CN117362392A - 一种靶向angpt2的多肽及用于诊断脑胶质瘤的放射性分子探针 - Google Patents

一种靶向angpt2的多肽及用于诊断脑胶质瘤的放射性分子探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向ANGPT2的多肽及用于诊断脑胶质瘤的放射性分子探针。所述多肽的氨基酸序列如下所示：GSFIHSVPRH(甘氨酸‑丝氨酸‑苯丙氨酸‑异亮氨酸‑组氨酸‑丝氨酸‑缬氨酸‑脯氨酸‑精氨酸‑组氨酸，Gly‑Ser‑Phe‑Ile‑His‑Ser‑Val‑Pro‑Arg‑His)。本发明利用分子对接技术设计和筛选出与ANGPT2特异性结合的靶向多肽，填补了ANGPT2高亲和力多肽配体的空白；本发明制备的放射性核素标记分子探针作为脑胶质瘤的显像药物，具有显像时间长、容易制备等特点。

Description

一种靶向ANGPT2的多肽及用于诊断脑胶质瘤的放射性分子 探针
技术领域
本发明属于生物医学新技术应用领域，具体涉及一种靶向ANGPT2的多肽及用于诊断脑胶质瘤的放射性分子探针。
背景技术
多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是最致命的原发性脑肿瘤之一。根据世界卫生组织(WHO)的分类标准，GBM被归类为IV级胶质瘤，其预后极差。尽管目前通过手术切除和放、化疗等治疗手段能在一定程度上延长GBM患者的生存时间，但情况仍不乐观，患者的中位生存期仅为12个月。因此，迫切需要发展新的有效治疗方法。随着对脑胶质瘤的深入研究，大量实验揭示了与之相关的多种肿瘤特异性分子，这些分子可被视为潜在的诊断和治疗靶点。结合目前快速发展的非侵入性成像技术，可以实现对GBM的早期发现和治疗，从而为患者争取更多的治疗机会，并提高生存率。然而，针对高级别胶质瘤的精确治疗仍然具有挑战性，例如面临着肿瘤高度异质性、肿瘤突变以及药物在中枢神经系统(CNS)中的渗透性差等问题。因此，充分了解脑胶质瘤发生和发展的分子机制，开发能够穿越血脑屏障并具有抑制作用的GBM靶向药物，仍然是未来研究的重点。
血管生成是肿瘤发生发展的必要条件，在肿瘤生长和代谢中起着重要作用，是很有前景的肿瘤治疗靶点。血管生成素1(Angiopoietin 1，ANGPT1)和血管生成素2(Angiopoietin 2，ANGPT2)与Tie-2竞争性结合，ANGPT2与Tie-2结合促进Tie-2磷酸化，从而促进肿瘤细胞存活、侵袭和迁移。基于TCGA数据库分析发现，ANGPT2在GBM的表达丰度高。此外，脑胶质瘤病理分级越高，ANGPT2表达量越高，患者预后生存率越低。因此，ANGPT2具有开发为GBM诊断和治疗靶点的潜力。多肽与单抗相比具有分子量小、能够穿过血脑屏障等特点，是研发脑胶质瘤诊断和治疗药物的重要配体分子。目前，尚无针对ANGPT2蛋白用于脑胶质瘤诊断和治疗的靶向多肽，急需能够与ANGPT2蛋白特异结合的分子探针，用于GBM的临床诊断和治疗。
发明内容
基于上述背景，本发明设计一种与AGNPT2蛋白结合模式和亲和力最佳的多肽配体，最终得到靶向AGNPT2蛋白的多肽序列。设计、合成了一种对人脑胶质瘤细胞移植瘤具有特异靶向性的放射性分子探针，探究了细胞实验和放射性核素99mTcO标记GSF对脑胶质瘤细胞U87-MG细胞移植瘤的靶向作用，结果表明GSF对脑胶质瘤具有靶向作用，具有显像脑胶质瘤的潜在应用价值。
本发明的目的之一是提供一种靶向AGNPT2蛋白的多肽，其氨基酸序列如下所示：GSFIHSVPRH(甘氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-组氨酸-丝氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-组氨酸，Gly-Ser-Phe-Ile-His-Ser-Val-Pro-Arg-His)，缩写为GSF。
本发明设计与AGNPT2蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，鉴定所述多肽与AGNPT2蛋白的亲和力。
