KR20130028051A - 방사 면역 접합체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 CD37에 결합하는 방사 면역 접합체에 관한 것이다. 암 - 특히 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 약학적 조성물 및 그의 용도는 본 발명의 양태이다.

Description

신규 방사 면역 접합체 및 그 용도{NOVEL RADIOIMMUNOCONJUGATES AND USES THEREOF}
본 발명은 예상치못한 높은 세포독성을 갖는 방사능 표지된(radiolabeled) 단일클론 항체를 사용한 혈액암의 방사 면역치료법에 관한 것이다.
방사능 표지된 항체를 사용한 요법은 비-호지킨 림프종(NHL)에 대하여 도입되어 왔고 또한 오늘날 인가된 방법이다. ZevalinTM 및 BexxarTM와 같은 2개 제품이 시판중이며, 또한 이들 양자는 CD20 항원을 표적으로 한다(Jacene et al., 2007).
면역치료제 리툭시맙(RituxanTM/MabtheraTM) 역시 CD20 항원을 표적으로 한다. 동일 표적에 대한 치료법에 관련된 한가지 문제는 질병과정 동안 면역표현형 유동(immunophenotypic drift)의 가능성이 있어(Ngo et al., 2009), 리툭시맙(Rituximab) 요법에서와 같이 장시간에 걸쳐 반복될 때 또는 연장된 리툭시맙 요법에 이어 CD20-계 방사 면역 요법(RIT)을 투여하면 CD20 요법의 효과 감소를 초래할 수 있는 것이다.
CD20 관련 요법을 처리받은 다수의 환자들은 결국 재발을 경험할 것이다(Buchegger et al., 2006; Gordon et al 2004). 따라서, NHL 환자에서 CD20보다는 다른 항원을 표적으로 하는 RIT의 필요성이 상당히 존재한다.
RIT의 개발 초기에, 2개 항원 CD37 및 CD20가 표적으로 평가되었다(Press et al., 2001). CD20를 표적으로 하는 RIT가 더욱 적절하므로 CD37을 표적으로 하는 RIT는 포기하는 것으로 결론지어졌다. 따라서, 단일클론 항체는 림프종에 대한 RIT에 사용하기에 적합하지만, CD20을 표적으로 하는 방사 면역 접합체(RIC)는 CD37을 표적으로 하는 RIC보다 더 우수하다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다(Press et al., 2001).
최근에 CD37는 키메릭(chimeric) 또는 인간화된 항체 작제물을 사용한 면역요법에 대한 표적으로서 주로 새로운 관심을 끌고 있다(Heider et al., 2009; Grosmaire, 2007). 이들 연구는 통상의 쥐 IgG 단일클론 항체를 사용하는 것은 배제하고 있는데, 이는 쥐의 항체가 환자에서 인간 항-마우스 항체(HAMA) 생산을 유도할 수 있어, 면역요법의 효율 감소와 불편함을 초래할 수 있기 때문이다.
RIT의 경우, 통상의 쥐 단일클론 항체는 여전히 흥미로운 것으로 간주되고 있는데, 이는 일반적으로 단백질 사용량이 더 적고 면역요법과 동일한 정도로 치료를 반복할 필요가 없기 때문이다. 또한, 쥐 IgG의 제거는 일반적으로 동일한 IgG의 인간화된 또는 키메라 버젼보다 약간 더 빠르며, 이는 RIT로부터 전신 방사선 노출 면에서 적어도 일부 세팅에서는 더욱 적절할 수 있다. Bexxar 및 Zevalin 양자는 쥐 항체를 기본으로 하는 것임을 유념해야 한다.
본 발명은 방사성 동위원소(radioisotope)에 대한 캐리어로서 항-CD37 쥐 항체 HH1을 제공한다. 쥐 항-CD37 항체 HH1을 생산하는 최초의 하이브리도마 클론(hybridoma clone)은 1980년대에 개발(Smeland et al., 1985)되었고 HH1 항체는 몇 년 동안 면역조직화학법에서 시험관내 사용을 위해 시판되고 있다.
HH1은 이전에는 생체분포 및 세포의 세포독성 면에서 방사 면역 요법용으로 평가되지 않았다. 따라서 현재의 연구는 방사 면역 요법에서 HH1의 적합성을 평가하기 위해 실시되었다. 클로라민 T/요오도겐(Iodogen) 방법을 이용하여 티로신 잔기에 직접적으로 방사능 표지된 131I를 사용하였던 항-CD37 RIC를 사용한 이전의 임상 연구 및 전임상(preclinical) 연구와 대조적으로, HH1은 할로겐 대신 금속 방사성 핵종(radionuclide)을 사용하여 킬레이터를 통하여 방사능표지되었다.
킬레이터-링커를 통하여 표지된 금속 방사성 핵종을 사용하는 것은, 131I-표지된 항체의 사용이 RIC로부터 방출된 각종 양의 요오드에 갑상선이 노출되는 것과 관련되기 때문에 유리할 수 있었다.
HH1이 방사 면역 접합체를 생성하는 데 적합한지 여부를 평가하기 위한 이전의 연구에서는, CHX-A-DTPA가 HH1에 접합(conjugated)되었고 상기 접합체는 시험관내 모델링 목적을 위해 205'206Bi에 의해 표지되었다(Henriksen et al., 1997).
세포주 Raji에서의 흡수는 HH1 또는 스트렙트애비딘에 접합된 비스무트에 대해 비교되었다. 후자의 경우 세포는 바이오틴화된-HH1에 의해 미리 포화되었다.
212Bi 또는 213Bi에 의해 표지될 때 기능적 RIC를 보장하는데 필요한 킬레이터의 수가 제한 인자이라는 것이 밝혀졌다. 따라서 HH1계(based) RIC 대신 바이오틴화된 HH1를 사용하는 것이 제시되었다. 세포에 일단 결합되면, 바이오틴화된 HH1은 방사능 표지된 스트렙트애비딘에 의해 표적화될 수 있다.
따라서, 상기 연구는 알파-입자-방출 방사성 핵종에 의해 표지된 HH1은, 충분한 결합능을 유지하기 위해 HH1에 대해 허용될 수 있는 킬레이터 농도에서 불충분한 비활성(specific activity)으로 인하여 덜 유용함을 제시한다.
상기 논문에서는 또한 충분한 효과를 얻기 위해서는 크로스 파이어(cross-fire)가 필수적이기 때문에 베타선 방출제(beta-emitter)를 사용한 표적화된 방사능요법이 산재성(disseminated) 질병에서 열등해야 한다고 저자들이 기술하고 있으므로, 베타선 방출제는 알파선 방출제(alpha-emitter)와 비교하여 기능적 RIC를 작제하기에 훨씬 덜 적합할 것이라 나타내었다.
따라서, 상기 인용된 연구는 방사 면역 요법에서 직접적으로 킬레이트화된 HH1을 사용하는 것을 시사하지 않고 있으며 베타선 방출제계 RIC에서 HH1을 사용하는 것도 시사하고 있지 않다.
본 발명은 쥐 단일클론 항체 HH1, 링커, 및 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 47Sc, 및 177Lu로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 핵종을 포함하는 인간 CD37을 결합하는 방사 면역 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 상기 링커는 킬레이팅(chelating) 링커이고 상기 방사성 핵종은 177Lu이다.
본 발명의 일 양태는 본 발명의 방사 면역 접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 본 발명의 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 부가적 항체 또는 방사 면역 접합체를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 하나 이상의 부가적 항체 또는 방사 면역 접합체는 CD20을 표적으로 한다.
본 발명의 다른 실시양태는 CD37 항원을 발현하는 B-세포 악성종양 세포를 치료하기 위한 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병 치료용이다.
본 발명의 일 양태는 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 본 발명의 방사 면역 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태는 다른 요법과 함께 또는 다른 요법 이외에 투여되는 본 발명의 방사 면역 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 상기 요법은 전처리, 화학요법, 단일클론 항체 요법, 수술, 방사선요법, 및/또는 광역학(photodynamic) 요법으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 요법은 본 발명의 방사 면역 접합체를 사용한 치료 이전에 항-CD20 및/또는 항-CD37 단일클론 항체를 사용한 전처리를 포함한다.
