涤后，使用用于流式细胞术的Guava ViaCount细胞分散试剂(默克公司，德国达姆施塔特)测量细胞浓度和活力，并在Guava EasyCyte 12HT(默克公司，德国达姆施塔特)中进行测量，以确定细胞在温育中的存活程度。将细胞接种在96孔板中，该板预先用0.2mL培养基中的浓度在0.5μM和2.5μM之间的维奈托克包被，并在37℃/5％CO2下温育120个小时，然后使用alamarblue细胞活力测定法测量细胞毒性作用。
统计
使用Compusyn软件将Chou-Talalay模型用于协同计算。计算出各个治疗的R(拟合优度)，在体外培养实验中R应大于0.90，以放心使用计算出的组合指数(CI)。CI表示协同作用：0-0.9被认为是协同作用。如WO2006004917A2中的表3中所述使用协同作用分级。
结果与讨论
单独使用Humalutin和维奈托克
SUDHL-6和U2932对Humalutin和维奈托克的敏感性非常相似，而SUDHL-4对这两种药物的耐药性更高(表2，图1)。
表2.接种后120小时的孵育时间后，Humalutin和维奈托克的IC50值。
Figure BDA0002501161310000611
Humalutin和维奈托克的组合
图29给出了两种治疗方法(以及单个治疗方法)的药物反应曲线。通过ChouTalalay方法计算的组合指数(CI)显示出不同程度的协同作用，具体取决于细胞系以及所用的维奈托克和Humalutin的剂量(表3)。重要的是要注意，对于U2932细胞系中的Humalutin IC50的拟合，单单治疗的R值低于0.9，这意味着应谨慎考虑Chou Talalay方法得到的结果。
有趣的是，我们注意到SUDHL-4是对Humalutin和维奈托克耐药性最高的细胞系(与对BH3不敏感的情况相符)，同时显示出更强的协同作用。
表3.使用Chou-Talalay方法计算0.5μg/mL或1μg/mL的Humalutin与不同剂量的维奈托克的组合的组合指数。
Figure BDA0002501161310000612
结论
在使用Humalutin治疗5天后，在三种测试的DLBCL细胞系：SUDHL-4，SUDHL-6和U2932中观察到了Humalutin与BCL-2抑制剂维奈托克之间的协同作用。结果表明，放射免疫疗法进行治疗可以使淋巴瘤对BCL-2抑制剂变得敏感。有必要在动物模型中进行进一步研究。
实施例9：Humalutin和奥拉帕尼在DLBCL细胞系中的协同作用
目标
当前的研究旨在探讨作为媒介物以向选择性地向肿瘤细胞传递辐射的抗CD37放射免疫缀合物Humalutin(177Lu-chHH1.1)与PARP抑制剂奥拉帕尼的组合在治疗后5天测量细胞存活率时是否具有协同作用。先前的研究表明，在治疗3天后测量细胞存活率时，在不同的套细胞淋巴瘤(MCL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中具有强大的协同作用。当前的研究集中在3种DLBCL细胞系上：DOHH2、SUDHL-4和U2932以及MCL细胞系Granta 519。
材料和方法
细胞系
细胞在RPMI 1640培养基或DMEM培养基中生长，培养基补充有Glutamax(Gibco，Paisley，UK)，10％热活化FBS(Gibco)和1％青霉素-链霉素(Gibco)。将细胞在37℃和5％CO2下培养。每周两次用预热的培养基将细胞悬液以1：3至1：5稀释，并在实验开始前2-4天稀释，以确保它们在实验开始时呈指数增长。
表1：使用的细胞系，细节和培养条件。
Figure BDA0002501161310000621
用177Lu标记chHH1.1-satetraxetan
将螯合剂p-SCN-Bn-DOTA(satetraxetan，Macrocyclics，TX，美国)溶解在0.005MHCl中，以6：1的比例添加到抗体中，并使用碳酸盐缓冲液将pH值调节至大约8.5。在37℃下孵育45分钟后，通过添加50mL每mg Ab的甘氨酸溶液终止反应。为了除去游离的satetraxetan，使用Vivaspin 20离心管(Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根)用0.9％的NaCl洗涤结合抗体4-5次。在用177Lu标记之前，使用0.25M乙酸铵缓冲液将pH调节至5.3±0.3。将约200MBq的177Lu(ITG，德国加兴)添加到0.25mg satetraxetan-chHH1中，并在37℃下孵育15至30分钟。使用即时薄层色谱法评估了缀合物的放射化学纯度(RCP)，且放射化学纯度高于95％。将比活设定为600MBq/mg(根据需要用冷chHH1-satetraxetan稀释)。
Humalutin的免疫反应部分
使用Ramos细胞和单点修饰Lindmo方法测量放射免疫缀合物的免疫反应性。使用的细胞浓度为7500万个细胞/mL。缀合物的免疫反应性高于70％。
细胞毒性研究
用Humalutin，维奈托克或两者的组合处理细胞，然后将细胞接种到96孔板中。在处理后的每个时间点，将细胞用Alamar Blue(赛默飞世尔公司，DALL1100)孵育4小时，并使用多板读数器Fluoroskan ascent FL进行荧光测量以评估细胞增殖和活力。所有实验一式两份，每次实验用到两个样本。将数据标准化为未处理的对照。通过Graphpad Prism 8软件(Graphpad软件，美国加州圣地亚哥)使用对数刻度转换和非线性拟合(顶部为100％，底部为0％)来计算IC50。
用Humalutin治疗
在细胞培养瓶中将细胞与0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL或5μg/mL的Humalutin一起孵育，并在37℃/5％CO2下孵育。18-20小时后，将细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。使用校准的γ检测器(Cobra II自动γ检测器，Packard Instrument Company，美国梅里登)测量洗涤后的细胞结合活性。在洗涤后，使用用于流式细胞术的Guava ViaCount细胞分散试剂(默克公司，德国达姆施塔特)测量细胞浓度和活力，并在Guava EasyCyte12HT(默克公司，德国达姆施塔特)中进行测量，以确定细胞在温育中的存活程度。将细胞接种在96孔板中。接种后的120个小时进行Alamar blue活力测量。
用奥拉帕尼治疗
将细胞接种到96孔板中，该板预先用0.2mL培养基中的0μM，0.5μM，1μM，2μM，和2.5μM维奈托克包被，并在37℃/5％CO2下温育120个小时，然后使用alamar blue细胞活力测定法测量细胞毒性作用。
