BR112012018843B1

BR112012018843B1 - Radioimunoconjugado que se liga a cd37 humano, composição farmacêutica, uso do radioimunoconjugado, método para tratamento de uma malignidade de célula b e kit para a produção do radioimunoconjugado

Info

Publication number: BR112012018843B1
Application number: BR112012018843-7A
Authority: BR
Inventors: Roy H. Larsen; Jostein Dahle; Oyvind S. Bruland
Original assignee: Nordic Nanovector As
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2020-09-24
Also published as: BR112012018843A8; PL2528627T3; CN102762230B; RU2560587C9; KR101893720B1; DK2528627T3; CN102762230A; KR20130028051A; PT2528627E; CN104338154A; US20120301396A1; EP2705857B1; CA2786655C; DK2705857T3; BR112012018843B8; IL221091A; IL221091A0; MX342539B; EP2705857A2; JP2015057415A

Abstract

radioimunoconjugado que se liga a cd37 humano, composição farmacêutica, uso do radioimunoconjugado, método para tratamento de uma malignidade de célula b e kit para a produção do radioimunoconjugado. a presente invenção refere-se a um radioimunoconjugado que se liga a cd37 humano. as composições farmacêuticas e usos da mesma para o tratamento de câncer- e, em particular, malignidades de célula b - são aspectos da presente invenção.

Description

RADIOIMUNOCONJUGADO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO RADIOIMUNOCONJUGADO, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B E KIT PARA A PRODUÇÃO DO RADIOIMUNOCONJUGADO

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à radioimunoterapia de câncer hematológico com um anticorpo monoclonal radioidentificado com uma citotoxicidade inesperadamente alta.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A terapia com anticorpos radioidentificados foi introduzida contra o linfoma não Hodgkin (NHL) e é, atualmente, um método aprovado. Dois produtos estão no mercado, Zevalin™ e Bexxar™, e ambos têm como alvo o antígeno CD20 (Jacene et al., 2007).

[003] Além disso, o agente imunoterapêutico rituximab (Rituxan™/Mabthera™) tem como alvo o antígeno CD20. Um problema com o tratamento contra o mesmo alvo é a possibilidade de tendência imunofenotípica durante o curso da doença (Ngo et al., 2009) que poderia ocasionar efeitos diminuídos de terapia de CD20 quando repetida ao longo do tempo como em terapia de rituximab ou se radioimunoterapia à base de CD20 (RIT) é administrada após terapia de rituximab prolongada.

[004] Um grande número de pacientes que recebe terapia direcionada de CD20 eventualmente experimentarão relapso (Buchegger et al., 2006; Gordon et al.; 2004). Dessa forma, há uma necessidade significativa por RIT que tem como alvo outro antígeno que o CD20 em pacientes de NHL.

[005] No desenvolvimento precoce de RIT, os dois antígenos CD37 e CD20 foram avaliados como alvos (Press et al., 2001). Concluiu-se que a RIT que tem como alvo CD20 foi mais apropriada e, portanto, o desenvolvimento de RIT direcionada de CD37 foi abandonado. Dessa forma, é conhecido na técnica que anticorpos monoclonais são adequados para uso em RIT contra linfoma, mas que o radioimunoconjugado (RIC) que tem como alvo CD20 é superior ao RIC que tem como alvo CD37 (Press et al., 2001).

[006] Nos últimos anos, o CD37 tem atraído algum interesse (Heider et al., 2009; Grosmaire, 2007), principalmente como alvo para imunoterapia com o uso de construtos de anticorpo quimérico ou humanizado. Esse trabalho ensina alternativas ao uso de anticorpos monoclonais IgG de murino convencionais, já que anticorpos de murino podem induzir produção de anticorpo anti-camundongo humano (HAMA) em pacientes, o que pode causar desconforto e eficácia reduzida de imunoterapias.

[007] Para RIT, os anticorpos monoclonais de murino convencionais ainda são considerados interessantes, já que, em geral, as doses de proteína usadas são inferiores e o tratamento não precisa ser repetido na mesma medida de que com imunoterapia. Além disso, a eliminação de IgG de murino é, em geral, levemente mais rápida que versões humanizadas ou quiméricas do mesmo IgG, que pode ser mais apropriada em termos de exposição à radiação de corpo inteiro de RIT, pelo menos em algumas configurações. Deve-se observar que tanto Bexxar quanto Zevalin são baseados em anticorpos de murino.

[008] A presente invenção fornece o anticorpo de murino anti-CD37 HH1 como carreador para radioisótopo. O clone de hibridoma original que produz o anticorpo anti-CD37 de murino HH1 foi desenvolvido na década de 80 (Smeland et al., 1985) e o anticorpo HH1 está à venda para uso in vitro em imuno-histoquímica há vários anos.

[009] HH1 não foi previamente avaliado para radioimunoterapia em termos de biodistribuição e citotoxicidade celular. O trabalho atual foi, portanto, realizado para avaliar a adequação de HH1 em radioimunoterapia. Em contraste ao trabalho clínico e pré-clínico anterior com RIC anti-CD37, que usou 131I diretamente radioidentificado em relação aos resíduos de tirosina que usam métodos de chloramineT/Iodogen, o HH1 foi radioidentificado através de um quelante que usa um radionuclídeo metálico ao invés de um halogênio.

[010] O uso de um radionuclídeo metálico identificado através de um quelante-ligante poderia ser vantajoso já que o uso de anticorpos 131I identificados está associado à exposição da tireoide a quantidades variadas de iodo liberado dos RICs.

[011] Em um estudo anterior para avaliar se HH1 era adequado para a produção de um radioimunoconjugado, CHX-A-DTPA foi conjugado em HH1 e o conjugado identificado com 205,206Bi para finalidades de modelagem in vitro (Henriksen et al., 1997).

[012] A absorção na linhagem celular Raji foi comparada para bismuta conjugada em HH1 ou estreptavidina. No último caso, as células foram pré-saturadas com HH1 biotinilado.

[013] Verificou-se que o número de quelantes necessário para assegurar RIC funcional quando identificado 213 com 212Bi ou 213Bi era um fator limitante. Portanto, foi sugerida a utilização de HH1 biotinilado ao invés de um RIC à base de HH1. Uma vez ligado às células, o HH1 biotinilado poderia, então, ser alvejado com estreptavidina radioidentificada.

[014] Dessa forma, o trabalho sugere que HH1 identificado com um radionuclídeo emissor de partícula alfa foi menos útil devido à atividade específica insuficiente nas concentrações de quelante consideradas toleráveis para que o HH1 retivesse capacidade de ligação suficiente.

[015] Também foi indicado no artigo que um emissor de beta ainda seria menos adequado para construção de um RIC funcional comparado a um beta emissor (Henriksen et al, 1997) já que os autores relataram que radioterapia alvejada com beta emissor deveria ser inferior em doenças disseminadas devido ao fato de que o fogo cruzado é essencial para a obtenção de efeito suficiente.

[016] Dessa forma, o trabalho citado acima ensina alternativas ao uso de um HH1 diretamente quelado em radioimunoterapia e também alternativas ao uso de HH1 em um RIC à base de beta emissor.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[017] A presente invenção refere-se a radioimunoconjugado que se liga a CD37 humano que compreende anticorpo monoclonal de murino HH1, um ligante, e um radionuclídeo selecionado a partir do grupo que consiste em 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 47Sc e 177Lu.

[018] Em uma modalidade da presente invenção, o ligante é um ligante quelante e o radionuclídeo é 177Lu.

[019] Um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um radioimunoconjugado da presente invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[020] Em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção compreende um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais.

[021] Em outra modalidade da presente invenção, um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais têm como alvo CD20.

[022] Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica da presente invenção para tratamento de células malignas de B-células que expressam o antígeno CD37.