본 발명의 일 양태는 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병으로부터 선택된 B-세포 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지는 2 이상의 바이얼을 포함하는 본 발명의 방사 면역 접합체를 제조하기 위한 키트에 관한 것으로, 1개 바이얼은 쥐 단일클론 항체 HH1에 결합된 킬레이터를 포함하는 접합물을 함유하고; 제2 바이얼은 방사성 핵종을 함유한다.
본 발명의 일 실시양태는 바이얼의 하나 또는 몇 개의 내용물이 동결건조되거나 또는 용액인 본 발명의 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 방사 면역 접합체는 2개 바이얼의 내용물을 혼합하는 것에 의해 생성된다.
도 1
111In-HH1, 111In-리툭시맙(rituximab), 125I-HH1 및 125I-리툭시맙을 갖는 Raji, Rael 및 Daudi 세포를 배양한 직후(A) 및 96시간 후(B)의 세포 결합된 항체.
도 2
177Lu-HH1 또는 177Lu-리툭시맙과 함께 2시간(A) 및 18시간(B) 배양한 후의 Daudi 세포 결합된 활성. 블로킹된(blocked) 세포는 100 ㎍/ml 비-표지된 항체에 의해 블로킹하였다.
도 3
세척하기 전에 177Lu-HH1(A) 또는 177Lu-리툭시맙(B)와 함께 2시간 동안 배양된 Daudi 세포의 성장.
도 4
세척하기 전에 177Lu-HH1(A) 또는 177Lu-리툭시맙(B)와 함께 18시간 동안 배양된 Daudi 세포의 성장
도 5
Daudi 이종이식편(xenograft)을 갖는 마우스에서 킬레이터를 통하여 HH1에 표지된 111In의 생체분포.
도 6
표지되지 않은 Daudi 세포, 2차 항체만으로 표지된 Daudi 세포, 또는 HH1, ON.108, IPO.24 또는 6D263에 의해 표지된 Daudi 세포의 FITC-히스토그램.
도 7
Daudi 종양을 갖는 자성(female) 누드 마우스에서 177Lu의 생체분포.
도 8
정맥 주사된 Daudi 세포를 사용한 마우스의 요법. 50 및 100 MBq/kg 177Lu-HH1, 냉각 HH1, 냉각 리툭시맙 및 NaCl에 의해 처리된 마우스의 생존.
본 발명은 방사 면역 요법에서 항체 HH1의 용도에 관한 것이다.
금속 방사성 핵종, 링커 및 항-CD37 단일클론 항체의 조합은 놀랍게도 방사능 표지된 HH1이 이종이식편/누드 마우스 모델에서 관련 생체분배 및 종양 흡수를 갖는 것을 나타내었다.
이것은 방사 면역 요법에서 사용 적합성을 나타내는 중요한 정보이다.
방사 면역 접합체
본 발명은 놀랍게도 방사 면역 접합체 177Lu-HH1이 산재된 종양 세포 상에서 현저한 세포독성을 나타내고 177Lu-HH1은 소정 투여량에 대해 종양 세포에 대해 177Lu-리툭시맙보다 더욱 세포독성인 것을 나타낸다.
이 발견은 세포당 더 많은 방사능활성이 결합되고, 결합된 방사성 핵종의 체류가 177Lu-리툭시맙에 대해 유사하거나 또는 더 우수하기 때문에 예상치 못한 것이었다.
이것은, 항-CD20 항체가 방사 면역 요법에 대해 항-CD37 항체보다 더 우수하다는 이 분야의 통상의 지식에 반하는 것을 시사한다. 또한, 본 연구는 베타선 발생제의 경우 산재된 세포에서 얻을 수 없는 크로스-파이어가 충분한 효과를 얻기 위해 필수적일 수 있다는 점에서 이전의 관념과 상이하다(Henriksen et al., 1997).
상기 관찰된 효과에 대한 이유는 분명하지 않다. 다양한 투여량의 표지되지 않은 HH1 및 리툭시맙을 사용한 실험으로부터 얻은 데이터는 이용된 성장 에세이에서 표지되지 않은 항체로부터의 어떠한 효과도 나타내지 않았다.
한가지 가능한 설명은, CD20은 사용된 세포주 상에서 평균적으로 더욱 강하게 발현됨에도 불구하고, CD37 대 CD20 중에서 아주 낮은 항원 밀도를 갖는 세포가 몇 개 존재할 수 있다는 것이다.
체류 데이터는 가능한 설명일 수 있는 CD37의 내재화(internalization)로 인한 우수한 체류를 제시하지 않았는데, CD37 항원에 의한 일부 내재화가 보고되어 있기 때문이다(Press et al, 2001).
따라서, 본 발명은 쥐 단일클론 항체 HH1, 링커, 및 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 47Sc, 및 177Lu로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 핵종을 포함하는 인간 CD37을 결합하는 방사 면역 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 상기 링커는 킬레이팅 링커이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 방사성 핵종은 177Lu이다.
다른 실시양태에서 상기 방사성 핵종은 다른 베타선 발생제 또는 알파선 발생제이다.
본 발명은, 시험관내 데이터에 의해, 방사능 표지된 리툭시맙이 CD20 항원에 결합하는 것에 비하여, 방사능 표지된 HH1이 CD37 항원에 더욱 효과적으로 결합하는, 즉 덜 순환하는 필요 항체에 의해 항원에 대하여 최대 결합에 도달함을 제시한다(표 2, 도 2).
최대 결합에 도달하는 데 시간이 덜 소요된다(도 2). 이들은 생체 내에서도 마찬가지로 중요한 특징일 수 있는데, 이는 종양 세포가 고형암이 덜 생기는 영역에서 생길 수 있는 상황인 저농도의 순환 항체에서, 정상 조직의 먼 영역에 위치한 단일 종양 세포 및 암세포의 미소전이(micrometastases)의 경우에도 RIC를 포획할 수 있음을 의미하기 때문이다.
이것은 항원을 포화시키고 바람직한 생체분포를 얻기 위하여 항-CD20 항체와 비교하여(Press et al., 1993), 더 높은 항체 농도가 HH1(Bernstein et al., 1990)보다 다른 항-CD37 항체와 함께 필요하다고 나타낸 이전의 데이터와는 현저히 상이하다.
또한, 본 발명은 모든 항체가 실질적으로 동일 에피토프에 결합함에도 불구하고 HH1가 3개의 상이한 항-CD37 항체 패널과 비교할 때 일부 상이한 항원 결합 특성을 가짐을 나타낸다.
표지되지 않은 항체를 사용하여 예비포화된 세포를 사용한 블록킹 실험은 HH1이, 3개의 다른 항-CD37 항체보다도 실질적으로 더 우수하게, 살아있는 세포 상의 방사능 표지된 HH1에 결합하지 않도록 CD37을 블로킹할 것이라는 것을 나타내었다.
방사능 표지된 항체를 비교하는 세포 에세이에서, HH1은 3개의 다른 항체와 비교하여 훨씬 더 우수한 면역 반응성 분획을 나타내었다. 면역 반응성 분획이라는 것은 무제한적 과량의 항원이 존재할 때 항원을 결합할 수 있는 항체의 분획을 의미한다. 상이한 항체는 표지 과정을 거친 후에 면역 반응성을 보존하는 상이한 능력을 가질 수 있다. 실시예 6, 실험 IV, 표 5에 나타낸 결과는 HH1의 면역 반응성이 3개의 시판되는 항체의 면역 반응성보다 더 잘 보존됨을 나타낸다.
한편, 면역조직화학 분석은 상기 3개의 항체는 파라핀-매립 고정된 종양 샘플로부터 얻은 조직 부분을 염색시켰지만, HH1은 그렇지 않았음을 보여 주였다. 항체 항원 상호작용에서의 차이는 유세포 분석기(Flow cytometry)에 의해서는 검출될 수 없었다.
유세포 분석기 히스토그램은 HH1 및 상기 3개의 다른 항-CD37 항체의 경우에 유사하였다(도 6). 대체로 이들 데이터는, HH1이 중요한 개별적 항원 상호작용을 가지며, 이는 몇몇 양태에서는 다른 항-CD37 항체 연구로부터는 예상될 수 없는 것임을 나타낸다.
