EA030461B1 - ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО НАРУШЕНИЯ, ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ, ГИПЕРЛИПИДЕМИИ, ДИАБЕТА 1 И 2 ТИПА, ПОЛИПЕПТИД АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ (AARS) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к терапевтической композиции для лечения воспалительного нарушения, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 1 и 2 типа, метаболического синдрома или сосудистых заболеваний; изолированному полипептиду аминоацил-тРНК-синтетазы; клеточной композиции для рекомбинантной продукции полипептида аминоацил-тРНК-синтетазы; вектору экспрессии; способу идентификации соединения, которое специфично связывается с полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы; способу лечения воспалительного нарушения, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 1 и 2 типа, метаболического синдрома или сосудистых заболеваний.

Description

Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/363586, поданной 12 июля 2010 г.; предварительной заявке на патент США № 61/363589, поданной 12 июля 2010 г.; и предварительной заявке на патент США № 61/363583, поданной 12 июля 2010 г., полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Положение относительно перечня последовательностей

Перечень последовательностей, приложенный к настоящему описанию, представленный в текстовом формате, полностью соответствующем бумажной копии, таким образом, включен посредством ссылки в заявку. Текстовый файл, содержащий перечень последовательностей, имеет название 120161 432РС Зесщепсе Ыкйид.Ш. Его размер составляет примерно 123 Кбайт. Указанный файл был создан 8 июля 2011 г. и представлен в электронном виде в системе ΕΡδ-АеЬ.

Область техники

Настоящее изобретение, в целом, относится к композициям, содержащим новые идентифицированные белковые фрагменты аминоацил-тРНК-синтетаз и другие белки, полинуклеотиды, которые их кодируют, и соответствующие комплементарные последовательности и родственные агенты, и к способам их применения в диагностических целях в целях поиска лекарственных средств, в исследовательских и терапевтических целях.

Уровень техники

Более четырех десятилетий аминоацил-тРНК-синтетазы (ΆΆΚ8) считаются важными белками домашнего хозяйства (Ьоикекеершд), которые катализируют аминоацилирование молекул тРНК в рамках процесса декодирования генетической информации в процессе трансляции белка. ЛЛР8 интенсивно исследовались в этом аспекте, и многие из их полноразмерных последовательностей клонировали для секвенирования, что обеспечило богатый источник для биохимических экспериментов. Однако некоторые фрагменты ЛЛР8 и другие белки обладают неожиданными видами активности, не связанными с аминоацилированием, включая активность во внеклеточной передаче сигнала, модулирующую сигнальные пути не связанным с трансляцией белка образом. В целом, указанные неожиданные виды активности не наблюдаются у полноразмерной или исходной последовательности белка; при этом они наблюдаются после удаления или резекции белковых фрагментов ΆΆΚ8 из их исходной последовательности или при экспрессии и достаточной очистке фрагмента последовательности ΆΆΚ8 и последующего исследования на предмет новых видов активности, не связанных с синтетазной активностью.

Несмотря на то что полноразмерные последовательности ΆΆΚ8 известны в течение достаточного времени, не проводилось системного экспериментального анализа для выяснения таких белковых фрагментов ΆΆΚ8 или белковых фрагментов из родственных или связанных белков или для оценки возможной роли полноразмерных белков ΆΆΚ8 в новых видах биологической активности, не связанных с синтезом аминокислот. В некоторых частях настоящего описания, указанные белковые фрагменты ΆΆΚ8, домены ΆΆΚ8 или варианты альтернативного сплайсинга ΆΆΚ8 называются резектинами. Термин резектин в широком смысле относится к части белка, которая была вырезана или резектирована (путем протеолиза, альтернативного сплайсинга, мутагенеза или рекомбинантной генной инженерии) из контекста его нативной полноразмерной или исходной последовательности белка, которая, в противном случае, часто маскирует ее новые виды биологической активности. Также не было проведено системного экспериментального анализа для исследования применения указанных резектинов в качестве биотерапевтических агентов, диагностических агентов или мишеней лекарственных средств для лечения различных медицинских состояний или анализа их возможной связи с заболеваниями человека. Так как ΆΆΚ8 являются важными генами домашнего хозяйства с известной функцией у млекопитающих, которая является критичной для жизни, они не рассматривались в качестве мишени для лекарственных средств у млекопитающих, и их не исследовали методом стандартного геномного секвенирования, биоинформатического или подобного анализа для идентификации резектинов, имеющих не синтетазную активность. Также стандартные биохимические исследования не были направлены на характеристику биологических свойств резектинов ΆΆΚ8 и их возможного терапевтического и диагностического значения, главным образом, из-за ранее показанной роли соответствующих исходных полноразмерных ΆΆΚ8. Краткое описание фигур.

На фиг. 1 показана доменная структура аспартиламиноацил-тРНК-синтетазы, с относительными положениями и размерами идентифицированных Ν-концевых полипептидов ΆΆΚ8, показанных схематически. На фиг. 1А представлены фрагменты, идентифицированные с помощью массспектрометрического анализа, на фиг. 1В представлены фрагменты, идентифицированные с помощью глубокого секвенирования транскриптомов, и на фиг. 1С представлены фрагменты, идентифицированные с помощью биоинформатического анализа.

На фиг. 2 показана доменная структура аспартиламиноацил-тРНК-синтетазы с относительными положениями и размерами идентифицированных С-концевых полипептидов ΆΆΚ8, показанных схематически. На фиг. 2А представлены фрагменты, идентифицированные с помощью масс-спектрометрического анализа, и на фиг. 2В представлены фрагменты, идентифицированные с помощью биоинформатического

- 1 030461 анализа.

На фиг. 3 показана доменная структура аспартиламиноацил-тРНК-синтетазы с относительными положениями и размерами идентифицированных внутренних полипептидов ΛΛΚδ, показанных схематически. На фиг. ЗА представлены фрагменты, идентифицированные с помощью масс-спектрометрического анализа и на фиг. ЗВ показаны фрагменты, идентифицированные с помощью биоинформатического анализа.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для лечения воспалительного нарушения, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 1 и 2 типа, метаболического синдрома или сосудистых заболеваний, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и изолированный полипептид аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΛΚδ), который является по меньшей мере на 90, 95, 98 или 100% идентичным последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 16 или 14 или ее фрагменту, который представляет собой 220 или более смежных аминокислот последовательности δΕΟ ГО N0: 16 или 14, причем указанный полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала, выбранную из модуляции захвата ацетилированных ЛПНП, модуляции высвобождения цитокинов, модуляции клеточной адгезии.

Вариантом настоящего изобретения является терапевтическая композиция, где ΛΛΚδ полипептид слит с гетерологичным полипептидом, выбранным из группы, состоящей из меток аффинной очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).

Вариантом настоящего изобретения является терапевтическая композиция, где ΛΛΚδ полипептид по меньшей мере на 98 или 100% идентичен последовательности δΕΟ ГО N0: 16 или 14.

Настоящее изобретение относится к изолированному полипептиду аминоацил-тРНК-синтетазы, который является по меньшей мере на 90, 95, 98 или 100% идентичным последовательности δΕΟ ГО N0: 16 или 14 или ее фрагменту, который представляет собой 220 или более смежных аминокислот последовательности δΕΟ ГО N0: 16 или 14, причем полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала, выбранную из модуляции захвата ацетилированных ЛПНП, модуляции высвобождения цитокинов, модуляции клеточной адгезии.

Вариантом настоящего изобретения является изолированный полипептид, где ΛΛΚδ полипептид слит с гетерологичным полипептидом, выбранным из группы, состоящей из меток аффинной очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).

Вариантом настоящего изобретения является изолированный полипептид, где ΛΛΚδ полипептид по меньшей мере на 98 или 100% идентичен последовательности δΕΟ ГО N0: 16 или 14.

Вариантом настоящего изобретения является изолированный полипептид, где к указанному полипептиду ковалентно или нековалентно присоединен по меньшей мере один фрагмент или где к указанному полипептиду присоединен твердый субстрат, где по меньшей мере один фрагмент представляет собой детектируемую метку или растворимый в воде полимер.

Настоящее изобретение относится к клеточной композиции для рекомбинантной продукции вышеуказанного полипептида аминоацил-тРНК-синтетазы (ΛΛΚδ), содержащая сконструированную популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит и экспрессирует полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид ΛΛΚδ, и бессывороточную среду, причем указанные клетки способны расти в бессывороточной среде.

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеотидную последовательность, которая кодирует вышеуказанный полипептид ΛΛΚδ.

Настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое специфично связывается с вышеуказанным полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы, включающий:

a) объединение полипептида ΛΛΚδ по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях связывания и

b) детектирование связывания полипептида ΛΛΚδ с исследуемым соединением, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с полипептидом ΛΛΚδ.

Настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного нарушения, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 1 и 2 типа, метаболического синдрома или сосудистых заболеваний путем введения вышеуказанного полипептида ΛΛΚδ.

Варианты реализации настоящего изобретения, в целом, относятся к открытию белковых фрагментов аминоацил-тРНК-синтетаз, которые обладают неканоническими видами биологической активности, такими как активность во внеклеточной передаче сигнала, и/или другими характеристиками терапевтического и диагностического значения. ΛΛΚδ являются универсальными и важными элементами системы синтеза белка, имеющейся во всех организмах, но ΛΛΚδ человека и связанные с ними белки имеют природные варианты, являющиеся результатом резекции, эффективно участвующие в клеточной передаче сигнала и принимающие участие в нормальном функционировании организма человека. Виды активности указанных белковых фрагментов отличаются от видов активности, связанных с синтезом белка, общеизвестных для ΛΛΚδ, и настоящее изобретение включает открытие и разработку указанных резекти- 2 030461 рованных белков как новых биотерапевтических агентов, новых реагентов для поисковых исследований и новых антигенов/мишеней для биологических препаратов направленного действия и диагностических агентов, которые можно применять для потенциального лечения или диагностики большого количества разнообразных заболеваний человека, таких как воспалительные, гематологические, нейродегенеративные, аутоиммунные, гематопоэтические, сердечно-сосудистые и метаболические заболевания или нарушения.

Белковый фрагмент (фрагменты) ААКБ согласно настоящему изобретению, таким образом, может называться резектином или в альтернативном варианте аппендакрином. Как отмечено выше, термин резектин происходит от процесса вырезания, или резекции, конкретного белкового фрагмент ААКБ из последовательности соответствующей полноразмерной исходной ААКБ, в которой, как правило, его неканонические виды активности маскированы. В конкретных примерах с помощью указанного процесса резекции были идентифицированы белковые фрагменты и полинуклеотиды ААКБ согласно настоящему изобретению как природные (например, протеолитические, сплайс-варианты), так и искусственные или предсказанные. Термин аппендакрин происходит от комбинации аппенд (от лат. аррепбег) и разделять или выявлять (от греч. егшек), а также отражает изолирование одного или более дополнительных доменов белковых фрагментов ААКБ из их соответствующей последовательности полноразмерного или исходного белка ААКБ.

Несмотря на то что ранее было показано, что некоторые фрагменты ААКБ обладают видами активности, не связанными с синтетазной функцией, экспрессия, изолирование, очистка и характеристика указанных фрагментов для биотерапевтического, научно-исследовательского или диагностического применения были ограничены, и для специалистов в данной области техники не является очевидным, что указанные активности связаны с каждым членом целого семейства ААКБ или с альтернативными фрагментами. В настоящем описании использовали методический подход для обнаружения и проверки белковых фрагментов ААКБ в 20 митохондриальных и 20 цитозольных ААКБ (и ассоциированных белках) для биотерапевтического применения, в целях поиска лекарственных средств и диагностического применения. Например, конкретный белковый фрагмент (фрагменты) ААКБ согласно настоящему изобретению и полинуклеотиды, которые его кодируют, идентифицированы в биологических образцах с использованием масс-спектрометрии (МС), главным образом для идентификации протеолитических фрагментов, и другие были идентифицированы с помощью методов глубокого секвенирования, главным образом в случае идентификации сплайс-вариантов. Другой белковый фрагмент (фрагменты) ААКБ идентифицирован с использованием предсказаний с помощью компьютерного моделирования аминокислотных последовательностей, например с помощью компьютерного сравнения синтетаз человека и низших организмов, наряду с определением основных границ (например, сайтов протеазы); указанный подход использовали для анализа последовательности полноразмерного ААКБ на основе специфических критериев для изолирования протеолитических фрагментов и функциональных доменов, обладающих неканоническими видами биологической активности.

Новые резектины ААКБ являются неожиданными, и их дифференциальная экспрессия также является непредвиденной. Специфические резекции, как правило, наблюдаются при различных способах обработки (например, в клетках, культивируемых в среде, содержащей и не содержащей сыворотку), на различных стадиях роста (например, мозг взрослого по сравнению с мозгом эмбриона) и в различных типах тканей (например, поджелудочная железа по сравнению с печенью). Паттерн экспрессии не одинаков для всех аминоацил-тРНК-синтетаз, несмотря на то, что канонические функции для всех аминоацилтРНК-синтетаз необходимы в одинаковых участках в клетке и на относительно пропорциональном уровне. Не следует ожидать повышения уровня активности аминоацил-тРНК-синтетазы без одновременного повышения уровня других видов активности аминоацил-тРНК-синтетазы. Данные масс-спектрометрии и глубокого секвенирования указывают на то, что резектины аминоацил-тРНК-синтетазы имеют различный уровень и встречаются в различных областях и на различных стадиях.

Кроме того, белковые фрагменты ААКБ могут быть экспрессированы и очищены до степени чистоты, достаточно высокой для распознавания их биологических свойств. Ранее фрагменты часто не соответствовали достаточной степени чистоты, укладки и стабильности для обеспечения возможности соответствующего биологического исследования несинтетазных видов активности. Клеточные анализы, например, используют в комбинации с достаточно чистыми, стабильными, растворимыми и правильно уложенными резектинами для выявления их функций, важных для биотерапевтического, научноисследовательского или диагностического применения.

В частности, варианты реализации настоящего изобретения относятся к белковым фрагментам аспартил-тРНК-синтетазы, родственным агентам и композициям, имеющим биотерапевтическую, научноисследовательскую или диагностическую применимость, и способам их применения. Композиции согласно настоящему изобретению применимы в различных диагностических целях, для разработки (поиска) лекарственных средств и в терапевтических целях, как описано в настоящем документе. Предпочтительно белки и фрагменты ЛЛКБ очищают и хранят в подходящих условиях, если они требуются для указанного применения в биотерапевтических, научно-исследовательских или диагностических целях.

- 3 030461

Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере примерно из 100, 90, 80, 70, 60, 50 или 40 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и имеет растворимость, составляющую по меньшей мере примерно 5 мг/мл, причем чистота композиции составляет по меньшей мере примерно 95% по белку, и композиция содержит меньше примерно 10 единиц эндотоксина (ЕЭ) на 1 мг белка. Согласно одному аспекту композиция представляет собой терапевтическую композицию. Согласно конкретному варианту реализации изобретения композиция, по существу, не содержит сыворотки. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения белковый фрагмент ЛЛК8 обладает неканонической активностью. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения неканоническая биологическая активность выбрана из модуляции внеклеточной передачи сигнала, модуляции пролиферации клеток, модуляции дифференцировки клеток, модуляции транскрипции генов, модуляции продукции или активности цитокинов, модуляции активности цитокиновых рецепторов и модуляции воспаления. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения ЕС₅₀ белкового фрагмента ЛЛК8 составляет меньше примерно 1 нМ, примерно 5 нМ, примерно 10 нМ, примерно 50 нМ, примерно 100 нМ или примерно 200 нМ для клеточной неканонической биологической активности.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковый фрагмент ЛЛК8 слит с гетерологичным полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения слитый белок ЛЛК8, по существу, сохраняет неканоническую активность белкового фрагмента ЛЛК8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения слитый белок ЛЛК8 подавляет неканоническую активность белкового фрагмента ААК.8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения гетерологичный полипептид присоединен к Ν-концу белкового фрагмента АЛК.8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения гетерологичный полипептид присоединен к С-концу белкового фрагмента АЛК.8. Согласно одному аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения гетерологичный полипептид выбран из группы, состоящей из меток очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция содержит белковый фрагмент ААК8 в концентрации, составляющей по меньшей мере примерно 10 мг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция содержит белковый фрагмент ААК8, который является по меньшей мере на 90% монодисперсным. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция содержит меньше примерно 3% высокомолекулярных агрегированных белков. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция характеризуется менее чем 3% агрегацией при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в РВ8 в течение одной недели при 4°С. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция характеризуется менее чем 3% агрегацией при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в РВ8 в течение одной недели при комнатной температуре.

Различные анализы для измерения указанных признаков резектинов описаны в настоящем документе и могут быть применены для определения аспектов изобретения. Согласно конкретным аспектам изобретения указанные признаки являются предпочтительными для биотерапевтического применения белковых фрагментов ААК.8, описанных в настоящем документе.

Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который отличается от аминокислотной последовательности, описанной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, заменой, делецией и/или добавлением примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот, причем измененный белковый фрагмент, по существу, сохраняет неканоническую активность неизмененного белка или имеет доминантный отрицательный фенотип в отношении неканонической активности, где растворимость указанного белкового фрагмента составляет по меньшей мере примерно 5 мг/мл и где чистота композиции составляет по меньшей мере примерно 95% (на основе белка) и указанная композиция содержит меньше примерно 10 ЕЭ/мг белка эндотоксина. Согласно конкретному варианту реализации изобретения композиция, по существу, не содержит сыворотки.

Другие варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированное антитело, которое специфично связывается с изолированным белковым фрагментом аминоацил-тРНКсинтетазы (ААК8), описанным в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, где аффинность указанного антитела к указанному белковому фрагменту ААК8 примерно в 10 раз превышает его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ААК8. Один из неожиданных аспектов настоящего изобретения включает конкретные резектины, обладающие новыми поверхностями, доступными для антитела или других нацеленных биологических агентов, тогда как в полноразмерном белке ААКЗ указанные поверхности спрятаны или закрыты другими последовательностями или соседними доменами. Процесс резекции также может приводить к получению большей доступности для воды, благодаря чему проявляются ранее не идентифицированные виды биологической активности. Некоторые варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированное антитело, которое специфично связывается с изоли- 4 030461 рованным белковым фрагментом аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), описанным в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, где аффинность антитела к белковому фрагменту ΆΛΚδ составляет по меньшей мере примерно 10 нМ и аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ΑΑΚδ составляет по меньшей мере примерно 100 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения антитело связывается с эпитопом, расположенным в уникальной границе сплайсинга полипептида ΑΑΚδ, описанной в любой из табл. 1-3, 4-6 и 7-9, или с аминокислотной последовательностью С-конца указанного сайта сплайсинга. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело проявляет антагонизм в отношении неканонической активности белкового фрагмента ΑΑΚδ. Указанные антагонисты могут необязательно связываться с соответствующей исходной или полноразмерной ΑΑΚδ.

Другие аспекты относятся к системам биоанализа, содержащим, по существу, чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и партнер по связыванию, который связывается с указанным белковым фрагментом ΑΑΚδ. Согласно одному аспекту партнер по связыванию выбран из группы, состоящей из белка-рецептора клеточной поверхности, нуклеиновой кислоты, липидной мембраны, клеточного регуляторного белка, фермента и фактора транскрипции. Необязательно, указанный рецептор может являться частью клетки, предпочтительно клетки, подходящей для выявления биологической активности резектина.

Конкретные варианты реализации изобретения включают клеточные композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и модифицированную популяцию клеток, в которых по меньшей мере одна клетка содержит полинуклеотид, кодирующий указанный белковый фрагмент ΑΑΚδ. Согласно одному аспекту указанные клетки способны расти в бессывороточной среде.