用Humalutin和奥拉帕尼治疗
将细胞与0μg/mL(对照)、0.5μg/mL、或1μg/mL的Humalutin一起孵育18至20个小时。将细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。使用校准的γ检测器(Cobra II自动γ检测器，Packard Instrument Company，美国梅里登)测量洗涤后的细胞结合活性。在洗涤后，使用用于流式细胞术的Guava ViaCount细胞分散试剂(默克公司，德国达姆施塔特)测量细胞浓度和活力，并在Guava EasyCyte12HT(默克公司，德国达姆施塔特)中进行测量，以确定细胞在温育中的存活程度。将细胞接种在96孔板中，该板预先用0.2mL培养基中的浓度在1μM和100μM之间的奥拉帕尼包被，并在37℃/5％CO2下温育120个小时，然后使用alamar blue细胞活力测定法测量细胞毒性作用。
统计
使用Compusyn软件将Chou-Talalay模型用于协同计算。计算出各个治疗的R(拟合优度)，在体外培养实验中R应大于0.90，以放心使用计算出的组合指数(CI)。CI表示协同作用：0-0.9被认为是协同作用。如WO2006004917A2中的表3中所述使用协同作用分级。
结果与讨论
单独使用Humalutin和奥拉帕尼
在不同细胞系中，对Humalutin和奥拉帕尼的敏感性有所不同(表2，图30)。对Humalutin最有耐药性的细胞系是DOHH2，而对奥拉帕尼最敏感的也是DOHH2。对Humalutin最敏感的细胞系是U2932，而对奥拉帕尼最有耐药性的细胞系也是U2932。
表2.接种后120小时的孵育时间后，Humalutin和奥拉帕尼的IC50值。
Figure BDA0002501161310000641
Humalutin和奥拉帕尼的组合
图29给出了两种治疗方法(以及单个治疗方法)的药物反应曲线。通过ChouTalalay方法计算的组合指数(CI)显示出不同程度的协同作用，具体取决于细胞系以及所用的奥拉帕尼和Humalutin的剂量(表3)。重要的是要注意，对于U2932细胞系中的Humalutin IC50的拟合，单单治疗的R值低于0.9，这意味着Chou Talalay方法得到的结果可能是不精确的。请注意，对于Humalutin和奥拉帕尼的几种组合，在SUDHL-4、DOHH2和Granta细胞系中观察到了不同程度的拮抗作用。在1μg/mL的Humalutin处理的SUDHL-4中发现了最高的协同作用。
表3.使用Chou-Talalay方法计算0.5μg/mL或1μg/mL的Humalutin与不同剂量的奥拉帕尼的组合的组合指数。
Figure BDA0002501161310000651
结论
在使用Humalutin治疗5天后，在所有测试的细胞系：SUDHL-4，SUDHL-6和U2932(DLBCL)和Granta 519(MCL)中观察到了Humalutin与PARP抑制剂奥拉帕尼之间的协同作用。结果表明，放射免疫疗法进行治疗可以使淋巴瘤对PARP抑制剂变得敏感。有必要在动物模型中进行进一步研究。
项
1.一种组合物，包括：
A：一种放射免疫缀合物，包含单克隆HH1抗体和放射性核素，例如177Lu-chHH1.1、177Lu-lilotomab和/或212Pb-chHH1.1，以及
B：一种另外的药物，其可以是能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子。
2.根据项1所述的组合物，其中177Lu-chHH1.1、177Lu-lilotomab和/或212Pb-chHH1.1通过螯合接头连接。
3.根据项1至2所述的组合物，其中所述螯合接头选自p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯，p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-苄基-TCMC和CHX-A”-DTPA。
4.根据项1至3所述的组合物，其中所述螯合接头是satetraxetan，也称为p-SCN-苄基-DOTA。
5.根据项1至4所述的组合物，其中A是177Lu-chHH1.1。
6.根据项1至5所述的组合物，其中A是177Lu-lilotomab。
7.根据项1至6所述的组合物，其中A是212Pb-chHH1.1。
8.根据项1至7所述的组合物，其中B是能够通过G2/M检查点导致细胞周期进展的蛋白质或分子，或能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子。
9.根据项1至8所述的组合物，其中所述蛋白质或分子导致WEE-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化降低以及通过G2/M检查点导致细胞周期进展。
10.根据项1至8所述的组合物，其中所述蛋白质或分子导致MYT-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化降低以及通过G2/M细胞周期阻滞导致细胞周期进展。
11.根据项1至8所述的组合物，其中所述导致含CDK7的CAK激酶介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化程度更高。
12.根据项1至8所述的组合物，其中所述蛋白质或分子是AURORA激酶的抑制剂。
13.根据项1至8所述的组合物，其中所述蛋白质或分子是蛋白14-3-3的抑制剂。
14.根据项1至13所述的组合物，其中所述蛋白质或分子是参与G2/M细胞周期阻滞的蛋白质的抑制剂，或是能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子。
15.根据项1至14所述的组合物，其中所述蛋白质或分子选自：MK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、黄酮哌啶醇、GSK461364、JNJ-7706621、LY2603618、NSC23766、NU6027、PHA-793887、甲苯磺酰基-L-精氨酸甲基酯(TAME)、BI6727(Volasertib)、ON-01910(Rigosertib)、HA-1077(Fasudil)、SCH727965(Dinaciclib)、LY2835219、LEE011、Salirasib、K-115(Ripasudil)、PD0332991(Palbociclib)、BI2536、MLN8237(Alisertib)或蛋白质14-3-3抑制剂，例如双氟哌啶。