在本发明的实施方案中，本发明鉴定所述多肽与AGNPT2蛋白的亲和力时，所使用的亲和力的鉴定方法为生物膜干涉技术，即，将20μg/mL的AGNPT2蛋白固化在NTA芯片，加入200μL浓度为100μM的多肽，通过生物膜干涉分析，得到GSF与AGNPT2的亲和力鉴定结果。
本发明的目的之二是提供一种基于上述多肽GSF的用于脑胶质瘤显像的放射性分子探针。
所述脑胶质瘤具体可为多形性胶质母细胞瘤。
本发明所提供的放射性分子探针，表示为：99mTcO-DTPA-GSF，其中，99mTcO为放射性核素，DTPA为螯合剂，GSF为靶向ANGPT2蛋白的多肽GSFIHSVPRH，
其中，靶向AGNPT2蛋白的多肽GSFIHSVPRH与DTPA螯合剂共价偶联，99mTcO放射性核素螯合到DTPA螯合剂上；
DTPA的结构式如下所示：
上述放射性分子探针通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)螯合剂-多肽的制备
多肽GSFIHSVPRH与DTPA-tetra(t-Bu ester)反应，纯化，得到螯合剂-多肽DTPA-GSF；
2)放射性核素标记螯合剂-多肽
向螯合剂-多肽DTPA-GSF、氯化亚锡、缓冲液的混合溶液中加入放射性核素，反应得到放射性核素标记螯合剂-多肽99mTcO-DTPA-GSF，即放射性分子探针。
上述方法步骤1)的操作为：所述多肽Fmoc-GSFIHSVPRH质谱鉴定正确后，脱除Fmoc保护基，加入摩尔倍数为3倍的DTPA-tetra(t-Bu ester)进行反应，茚三酮检测呈阴性后结束反应；通过裂解液(体积比为三氟乙酸：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝90：4：2：2：2)与直链肽树脂反应，得到脱除所有侧链保护基的直链肽；将直链肽溶解在水中，使用半制备色谱纯化，分离出纯度合格的液体，收集旋蒸冻干后即为DTPA-GSF。
上述方法步骤2)中，所述缓冲溶液为0.1M PBS缓冲液或生理盐水，pH为7.4，
DTPA-GSF与氯化亚锡、99mTcO的配比依次可为：0.1-0.2mg：60μg：2.5mCi，具体可为0.2mg：60μg：2.5mCi；
所述反应的温度可为室温，时间可为15-30min，具体可为30min；
步骤2)的操作具体可为：将DTPA-GSF溶解在超纯水，终浓度为1mg/mL，将200μLDTPA-GSF溶液与60μL 1mg/mL的氯化亚锡溶液混合在500μL的PBS，添加2.5mCi 99mTcO，室温反应30min制备得到99mTc-DTPA-GSF放射性分子探针。
上述放射性分子探针在制备脑胶质瘤诊断试剂中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，所述脑胶质瘤具体为多形性胶质母细胞瘤。
所述诊断试剂用于人脑胶质瘤细胞和生物体内脑胶质细胞移植瘤的显像。
根据本发明的实施方案，所选人脑胶质瘤细胞为U87-MG细胞，所选生物体内脑胶质细胞移植瘤为BABL/c裸鼠皮下移植瘤。
本发明所述的放射性分子探针(具体为99mTcO-DTPA-GSF)与现有技术相比，具有以下有益效果：
1)本发明利用分子对接技术设计和筛选出与ANGPT2特异性结合的靶向多肽，填补了ANGPT2高亲和力多肽配体的空白；
2)本发明制备的放射性核素标记分子探针作为脑胶质瘤的显像药物，具有显像时间长、容易制备等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1中多肽GSF的结构式。
图2为本发明实施例1中制得的多肽GSF的HPLC和MS鉴定结果。
图3为本发明实施例1中多肽GSF与ANGPT2蛋白的三维对接模型。
图4为本发明实施例2中GSF与ANGPT2蛋白的亲和力测试结果。
图5为本发明实施例3中FITC-GSF的结构式。
图6为本发明实施例3中制备的FITC-GSF的HPLC和MS鉴定结果。
