CN114081969A - 标记的小分子抗体、及其标记方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了标记的小分子抗体、及其标记方法和应用。此标记方法包含以下步骤：将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体；以及将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应；其中，所述小分子抗体为96ScFv。本发明以氨基酸类化合物作为抗体保护剂，使用放射性金属核素对小分子进行标记，实现了小分子抗体在25‑40oC下快速标记并能够保持高活性和高标记率。采用本发明方法标记得到的小分子抗体具有标记率高、稳定性好、较完整地保留了抗体标记前的生物活性特点。

Description

标记的小分子抗体、及其标记方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及标记的小分子抗体、及其标记方法和应用。
背景技术
抗体-放射性核素标记药物是一类将抗体对肿瘤细胞膜上特定抗原的高度专一性和高亲和力特性与放射性核素对肿瘤的高杀伤力结合，克服核素无靶向杀伤肿瘤细胞的缺陷，为肿瘤患者提供个性化的精准诊断和治疗。这类药物在肿瘤的体内诊断与治疗领域具有极其广泛的应用价值，是生物医药与核医药的学科交叉产生的新一代放免靶向药物。抗体放射性核素治疗药物逐步成为肿瘤治疗的最后选择。目前全球放射性靶向诊疗药物处于行业的起步阶段，竞争日趋激烈。我国的放射性治疗药物目前主要依赖进口，在研项目也集中在几个国外药物的仿制药，自主创新药物迫在眉睫。
与大分子单克隆抗体相比，小分子抗体或称抗体片段具有大分子抗体同等效力识别相关靶抗原，但又具有大分子抗体所不具有的如下优势：1）容易穿过血管壁，能在体内快速富集到肿瘤细胞表面，特别适合作为核素药物的靶向载体，实现核素药物的快速、精准成像和精准治疗。2）小分子抗体半衰期短，全身清除快，能减少核素对正常细胞的杀伤副作用。3）小分子抗体人体免疫源性反应低、毒性小、不经过肝脾等组织代谢，因此小分子抗体作为同位素靶向药物载体安全性更高。4）小分子抗体分子可以根据不同核素的半衰期容易进行抗体结构改造或修饰，以满足临床诊疗一体化的需要，形成新一代核素靶向药物的产业链。5）小分子抗体生产成本远低于真核细胞的全抗生产成本，为新药的临床推广和民众福祉提供可能。
目前核素标记抗体技术分为金属核素标记和非金属核素标记，其中金属放射性金属核素标记抗体是放射性标记药物发展的趋势，因为：1）放射性金属核素通过双功能偶联剂连接在单抗上，具有反应迅速、标记率高和稳定性好的特点；2）可方便通过更换诊断和治疗金属核素实现诊疗一体化；3）放射性金属核素治疗包括β核素和α核素，可以进行梯度治疗。目前临床上部分β核素治疗耐受的肿瘤患者用α核素治疗可以达到更好的疗效。
目前抗体与放射性金属核素标记技术涉及使用到较高的温度、较酸性的缓冲液等不利于抗体稳定性的反应条件，对只有抗体可变区的小分子抗体-核素标记产品的核素标记率、活性和稳定性极不适用，易导致小分子抗体功能失活或产生多聚体或抗体断裂或标记率低等，给小分子抗体-核素药物带来有效性和安全性隐患，影响小分子抗体-核素药物的应用推广。因此放射性核素标记小分子抗体技术改进是目前小分子抗体药物的技术难点之一。
发明内容
为解决背景技术中的问题，本发明提供了标记的小分子抗体、及其标记方法和应用。本发明的标记方法能够显著提高放射性金属核素标记小分子抗体的标记率、产物活性及稳定性。
本发明使用的抗体为96ScFv，为识别广谱肿瘤标志物CEA靶标的小分子抗体，为中国专利CN112724255A公开的小分子抗体。
为达到上述目的，本发明采用的第一个技术方案为：
标记的小分子抗体，为放射性金属核素在抗体保护剂中标记小分子抗体96ScFv得到的组合物。
优选的，所述抗体保护剂为氨基酸类化合物，摩尔浓度为20-200mM；
更优选的，摩尔浓度为100mM。
优选的，所述氨基酸类化合物包含甘氨酸或精氨酸化合物；
更优选的，所述氨基酸类化合物为L-甘氨酸。
优选的，所述放射性金属核素包含但不限于111In、68Ga、90Y、177Lu、225Ac中任一种。
本发明采用的第二个技术方案为：
小分子抗体的标记方法，包含以下步骤：
将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体；以及
将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应；
其中，所述小分子抗体为96ScFv。
优选的，所述抗体保护剂为氨基酸类化合物，摩尔浓度为20-200mM；
更优选的，摩尔浓度为100mM。
优选的，所述氨基酸类化合物包含甘氨酸或精氨酸化合物；
更优选的，所述氨基酸类化合物为L-甘氨酸。
优选的，所述放射性金属核素包含但不限于111In、68Ga、90Y、177Lu、225Ac中任一种。