16.根据项1至7所述的组合物，其中B是蛋白质或分子，所述蛋白质或分子为PARP抑制剂。
17.根据项1至7和16所述的组合物，其中所述PARP抑制剂选自奥拉帕尼(AZD2281、Ku-0059436)、维利帕尼(ABT-888)、鲁卡帕尼(AG-014699、PF-01367338)、塔拉唑帕尼(BMN673)、AG-14361、INO-1001(3-氨基苯甲酰胺)、A-966492、PJ34 HCl、尼拉帕尼(MK-4827)、UPF 1069、ME0328、NMS-P118、E7449、吡啶甲酰胺、苯甲酰胺、尼拉帕尼(MK-4827)甲苯磺酸酯、NU1025、伊尼帕利(BSI-201)、AZD2461和BGP-15 2HCl。
18.根据项1至7所述的组合物，其中B是蛋白质或分子，所述蛋白质或分子为BCL2抑制剂。
19.根据项1至17所述的组合物，其中所述组合物被配置成药物组合物。
20.根据项19所述的组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体或佐剂。
21.根据项1至20所述的组合物用作药物。
22.根据项21所述用途的组合物，其中所述药物针对非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
23.根据项22所述用途的组合物，其中NHL选自转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴白血病、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、移植诱导的淋巴瘤。
24.根据项22-23所述用途的组合物，其中所述用途指的是联合疗法，其中所述组合物之后是同时进行处理或后处理的抗体疗法、免疫缀合物疗法或其组合。
25.根据项22-24中任一项所述用途的组合物，其中在所述组合物之后以单次施用或以重复施用方式进行抗CD20抗体治疗。
26.根据项25所述用途的组合物，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗、obinutuzumab或奥法木单抗。
27.一种用作药物的组合物，包含：
A：177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，以及
B：一种另外的药物，其可以是能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子。
28.一种用作根据项27所述用途的组合物，包含：
A：177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1，以及
B：一种另外的药物，其可以是能够通过G2/M检查点导致细胞周期的进展的蛋白质或分子，能够通过有丝分裂抑制进展的蛋白质或分子，作为BCL2抑制剂的蛋白质或分子，或者作为PARP抑制剂的蛋白质或分子，
其中所述药物针对非霍奇金淋巴瘤。
29.根据项28所述用途的组合物，其中NHL是转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴白血病、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、移植诱导的淋巴瘤。
30.根据项27-29所述用途的组合物，其中所述用途指的是联合疗法，其中所述组合物之后是同时进行处理或后处理的抗体疗法、免疫缀合物疗法或其组合。
31.根据项27-30中任一项所述用途的组合物，其中在所述组合物之后以单次施用或以重复施用方式进行抗CD20抗体治疗。
32.根据项31所述用途的组合物，其中抗CD20抗体是利妥昔单抗、obinutuzumab或奥法木单抗或利妥昔单抗生物类似药，如Rixathon或Truxima。
33.根据项27-32中任一项所述用途的组合物，其中177Lu-lilotomab、177Lu-chHH1.1和/或212Pb-chHH1.1通过螯合接头连接。
34.根据项26-32中任一项所述用途的组合物，其中所述螯合接头选自p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯，p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-苄基-TCMC和CHX-A”-DTPA。
35.根据项27-34中任一项所述用途的组合物，其中所述螯合接头是satetraxetan，也称为p-SCN-苄基-DOTA。
36.根据项27-35中任一项所述用途的组合物，其中所述蛋白质或分子导致WEE-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化降低。
38.根据项27-35中任一项所述用途的组合物，其中所述蛋白质或分子导致MYT-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化降低。
39.根据项27-35中任一项所述用途的组合物，其中导致含CDK7的CAK激酶介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化程度更高。
40.根据项27-37中任一项所述用途的组合物，其中所述蛋白质或分子是G2细胞周期阻滞的抑制剂或M期进展的抑制剂。
41.根据项27-40中任一项所述用途的组合物，其中所述蛋白质或分子选自：MK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、黄酮哌啶醇、GSK461364、JNJ-7706621、LY2603618、NSC23766、NU6027、PHA-793887、甲苯磺酰基-L-精氨酸甲基酯(TAME)、BI6727(Volasertib)、ON-01910(Rigosertib)、HA-1077(Fasudil)、SCH727965(Dinaciclib)、LY2835219、LEE011、Salirasib、K-115(Ripasudil)、PD0332991(Palbociclib)、BI2536、MLN8237(Alisertib)或蛋白质14-3-3抑制剂，例如双氟哌啶。
42.根据项27-41中任一项所述用途的组合物，其中所述蛋白质或分子是MK-1775。
43.根据项27-41中任一项所述用途的组合物，其中所述蛋白质或分子是PD-166285。
44.根据项27-43中任一项所述用途的组合物，其中A和B配置成一种或多种药物组合物。
45.根据项27-44中任一项所述用途的组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体或佐剂。