상기 기재된 강한 세포독성 특성을 갖는 신규 항-CD37 방사 면역 접합체는 쥐 단일클론 항체 HH1, 킬레이팅 링커, 및 베타선 발생제 177Lu으로 구성된다.
먼저 이작용성 킬레이터, 예컨대 p-SCN-bn-DOTA(마크로사이클릭스 제조, 미국 텍사스 소재)를 상기 항체와 반응시킨 다음 접합되지 않은 킬레이터를 제거하도록 정제하고, 뒤이어 상기 킬레이터 항체 접합체를 방사성 핵종과 반응시킨 다음, 접합되지 않은 방사성 핵종을 제거하기 위하여 정제하는 것에 의해 방사성 핵종을 상기 항체에 부착시킬 수 있다.
다르게는, 상기 킬레이터 및 방사성 핵종은 먼저 조합된 다음 항체에 접합될 수 있다.
예컨대 p-SCN-bn-DOTA와 같은 킬레이팅 링커는 177Lu에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 다른 금속 방사성 핵종을 HH1에 접합시키기 위해 사용될 수 있다.
단백질 또는 펩티드에 직접적 또는 간접적인 접합을 허용하는 충분한 착화능(complexing ability)과 작용기를 갖는 임의 유형의 링커도 사용될 수 있다. 이러한 링커의 예는 문헌(예컨대 Brechbiel, 2008; Liu, 2008)에 기재되어 있다. 일부 유용한 예는 p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-에스테르와 같은 이작용성 시클릭 킬레이터; p-SCN-Bn-DTPA 및 CHX-A"-DTPA와 같은 이작용성 선형 킬레이터이다.
본 발명에서의 방사성 핵종은 바람직하게는 이작용성 킬레이터를 사용하는 것에 의해 표적화 분자에 접합될 것이다.
이들은 시클릭, 선형 또는 분기된(branched) 킬레이터일 수 있다. 주쇄(backbone) 질소에 부착된 산성기(예컨대 카복시알킬)를 갖는 선형, 시클릭 또는 분기된 폴리아자알칸 주쇄를 포함하는 폴리아미노폴리에시드 킬레이터를 특히 참조할 수 있다.
적합한 킬레이터의 예는 p-이소티오시아나토벤질-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(p-SCN-Bz-DOTA)과 같은 DOTA 유도체 및 p-이소티오시아나토벤질-디에틸렌트리아민펜타아세트산(p-SCN-Bz-DTPA)과 같은 DTPA 유도체를 포함하며, 전자는 시클릭 킬레이터이고, 후자는 선형 킬레이터이다.
착화 부분(complexing moiety)의 금속화는 착화 부분이 표적화 부분에 접합하기 전 또는 후에 실시될 수 있다.
방사능표지 과정은, 일반적으로 방사능표지가 실시되기 전에 킬레이트가 항체에 접합되면, 소요 시간 측면에서 더욱 편리할 것이다.
항체에 부착된 킬레이터를 사용하여 방사능표지된 접합체를 제조하는 원리는 예컨대 Liu, 2008에 광범위하게 기재되어 있다.
따라서, HH1은 방사능 특성 및 효과적인 반감기 면에서 차이가 있는 방사 면역 접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
예컨대, 쥐 단일클론 항체 HH1, 킬레이팅 링커 및 비제한적으로 177Lu, 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 47Sc 로 이루어진 군으로부터 선택된 베타선 또는 알파선 방출 방사성 핵종으로 구성된 항-CD37 방사 면역 접합체가 제조될 수 있고 약학적 제제 제조를 위해 사용될 수 있으며 치료 분야에서 사용될 수 있다.
약학적 조성물
HH1을 기본으로 하는 방사 면역 치료제 생성물은 방사 면역 접합체의 화학적 통합성을 실질적인 정도로 유지하고 환자에 주입하기에 생리학적으로 적합한, 완충액에 용해된 쥐 단일클론 항체 HH1에 상기 기재된 바와 같은 방사성 핵종이 킬레이터를 통하여 결합된 약학적 조성물로서 전형적으로 제공될 것이다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명의 방사 면역 접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
허용가능한 약학적 담체는, 비제한적으로, 비독성 완충액, 충전제, 등장 용액 등을 포함한다. 보다 자세하게는, 상기 약학적 담체는 비제한적으로 생리식염수(0.9%), 1/2 생리식염수, 링거 락테이트(Ringer's lactate), 5% 덱스트로오스, 3.3% 덱스트로오스/0.3% 식염수일 수 있다. 생리학적으로 허용되는 담체는 저장 및 선적하는 동안 방사성약물의 통합성을 보호하는, 예컨대 아스코르브산과 같은 방사선분해(raidolytic) 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 상기 약학적 조성물 및 하나 이상의 부가적 항체 또는 방사 면역 접합체를 포함한다. 항체는 비제한적으로 리툭시맙, 에프라투주맙, L19, F8, F16, 갈릭시맙, 토라질주맙, 알렘투주맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 아푸투주맙, 토시투모맙, 레디툭스 및 이브리투모맙을 포함한다. 방사 면역 접합체는 비제한적으로 제발린(Zevalin) 및 벡사르(Bexxar)를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 하나 이상의 부가적 항체 또는 방사 면역 접합체는 CD20을 표적으로 한다. 항체는 비제한적으로 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 아푸투주맙, 토시투모맙, 레디툭스 및 이브리투모맙을 포함한다. 방사 면역 접합체는 비제한적으로 제발린(Zevalin) 및 벡사르(Bexxar)를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 CD37 항원을 발현하는 B-세포 악성종양 세포를 표적화하기 위한 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위한 것이다.
서열 동일성
보통 정의되는 바와 같이 본 명세서에서 "동일성"은 각각 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 유전자 또는 단백질 사이의 서열 동일성으로 정의된다.
따라서, 본 발명의 내용에서 "서열 동일성"은 아미노산 수준에서 단백질 사이의 동일성의 측도 및 뉴클레오티드 수준에서 핵산 사이의 동일성의 측도이다.
상기 단백질 서열 동일성은 서열이 정렬될 때 각 서열 중의 소정 위치에서 아미노산 서열을 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다.
유사하게, 상기 핵산 서열 동일성은 서열을 정렬할 때 각 서열 중의 소정 위치에서 뉴클레오티드 서열을 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다.
2개 핵산 사열 또는 2개 아미노산 서열의 퍼센트(%) 동일성을 결정하기 위해서는, 최적 비교 목적을 위한 서열들을 정렬시킨다(예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 중에 갭이 도입될 수 있음). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 있는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다.
제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 그 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 점유된 동일 위치의 수의 관계이다(즉, % 동일성 = 동일 위치의 #/위치의 총 # (예컨대 중첩 위치) x 100). 일 실시양태에서, 상기 2개 서열은 동일 길이이다.
서열들을 수동으로 정렬하여 동일한 핵산 또는 아미노산의 수를 셀 수 있다. 다르게는, 퍼센트 동일성을 측정하기 위한 2개 서열의 정렬은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12를 이용하여 실시되어 본 발명의 핵산 분자와 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻는다. BLAST 단백질 연구는 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3을 이용하여 실시되어 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 얻는다.
대조 목적을 위한 갭이 있는 정렬(gapped alignment)을 얻기 위하여, Gapped BLAST를 이용할 수 있다. 다르게는, 분자 사이의 간격 관계를 검출하는 반복된 연구를 실시하기 위해 PSI-Blast가 이용될 수 있다. NBLAST, XBLAST, 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 디폴트(default) 변수가 이용될 수 있다. 참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 다르게는, 예컨대 EMBL 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST) 중의 BLAST 프로그램에 의해 서열이 정렬된 후 서열 동일성을 산출할 수 있다.
일반적으로, 상기 정렬에는 예컨대 "스코어링 매트릭스(scoring matrix)" 및 "갭 페널티(gap penalty)"와 관련된 디폴트 세팅이 이용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, BLASTN 및 PSI BLAST 디폴트 세팅이 유리할 수 있다.
2개 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 갭을 갖거나 또는 갭을 허용하지 않고, 상기 기재된 것과 유사한 수법을 이용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성 산출시, 오직 정확한 매칭만 카운트한다.