[023] Em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica serve para o tratamento de linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica.

[024] Um aspecto da presente invenção refere-se ao uso do radioimunoconjugado da presente invenção para o tratamento de malignidade de células B.

[025] Uma modalidade da presente invenção refere-se ao uso do radioimunoconjugado da presente invenção administrado em combinação com ou em adição a outra terapia.

[026] Em uma modalidade da presente invenção, a terapia é selecionada de pré-tratamento, quimioterapia, terapia de anticorpo monoclonal, cirurgia, radioterapia e/ou terapia fotodinâmica.

[027] Em outra modalidade da presente invenção, a terapia compreende pré-tratamento com o uso de anticorpo monoclonal anti-CD20 e/ou anti-CD37 antes do tratamento com o radioimunoconjugado da presente invenção.

[028] Um aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratamento de uma malignidade de célula B selecionada de linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica, que compreende administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção.

[029] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para a produção do radioimunoconjugado da presente invenção que compreende dois ou mais frascos, em que um frasco contém um conjugado que compreende um quelante ligado a um anticorpo monoclonal de murino HH1; e um segundo frasco contém um radionuclídeo.

[030] Uma modalidade da presente invenção refere-se a um kit da presente invenção, em que o conteúdo de um ou diversos frascos ou está liofilizado ou em uma solução.

[031] Em outra modalidade da presente invenção, o radioimunoconjugado é gerado através da mistura do conteúdo dos dois frascos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[032] Figura 1

[033] Anticorpo ligado à célula imediatamente (A) e 96 horas (B) após lavagem para incubação de células Raji, Rael e Daudi com 111In-HH1, 111In-rituximab, 125I-HH1 e 125I-rituximab.

[034] Figura 2

[035] Atividade ligada a células Daudi após incubação com 177 Lu-HH1 ou 177Lu-rituximab por 2 horas (A) e 18 horas (B). Células bloqueadas foram bloqueadas com 100 μg/ml de anticorpo não identificado.

[036] Figura 3

[037] Crescimento de células Daudi incubadas com 177Lu-HH1
(A) ou 177Lu-rituximab (B) por 2 horas antes da lavagem.

[038] Figura 4

[039] Crescimento de células Daudi incubadas com 177Lu-HH1
(A) ou 177Lu-rituximab (B) por 18 horas antes da lavagem.

[040] Figura 5

[041] Biodistribuição de 111In identificado através de quelante para HH1 em camundongos com xenoenxertos de Daudi.

[042] Figura 6

[043] Histogramas FITC de células Daudi não identificadas, células Daudi identificadas com anticorpo secundário apenas, ou identificadas com HH1, ON.108, IPO.24 ou 6D263.

[044] Figura 7

[045] Biodistribuição de 177Lu- em camundongo nu fêmea com tumor de Daudi.

[046] Terapia de camundongos com células Daudi injetadas

[047] iv. Sobrevivência de camundongos tratados com 50 e 100 MBq/kg de 177Lu-HH1, HH1 frio, rituximab frio e NaCl.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[048] A presente invenção refere-se ao uso de anticorpo HH1 em radioimunoterapia.

[049] A combinação de um radionuclídeo de metal, um ligante e o anticorpo monoclonal anti-CD37 mostrou surpreendentemente que HH1 radioidentificado tem uma biodistribuição relevante e absorção de tumor em um modelo de xenoenxerto/camundongo nu.

[050] Essa é uma importante informação que indica adequabilidade para uso em radioimunoterapia. Radioimunoconjugados

[051] A presente invenção mostra surpreendentemente que o radioimunoconjugado 177Lu-HH1 exibiu uma citotoxicidade significativa em células de tumor disseminadas e que 177Lu- HH1 foi mais citotóxico que 177Lu-rituximab contra as células de tumor para uma dada dosagem.

[052] Esse veredito foi inesperado já que radioatividade estava ligada por célula e a retenção do radionuclídeo ligada era similar ou melhor para 177Lu-rituximab.

[053] Esse ensinamento vai de encontro ao conhecimento comum no campo, que é que anticorpo anti-CD20 é melhor que o anticorpo anti-CD37 para radioimunoterapia.

[054] Ademais, o trabalho atual difere da noção anterior já que, para um beta emissor, fogo cruzado, que não é obtenível em células disseminadas, seria essencial para a obtenção de efeito suficiente (Henriksen et al., 1997).

[055] A razão pela qual o efeito observado não é evidente. Os dados de experimentos com várias dosagens de HH1 e rituximab não identificados não indicam nenhum efeito dos anticorpos não identificados no ensaio de crescimento usado.

[056] Uma explicação possível poderia ser que há poucas células com densidade de antígeno muito baixa entre CD37 vs. CD20 mesmo que CD20 esteja na média expressa de maneira mais forte na linhagem celular usada.

[057] Os dados de retenção não sugerem melhor retenção devido à internalização de CD37, que poderia, de outra foram, ser uma possível explicação, já que alguma internalização foi relatada com o antígeno CD37 (Press et al, 2001).

[058] Dessa forma, a presente invenção refere-se a um radioimunoconjugado que se liga a um CD37 humano que compreende um anticorpo monoclonal de murino HH1, um ligante e um radionuclídeo selecionado a partir do grupo que consiste em 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 47Sc e 177Lu.

[059] Em uma modalidade da presente invenção, o ligante é um ligante quelante.

[060] Em outra modalidade da presente invenção, o radionuclídeo é 177Lu.

[061] Em ainda outra modalidade, o radionuclídeo é outro beta emissor ou um alfa emissor.

[062] A presente invenção sugere, com dados in vitro, que HH1 radioidentificado se liga de modo mais eficaz ao antígeno CD37 que rituximab radioidentificado do que o antígeno CD20, isto é, alcançou ligação máxima ao antígeno com menos circulação exigida de anticorpo (Tabela 2, Figura 2).

[063] Isso também exigiu menos tempo para alcançar ligação máxima (Figura 2). Esses também seriam recursos importantes in vivo devido ao fato de que isso significa que células de tumor podem aprisionar o RIC mesmo em concentração inferior de anticorpos em circulação, uma situação que pode ocorrer em áreas menos disponíveis de tumores sólidos e para células de tumor únicas e micrometástase localizada em áreas remotas de tecidos normais.

[064] Isso é significativamente diferente dos dados anteriores que indicaram que concentração de anticorpo maior foi exigida com outro anticorpo anti-CD37 que HH1 (Bernstein et al., 1990), também comparado a um anticorpo anti-CD20 (Press et al., 1993), a fim de saturar antígeno e obter biodistribuição favorável.

[065] Além disso, a presente invenção mostra que HH1 tem algumas propriedades de ligação de antígeno diferentes comparado a um painel de três anticorpos anti-CD37 diferentes - apesar de que todos os anticorpos se ligam substancialmente ao mesmo epítopo.

[066] Os experimentos de bloqueio, isto é, que usam células pré-saturadas com anticorpo não identificado, mostraram que HH1 impediria que o CD37 em células vivas se ligasse a HH1 radioidentificado, de modo substancialmente melhor que os outros três anticorpos anti-CD37.

[067] Em um ensaio de célula que compara anticorpos radioidentificados, HH1 mostrou fração imunorreativa muito melhor comparado aos outros três anticorpos. Por fração imunorreativa, entende-se a fração de anticorpo que pode se ligar ao antígeno se houver um excesso ilimitado de antígenos. Diferentes anticorpos podem ter capacidade diferente de preservar a imunoreatividade após atravessarem um procedimento de identificação. Os resultados no Exemplo 6, Experimento IV, Tabela 5 mostram que a imunoreatividade de HH1 foi mais bem preservada que a imunoreatividade de três anticorpos comercialmente disponíveis.