46.一种包含177Lu-lilotomab satetraxetan的组合物，用于治疗非霍奇金淋巴瘤，显示出抑制性CDK1磷酸化降低。
47.根据项45所述的组合物，其中所述降低的抑制性CDK1磷酸化来自WEE-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的较低的磷酸化。
48.根据项45所述的组合物，其中所述降低的抑制性CDK1磷酸化来自MYT-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的较低的磷酸化。
49.一种包含177Lu-lilotomab satetraxetan的组合物，用于治疗非霍奇金淋巴瘤的用途，显示出含CDK7的CAK激酶介导的细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)的磷酸化程度更高。
50.根据项44-50所述用途的组合物，其中NHL是转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴白血病、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、移植诱导的淋巴瘤。
51.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是MK-1775。
52.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是PD-166285。
53.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是AMG900。
54.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是AZD7762。
55.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是JNJ7706621。
56.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是CYC116。
57.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是AT7519。
58.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是LY2603618。
59.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是黄酮哌啶醇。
60.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是GSK461364。
61.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是NSC23766。
62.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是NU6027。
63.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是PHA-793887。
64.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是甲苯磺酰基-L-精氨酸。
65.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是甲酯(TAME)。
66.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是BI6727(Volasertib)。
67.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是ON-01910(Rigosertib)。
68.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是HA-1077(Fasudil)。
69.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是SCH727965(Dinaciclib)。
70.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是LY2835219。
71.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是LEE011。
72.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是Salirasib。
73.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是K-115(Ripasudil)。
74.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是PD0332991(Palbociclib)。
75.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是蛋白质14-3-3抑制剂。
76.根据项14所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是双氟哌啶。
77.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是奥拉帕尼(AZD2281、Ku-0059436)。
78.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是维利帕尼(ABT-888)。
79.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是鲁卡帕尼(AG-014699、PF-01367338)。
80.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是塔拉唑帕尼(BMN 673)。
81.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是AG-14361。
82.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是INO-1001(3-氨基苯甲酰胺)。