优选的，所述双功能偶联剂包含但不限于p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-PCTA、p-SCN-Bn-DOTA、DOTA-NHS、Maleimido-mono-amide-DTPA、Maleimido-mono-amide-DOTA、Maleimido-mono-amide-NOTA、Maleimido-mono-amide-PCTA中任一种。
优选的，所述将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体的具体方法包含： 取0.5-1.0mg小分子抗体溶于pH8.0-9.0的PBS溶液，使小分子抗体的质量体积浓度为1.0-1.5mg/ml；以及
向上述混合溶液中加入双功能偶联剂，25~40℃轻微振荡孵育2~4 h后，静置、离心；
其中，所述双功能偶联剂的物质的量为小分子抗体的物质的量的20-50倍。
优选的，将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应的具体方法包含：
将中间体与抗体保护剂、放射性核素混合后置于pH 4.5~5.5环境中，在25-40oC反应15-60 min。
本发明采用的第三个技术方案为：
一种标记的小分子抗体，所述标记的小分子抗体为由第一个技术方案的标记方法得到的小分子抗体-放射性金属核素标记分子。
本发明采用的第四个技术方案为：
第二个技术方案的标记的小分子抗体在制备SPECT/CT或PET/CT分子诊断显像剂中的应用。
第二个技术方案的标记的小分子抗体在制备治疗CEA抗原相关肿瘤药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明以氨基酸类化合物作为抗体保护剂，使用放射性金属核素对小分子进行标记，实现了小分子抗体在25-40oC下快速标记并能够保持高活性和高标记率。
本发明提供的标记的小分子抗体具有标记率高、稳定性好、较完整地保留了抗体标记前的生物活性特点。
通过本发明标记得到的小分子抗体，当标记的放射性金属核素为111In、68Ga、时，可作为SPECT/CT或PET/CT分子在制备CEA抗原相关肿瘤诊断显像剂中应用；当标记的放射性金属为90Y、177Lu、225Ac时，可在制备治疗CEA抗原相关肿瘤的治疗药物中应用，且均能取得良好的效果。
附图说明
图1为实施例1中偶联剂结合抗体前后的CEX-HPLC检测图谱；
图2 为实施例1中68Ga-PCTA-96ScFv空白组TLC图谱及峰面积积分数据；
图3为实施例1中68Ga-PCTA-96ScFv在20mM L-甘氨酸反应液中测定TLC图谱及峰面积积分数据；
图4为实施例1中68Ga-PCTA-96ScFv在100mM L-甘氨酸反应液中测定TLC图谱及峰面积积分数据；
图5为实施例1中68Ga-PCTA-96ScFv在200mM L-甘氨酸反应液中测定TLC图谱及峰面积积分数据；
图6为实施例1中空白组和实验组样品放化纯随放置时间变化曲线图；
图7为实施例1中表1.2中四组68Ga-PCTA-96ScFv标记后的ELISA活性分析图；
图8为实施例1中空白组（68Ga-PCTA-96ScFv）SEC-HPLC图谱；
图9为实施例1中实验组（68Ga-PCTA-96ScFv+20mM L-甘氨酸）SEC-HPLC图谱；
图10为实施例1中实验组（68Ga-PCTA-96ScFv+100mM L-甘氨酸）SEC-HPLC图谱；
图11为实施例1中实验组（68Ga-PCTA-96ScFv+200mM L-甘氨酸）SEC-HPLC图谱；
图12为实施例1中实验组（右）和对照组（左）样品注射1h，动物矢状面；
图13为实施例2中111In-DOTA-NHS-96ScFv的TLC图谱及峰面积积分数据；
图14为实施例2中111In-DOTA-NCS-96ScFv的TLC图谱及峰面积积分数据；
图15为实施例2中111In-DOTA-NHS-96ScFv在血清中放置24h的TLC图谱及峰面积积分数据；
图16为实施例2中111In-DOTA-NCS-96ScFv在血清中放置24h的TLC图谱及峰面积积分数据；
图17为实施例2中111In-DOTA-NHS-96ScFv在血清中放置48h的TLC图谱及峰面积积分数据；
图18为实施例2中111In-DOTA-NCS-96ScFv在血清中放置48h的TLC图谱及峰面积积分数据；
图19为实施例2中111In-DOTA-NHS-96ScFv在血清中放置72h的TLC图谱及峰面积积分数据；
图20为实施例2中111In-DOTA-NCS-96ScFv在血清中放置72h的TLC图谱及峰面积积分数据；
图21为实施例2中111In-DOTA-NHS-96ScFv的ELISA活性分析图；
图22为实施例2中111In-DOTA-NCS-96ScFv的ELISA活性分析图；
图23为实施例2中111In-DOTA-NHS-96ScFv注射荷结肠癌裸鼠3h后的SPECT/CT图；