일 실시양태로서, 본 발명은 HH1 항체 VH 서열(서열번호: 1) 및/또는 VL 서열(서열번호: 3)과 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된(isolated) 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태는 HH1 항체 VH 서열(서열번호: 1) 및/또는 VL 서열(서열번호: 3)을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 단리된 핵산은 HH1 항체 VH 서열(서열번호: 1) 및/또는 VL 서열(서열번호: 3)과 90% 동일성, 91% 동일성, 92% 동일성, 93% 동일성, 94% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성과 같이 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 HH1 항체 VH 서열(서열번호: 2) 및/또는 VL 서열(서열번호: 4)과 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 HH1 항체 VH 서열(서열번호: 2) 및/또는 VL 서열(서열번호: 4)을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 항체는 HH1 항체 VH 서열(서열번호: 2) 및/또는 VL 서열(서열번호: 4)과 90% 동일성, 91% 동일성, 92% 동일성, 93% 동일성, 94% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성과 같은 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
유전자 변이
유전자 변이는 유전자의 뉴클레오티드 중의 염기 순서에서 변이에 의해 유발된다. 이러한 변이는 유전자에서 돌연변이를 유발하며 그러한 유전자가 코딩하는 단백질에서 돌연변이를 유발한다.
이들 돌연변이는 센스 또는 미스센스(missense) 돌연변이 또는 치환일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1과 같은 적어도 50개 센스 돌연변이를 포함하는 HH1 단일클론 항체 VH 사슬(서열번호: 1) 및/또는 VL 사슬(서열번호: 3)의 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 1 내지 50, 0 내지 20, 1 내지 20, 0 내지 10, 1 내지 10, 0 내지 5, 1 내지 5, 3, 1과 같은 0 내지 50개의 센스 돌연변이를 포함하는 HH1 단일클론 항체 VH 사슬(서열번호: 1) 및/또는 VL 사슬(서열번호: 3)의 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
미스센스 돌연변이(비동의적 돌연변이 유형)는 단일 뉴클레오티드가 변경된 점 돌연변이이며, 상이한 아미노산을 코딩하는 코돈을 초래한다(정지 코돈에 대한 아미노산을 변경하는 돌연변이는 미스센스 돌연변이라기보다는 논센스(nonsense) 돌연변이로 간주된다). 미스센스 돌연변이는 생성 단백질을 비작용성으로 만들 수 있다.
그러나, 모든 미스센스 돌연변이가 허용가능한 단백질 변화를 초래하는 것은 아니다. 아미노산은 아주 유사한 화학 특성의 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 이러한 경우, 상기 단백질은 정상적으로 작용할 수 있고; 이는 "중성", "조용한", 또는 보존적 돌연변이라 칭한다.
다르게는, 상기 아미노산 치환은 단백질 2차 구조 또는 작용에 현저히 나쁜 영향을 주지 않는 단백질의 영역에서 생길 수 있다. 일개 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 코딩될 수 있으면(소위 "축퇴 코딩"), 코돈에서 돌연변이는 번역에서 변화를 가져오지 않을 수 있다; 이는 동의적(synonymous) 돌연변이(침묵 돌연변이 형태)이고 미스센스 돌연변이는 아니다.
본 발명의 일 실시양태는 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1과 같은 적어도 50개 미스센스 돌연변이를 포함하는 HH1 단일클론 항체 VH 사슬(서열번호: 1) 및/또는 VL 사슬(서열번호: 3)의 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태는 1 내지 50, 0 내지 20, 1 내지 20, 0 내지 10, 1 내지 10, 0 내지 5, 1 내지 5, 3, 1과 같은 0 내지 50개 미스센스 돌연변이를 포함하는 HH1 단일클론 항체 VH 사슬(서열번호: 1) 및/또는 VL 사슬(서열번호: 3)의 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
보존적 치환은 일개 아미노산을, 전체적 작용이 심각하게 영향을 받지 않을 정도로 일반적으로 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 미스센스 돌연변이는 보존적 돌연변이 또는 치환이다.
본 발명의 다른 실시양태는 HH1의 가변 중쇄(서열번호: 2) 및/또는 가변 경쇄(서열번호: 4) 서열과 80% 서열 동일성을 갖고, 서열 변이가 보존적 치환인, 단리된 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 80% 서열 동일성은 90% 동일성, 91% 동일성, 92% 동일성, 93% 동일성, 94% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성과 같은 동일성을 갖고 서열 변이가 보존적 치환이다.
방사능표지 단계를 향상시키기 위하여, 여분의 리신을 예컨대 HH1의 Fc 부분에 도입하는 것이 유익할 수 있다. 이는 리신 결합성 킬레이터를 항체에서 항원 결합성 부위에 부착할 가능성을 감소시킬 것이므로, 방사능표지 동안 면역 반응성을 희생할 우려를 감소시킬 수 있다.
리신을 예컨대 HH1의 Fc 부분에 도입하는 방법은 당해 분야, 예컨대 Hemminki et al., 1995에 공지되어 있다.
본 발명의 일 실시양태는 HH1의 Fc 부분 중의 10개 Lys, 예컨대 8개 Lys, 6개 Lys, 5개 Lys, 4개 Lys, 3개 Lys, 2개 Lys, 1개 Lys에 의해 변형된 본 발명의 방사 면역 접합체에 관한 것이다.
치료
본 발명의 약학적 해결책의 치료적 용도는, 비제한적으로, 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병을 비롯하여, CD37 항원을 발현하는 악성종양 세포에 대한 치료를 위한 것이다.
다른 용도는 자가면역 질병의 치료 및 이식 관련된 효과의 치료일 수 있다. 이 요법은 비제한적으로 베타-입자-방사선 또는 알파-입자-방사선 또는 이들의 조합을 기본으로 할 수 있다.
이 요법은 단일요법 또는 다른 요법과 조합하여 투여될 수 있고, 바람직하게는 표준 치료일 수 있다. 이러한 다른 요법은 전처리, 수술, 화학요법, 면역요법, 광역학 요법, 방사 면역 요법 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있다. 투여한다는 것은 정맥 주입 또는 정맥 주사를 의미한다. 보다 자세하게는, 본 발명의 방사 면역 접합체는 공기 색전증을 예방하고 예상 유량이 환자에게 들어가게 하는 드립 챔버(drip chamber)에 연결된 주변 캐눌라에 의해 정맥에 직접적으로 투여될 수 있다.
일 실시양태에서 상기 방사 면역 접합체는 반복적 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 방사 면역 접합체는 반복되는 방식으로 투여되 수 있지만, 상이한 방사성 핵종을 사용하여, 예컨대 베타-방사 면역 요법에 이어 알파-방사 면역 요법을 실시하거나 또는 그 반대로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 본 발명의 방사 면역 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태는 다른 요법과 조합되어 또는 다른 요법 이외에 투여되는 본 발명의 방사 면역 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 상기 다른 요법은 전처리, 화학요법, 단일클론 항체 요법, 수술, 방사선요법, 및/또는 광역학 요법으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 다른 요법은 골수 이식 또는 줄기세포 이식 및/또는 요법이다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 방사 면역 접합체로 치료하기 전에 항-CD20 및/또는 항-CD37 단일클론 항체를 사용하는 치료적 전처리를 포함한다.
본 발명의 일 양태는 유효량의 본 발명의 상기 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병으로부터 선택된 B-세포 악성종양의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서 상기 항체 투여량은 1-1000 mg/환자, 더욱 바람직하게는 5-50 mg/환자이고, 177Lu는 1-200 MBq/kg 체중, 더욱 바람직하게는 10-100 MBq/kg 체중에 달한다.
키트
본 발명의 일 양태는 2개 이상의 바이얼을 포함하는, 본 발명의 방사 면역 접합체를 제조하기 위한 키트로서, 1개 바이얼은 쥐 단일클론 항체 HH1에 결합된 킬레이터를 포함하는 접합체를 함유하고; 제2 바이얼은 방사성 핵종을 함유하는 키트에 관한 것이다.
키트는 일부 과정을 실시할 필요가 있으며, 예컨대 주입 이전에 예컨대, 방사능표지 및/또는 정제가 실시된다.
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 키트에 관한 것으로, 바이얼의 1 또는 몇 개의 내용물은 동결건조되거나 또는 용액일 수 있다.