83.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是A-966492。
84.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是PJ34 HCl。
85.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是尼拉帕尼(MK-4827)。
86.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是UPF 1069。
87.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是ME0328。
88.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是NMS-P118。
89.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是E7449。
90.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是吡啶甲酰胺。
91.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是苯甲酰胺。
92.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是尼拉帕尼(MK-4827)甲苯磺酸酯。
93.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是NU1025。
94.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是伊尼帕利(BSI-201)。
95.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是AZD2461。
96.根据项16所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中所述PARP抑制剂是BGP-15 2HCl。
97.根据项16所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是BI2536。
98.根据项16所述的组合物或根据项41所述的组合，其中所述蛋白质或分子是MLN8237(Alisertib)。
99.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂选自维奈托克(ABT-199、GDC-0199)、奥巴拉克甲磺酸盐(GX15-070)、HA14(1)、ABT-263(navitoclax)、ABT-737、TW-37，AT101、sabutoclax、WEHI-539、A-1155463、棉酚和AT-101、阿朴棉子酚、S1、2-甲氧基抗霉素A3、BXI-61、BXI-72、TW37、MIM1、UMI-77和藤黄酸。
100.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是维奈托克(ABT-199、GDC-0199)。
101.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是奥巴拉克甲磺酸盐(GX15-070)。
102.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是HA14(1)。
103.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是ABT-263(navitoclax)。
104.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是TW-37。
105.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是AT-101。
106.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是sabutoclax。
107.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是藤黄酸。
108.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是WEHI-539。
109.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是A-1155463。
110.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是棉酚和AT-101。
111.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是阿朴棉子酚。
112.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是S1。
113.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是2-甲氧基抗霉素A3。
114.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是BXI-61。
115.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是BXI-72。
116.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是TW37。
117.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是MIM1。
118.根据项18所述的组合物或根据项27-28所述用途的组合，其中BCL2抑制剂是UMI-77。
119.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是转化的滤泡性淋巴瘤。
120.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
121.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是套细胞淋巴瘤。
122.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是边缘区淋巴瘤。
123.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是慢性淋巴白血病。