图24为实施例3中90Y-DTPA-96ScFv和90Y-DOTA-96ScFv标记前后ELISA活性分析图；
图25为实施例3中90Y-DTPA-96ScFv标记率测定TLC图谱；
图26为实施例3中90Y-DOTA-96ScFv标记率测定TLC图谱；
图27为实施例3中90Y-DTPA-96ScFv在动物体内抑制肿瘤细胞生长结果图；
图28为实施例4中177Lu-DTPA-96ScFv标记率测定TLC图谱；
图29为实施例4中177Lu-DOTA-96ScFv标记率测定TLC图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明第一实施方式提供了标记的小分子抗体，为放射性金属核素在抗体保护剂中标记小分子抗体96ScFv得到的组合物。
需要说明的是，本发明的所有实施方式中使用的小分子抗体96ScFv，为识别广谱肿瘤标志物CEA靶标的小分子抗体，是中国专利CN112724255A公开的小分子抗体。
在一些具体实施方式中，所述抗体保护剂为氨基酸类化合物，摩尔浓度为20-200mM；优选的，摩尔浓度为100mM。
本发明提供的标记的小分子抗体是在现有的核素标记小分子抗体的过程中，添加了抗体保护剂得到的，此抗体保护剂为氨基酸类化合物，可以调节该单抗在水溶液中分子电荷和疏水性，防止单抗形成多聚体，提高抗体在较高温度和偏酸条件下的稳定性，实现了小分子抗体在25-40oC下快速标记并实现高活性和高标记率。
在一些可选实施方式中，所述氨基酸类化合物包含甘氨酸或精氨酸化合物；在一些优选实施方式张中，所述氨基酸类化合物为L-甘氨酸。
本发明所使用的放射性金属核素为常用的显像用或治疗用金属核素，包含但不限于111In、68Ga、90Y、177Lu、225Ac中任一种。其中，正电子核素68Ga具有不依赖于加速器、易获得和推广的优势，是未来肿瘤精准诊断的主流方向，同时能与治疗核素90Y/177Lu/225Ac等配合使用达到诊疗一体化的效果；单光子核素111In使用SPET显像，可以更方便在没有装备PET/CT的基层医院进行推广，比较适合我国当前的国情，能使更多患者受益；90Y和177Lu是放射性治疗药物中广泛应用的β治疗金属核素，其具有较长的半衰期，并且能量适中，能够持续照射肿瘤细胞，是目前优选的治疗型核素。根据核素的不同特点及临床上的应用需求可以通过工程技术调整单抗的半衰期达到更好的治疗效果；225Ac是一种性质优异的α治疗金属核素，与β核素相比具有显著更高的线性能量转移值，能够诱发DNA双链断裂，对肿瘤达到更高的杀伤作用，更短的穿透半径带来更高的安全性，是核素药物治疗未来的发展方向。
本发明第二实施方式提供了小分子抗体的标记方法，包含以下步骤：
将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体；以及
将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应；
其中，所述小分子抗体为96ScFv。
本发明所述抗体保护剂为氨基酸类化合物，其摩尔浓度为20-200mM；优选为100mM。
本发明在现有的核素标记小分子抗体的过程中，添加了氨基酸类化合物作为抗体保护剂，调节该单抗在水溶液中分子电荷和疏水性，防止单抗形成多聚体，提高抗体在较高温度和偏酸条件下的稳定性，实现了小分子抗体在25-40oC下快速标记并实现高活性和高标记率。采用优化后的核素标记技术，所获得的标记产物具有标记率高、稳定性好、较完整地保留了抗体标记前的生物活性特点。
在一些可选实施方式中，所述氨基酸类化合物包含甘氨酸或精氨酸化合物。作为一个最优实施方式，所述氨基酸类化合物为L-甘氨酸。
需要说明的是，本发明所使用的放射性金属核素为常用的显像用或治疗用金属核素，包含但不限于111In、68Ga、90Y、177Lu、225Ac中任一种。
本发明实施方式中所使用的双功能偶联剂均为本领域常用的双功能偶联剂，包含但不限于p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-PCTA、p-SCN-Bn-DOTA、DOTA-NHS、Maleimido-mono-amide-DTPA、Maleimido-mono-amide-DOTA、Maleimido-mono-amide-NOTA、Maleimido-mono-amide-PCTA中任一种。
在一些具体实施方式中，所述将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体的具体方法包含：取0.5-1.0mg小分子抗体溶于pH8.0-9.0的PBS溶液，使小分子抗体的质量体积浓度为1.0-1.5 mg/ml；以及向上述混合溶液中加入双功能偶联剂，25~40℃轻微振荡孵育2~4 h后，静置、离心；其中，所述双功能偶联剂的物质的量为小分子抗体的物质的量的20-50倍。
需要说明的是，小分子抗体与双功能偶联剂反应的方法为本领域常用的方法，上述所列举的方法仅为一些比较优选的方式。