图7为本发明实施例3中流式细胞仪对比U87-MG细胞对GSF的摄取情况(共培养)。
图8为本发明实施例4制备的DTPA-GSF的结构式。
图9为本发明实施例4制备的DTPA-GSF的HPLC和MS鉴定结果。
图10为本发明实施例4制备的99mTcO-DTPA-GSF的TLC检测结果。
图11为本发明实施例4制备的99mTcO-DTPA-GSF的体外稳定性实验结果。
图12为本发明实施例4中U87-MG细胞对99mTcO-DTPA-GSH的摄取结果。**p﹤0.01。
图13为本发明实施例5中接种U87-MG细胞的BABL/c裸鼠经瘤体注射99mTcO-DTPA-GSH和99mTcO的SPECT/CT显像结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、GSF的合成
人工合成多肽，其序列为甘氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-组氨酸-丝氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-组氨酸，Gly-Ser-Phe-Ile-His-Ser-Val-Pro-Arg-His，简写为GSFIHSVPRH，缩写为GSF，结构式见图1；
选择替代度为0.35mmol/g的Fmoc-His(Boc)-Wang Resin树脂，溶胀后脱除Fmoc保护基。按照多肽序列，依次从C端到N端进行偶联直至Gly，取小样切割判断多肽的正确性，其中Ser、His、Arg的侧链保护基分别是tBu、Boc、pbf，所有的氨基酸都用Fmoc保护α位氨基。通过裂解液(三氟乙酸：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝90：4：2：2：2)与直链肽树脂反应，得到脱除所有侧链保护基的直链肽。将直链肽溶解在水中，使用半制备色谱纯化，分离出纯度合格的液体，收集旋蒸冻干后即目的多肽。GSF的HPLC和MS鉴定结果见图2。其与ANGPT2对接的相互作用位置结果见图3。多肽的第9位Arg与ANGPT2的第448位Asp形成盐桥，多肽的第9位Arg与ANGPT2的第450位Cys以及第451位Gly形成氢键，多肽的第10位His与ANGPT2的第476位Tyr形成氢键。
实施例2、GSF与ANGPT2蛋白的亲和力鉴定
用PBS将ANGPT2蛋白稀释成20μg/mL，用于芯片的固化，用PBST(pH 7.4)将多肽稀释成100μM。将ANGPT2蛋白溶液滴加在NTA芯片，在固化完成的NTA芯片不同孔中加入200μL的PBST(pH 7.4)作为对照，其他孔中入200μL浓度为100μM的多肽。向传感器中注入250μLPBS缓冲液(pH 7.4)，以最大流速(150μL/min)运行缓冲液，达到信号基线，将缓冲液的流速降至20μL/min，以获得较为稳定的基线。GSF与ANGPT2蛋白结合的信号见图4。结果表明，GSF与ANGPT2蛋白的结合作用较强，两者之间相互作用的平衡解离常数KD为3.43μM。
实施例3、U87-MG细胞对GSF的摄取分析
1)FITC-GSF制备
合成步骤：选择替代度为0.35mmol/g的Fmoc-His(Boc)-Wang Resin树脂，溶胀后脱除Fmoc保护基。按照多肽序列，依次从C端到N端进行偶联直至Gly，取小样切割判断多肽的正确性；其中Ser、His、Arg的侧链保护基分别是tBu、Boc、pbf；所有的氨基酸都用Fmoc保护α位氨基。确定片段多肽Fmoc-GSFIHSVPRH质谱正确后，脱除Fmoc保护基，加入摩尔倍数为3倍的FITC，进行反应，茚三酮检测呈阴性后结束反应。通过裂解液(体积比为三氟乙酸：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝90：4：2：2：2)与直链肽树脂反应，得到脱除所有侧链保护基的直链肽。将直链肽溶解在水中，使用半制备色谱纯化，分离出纯度合格的液体，收集旋蒸冻干后即为FITC-GSF。FITC-GSF的结构式见图5，HPLC和MS鉴定结果见图6。