124.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是皮肤T-细胞淋巴瘤。
125.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是淋巴浆细胞性淋巴瘤。
126.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是边缘区B细胞淋巴瘤。
127.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是MALT淋巴瘤。
128.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是小细胞淋巴性淋巴瘤。
129.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是伯基特淋巴瘤。
130.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是间变性大细胞淋巴瘤。
131.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是淋巴母细胞淋巴瘤。
132.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是外周T细胞淋巴瘤。
133.根据项23或50所述用途的组合物或根据项28所述用途的组合，其中NHL是移植诱导的淋巴瘤。

Claims (20)

1.一种用作药物的组合，其特征在于，包含：
A：一种放射免疫缀合物，包含单克隆HH1抗体和放射性核素，以及
B：一种BCL2抑制剂。
2.一种组合物，包含：
A：一种放射免疫缀合物，包含单克隆HH1抗体，以及
B：一种BCL2抑制剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，用作药物。
4.根据权利要求1所述用途的组合，根据权利要求2所述的组合物，或根据权利要求3所述用途的组合物，其特征在于，所述放射免疫缀合物包含单克隆HH1抗体，所述单克隆HH1抗体是嵌合IgG1 HH1(chHH1.1)或鼠HH1(HH1，利洛托单抗)。
5.根据权利要求1和4所述用途的组合物，根据权利要求2和4所述的组合物，或根据权利要求3和4所述的组合物，其特征在于，所述放射性核素是177Lu或212Pb。
6.根据权利要求1和4-5所述用途的组合物，根据权利要求2和4-5所述的组合物，或根据权利要求3至5所述用途的组合物，其特征在于，所述单克隆HH1抗体和放射性核素通过螯合接头连接。
7.根据权利要求6所述用途的组合，根据权利要求6所述的组合物，或根据权利要求6所述用途的组合物，其特征在于，所述螯合接头选自p-SCN-苄基-DOTA、DOTA-NHS-酯，p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-苄基-TCMC和CHX-A”-DTPA。
8.根据权利要求1和4-7所述用途的组合，根据权利要求2和4-7所述的组合物，或根据权利要求3至7所述用途的组合物，其特征在于，所述螯合接头是satetraxetan(p-SCN-苄基-DOTA)。
9.根据权利要求1和4-8所述用途的组合，根据权利要求2和4-8所述的组合物，或根据权利要求3至8所述用途的组合物，其特征在于，A是177Lu-chHH1.1。
10.根据权利要求1和4-8所述用途的组合，根据权利要求2和4-8所述的组合物，或根据权利要求3至8所述用途的组合物，其特征在于，A是177Lu-lilotomab。
11.根据权利要求1和4-8所述用途的组合，根据权利要求2和4-8所述的组合物，或根据权利要求3至8所述用途的组合物，其特征在于，A是212Pb-chHH1.1。
12.根据权利要求1和4-11所述用途的组合，根据权利要求2和4-11所述的组合物，或根据权利要求3至11所述用途的组合物，其特征在于，BCL2抑制剂选自维奈托克(ABT-199、GDC-0199)、奥巴拉克甲磺酸盐(GX15-070)、HA14(1)、ABT-263(navitoclax)、ABT-737、TW-37，AT101、sabutoclax、WEHI-539、A-1155463、棉酚和AT-101、阿朴棉子酚、S1、2-甲氧基抗霉素A3、BXI-61、BXI-72、TW37、MIM1、UMI-77和藤黄酸。
13.根据权利要求1和4-12所述用途的组合，根据权利要求2和4-12所述的组合物，或根据权利要求3至12所述用途的组合物，其特征在于，BCL2抑制剂是维奈托克(ABT-199、GDC-0199)。
14.根据权利要求1和4-13所述用途的组合，根据权利要求2和4-13所述用途的组合物，或根据权利要求3至13所述用途的组合物，其特征在于，所述组合物被配置成药物组合物。
15.根据权利要求14所述用途的组合，根据权利要求14所述的组合物，或根据权利要求14所述用途的组合物，其特征在于，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体和/或佐剂。
16.根据权利要求1和4-15所述用途的组合，或根据权利要求3至15所述用途的组合物，其特征在于，所述药物针对非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
17.根据权利要求16所述用途的组合，或根据权利要求16所述用途的组合物，其特征在于，NHL选自转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴白血病、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、移植诱导的淋巴瘤。
18.根据权利要求1和4-17所述用途的组合，或根据权利要求3至17所述用途的组合物，其特征在于，所述用途指的是联合疗法，其中所述组合物之后是同时进行处理或后处理的抗体疗法、免疫缀合物疗法或其组合。
19.根据权利要求1和4-18所述用途的组合，或根据权利要求3至18所述用途的组合物，其特征在于，在所述组合物之后以单次施用或以重复施用方式进行抗CD20抗体治疗。
20.根据权利要求19所述用途的组合，或根据权利要求19所述用途的组合物，其特征在于，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗、obinutuzumab或奥法木单抗。
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