[068] Por outro lado, a análise imuno-histoquímica mostrou que os três anticorpos mancharam seções de tecido de amostras de tumor fixo embutidas em parafina, enquanto HH1 falhou ao fazer isso. Diferenças em interações entre anticorpo e antígeno não foram detectáveis por citometria de fluxo.

[069] Os histogramas de citometria de fluxo foram similares para HH1 e para os três outros anticorpos anti-CD37 (Figura 6). De todo modo, esses dados mostram que HH1 tem uma interação de antígeno individual significativa, que, em vários aspectos, não pode ser prevista a partir de estudos com outros anticorpos anti-CD37.

[070] O radioimunoconjugado anti-CD37 inovador com fortes propriedades citotóxicas aqui descrito consiste no anticorpo monoclonal de murino HH1, um ligante quelante e o beta emissor 177Lu.

[071] O radionuclídeo pode ser fixado ao anticorpo ao, em primeiro lugar, reagir um quelante bifuncional, por exemplo, p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, EUA), com o anticorpo, seguido pela purificação para remover quelante não conjugado, e, então, reação do conjugado de anticorpo quelante com o radionuclídeo, seguido pela purificação para remover qualquer radionuclídeo não conjugado.

[072] Alternativamente, o quelante e o radionuclídeo podem ser, em primeiro ligar, combinados e, subsequentemente, conjugados em relação ao anticorpo.

[073] Os ligantes quelantes como, por exemplo, p-SCN-bn- DOTA, podem ser suados para conjugação de outros radionuclídeos de metal em relação a HH1 de modo similar àquele descrito para 177Lu.

[074] Qualquer tipo de ligante com capacidade complexante suficiente e m grupo funcional que permite conjugação direta ou indireta em relação a uma proteína ou um peptídeo poderia ser usado.

[075] Exemplos de tais ligantes estão descritos na literatura (por exemplo, Brechbiel, 2008; Liu, 2008). Alguns exemplos úteis são quelantes cíclicos bifuncionais como p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-éster; quelantes lineares bifuncionais como p-SCN-Bn-DTPA e CHX-A''-DTPA.

[076] Os radionuclídeos na presente invenção serão, de preferência, conjugados em relação a uma molécula alvo através do uso de quelantes bifuncionais.

[077] Os mesmos poderiam ser quelantes cíclicos, lineares ou ramificados. Pode-se fazer referência particular aos quelantes de poliácido poliamino que compreendem uma cadeia principal de poliazaalcano linear, cíclica ou ramificada com grupos ácidos (por exemplo, carboxialquila) fixados em nitrogênios de cadeia principal.

[078] Exemplos de quelantes adequados incluem derivados de DOTA como ácido p-isotiocianatobenzil-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (p-SCN-Bz-DOTA) e derivados de DTPA como ácido p-isotiocianatobenzil-dietilenotriaminapentaacético (p-SCN-Bz-DTPA), em que os primeiros são quelantes cíclicos, os últimos são quelantes lineares.

[079] A metalação da porção de complexante pode ser realizada antes ou após conjugação da porção complexante em relação à porção alvo.

[080] O procedimento de radioidentificação será, em geral, mais conveniente em termos de tempo utilizado, etc. se o quelante é conjugado em relação ao anticorpo antes da ocorrência da radioidentificação.

[081] Os princípios de preparo de conjugados radioidentificados com o uso de quelantes fixados aos anticorpos é descrito de forma mais ampla em, por exemplo, Liu.; 2008.

[082] Dessa forma, HH1 pode ser usado para preparar radioimunoconjugados com diferenças em propriedades de radiação e meias vidas eficazes.

[083] Por exemplo, o radioimunoconjugado anti-CD37 que consistem no anticorpo monoclonal de murino HH1, um ligante quelante e um radionuclídeo beta ou alfa emissor incluindo, mas não limitado a, 177Lu, 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm 149Pm 142Pr 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 47Sc pode ser preparado e usado para o preparo de preparações farmacêuticas e usado em aplicações terapêuticas.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS.

[084] Um produto radioimunoterapêutico baseado em HH1 seria, tipicamente, fornecido como uma composição farmacêutica que consiste em um radionuclídeo, de acordo com a descrição acima, ligada através de um quelante ao anticorpo monoclonal de murino HH1 dissolvido em uma solução tampão, que, em um grau substancial, mantém a integridade química do radioimunoconjugado e é fisiologicamente aceitável para infusão em pacientes.

[085] Dessa forma, um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um radioimunoconjugado da presente invenção, e um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[086] Os carreadores farmacêuticos aceitáveis incluem, mas não se limitam a, tampões não tóxicos, cargas, soluções isotônicas, etc. Mais especificamente, o carreador farmacêutico pode ser, mas não se limita a, solução salina normal (0,9 %), salina meio normal, lactato de Ringer, 5 % de Dextrose, 3,3 % de Dextrose/0,3 % de Solução Salina. O carreador fisiologicamente aceitável pode conter um estabilizador radiolítico, por exemplo, ácido ascórbico, que protege a integridade do radiofarmacêutico durante armazenamento e transporte.

[087] Uma modalidade da presente invenção compreende a composição farmacêutica da presente invenção e um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais. Anticorpos incluem, mas não se limitam a, Rituximab, Epratuzumab, L19, F8, F16, Galiximab, Toralizumab, Alemtuzumab, Ofatumumab, Veltuzumab, Afutuzumab, Tositumomab, Reditux e Ibritumomab. Radioimunoconjugados incluem, mas não se limitam a, Zevalin e Bexxar.

[088] Em outra modalidade da presente invenção, um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais têm como alvo o CD20. Anticorpos incluem, mas não se limitam a, Rituximab, Veltuzumab, Ofatumumab, Afutuzumab, Tositumomab, Reditux e Ibritumomab. Radioimunoconjugados incluem, mas não se limitam a, Zevalin eBexxar.

[089] Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica da presente invenção para tratamento de células malignas de B-células que expressam o antígeno CD37.

[090] Em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica serve para o tratamento de linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica.

IDENTIDADE DE SEQUÊNCIA

[091] Como comumente definido, "identidade" é definida, aqui, como identidade de sequência entre genes ou proteínas no nível de nucleotídeo ou aminoácido, respectivamente.

[092] Dessa forma, no presente contexto, "identidade de sequência" é uma medida de identidade entre proteínas no nível de aminoácido e uma medida de identidade entre ácidos nucleicos em nível de nucleotídeo.

[093] A identidade de sequência de proteína pode ser determinada ao compara a sequência de aminoácido em uma dada posição em cada sequência quando as sequências estão alinhadas.

[094] De modo similar, a identidade de sequência de ácido nucleico pode ser determinada ao comparar a sequência de nucleotídeo em uma dada posição em cada sequência quando as sequências estão alinhadas.

[095] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de ácido nucleico ou de dois aminoácidos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideais (por exemplo, vãos podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácido ou ácido nucleico para alinhamento ideal co uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são, então, comparados.

[096] Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = n° de posições idênticas/n° total de posições (por exemplo, posições de sobreposição) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento.

[097] Podem-se alinhar manualmente as sequências e contar o número de ácidos nucleicos ou aminoácidos idênticos. Alternativamente, o alinhamento de duas sequências para a determinação de identidade percentual pode ser realizado com o uso de um algoritmo matemático. Tal algoritmo é incorporado aos programas NBLAST e XBLAST. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, identificação = 100, comprimento de palavra = 12, a fim de obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma molécula de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, identificação = 50, comprimento de palavra = 3 a fim de obter sequências de aminoácido homólogas a uma molécula de proteína da invenção.