Также предложены системы выявления, содержащие, по существу, чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 50 или 100 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, клетку, которая содержит рецептор клеточной поверхности или его внеклеточную часть, которая связывается с белковым фрагментом, и молекулу, размер которой составляет меньше примерно 2000 Да, или второй полипептид, который модулирует связывание или взаимодействие между указанным белковым фрагментом ΑΑΚδ и указанным внеклеточным рецептором.

Конкретные варианты реализации включают диагностические системы, содержащие, по существу, чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и клетку, которая содержит рецептор клеточной поверхности или его внеклеточную часть, которая связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, где указанная система или клетка содержит индикаторную молекулу, которая позволяет детектирование изменения уровня или активности указанного рецептора клеточной поверхности или его внеклеточной части.

Конкретные варианты реализации изобретения включают устройства для выращивания клеток, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, модифицированную популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит полинуклеотид, кодирующий указанный белковый фрагмент ΑΑΚδ, по меньшей мере примерно 10 л бессывороточной среды для культивирования клеток и стерильный контейнер. Согласно конкретному варианту реализации изобретения клетки, используемые в любом из способов или композиций, описанных в настоящем документе, способны расти в бессывороточной среде, необязательно в присутствии антибиотика и индуктора.

Некоторые варианты реализации изобретения относятся к антисмысловым агентам или агентам РНК-интерференции (РНКи), содержащим последовательность, нацеленную против уникальной границы сплайсинга сплайс-варианта ΑΑΚδ, представленного в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9.

Также предложены терапевтические композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, где указанный белковый фрагмент специфично связывается с партнером по связыванию и имеет растворимость, составляющую по меньшей мере примерно 5 мг/мл, и при этом чистота указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 95% по белку. Согласно некоторым аспектам композиция может содержать менее чем 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка.

Также предложены композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНКсинтетазы, состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот, который является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичным аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, причем растворимость указанного белкового фрагмента составляет по меньшей мере примерно 5 мг/мл, и при этом чистота указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 95% (на основе белка), и указанная композиция содержит менее чем 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка. Согласно любому из

- 5 030461 указанных вариантов реализации изобретения композиции могут содержать белковый фрагмент ЛЛК.8. который является по меньшей мере примерно на 50%. примерно на 60%. примерно на 70%. примерно на 80%. примерно на 90% или примерно на 95% монодисперсным с точки зрения его определенной молекулярной массы. Согласно другому аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения композиции содержат меньше примерно 10% (на основе белка) высокомолекулярных агрегированных белков или меньше примерно 5% высокомолекулярных агрегированных белков или меньше примерно 4% высокомолекулярных агрегированных белков или меньше примерно 3% высокомолекулярных агрегированных белков или менее чем 2% высокомолекулярных агрегированных белков или меньше примерно 1% высокомолекулярных агрегированных белков.

Согласно другому аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения композиция демонстрирует менее чем 10% агрегацию при хранении в концентрации. составляющей по меньшей мере 10 мг/мл. в РВ8 в течение одной недели при 4°С. или демонстрирует менее чем 5% агрегацию при хранении в концентрации. составляющей по меньшей мере 10 мг/мл. в РВ8 в течение одной недели при 4°С. или характеризуется менее чем 3% агрегацией при хранении в концентрации. составляющей по меньшей мере 10 мг/мл. в РВ8 в течение одной недели при 4°С. или агрегирует меньше примерно на 2% при хранении в концентрации. составляющей по меньшей мере 10 мг/мл. в РВ8 в течение одной недели при 4°С. или характеризуется менее чем 1% агрегацией при хранении в концентрации. составляющей по меньшей мере 10 мг/мл. в РВ8 в течение одной недели при 4°С.

Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции. содержащие. по существу. чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы. состоящий по меньшей мере из 22 аминокислот. который содержит аминокислотную последовательность. описанную в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. и по меньшей мере один ковалентно или не ковалентно присоединенный к нему агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный агент представляет собой детектируемую метку. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный фрагмент представляет собой растворимый в воде полимер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный агент представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). Согласно одному аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения указанный фрагмент присоединен к Ν-концу белкового фрагмента. Согласно одному аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения указанный агент присоединен к С-концу белкового фрагмента.

Конкретные варианты реализации включают композиции. содержащие твердый субстрат. присоединенный к изолированному белковому фрагменту аминоацил-тРНК-синтетазы (ΆΆΚ8). состоящему по меньшей мере из 22 аминокислот. который содержит аминокислотную последовательность. приведенную в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. или его биологически активному фрагменту или варианту. причем растворимость указанного белкового фрагмента составляет по меньшей мере примерно 5 мг/мл. и при этом чистота композиции составляет по меньшей мере примерно 95% по белку

Также предложены композиции. содержащие связывающий агент. который специфично связывается с изолированным белковым фрагментом аминоацил-тРНК-синтетазы (ΆΆΚ8). приведенным в табл. 13. или 4-6. или 7-9. причем аффинность указанного связывающего агента к указанному белковому фрагменту составляет по меньшей мере примерно 1 нМ. Согласно одному аспекту связывающий агент связывается с эпитопом. расположенным в уникальной границе сплайсинга полипептида ЛЛР8. приведенной в любой из табл. 1-3. 4-6 и 7-9. или с С-концом аминокислотной последовательности указанного сайта сплайсинга. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения связывающий агент проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ЛЛР8.

Конкретные варианты реализации изобретения включают изолированный полипептид аминоацилтРНК-синтетазы (ΆΆΚ8). содержащий аминокислотную последовательность белкового фрагмента ЛЛР8. описанного в настоящем документе. аминокислотную последовательность. кодируемую полинуклеотидом ЛЛР8. описанным в настоящем документе. или его вариант или фрагмент. Конкретные полипептиды ЛЛР8 включают аминокислотную последовательность. которая является по меньшей мере на 80. 85. 90. 95. 98 или 100% идентичной эталонной последовательности ЛЛР8. приведенной в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. или Е2. Конкретные полипептиды ЛЛР8. по существу. состоят из аминокислотной последовательности. которая является по меньшей мере на 80. 85. 90. 95. 98 или 100% идентичной эталонной последовательности ЛЛР8. приведенной в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. или Е2. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанный полипептид обладает неканонической биологической активностью. Согласно конкретному варианту реализации изобретения указанная неканоническая биологическая активность выбрана из модуляции клеточной передачи сигнала (например. внеклеточной передачи сигнала). модуляции пролиферации клеток. модуляции миграции клеток. модуляции дифференцировки клеток. модуляции апоптоза или клеточной гибели. модуляции ангиогенеза. модуляции клеточного связывания. модуляции клеточного метаболизма. модуляции клеточного поглощения. модуляции транскрипции генов или секреции. модуляции продукции или активности цитокинов. модуляции активности цитокиновых рецепторов и модуляции воспаления.

Другие аспекты включают антитела и другие связывающие агенты. которые проявляют специфичность связывания в отношении изолированного полипептида ЛЛР8. описанного в настоящем документе.

- 6 030461 партнера по связыванию полипептида ЛЛК.8. или их комплексом. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения аффинность антитела или связывающего агента к полипептиду ΑΑΚδ примерно в 10 раз превышает его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ΑΑΚδ. Согласно конкретному варианту реализации изобретения связывающий агент выбран из пептида. пептидомиметика. аднектина. аптамера и низкомолекулярного соединения. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело или связывающий агент проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Согласно другим вариантам реализации изобретения антитело или связывающий агент проявляет агонизм в отношении неканонической активности полипептида ΑΑΚδ.

Конкретные варианты реализации изобретения включают изолированные полинуклеотиды аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ). содержащие нуклеотидную последовательность полинуклеотида ΑΑΚδ. описанную в настоящем документе. нуклеотидную последовательность. кодирующую белковый фрагмент ΑΑΚδ. описанный в настоящем документе. или его вариант. фрагмент или соответствующий комплементарный полинуклеотид. Конкретные полинуклеотиды ΑΑΚδ содержат нуклеотидную последовательность. которая является по меньшей мере на 80. 85. 90. 95. 98 или 100% идентичной эталонной последовательности полинуклеотида ΑΑΚδ или соответствующей комплементарной последовательности. приведенной в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. или Е2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной для бактериальной экспрессии. Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80% идентичной полинуклеотидной последовательности. описанной в табл. Е2.

Конкретные полинуклеотиды ΆΆΚδ состоят. по существу. из нуклеотидной последовательности. которая является по меньшей мере на 80. 85. 90. 95. 98 или 100% идентичной эталонной последовательности полинуклеотида ΑΑΚδ или его комплемента. приведенной в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. или Е2. Другие полинуклеотиды ΑΑΚδ содержат или по существу состоят из нуклеотидной последовательности. которая специфично гибридизуется с эталонным полинуклеотидом ΑΑΚδ. приведенным в табл. 1-3. или 4-6. или 7-9. или Е2. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанный полинуклеотид выбран из праймера. зонда и антисмыслового олигонуклеотида. Согласно конкретному варианту реализации изобретения указанный праймер. зонд или антисмысловой олигонуклеотид нацелен против специфической или уникальной границы сплайсинга и/или последовательности. расположенной в 3'направлении от указанного сайта сплайсинга указанного полинуклеотида ΑΑΚδ.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ в образце. включающие осуществление контакта образца с одним или более связывающими агентами. которые специфично связываются с белковым фрагментом ΑΑΚδ. описанным в настоящем документе. детектирование присутствия или отсутствия указанного связывающего агента. что обеспечивает возможность определения или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ. Другие варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ в образце. включающие анализ образца с помощью детектора. способного специфично идентифицировать указанный белковый фрагмент. описанный в настоящем документе. обеспечивая. таким образом. определение присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно конкретному варианту реализации изобретения детектор представляет собой масс-спектрометр (МС). проточный цитометр. устройство визуализации белка. тест-системы для твердофазного иммуноферментного анализа (ΕΜδΑ) или белковый микрочип. Конкретные варианты реализации изобретения включают сравнение присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ с контрольным образцом или заранее определенным значением. Конкретные варианты реализации изобретения включают исследование состояния образца для различения его от контроля. Согласно конкретному варианту реализации изобретения образец и контроль включают клетку или ткань. и способ включает осуществление различения клеток или тканей различных видов. клеток различных тканей или органов. клеток на различных стадиях клеточного развития. клеток на различных стадиях дифференцировки клеток. клеток в различных физиологических состояниях или между здоровыми и больными клетками. Например. выбранные резектины могут являться более многочисленными при таких состояниях. как стресс или инсульт.

Конкретные варианты реализации изобретения включают разработку способов и соответствующих композиций для идентификации соединения. которое специфично связывается с полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ). описанным в настоящем документе. или одним или более из его клеточных партнеров по связыванию. включающих а) объединение полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию или обоих по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях и Ь) детектирование связывания полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию или обоих с указанным исследуемым соединением. что обеспечивает идентификацию соединения. которое специфично связывается с полипептидом ΑΑΚδ или его клеточным партнером по связыванию или обоими. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение представляет собой полипептид или пептид. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. пептидомиметик или низкомолекулярное соединение. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение является агонистом неканонической биологической активности полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию. Согласно другим вариантам реализации изобретения

- 7 030461 исследуемое соединение проявляет антагонизм в отношении неканонической биологической активности полипептида ЛЛК.8 или его клеточного партнера по связыванию. Конкретные варианты реализации изобретения включают соединение, идентифицированное с помощью указанного выше способа, такое как агонист (например, низкомолекулярное соединение, пептид).

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ΆΆΚ8 в образце, включающие осуществление контакта образца с одним или более олигонуклеотидами, которые специфично гибридизуются с полинуклеотидом ЛЛК.8. описанным в настоящем документе, детектирование присутствия или отсутствия указанных олигонуклеотидов в образце, что обеспечивает возможность определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ЛЛК.8. Другие варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ЛЛК.8 в образце, включающие осуществление контакта образца по меньшей мере с двумя олигонуклеотидами, которые специфично амплифицируют полинуклеотид ΆΆΚ8, описанный в настоящем документе, проведение реакции амплификации, детектирование присутствия или отсутствия амплифицированного продукта, что обеспечивает возможность определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ΆΆΚ8. Согласно конкретному варианту реализации изобретения олигонуклеотид (олигонуклеотиды) специфично гибридизуется или специфично амплифицирует границу сплайсинга, которая является уникальной для сплайс-варианта ΆΆΚ8. Конкретные варианты реализации изобретения включают сравнение присутствия или уровня белкового фрагмента или сплайс-варианта ЛЛК.8 с контрольным образцом или заранее определенным значением. Конкретные варианты реализации изобретения включают исследование состояния образца для его отличия от контроля. Согласно конкретному варианту реализации изобретения указанный образец и контроль включают клетку или ткань, и указанный способ включает осуществление различения клеток или тканей различных видов, клеток различных тканей или органов, клеток на различных стадиях клеточного развития, клеток на различных стадиях дифференцировки клеток или здоровых и больных клеток.

Некоторые варианты реализации изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотид ΆΆΚ8, описанный в настоящем документе, полипептид ΆΆΚ8, описанный в настоящем документе, связывающий агент, описанный в настоящем документе, или соединение, идентифицированное с помощью указанного выше способа или описанное в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы модуляции клеточной активности клетки, включающие осуществление контакта указанной клетки с полинуклеотидом ΆΆΚ8, описанным в настоящем документе, полипептидом ΆΆΚ8, описанным в настоящем документе, связывающим агентом, описанным в настоящем документе, соединением, полученным согласно указанному выше способу или описанным в настоящем документе, или фармацевтической композицией, описанной в настоящем документе. Согласно конкретному варианту реализации изобретения клеточная активность выбрана из пролиферации клеток, миграции клеток, дифференцировки клеток, апоптоза или клеточной гибели, клеточной передачи сигнала, ангиогенеза, клеточного связывания, клеточного поглощения, клеточной секреции, метаболизма, продукции или активности цитокинов, активности цитокиновых рецепторов, транскрипции генов и воспаления. Согласно одному аспекту клетка выбрана из группы, состоящей из пре-адипоцитов, клеток костного мозга, нейтрофилов, клеток крови, гепатоцитов, астроцитов, мезенхимальных стволовых клеток и клеток скелетной мускулатуры. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения клетка находится в теле субъекта. Конкретные варианты реализации изобретения включают лечение субъекта, где указанный субъект страдает состоянием, связанным с неопластическим заболеванием, заболеванием или состоянием иммунной системы, инфекционным заболеванием, метаболическим заболеванием, воспалительным нарушением, нервным/неврологическим заболеванием, мышечным/сердечно-сосудистым заболеванием, заболеванием, связанным с нарушением кроветворения, заболеванием, связанным с нарушением ангиогенеза, или заболеванием, связанным с нарушением выживаемости клеток.

Также предложены способы получения фармацевтического соединения, включающие а) проведение скрининга ίη νίίτο одного или более кандидатов соединения в присутствии белкового фрагмента ΆΆΚ8, состоящего по меньшей мере из 22 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с белковым фрагментом ΆΆΚ8; Ь) проведение клеточного или биохимического или рецепторного анализа соединения, идентифицированного на этапе а), с идентификацией соединения, которое модулирует один или более видов неканонической активности белкового фрагмента ЛЛК.8; с) необязательно, оценку зависимости активности от структуры ЩгисЩгс-асЩ'Пу ΓοΙαΙίοηδΗίρ, 8ЛК) соединения, идентифицированного на этапе Ь) с соотнесением его структуры со способностью к модуляции неканонической активности и, необязательно, дериватизацию соединения с изменением его способности модулировать неканоническую активность и б) производство достаточного количества соединения, идентифицированного на этапе Ь) или дериватизация соединения, полученного на этапе с), для применения у людей, таким образом, для изготовления фармацевтического соединения.

- 8 030461

Другие варианты реализации изобретения включают способы получения фармацевтического соединения, включающие а) проведение скрининга ίη νίίτο одного или более кандидатов соединения в присутствии рецептора клеточной поверхности или его внеклеточной части, которая специфично связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, описанным в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с рецептором клеточной поверхности или его внеклеточной частью; Ь) проведение клеточного или биохимического или рецепторного анализа с соединением, идентифицированным на этапе а), с идентификацией соединения, которое модулирует один или более видов неканонической активности белкового фрагмента ΆΛΚδ; с) необязательно, оценку зависимости активности от структуры (δΑΚ) соединения, идентифицированного на этапе Ь), с соотнесением его структуры с модуляцией неканонической активности и, необязательно, дериватизацию соединения с изменением его способности модулировать указанную неканоническую активность; и ά) производство достаточного количества соединения, идентифицированного на этапе Ь), или дериватизированного соединения, полученного на этапе с), для применения у людей, таким образом, для изготовления фармацевтического соединения.

Некоторые варианты реализации изобретения включают клеточную композицию, содержащую модифицированную популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит полинуклеотид, кодирующий гетерологичный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), где указанные клетки способны расти в бессывороточной среде. Согласно одному аспекту полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы содержит гетерологичную метку очистки или эпитопную метку, обеспечивающую облегчение очистки белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно другому аспекту полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы содержит гетерологичный сайт протеолиза, обеспечивающий продукцию белкового фрагмента ΑΑΚδ при расщеплении.

Некоторые варианты реализации изобретения включают способ получения полипептида ΑΑΚδ, приведенного в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или Е2, ίη δίΐιι в клетке, включающий ί) экспрессию гетерологичного полноразмерного белка аминоацил-тРНК-синтетазы в клетке, причем указанная клетка содержит протеазу, способную расщеплять указанный гетерологичный полноразмерный белок аминоацил-тРНКсинтетазы с получением полипептида ΑΑΚδ.

Некоторые варианты реализации изобретения включают способ продукции полипептида ΑΑΚδ, приведенного в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или Е2, включающий осуществление контакта изолированного полноразмерного белка аминоацил-тРНК-синтетазы с протеазой, которая способна расщеплять полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы, и продукцию полипептида ΑΑΚδ.

Некоторые варианты реализации изобретения включают модифицированный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы, содержащий гетерологичный сайт протеолиза для обеспечения протеолитической генерации белкового фрагмента ΑΑΚδ, приведенного в любой из табл. 1-3, 4-6 и 7-9, или Е2.

Некоторые варианты реализации изобретения включают композицию, содержащую изолированный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы, причем чистота указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 95% (на основе белка), и указанная композиция содержит меньше примерно 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка и, по существу, не содержит сыворотки. Согласно одному аспекту полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, и является по меньшей мере на 90% монодисперсным. Другой вариант реализации изобретения включает способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного нарушенной регуляцией экспрессии, активности или пространственно-временного расположения тРНК-синтетазы, посредством введения белкового фрагмента ΑΑΚδ или нуклеиновой кислоты, кодирующей белковый фрагмент ΑΚΚδ, приведенный в любой из табл. 1-3, 4-6 и 7-9, или Е2. Согласно одному аспекту настоящего изобретения заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, нейропатии, диабета и воспалительных нарушений.

Подробное описание изобретения

I. Введение.

Настоящее изобретение относится по меньшей мере отчасти к поиску новых полипептидов ΑΑΚδ и способов их получения и применения, которые включают трансформацию нативных белков дикого типа в новые формы, которые проявляют значительно отличающиеся характеристики по сравнению с природными генами полноразмерной аспартил-тРНК-синтетазы. Указанные полипептиды ΑΑΚδ были идентифицированы на основе глубокого анализа последовательности и масс-спектрометрического анализа экспрессированной аспартил-тРНК-синтетазы в различных тканях с последующей системной продукцией и тестированием каждого потенциального полипептида ΑΑΚδ для идентификации белковой последовательности, которая предоставляет стабильные и растворимые белковые домены, проявляющие новые биологические активности и благоприятные терапевтические характеристики для лекарственного средства.