在一些具体实施方式中，将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应的具体方法包含：将中间体与抗体保护剂、放射性核素混合后置于pH 4.5~5.5环境中，在25-40oC反应15-60 min。
本发明第三实施方式提供了一种标记的小分子抗体，所述标记的小分子抗体为由第一个技术方案的标记方法得到的小分子抗体-放射性金属核素标记分子。例如，本发明实施方式得到的标记的小分子抗体包括111In-DOTA-NHS-96ScFv、111In-DOTA-NCS-96ScFv、68Ga-PCTA-96ScFv、90Y-DTPA-96ScFv、90Y-DOTA-96ScFv、177Lu-DTPA-96ScFv、177Lu-DOTA-96ScFv、225Ac-DOTA-96ScFv等产品。
本发明第四实施方式提供了标记的小分子抗体的应用。当标记的金属核素为111In、68Ga时，标记的小分子抗体在制备CEA抗原相关肿瘤SPECT/CT或PET/CT分子诊断显像剂中的应用。当标记的金属核素为90Y、177Lu、225Ac时，标记的小分子抗体在制备治疗CEA抗原相关肿瘤药物中的应用。例如，111In-DOTA-NHS-96ScFv可用于SPECT/CT显像，68Ga-PCTA-96ScFv可用于PET/CT显像，对于癌胚抗原CEA高表达的多种肿瘤进行体内诊断，而90Y-DTPA/DOTA-96ScFv、177Lu-DTPA/DOTA-96ScFv、225Ac- DOTA-96ScFv产品可用于CEA抗原高表达的多种肿瘤治疗，实现对相关肿瘤患者诊疗一体化的个性化精准治疗。
为更好地理解本发明提供的技术方案，下述以多个具体实例分别说明应用本发明上述实施方式提供的小分子抗体的标记方法、应用，及性能测试。
本发明具体实施方式中测定标记率、产品活性和放射化学纯度的方法为：取标记后的待测样品溶液2-5μl，点样于硅胶纸带并在展开剂中展开，利用放射性薄层层析(radio-TLC)测定标记率或放射化学纯度。应用抗原-抗体间接ELISA方法检测标记后产品的生物活性。应用SEC-HPLC方法检测样品的纯度。
本发明具体实施方式中对标记的小分子抗体进行诊断和治疗应用的方法为：选取癌胚抗原高表达的结直肠肿瘤模型作为评价指标，标记诊断型核素的单抗例如111In-DOTA-NHS-96ScFv、68Ga-PCTA-96ScFv，通过尾静脉给药荷瘤小鼠，进行SPECT或PET显像，观察其体内分布和靶向性。标记治疗型核素的单抗例如90Y- DOTA-96ScFv、177Lu- DOTA-96ScFv、225Ac- DOTA-96ScFv，通过尾静脉给药荷瘤小鼠，观察肿瘤尺寸变化。
实施例1 68Ga-PCTA-96ScFv的制备及性能测定
1.1 68Ga-PCTA-96ScFv制备
取400 μl 1.5 mg/ml 96ScFv抗体的10 mM PBS溶液（pH 8.0）至1ml EP管中，加入20 μlp-SCN-Bn-PCTA溶液使双功能偶联剂的物质的量为抗体的20倍，于涡旋振荡器上震荡30s，25oC反应4h，4oC反应过夜。反应结束后，在低温高速离心机上用10k超滤管离心（12000 rpm 15min）除去残留的双功能偶联剂，室温3300rpm，5min离心反甩得到功能化的抗体：PCTA-96ScFv。
空白组：将得到的功能化抗体PCTA-96ScFv用pH4.5醋酸钠缓冲液稀释至0.5ml，浓度约为0.8 mg/ml，加入0.2 ml（约37MBq）的68GaCl3，振荡摇匀，25oC静置反应30min。反应完成后取10μl样品与10μl EDTA饱和溶液进行混合，取样5μl于生理盐水展开剂中展开测定标记率；8h后测定SEC-HPLC和ELISA活性。
实验组：将得到的功能化抗体PCTA-96ScFv用pH4.5醋酸钠缓冲液稀释至0.5ml，度约为0.8 mg/ml，分别加入1M L-甘氨酸储备液11μl、55μl、110μl，使L-甘氨酸浓度分别为20mM，100mM，200mM。然后分别加入0.2ml（约37MBq）的68GaCl3，振荡摇匀，25oC静置下反应30min，得到68Ga-PCTA-96ScFv。
取10μl 68Ga-PCTA-96ScFv与10μl EDTA饱和溶液进行混合，取混合样5μl点样值硅胶纸带在生理盐水展开剂中展开，采用放射性薄层层析测定抗体-核素标记产品的标记率；8h后SEC-HPLC方法检测样品纯度、ELISA方法检测样品的生物活性。
1.2 功能化PCTA-96ScFv产物的CEX-HPLC检测
采用CEX-HPLC方法检查抗体与偶联剂结合情况：对1.1中96ScFv单抗（A1）和功能化抗体PCTA-96ScFv（A2）样品分别采用安捷伦1260Infinity型高效液相色谱仪分析。采用Proteomix SCX-NP5( 5µm, 4.6×250mm)色谱柱，以20mM PB(pH 6.0)为流动相A，以20mMPB+1M NaCl(pH 6.0)为流动相B，进样50μl，0.8ml/min流速进行洗脱，在280nm波长处室温检测。