[098] Para obter alinhamentos com intervalos para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Ao utilizar os programas NBLAST, XBLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas podem ser usados. Consulte http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

[099] Alternativamente, a identidade de sequência pode ser calculada após as sequências terem sido alinhadas, por exemplo, pelo programa BLAST na base de dados EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST).

[100] De modo geral, as configurações padrão em relação a, por exemplo, "matriz de identificação" e "penalidade por intervalo " podem ser usadas para alinhamento. No contexto da presente invenção, as configurações padrão de BLASTN e PSI BLAST podem ser vantajosas.

[101] A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada com o uso de técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem a permissão de intervalos. No cálculo da identidade percentual, apenas compatibilidades exatas são calculadas.

[102] Uma modalidade da invenção se refere a um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que compartilha 80% de identidade de sequência com a sequência VH (SEQ ID NO:1) e/ou sequência VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo HH1.

[103] Uma modalidade da invenção se refere a um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência com a sequência VH (SEQ ID NO: 1) e/ou sequência VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo HH1.

[104] Em outra modalidade da invenção, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência que compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência VH (SEQ ID NO:1) e/ou sequência VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo HH1, como 90% de identidade, 91% de identidade, 92% de identidade, 93% de identidade, 94% de identidade, 95% de identidade, 96 % identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade.

[105] Outra modalidade da invenção se refere a um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeo que compartilha 80% de identidade de sequência com a sequência VH (SEQ ID NO: 2) e/ou sequência VL (SEQ ID NO: 4) de anticorpo HH1.

[106] Outra modalidade da invenção se refere a um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeo com a sequência VH (SEQ ID NO: 2) e/ou sequência VL (SEQ ID NO: 4) de anticorpo HH1.

[107] Em outra modalidade da presente invenção, o anticorpo compreende uma sequência que compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência VH (SEQ ID NO:2) e/ou sequência VL (SEQ ID NO: 4) de anticorpo HH1, como 90% de identidade, 91% de identidade, 92% de identidade, 93% de identidade, 94% de identidade, 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade.

VARIAÇÃO GENÉTICA

[108] A variação genética é causada pela variação na ordem de bases nos nucleotídeos em genes. Essa variação causa mutações nos genes e, subsequentemente, nas proteínas que tais genes encodificam.

[109] Essas mutações podem ser substituições ou mutações de sentido ou de sentido trocado.

[110] Uma modalidade da presente invenção se refere à sequência de ácido nucleico isolado da cadeia VH (SEQ ID NO:1) e/ou cadeia VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo monoclonal HH1 que compreende pelo menos 50, como 20, como 10, como 5, como 4, como 3, como 2, como 1 mutação de sentido.

[111] Outra modalidade da presente invenção se refere à sequência de ácido nucleico isolado da cadeia VH (SEQ ID NO:1) e/ou cadeia VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo monoclonal HH1 que compreende 0 a 50, como 1 a 50, como 0 a 20, como 1 a 20, como 0 a 10, como 1 a 10, como 0 a 5, como 1 a 5, como 3, como 1 mutação de sentido.

[112] Uma mutação de sentido trocado (um tipo de mutação não sinônima) é uma mutação pontual na qual um único nucleotídeo é alterado, resultando em um códon que codifica um aminoácido diferente (mutações que alteram um aminoácido por um códon de parada são consideradas mutações sem sentido trocado, diferentes de mutações de sentido trocado). Uma mutação de sentido trocado pode tornar a proteína resultante não funcional.

[113] Entretanto, nem todas as mutações de sentido trocado levam a alterações de proteína apreciáveis. Um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido de propriedades químicas muito similares, nesse caso, a proteína pode ainda funcionar normalmente; isso é denominado como uma mutação neutra, "quieta" ou conservadora.

[114] Alternativamente, a substituição de aminoácido poderia ocorrer em uma região da proteína que não afeta significativamente a estrutura ou função secundária da proteína. Quando um aminoácido pode ser encodificado por mais de um códon (denominado "codificação degenerada"), uma mutação em um códon pode não produzir qualquer alteração na tradução; isso seria uma mutação sinônima (uma forma de mutação silenciosa) e não uma mutação de sentido trocado.

[115] Uma modalidade da presente invenção se refere a um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeo da cadeia VH (SEQ ID NO: 1) e/ou cadeia VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo monoclonal HH1 que compreende pelo menos 50, como 20, como 10, como 5, como 4, como 3, como 2, como 1 mutação de sentido trocado.

[116] Uma modalidade da presente invenção se refere a um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeo da cadeia VH (SEQ ID NO: 1) e/ou cadeia VL (SEQ ID NO: 3) de anticorpo monoclonal HH1 que compreende 0 a 50, como 1 a 50, como 0 a 20, como 1 a 20, como 0 a 10, como 1 a 10, como 0 a 5, como 1 a 5, como 3, como 1 mutação de sentido trocado.

[117] Uma substituição conservadora é uma substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente similares, tal que o funcionamento geral não seja provavelmente seriamente afetado.

[118] Em outra modalidade da presente invenção, as substituições ou mutações conservadoras são as mutações de sentido trocado.

[119] Uma modalidade adicional da presente invenção se refere a uma sequência de ácido nucleico isolado ou a uma sequência de polipeptídeo com 80% de identidade de sequência em relação às sequências af HH1 de cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 2) e/ou cadeia leve variável (SEQ ID NO: 4), em que a variação de sequência são substituições conservadoras.

[120] Em outra modalidade da presente invenção a identidade de sequência é 80% identidade, como 90% identidade, 91% de identidade, 92% de identidade, 93% de identidade, 94% de identidade, 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade e a variação de sequência são substituições conservadoras.

[121] A fim de aprimorar a etapa de radioidentificação, pode ser benéfico introduzir uma lisina extra, por exemplo, na porção Fc de HH1. Isso poderia reduzir a probabilidade de fixação de quelantes ligantes de lisina nos sítios de combinação de antígeno no anticorpo, desse modo, reduzindo o risco de comprometer a imunorreatividade durante a radioidentificação.

[122] Os métodos para introduzir lisina, por exemplo, na porção Fc de HH1, são conhecidos na técnica, por exemplo, de Hemminki et al., 1995.

[123] Uma modalidade da presente invenção se refere ao radioimunoconjugado da presente invenção que foi modificado por 10 Lis na porção Fc de HH1, como 8 Lis, como 6 Lis, como 5 Lis, como 4 Lis, como 3 Lis, como 2 Lis, como 1 Lis.

TRATAMENTO

[124] O uso terapêutico de uma solução farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser para o tratamento contra células malignas que expressam o antígeno CD37, incluindo, mas não se limitando a linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica.

[125] Outros usos poderiam ser o tratamento de doenças autoimunes e tratamento de efeitos relacionados a transplante . A terapia poderia ter como base, mas sem se limitar a, radiação de partícula beta ou radiação de partícula alfa ou uma combinação dessas.

[126] A terapia poderia ser administrada como uma monoterapia ou em combinação com outras terapias, de preferência, tratamentos padrão. Tais outras terapias podem ser pré-tratamento, cirurgia, quimioterapia, imunoterapia, terapia fotodinâmica, radioimmunoterapia ou uma combinação de dois ou mais desses. Por administrado entende-se infusão intravenosa ou injeção intravenosa. Mais especificamente, o radioimunoconjugado da presente invenção pode ser administrado diretamente em uma veia através de uma cânula periférica conectada a uma câmara de gotejamento que evita o embolismo de ar e permite uma estimativa da taxa de fluxo no paciente.

[127] Em uma modalidade, o radioimunoconjugado pode ser administrado em um modo repetido.

[128] Em outra modalidade da presente invenção, o radioimunoconjugado poderia ser administrado em um modo repetido, mas com radionuclídeos diferentes, por exemplo, a beta-radioimunoterapia poderia ser seguida por alfa-radioimunoterapia ou vice versa.