На основе указанного анализа были идентифицированы по меньшей мере семь новых семейств полипептидов ΑΑΚδ, полученных из аспартил-тРНК-синтетазы.

Согласно первому аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ включают полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 1-274 аминокислоты аспартил-тРНК-синтетазы.

- 9 030461

Согласно второму аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ содержат полипептидные последовательности, содержащие приблизительно ί) 1-41+73-50, ίί) 1-141+189-501 или ίίί) 1-319+369-501 альтернативно сплайсированные аминокислоты аспартил-тРНКсинтетазы.

Согласно третьему аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΆΛΚδ содержат полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 1-22 аминокислоты аспартил-тРНК-синтетазы + альтернативно сплайсированный слитый белок из 63 аминокислот.

Согласно четвертому аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ содержат полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 297-501 амино кислоты аспартил-тРНК-синтетазы.

Согласно пятому аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ содержат полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 101-501 аминокислоты аспартил-тРНК-синтетазы.

Согласно шестому аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ содержат полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 38-292 аминокислоты аспартил-тРНК-синтетазы.

Согласно седьмому аспекту указанные производные от аспартил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ содержат полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 23-154 аминокислоты аспартил-тРНК-синтетазы.

Указанные новые семейства полипептидов ΑΑΚδ представляют собой новые, ранее неизвестные белковые продукты, которые проявляют, среди прочего, ί) новую биологическую активность, ίί) благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка и ίίί) способность экспрессироваться и продуцироваться на высоком уровне в прокариотических системах экспрессии, которые являются, по существу, отличающимися характеристиками, не обнаруживаемыми в интактных белках дикого типа.

II. Определения.

Если иное не указано, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как и общепринятое значение для специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, могут применяться для практического осуществления или проверки настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. В целях настоящего изобретения, следующие термины определены ниже.

Употребление существительного в единственном числе в настоящем описании относится к одному, или более чем одному (т.е. по меньшей мере одному) указанному существительному. В качестве примера элемент означает один элемент или более одного элемента.

Термин примерно подразумевает количество, уровень, значение, число, частоту, процент, расстояние, размер, содержание, массу или длину, которая варьирует не более чем на 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% по сравнению с указанным количеством, уровнем, значением, числом, частотой, процентом, расстоянием, размером, содержанием, массой или длиной.

Термин агонист относится к молекуле, которая усиливает или имитирует активность. Например, неканоническую биологическую активность ΑΑΚδ или другого белка. Агонисты могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводороды, низкомолекулярные соединения или любое другое соединение или композицию, которая модулирует активность ΑΑΚδ либо путем непосредственного взаимодействия с ΑΑΚδ или его партнером по связыванию, либо путем действия на компоненты биологического пути, в котором ΑΑΚδ принимает участие. Включены частичные и полные агонисты.

В настоящем описании термин аминокислота означает как природные, так и неприродные аминокислоты, так же как и аминокислотные аналоги и миметики. Природные аминокислоты включают 20 (Ъ)-аминокислот, которые используются в ходе биосинтеза белка, так же как и другие, такие как 4-гидроксипролин, гидроксилизин, десмозин, изодесмозин, гомоцистеин, цитруллин и орнитин, например. Неприродные аминокислоты включают, например, (О)-аминокислоты, норлейцин, норвалин, пфторфенилаланин, этионин и т.п., которые известны специалистам в данной области техники. Аминокислотные аналоги включают модифицированные формы природных и неприродных аминокислот. Указанные модификации могут включать, например, замену или замещение химических групп и фрагментов аминокислот или дериватизацию аминокислот. Аминокислотные миметики включают, например, органические структуры, которые обладают функционально сходными свойствами, такие как заряд и расстояние между зарядами эталонной аминокислоты. Например, органическая структура, которая имитирует аргинин (Αγ§ или Κ), имеет положительно заряженный фрагмент, расположенный в таком же молекулярном пространстве и имеющий такую же степень подвижности, как е-амино группа боковой цепи природных Лгд аминокислот. Миметики также включают неестественные структуры, созданные для поддержания оптимального расстояния и взаимодействия между зарядами аминокислоты или функциональных групп аминокислоты. Специалисты в данной области техники знают или могут определить, какие структуры составляют функционально эквивалентные аналоги и миметики аминокислот.

- 10 030461

Согласно конкретным аспектам изобретения применение неприродных аминокислот может использоваться для модификации (например, повышения) выбранной неканонической активности белкового фрагмента ΑΑΚδ или для изменения ίη νινο или ίη νίίτο периода полувыведения белка. Неприродные аминокислоты также можно применять для облегчения (селективного) химических модификаций (например, пегилирования) белка ΆΛΚδ. Например, конкретные неприродные аминокислоты позволяют селективное присоединение полимеров, таких как полиэтиленгликоль, ПЭГ, к данному белку и, таким образом, улучшают их фармакокинетические свойства.

Конкретные примеры аминокислотных аналогов и миметиков могут быть найдены, например, в источниках КоЬсгй апй Уе11ассю, Тйе РерННе8: Лпа1у818, δνηΐΐιοδ®. Βίοίοβν. ЕН8. Сго88 ηηά МстНоГсг. νοί. 5, р. 341, ЛсаНепис Рге88, 1пс., №υ ΥοιΚ Ν.Υ. (1983), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Другие примеры включают пералкилированные аминокислоты, в частности перметилированные аминокислоты. См., например, СοтЬ^ηаίο^^а1 СНет18йу, ЕН8. \νί18οη ;шН С/апиС СН. 11, р. 235, ΙοΗη \УПеу & δοη8 1пс., №υ ΥοιΊν Ν.Υ. (1997), полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки. Другие примеры включают аминокислоты, амидная часть которых (и, следовательно, амидный каркас полученного в результате пептида) замещена, например, на сахарное кольцо, стероид, бензодиазепин или карбоцикл. См., например, Вигдег'8 Мейюша1 СНепп81гу анН Эгид ^^8сονе^у, ЕН. МамГгей Ε. ^ο1ΓΓ, СН. 15, р. 619-620, ΙοΗη XV Псу & δοη8 1пс., Νου ΥοιΊν Ν.Υ. (1995), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Способы синтеза пептидов, полипептидов, пептидомиметиков и белков хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США № 5420109; М. Вοάаηζ8ку, Ргшщр1е8 οΓ РерОНе δνηίΗθ8ΐ8 (1^8ί еН. & 2^ηά геу. ей.), δρη^οΓ-νοτ^, Νου ΥοιΊν Ν.Υ. (1984 & 1993), см. главу 7; δίογ-πη анН Υοικίβ, δο1ίά РНа8е РерННе δνηίΗθ8ΐ8, (2^ηά ей.), Р1егсе СНетка1 СЬ., ΚοскΓο^й, 111. (1984), каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки). Соответственно, полипептиды ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению могут состоять из природных и неприродных аминокислот, так же как и аминокислотных аналогов и миметиков.

Термин антагонист относится к молекуле, которая снижает или ослабляет активность. Например, неканоническую биологическую активность ΑΑΚδ или другого белка. Антагонисты могут включать белки, такие как антитела, нуклеиновые кислоты, углеводороды, низкомолекулярные соединения или любое другое соединение или композицию, которая модулирует активность ΑΑΚδ или его партнера по связыванию, либо путем непосредственного взаимодействия ΑΑΚδ или его партнером по связыванию, либо путем действия на компоненты биологического пути, в котором ΑΑΚδ принимает участие. Включены частичные и полные антагонисты.

Термин аминоацил-тРНК-синтетаза, в целом, относится к ферментам, которые в своей природной форме или форме дикого типа способны катализировать сложную этерификацию конкретной аминокислоты или ее предшественника с одной из всех совместимых с ней узнаваемых молекул тРНК с образованием аминоацил-тРНК. В соответствии с указанной традиционной активностью аминоацил-тРНКсинтетазы катализируют двухэтапную реакцию: во-первых, они активируют соответствующие аминокислоты путем образования аминоациладенилата, в котором карбоксил аминокислоты связывается с альфа-фосфатом АТФ путем замещения пирофосфата, и затем, когда связывается правильная тРНК, аминоацильная группа аминоациладенилата превращается в 2'- или 3'-концевой ОН тРНК.

Аминоацил-тРНК-синтетазы I класса, как правило, содержат два мотива с высоко консервативными последовательностями. Указанные ферменты аминоацилируют аденозиновый нуклеотид в положении 2'ОН и обычно являются мономерными или димерными. Аминоацил-тРНК-синтетазы II класса, как правило, содержат три мотива с высоко консервативными последовательностями. Указанные ферменты аминоацилируют тот же аденозин в положении 3'-ОН и обычно являются димерными или тетрамерными. Активные сайты ферментов II класса в основном состоят из β-листа, состоящего из семи антипараллельных цепей, фланкируемого α-спиралями. Несмотря на то что фенилаланин-тРНК-синтетаза относится ко II классу, она производит аминоацилирование в положении 2'-ОН.

Полипептиды ΑΑΚδ включают источники митохондриальных и цитоплазматических форм тирозил-тРНК-синтетаз (ТуτΚδ), триптофанил-тРНК-синтетаз (ΤιρΚδ), глутаминил-тРНК-синтетаз (Ο1ηΚδ), глицил-тРНК-синтетаз (Ο^Κδ), гистидил-тРНК-синтетаз (Ηΐ8Κδ), серил-тРНК-синтетаз (δοτΗδ), фенилаланил-тРНК-синтетаз (РНе^), аланил-тРНК-синтетаз (Α18Κδ), аспарагинил-тРНК-синтетаз (Α8ηΚδ), аспартил-тРНК-синтетаз ^8р^), цистеинил-тРНК-синтетаз (Су8^), глутамил-тРНК-синтетаз (Ο1ηΚδ), пролил-тРНК-синтетаз (Рго^), аргинил-тРНК-синтетаз (ΑΓβΚδ), изолейцил-тРНК-синтетаз (ΠοΚδ)„ лейцил-тРНК-синтетаз (Ьеи^), лизил-тРНК-синтетаз (Ьу8^), треонил-тРНК-синтетаз (ΤΗτΚδ), метионилтРНК-синтетаз (Ме®5) или валил-тРНК-синтетаз ^а1^). Последовательности дикого типа или исходные последовательности указанных полипептидов ΑΑΚδ известны в данной области техники.

Кодирующая последовательность означает любую последовательность нуклеиновых кислот, которая участвует в кодировании полипептидного продукта гена. Термин некодирующая последовательность, наоборот, относится к любой последовательности нуклеиновых кислот, которая не участвует в кодировании полипептидного продукта гена.

- 11 030461

В тексте настоящего описания, если иное не вытекает из контекста, следует понимать, что слова включает, содержит и содержащий подразумевают включение приведенного этапа или элемента или группы этапов или элементов, но не исключение любых других этапов или элементов или групп этапов или элементов.

Состоящий из означает включение и ограничение теми элементами, которые следуют за фразой состоящий из. Таким образом, фраза состоящий из указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или являются обязательными, и что другие элементы не могут присутствовать. Состоящий, по существу, из означает включение любых элементов, перечисленных после указанной фразы, и ограничение другими элементами, которые не препятствуют или не вносят вклад в активность или действие, заявленное в настоящем описании для перечисленных элементов. Таким образом, фраза по существу, состоящий из указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или являются обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать в зависимости от того, влияют ли они значительно на активность или действие перечисленных элементов.

Фраза свободный от эндотоксина или по существу, не содержащий эндотоксина в целом относится к композициям, растворителям и/или емкостям, которые содержат не более чем следовые количества (например, количества, не оказывающие клинических нежелательных физиологических эффектов у субъекта) эндотоксина и предпочтительно не поддающиеся выявлению количества эндотоксина. Эндотоксины представляют собой токсины, связанные с конкретными бактериями, как правило, грамотрицательными бактериями, несмотря на то, что эндотоксины могут быть найдены в грамположительных бактериях, таких как ЫИепа топосу1одепе5. Наиболее распространенные эндотоксины представляют собой липополисахариды (ΚΡδ) или липоолигосахариды (Τ0δ), обнаруживаемые в наружной мембране различных грамотрицательных бактерий и являющиеся основным патогенным элементом, придающим способность указанным бактериям вызывать заболевание. Малые количества эндотоксина у людей могут вызывать лихорадку, снижение кровяного давления и активацию воспаления и коагуляцию, среди прочих нежелательных физиологических эффектов.

Таким образом, при фармацевтическом получении полипептидов ΛΛΚδ часто является желательным удалять большую часть или все следы эндотоксина из лекарственных продуктов и/или лекарственных контейнеров, так как даже малые количества могут вызывать нежелательные эффекты у людей. Для указанной цели может использоваться печь для удаления пирогенов, так как для разрушения большинства эндотоксинов, как правило, требуются температуры выше 300°С. Например, в случае материалов первичной упаковки, такой как шприцы или ампулы, комбинация температуры стекла 250°С и время выдержки 30 мин часто является достаточным для достижения снижения уровня эндотоксина на 3 1од. Предусмотрены и другие способы удаления эндотоксинов, включая, например, способы хроматографии и фильтрации, описанные в настоящем документе и известные в данной области техники. Также включены способы производства полипептидов ΛΛΚδ в и изолирование их из указанных эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих, со сниженным, если не устраненным, риском присутствия эндотоксинов в композиции согласно изобретению. Предпочтительными являются способы производства полипептидов ΛΛΚδ в свободных от сыворотки клетках и изолирования их из указанных свободных от сыворотки клеток. Указанные композиции, содержащие полипептиды ΛΛΚδ, предоставляют собой новые лекарственные формы, которые проявляют новые биологические и терапевтические характеристики, не наблюдаемые у композиций на основе полипептида ΛΛΚδ, загрязненных сывороткой или эндотоксином, который имеет потенциальную способность связываться с полипептидами ΛΛΚδ и изменять их новые биологические свойства.

Эндотоксины могут быть детектированы с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Например, анализ лизата амебоцитов мечехвоста Ыти1и8 ро1урйети8, в котором используется кровь указанного мечехвоста, представляет собой очень чувствительный анализ для выявления присутствия эндотоксина, и реагенты, наборы и приборы для выявления эндотоксина на основе указанного анализа являются коммерчески доступными, например, в компании Ьоп/а Сгоир. В указанном анализе очень низкий уровень ΤΡδ может вызывать поддающуюся выявлению коагуляцию лизата Ь1ти1и8 из-за интенсивного ферментативного каскада, амплифицирующего указанную реакцию. Эндотоксины также можно количественно оценивать с помощью иммуноферментного анализа (ΕΜδΛ). Уровень эндотоксина, по существу, в свободной от эндотоксина композиции может быть меньше примерно 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка. Как правило, 1 нг липополисахарида (ΚΡδ) соответствует примерно 1-10 ЕЭ (единицам эндотоксина).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения чистота любого конкретного агента (например, белкового фрагмента ΛΛΚδ) в композиции может быть специально определена. Например, конкретные композиции могут содержать агент, который является по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% чистым, включая все десятичные дроби между ними, по результатам измерения с помощью методов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД), хорошо известную форму колоночной хроматографии, часто используемую в биохимии и аналитической химии для разделения, идентификации и количественной

- 12 030461 оценки соединений.

В настоящем описании термины функция и функциональный и т.п. относятся к биологической, ферментативной или терапевтической функции.

Ген означает единицу наследования, которая может занимать специфический локус хромосомы и содержит транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности и/или кодирующую область и/или нетранслируемые последовательности (т.е. интроны, 5'- и З'-нетранслируемые последовательности).

Гомология относится к процентному числу аминокислот, которые являются идентичными или составляют консервативные замены. Гомологию можно определить с использованием программ для сравнения последовательностей, таких как ОЛР (Оеуегаих с1 а1., 1984, Νυοίοίο Λείάδ Кекеатей, 12, 387-395), которые включены в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, последовательности одинаковой или, по существу, разной длины с последовательностями, приведенными в настоящем описании, можно сравнивать путем внесения пропусков в выравнивание, где указанные пропуски определяются, например, с помощью алгоритма сравнения, используемого программой ОЛР.

Термин клетка-хозяин включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть реципиентом любого рекомбинантного вектора (векторов), изолированного полинуклеотида или полипептида согласно изобретению. Клетки-хозяева включают потомство одной хозяйской клетки, и указанное потомство необязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по общей комплементарности ДНК) оригинальной исходной клетке из-за природной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения. Клетка-хозяина включает клетки, трансфицированные или инфицированные ίη νίνο или ίη νίΐτο рекомбинантным вектором или полинуклеотидом согласно изобретению. Клеткахозяин, которая содержит рекомбинантный вектор согласно изобретению, представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина.

Термин изолированный обозначает материал, который по существу или не по существу свободен от компонентов, которые в норме окружают его в его нативном состоянии. Например, изолированный полинуклеотид в настоящем описании включает полинуклеотид, который был очищен из последовательности, фланкирующей его в его природном состоянии, например фрагмент ДНК, который был выделен из последовательностей, которые в норме находятся рядом с фрагментом. В альтернативном варианте изолированный пептид или изолированный полипептид и т.п. в настоящем описании включает ίη νίΐτο изолирование и/или очистку молекулы пептида или полипептида из ее природного клеточного окружения и от ее связи с другими компонентами клетки; т.е. указанная молекула является значительно не связанной с веществами ίη νίνο.

Термин мРНК или иногда употребляемый термин мРНК-транскрипт в настоящем описании, включает, но не ограничивается перечисленными, пре-мРНК-транскрипт (транскрипты), промежуточные продукты процессинга транскрипта, зрелую (зрелые) мРНК, готовую к трансляции и транскрипции гена или генов, или нуклеиновые кислоты, которые являются производными транскрипта (транскриптов) мРНК. Процессинг транскриптов может включать сплайсинг, редактирование и разрушение. В настоящем описании нуклеиновая кислота, произошедшая из мРНК-транскрипта, относится к нуклеиновой кислоте, для синтеза которой мРНК-транскрипт или его субпоследовательность в конечном итоге служит в качестве матрицы. кДНК, обратно транскрибированная из мРНК, РНК, транскрибированная из указанной кДНК, ДНК, амплифицированная из кДНК, РНК, транскрибированная из амплифицированной ДНК, и т.д., являются происшедшими из мРНК-транскрипта, и детектирование таких производных продуктов указывает на присутствие и/или избыток исходного транскрипта в образце. Таким образом, полученные из мРНК образцы включают, но не ограничиваются перечисленными, мРНК-транскрипты гена или генов, кДНК, обратно транскрибированную из мРНК, кРНК, транскрибированную из кДНК, ДНК, амплифицированую из генов, РНК, транскрибированную из амплифицированной ДНК и т.п.

Неканонические виды активности в настоящем описании, в целом, относятся либо ί) к новым видам активности, которыми обладает полипептид ААК.8 согласно изобретению, которыми не обладает в какой-либо значительной степени интактный нативный полноразмерный исходный белок, либо ίί) виды активности, которыми обладал интактный нативный полноразмерный исходный белок, причем полипептид АЛК8 либо проявляет значительно более высокую (т.е. по меньшей мере на 20% превышающую) специфическую активность по сравнению с интактным нативным полноразмерным исходным белком, либо проявляет активность в новом контексте; например, в результате выделения указанной активности из других видов активности, которыми обладает интактный нативный полноразмерный исходный белок. В случае полипептидов АЛК8 неограничивающие примеры неканонических видов активности включают внеклеточный сигналинг, связывание с РНК, связывание с аминокислотами, модуляцию пролиферации клеток, модуляцию миграции клеток, модуляцию дифференцировки клеток (например, гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза), модуляцию транскрипции генов, модуляцию апоптоза или других форм клеточной гибели, модуляцию клеточной передачи сигнала, модуляцию клеточного поглощения или секреции, модуляцию ангиогенеза, модуляцию клеточного связывания, модуляцию клеточного метаболизма, модуляцию продукции или активности цитокинов, модуляцию активности цитокиновых рецепторов, модуляцию воспаления и т. п.