방사 면역 접합체를 생성하기 위해 2개 바이얼의 내용물을 혼합하는 것에 의해 최종 생성물이 나타날 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 방사 면역 접합체는 2개 바이얼의 내용물을 혼합하는 것에 의해 생성된다. 상기 생성물은 사용 이전에 정제를 필요로 할 수 있다.
실시예
실시예 1 - HH1의 방사능표지
요오드화: 항체들은 제조자들의 기재에 따라서 요오도겐(IODOGEN) 예비코팅된 요오드화 튜브(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 간접적인 요오드화를 통하여 125I에 의해 표지되었다.
111In 및 177Lu에 의한 표지: 항체들은 먼저 킬레이터(p-SCN-Bn-DTPA 또는 p-SCN-Bn-DOTA)와 반응하였다.
상기 DTPA 또는 DOTA 킬레이터를 0.05M HCl에 용해시키고, 이어서 항체에 부가하였고, 이것은 5:1 비율의 카보네이트 완충액을 사용하여 세척하는 것에 의해 약(ca.) 8로 pH 조절되었다. pH를 다시 확인하고 필요하면 다시 조절하였다. 상기 용액을 실온에서 60분간 진탕한 다음, 50 ㎕의 200 mM 글리신 용액(mg 항체당)을 부가하는 것에 의해 반응을 종료시켰다. 유리 킬레이터를 제거하기 위하여 상기 접합된 항체는 PBS(PAA)를 사용하여 4-5회 세척하고, 암모늄 아세테이트를 사용하여 세척하는 것에 의해 pH 5로 조절하였다. 111In 또는 177Lu(퍼킨엘머 제조, 미국 매사추세츠 보스톤 소재)를 0.5mg DOTA-Ab에 부가하고, 42℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 마지막으로, 겔 여과 컬럼, 예컨대 Sephadex G-25 PD10(GE 헬쓰 제조) 또는 유사 컬럼 상에서 용출시키는 것에 의해 상기 생성물을 정제하였다. 전체 표지는 17% 내지 63%로 다양하였다.
방사 면역 접합체의 양은 림프종 세포 및 변형된 린드모(Lindmo) 방법을 이용하여 측정하였다. 111In-접합체의 가장 보통의 비활성을 보상하기 위하여 108 세포/ml에 달하는 세포 농도를 이용하였다. 125I-접합체(더 높은 비활성을 갖는)의 경우, 4*107 세포/ml에 달하는 세포 농도를 사용하는 것이 충분하였다.
방사 면역 접합체의 면역 반응성 및 비활성은 표 1에서 볼 수 있다.
실시예 2 - 결합 변수
결합속도 상수, ka, 평형 해리 상수, Kd, 및 결합 부위의 평균, Bmax,은 원-스텝 곡선맞춤법에 의해 측정하였다(Dahle et al . 2007). 상기 결합 변수는 HH1 및 리툭시맙 그리고 상이한 3개의 림프종 세포주 Raji, Rael 및 Daudi 세포(표 2)에 대해 측정하였다. 특정 결합은 시간 및 항체 농도의 관계로서 측정하였고, 항원-항체 복합체를 형성하는 네트 속도를 기재하는 미분방정식의 해는 결합속도 상수, ka, 평형 해리 상수, Kd, 및 결합 부위의 평균, Bmax,을 변수로 사용하여 실험 데이타 점에 맞추었다. ml당 5백만 세포와 4개 농도의125I-표지된 항체(100 ng/ml, 1000 ng/ml, 5000 ng/ml 및 10000 ng/ml) 및 7개 배양 시점(5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 1.5 시간 및 2시간)을 이용하였다. 배양 후, 세포를 PBS를 사용하여 2회 세척한 다음 감마 계수기(counter)에서 계수하였다.
실시예 3 - 세포 결합된 항체의 체류
세척 직후 및 96시간 후 세포 결합된 항체의 체류는 Raji, Rael 및 Daudi 세포를 111In-HH1,111In-리툭시맙, 125I-HH1 및 125I-리툭시맙과 함께 배양한 후에 측정하였다(도 1).
10% 우태아 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙트마이신을 갖는 1 ml의 RPMI 1640 배지 중의 백만개 세포를 1 ㎍/ml 125I- 또는 111In-표지된 HH1 또는 리툭시맙과 함께 1시간 동안 배양한 다음, 배지로 2회 세척하고 4일간 더 배양하였다. 세포 결합 활성은 세포의 수(Vi Cell Viability Analyzer, 베크만 쿨터 제조, 미국 캘리포니아 풀러톤 소재) 및 검량된 감마 검출기(Cobra II 자동 감마 검출기, 팩커드 인스트루먼트 컴패니 제조, 미국 코네티컷 메리덴 소재)에 의해 얻은 방사능활성양을 측정하는 것에 의해 세척한 직후(도 1A) 및 4일간 배양한 후(도 1B) 측정하였다.
실시예 4 - 177Lu-HH1 또는 177Lu- 리툭시맙을 사용하여 시험관내에서 림프종 세포의 치료
실험 I: Daudi 세포에 대한 177Lu-HH1의 결합
1 ml의 Daudi 세포 현탁액(1 백만 세포/ml)을 24개 튜브에 씨딩(seeded)하고 상기 튜브의 반은 100 ㎍/ml의 HH1 또는 리툭시맙을 사용하여 블로킹시키며 37℃에서 30분간 배양하였다. 이어, 각 튜브에 177Lu-HH1 또는 177Lu-리툭시맙을 최종 농도 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20 ㎍/ml로 부가하고 37℃에서 더 배양하였다. 비활성은 177Lu-HH1의 경우 91.6 kBq/g이었고 177Lu-리툭시맙의 경우 136.6 kBq/Mg이었다.
배양 기간 동안 부가된 활성의 양은 감마 검출기(Cobra II 자동-감마 검출기, 팩커드 인스트루먼트 컴패니 제조)를 이용하여 측정하였다. 2시간 후, 세포의 절반을 세척하고 세포 결합 활성을 측정(도 2A)한 반면, 세포의 나머지 절반은 세척 하기 전에 철야(18시간) 배양한 다음 세포 결합 활성을 측정하였다(도 2B).
HH1과 함께 배양된 세포와 리툭시맙과 함께 배양된 세포 사이에는 2시간 배양 후에 차이가 없는 반면, 세포 결합 활성은 HH1과 배양한 세포의 경우 18시간 배양한 후에서 보다 리툭시맙과 함께 배양된 세포에서 2배 더 높았다(도 2).
표 3 및 4는 방사능 표지된 HH1이 리툭시맙에 비하여 더 신속하게 더 낮은 항체 농도에서 항원을 포화시킨다는 것을 나타낸다. 비특이적 결합은 2개의 방사 면역 접합체(RIC)의 경우와 유사한 것으로 보이며, 이는 배지에서 RIC 농도 증가에 따라 증가한다.
특이적으로 결합된 177Lu의 최대 수는 HH1의 경우에서 리툭시맙의 경우보다 약 2배 더 높았다. 그러나, 1 ㎍/ml 투여량에서, 특이적으로 결합된 방사능활성 원자의 수에서 차이는 거의 없었다.
실험 II: 177Lu-IgG를 사용한 2시간 배양: 세포 성장 데이터
Daudi 세포를 실험 I에서와 같이 방사 면역 접합체와 함께 배양하였다(도 2A).
177Lu-HH1 또는 177Lu-리툭시맙과 함께 2시간 배양한 후 Daudi 세포의 성장은 각 튜브로부터 50,000개 세포를 6개의 12-웰 플레이트 중 3개 웰에 씨딩(seeding)하는 것에 의해 측정하였다. 세포의 양은 14일 동안 몇 개의 시점에서 자동 영상화 시스템을 이용하여 측정하였다(Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK).
표지되지 않는 항체 단독은 세포 성장에 대하여 효과를 별로 나타내지 않았다. 그러나, 177Lu-항체에 의해 처리된 블로킹된 세포는 미처리 대조군 세포만큼 신속하게 분명히 성장하지 않는데, 이는 비결합 177Lu-항체 또는 비특이적으로 결합된 177Lu-항체가 세포에 대하여 효과를 가짐을 나타낸다(도 3).