2)U87-MG细胞摄取GSF定量和定性分析
bEnd.3和HUVEC与U87-MG细胞按照1:5的比例分别铺于Transwell的上、下室，培养48小时模拟血脑屏障和血脑肿瘤屏障，将Transwell上室中的bEnd.3和HUVEC细胞培养液吸出，加入用含10％FBS的终浓度为20μg/mL的FITC-GSF(分子量1638.8)和5.5μg/mL的FITC(分子量389.4)，37℃孵育，分别于培养后4和8小时用0.25％胰蛋白酶消化下室的U87-MG细胞，并用冷PBS洗涤3次，然后重悬于300μL冷PBS中，用于流式测定细胞荧光强度，未链接多肽的FITC作为对照。结果显示，培养8小时后，U87-MG细胞的FITC荧光强度大于4小时和FITC组，说明随着时间增加GSF能够被U87-MG细胞逐步摄取(图7)。
实施例4、99mTcO-DTPA-GSF分子探针的制备
(1)DTPA-GSF制备
选择替代度为0.35mmol/g的Fmoc-His(Boc)-Wang Resin树脂，溶胀后脱除Fmoc保护基。按照多肽序列，依次从C端到N端进行偶联直至Gly，取小样切割判断多肽的正确性；其中Ser、His、Arg的侧链保护基分别是tBu、Boc、pbf；所有的氨基酸都用Fmoc保护α位氨基。确定片段多肽Fmoc-GSFIHSVPRH质谱正确后，脱除Fmoc保护基，加入摩尔倍数为3倍的DTPA-tetra(t-Bu ester)，进行反应，茚三酮检测呈阴性后结束反应。通过裂解液(体积比为三氟乙酸：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝90：4：2：2：2)与直链肽树脂反应，得到脱除所有侧链保护基的直链肽。将直链肽溶解在水中，使用半制备色谱纯化，分离出纯度合格的液体，收集旋蒸冻干后即为DTPA-GSF。DTPA-GSF的结构式见图8，HPLC和MS鉴定结果见图9。
(2)99mTcO标记DTPA-GSF
99mTcO-DTPA-GSF放射性分子探针包括DTPA-GSF和放射性核素99mTcO，所述GSF和99mTcO用DTPA连接，其制备方法包括以下步骤：
1)99mTcO的淋洗
取生理盐水5mL，对钼锝发生器进行淋洗，收集淋洗液至负压瓶内，使用医用活度计对放射性进行检测，活度为5mCi。
2)99mTcO标记DTPA-GSF
DTPA-GSF溶解在超纯水，终浓度为1mg/mL，将200μL DTPA-GSF溶液与60μL1mg/mL的氯化亚锡溶液混合在500μL的PBS，添加2.5mCi 99mTcO，室温反应30min制备得到99mTc-DTPA-GSF放射性分子探针。使用TLC检测放射性分子探针的放射化学纯度，如图10所示，放射化学纯度为100％。
3)99mTcO-DTPA-GSF体外稳定性实验
取制备得到的放射性分子探针(100μL，100μCi)，置于1mL 10％的胎牛血清(PBS配制)中，置于37℃孵育0.5、1、2、4、6和8小时后，用TLC检测放射性分子探针的放射化学纯度。结果如图11所示，放射性分子探针在10％胎牛血清中的稳定性高，标记后8小时放射化学纯度仍为100％。
4)99mTcO-DTPA-GSF的细胞摄取实验
将U87-MG细胞接种到6孔板中孵育24小时，将步骤2)制备的99mTcO标记DTPA-GSF(约25μCi)分别添加到6孔板中，对照组添加游离99mTcO到6孔板中。培养1、2、4小时，用冷PBS洗涤细胞3次，然后用0.5mL的1M NaOH裂解细胞，用伽玛计数器Wizard 2470计数。摄取率＝细胞的伽马计数/25μCi 99mTcO的伽马计数×100％。结果显示，对照组随时间增加游离99mTcO在细胞的摄取没有显著变化，而99mTcO-DTPA-GSF随时间增加，细胞摄取增多，说明99mTcO-DTPA-GSF对U87-MG具有靶向结合作用(图12)。
实施例5、U87-MG细胞移植瘤体内显像
1)U87-MG细胞皮下瘤动物模型建立