- 13 030461

Термин полумаксимальная эффективная концентрация или ЕС₅₀ относится к концентрации белкового фрагмента ΑΑΚδ, антитела или другого агента, описанного в настоящем документе, при которой вызываемый им эффект находится посередине между исходным и максимальным эффектом после некоторого определенного времени воздействия; ЕС₅₀ для кривой зависимости эффекта от определенной дозы, таким образом, обозначает концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения ЕС₅₀ агента, предложенного в настоящем описании, указывается в отношении неканонической активности, как отмечено выше. ЕС₅₀ также обозначает плазматическую концентрацию, необходимую для достижения 50% максимального эффекта ίη νίνο. Подобным образом, ЕС₉₀ относится к концентрации агента или композиции, при которой наблюдается 90% ее максимального эффекта. ЕС₉₀ можно рассчитать из ЕС₅₀ и наклона кривой зависимости или можно определить непосредственно из данных с использованием стандартных навыков в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения значение ЕС₅₀ белкового фрагмента ΑΑΚδ, антитела или другого агента составляет меньше примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нМ. Предпочтительно значение ЕС₅₀ биотерапевтической композиции составляет примерно 1 нМ или менее.

Термин модуляция включает повышение или стимулирование, а также снижение или уменьшение, как правило, на статистически значимом или физиологически значимом уровне, по сравнению с контролем. Соответственно, модулятор может представлять собой агонист, антагонист или любую их смесь в зависимости от используемых условий. Повышенное или увеличенное количество, как правило, является статистически значимым количеством и может включать повышение в 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, в 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные дроби между ними, превышающие 1, например 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, и т.д.) количества, продуцируемого в отсутствие композиций (в отсутствие агента или соединения), или контрольной композиций. Сниженное или уменьшенное количество, как правило, представляет собой статистически значимое количество и может включать снижение на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% количества, продуцируемого в отсутствие композиций (в отсутствие агента или соединения) или в присутствии контрольной композиции, включая все целые числа между ними. В качестве одного неограничивающего примера контроль для сравнения традиционных и неканонических видов активности может включать сравнение интересующего белкового фрагмента ΑΑΚδ с его соответствующим полноразмерным белком ΑΑΚδ или фрагмента ΑΑΚδ, обладающего сравнимыми традиционными видами активности, с его соответствующим полноразмерным ΑΑΚδ. Другие примеры статистически значимых количеств описаны в настоящем документе.

Полученный из (производный) означает, что образец, такой как, например, полинуклеотидный экстракт или полипептидный экстракт, был выделен или получен из конкретного источника субъекта. Например, экстракт может быть получен из ткани или биологической жидкости, непосредственно изолированной из субъекта. Производный или полученный из также может относиться к источнику полипептидной или полинуклеотидной последовательности. Например, последовательность ΆΛΚδ согласно настоящему изобретению может происходить из информации последовательности протеолитического фрагмента ΑΑΚδ или сплайс-варианта ΑΑΚδ или его части, полученной естественным или искусственным путем, и, таким образом, может содержать, по существу состоять из или состоять из указанной последовательности.

Термины полипептид и белок являются взаимозаменяемыми в настоящем описании и относятся к полимеру аминокислотных остатков и к их вариантам и синтетическим и природным аналогам. Таким образом, указанные термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются синтетическими неприродными аминокислотами, такими как химический аналог соответствующей природной аминокислоты, так же как и природным аминокислотным полимерам и их природным химическим производным. Указанные производные включают, например, продукты посттрансляционной модификации и разрушения, включая пироглутамил, изоаспартил, протеолитические, фосфорилированные, гликозилированные, оксиленные, изомеризованные и дезаминированные варианты эталонного фрагмента ΑΑΚδ.

Фразы идентичная по последовательности или, например, содержащий последовательность, на 50% идентичную в настоящем описании относятся к тому, насколько последовательности являются идентичными на основе нуклеотидов или аминокислот в области окна сравнения. Таким образом, процентная идентичность по последовательности может быть рассчитана путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, С, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Αία, Рго, δθτ, ТЬг, С1у, Уа1, Ьеи, 11е, РЬе, Туг, Тгр, Ьу8, Лгд. Ηίδ, Αδρ, С1и, Αδη, С1п, Су8 и Ме!) встречается в обеих последовательностях, для получения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 для получения процентной идентичности по последовательности.

- 14 030461

Термины, используемые для описания отношений между двумя или более последовательностями полинуклеотидов или полипептидов, включают эталонную последовательность, окно сравнения, идентичность по последовательности, процентную идентичность по последовательности и фактическую идентичность. Эталонная последовательность составляет по меньшей мере 12, но часто от 15 до 18 и часто по меньшей мере 25 мономерных единиц, включая нуклеотиды и аминокислотные остатки, в длину. Так как каждый из двух полинуклеотидов может содержать (1) последовательность (т.е. только часть полной полинуклеотидной последовательности), которая является одинаковой между двумя полинуклеотидами, и (2) последовательность, которая различается между двумя полинуклеотидами, сравнения по последовательности между двумя (или более) полинуклеотидами, как правило, проводятся путем сравнения по последовательности двух полинуклеотидов в пределах окна сравнения для идентификации и сравнения ограниченных участков подобия по последовательности. Окно сравнения относится к смысловому сегменту, состоящему по меньшей мере из 6 заменимых положений, обычно примерно от 50 до примерно 100, чаще от примерно 100 до примерно 150, в которых данная последовательность сравнивается с эталонной последовательностью, содержащей такое же количество заменимых положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Окно сравнения может включать добавления или делеции (т.е. пропуски), составляющие примерно 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции), для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательности для выравнивания окна сравнения можно проводить путем компьютерного применения алгоритмов (ОАР, ΒΕ3ΤΡΙΤ, ΡΆ3ΤΆ и ΤΡΆ3ΤΆ в программе Χνίκαοηκίη Оеиейск Зойгаге Раскаде Ке1еаке 7.0, Оеиейск С’отрШег Огоир, 575 Заеисе Όπνο Майкоп. Висконсин, США) или путем проверки и оптимального выравнивания (т.е. полученного при максимальной процентной гомологии в пределах окна сравнения), осуществленного с помощью любого из различных выбранных способов. Также следует отметить семейство программ ΒΕΆ8Τ, например, описанных Альтшулем (ΆΙΐκΛώ е! а1., 1997, Ыис1. Άα^ Кек. 25:3389). Подробное обсуждение анализа последовательности можно найти в источнике Ипй 19,3 о£ ΆиκиЬе1 е! а1., Сиггеи! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойи \νίΚ\· & 8оик 1ис, 1994-1998, глава 15.

Расчет подобия последовательности или идентичности последовательности между последовательностями (термины являются взаимозаменяемыми в настоящем описании) проводили, как описано далее. Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот последовательности выравнивали для оптимального сравнения (например, пропуски (дарк) могут вводиться в одну или в обе из первой и второй последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания и не гомологичные последовательности могут быть исключены из сравнения). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения длина эталонной последовательности, которую выравнивают в целях сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50, 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными по этому положению.

Процентная идентичность между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, одинаковых в последовательностях, с учетом числа пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей.

Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием математического алгоритма. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями определяли с использованием алгоритма Нидлмана и Вунша (№ей1етаи аий 1970, 1. Мо1. Вю1. 48:444-453), который был включен в программу ΟΆΡ пакета программного обеспечения ОСО (доступного по электронному адресу кйр://иии.дсд.сот), с использованием либо матрицы В1оккит 62, либо матрицы РАМ250 и цены пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и цены длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Согласно другому предпочтительному варианту реализации изобретения процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяли с использованием программы ΟΆΡ пакета программного обеспечения ОСО (доступного по ссылке кйр://иии.дсд.сот), с использованием матрицы NVδдар ДНК, СМР и цены пропуска 40, 50, 60, 70 или 80 и цены длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особо предпочтительный набор параметров (и тот, который следует использовать, если иное не указано) представляет собой матрицу счета В1оккит 62 (штраф за пропуск 12, штраф за продолжение пропуска 4 и штраф за пропуск сдвига рамки считывания 5).

Процентную идентичность между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями можно определить с использованием алгоритма Мейерса и Миллера (Е. Меуегк аий V. Мй1ег, 1989, СаЪюк, 4:11-17), который был включен в программу ΆΡΙ6Ν (версия 2,0), с использованием таблицы цены остатков РАМ120, штрафа за длину пропуска, равного 12, и штрафа за пропуск, равного 4.

- 15 030461

Последовательности нуклеиновых кислот и белков, описанные в настоящем документе, можно применять как искомые последовательности для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Указанные поиски можно проводить с использованием программ ΝΒΕΑδΤ и ΧΒΕΑδΤ (версия 2,0) согласно Альтшулю (ΑΙίδοΗυΙ, е( а1., 1990, I. ΜοΙ. ΒίοΙ, 215:403-10). Поиски нуклеотида в базе ΒΕΑδΤ можно осуществить с помощью программы ΝΒΕΑδΤ (очки = 100, длина слова = 12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Поиски белка в базе ΒΕΑδΤ можно осуществлять с помощью программы ΧΒΕΑδΤ (очки = 50, длина слова = 3) для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка согласно изобретению. Для получения выравнивания с пропусками (дарк) для сравнения можно использовать программу Сарреб ΒΕΑδΤ, как описано в источнике Л1(5сНи1 е( а1., 1997, ΝιιοΕία Αοί6κ Рек, 25:3389-3402. При использовании программ ΒΕΑδΤ и Сарреб ΒΕΑδΤ можно применять параметры, установленные по умолчанию для соответствующих программ (например, ΧΒΕΑδΤ и ΝΒΕΑδΤ).

Термин растворимость относится к способности агента, предложенного в настоящем описании, растворяться в жидком растворителе и образовывать гомогенный раствор. Растворимость, как правило, выражается как концентрация на основе массы растворенного вещества на единицу объема растворителя (1 г растворенного вещества на 1 кг растворителя, 1 г на 1 дл (100 мл), 1 мг/мл и т.д.), молярности, моляльности, мольной доли или других подобных единиц концентрации. Максимальное равновесное количество растворенного вещества, которое может раствориться, на количество растворителя представляет собой растворимость указанного растворенного вещества в указанном растворителе при конкретных условиях, включая температуру, давление, рН и природу растворителя. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения растворимость измеряют при физиологическом рН. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения измеряют растворимость в воде или физиологическом буфере, таком как ΡΒδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения измеряют растворимость в биологической жидкости (растворителе), таком как кровь или сыворотка. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения температура может быть примерно равна комнатной температуре (например, примерно 20, 21, 22, 23, 24, 25°С) или примерно равна температуре тела (37°С). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения агент, такой как белковый фрагмент ΑΑΚδ, имеет растворимость по меньшей мере примерно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 или 30 мг/мл при комнатной температуре или при 37°С.

Граница сплайсинга в настоящем описании включает область зрелого мРНК-транскрипта или кодируемого полипептида, в котором 3'-конец первого экзона соединяется с 5'-концом второго экзона. Размер участка может варьировать и может включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более (включая все целые числа между ними) нуклеотидных или аминокислотных остатков с любой стороны конкретных остатков, где 3'-конец одного экзона соединяется с 5'-концом другого экзона. Термин экзон относится к последовательности нуклеиновых кислот, которая представлена в зрелой форме молекулы РНК после того, как какие-либо части предшественника РНК (интроны) были удалены путем цис-сплайсинга, или две или более молекулы предшественников РНК были лигированы путем транс-сплайсинга. Зрелая молекула РНК может представлять собой матричную РНК или функциональную форму некодирующей РНК, такую как рРНК или тРНК. В зависимости от контекста экзон может относиться к последовательности в ДНК или ее РНКтранскрипте. Термин интрон относится к некодирующему участку нуклеиновой кислоты в гене, который не транслируется в белок. Некодирующие интронные участки транскрибируются с получением предшественника мРНК (пре-мРНК) и некоторых других РНК (таких как длинные некодирующие РНК) и затем удаляются путем сплайсинга во время процессинга с образованием зрелой РНК.

Термин сплайс-вариант относится к зрелой мРНК и кодируемому ею белку, который продуцируется путем альтернативного сплайсинга, процесса, в результате которого экзоны РНК (первичного транскрипта гена или пре-мРНК) заново соединяются несколькими путями во время сплайсинга РНК. Полученные в результате разные мРНК могут транслироваться в различные изоформы белка, позволяя одному гену кодировать несколько белков.

Термин субъект в настоящем описании включает любое животное, которое проявляет симптом или находится в группе риска проявления указанного симптома, который можно лечить или диагностировать с помощью полинуклеотида полипептида ΑΑΚδ или согласно изобретению. Также включены субъекты, для которых является желательным анализ уровня полипептидов и/или полинуклеотидов ΑΑΚδ согласно изобретению, в диагностических или других целях. Подходящие субъекты (пациенты) включают лабораторных животных (таких как мышь, крыса, кролик или морская свинка), сельскохозяйственных животных и домашних животных или питомцев (таких как кошка или собака). Включены приматы, отличные от человека и предпочтительно, пациенты, представляющие собой человека.

Лечение или осуществление лечения в настоящем описании включает любой желательный эффект на симптомы или патологию заболевания или состояния, на которые могут влиять неканонические виды активности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ, описанного в настоящем документе, и может включать даже минимальные изменения или улучшения одного или более измеряемых маркеров заболе- 16 030461 вания или состояния, подвергаемого лечению. Также включено лечение, которое относится к терапии без использования ААК8, в котором последовательность ААК8, описанная в настоящем изобретении, обеспечивает клинический маркер лечения. Лечение или проведение лечения необязательно означает полное устранение или вылечивание заболевания или состояния или связанных с ними симптомов. Субъект, получающий указанное лечение, представляет собой любого субъекта, нуждающегося в указанном лечении. Примеры маркеров клинического улучшения очевидны специалистам в данной области техники.

Для практического осуществления настоящего изобретения, если иное специально не указано, используют стандартные методы молекулярной биологии и рекомбинантной ДНК в пределах данной области техники, многие из которых описаны ниже в качестве иллюстрации. Указанные методы подробно описаны в литературе. См., например, 8атЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога!огу Маииа1 (3^Γά Εάίίίοη, 2000); ΌΝΑ С1отид: А Ргасйса1 АрргоасЬ, уо1. I & II (Ό. О1оуег, е0.); 0Пдопис1еоИ0е 8уи1Ьек1к (Ν. Сай, е0., 1984); 0Пдопис1еоИ0е 8уи1Ьек1к: Ме1йо08 ηηά Аррйсайоик (Р. НеМеууи, е0., 2004); №с1ею Ααά НуЬп01/аИоп (В. Натек & 8. Шддтк, епк., 1985); №с1ею Аа0 НуЬп01/аИоп: Мопеги Аррйсайоик (Βιιζάίη аи0 Ьикуаиоу, е05., 2009); Тгаиксйрйои ап0 Тгаик1айои (В. Натек & 8. Шддтк, епк., 1984); Атта1 Се11 СиНиге (К. РгекЬиеу, е0., 1986); РгекЬиеу, КД. (2005), СиЙиге оГ Атта1 Се11к, а Маииа1 оГ Вакю ТесЬтдие, 5'¹' Εά. НоЬокеи N1, 1оЬи АПеу & 8оик; В. РегЬа1, А Ргасйса1 Сш0е 1о Мо1еси1аг С1отид (3^Γά Е0111ои, 2010); Раггей, К., ^А МеΐЬοάο1οд^ек: А ЬаЬога!огу Си^е Гог 1ико1а1юи агД СЬа^асΐе^^ζайοи (3^Γά Εά^ι^οη. 2005), МеΐЬοάк оГ Егмуто1оду: ^NΑ 81гис1иге Рай А: 8уи1йек1к агД РЬукюа1 Аиа1уык оГ ^NΑ МеΐЬοάк 1и Егмуто^ду, Αсаάет^с Ргекк; иктд Αиΐ^Ьοά^ек: А ЬаЬога!огу Маииа1: РойаЬ1е Рго!осо1 № I Ьу ΕάλΜ-πά Наг1оу, Эа\Ш Ьаие, Εά Наг1о\у (1999, СоШ 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, I8ВN 0-87969-544-7); ΑийЬοά^ек: А ЬаЬога!огу Маииа1 Ьу Εά Наг1о\у (Εά^Γ), ^аν^ά Ьаие (Εά^Γ) (1988, СоШ 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, I8ВN 0-87969-3, 4-2), 1855. НагЛЬоок оГ Эгид 8сгеетид, еάйеά Ьу КатакпкЬиа 8ее!Ьа1а, РгаЬЬауа!Ы В. РетаМек (2001, №у Уогк, Ν.Υ., Магсе1 Эеккег, I8ВN 0-8247-0562-9); и ЬаЬ КеГ: А НаМЬоок оГ Кесрек, Кеадеи!к, аЫ 01йег КеГегеисе Тоо1к Гог Ике а! !Ье ВеисЬ, Εά^ά 1аие Коккатк агД □ йа Кοάде^к, (2002, СоШ 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, I8ВN 0-87969-630-3).

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, таким образом, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

III. Очищенные белковые фрагменты ААК8 и варианты для терапевтического и других применений.

Неожиданным образом было обнаружено, что фрагменты ААК8, в отличие от их исходных полноразмерных последовательностей, для которых известны только виды активности, связанные с аминоацилированием, обладают биологическими видами активности, важными для применения в биотерапевтических, исследовательских и диагностических целях. Варианты реализации настоящего изобретения, таким образом, включают полноразмерные белки, зрелые изоформы белков и белковые фрагменты аминоацилтРНК-синтетаз (ААК8), а также их биологически активные варианты и их фрагменты. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанные белки и фрагменты могут образовываться в результате эндогенного протеолиза, ш уйго протеолиза, сплайсинга или предсказания с помощью компьютерного моделирования, и другими путями.

Белковые фрагменты ААК8, описанные в настоящем документе, и их варианты могут обладать по меньшей мере одной неканонической биологической активностью. Белковый фрагмент (фрагменты) ААК8 согласно настоящему изобретению также называется в настоящем описании полипептидом ААК8 или эталонным полипептидом ААК8. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полипептиды ААК8, предложенные в настоящем описании, содержат или по существу состоят из всего или части полипептида эталонной последовательности (последовательностей) ААК8, описанной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, ниже, которая представляет собой аминокислотную последовательность (последовательности) различных фрагментов аспартил-тРНК-синтетазы. Белковые последовательности ААК8 мыши и человека являются сильно родственными, различаясь, как правило, не более чем по нескольким аминокислотам в целой последовательности, конкретном домене или конкретном белковом фрагменте.

Ν-Концевые полипептиды ААК8 приведены в табл. 1-3.