블로킹되지 않은 세포를 177Lu-항체를 사용하여 처리하는 것은 10 ㎍/ml 177Lu-HH1으로 처리된 세포의 경우 44%의 성장 지연 증가를 초래하였고(도 3A) 10 ㎍/ml 177Lu-리툭시맙으로 처리된 세포의 경우 31%의 성장 지연 증가를 초래하였다(도 3B).
20 ㎍/ml에 의한 처리의 경우 177Lu-HH1으로 처리된 세포의 재성장이 없기 때문에 2개 항체 사이의 차이가 더 컸다. 이러한 결과는 상기 세포가 동량의 항체에 의해 표지되었기 때문에 예상치 못한 것이었다(도 2A).
실험 III: 177Lu-IgG를 사용한 18시간 배양: 세포 성장 데이터.
Daudi 세포를 실험 I에서와 같이 방사 면역 접합체와 함께 배양하였다(도 2B). 177Lu-HH1 또는 177Lu-리툭시맙과 18시간 배양한 후의 Daudi 세포의 성장은 각 튜브로부터 50,000개 세포를 6개의 12-웰 플레이트 중 3개 웰에 씨딩하는 것에 의해 측정하였다.
세포의 양은 14일 동안 몇 개의 시점에서 자동 영상화 시스템을 이용하여 측정하였다(Clone Select Imager, 젠틱스 리미티드 제조, 영국 햄프셔 소재). 표지되지 않은 항체 단독은 세포 성장에 대하여 영향을 나타내지 않았다.
177Lu-항체에 의해 처리된 블로킹된 세포에 대한 세포 성장의 억제는 실험 II(도 3)에서 보다 이 실험에서 더 컸는데(도 4), 이는 배지 중의 방사 면역 접합체와의 16시간 증가된 배양으로 인한 것이다.
블로킹되지 않은 세포를 177Lu-항체로 처리하면 2.5 ㎍/ml 177Lu-HH1에 의해 처리된 세포의 경우 107%의 성장 지연 증가를 초래하였고(도 4A), 2.5 ㎍/ml177Lu-리툭시맙으로 처리된 세포의 경우 52%의 성장 지연 증가를 나타내었다(도 4B). 이 결과는 예상치 못한 것이었는데, 18시간 배양한 후 177Lu-리툭시맙으로 표지된 세포는 177Lu-HH1에 의해 표지된 세포에 비하여 부착된 세포 결합 활성이 2배를 가졌기 때문이다(도 2B).
실시예 5 - HH1의 생체분포
111In-표지된 HH1의 생체분포는 연구 개시시 32-256 mm3 크기의 Daudi 이종이식편을 사용하여 BALB/c-누드(nu/nu) 마우스에서 연구되었다.
방사성 핵종을 착화하여 그것을 항체에 부착시키기 위한 이작용성 킬레이트화제로서 pSCN-Bz-DOTA를 사용하여 방사능표지를 실시하였다(참조: 실시예 1). 이 제제는 각 동물에 100 ㎕ 용액을 꼬리 정맥 주사하는 것에 의해 투여되었다.
120 kBq의 활성을 각 동물에 주입하였다. 시점마다 5마리 동물을 사용하였다. 주입 후 다양한 시점에서 경추 탈골(cervical dislocation)후 해부검시를 실시하였다. 각 조직 샘플의 중량을 측정하고, 검량된 감마 검출기(Cobra II 자동-감마 검출기, 팩커드 인스트루먼트 컴패니 제조, 미국 코네티컷 메리덴 소재)를 이용하여 111In을 측정하였다. 상기 측정 과정에서는 주입 샘플을 기준으로 사용하였다.
Daudi 이종이식편을 갖는 마우스를 주입한 지 24시간 후 111In-HH1의 흡수 및 정상 조직에서 생체 분포는 도 5에 나타낸다. 방사능 표지된 항체는 관련된 종양 표적화 및 생체분포를 지니고 있다. 킬레이터-접합체 111In-HH1는 생체내에서 양호한 안정성을 나타낸다.
실시예 6 - 3개의 다른 항-CD37 항체와 HH1의 비교
실험 I: 방사능 표지된 HH1에 대한 항-CD37 항체의 항원 블로킹능
HH1 항원 상호작용이 다른 항-CD37 항체에 의해 블로킹될 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, Daudi 세포는 HH1, O.N.108, IPO-24 또는 6D263 항체와 함께 예비배양하는 것에 의해 블로킹되었다. Daudi 세포(2 백만/ml)를 HH1, O.N.108, IPO-24 또는 6D263 항체(20 ㎍/ml)과 함께 15분간 배양하였고, 125I-표지된 HH1 항체를 부가한 다음 1시간 동안 배양하였다.
그 후, 세포들을 원심분리시키고 3회 세척하며 상청액 및 세포 펠릿 중의 활성은 X-선/감마 계수기를 이용하여 카운트하였다. HH1 블로킹된 세포와 비교하여, 125I-표지된 HH1의 결합 분획은 O.N.108, IPO-24 또는 6D263 블로킹된 세포의 경우에 대해 각각 48%, 44% 및 51% 더 높았다.
따라서, 125I-HH1의 항원 결합은 3개의 다른 항체에 의해서보다는 HH1에 의해 더 잘 블로킹되었고, 이는 항원 상호작용에서 일부 차이를 제시한다. 결론적으로, HH1은 3개의 다른 항-CD37 단일클론 항체의 패널과 비교할 때 현저히 상이한 항원-결합 특성을 갖는다.
실험 II: 파라핀 매립된 림프종 조직 샘플에 대한 항체 결합
고정된 림프종 샘플에 결합하는 HH1 및 3개의 시중에서 구입할 수 있는 CD37 항체의 능력을 비교하기 위하여, 림프종 환자로부터 생검을 포르말린에 고정하고, 파라핀에 매립한 다음 10 ㎛ 조각으로 절단하고 이를 대물 글래스 위에 위치시켰다.
상기 샘플들은 항체 HH1, IPO.24, ON.108 및 6D263에 의해 표지되었고, 표지 정도는 토끼 항 마우스 다클론성(polyclonal) 항체 및 퍼옥시다아제 염색을 이용하여 검출하였다.
항체 IPO.24 및 ON.108은 림프종 샘플의 가장 강한 표지를 초래하였다. 6D263 항체는 샘플을 약간 더 약하게 표지시켰다. 이 구획의 HH1 항체 표지는 미미하였다.
따라서, HH1은 결합하지 않은 반면에 다른 항-CD37 항체들은 결합하였기 때문에, HH1은 현저하게 상이한 항원 상호작용을 갖는 것으로 결론지을 수 있다.
실험 III: HH1, IPO.24, ON.108 및 6D263 항체의 유세포 분석기
상이한 CD37 항체 대 HH1에 의해 검출된 항원 발현에서 차이점을 조사하기 위하여, Daudi 세포를 5% 우태아 혈청을 갖는 RPMI 1640 배지로 2회 세척하고, 얼음상에서 10% FCS를 갖는 0.2 ml 배지 중에서 10 ㎍/ml의 일차 항체 HH1, IPO.24, ON.108 및 6D363에 의해 0.5 시간 동안 표지시켰다.
이어, 상기 세포들을 0.25% FCS를 갖는 PBS를 사용하여 2회 세척하고, FITC-표지된 다클론성 토끼 항-마우스 IgG Fab' 2(1:20으로 희석됨)에 의해 얼음 상에서 0.5 시간 동안 표지시켰다(도 6). FITC-표지로부터 얻은 형광은 유세포 분석기에서 488 nm 레이저에 의해 여기함으로써 검출하였다.
치사 세포 및 더블렛(doublets)은 전방 스캐터(scatter), 측면 스캐터 및 프로피디움 요오드화물 신호를 이용하여 제거된다. 다양한 CD37 항체의 상이한 FITC 히스토그램 중에는 현저한 변이가 없었다(도 6).
결론적으로, HH1 및 3개의 다른 항-CD37 항체 IPO.24, ON.108 및 6D363은 유사한 유세포 분석기 히스토그램을 나타낸다.