[129] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso do radioimunoconjugado da presente invenção para o tratamento de malignidades de célula B.

[130] Uma modalidade da presente invenção se refere ao uso do radioimunoconjugado da presente invenção administrado em combinação com ou em adição a outra terapia.

[131] Em uma modalidade da presente invenção, as outras terapias são selecionadas a partir de pré-tratamento, quimioterapia, terapia de anticorpo monoclonal, cirurgia, radioterapia e/ou terapia fotodinâmica.

[132] Em outra modalidade da presente invenção, as outras terapias são transplante de medula óssea ou terapia e/ou transplante de célula tronco.

[133] Outra modalidade da presente invenção compreende pré-tratamento terapêutico com o uso de anticorpo monoclonal anti-CD20 e/ou anti-CD37 antes do tratamento com o radioimunoconjugado da presente invenção.

[134] Um aspecto da presente invenção se refere a um método para o tratamento de malignidades de célula B selecionadas a partir de linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica, que compreende a administração de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da presente invenção.

[135] Em uma modalidade da presente invenção, a dosagem de anticorpo é de 1 a 1000 mg por paciente, com mais preferência, de 5 a 50 mg por paciente e 177Lu equivale a 1 a 200 MBq/kg, com mais preferência, 10 a 100 MBq/kg de peso corporal.

KITS

[136] Um aspecto da presente invenção se refere a um kit para a produção do radioimunoconjugado da presente invenção que compreende dois ou mais frascos, em que um frasco contém um conjugado que compreende um quelante ligado a um anticorpo HH1 monoclonal murino; e um segundo frasco que contém um radionuclídeo.

[137] Um kit pode exigir que alguns procedimentos sejam realizados, por exemplo, que a radioidentificação e/ou purificação ocorra antes da infusão.

[138] Uma modalidade da presente invenção se refere a um kit da presente invenção, em que o conteúdo de um ou inúmeros frascos é liofilizado ou esteja em uma solução.

[139] Ao misturar os conteúdos dos dois frascos para gerar o radioimunoconjugado, aparecerá o produto final. Dessa forma, em outra modalidade da presente invenção, o radioimunoconjugado é gerado pela mistura do conteúdo dos dois frascos.

[140] Esse produto pode precisar de purificação antes do uso.

EXEMPLOS

[141] Exemplo 1 - Radioidentificação de HH1

[142] Iodinação: Os anticorpos foram identificados com 125I através de iodinação indireta com o uso de tubos de iodinação pré-revestidos com IODOGEN (Pierce, Rockford, IL, EUA) de acordo com a descrição do fabricante.

[143] Identificação com 111In e 177Lu: Os anticorpos foram primeiramente reagidos com um quelante (p-SCN-Bn-DTPA ou p- SCN-Bn-DOTA). O quelante DTPA ou DOTA foi dissolvido em 0,05 M de HCl e, então, adicionado ao anticorpo, que teve o pH ajustado para aproximadamente 8, através da lavagem com tampão de carbonato, em uma razão de 5:1. O pH foi, então, checado novamente e, caso necessário, ajustado. A solução foi agitada em 60 min à temperatura ambiente e, então, a reação foi concluída pela adição de 50 μl de solução de glicina a 200 mM (por mg de anticorpo). Para remover o quelante livre, o anticorpo conjugado foi lavado 4 a 5 vezes com PBS (PAA) e, então, ajustado para pH 5 através da lavagem com acetato de amônio. 111In ou 177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, EUA) foi, então, adicionado a 0,5 mg de DOTA-Ab, e agitado por uma hora a 42°C. Finalmente, o produto foi purificado por eluição em uma coluna de filtração em gel, por exemplo, Sephadex G-25 PD10 (GE health) ou similar. O rendimento de identificação geral variou de 17% a 63%.

[144] A qualidade dos radioimunoconjugados foi medida com o uso de células linfoma e um método Lindmo modificado. As concentrações celulares até 108 células por ml foram usadas para compensar a atividade específica modesta de conjugados 111In. Para conjugados 125I (que têm uma atividade específica maior) foi suficiente usar concentrações celulares até 4*107 células por ml.

[145] A imunorreatividade e atividade específica para os radioimunoconjugados podem ser vistas na Tabela 1.

[146] Exemplo 2 - Parâmetros de ligação

[147] A constante da taxa de associação, ka, a constante de dissociação de equilíbrio, Kd, e o número médio de sítios de ligação, Bmax, foram determinadas por um método de ajuste de curva de única etapa (Dahle et al. 2007). Os parâmetros de ligação foram medidos para HH1 e rituximab e para três linhagens celulares de linfoma diferentes; células de Raji, Rael e Daudi (Tabela 2). A ligação específica foi medida como uma função de tempo e concentração de anticorpo, e a solução da equação diferencial que descreve a taxa líquida de formação do complexo antígeno-anticorpo foi ajustada aos pontos de dados experimentais com o uso da constante da taxa de associação, ka, da constante de dissociação de equilíbrio, Kd, e do número médio de sítio de ligação, Bmax, como parâmetros. Cinco milhões de células por ml foram usadas, quatro concentrações de anticorpo identificado por 125I (100 ng/ml, 1.000 ng/ml, 5.000 ng/ml e 10.000 ng/ml) e 7 pontos de períodos de tempo de incubação (5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h e 2 h). Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e, então, contadas em um contador gama.

[148] Exemplo 3 - Retenção de anticorpo ligado à célula

[149] A retenção de anticorpo ligado à célula imediatamente e 96 horas após a lavagem foi medida após a incubação de células de Raji, Rael e Daudi com 111In-HH1, 111In-rituximab, 125I-HH1 e 125I-rituximab (Figura 1).

[150] Um milhão de células em 1 ml de meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bezerro, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina foram incubadas com 1 μg/ml de HH1 identificado por 125I ou 111In ou rituximab por uma hora, lavadas duas vezes com meio e incubadas adicionalmente por quatro dias. A atividade de ligação de célula foi determinada imediatamente após a lavagem (Figura 1A) e após quatro dias de incubação (Figura 1B) através da medição do número de células (Analisador de Viabilidade Celular Vi, Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA) e da quantidade de radioatividade com um detector gama calibrado (detector autogama Cobra II, Packard Instrument Company, Meriden, CT, 2 0 EUA).

[151] Exemplo 4 - Tratamento de células de linfoma in vitro com 177Lu-HH1 ou 177Lu-rituximab

[152] Experimento I: Ligação de 177Lu-HH1 com células de Daudi

[153] Um ml de suspensão celular de Daudi (1 milhão de células/ml) foi semeado em 24 tubos e metade dos tubos foi bloqueada com 100 μg/ml de HH1 ou rituximab e incubados por 30 minutos a 37°C. Subsequentemente, em cada tubo foi adicionado 177Lu-HH1 ou 177Lu-rituximab a uma concentração final de 0, 1, 2.5, 5, 10 ou 20 μg/ml e incubado adicionalmente a 37°C. A atividade específica foi de 91,6 kBq/μg para 177Lu-HH1 e 136,6 kBq/μg para 177Lu-rituximab.

[154] A quantidade de atividade adicionada foi medida durante o período de incubação com um detector gama (Cobra II detector de autogama, Packard Instrument Company). Após 2 horas, metade das células foi lavada e a atividade ligada à célula foi medida (Figura 2A) enquanto que a metade das células foi incubada de um dia para o outro (18 h) antes da lavagem e medição da atividade ligada à célula (Figura 2B).

[155] Não houve diferença entre as células incubadas com HH1 e as células incubadas com rituximab após 2 horas de incubação, enquanto que a atividade ligada à célula foi duas vezes tão alta para as células incubadas com rituximab do que para as células incubadas com HH1 após 18 horas de incubação (Figura 2).