取对数生长期的U87-MG-luc细胞，用0.25％胰酶消化后，调整细胞密度为1×105/mL，吸取5μL细胞悬液经小鼠右前肢腋下接种。
2)裸鼠的SPET/CT显像
U87-MG细胞皮下移植瘤裸鼠分为99mTcO组和99mTcO-DTPA-GSF组，99mTcO组经肿瘤注射约200μCi的99mTcO，99mTcO-DTPA-GSF组经肿瘤注射约200μCi的99mTcO-DTPA-GSF，给药后5min、0.5h、1h、2h和3h使用SPET/CT采集图像。结果显示，99mTcO组给药后5min，肿瘤有显像，但在1h、2h和3h，随着时间的推移，99mTcO逐渐扩散至全身，说明游离99mTcO没有靶向作用导致随血液循环至全身；99mTcO-DTPA-GSF组在5min、0.5h、1h、2h和3h，只在肿瘤部位有显像，且随着时间的推移，99mTcO-DTPA-GSF几乎没有发生扩散，说明由于GSF对脑胶质瘤的靶向结合作用，使放射性分子探针能够持续显像脑胶质瘤(图13)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.一种靶向AGNPT2蛋白的多肽，其氨基酸序列如下所示：GSFIHSVPRH，甘氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-组氨酸-丝氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-组氨酸，Gly-Ser-Phe-Ile-His-Ser-Val-Pro-Arg-His，缩写为GSF。
2.权利要求1所述的靶向AGNPT2蛋白的多肽在制备诊断和治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
3.一种用于脑胶质瘤显像的放射性分子探针，表示为：99mTcO-DTPA-GSF，其中，99mTcO为放射性核素，DTPA为螯合剂，GSF为靶向ANGPT2蛋白的多肽GSFIHSVPRH，靶向AGNPT2蛋白的多肽GSFIHSVPRH与DTPA螯合剂共价偶联，99mTcO放射性核素螯合到DTPA螯合剂上。
4.制备权利要求3所述的用于脑胶质瘤显像的放射性分子探针的方法，包括如下步骤：1)螯合剂-多肽的制备
多肽GSFIHSVPRH与DTPA-tetra(t-Bu ester)反应，纯化，得到螯合剂-多肽DTPA-GSF；
2)放射性核素标记螯合剂-多肽
向螯合剂-多肽DTPA-GSF、氯化亚锡、缓冲液的混合溶液中加入放射性核素，反应得到放射性核素标记螯合剂-多肽99mTcO-DTPA-GSF，即放射性分子探针。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)的操作为：多肽Fmoc-GSFIHSVPRH质谱鉴定正确后，脱除Fmoc保护基，加入摩尔倍数为3倍的DTPA-tetra(t-Bu ester)进行反应，茚三酮检测呈阴性后结束反应；通过裂解液与直链肽树脂反应，得到脱除所有侧链保护基的直链肽；将直链肽溶解在水中，使用半制备色谱纯化，分离出纯度合格的液体，收集旋蒸冻干后即为DTPA-GSF；
其中，所述裂解液的体积比为三氟乙酸：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝90：4：2：2：2。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述缓冲溶液为0.1M PBS缓冲液或生理盐水，pH为7.4，
DTPA-GSF与氯化亚锡、99mTcO的配比依次为：0.1-0.2mg：60μg：2.5mCi；
所述反应的温度为室温，时间为15-30min。
7.权利要求3所述的放射性分子探针在制备脑胶质瘤诊断试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述脑胶质瘤为多形性胶质母细胞瘤。
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