- 17 030461

Таблица 1А

Полипептиды ΑΑΚδ. идентифицированные с помощью МС

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	5Εζ) ΙΌ N0:
АзрН31ы1	Белок/Человек/ 1-154	МР5А5А5КК50ЕКРКЕ1МОААЕО¥АКЕК¥С155М1<25<2ЕКРОКУЬУКУКББТ1<2КАБЕ УУИУНАНУНТ5НАКСКОСЕЬУЬНОООЕЫУОАЬЧАУСЕНАЗΚΟΜνΚΕΑΑΝIΝΚΕ5Iνϋν ЕСУУККУЕ<2К1С5СТ<2<2ОУЕЕНУ<2К1¥У15ЬАЕРКЬРЬ	3Εζ) ΙΌ N0: 12
АзрН31ы1	ДНК/Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАСС СССС ССААСАТ ТАТ СС ТАААСАСАСАТАТ ССААТАТС Τ Т СААТ САТАСААТ САСААСА ААААС С АСАТССАСТТТТССТТССССТ Т АСАСАС Τ Т САСААТАСАААААСС Т САТ 6АА СТТСТТТСССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАССТАААСССАААСАСТССТТСТ ТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТСТСССССТСССАСАССАТСС ААССААССАСАТССТТАААТΤТССТСССААСАТСААСААА6А6А6САТТСТССАТСТА СААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАС С Τ Т С АСТТАСАТСТТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТСТСССССТС	ЗЕО ΙΌ N0: 13
АзрН31ы2 АзрН31ы2 АзрНЗ!143	Белок/Человек/ 1-274 ДНК/Человек/ Белок/Человек/ 1-224	ΜΡ5Α5Α5ΗΚ50ΕΚΡΗΕΙΜϋΑΑΕϋΥΑΚΕΗΥΰΙ55ΜΙ050ΕΚΡϋΗνΗνΗνΗΌΗΤΙ0ΚΑϋΕ УУИУНАНУНТ5НАКСКОСЕЬЧЬНОООЕЫУОАЬЧАУСОНАЗΚΟΜνΚΕΑΑΝIΝΚΕ5Iνϋν ЕСУУККУЕ<2К1С5СТ<2<2ОУЕЕНУ<2К1¥У15ЬАЕРКЬРИ2ЬООАУКРЕАЕСЕЕЕСКАТУ Ы0ОТНЕОЫНУ1ОЕНТ5Т50АУЕНЬ05С1СНЬЕНЕТЫЫКСЕУЕ10ТРК113ААЗЕССА ΝνΕΤνΕΥΕΚΝΝΑΥΕΑΟΕ РОЬБКОМСIСАБЕЕКЧЕЗIСРЧЕНА АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАСС ССССССААСАТ ТАТ СС ТАААСАСАСАТАТ ССААТАТ С Τ Т СААТ САТАСААТ САСААСА ААААС САСАТ С САС ТТТТССТТССССТ ТАСАСАС Τ Т САСААТАСАААААС С Т САТ САА СТТСТТТСССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАССТАААСССАААСАСТССТТСТ ТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТСТСССССТСССАСАССАТСС ААССААССАСАТССТТАААТΤТССТСССААСАТСААСАААСАСАССАТТСТССАТСТА СААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАС С Τ Т С АСТТАСАТСТТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТСТСССССТССА ССТССАТСАТССТСТТСССССТСАСССАСААССАСААСАССААССААСАССТАСТСТТ ААС САССАТАСААСАТ ТАСАСААСАСАС Т САТ Т САТ С Τ ТАССАСАТ СААС ТАС Т САСС САСТСТТСССТСТССАСТСТСССАТСТСССАТСТСТТСССАСАААСТТТААТТААСАА АССТТТТСТССАААТССАААСТССТААААТТАТТТСАССТСССАСТСААССАССАССС ААТСΤΤΤΤТАСТСТСТСАТАТΤΤΤАААААТААТССАТАССТСССТСАСТССССАСАСС ТАТАТААССАААТСТССАТТТСТССТСАТТТТСАСААССТТТТСТСТАТТССАССАСТ АТТСАСАССС ΜΡ3Α3Α3ΗΚ30ΕΚΡΗΕΙΜϋΑΑΕϋΥΑΚΕΗΥΰΙ33ΜΙ030ΕΚΡϋΗνΕνΗνΚϋΕΤΙ0ΚΑϋΕ ννίΛίνΗΑΗνΗΤ 3 НАКСКОС ЕЬУЬНООО ЕЫУОАЬУАУСЕНАЗ ΚΟΜνΚΕΑΑΝ IΝΚΕ 31 νϋν ЕСУУИКУЫ0К1СЗСТ00ЕУЕЬНУ0К1¥У13ЬАЕРИЬРЬ0ЬЕЕАУИРЕАЕСЕЕЕСИАТУ Е<2ОТРЬОЖУ1ОЬРТ5Т5<2АУЕРЬ<25С1СНЬЕРЕТЫЖСЕУЕ1<2ТРК11	3Εζ) ΙΌ N0: 14 ЗЕ<2 Ю N0: 15 5Εζ) Ιϋ N0: 16

АзрН31ыз

ДНК/Человек/

АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАСС С С С С С СААСАТ ТАТ С С ТАААСАСАСАТАТ С СААТАТ С Τ Т СААТ САТАСААТ САСААСА ААААС САСАТ С САС ТТТТССТТССССТ ТАСАСАС Τ Т САСААТАСАААААС С Т САТ САА еттетттееетАсетесААеАеттсАТАСААесАеАестАААеееАААСАетесттст тАетсстАсетсАесАесАетттААтстссАеестсттетеесеетеееАеАссАтес ААССААССАСАТССТТАААТТТССТСССААСАТСААСАААСАСАССАТТСТССАТСТА СААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАС С Τ Т С АСТТАСАТСТТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТСТСССССТССА ССТССАТСАТССТСТТСССССТСАСССАСААССАСААСАССААССААСАССТАСТСТТ ААС САССАТАСААСАТ ТАСАСААСАСАС Т САТ Т САТ С Τ ТАССАСАТ СААС ТАС Т САСС САСТСТТСССТСТССАСТСТСССАТСТСССАТСТСТТСССАСАААСТТТААТТААСАА АССΤΤΤТСТССАААТССАААСТССΤААААТТАТТ

ЗЕ<2 ΙΌ N0: 17

- 18 030461

Таблица 1В

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды ΑδρΚ81^Ν1 и предполагаемые

связывающие пептиды
Тип/вид	Последовательность	ЗЕО	ΙΌ	N0:
Белок/мышь	1С5СТ<2<2ОУЕЬНУ<2К	5Е<2 18	ΙΡ	N0:
Белок/мышь	1¥У15ЪАЕРКЬРЬ<2ЬОБА1КРЕУЕеЕЕОеКАТУБ<2ОТКБОККУ1БЪКТ5Т5<2А1ЕКЪ<25С1СНЪЕКЕТЫБ	5Е<2	ΙΡ	N0:
КСЕУЕЮТРК	19
Белок/мышь	11ЗААЗЕССАДГЧЕТУЗ ΥΕΚ	5Е<2	ΙΡ	N0:
		20
Белок/мышь	Ε5ΙΙΡνΕ6ννΚ	5Е<2 21	ю	N0:
Белок/мышь	КУБОК	5Е<2 22	ю	N0:
Белок/мышь	ТСЗСТООРУЕБНУОК	5Е<2 23	ΙΡ	N0:

Таблица1С

Составленные последовательности ΛδρΚ81^Ν1 на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов

Тип/вид	Последовательность	ЗЕО 1Б N0:
Белок/мышь	1С5СТ00РУЕЪНУ<2К1¥У15ЪАЕРКЪРЪ<2ЪРРА1КРЕУЕСЕЕРСКАТУБ<2РТКЪРБКУ1 РЪНТ5Т50А1ЕНЪ05С1СНЪЕНЕТЫБКСЕУЕ10ТРК115АА5ЕСС¥ЛУЕТУ5¥ЕК	5Е<2 Ю N0: 24
Белок/мышь	Е 511ΡΥΕ СУУККУБ<2К IС5 С Т <2<2РУЕ ЪНУ<2К	5Е<2 ΙΡ N0: 25

Таблица 2А

Полипептиды и альтернативные транскрипты ААК8, идентифицированные методом глубокого секвенирования

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	3Εζ) 1Б N0:
АзрК31ыь	Белок/	МР5А5А5НК5<2ЕКРНЕ1МБААЕ1ЕЕКЕСЬЕТ	8Е<2 Ю N0:
	Человек/ 1-22+9 аа		26
Α5ρΚ31Ν5	ДНК/ Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАС СССССС6АААТССАСТТТТССТТССССТТАСАСАСТТСА	ЗЕ<2 Ю N0: 27
АзрНЗ 1Ν6	Белок/Человек/ 1-41+73-501	ΜΡ5Α5Α5ΚΚ5(2ΕΚΡΚΕΙΜΡΑΑΕΡΥΑΚΕΚΥ(3Ι55ΜΙ(25(2ΕΚΡσΚ(23ΕΕνΕΚ(2(2(2ΕΝν(2 АЬЧАЧСРНАЗ К<2МЧК ΕΑΑΝIΝΚΕ 31ЧБЧЕ СУУНКУБ<2К IС 3 С Т <2<2РЧЕ ЪНЧ<2К I Υν I ЗНАЕРНЕРИ2ЪРРАУНРЕАЕСЕЕЕСНАТУН<2БТНЪРЫНУ1РЕНТЗТ5<2АУЕНИ23С1 ΟΗΕΕΚΕΤΕΙΝΚ6ΕνΕΐαΤΡΚΙΙ3ΑΑ3ΕσσΑΝνΕΤν3ΥΕΚΝΝΑΥΕΑ<25Ρ<2ΗΥΚ<2ΜΟΙΟ ΑΡΕΕΚνΕ3Ι6ΡνΕΗΑΕΡ3ΝΤΗΗΗΕΤΕΕν6ΗΡΙΕΜΑΕΝΥΗΥΗΕλ/ΜΕΕΙΑΡΤΜν0ΙΕΚΟ ЪОЕНЕОТЕЮТУККОЕРСЕРЕКЕЪЕРТЪНЪЕУСЕАЪАМЪНЕАСУЕМСОЕРРЬЗТРКЕ ΚΕΕ6ΗΕνΚΕΚΥΡΤΡΕΥΙΕΡΚΥΡΕΑνΚΡΕΥΤΜΡΡΡΚΝΡΚ(23Ν3ΥΡΜΕΜΚ6ΕΕΙΕ36Α(2 Н1НРР0ЕЪТЕНАЪННС1РНЕК1КА¥1БЗЕНЕСАРРНАССС1СНЕНУТМЪЕЪСЪНБУН ОТЗМЕРНРРКНЕТР	ЗЕ<2 Ю N0: 28
АзрНЗ!146	ДНК/ Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАС СССССС6ААСАТ ТАТ 6С ТАААСА6А6АТАТ 6СААТАТС Τ Т СААТ САТАСААТ САСАА САААААССАСССАААСАСТССТТСТТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАС ССТСТТ6ТССС6СТСССАСАССАТССААССААССАСАТССТТАААТТТССТСССААС АТ СААСАААСА6АС САТТСТССАТС ТАСААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААА АТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАС С Τ Т САС Т ТАСАТ С Τ Т САСААСАТ ТТАТСТСАТС АСТТТС6СТСААСССССТСТСССССТССАССТССАТСАТССТСТТСССССТСАСССА СААССА6ААСА6СААССААСАССТАСТСТТААССАССАТАСААСАТТАСАСААСАСА СТСАТТ6АТСТТАССАСАТСААСТАСТСАСССАСТСТТСССТСТССАСТСТСССАТС	5Е<2 Ιϋ N0: 29

- 19 030461

		ТСССАТСТСТТСССАСАААСТТТААТТААСАААССТТТТСТССАААТССАААСТССТ ААААТТАТТТСАССТСССАСТСААССАССАСССААТСТТТТТАСТСТСТСАТАТТТТ АААААТААТССАТАССТСССТСАСТССССАСАССТАТАТААССАААТСТССАТТТСТ ССТ САТ ТТТ САСААССТ Τ Τ Т С Т С ТАТ Т ССАССАСТАТ Т САСАССССААСАС Т С ТААТ АСССАТАСАСАТСТААСТСА6ТТТСТТССТТТССАСАТТСАААТСССТТТТААТТАС САТ ТАС САС СААС Τ ТАТ ССААСАААТ Т СС Т САСАС САТ СС ТАСАААТАТ Т САААССА С Τ Т СААСАААС С Τ Τ Т САСАС Т САААТ Т САААСАС Т СААТАААСАС ТТСССАТСТ САС ССАТ Т САААТ ТТТ Т ССАСССААС Т С ТААСАС ТАСААТАТ Т СТ СААССАТ Т ССС ТАТ С СТТАСССААССТССАСТССАААТСССАСАТСААСАССАТСТСАССАСАССАААТСАА ААСС Т С Τ Т СССТ САТ Τ Т ССТАААССААААСТАТ САТАСАСАТ ТТТ ТАТАТ Т С Τ Т САТ АААТАТ ССАТТСССТС ТААСАС СТТТСТАТАССАТСССТ САС С СААСАААТ С С СААА САС Т С СААС Т С Τ Т АС САТ АТ С Τ Т САТСАСАССАСААСАААТАТ Т СТ САССАСС Т САА АСААТАСАТ САТ СС Т СААС Т СС ТААСАСАСАСАСС Τ Т ТАСАТ САТ ССААТ Т САТ Τ Т С САСААААТТААСССТТАСАТТСАТТССТТССССТТТССАСССССТССТСАТССТССТ ССАСССАТТССАТТССААССАСТТАСТАТССТСТТТСТСССАТТССАТААТСТТССТ САСАССТССАТСТТСССТССТСАТСССАААССАСТСАСТССТТАА
АзрКЗ 1Ν7	Белок/ Человек/1- 141+189-501	МРЗАЗАЗККЗ<2ЕКРКЕ1МОААЕОТАКЕКТС133М1<23<2ЕКРОКУ1ТОКУКОЬТ1<2КАО ЕУУИУВАНУНТ5НАКСКОСЕЕЧЬЕОООЕКУОАЬУАУСОНАЗΚΟΜνΚΕΑΑΝIΝΚΕ5IV ОУЕСУУККУК<2К1С5СТ<2<2ОУЕЬНУ<2КТ5Т5<2АУЕКИ25С1СНЬЕКЕТЫМКСЕЧЕ1 ΟΤΡΚΙ15ΑΑ5ΕΰΰΑΝνΕΤν5ΥΕΚΝΝΑΥ1Α.ζ)5Ρ(2ΕΥΚ(2ΜΕΙΟΑΟΕΕΚνΕ51СРЧЕКАЕ ΟΕΝΤΗΗΗΕΤΕΕνΰΕΟΙΕΜΑΕΝΥΗΥΗΕλ/ΜΕΕΙΑϋΤΜνΟΙΕΚΰΕΟΕΗΕΟΤΕΙΟΤνΝΚΟΕ РСЕРЕКЕЬЕРТЬКЬЕТСЕАЬАМЬКЕАСУЕМСОЕОБЬЗТРКЕКЬЬСНЬУКЕКТОТОЕТ	5Е<2 ТО N0: 30
		1ТОКТРЬАУКРЕТТМРОРККРК<23КЗТОМЕМКСЕЕТОЗСА<2К1НОР<2]ТОТЕКАЬННС ТОЬЕК1КАУТОЗ ЕКЕСАРРНАССС1СЬЕКУТМЬЕЬСЬН1ТОК<2ТЗМЕРКОРККЬТР
АзрКЗ!147	ДНК/ Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАС СССССССААСАТТАТССТАААСАСАСАТАТССААТАТСΤТСААТСАТАСААТСАСАА САААААС САСАТ С САС ТТТТССТТССССТ ТАСАСАС Τ Т САСААТАСАААААС С Т САТ СААСТТСТТТСССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАССТАААСССАААСАСТСС ТТСТТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТСТСССССТСССАСАС САТ ССААССААССАСАТССТ ТАААТΤ Т СС Т СССААСАТ СААСАААСАСАССАТ Т СТ С САТ С ТАСААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС САА САС С Τ Т САС Т ТАСАТ С Τ Т САСААСАСАТ СААС ТАС Т САС С САС ТСТТСССТСТС САС ТСТСССАТСТСССАТСТСТТСССАСАААСТТТААТТААСАААССТТТТСТССАААТС САААСТССТААААТТАТТТСАССТСССАСТСААССАССАСССААТСТТТТТАСТСТС ТСАТАТТТТАААААТААТССАТАССТСССТСАСТССССАСАССТАТАТААССАААТС ТССАТТТСТССТСАТТТТСАСААССТТТТСТСТАТТССАССАСТАТТСАСАССССАА САС Т С ТААТАС С САТАСАСАТ С ТААС Т САС ТТТСТТССТТ Т ССАСАТ Т САААТ ССС Т Τ Τ ТААТ ТАС САТ ТАС САС СААС Τ ТАТ С СААСАААТ Т С С Т САСАС САТ С С ТАСАААТА Τ Т САААС САС Τ Т СААСАААС С Τ Τ Т САСАС Т САААТ Т САААСАС Т СААТАААСАС Τ Т С С САТ С Т САС С САТ Т САААТ Τ Τ Τ Т С САС С СААС Т С ТААСАС ТАСААТАТ Т С Т СААС СА ТТСССТАТССТТАСССААССТССАСТССАААТСССАСАТСААСАССАТСТСАССАСА С САААТ СААААС СТСТТСССТСАТТТСС ТАААС СААААС ТАТ САТАСАСАТ Τ Τ Τ ТАТ АТТСΤТСАТАААТАТССАТТСССТСТААСАССΤΤТСТАТАССАТСССТСАСССААСА ААТ С С САААСАС Т С СААС ТСТТАССАТАТСТТСАТ САСАС САСААСАААТАТ Т С Т СА	5Е<2 ТО ΝΟ: 31

- 20 030461

		66А6С ТСАААСААТАСАТ6АТ СС ТСААС Т 6С ТААСА6А6А6А6С ΤТ ТАСАТ САТ ССА АТТСАТТТССАСААААТТААСССТТАСАТТСАТТССТТССССТТТССАСССССТССТ САТССТССТССАСССАТТССАТТССААССАСТТАСТАТССТСТТТСТСССАТТССАТ ААТСТТССТСАСАССТССАТСТТСССТССТСАТСССАААССАСТСАСТССТТАА
АзрНЗ!148	Белок/ Человек/ 1-319+369-501	ΜΡ3Α3Α3ΗΚ30ΕΚΡΗΕΙΜΟΑΑΕΟΥΑΚΕΗΥσΐ33ΜΙ030ΕΚΡΟΗν4νΗνΗΟΣΤΙ0ΚΑΟ ЕАЛ/ИЧНАНУНТ3НАКСКОСЕЬУЬНОООЕЫУОАЬУАУСОНАЗΚΟΜνΚΕΑΑΝIΝΚΕ3IV ОУЕСУУККУЕ<2К1СЗСТ<2<2ОУЕЬНУ<2К1ЕУ13ЬАЕРКЬРИ2ЬООАУКРЕАЕСЕЕЕСК ΑΤνΝΟΕΤΚΕΡΝΚνΐОННТ3 Т 3 ОАУЕННОЗ 01СНЕ ЕНЕ ТЫМКСЕУЕIОТ ΡΚΙIЗААЗ Ε66ΑΝνΕΤν3ΥΕΚΝΝΑΥ1Α.03Ρ0ΗΥΚ0ΜΟΙΟΑΟΕΕΚνΕ31СРУЕНАЕОЗЫТНННЬТЕ Εν6ΗΟΙΕΜΑΕΝΥΗΥΗΕλ/ΜΕΕΙΑΟΤΜν0ΙΕΚ6Η0Ε3ΤΡΝΕΚΗΗ6ΗΕνΚΕΚΥΟΤΟΕΥΙΗ ОКУРЪАУИРЕУТМРОРИЫРК03ЫЗУОМЕМИСЕЕ1ЪЗСА0И1НОР0ЪЪТЕИАЪННС1О ЬЕК1КАЕ1О5ЕКЕСАРРНАССС1СЬЕКУТМЬЕЬСЬН1Ш<<2ТЗМЕРКОРККЬТР	ЗЕО ΙΕ N0: 32
АзрНЗ!148	ДНК/Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАС СССССССААСАТТАТССТАААСАСАСАТАТССААТАТСТТСААТСАТАСААТСАСАА САААААС САСАТ С САС ТТТТССТТССССТ ТАСАСАС Τ Т САСААТАСАААААС С Т САТ СААСТТСТТТСССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАССТАААСССАААСАСТСС ТТСТТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТСТСССССТСССАСАС САТССААССААССАСАТССТТАААТΤТССТСССААСАТСААСАААСАСАССАТТСТС САТ С ТАСААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС САА САССТТСАСТТАСАТСТТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТСТС ССССТССАССТССАТСАТССТСТТСССССТСАСССАСААССАСААСАССААССААСА СС ТАС Т С Τ ТААС САССАТАСААСАТ ТАСАСААСАСАС Т САТ Т САТ С Τ ТАССАСАТ СА	ЗЕ<2 Ю N0: 33