[156] As tabelas 3 e 4 indicam que o HH1 radioidentificado satura o antígeno de maneira mais rápida e em uma concentração de anticorpo inferior em relação ao rituximab. A ligação não específica aparenta ser similar para os dois radioimunoconjugados (RIC), e aumenta com a concentração crescente de RIC no meio.

[157] O número máximo de 177Lu de ligação específica foi cerca de duas vezes tão alto para rituximab quanto para HH1. Entretanto, na dosagem de 1 μg/ml, não houve quase nenhuma diferença no número de átomos radioativos especificamente ligados.

[158] Experimento II: Incubação de duas horas com 177Lu-IgG: Dados de crescimento celular

[159] As células de Daudi foram incubadas com radioimunoconjugados como no experimento I (Figura 2A).

[160] O crescimento de células de Daudi após 2 horas de incubação com 177Lu-HH1 ou 177Lu-rituximab foi medido pela semeadura de 50.000 células a partir de cada tubo em três cavidades em seis placas com 12 cavidades. A quantidade de células foi medida para diversos pontos de tempo nos 14 dias seguintes usando um sistema de imageamento automático (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, Reino Unido).

[161] Não houve nenhum efeito do anticorpo não identificado sozinho sobre o crescimento celular. Entretanto, as células bloqueadas tratadas com anticorpo 177Lu, claramente, não cresceram de modo tão rápido quanto as células de controle não tratadas, indicando que houve um efeito do anticorpo 177Lu não ligado ou do anticorpo 177Lu ligada de forma não específica sobre as células (Figura 3).

[162] O tratamento de células não bloqueadas com anticorpo 177Lu resultou em um aumento no atraso de crescimento de 44% para as células tratadas com 10 μg/ml de 177 Lu-HH1 (Figura 3 A) e de 31% para as células tratadas com 10 μg/ml de 177Lu-rituximab (Figura 3 B).

[163] Para o tratamento com 20 μg/ml, a diferença entre os dois anticorpos foi ainda maior, visto que não houve crescimento renovado das células tratadas com 177Lu-HH1. Esse resultado foi inesperado já que as células foram identificadas com a mesma quantidade de anticorpos (Figura 2 A).

[164] Experimento III: Incubação de dezoito horas com 177Lu-IgG: Dados de crescimento celular

[165] As células de Daudi foram incubadas com radioimunoconjugados como no experimento I (Figura 2 B). O crescimento de células de Daudi após 18 horas de incubação com 177Lu-HH1 ou 177Lu-rituximab foi medido pela semeadura de 50.000 células a partir de cada tubo em três cavidades em seis placas de 12 cavidades.

[166] A quantidade de células foi medida para inúmeros pontos de tempo nos 14 dias seguintes usando um sistema de imageamento automático (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, Reino Unido). Não houve efeito do anticorpo não identificado sozinho sobre o crescimento celular.

[167] A inibição do crescimento celular nas células bloqueadas tratadas com anticorpo 177Lu foi maior nesse experimento (Figura 4) do que no experimento II (Figura 3) devido ao tempo de incubação crescente de 16 horas com radioimunoconjugado no meio.

[168] O tratamento de células não bloqueadas com anticorpo 177Lu resultou em um aumento no atraso do crescimento de 107% para células tratadas com 2,5 μg/ml de 177Lu-HH1 (Figura 4 A) e de 52% para células tratadas com 2,5μg/ml de 177Lu-rituximab (Figura 4 B). Esse resultado foi inesperado visto que após 18 h de incubação, as células identificadas com 177Lu-rituximab tiveram duas vezes mais atividade ligada à célula fixada do que as células identificadas com 177Lu-HH1 (Figura 2 B).

[169] Exemplo 5 - Biodistribuição de HH1

[170] A biodistribuição de HH1 identificado com 111In foi estudada em camundongos BALB/c-nus (nu/nu) com xenoenxertos de Daudi com tamanho de 32 a 256 mm3 no início do estudo.

[171] A radioidentificação foi realizada com o uso de pSCN-Bz-DOTA como um agente quelante bifuncional para complexar o radionuclídeo e fixá-lo ao anticorpo (consulte Exemplo 1). A preparação foi administrada pela injeção na veia da cauda de 100 μl de solução em cada animal.

[172] Uma atividade de 120 kBq foi injetada em cada animal. Cinco animais foram usados por ponto de tempo. As autópsias foram realizadas após o deslocamento cervical em vários pontos de tempo após a injeção. O peso de cada amostra de tecido foi determinado, e 111In foi medido por um detector gama calibrado (detector autogama Cobra II, Packard Instrument Company, Meriden, CT, EUA). As amostras dos injetados foram usadas como referências nos procedimentos de medição.

[173] A absorção de 111In-HH1 24 horas após a injeção nos camundongos com xenoenxertos de Daudi e a biodistribuição em tecidos normais são apresentadas na Figura 5. O anticorpo radioidentificado teve uma biodistribuição e alvejamento de tumor relevantes. O conjugado quelante 111In-HH1 mostra boa estabilidade in vivo.

[174] Exemplo 6 - Comparação de HH1 com três outros anticorpos anti-CD37

[175] Experimento I: Capacidade de bloqueamento de antígeno de anticorpos anti-CD37 contra HH1 radioidentificado Para testar se a interação de antígeno HH1 pode ser bloqueada por outros anticorpos anti-CD37, as células de Daudi foram bloqueadas por pré-incubação com anticorpos HH1, O.N.108, IPO-24 ou 6D263. As células de Daudi (2 milhões/ml) foram incubadas por 15 minutos com anticorpos HH1, O.N.108, IPO-24 ou 6D263 (20 μg/ml) e adicionadas com anticorpo HH1 identificado com 125I incubadas por 1 hora.

[176] Então, as células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes e as atividades em sobrenadantes e péletes celulares foram contadas com o uso de um contador de raios X/gama. Em comparação com as células bloqueadas HH1, a fração ligada de HH1 identificado com 125I foi 48%, 44% e 51% maior para células bloqueadas O.N.108, IPO-24 ou 6D263, respectivamente.

[177] Dessa forma, a ligação de antígeno de 125I-HH1 foi mais bem bloqueada com HH1 do que com os três outros anticorpos, sugerindo algumas diferenças na interação de antígeno. Em conclusão, HH1 teve propriedades de ligação de antígeno diferentes significativas em comparação com um painel de três outros anticorpos monoclonais anti-CD37.

[178] Experimento II: Ligação de anticorpo para amostras de tecido de linfoma embutidas em parafina

[179] Para comparar a capacidade de HH1 e três anticorpos CD37 comercialmente disponíveis de se ligar a amostras de linfoma fixadas, as biópsias de pacientes com linfoma foram fixadas em formalina, embutidas em parafina e cortadas em pedações de 10 μm que foram montados sobre lentes objetivas. As amostras foram identificadas com os anticorpos HH1, IPO.24, ON.108 e 6D263 e o grau de identificação foi detectado com o uso de anticorpo policlonal anticamundongo de coelho e manchamento de peroxidase.

[180] Os anticorpos IPO.24 e ON.108 resultaram na identificação mais forte das amostras de linfoma. O anticorpo 6D263 identificou a amostra de modo um pouco mais fraco. A identificação do anticorpo HH1 das seções foi insignificante.

[181] Portanto, pode-se concluir, já que o HH1 não se ligou enquanto três outros anticorpos antiCD37 estavam ligando, que HH1 tem uma interação de antígeno significantemente diferente.