图1为偶联剂标记前后抗体（A1：96ScFv，A2：PCTA-96ScFv）的CEX-HPLC检测图谱，从图1可看出，采用本发明实施例1的双功能试剂结合方法，结合前后96ScFv单抗（A1）PCTA-96ScFv（A2）样品的主峰明显差异，该结果表明偶联剂成功修饰96ScFv单抗。
1.3 68Ga-PCTA-96ScFv标记率检测
取10μl 68Ga-PCTA-96ScFv与10μl EDTA饱和溶液进行混合，取混合样5μl点样硅胶纸带在生理盐水展开剂中展开，采用放射性薄层层析测定抗体-核素标记产品的标记率，取前端主峰峰面积占总面积的百分比为标记率。结果如图2-5所示。
图2为1.1中空白组68Ga-PCTA-96ScFv的TLC图谱及峰面积积分数据；图3为1.1中实验组68Ga-PCTA-96ScFv在20mM L-甘氨酸反应液中测定的TLC图谱及峰面积积分数据；图4为1.1中实验组68Ga-PCTA-96ScFv在100mM L-甘氨酸反应液中测定的TLC图谱及峰面积积分数据；图5为1.1中实验组68Ga-PCTA-96ScFv在200mM L-甘氨酸反应液中测定的TLC图谱及峰面积积分数据。
从图2-图5可以看出：在68Ga标记96ScFv小分子单抗的反应中，图2显示空白组的标记率为78.80%，图3标记率为93.05%，图4标记率为98.72%，图5标记率为99.23%。实验证明在核素标记反应液中添加20-200mM的L-甘氨酸有利于增加小分子抗体的标记率。
1.4 68Ga-PCTA-96ScFv体外稳定性
取1.1实验组（68Ga-PCTA-96ScFv+100mM L-甘氨酸）标记溶液和空白组（68Ga-PCTA-96ScFv）标记溶液各0.2ml，分别加入1ml无支原体胎牛血清，振荡混匀后室温存放。在1h、2h、4h分别取样进行纸层析分析，方法同标记率检测方法：取10μl待测样品与10μl EDTA饱和溶液进行混合，取样5μl点样于硅胶纸带在生理盐水展开剂中展开，采用放射性薄层层析测定样品的放化纯。相应的图谱与峰面积占比表参考2.3中图15-20。本实施例最终结果如表1.1和图6所示。
表1.1 68Ga-PCTA-96ScFv的体外血清稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
从表1.1和图6实验结果中可以看出，在室温血清中放置4h后，100mM L-甘氨酸实验组放化纯下降速度低于空白组，100mM L-甘氨酸实验组稳定性优于空白组。说明L-甘氨酸的加入有利于提高终产品在血清中的稳定性能。
1.5 68Ga-PCTA-96ScFv单抗结合力
通过ELISA检测标记前后抗体96ScFv的生物学活性变化，ELISA检测方法参照中国专利CN112724255A。
实验结果如表1.2和图7，100mM L-甘氨酸组和200mM L-甘氨酸组标记完成后抗体活性最高，两者相差不大，优于20mM L-甘氨酸组。空白组未加甘氨酸在标记后抗体活性较低。说明甘氨酸的加入有利于抗体在标记反应后保持更高的活性。
表1.2 四组68Ga-PCTA-96ScFv标记后EC50数据
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
1.6 68Ga-PCTA-96ScFv组分变化
采用SEC-HPLC方法测量样品纯度，具体方法为：采用安捷伦1260Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪分析。采用摩尔Target-SEC150 7.8×300mm 5μm色谱柱，检测波长280nm，柱温30℃。样品进样50μl，以125mM PB+300mM NaCl为流动相，0.3ml/min流速检测，检测完成后对色谱峰进行积分处理。对空白组和实验组中三组甘氨酸样品（即68Ga-PCTA-96ScFv+20mM L-甘氨酸、68Ga-PCTA-96ScFv+100mM L-甘氨酸、68Ga-PCTA-96ScFv+200mM L-甘氨酸）进行纯度检查，结果如图8-11所示。从图中可以看出空白组产生明显的多聚体（峰位保留时间为21 min），在20mM 、100mM和200mM L-甘氨酸组中未见明显的多聚体产生。说明L-甘氨酸能减少多聚体杂质的产生。
1.7 68Ga-PCTA-96ScFv 动物体内分布
选取种植了人结直肠腺癌细胞（LS174T）的荷瘤小鼠（肿瘤大小为100~300mm3），对照组先注射100μl冷抗96ScFv（0.8mg/ml）封闭，冷抗注射1h后，尾静脉注射100μl（约100μCi）的68Ga-PCTA-96ScFv。实验组直接尾静脉注射100μl（约100μCi）的68Ga-PCTA-96ScFv。注射后1小时以后进行动态PET/CT扫描。microPET/CT成像结果如图12所示，左边为对照组图像，右边为实验组图像（小鼠图像右下角突出部分为接种肿瘤部位）。