		АСТАСТСАСССАСТСТТСССТСТССАСТСТСССАТСТСССАТСТСТТСССАСАААСТ ΤТААТТААСАААССΤΤΤТСТССАААТССАААСТССΤААААТТАТΤТСАССТСССАСТ СААССАССАСССААТСТТТТТАСТСТСТСАТАТТТТАААААТААТССАТАССТСССТ САСТССССАСАССТАТАТААССАААТСТССАТТТСТССТСАТТТТСАСААССТТТТС Т С ТАТ Т С САС САС ТАТ Т САСАС С С СААСАС Т С ТААТАС С САТАСАСАТ С ТААС Т САС ТТТСТТССТТТССАСАТТСАААТСССТТТТААТТАССАТТАССАССААСТТАТССАА САААТ ТССТ САСАССАТ СС ТАСАААТАТ Т САААССАС Τ Т СААСАААССАСАССАААТ СААААСС Т СТ Т СССТ САТ Τ Т ССТАААССААААСТАТ САТАСАСАТ Τ Τ Т ТАТАТ Т С Τ Т САТАААТАТ ССАТТСССТС ТААСАС СТТТСТАТАССАТСССТ САС С СААСАААТ С С С АААСАС Т С СААС ТСТТАССАТАТСТТСАТ САСАС САСААСАААТАТ Т С Т САС САС С Т САААСААТАСАТ САТ СС Т СААС Т СС ТААСАСАСАСАСС Τ Т ТАСАТ САТ ССААТ Т САТ ТТССАСААААТТААСССТТАСАТТСАТТССТТССССТТТССАСССССТССТСАТССТ еетееАеесАттесАттееААсеАеттАстАтестетттстеееАттесАТААтетт ССТСАСАССТССАТСТТСССТССТСАТСССАААССАСТСАСТССТТАА
АзрНЗ!149	Белок/ Человек/ 1-22+63 аа	МРЗАЗАЗНКЗОЕКРНЕ1МОААЕО№ЫЕЬЬССГ№ОС1МЕУНРРСЗЬУ1РЫОЗЬЬКЕТЬС НЬТРУИМТЕНОРАЗККККККЕЗНТЧЗЕО	ЗЕО ТО N0: 34
АзрНЗ!149	ДНК/Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАС СССССССААСАТТССААССАСТТАСТАТССТСТТТСТСССАТТССАТААТСТТССТС АСАССТССАТСТТСССТССТСАТСССАААССАСТСАСТССТТАААТТСАСАСТТТСС САС Τ ТААС Т С САС Т С Т С САТ САСАСАС С САСАС С С Т С С С Т САААААААААААААААА АААСАААС С САСАС ТТАТТСТТТТ САС ΤАА	ЗЕ<2 Ю N0: 35

АзрНЗ!1410	Белок/Человек/ 1-22+5 аа	МРЗАЗАЗНКЗОЕКРНЕПГОААЕСЫЗАЗ	5Е<2 Ю N0: 36
АзрНЗ!1410	ДНК/Человек/	АТССССАСССССАСССССАСССССААСАСТСАССАСААССССССССАСАТСАТССАС СССССССААССАААСАСТССТТСТТАС	5Е<2 Ю N0: 37

- 21 030461

Таблица 2В

Уникальные границы сплайсинга полипептидов ААК8

Название	Тип/вид	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот в области уникальной границы сплайсинга	ЗЕО	Ю	N0:
Ό1-Α501	ДНК/Человек	СССССАСАТСАТССАССССССССАА|АТССАСТТТТССТТССССТТАСАСА	ЗЕО 38	ΙΌ	N0:
	Белок/Человек	КЕ1МБААЕ1ЕБКБСБЕ	ЗЕО 39	ΙΌ	N0:
Ό1-Α302	ДНК/Человек	АТСАТАСААТСАСААСАААААССАС|ССАААСАСТССТТСТТАСТССТАСС	ЗЕО 40	ΙΌ	N0:
	Белок/Человек	М1<25<2ЕКРСК<2СБНУЬ	ЗЕО 41	ΙΌ	N0:
Ό1-Α508	ДНК/Человек	АСАССТТСАСТТАСАТСТТСАСААС|АСАТСААСТАСТСАСССАСТСТТСС	ЗЕО 42	Ю	N0:
	Белок/Человек	БЧЕ БНЧОКТ ЗТЗ ОАЧЕ	ЗЕО 43	ΙΌ	N0:
Ό1-Α309	ДНК/Человек	АААТАТТСАААССАСТТСААСАААС|САСАССАААТСААААССТСТТСССТ	ЗЕО 44	ΙΌ	N0:
	Белок/Человек	IЕКСЬОЕЗТРНЕКНЬС	ЗЕО 45	ΙΌ	N0:
Ό1-Α505	ДНК/Человек	СССССАСАТСАТССАССССССССАА|САТТССААССАСТТАСТАТССТСТТ	ЗЕО 46	ΙΌ	N0:
	Белок/Человек	НЕΙΜΌΑΑΕΌΐΛίΝΕΗΡιΟΟ	ЗЕО 47	ΙΌ	N0:
Ό1-Α507	ДНК/Человек	СССССАСАТСАТССАССССССССАА|ССАААСАСТССТТСТТАСТССТАСС	ЗЕО 48	ΙΌ	N0:
	Белок/Человек	НЕТМБААЕСЫЗАЗ	ЗЕО 49	ΙΌ	N0:

Таблица 3

Полипептиды и нуклеиновые кислоты ААК8, идентифицированные биоинформатическими методами

С-концевые полипептиды ААК8 приведены в табл. 4-6.

Таблица 4 А

Полипептиды ААК8, идентифицированные с помощью МС | Название | Тип/вид/Остатки | Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот | 5Е0 ΙΡ ΝΟ: |

Таблица 4В

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды и предполагаемые связывающие пептиды | Тип/вид | Последовательность | 5Е0 ΙΡ N0: |

Таблица 4С

Составленные последовательности на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов | Тип/вид | Последовательность | ЗЕО ΙΡ N0; |

- 22 030461

Таблица 5А

Полипептиды и альтернативные транскрипты ААН8. идентифицированные методом глубокого секвенирования

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	5Ες Ιϋ ΝΟ:
АзрН51с2	Белок/Человек/ 101-501	МУКЕААШЫКЕ51УОУЕСУУККУЫ<2К1С5СТ<2<2ОУЕЪНУ<2К1¥Ч15ЪАЕРКЪРЪ<2ЬОО АУНРЕАЕСЕЕЕСНАТУЫ0ОТНЕОЫНУ1ОЕНТ5Т50АУЕНЬ05С1СНЬЕНЕТЫЫКСЕУ ΕΙ0ΤΡΚΙΙ5ΑΑ5Ε66ΑΝνΕΤν5ΥΕΚΝΝΑΥΕΑζ)5Ρ(2ΕΥΚ(2ΜΟΙΟΑΟΕΕΚνΕ5Ι6ΡνΕΚΑ ΕΌ5ΝΤΗΚΗΕΤΕΕνσΕΟΙΕΜΑΕΝΥΗΥΗΕνΜΕΕΙΑΟΤΜν<2ΙΕΚ(ΟΕ<2ΕΚΕ<2ΤΕΙ<2ΤνΝΚ<2Ε РСЕРЕКЕЬЕРТЬКЬЕУСЕАЬАМЬКЕАСУЕМСОЕООЬЗТРЕЕКЬЬСНЬУКЕКУОТОЕУ! ЬБК¥РЬАУКРЕ¥ТМРОРКЕРКа5Е5¥ОМЕМКСЕЕ1Ь5СА<2К1НОР<2ЬЬТЕКАЬННС1О ЬЕК1КА¥1О5ЕКЕСАРРНАССС1СЬЕКУТМЬЕЬСЬНКУК<2Т5МЕРКОРККЬТР	5Е<2 Ю N0: 73
АзрН51с2	ДНК/Человек	АТССТТАААТТТССТСССААСАТСААСАААСАСАССАТТСТССАТСТАСААССТСТТС Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАС С Τ Т САС Τ ТАСАТ С Т ТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТСТСССССТССАССТССАТСАТ ССТСТТСССССТСАСССАСААССАСААСАССААССААСАССТАСТСТТААССАССАТА С ААСАТ Т АСАС ААС АСАС Т С АТ Т САТ С Τ Т АС САС АТ С ААС Т АС Т САС С САС Т С Τ Т С С С ТСТССАСТСТСССАТСТСССАТСТСТТСССАСАААСТТТААТТААСАААССТТТТСТС САААТССАААСТССТААААТТАТТТСАССТСССАСТСААССАССАСССААТСТТТТТА СТСТСТСАТАТТТТАААААТААТССАТАССТСССТСАСТССССАСАССТАТАТААССА ААТСТССАТТТСТССТСАТТТТСАСААССТТТТСТСТАТТССАССАСТАТТСАСАССС СААСАС Т С ΤААТАС С САТАСАСАТ С ТААС Т САС ТТТСТТССТТТС САСАТ Т САААТ С С СТТТТААТТАССАТТАС САС СААС Τ ТАТ С СААСАААТ Т С С Т САСАС САТ С С ТАСАААТ АТТ САААС САС Τ Т СААСАААС С Τ Τ Т САСАС Т САААТ Т САААСАС Т СААТАААСАС Τ Т С	5Е<2 Ю ΝΟ: 74

		С САТ С Т САСС САТ Т САААТ Τ Τ Τ Т ССАСС СААС Т С ТААСАС ТАСААТАТ Т С Т СААССАТ ТСССТАТССТТАСССААССТССАСТССАААТСССАСАТСААСАССАТСТСАССАСАСС АААТ СААААСС Т СТ Т СССТ САТ Τ Т ССТАААССААААСТАТ САТАСАСАТ Τ Τ Τ ТАТАТ Т СΤТСАТАААТАТССАТТСССТСТААСАССΤΤТСТАТАССАТСССТСАСССААСАААТС С САААСАС Т С СААС ТСТТАССАТАТСТТСАТ САСАС САСААСАААТАТ Т С Т САС САС С Т САААСААТАСАТ САТ СС Т СААС Т СС ТААСАСАСАСАСС Τ Т ТАСАТ САТ ССААТ Т САТ ТТССАСААААТТААСССТТАСАТТСАТТССТТССССТТТССАСССССТССТСАТССТС СТССАСССАТТССАТТССААССАСТТАСТАТССТСТТТСТСССАТТССАТААТСТТСС ТСАСАССТССАТСТТСССТССТСАТСССАААССАСТСАСТССТТАА
АзрН51сз	Белок/Человек/ 478-501	МЬЕЬСЕНКУК<2Т5МЕРКОРККЬТР	3Εζ) Ιϋ N0: 75
АзрИ51сз	ДНК/Человек	АТССТСТТТСТСССАТТССАТААТСТТССТСАСАССТССАТСТТСССТССТСАТСССА ААССАСТСАСТССΤΤАА	5Е<2 Ю ΝΟ: 76

Таблица 5В

Уникальные границы сплайсинга полипептидов ААН8

Название	Тип/вид	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот в области уникальной границы сплайсинга	5Εζ) Ιϋ ΝΟ:
Ώ1-Α507	ДНК/Человек	СССССАСАТСАТССАССССССССАА|АТССАСТТТТССТТССССТТАСАСА	5Е<2 Ю N0: 77
	Белок/Человек	Ν/Α
Ώ1-Α505	ДНК/Человек	СССССАСАТСАТССАССССССССАА|САТТССААССАСТТАСТАТССТСТТ	5Е<2 Ю N0:
			78
	Белок/Человек	МЬ	5Е<2 Ю N0: 79

- 23 030461

Таблица 6

Полипептиды и нуклеиновые кислоты ΑΑΚδ, идентифицированные биоинформатическими методами

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	ЗЕО Ю N0:
АзрН31с1	Белок/Человек/ 297-501	УН¥НЕЧМЕЕ1АБТМУ(21ЕКСЬ(2ЕКЕ(2ТЕ1(2ТЧЖКаЕРСЕРЕКЕЪЕРТЪКЪЕ¥СЕАЬАМ ΕΚΕΑ0νΕΜ0ΌΕ00Ε5ΤΡΝΕΚΕΕ0ΗΕνΚΕΚΥΕΤ0ΕΥΙΕΕΚΥΡΙΑ.νΚΡΕΥΤΜΡΕΡΚΝΡΚ(2 ЗПЗ¥ОМЕМНСЕЕ1ЕЗСА0Н1НОР0ЬЬТЕНАЬННС1ОЬЕК1КА¥ЮЗЕНЕСАРРНАССС 1СЕЕКУТМЬЕЬСЬНПУН<2Т5МЕРКОРККЬТР	5Е<2 Ю N0: 80
АзрН51с1	ДНК/Человек/	ТАС САТ ТАС САС СААС Τ ТАТ С СААСАААТ Т С С Т 6АСАССАТ ССТАСАААТАТ Т САААС САС Τ Т СААСАААС С Τ Τ Т СА6АСТ САААТ Т САААСАСТ СААТАААСАСТТСССАТСТСА СССАТ Т САААТ ТТТ Т ССАСССААС Т С ТААСАС ТАСААТАТ Т СТ СААССАТ Т ССС ТАТ С С Т ТАСССААСС Т ССАСТ ССАААТ СССАСАТ СААСАССАТ С Т САССАСАССАААТ СААА АСС Т СТ Т СССТ САТ Τ Т ССТАААССААААСТАТ САТАСАСАТ ТТТ ТАТАТ Т С Τ Т САТАА АТАТССАТТСССТС ТААСАС СТТТСТАТАССАТСССТ САС С СААСАААТ С С С АААС АС Т С СААС Т С Τ ТАС САТАТ С Τ Т САТСАСАССАСААСАААТАТ Т СТ САССАСС Т САААСАА ТАСАТ САТ СС Т СААС Т СС ТААСАСАСАСАСС Τ Т ТАСАТ САТ ССААТ Т САТ Τ Т ССАСАА ААТТААСССТТАСАТТСАТТССТТССССТТТССАСССССТССТСАТССТССТССАССС АТТССАТТССААССАСТТАСТАТССТСТТТСТСССАТТССАТААТСТТССТСАСАССТ ССАТСТТСССТССТСАТСССАААССАСТСАСТССТТАА	5Е<2 Ю N0: 81

Внутренние полипептиды ΑΑΚδ приведены в табл. 7-9.

Таблица 7 А

Полипептиды ΑΑΚδ, идентифицированные с помощью МС

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	ЗЕО Ю N0:
АзрР.5111	Белок/Человек/ 38-292	0ЕКРОКУЬУКУКОЬТ10КАОЕУУЖ/КАКУНТ5КАКСК<2СЕЬУЬК<2<2<2Е1АЛ2АЬУАУС ΏΗΑ3 К<2МЧК ΕΑΑΝIΝΚΕ 51УБЧЕ 0ννΚΚνΝ<2ΚIС 5 С Τ <2<2БУЕ ЬНЧ<2К IΥ413 ЬАЕ РН ЬРЬ<2ЬООАУКРЕАЕСЕЕЕСКАТУП<2ОТКЬОПКУЮЬКТ5Т5<2АУЕКЬ<25С1СНЬЕКЕ ΤΕΙΝΚΟΕνΕΙ<2ΤΡΚΙΙ5ΑΑ5ΕΟΟΑΝνΕΤν5ΥΕΚΝΝΑΥΗΑ<25Ρ<2ΗΥΚ<2ΜΟΙΟΑΟΕΕΚν Е31СРУЕНАЕ03ПТНННЬТЕЕУСЬ01Е	5Е<2 Ю N0: 88
АзрНЗ!11	ДНК/Человек/	СААСАААААС САСАТ С САС ТТТТССТТССССТ ТАСАСАС Τ Т САСААТАСАААААС С Т САТСААСТТСТТТСССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАССТАААСССАААСАС ТССТТСТТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТСТСССССТСССА САССАТССААССААССАСАТССТТАААТΤТССТСССААСАТСААСАААСАСАССАТТ С Т С САТ С ТАСААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАССТТСАСТТАСАТСТТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТ СТСССССТССАССТССАТСАТССТСТТСССССТСАСССАСААССАСААСАССААССА АСАСС ТАС Т С Τ ТААС САССАТАСААСАТ ТАСАСААСАСАС Т САТ Т САТ С Τ ТАССАСА ТСААСТАСТСАСССАСТСТТСССТСТССАСТСТСССАТСТСССАТСТСТТСССАСАА АСΤΤТААТТААСАААССΤΤΤТСТССАААТССАААСТССΤААААТТАТΤТСАССТССС АС Т СААС САС САС С СААТ СТТТТТАСТСТСТСАТАТТТ ΤАААААТААТ С САТАС С Т С	5Е<2 Ю N0: 89
		ССТСАСТССССАСАССТАТАТААССАААТСТССАТТТСТССТСАТТТТСАСААССТТ ТТСТСТАТТС САС САС ТАТ Т САСАС С С СААСАС Т С ТААТАС С САТАСАСАТ С ТААС Т САСТТТСТТССТТТССАСАТТСАА

Таблица 7В

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды ΑδρΚδ1¹¹ и предполагаемые связывающие пептиды

Тип/вид	Последовательность	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:
Белок/мышь	1СЗСТ00ЕУЕЬНУ0К	ЗЕ<2 90	ю	N0:
Белок/мышь	ΙΥνίΕΙΑΈΡΗ	ЗЕ<2 91	ю	N0:
Белок/мышь	ЬРЬ0ЬЕЕА1НРЕЧЕСЕЕЕСН	ЗЕ<2 92	ю	N0:
Белок/мышь	АТУП<2ОТКЬОПКУ1ОЬКТЗТЗ<2А1ЕКЬ<23С1СНЬЕКЕТЫМКСЕУЕ1<2ТРК115	ЗЕ<2 93	ю	N0:
Белок/мышь	ΑΑ5ΕΟΟΑΝνΕΤν5ΥΕΚ	ЗЕО 94	ю	N0:

- 24 030461

Таблица 7 С

Составленные последовательности ΆδρΚδΙ¹¹ на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов

Тип/вид	Последовательность	5Εζ) ΙΌ ΝΟ:
Белок/мышь	1СЗСТ00ОЧЕЬНЧ0К1¥Ч13ЬАЕРНЬРЬ0ЬООА1НРЕЧЕСЕЕОСНАТЧК0ОТНЬОЫНЧ1ОЬНТЗТ30А1ЕНЬ	5Е<2 Ю N0:
ОЗСТСНЬЕНЕТЫЫКСЕЧЕЮТРКТ ТЗААЗЕССАБЧЕТЧЗУЕК	95