[182] Experimento III: Citometria de fluxo dos anticorpos HH1, IPO.24, ON.108 e 6D263

[183] Para investigar as diferenças na expressão de antígeno detectadas pelos diferentes anticorpos CD37 vs. as Daudi HH1, células foram lavadas duas vezes com meio RPMI 1640 com 5% de soro fetal de bezerro e identificadas com 10 μg/ml dos anticorpos primários HH1, IPO.24, ON.108 e 6D363 por 0,5 hora em 0,2 ml de meio com 10% de FCS em gelo.

[184] Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes com PBS com 0,25% de FCS e identificadas com IgG Fab'2 anticamundongo de coelho policlonal identificado com FITC (diluído em 1:20) (Figura 6) por 0,5 hora em gelo. A fluorescência da identificação FITC foi detectada ao excitar com um laser de 488 nm em um citômetro de fluxo.

[185] As células mortas e os dupletos foram removidos com o uso de difusão direta, difusão lateral e sinais de iodeto de propídio. Não houve variação significativa dentre os diferentes histogramas de FITC dos vários anticorpos CD37 (Figure 6).

[186] Concluindo, HH1 e os outros três anticorpos antiCD37 IPO.24, ON.108 e 6D363, produzem histogramas de citometria de fluxo.

[187] Experimento IV: A fração de ligação para HH1 e três anticorpos antiCD37 comercialmente disponíveis.

[188] Para comparar a fração de ligação de HH1 com os anticorpos O.N.108, IPO-24 ou 6D263 (Santa Cruz Biotechnology) com o uso de células Daudi. As suspensões de célula, representando um grande excesso de antígeno, que consistem em 60 milhões de células Daudi em 0,2 ml de meio RPMI 1640 com 5% de soro fetal de bezerro, foram bloqueadas por 15 minutos com os anticorpos HH1, O.N.108, IPO-24 ou 6D263 (500 μg/ml) para responder pela ligação não específica do anticorpo. Outros paralelos foram desbloqueados.

[189] Subsequentemente, HH1 identificado por 125I, O.N.108, IPO-24 ou o anticorpo 6D263 (5 a 10 ng/ml) foi acrescentado e as células foram incubadas por 2 horas a 4°C com agitação leve. Depois disso, as células foram centrifugadas e lavadas 2 vezes com PBS com 1% de FCS. Os péletes de célula foram transferidas para limpar tubos e contadas com o uso de um contador gama.

[190] A fração de ligação foi determinada como a diferença na atividade para frascos não bloqueados e bloqueados vs. a atividade adicionada. O HH1 exibiu uma fração de ligação muito mais alta, se comparado com outros anticorpos CD37 (Tabela 5). Concluindo, HH1 mostrou uma imunorreatividade muito mais alta contra células vivas, se comparado a IPO.24, ON.108 e 6D363 quanto os anticorpos foram radioidentificados de maneira similar. Esse resultado indica que HH1 tem interação de antígeno diferente dos outros três anticorpos.

[191] Exemplo 7 - DNA e a sequência de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada e inferiores

[192] O gene e a sequência de proteína das regiões variáveis do anticorpo HH1 antiCD37 é conforme segue:

[193] A sequência de gene de VH nCD37 corresponde à SEQ ID NO: 1 e a sequência de proteína de VH nCD37 corresponde à SEQ ID NO: 2.

[194] VH ¤ CD37
gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggta
E I Q L Q Q S G P E L V K P G A S V K V
tcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagc
S C K A S G Y S F T D Y N M Y W V K Q S
catggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctac
H G K S L E W I G Y I D P Y N G D T T Y
aaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttc
N Q K F K G K A T L T V D K S S S T A F
atccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcccct
I H L N S L T S E D S A V Y Y C A R S P
tatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
Y G H Y A M D Y W G Q G T S V T V S S

[195] A sequência de gene de VL nCD37 corresponde à SEQ ID NO:3 e a sequência de proteína VL nCD37 corresponde à SEQ ID NO: 4.

[196] VL ¤CD37
gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagc
D I V M T Q S H K L L S T S V G D R V S
atcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaaca gaaacca
I T C K A S Q D V S T A V D W Y Q Q K P
ggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagt ccctgat
R F T G S G S G T D Y T L T I S S M Q A
gaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgtt cggctcg
E D L A L Y Y C R Q H Y S T P F T F G S
gggacaaagttggaaataaaa
G T K L E I K

[197] A sequência de aminoácidos é significativamente diferente da sequência e aminoácidos do anticorpo de ligação A0 CD37 (Heider et al., 2009). A sobreposição entre a cadeia leve variável de HH1 e A0 é de 56%, enquanto a sobreposição entre a cadeia pesada variável é de 82%.

[198] Exemplo 8 - Ligação de HH1 radioidentificado em células saturadas com rituximad de anticorpo CD20.

ANTECEDENTES

[199] Paciente s de linfoma não Hodgkin frequentemente recebem rituximab como uma terapia padrão. Seria vantajoso se o HH1 radioidentificado pudesse ser usado em pacientes mesmo se eles estivessem passando por terapia com rituximab. Células de linfoma Daudi, que expressam ambos os antígenos CD20 e CD37, foram usadas como modelo.

MÉTODOS

[200] Células de linfoma Daudi (3.3 milhões em 0,5 ml) foram ou pré e cotratadas com quantidades excessivas (100 μg/ml de rituximab) por cinco minutos e, depois disso, acrescentou-se 1 μg de HH1 identificadas com 125I ou receberam HH1 identificado com 125I sem pré-tratamento com rituximab. Para determinar a ligação não específica de 125I-HH1, a mesma configuração que acima, mas com o pré-tratamento com HH1 não identificado (10 μg/ml) foi usada. As células foram incubadas por duas horas em PBS à temperatura ambiente e contadas em uma bancada gama, lavadas três vezes em 1 ml de PBS, seguido por centrifugação, e, finalmente, recontadas para radioatividade de ligação de célula.

RESULTADOS

[201] Com pré-tratamento/cotratamento de rituximab, 26,0% (ligação total, 27,4% - ligação não específica, 1,4%) do 125I- HH1 adicionado se ligou especificamente às células.

[202] Sem o pré-tratamento/cotratamento de rituximab, 25,5% (26,9 a 1,4) se ligou especificamente (todos os números representam a média de três paralelos). Ou seja, não houve diferença significativa na ligação de 125I-HH1 devido à presença de rituximab.

CONCLUSÃO

[203] O pré e cotratamento com quantidades excessivas de rituximab não alterou a capacidade de ligação da célula de HH1 radioidentificado e, portanto, não bloqueou o acesso ao antígeno CD37.

[204] Isso indica que a radioimunoterapia com HH1 radioidentificado pode ser adequada em pacientes subsequentemente a ou durante a imunoterapua com anticorpo antiCD20, assim como em pacientes não tratados com rituximab.

[205] Exemplo 9 - Tratamento de camundongos SCID inoculados de maneira intravenosa com células de linfoma Daudi com o uso de 177Lu-HH1.

ANTECEDENTES

[206] O tratamento de pacientes de linfoma com radioimunoterapia direcionada de CD20 atual pode ser problemático em pacientes já tratados com rituximab devido à variação antigênica e possível bloqueio de antígeno CD20. Portanto, a radioimunoterapia que alveja outros antígenos pode ser mais eficaz. Por injeção intravenosa de células de linfoma humano em camundongos com deficiência imunológica combinada grave (SCID) faz-se um modelo de tumor intravenoso. Quando os camundongos com SCID forem inoculados de maneira intravenosa com células de linfoma Daudi, desenvolverão paralisia das patas traseiras devido ao crescimento das células de tumor Daudi.