通过图12可以看出：实验组68Ga-PCTA-96ScFv在肿瘤部位有明显摄取，而对照组（冷抗封闭）肿瘤无明显摄取。说明68Ga-PCTA-96ScFv对人结直肠腺癌细胞（LS174T）具有靶向性，有望开发成为结直肠癌的无创靶向诊断试剂。
实施例2 111In-DOTA-96ScFv的制备及性能测定
2.1 111In-DOTA-96ScFv的制备
取400 μl 1.5 mg/ml 96ScFv抗体的10 mM PBS溶液（pH 8.0）至1ml EP管中，分别加入20μl DOTA-NHS和p-SCN-Bn-DOTA（以下简称DOTA-NCS）溶液使双功能偶联剂的物质的量为抗体的20倍，于涡旋振荡器上震荡30s，40oC反应2h。反应结束后，在低温高速离心机上用10k超滤管离心（12000rpm ，15min）除去残留的双功能偶联剂，再3300rpm，5min反甩得到功能化的抗体DOTA-NHS-96ScFv和DOTA-NCS-96ScFv。
取400 μCi 111InCl3溶液，加入100 μl 1M pH 4.5的醋酸钠缓冲液， 55μl 1M甘L-氨酸，使L-甘氨酸浓度分别为100mM，于涡旋振荡器上震荡30s。分别加入100 μl 0.5 mg/mlDOTA-NHS-96ScFv或DOTA-NCS-96ScFv抗体，40oC反应30 min，获得目标产物111In-DOTA-96ScFv。
2.2 111In-DOTA-96ScFv标记率测定
以5mM DTPA作为纸层析的展开剂，取0.4min以前计数除以1min总计数得到产物标记率数据。结果如图13-14所示，图13为111In-DOTA-NHS-96ScFv的TLC图谱及峰面积积分数据，图14为111In-DOTA-NCS-96ScFv的TLC图谱及峰面积积分数据。
实验结果表明在5mM DTPA的展开体系中， 111In-DOTA-NHS-96ScFv与111In-DOTA-NCS-96ScFv的Rf值均在原点。111In-DOTA-NHS-96ScFv的标记率约为90%，111In-DOTA-NCS-96ScFv的标记率约为95%。
2.3 111In-DOTA-96ScFv体外稳定性
取2.1中111In-DOTA-NHS-96ScFv及111In-DOTA-NCS-96ScFv经PD 10柱纯化后的溶液各0.2ml，分别加入1ml无支原体胎牛血清，震荡混匀后，2组均室温存放。在24h、48h、72h将2组样品分别取样进行纸层析分析，取0.4min以前计数除以1.0min总计数得到放化纯数据。具体的TLC图谱及峰面积积分数据如图15-20、表2.1所示。
表2.1 111In-DOTA-96ScFv的体外稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
从图15-20、表2.1可以看出：在血清中放置72h，111In-DOTA-NHS-96ScFv仍能保持较好的稳定性，而111In-DOTA-NCS-96ScFv的稳定性就相对要差一些。说明不同的双功能偶联剂对标记物的稳定性有一定差异。
2.4 111In-DOTA-96ScFv单抗结合力
通过ELISA方法检测标记前后抗体96ScFv的生物学活性变化，ELISA检测方法参照中国专利CN112724255A。
111In-DOTA-NHS-96ScFv及111In-DOTA-NCS-96ScFv的结果分别如图21-22所示，标记后抗体的生物学活性均在95%以上，与96ScFv比较未发生明显变化。
2.5 111In-DOTA-NHS-96ScFv动物体内分布
选取种植了人结直肠腺癌细胞（LS174T）的荷瘤小鼠（肿瘤大小为100-200 mm3），尾静脉注射100μl（约100μCi）111In-DOTA-NHS-96ScFv，进行SPECT/CT融合显像。
结果如图23所示，111In-DOTA-NHS-96ScFv注射后3 h，放射性主要分布于肿瘤组织，其他器官均未见明显的放射性分布。111In-DOTA-NHS-96ScFv标记物进入裸鼠体内后代谢速度比较快，因为单链抗体的分子量较小，在小鼠体内可以快速的被清除。说明111In-DOTA-NHS-96ScFv有望开发成为CEA高表达肿瘤细胞例如结直肠癌肿瘤细胞的快速诊断试剂。
实施例3 90Y-DTPA-96ScFv和90Y-DOTA-96ScFv的制备及性能测定
3.1 DTPA-96ScFv和DOTA-96ScFv制备
取600 μl 浓度为1.5 mg/ml的96ScFv抗体的10mM PBS溶液（pH 8.0）于1.5ml EP管，加入20μl p-SCN-Bn-DTPA溶液(或p-SCN-Bn-DOTA溶液)使双功能偶联剂的物质的量约抗体20倍，涡旋振荡器上震荡30s，40oC反应2h，再放置冰箱4oC 过夜。反应结束后，在低温高速离心机上用10k超滤管12000rpm 15min离心多次除去多余的双功能偶联剂， 3300rpm，5min反甩得到功能化的抗体DTPA-96ScFv和DOTA-96ScFv。