Таблица 8А

Полипептиды ААК8 и альтернативные транскрипты, идентифицированные __ с помощью глубокого секвенирования__

Название | Тип/вид/Остатки | Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот | 5Εζ2 ΙΌ ΝΟ:

Таблица 8В

Уникальные границы сплайсинга полипептидов ААК8

Название

Тип/вид

Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот в области уникальной границы сплайсинга

5Е0 Ιϋ ΝΟ:

Таблица 9

Полипептиды и нуклеиновые кислоты ААК8, идентифицированные биоинформатическими методами

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	5Εζ) Ιϋ ΝΟ:
АзрР.3112 АзрН3112 АзрВ.5113 АзрКЗ!13	Белок/ Человек/ 23-154 ДНК/Человек Белок/ Человек/ 33-154 ДНК/Человек	О¥АКЕК¥С133М1<23<2ЕКРОКЧЬЧКЧКОЬТ1<2КАОЕЧЧИЧКАКЧНТЗКАКСК<2СЕЬЧЬ К<2<2<2ЕКЧ<2АЬЧАЧСОНАЗК<2МЧКЕААШМКЕ31ЧОЧЕСЧЧККЧК<2К1СЗСТ<2<2ОЧЕЬН Ч<2К1¥Ч13ЬАЕРКЬРЬ САТ ТАТ СС ТАААСАСАСАТАТ ССААТАТ С Τ Т СААТ САТАСААТ САСААСАААААССАС АТССАСТТТТССТТССССТТАСАСАСТТСАСААТАСАААААССТСАТСААСТТСТТТС ССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАССТАААСССАААСАСТССТТСТТАСТССТА ССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТСТСССССТСССАСАССАТССААССААСС АСАТССТТАААТТТССТСССААСАТСААСАААСАСАССАТТСТССАТСТАСААССТСТ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т 6СААСС Т С ТАСАСАССААСАС С Τ Т САС Т ТАСАТ СТТСАСААСАТТТАТСТСАТСАСТТТСССТСААСССССТСТСССССТС ЗМ1<23<2ЕКРОКЧЬЧКЧКОЬТ1<2КАОЕЧЧИЧКАКЧНТЗКАКСК<2СЕЬЧЬК<2<2<2ЕКЧ<2АЬ ЧАЧСБНАЗ К<2МЧК ΕΑΑΝIΝΚΕ 31ЧБЧЕ СЧЧНКЧЫОКIС 3 С Τ <2<2ϋ4Ε ЬНЧ<2К IΥ413 ЬА ЕРНЬРЬ Т СААТ САТАСААТ САСААСАААААС САСАТ С САС ТТТТССТТССССТ ТАСАСАС Τ Т СА СААТАСАААААССТСАТСААСТТСТТТСССТАССТССААСАСТТСАТАСААССАСАСС ТАААСССАААСАСТССТТСТТАСТССТАССТСАССАССАСТТТААТСТССАСССТСТТ СТСССССТСССАСАССАТССААССААССАСАТССТТАААТТТССТСССААСАТСААСА ААСАСАС САТТСТССАТС ТАСААС С Т С Τ Т С Т САСААААС Т СААТ САСААААТ Т С СААС С Т С ТАСАСАС СААСАС С Τ Т САС Т ТАСАТ С Τ Т САСААСАТ ТТАТСТСАТ САС Τ Τ Т С С С Т СААСССССТСТСССССТС	3Εζ) Ю ΝΟ: 96 3Εζ) Ю ΝΟ: 97 3Εζ) Ю ΝΟ: 98 3Εζ) Ю ΝΟ: 99

Белковые фрагменты или аминокислотные последовательности белковых фрагментов, такие как протеолитические фрагменты или фрагменты вариантов сплайсинга, могут быть охарактеризованы, идентифицированы или получены в соответствии с различными методами. Например, варианты сплайсинга могут быть идентифицированы с помощью таких методов, как глубокое секвенирование (см., например, Χΐη§ е! а1., КЫА. 14:1470-1479, 2008 и 2Бапд е! а1., Оепоше К^еагсБ. 17:503-509, 2007). В качестве другого примера белковые фрагменты, такие как протеолитические фрагменты, могут быть идентифицированы ΐη νΐίΓο, например, посредством инкубации полноразмерных или других полипептидов ААК8 с выбранными протеазами или они могут быть идентифицированы эндогенно (например, ΐη νίνο). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты, такие как эндогенные протеолитические фрагменты, могут быть созданы или идентифицированы, например, путем рекомбинантной экспрессии полноразмерных или других полипептидов ААК8 в выбранном микроорганизме или эукариотической клетке, который либо был модифицирован для включения одной или более выбранных протеаз, либо естественным образом содержит одну или более протеаз, которые способны действовать на выбранный полипептид ААК8, и изолирования и характеристики эндогенно продуцированных его белковых фрагментов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты, такие как эндогенные (например, природные) протеолитические фрагменты, могут быть созданы или идентифицированы, например, в различных клеточных фракциях (например, цитозольной, мембранной, ядерной) и/или ростовой среде различных клеточных типов, включая, например, иммунные клетки, такие как моноциты, дендритные клетки, макрофаги (например, макрофаги КА^ 264,7), нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и лимфоциты, такие как В-клетки и Т-клетки (например, СЭ4+ хелперные и СЭ8+ киллерные клетки),

- 25 030461 включая первичные Т-клетки и Т-клеточные линии, такие как Т-клетки .Никак так же как и естественные киллеры (па!ига1 кШег, ИК-клетки).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты, такие как эндогенные протеолитические фрагменты, полученные любым способом, могут быть идентифицированы с помощью методов, таких как масс-спектрометрия или эквивалентные методы. После получения ίη νίΐΐΌ или идентификации эндогенно идентифицированного белкового фрагмента его можно картировать или секвенировать и, например, клонировать в векторе экспрессии для рекомбинантной продукции или получать синтетическим путем.

Широкое разнообразие протеаз может использоваться для продукции, идентификации, изолирования или исследования последовательности белковых фрагментов ΛΛΚδ, таких как протеолитические фрагменты. В целом, протеазы обычно классифицируют по трем основным критериям: (ί) катализируемая реакция, (ίί) химическая природа каталитического сайта и (ίίί) эволюционные отношения, выявленные на основе структуры. Общие примеры протеаз, или протеиназ, при классификации по механизму катализа включают аспарагиновые протеазы, сериновые протеазы, цистеиновые протеазы и металлопротеазы.

Большинство аспарагиновых протеаз принадлежат к семейству пепсинов. Указанное семейство включает пищеварительные ферменты, такие как пепсин и химозин, так же как и лизосомальные катепсины Ό и ферменты процессинга, такие как ренин, и ключевые грибковые протеазы (например, пенициллопепсин, ризопуспепсин, эндотиапепсин). Второе семейство аспарагиновых протеаз включает вирусные протеазы, такие как протеаза из вируса СПИДа (Ηΐν), также называемая ретропепсином.

Сериновые протеазы включают два отдельных семейства. Первое, семейство химотрипсинов, которое включает ферменты млекопитающих, такие как химотрипсин, трипсин, эластазу и калликреин, и второе, семейство субстилизинов, которое включает бактериальные ферменты, такие как субстилизин. Общая трехмерная структура различается между указанными двумя классами, но они имеют одинаковую геометрию активного сайта, и катализ проходит по одинаковому механизму. Сериновые протеазы проявляют разную субстратную специфичность, что связано, главным образом с аминокислотными заменами в различных субсайтах фермента (сайтах взаимодействия с остатком субстрата). Некоторые сериновые протеазы имеют расширенный сайт взаимодействия с субстратом, тогда как другие имеют специфичность, которая ограничивается остатком субстрата Р1.

Семейство цистеиновых протеаз включает протеазы растений, такие как папаин, актинидин и бромелаин, некоторые лизосомальные катепсины млекопитающих, цитозольные кальпаины (кальцийактивируемые), так же как и некоторые протеазы паразитов (например, Тгураповота, δсΗ^βΐоβота). Папаин представляет собой архетипичный и наиболее изученный член семейства. Недавнее раскрытие рентгеновской структуры превращающего интерлейкин-1-бета фермента выявило новый тип укладки цистеиновых протеиназ.

Металлопротеазы являются одним из наиболее древних классов протеаз, обнаруженных в бактериях, грибах и высших организмах. Они значительно различаются по их последовательностям и трехмерным структурам, но значительное большинство ферментов содержит атом цинка, который является каталитически активным. В некоторых случаях цинк может быть замещен другим металлом, таким как кобальт или никель, без потери протеолитической активности. Бактериальный термолизин был хорошо охарактеризован и его кристаллографическая структура указывает на то, что цинк связан двумя гистидинами и одной глутаминовой кислотой. Многие металлопротеазы содержат мотив последовательности НЕХХН, который обеспечивает два гистидиновых лиганда для цинка. Третий лиганд либо представляет собой глутаминовую кислоту (термолизин, неприлизин, аланиламинопептидаза), либо гистидин (астацин, серрализин).

Типичные протеазы включают, например, ахромопептидазу, аминопептидазу, анкрод, ангиотензинпревращающий фермент, бромелаин, кальпаин, кальпаин Ι, кальпаин ΙΙ, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В, карбоксипептидазу С, карбоксипептидазу Р, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу Υ, каспазу 1, каспазу 2, каспазу 3, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 6, каспазу 7, каспазу 8, каспазу 9, каспазу 10, каспазу 11, каспазу 12, каспазу 13, катепсин В, катепсин С, катепсин Ό, катепсин Е, катепсин С, катепсин Н, катепсин Ь, химопапаин, химазу, химотрипсин, клострипаин, коллагеназу, компонент комплемента С1г, компонент комплемента С1в, фактор комплемента Ό, фактор комплемента I, кукумизин, дипептидилпептидазу IV, эластазу (лейкоцитарную), эластазу (панкреатическую), эндопротеиназу Λγ§-^ эндопротеиназу Λβр-N, эндопротеиназу С1и-С, эндопротеиназу Ьув-С, энтерокиназу, фактор Ха, фицин, фурин, гранзим А, гранзим В, протеазу ВИЧ, 1С-азу, тканевой калликреин, лейциновую аминопептидазу (общую), лейциновую аминопептидазу (цитозольную), лейциновую аминопептидазу (микросомальную), матриксную металлопротеазу, метиониновую аминопептидазу, нейтразу, папаин, пепсин, плазмин, пролидазу, проназу Е, простатоспецифический антиген, алкалофильную протеазу из δί^ерΐотусеβ дпвеив, протеазу из Λβре^д^11иβ, протеазу из Λβре^д^11иβ вайоц протеазу из Λβре^д^11иβ во.)ае, протеазу (В. ПсНешГогпив) (щелочную, или алкалазу), протеазу из ВасШив ро1утуха, протеазу из ВасШив вр., протеазу из ΚΗί/орив вр., протеазу δ, протеасомы, протеиназу из Λβре^дШиβ огу/ае, протеиназу 3, протеиназу А, протеиназу К, протеин С, пироглутаматаминопептидазу, ренин, стрептокиназу, субтилизин, термоли- 26 030461 зин, тромбин, тканевой активатор плазминогена, трипсин, триптазу и урокиназу.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к изолированным полипептидам ААК8, содержащим, по существу состоящим из или состоящим из аминокислотных последовательностей, которые являются производными эндогенных природных полипептидных фрагментов ААК8, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные фрагменты, и способам их применения. Указанные и родственные варианты реализации изобретения могут быть получены или идентифицированы ίη νίνο, ех νίνο и/или ίη νίΐτο. Согласно конкретным предпочтительным вариантам реализации изобретения ίη νίΐτο получают или идентифицируют протеолитические фрагменты ААК8 путем инкубирования полипептида ААК8, такого как полноразмерный полипептид ААК8, с одной или более изолированными человеческими протеазами, главным образом, эндогенными для человека или природными протеазами, такими как эластаза и другие, описанные в настоящем документе и известные в данной области техники. Другие варианты реализации изобретения относятся к изолированным полипептидам ААК8, содержащим, по существу состоящим из или состоящим из аминокислотных последовательностей, которые являются производными эндогенных природных сплайс-вариантов ААК8, и фармацевтическим композициям, содержащим указанные фрагменты, и способам их применения. По существу, белковый фрагмент ААК8 может быть изолирован из образцов, которые подвергали действию протеаз, ίη νίνο или ίη νίΐτο.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты ААК8 могут быть идентифицированы с помощью методов, таких как масс-спектрометрия или эквивалентные методы. Исключительно в качестве иллюстрации, но не ограничения, согласно конкретным вариантам реализации изобретения тотальные белки из различных типов клеток, тканей или жидкостей организма в различных физиологических состояниях (например, гипоксия, диета, возраст, заболевание) или их фракции могут быть разделены с помощью одномерного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, и гелевые дорожки могут быть нарезаны на полосы с фиксированными интервалами; после чего указанные полосы могут быть, необязательно, расщеплены соответствующей протеазой, такой как трипсин, для высвобождения пептидов, которые затем можно анализировать с помощью одномерной обращенно-фазовой ЖХ/МС/МС. Полученные данные протеомного анализа можно вводить в так называемые пептографы, которые наносят на график, в левой панели, частоту встречаемости последовательности для конкретного белка в горизонтальном направлении (от Ν-конца к С-концу, слева направо) в зависимости от перемещения в процессе электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальном направлении (от больших к маленьким молекулярным массам, сверху вниз). Конкретные пептидные фрагменты могут затем быть секвенированы или картированы. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения эталонный фрагмент ААК8 может характеризоваться уникальной молекулярной массой, по сравнению, например, с молекулярной массой соответствующего полноразмерного ААК8.

Как отмечено выше, варианты реализации настоящего изобретения включают полипептиды ААК8, представленные в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9. Также включены варианты эталонных полипептидов ААК8. Термин вариант полипептида относится к полипептидам, которые отличаются от эталонного полипептида ААК8 в результате добавления, делеции и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка и которые, как правило, сохраняют (например, имитируют) или модулируют (например, проявляют антагонизм) один или более видов неканонической активности эталонного полипептида ААК8.

Кроме того, человеческие аспартил-тРНК-синтетазы включают несколько сотен высокородственных полиморфных форм, и указанные формы, как известно в данной области техники, являются, по меньшей мере частично, функционально взаимозаменимыми. Таким образом, выбор природного варианта аспартил-тРНК-синтетазы является обычной задачей, включая, например, однонуклеотидные полиморфные формы, перечисленные в табл. А, для создания полипептида ААК8, содержащего одно или более аминокислотных изменений, на основе последовательности любого из гомологов, ортологов и природных изоформ человека, так же как и других видов аспартил-тРНК-синтетазы.

- 27 030461

Таблица А

Однонуклеотидные полиморфные формы (δΝΡ) человеческих аспартил-тРНК-синтетаз

Код доступа в СепеВапк	Замена нуклеотида
гз76296777	А/С
гз76133650	А/С
гз71672806	(БОЛЬШАЯ ДЕЛЕЦИЯ)
гз60318326	С/Т
гз35363362	С/С
гз11548870	А/С
гз10705557	(БОЛЬШАЯ ДЕЛЕЦИЯ)
гз2228бб0	А/С
гз18031б7	С/Т
гз!8031б5	С/Т

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариант полипептида отличается от эталонного полипептида одной или более заменами, которые могут быть консервативными или не консервативными, как описано в настоящем документе и известно в данной области техники. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариант полипептида содержит консервативные замены, при этом совершенно очевидно в данной области техники, что некоторые аминокислоты могут быть заменены на другие, в целом обладающие такими же свойствами, без изменения природы активности полипептида.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариантный полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или более идентичную или подобную по последовательности соответствующей эталонной последовательности полипептида ΑΑΚδ, описанного в настоящем документе, и, по существу, сохраняет неканоническую активность указанного эталонного полипептида. Также включены последовательности, отличающиеся от эталонной последовательности ΑΑΚδ в результате добавления, делеции или замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или более аминокислот, но сохраняющие свойства эталонного полипептида ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения добавления или делеции аминокислот происходят на С-конце и/или Ν-конце эталонного полипептида ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения присоединения аминокислот включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более остатков дикого типа (т.е. от соответствующего полноразмерного полипептида ΑΑΚδ), которые являются наиболее приближенными к С-концу и/или Ν-концу эталонного полипептида ΑΑΚδ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариантные полипептиды отличаются от соответствующей эталонной последовательности ΑΑΚδ по меньшей мере на 1%, но менее чем на 20, 15, 10 или 5% по остаткам. (Если указанное сравнение требует выравнивания, то последовательности следует выравнивать с обеспечением максимального подобия. Выпетленные последовательности в результате делеции или вставки или несовпадений считаются различиями). Различия предпочтительно представляют собой различия или изменения в заменимых остатках или консервативную замену. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения молекулярная масса варианта полипептида ΑΑΚδ отличается от молекулярной массы эталонного полипептида ΑΑΚδ примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20% или более.

Также предложены биологически активные фрагменты эталонных полипептидов ΑΑΚδ, т.е. биологически активные фрагменты белковых фрагментов ΑΑΚδ. Типичные биологически активные фрагменты, в целом, принимают участие во взаимодействии, например внутримолекулярном или межмолекулярном взаимодействии. Межмолекулярное взаимодействие может представлять собой специфическое связывание или ферментативное взаимодействие. Межмолекулярное взаимодействие может представлять собой взаимодействие между полипептидом ΑΑΚδ и клеточным партнером по связыванию, таким как клеточный рецептор или другие хозяйские молекулы, которые принимают участие в неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения белки ΑΑΚδ, их варианты и биологически активные фрагменты, связываются с одним или более клеточными партнерами связывании с аффинностью, составляющей по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 или 50 нМ. Аффинность связывания белкового фрагмента ΑΑΚδ с выбранным клеточным партнером по связыванию, в частности партнером по связыванию, который принимает участие в некано- 28 030461 нической активности, как правило, сильнее, чем аффинность белкового фрагмента ΑΑΚδ к соответствующему полноразмерному полипептиду ΑΑΚδ по меньшей мере примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз (включая все целые числа между указанными). Аффинность связывания белкового фрагмента ΑΑΚδ с партнером по связыванию, который принимает участие по меньшей мере в одной традиционной активности ΑΑΚδ, как правило, меньше аффинности указанного белкового фрагмента ΑΑΚδ к соответствующему полноразмерному полипептиду ΑΑΚδ по меньшей мере примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз.

Как правило, биологически активные фрагменты включают домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью эталонного полипептида ΑΑΚδ, и могут включать один или более (и в некоторых случаях все) из различных активных доменов и включают фрагменты, обладающие неканонической активностью. В некоторых случаях, биологически активные фрагменты полипептида ΑΑΚδ обладают биологической активностью, которая является уникальной для конкретного укороченного фрагмента, при этом полноразмерный полипептид ΑΑΚδ может не обладать указанной активностью. В конкретных случаях биологическая активность может быть раскрыта путем отделения биологически активного фрагмента полипептида ΑΑΚδ от других последовательностей полноразмерного полипептида ΑΑΚδ или путем изменения конкретных остатков последовательности полноразмерного полипептида ΑΑΚδ дикого типа для открытия биологически активных доменов.