실험 IV: HH1 및 3개의 시판되는 항-CD37 항체에 대한 결합 분획
Daudi 세포를 사용하여 HH1과 O.N.108, IPO-24 또는 6D263 항체(Santa Cruz Biotechnology)의 결합 분획을 비교. 5% 우테아 혈청을 갖는 0.2 ml RPMI 1640 배지에서 6천만 Daudi 세포로 이루어진 다량의 항원을 나타내는 세포 현탁액을 HH1, O.N.108, IPO-24 또는 6D263 항체(500 ㎍/ml)를 사용하여 15분간 블로킹시켜 항체의 비특이적 결합을 확인하였다. 다른 균등물(parallel)들은 블로킹되지 않았다.
이어, 125I-표지된 HH1, O.N.108, IPO-24 또는 6D263 항체(5-10 ng/ml)를 부가하고, 상기 세포들을 4℃에서 2시간 동안 가볍게 진탕하면서 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 원심분리시키고, 1% FCS를 갖는 PBS를 사용하여 2회 세척하였다. 세포 펠릿을 청정 튜브로 전달하고 감마 계수기를 이용하여 카운트하였다.
블로킹되지 않는 바이얼과 블로킹된 바이얼에 대한 활성 대 부가된 활성에서의 차이로서 결합 분획을 결정하였다. HH1은 다른 CD37 항체와 비교하여 훨씬 더 높은 결합 분획을 나타내었다(표 5). 결론적으로, 항체가 유사한 방식으로 방사능표지되었을 때 HH1은 IPO.24, ON.108 및 6D363과 비교하여 생존 세포에 대하여 훨씬 더 높은 면역 반응성을 나타내었다. 이 결과는 HH1이 3개의 다른 항체보다 상이한 항원 상호작용을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 7 - 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열
HH1 항-CD37 항체의 가변 영역의 유전자 및 단백질 서열은 다음과 같다:
VH αCD37 유전자 서열은 서열번호: 1에 상응하고, VH αCD37 단백질 서열은 서열번호: 2에 상응한다.
Figure pct00001
VL αCD37 유전자 서열은 서열번호: 3에 상응하고, VL αCD37 단백질 서열은 서열번호: 4에 상응한다.
Figure pct00002
아미노산 서열은 CD37 결합 항체 AO의 아미노산 서열과는 상당히 상이하다(Heider et al., 2009). HH1과 AO의 가변 경쇄 사이의 중첩은 56%인 반면에, 가변 중쇄 사이의 중첩은 82%이다.
실시예 8 - CD20 항체 리툭시맙에 의해 포화된 세포에 대한 방사능 표지된 HH1의 결합
배경
비-호지킨 림프종 환자는 흔히 리툭시맙을 표준 요법으로 처리 받는다. 환자들이 리툭시맙 요법을 받고 있더라도 환자에서 방사능 표지된 HH1이 사용될 수 있다면 유리할 것이다. CD20 및 CD37 항원을 모두 발현하는 Daudi 림프종 세포를 모델로서 사용하였다.
방법
Daudi 림프종 세포(0.5 ml 중 3.3 백만)를 과량(100 ㎍/ml)의 리툭시맙에 의해 5분간 전처리 또는 공동처리한 다음 1 ㎍의 125I-표지된 HH1 또는 리툭시맙 전처리되지 않은 소정 125I-표지된 HH1를 부가하였다. 125I-HH1의 비특이적 결합을 측정하기 위하여, 표지되지 않는 HH1(10 ㎍/ml)에 의해 전처리된 것 이외에는 상기와 동일한 구성배치가 이용되었다. 상기 세포들을 PBS 중, 실온에서 2시간 동안 배양하고, 감마 계수기로 카운트한 다음, 1 ml PBS로 3회 세척하고, 원심분리하며, 마지막으로 세포 결합 방사능활성에 대해 재카운트하였다.
결과
리툭시맙 전처리/공동처리에 의해, 26.0%(전체 결합, 27.4% - 비특이적 결합, 1.4%)의 125I-HH1 결합 특이성이 세포에 부가되었다.
리툭시맙 전처리/공동처리를 하지 않은 경우, 25.5%(26.9 -1.4)가 특이적으로 결합하였다(모든 수자는 3개 균등물의 평균을 나타냄). 즉, 리툭시맙의 존재로 인한 125I-HH1 결합에서는 그리 중요한 차이가 없었다.
결론
과량의 리툭시맙에 의한 전처리 및 공동처리는 방사능 표지된 HH1의 세포 결합능을 변경하지 않았고, 따라서 CD37 항원에 대한 접근도 블로킹하지 않았다.
이는 방사능 표지된 HH1을 사용한 방사 면역 요법이 항-CD20 항체를 사용한 면역요법 동안 또는 그 이후에 환자에서 적합할 수 있을 뿐만 아니라 리툭시맙으로 처리되지 않은 환자에서도 적합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9 - Daudi 림프종 세포에 의해 정맥 접종된 SCID 마우스를 177Lu-HH1을 사용한 처리
배경
현재의 CD20 관련 방사 면역 요법을 이용한 림프종 환자의 치료는 리툭시맙으로 이전에 치료된 환자에서는 문제가 될 수 있는데, 이는 CD20 항원의 항원성 소변이(antigenic drift) 및 있을 수 있는 블로킹 때문이다. 따라서, 다른 항원을 표적으로 하는 방사 면역 요법이 더욱 효과적일 수 있다. 심각하게 조합된 면역 결핍(SCID) 마우스에서 인간 림프종 세포의 정맥 주사에 의해, 우리는 정맥 종양 모델을 만들었다. SCID 마우스가 Daudi 림프종 세포에 의해 정맥으로 접종되면, 이들은 Daudi 종양 세포의 성장으로 인하여 뒷다리 마비를 발병할 것이다.
실험
50 또는 100 MBq/kg 177Lu-HH1, 50 ㎍ HH1, 50 ㎍ 리툭시맙 또는 NaCl을 투여하기 1주일 전에 천만 Daudi 세포를 SCID 마우스에 정맥 주사하였다. 상기 마우스들을 뒷다리 마비와 체중 감소뿐만 아니라 WBC 카운트를 2주 마다 모니터링하였다. 무증상 생존기간(symptom-free survival)이 중단되는 것을 종점으로 이용하였다. 방사능 표지된 항체를 제조하기 위하여, HH1를 먼저 p-SCN-Bn-DOTA로 표지시킨 다음 정제하였다. 완충액 교환한 후, 177Lu(퍼킨 엘머 제조, 미국 매사추세츠 보스톤 소재)를 상기 DOTA-HH1에 부가하고, 40℃에서 40분간 진탕하였다. 최종 생성물에 대한 비활성은 대략 3200 MBq/mkg이었다. 각 제제를 등장성 식염수에 용해시켜 총 주사 부피를 동물당 100 ㎕로 만들었다.
결과
평균적인 무증상 생존기간은 식염수의 경우 26 일(21일 내지 33 범위), HH1의 경우 40일(23일 내지 44일 범위) 및 리툭시맙의 경우 40일(33일 내지 44일 범위)이었다(도 8). 50 kBq/kg 177Lu-HH1의 경우, 80%의 동물이 79일 이후 생존하였다. 100 kBq/g 그룹의 마우스 중의 2마리는 식염수 그룹의 동물 이전에 치사하였고, 혈액 세포 카운트는 방사능독성을 나타내었다. 100 kBq/g 그룹의 세 번째 동물은 49일에 치사하였다. 나머지 동물(70%)은 79일에 생존하였다. 177Lu-HH1에 의해 처리된 마우스의 생존은 NaCl, HH1 또는 리툭시맙에 의해 처리된 마우스의 생존보다 현저하게 더 높았다[p<0.005, 만 휘트니 로그 랭크 시험(Mann Whitney Log Rank Test)].
결론
상기 데이터는 50 또는 100 kBq/g 체중 투여량의 177Lu-HH1를 처리받은 그룹은 식염수 처리 그룹 또는 HH1 또는 리툭시맙에 의한 면역요법을 받는 그룹보다 현저하게 더 우수한 생존기간을 갖는다는 것을 나타낸다. 독성 데이터는 활성이 100 kBq/g 체중 아래로 유지되어야 하는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 177Lu-HH1이 생체내 방사 면역 요법에 대한 관련 특성을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 종양 이종이식편을 발현하는 CD37을 갖는 누드 마우스에서 177Lu-HH1의 생체분포
배경
생체내 조직 분포 및 종양 표적화에 대해 리튬-177 표지된 HH1 항체를 평가하였다.