3.2 90Y-DTPA-96ScFv和90Y-DOTA-96ScFv制备
取3.1中功能化抗体DTPA-96ScFv和DOTA-96ScFv各0.4 mg，分别用pH 5.5醋酸钠缓冲液稀释至0.5ml，加入55μl 1M L-甘氨酸，使L-甘氨酸浓度为100 mM，然后加入0.05ml（约74MBq，2mCi）的90YCl3，振荡摇匀，25oC下反应2小时，得到90Y-DTPA-96ScFv和90Y-DOTA-96ScFv。
反应完成后取3-5μl样品点样在10mM DTPA展开剂中展开测定标记率，ELISA检测抗体标记前后的生物学活性。
3.3 偶联后抗体结合力活性变化
通过ELISA检测抗体标记前后的生物学活性变化，ELISA检测方法参照中国专利CN112724255A。
实验结果如图24所示，表明在偶联前后，抗体的结合力活性无显著变化。
3.4 90Y-DTPA-96ScFv和90Y-DOTA-96ScFv标记率及纯化后放化纯测定
取3-5μl样品点样硅胶纸带在10mM DTPA展开剂中展开测定标记率。
检测结果如图25-26所示，表明90Y-DTPA-96ScFv标记率大于95%，90Y- DOTA-96ScFv标记率大于85%。
3.5 90Y-DTPA-96ScFv和90Y-DOTA-96ScFv体外稳定性
取3.1中90Y-DTPA- 96ScFv标记溶液和90Y-DOTA-96ScFv标记溶液各0.2ml，分别加入1ml无支原体胎牛血清，震荡混匀后，均室温存放。在1d、3d、5d、7d将2组样品分别取样进行纸层析分析。相应的图谱与峰面积占比表参考2.3中图15-20。最终结果如表3.1所示。
通过表3.1可看出：在血清中放置7d，90Y-DTPA/DOTA-96ScFv能保持较好的稳定性， 90Y-DOTA-96ScFv放化纯下降速率小于90Y-DTPA-96ScFv，90Y-DOTA-96ScFv的体外稳定性略优于90Y-DTPA-96ScFv。
表3.1 90Y-DTPA/DOTA-96ScFv的体外稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
3.6 90Y-DTPA-96ScFv肿瘤生长抑制
选取24只种植了结直肠腺癌细胞（LS174T）的荷瘤小鼠（肿瘤大小：100~200 mm3），分成4组，每组6只，其中A组经尾静脉注射1.6mCi 90Y-DTPA-96ScFv，B组经尾静脉注射0.8mCi 90Y-DTPA-96ScFv，C组经尾静脉注射150 μg 96ScFv-DTPA，D组经尾静脉注射100 μl生理盐水。给药后监测小鼠的肿瘤细胞生长情况。
结果如图27所示，表明注射90Y-DTPA-96ScFv后肿瘤细胞生长受抑制。给药量为1.6mCi时，对肿瘤的生长产生明显的抑制作用，在第10天观察到肿瘤的大小为生理盐水组的53%。
实施例4 177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv的制备及性能测定
4.1 177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv制备
本实施例使用的放射性金属核素为177Lu，抗体偶联修饰DTPA-96ScFv、DOTA-96ScFv的方法参照实施例3.1。
分别取0.4mg DTPA-96ScFv、DOTA-96ScFv用pH5.5醋酸钠缓冲液稀释至0.5ml，加入55μl 1ML-甘氨酸，使L-甘氨酸浓度分别为100mM，然后加入0.05ml（约37MBq）的177LuCl3，振荡摇匀，37oC下反应30min，得到177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv。
4.2 177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv标记率测定
取4.1中3-5μl样品点样硅胶纸带在10mM DTPA展开剂中展开测定标记率。
结果如图28-29所示，表明177Lu-DTPA-96ScFv标记率大于95%，177Lu-DOTA-96ScFv标记率大于95%。
4.3 177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv体外稳定性测定
取4.1中177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv标记溶液各0.2ml，分别加入1ml无支原体胎牛血清，震荡混匀后，2组均室温存放。在1d、3d、5d、7d将2组样品分别取样进行纸层析分析。相应的图谱与峰面积占比表参考2.3中图15-20。最终结果如表4.1所示。
从表4.1可看出：在血清中放置7d，177Lu-DTPA-96ScFv和177Lu-DOTA-96ScFv能保持较好的稳定性，放化纯大于85%。