Experimental

[207] Injetou-se de maneira intravenosa em camundongos com SCID 10 milhões de células Daudi uma semana antes da administração de 50 ou 100 MBq/kg de 177Lu-HH1, 50 μg de HH1,50 μg de rituximab ou NaCl. Os camundongos foram monitorados por paralisia das patas traseiras e perda de peso corporal, assim como contagem de leucócitos a cada segunda semana. A descontinuação de sobrevivência livre de sintomas foi usada como um ponto final. Para preparar o anticorpo radioidentificado, HH1 foi primeiramente identificado com p- SCN-Bn-DOTA e purificado. Após a troca de tampão, 177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, EUA) foi acrescentado a DOTA-HH1, e agitado por 40 minutos a 40°C. A atividade específica foi aproximadamente de 3.200 MBq/mkg para o produto final. Cada preparação foi dissolvida em solução salina isotônica para um volume de injeção total de 100 μl por animal.

Resultados

[208] A sobrevivência livre de sintomas média foi de 26 dias (na faixa de 21 a 33) para solução salina, 40 dias (a faixa de 23 a 44) para HH1 e 40 dias (na faixa de 33 a 44) para rituximab (Figura 8). Para 50 kBq/kg de 177Lu-HH1, 80% dos animais estavam vivos após 79 dias. Dois dos camundongos no grupo 100 kBq/g morreram antes de qualquer um dos animais dos grupos de solução salina, e a contagem de célula sanguínea indicou radiotoxicidade. um terceiro animal no grupo 100 kBq/g morreu no dia 49. Os outros animais (70%) ficaram vivos até o dia 79.

[209] A sobrevivência dos camundongos tratados com 177Lu-HH1 foi significativamente mais alta que a sobrevivência dos camundongos tratados com NaCl, HH1 ou Rituximab (p<0,005, teste de classificação de log de Mann Whitney).

CONCLUSÃO

[210] Os dados mostram que os grupos que receberam 177Lu- HH1 em dosagens de 50 ou 100 kBq/g em peso corporal tinham uma sobrevivência consideravelmente melhor que os grupos que recebem solução salina ou imunoterapia ou com HH1 ou com rituximab. Os dados de toxicidade indicam que a atividade deveria ser mantida abaixo de 100 kBq/g em peso corporal. Esses dados indicam que 177Lu-HH1 tem propriedades relevantes para a radioimunoterapia in vivo.

[211] Exemplo 10 - Biodistribuição de 177Lu-HH1 em camundongos nus com CD37 que expressa xenógrafos de tumor.

ANTECEDENTES

[212] O anticorpo HH1 identificado com Lutetium-177 foi avaliado para destruição de tecido in vivo e alvejamento tumoral.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

[213] Identificação de anticorpos com radionuclídeos

[214] O anticorpo foi primeiramente identificado com o quelante p-SCN-Bn-DOTA. DOTA foi dissolvido em 0,05M de HCl, acrescentado ao anticorpo em uma razão de 5:1 e teve o pH ajustado para 8 a 9 por lavagem com tampão de carbonato com o uso de filtros de centrifugação Amicon (Millipore, EUA) com um corte de peso molecular de 30 kDa.

[215] O pH foi, então, verificado novamente e, se necessário, ajustado. A solução foi agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente, e, então, a reação foi terminada pela adição de 50 μl de solução de glicina 200 mM (por mg de anticorpo). Para remover o quelante livre, o anticorpo conjugado foi lavado de 4 a 5 vezes com PBS (PAA) (com o uso de Amicon e centrifugação), e, então, ajustados ao pH 5 pela lavagem com acetato de amônio. 177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, EUA) foi, então, combinado com 0,5 mg de DOTA-HH1 em um tubo de polipropileno de 2 ml (Eppendorf, Alemanha), e agitado por uma hora a 40°C. Atividades específicas eram tipicamente 25 a 120 MBq/kg para conjugados de 177Lu.

IMUNORREATIVIDADE

[216] A qualidade dos radioimunoconjugados foi medida com o uso de células de linfoma e um método Lindmo modificado. As concentrações de célula de até 108 células por ml foram usadas. Os conjugados uados nos experimentos tinham imunorreatividade acima de 50%.

BIODISTRIBUIÇÃO DE RADIOIMUNOCONJUGADOS

[217] As biodistribuições de 177Lu-HH1 foram determinadas em camundongos nus BALB/c machos (nu/nu) implantados com 111 mm de xenoenxertos de tumor Daudi três semanas anteriormente. As preparações foram administradas por injeção na veia da cauda de 100 μl de solução em cada animal. Uma atividade média de 500 kBq por camundongo para 177Lu-HH1. Quatro a cinco animais foram usados por ponto no tempo. As autópsias foram realizadas após o deslocamento cervical em vários pontos no tempo após a injeção. O peso de cada amostra de tecido foi determinado e 177Lu foi medido por um detector gama calibrado (auto-gama detector Cobra II, Packard Instrument Company, Meriden, CT, EUA). As amostras dos injetados foram usadas como referências nos procedimentos de medição.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[218] A absorção e retenção de HH1 identificado por 177Lu e em tecidos normais de camundongos fêmeas BALB/c-nu (nu/nu) com xenoenxertos Daudi são apresentados na Figura 7. Não houve sinais de redistribuição de nuclídeos de/para quaisquer órgãos após a absorção inicial de radioimunoconjugados, que indicam que os radioimunoconjugados estavam estáveis.

[219] A injeção de 177Lu-HH1 em camundongos nus com tumor mostrou uma baixa absorção no osso. 177Lu livre é conhecido por acumular no osso, de modo que esse resultado indique que o radioimunoconjugado estava estável in vivo. A absorção nos tumores foi significativamente mais alta que em outros órgãos em pontos no tempo posteriores.

[220] Isso indica que 177Lu tem uma meia vida relevante para radioimunoterapia com o uso do anticorpo HH1.

[221] Os dados de biodistribuição de 177Lu-HH1 mostram uma absorção e eliminação e retenção de tecido normal relevante na expressão de xenógrafos de tumor que expressa CD37.

[222] O anticorpo HH1 parece ser bem adequado para a radioimunoterapia. O conjugado 177Lu-HH1 parece particularmente estável, já que razões favoráveis de tumor para tecido normal foram obtidas antes de uma fração maior do radionuclídeo ser deteriorada.

TABELAS

[223] Tabela 1

[224] Imunorreatividade e atividade específica para os radioimunoconjugados.

[225] 1Média ± SD (faixa) Tabela 2

[226] Número médio de antígenos (Bmáx) em células Raji, Rael e Daudi, a constante de dissociação de equilíbrio(kd) e a constante de taxa de associação (ka) para os anticorpos rituximab e HH1.

[232] Tabela 3

[233] Número de átomos 177Lu ligados por célula Daudi após 2 horas de incubação.

[234] (aAs diferentes contagens para as amostras de controle são indicativas da variação na radiação de fundo na bancada).

[235] Tabela 4

[236] Número de átomos 177Lu ligados por célula Daudi após 18 horas de incubação.

[237] Tabela 5

[238] Fração de ligação de quatro anticorpos antiCD37.

Referências

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Claims

Radioimunoconjugado que se liga a CD37 humano, caracterizado pelo fato de compreender
- a) anticorpo monoclonal murino HH1,
- b) um ligante quelante, e
- c) um radionuclídeo selecionado a partir do grupo que consiste em 177Lu, 225Ac, 212Pb, 227Th e 90Y.
Radioimunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o radionuclídeo é 177Lu.
Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um radioimunoconjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de compreender, ainda, um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados.
Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais alvejam CD20.
Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de ser para tratar células malignas do tipo célula B que expressam o antígeno CD37.
Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento do linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica.
Kit para a produção do radioimunoconjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender dois ou mais frascos, em que um frasco contém um conjugado que compreende um quelante ligado a um anticorpo monoclonal murino HH1; e um segundo frasco contém um radionuclídeo.
Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o conteúdo de um ou diversos dos frascos está liofilizado ou em uma solução.