실험 과정
방사성 핵종을 사용한 항체의 표지화
항체를 킬레이터 p-SCN-Bn-DOTA를 사용하여 먼저 표지시켰다. DOTA를 0.05M HCl에 용해시키고, 5:1 비율로 상기 항체에 부가하며, 30 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 아미콘 원심분리 필터(밀리포어 제조, 미국)를 이용하여 카보네이트 완충액으로 세척하는 것에 의해 pH를 8-9로 조절하였다.
pH를 다시 확인하고 필요하면 조절하였다. 용액을 실온에서 60분간 진탕한 다음, 50 ㎕의 200 mM 글리신 용액(mg 항체당)을 부가하는 것에 의해 반응을 종료시켰다. 유리 킬레이터를 제거하기 위하여, 접합 항체를 PBS(PAA)(아미콘 및 원심분리를 이용)에 의해 4-5회 세척한 다음, 암모늄 아세테이트를 사용하여 세척하는 것에 의해 pH 5로 조절하였다. 177Lu(퍼킨 엘머 제조, 미국 매사추세츠 보스톤 소재)를 2 ml 폴리프로필렌 튜브(에펜도르프 제조, 독일) 내에서 0.5 mg DOTA-HH1과 조합하고, 40℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 비활성은 177Lu-접합체의 경우 전형적으로 25-120 MBq/kg이었다.
면역 반응성
방사 면역 접합체의 특성은 림프종 세포 및 변형 린드모 방법을 이용하여 측정하였다. 108 세포/ml까지의 세포 농도를 사용하였다. 실험에 사용된 접합체는 50%를 상회하는 면역 반응성을 가졌다.
방사 면역 접합체의 생체분포
177Lu-HH1의 생체분포는 1·1·1 mm Daudi 종양 이종이식편으로 3주 전에 이식된 웅성 BALB/c 누드(nu/nu) 마우스에서 측정하였다. 각 동물에는 100 ㎕ 용액을 꼬리 정맥에 주사하는 것에 의해 제제를 투여하였다. 177Lu-HH1의 경우 500 kBq/마우스의 평균 활성. 시점 당 4 내지 5마리 동물을 사용하였다. 주사한 후 다양한 시점에서 경추탈골 후 해부검시를 실시하였다. 각 조직 샘플의 중량을 측정하고, 검량된 감마 검출기(Cobra II 자동감마 검출기, 팩커드 인스트루먼트 컴패니 제조, 미국 코네티컷 메리덴 소재)에 의해 177Lu를 측정하였다. 주사물 샘플은 상기 측정 과정에서 기준으로 사용하였다.
결과 및 논의
Daudi 이종이식편을 갖는 BALB/c-누드(nu/nu) 자성 마우스의 정상 조직에서 177Lu-표지된 HH1의 흡수 및 체류는 도 7에 도시되어 있다. 방사 면역 접합체의 초기 흡수 이후 기관으로부터 또는 기관으로의 핵종의 재분포의 징후는 없었고, 이는 방사 면역 접합체가 안정함을 나타낸다.
종양이 있는 누드 마우스에 177Lu-HH1의 주사는 뼈에서 낮은 흡수를 나타내었다. 유리 177Lu는 뼈에 축적되는 것으로 알려져 있고, 따라서 이러한 결과는 방사 면역 접합체가 생체 내에서 안정하다는 것을 나타낸다. 종양에서의 흡수는 이후의 시점에서 다른 기관에서보다 훨씬 더 높았다.
이는 177Lu가 HH1 항체를 사용한 방사 면역 요법에 대한 관련 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다.
177Lu-HH1의 생체분포 데이터는 관련 정상 조직 흡수 및 제거율과 종양 이종이식편을 발현하는 CD37에서 현저한 체류를 나타낸다.
HH1 항체는 방사 면역 요법에 아주 잘 적합한 것으로 보인다. 177Lu-HH1 접합체는 특히 적합한 것으로 보이는데, 이는 방사성 핵종의 더 큰 분획이 붕괴되기 전에 정상 조직에 대한 바람직한 종양 비율이 얻어지기 때문이다.
방사 면역 접합체의 면역 반응성 및 비활성
방사 면역 접합체 IRF1(%) 비활성1(MBq/mg) #실험
125I-HH1 66±17(39-92) 75±15(51-104) 17
111In-HH1 66±14(51-78) 22±12(9-32) 3
117Lu-HH1 56 92 1
125I-리툭시맙 62±6(54-68) 69±30(34-118) 6
111In-리툭시맙 45 16 1
117Lu-리툭시맙 60 137 1
1평균±SD(범위)
항체 리툭시맙 및 HH1에 대한 Raji, Rael 및 Daudi 세포 상에서의 항원의 평균 개수(Bmax), 평형 해리상수(Kd) 및 결합속도 상수(Ka)
항체 세포주 Bmax(Ag/세포) Kd(nM) Ka(nM/h)
HH1 Raji 146000±7600 6.3±1.7 0.36±0.14
HH1 Rael 263000±27000 12.7±5.5 0.07±0.01
HH1 Daudi 340000±5000 2.7±0.3 0.72±0.07
리툭시맙 Raji 272000±69000 4.8±0.9 0.08±0.006
리툭시맙 Rael 626000±36000 12.0±2.0 0.08±0.007
배양한지 2시간 후 Daudi 세포당 결합된 177Lu 원자의 수
항체투여량
(㎍/ml)
 177Lu-HH1 177Lu-리툭시맙
블로킹되지 않음 블로킹됨 특이적 블로킹되지 않음 블로킹됨 특이적
0a 12 7 5 8 53 -45
1 8318 449 7869 8554 372 8182
2.5 9105 720 8385 11629 885 10744
5 10025 1837 8188 13658 2019 11639
10 13646 3521 10125 17344 2769 14575
20 16290 8473 7812 30095 9709 20386
(a 대조 샘플에 대한 상이한 카운트는 계수기에 대한 배경 방사능에서의 변이를 나타냄).
배양한지 18시간 후 Daudi 세포당 결합된 177Lu 원자의 수
항체투여량
(㎍/ml)
 177Lu-HH1 177Lu-리툭시맙
블로킹되지 않음 블로킹됨 특이적 블로킹되지 않음 블로킹됨 특이적
0 12 5 7 10 53 -43
1 10327 301 10026 12831 356 12475
2.5 11757 787 10970 18836 1385 17451
5 12123 1857 10266 24097 1871 22226
10 11548 3205 8343 24249 2860 21389
20 15233 5445 9788 26639 5824 20815
4개의 항-CD37 항체의 결합 분획
항체 IRF
HH1 50%
0.N.108 24%
IPO-24 16%
6D263 21%
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Claims (15)

  1. a) 쥐 단일클론 항체 HH1,
    b) 링커, 및
    c) 177Lu, 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu, 및 47Sc로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 핵종을 포함하는, 인간 CD37에 결합하는 방사 면역 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커가 킬레이팅 링커인 CD37에 결합하는 방사 면역 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방사성 핵종이 177Lu인 CD37에 결합하는 방사 면역 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방사 면역 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 부가적 항체 또는 방사 면역 접합체를 더 포함하는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 부가적 항체 또는 방사 면역 접합체가 CD20을 표적으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CD37 항원을 발현하는 B-세포 악성종양 세포를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  9. B-세포 악성종양을 치료하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방사 면역 접합체의 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방사 면역 접합체는 다른 요법과 함께 또는 다른 요법 이외에 투여되는 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 요법이 전처리, 화학요법, 단일클론 항체 요법, 수술, 방사선요법, 및/또는 광역학 요법으로부터 선택되는 용도.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 요법은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방사 면역 접합체를 사용한 치료 이전에 항-CD20 및/또는 항-CD37 단일클론 항체를 사용한 전처리를 포함하는 용도.
  13. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병로부터 선택된 B-세포 악성종양의 치료 방법.
  14. 2 이상의 바이얼을 포함하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방사 면역 접합체를 제조하기 위한 키트로서, 1개 바이얼이 쥐 단일클론 항체 HH1에 결합된 킬레이터를 포함하는 접합체를 함유하며; 제2 바이얼이 방사성 핵종을 함유하는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 하나 또는 몇 개의 바이얼의 내용물이 동결건조되거나 또는 용액인 키트.
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