表4.1 177Lu-DTPA/DOTA-96ScFv的体外稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
实施例5 225Ac-DOTA-96ScFv的制备及性能测定
5.1 225Ac-DOTA-96ScFv制备
本实施例使用的放射性金属核素为225Ac，抗体偶联修饰DOTA-96ScFv的方法参照实施例3.1。
取0.4mg DOTA-96ScFv用pH5.5醋酸钠缓冲液稀释至0.5ml，加入55μl 1M L-甘氨酸，使L-甘氨酸浓度分别为100mM，然后加入0.01ml（约18MBq）的225AcCl3，振荡摇匀，35oC下反应40 min，得到225Ac-DOTA-96ScFv。
5.2 225Ac-DOTA-96ScFv标记率
取3-5μl 5.1中样品点样硅胶纸带于0.1M柠檬酸钠溶液 pH 5.0展开剂中展开，展开后干燥1h后进行分析，分析方法：使用伽马能谱仪进行分析，将展开纸带剪成均等两段，分别测定225Ac子体221Fr 218 keV谱线的活度。标记化合物位于下半段，游离核素位于上半段，下半段计数除以总计数得反应标记率或纯化后产品的放化纯。标记率和纯化后放化纯测定结果如下表5.1，225Ac-DOTA-96ScFv标记率大于60%，PD-10柱纯化后放化纯大于95%。
表5.1 225Ac-DOTA-96ScFv标记率/纯化后放化纯测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

1.标记的小分子抗体，其特征在于，为放射性金属核素在抗体保护剂中标记小分子抗体96ScFv得到的组合物。
2.如权利要求1所述的标记的小分子抗体，其特征在于，所述抗体保护剂为氨基酸类化合物，摩尔浓度为20-200mM；
优选的，摩尔浓度为100mM。
3.如权利要求2所述的标记的小分子抗体，其特征在于，所述氨基酸类化合物包含甘氨酸或精氨酸化合物；
优选的，所述氨基酸类化合物为L-甘氨酸。
4.如权利要求1-3任一所述的标记的小分子抗体，其特征在于，所述放射性金属核素包含但不限于111In、68Ga、90Y、177Lu、225Ac中任一种。
5.小分子抗体的标记方法，其特征在于，包含以下步骤：
将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体；以及
将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应；
其中，所述小分子抗体为96ScFv。
6.如权利要求5所述的小分子抗体的标记方法，其特征在于，所述抗体保护剂为氨基酸类化合物，摩尔浓度为20-200mM；
优选的，摩尔浓度为100mM。
7.如权利要求6所述的小分子抗体的标记方法，其特征在于，所述氨基酸类化合物包含甘氨酸或精氨酸化合物；
优选的，所述氨基酸类化合物为L-甘氨酸。
8.如权利要求5所述的小分子抗体的标记方法，其特征在于，所述放射性金属核素包含但不限于111In、68Ga、90Y、177Lu、225Ac中任一种。
9.如权利要求5所述的小分子抗体的标记方法，其特征在于，所述双功能偶联剂包含但不限于p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-PCTA、p-SCN-Bn-DOTA、DOTA-NHS、Maleimido-mono-amide-DTPA、Maleimido-mono-amide-DOTA、Maleimido-mono-amide-NOTA、Maleimido-mono-amide-PCTA中任一种。
10.如权利要求5所述的小分子抗体的标记方法，其特征在于，所述将小分子抗体与双功能偶联剂结合得到中间体的具体方法包含： 取0.5-1.0mg小分子抗体溶于pH8.0-9.0的PBS溶液，使小分子抗体的质量体积浓度为1.0-1.5 mg/ml；以及
向上述混合溶液中加入双功能偶联剂，25~40℃轻微振荡孵育2~4 h后，静置、离心；
其中，所述双功能偶联剂的物质的量为小分子抗体的物质的量的20-50倍。
11.如权利要求5所述的小分子抗体的标记方法，其特征在于，将中间体与放射性金属核素溶液和抗体保护剂混合反应的具体方法包含：
将中间体与抗体保护剂、放射性核素混合后置于pH 4.5~5.5环境中，在25-40oC反应15-60 min。
12.一种标记的小分子抗体，其特征在于，所述标记的小分子抗体为由权利要求5-11任一所述的标记方法得到的小分子抗体-放射性金属核素标记分子。
13.如权利要求1-4、12中任一所述标记的小分子抗体在制备CEA抗原相关肿瘤SPECT/CT或PET/CT分子诊断显像剂中的应用。
14.如权利要求1-4、12中任一所述标记的小分子抗体在制备治疗CEA抗原相关肿瘤药物中的应用。
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