Биологически активный фрагмент эталонного полипептида ΑΑΚδ может представлять собой полипептидный фрагмент, который состоит, например, из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 или более заменимых или незаменимых аминокислот, включая все целые числа (например, 101, 102, 103) и диапазоны (например, 50-100, 50-150, 50-200) между ними, аминокислотных последовательностей, описанных для любого из эталонных полипептидов ΑΑΚδ, описанных в настоящем документе, но, как правило, за исключением полноразмерной ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения биологически активный фрагмент содержит связанную с неканонической активностью последовательность, домен или мотив. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения С-концевой или Ν-концевой участок любого эталонного полипептида ΑΑΚδ может быть укорочен примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 или более аминокислот или примерно на 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650700 или более аминокислот, включая все целые числа и диапазоны между ними (например, 101, 102, 103, 104, 105), при условии, что укороченный полипептид ΑΑΚδ сохраняет неканоническую активность эталонного полипептида. Как правило, биологически активный фрагмент обладает не меньше примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 25% или примерно 50% активности (т.е. неканонической активности) биологически активного эталонного полипептида ΑΑΚδ, из которого он произошел. Примеры способов оценки указанных неканонических видов активности описаны в разделе Примеры.

Как отмечено выше, полипептид ΑΑΚδ может быть изменен различными путями, включая аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки. Методы таких манипуляций, в целом, известны в данной области техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей эталонного полипептида ΑΑΚδ могут быть получены путем введения мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменения нуклеотидной последовательности хорошо известны в данной области техники. См., например, Кипке1 (1985, Ргос. Αсаа. δοΐ. США. 82:488-492), Кипке1 е! а1., (1987, МеШоб8 ίη ЕпгушоЦ 154:367-382), патент США № 4873192, ХУа^ои, ί.Ό. е! а1., (Мо1еси1аг Вю1о§у оГ !Ье Сепе, РоийЬ Εάίίίοη, Веп)аш1п/Ситт1п§8, Мен1о Рагк, Са1Г., 1987) и цитированные в указанных источниках ссылки. Руководство по внесению соответствующих замен аминокислот, не влияющих на биологическую активность интересующего белка, может быть найдено в модели Дэйхоффа (ЭауЬоГГ е! а1., (1978), ΑΚίδ оГ Рго1ет δе^иеηсе аиб δΙπιΛιιΐΌ (Ν;·ιΐ1. Вютеб. Ве8. Роип6., ^δΗ^^οη, Э.С).

Аналогично, специалистам в данной области техники очевидно, как устранять и/или ослаблять проблему иммуногенности при ее возникновении при использовании полипептида ΑΑΚδ, например, путем применения автоматизированных программ компьютерного распознавания для идентификации потенциальных эпитопов Т-клеток и методов направленной разработки для идентификации менее иммуногенных форм.

Способы скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, созданных с помощью точечных мутаций или усечений и скрининга библиотеки кДНК на предмет генных продуктов, имеющих выбранное свойство, известны в данной области техники. Указанные способы можно адаптировать для быстрого скрининга генной библиотеки, созданной с помощью комбинаторного мутагенеза полипептидов ΑΑΚδ. Рекурсивный множественный мутагенез (ΚΕΜ), метод, который усиливает частоту возникновения функциональных мутантов в библиотеки, может применяться в комбинации со скрининговыми ана- 29 030461 лизами для идентификации вариантов полипептида ΆΆΚδ (АгкО и Уоигуаи (1992), Ргос. Ν;·ιΐ1. ^ай. 8с1. υδΆ 89:7811-7815; Эе1дгауе е! а1., (1993), Рго1еш Еидшеегшд, 6:327-331). Консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты на другую, имеющую сходные свойства, может являться желательным, как обсуждается более подробно ниже.

Биологически активные укороченные и/или вариантные полипептиды ΆΆΚδ могут содержать консервативные аминокислотные замены в различных положениях в их последовательности по сравнению с эталонным остатком аминокислоты ΆΆΚδ. Кроме того, природные варианты белков ΆΆΚδ были секвенированы и, как известно в данной области техники, являются, по меньшей мере, частично функционально взаимозаменяемыми. Таким образом, выбор положения аминокислот для введения консервативной или неконсервативной мутации в полипептид ΆΆΚδ на основании вариации природных последовательностей среди известных гомологов, ортологов и природных изоформ белков ΆΆΚδ человека, а также других видов белка ΆΆΚδ, является стандартной практикой.

Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области техники и, в целом, могут быть разделены на подклассы следующим образом.

Кислые: Остаток имеет отрицательный заряд из-за потери иона Н при физиологических значениях рН, и указанный остаток притягивается водным раствором таким образом, что поверхностные положения спрятаны внутри конформации пептида, в котором он содержится, когда указанный пептид находится в водной среде при физиологических значениях рН. Аминокислоты, содержащие кислые боковые цепи, включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту.

Основные: Остаток имеет положительный заряд из-за ассоциации с ионом Н при физиологических значениях рН или в пределах одной или двух единиц от физиологического значения рН (например, гистидин) и остаток притягивается водным раствором таким образом, что поверхностные положения спрятаны внутри конформации пептида, в котором он содержится, когда указанный пептид находится в водной среде при физиологических значениях рН. Аминокислоты, имеющие основную боковую цепь, включают аргинин, лизин и гистидин.

Заряженные: Остатки являются заряженными при физиологических значениях рН и, соответственно, включают аминокислоты, содержащие кислые или основные боковые цепи (т.е. глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аргинин, лизин и гистидин).

Гидрофобные: Остатки являются незаряженными при физиологических значениях рН, и остаток отталкивается водным раствором таким образом, что внутренние положения спрятаны внутри конформации пептида, в которой он находится в водной среде. Аминокислоты, имеющие гидрофобную боковую цепь, включают тирозин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин и триптофан.

Нейтральные/полярные: Остатки не заряжены при физиологических значениях рН, но остаток недостаточно отталкивается водным раствором таким образом, что внутренние положения спрятаны внутри конформации пептида, в которой он находится в водной среде. Аминокислоты, содержащие нейтральную/полярную боковую цепь, включают аспарагин, глутамин, цистеин, гистидин, серин и треонин.

Настоящее описание также характеризует конкретные аминокислоты как малые, если их боковые цепи не достаточно большие, даже в отсутствие полярных групп, для обеспечения гидрофобности. За исключением пролина, малые аминокислоты представляют собой аминокислоты, содержащие четыре атома углерода или менее, если по меньшей мере одна полярная группа находится на боковой цепи, и три атома углерода или менее, если нет. Аминокислоты, содержащие малую боковую цепочку, включают глицин, серин, аланин и треонин. Кодируемая генами вторичная аминокислота пролин представляет собой исключение из-за ее известного влияния на вторичную конформацию пептидных цепей. Структура пролина отличается ото всех других природных аминокислот тем, что его боковая цепочка связана с атомом азота α-аминогруппы, так же как и α-углеродом. Несколько матриц подобия аминокислот известно в данной области техники (см., например, матрицу РАМ120 и матрицу РАМ250, описанную, например, Дэйхоффом, ОауИоГГ е! а1., 1978, Ά тойе1 оГ еуо1ийоиагу сИаиде ш рго1ешк). Однако матрицы для определения отношений расстояния, описанные М.О. ОауИоГГ, (ей.), Άΐ^ оГ рго1еш кедиеисе аий кйисШге, Уо1. 5, р. 345-358, №йоиа1 Вютейюа1 РекеагсИ Роиийайои, VаκΗ^ηдЮη ОС и Ооиие! е! а1., (Зсюпсе, 256:14430-1445, 1992), включают пролин в той же группе, что и глицин, серин, аланин и треонин. Соответственно, в целях настоящего изобретения пролин классифицируют как малую аминокислоту.

Степень притяжения или отталкивания, необходимая для отнесения аминокислот к классу полярных или неполярных, является неоднозначной, и, соответственно, аминокислоты, которые конкретно рассматриваются согласно изобретению, были классифицированы как полярные или неполярные. Большинство аминокислот, которые не имеют конкретного названия, могут быть классифицированы на основе известного поведения.

Аминокислотные остатки могут быть также разделены на подклассы как циклические или нециклические и ароматические или неароматические (очевидные классификации на основе групп-заместителей боковых цепей остатков) и как маленькие или большие. Остаток считается маленьким, если он содержит

- 30 030461 в общем четыре атома углерода или менее, включая атом углерода карбоксила, при условии, что присутствует дополнительный полярный заместитель; в противном случае - три или менее. Маленькие остатки, безусловно, всегда являются неароматическими. В зависимости от их структурных свойств аминокислотные остатки могут входить в состав двух или более классов. Для аминокислот природных белков разделение на подклассы в соответствии с указанной схемой показано в табл. В.

ТаблицаВ

Подклассы аминокислот

Подклассы	Аминокислоты
Кислые	Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота
Основные	Нециклические: аргинин, лизин; Циклические: гистидин
Заряженные	Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аргинин, лизин, гистидин
Малые	Глицин, серин, аланин, треонин, пролин
Полярные/	Аспарагин, гистидин, глутамин, цистеин,
нейтральные	серин, треонин
Полярные/большие	Аспарагин, глутамин
Гидрофобные	Тирозин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан
Ароматические	Триптофан, тирозин, фенилаланин
Остатки,
влияющие на	Глицин и пролин
ориентацию цепи

Консервативная замена аминокислот также включает образование групп на основе боковых цепей. Например, группа аминокислот, имеющих алифатичекие боковые цепи, включает глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, включает серин и треонин; группа аминокислот, содержащих амидные боковые цепи, включает аспарагин и глутамин; группа аминокислот, содержащих ароматические боковые цепи, включает фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, содержащих основные боковые цепи, включает лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, содержащих боковые цепи, включающие серу, представляет собой цистеин и метионин. Например, имеются основания ожидать, что замещение лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или подобное замещение аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет оказывать значительное влияние на свойства полученного в результате варианта полипептида. Приводит ли изменение аминокислот к образованию функционально укороченного и/или вариантного полипептида ΑΑΚδ, можно с легкостью определить путем анализа его неканонической активности, как описано в настоящем документе. Консервативные замены показаны в табл. С. Аминокислотные замены в пределах объема изобретения, в целом, осуществляются путем выбора замен, которые значительно не отличаются по их влиянию на (а) поддержание структуры скелета пептида в области замены, (Ь) заряд или гидрофобность молекулы в области-мишени, (с) объем боковой цепи или (б) биологическую функцию. После введения замен варианты подвергали скринингу на предмет биологической активности.

- 31 030461

Таблица С

Примеры аминокислотных замен

Исходный остаток	Примеры замен	Предпочтительные замены
А1а	Уа1, Ьеи, 11е	Уа1
Агд	Ьуз, 61п, Азп	Ьуз
Азп	61η, ΗΪ3, Ьуз, Агд	С1п
Азр	С1и	С1и
Суз	Зег	Зег
С1п	Азп, ΗΪ3, Ьуз,	Азп
С1и	Азр, Ьуз	Азр
61у	Рго	Рго
ΗΪ3	Азп, 61п, Ьуз, Агд	Агд
Не	Ьеи, Уа1, МеЬ, А1а, РЬе, Ыог1еи	Ьеи
Ьеи	Ыог1еи, 11е, Уа1, МеЬ, А1а, РЬе	11е
Ьуз	Агд, 61п, Азп	Агд
МеЬ	Ьеи, 11е, РЬе	Ьеи
РЬе	Ьеи, Уа1, 11е, А1а	Ьеи
Рго	С1у	С1у
Зег	ТЬг	ТЬг
ТЬг	Зег	Зег
Тгр	Туг	Туг
Туг	Тгр, РЬе, ТНг, Зег	РЬе
Уа1	Т1е, Ьеи, МеЬ, РЬе, А1а, ЫогТеи	Ьеи

В альтернативном варианте подобные аминокислоты для создания консервативных замен могут быть разделены на три категории на основе идентичности боковых цепей. Первая группа включает глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аргинин, лизин, гистидин, все из которых имеют заряженные боковые цепи; вторая группа включает глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, глутамин, аспарагин; и третья группа включает лейцин, изолейцин, валин, аланин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, как описано в источнике /нЪау, О., ВгосНеппЛгу, ίΕΐτά ебнют Жт. С. Βτο^η РиЪйзйегз (1993).

Таким образом, предсказанные заменимые аминокислотные остатки в укороченном и/или вариантном полипептиде ААКЗ, как правило, заменяются на другой аминокислотный остаток из того же семейства боковых цепей. В альтернативном варианте могут быть введены случайные мутации по всей или части кодирующей последовательности ААКЗ, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут подвергаться скринингу на предмет видов активности исходного полипептида для идентификации мутантов, которые сохраняют указанные активности. После мутагенеза кодирующей последовательности закодированный пептид можно экспрессировать рекомбинантным путем и можно определить активности пептида. Заменимые аминокислотные остатки представляют собой остатки, которые могут быть измененными по сравнению с эталонной последовательностью полипептида согласно варианту реализации изобретения без устранения или существенного изменения одной или более видов активности. Соответствующее изменение, по существу, не устраняет один из указанных видов активности, например активность по меньшей мере составляет 20, 40, 60, 70 или 80 100, 500, 1000% или более от активности эталонной последовательности .АШЗ. Незаменимые аминокислотные остатки представляют собой остатки, изменение которых по сравнению с эталонной последовательностью полипептида ААКЗ приводит к устранению активности исходной молекулы, например сохраняется менее чем 20% эталонной активности. Например, указанные незаменимые аминокислотные остатки включают остатки, которые являются консервативными в полипептидах ААКЗ у разных видов, включая такие последовательности, которые являются консервативными по активному сайту (сайтам) связывания или мотиву (мотивам) полипептидов ААКЗ из различных источников.

В целом, полипептиды и гибридные полипептиды (так же как и кодирующие их полинуклеотиды) являются изолированными. Изолированный полипептид или полинуклеотид представляет собой полипептид или полинуклеотид, который был выделен из его естественного окружения. Например, природный белок является изолированным, если он отделен от некоторых или всех существующих с ним в естественной системе материалов. Предпочтительно указанные полипептиды являются по меньшей мере примерно на 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% чистыми. Полинуклеотид считается изолиро- 32 030461 ванным, если, например, он был клонирован в векторе, который не является частью естественного окружения.

Конкретные варианты реализации изобретения также включают димеры полипептидов ΑΑΚδ. Димеры могут включать, например, гомодимеры между двумя идентичными полипептидами ΑΑΚδ, гетеродимеры между двумя различными полипептидами ΑΑΚδ (например, полноразмерным полипептидом ΥΚδ и укороченным полипептидом ΥΚδ; укороченным полипептидом ΥΚδ и укороченным полипептидом ^Κδ), и/или гетеродимеры между полипептидом ΑΑΚδ и гетерологичным полипептидом. Конкретные гетеродимеры, такие как гетеродимеры между полипептидом ΑΑΚδ и гетерологичным полипептидом, могут являться бифункциональными, как описано в настоящем документе.

Также предложены мономеры полипептидов ΑΑΚδ, включая изолированные мономеры полипептидов ΑΑΚδ, которые, по существу, не димеризуются со вторым полипептидом ΑΑΚδ вследствие одного или более замещения, усечения, делеции, добавления, химической модификации или комбинации указанных изменений. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения мономерные полипептиды ΑΑΚδ обладают биологическими видами активности, включая неканонические виды активности, которыми не обладают димерные или мультимерные комплексы полипептидов ΑΑΚδ.

Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения также предложено применение модифицированных полипептидов ΑΑΚδ, включая модификации, улучшающие желательные характеристики полипептида ΑΑΚδ, описанного в настоящем документе. Модификации полипептидов ΑΑΚδ согласно изобретению включают химическую и/или ферментативную дериватизацию одной или более составляющих их аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации скелета и модификации Ν- и С-конца, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и присоединение углеводных или липидных фрагментов, кофакторов и т. п. Типичные модификации также включают пегилирование полипептида ΑΑΚδ (см., например, νοτοηο8θ апН Нат8, ΑНνаηсеН Эгид ОеПуегу Κονίογ8, 54:453-456, 2002 и Ра8и1 οί а1., Ехрей Оршюп. ТНег. Раίеηί8, 14(6):859-894, 2004, обе включены сюда посредством ссылки).

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой хорошо известный полимер, обладающий свойством растворимости в воде и во многих органических растворителях, отсутствием токсичности и отсутствием иммуногенности. Также он является прозрачным, бесцветным, не имеет запаха и является химически стабильным. По этим и другим причинам ПЭГ был выбран в качестве предпочтительного полимера для присоединения и использовался исключительно в целях иллюстрации, а не в качестве ограничения. Подобные продукты могут быть получены при использовании других растворимых в воде полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, поливинилспирт, другие поли(алкиленоксиды), такие как поли(пропиленгликоль) и т.п., поли(оксиэтилированные полиолы), такие как поли(оксиэтилированный глицерин) и т. п., карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, этилен/малеиновый ангидрид и полиаминокислоты. Специалисты в данной области техники смогут выбрать желательный полимер на основе желаемой дозы, времени циркуляции, устойчивости к протеолизу и других факторов.

В частности, многочисленные разнообразные производные ПЭГ являются доступными и подходящими для применения в получении ПЭГ-конъюгатов. Например, ПЭГ-реагенты компании ΝΟΡ Отр.® которые продаются под торговой маркой δυΝΒΚ!ΟΗΤ® δοπο8, предлагают множество ПЭГпроизводных, включая метоксиполиэтиленгликоли и активированные производные ПЭГ, такие как метокси-ПЭГ амины, малеимиды, сложные эфиры Ν-гидроксисукцинамида и карбоновые кислоты, для сочетания с помощью различных способов с Ν-концевой, С-концевой или любой внутренней аминокислотой полипептида ΑΑΚδ. Улучшенная технология пегилирования №1<1аг ТНегареи1ю8' также предлагает различные технологии ПЭГ-присоединения для потенциального улучшения безопасности и эффективности терапевтических средств на основе полипептида ΑΑΚδ.

Поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных заявок также позволит специалистам в данной области техники рассмотреть настоящее изобретение с учетом возможных значительных технологий ПЭГ-сочетания и ПЭГ-производных. Например, патенты США № 6436386; 5932462; 5900461; 5824784 и 4904584, содержание которых полностью включено посредством ссылки, описывают указанные технологи и производные, и способы для их получения.

Согласно конкретным аспектам изобретения для модификации полипептидов ΑΑΚδ согласно изобретению можно использовать метод хемоселективного лигирования, например, путем присоединения полимеров сайт-специфическим и контролируемым образом. Указанный метод, в целом основан на включении хемоселективных якорных фрагментов в белковый каркас либо химическим, либо рекомбинантным образом, и последующей модификации с помощью полимера, содержащего комплементарный линкер. В результате процесс сборки и ковалентную структуру полученного конъюгата белок-полимер можно контролировать, обеспечивая целесообразную оптимизацию свойств лекарственного средства, таких как эффективность и фармакокинетические свойства (см., например, ΚοΟιοπΗοογΓογ СиггеШ Оршюп ίη СНетюа1 Вюкду, 9:555-560, 2005).

Согласно другим вариантам реализации изобретения также предложены слитые белки полипептида ΑΑΚδ с другими белками, и указанные слитые белки могут повышать биологическую активность, секре- 33 030461 цию, направленность, время биологической жизни, способность проникать через клеточные мембраны или гематоэнцефалический барьер или фармакокинетические свойства указанного полипептида ΑΑΚδ. Примеры слитых белков, которые улучшают фармакокинетические свойства (модификаторов фармакокинетических свойств (ΡΚ)), включают, но не ограничиваются перечисленными, белки слияния с человеческим альбумином (ОкЬогп е( а1.: Еиг. I. РЬагтасо1. 456(1-3):149-158, (2002)), Рс-доменами антитела, последовательностями поли-С1и или поли-Α8р и трансферрином. Кроме того, слитые белки с информационно измененными полипептидными последовательностями состоят из аминокислот Рго, ΑΕι и δе^ ('^Αδγ^οη) или гидроксиэтилкрахмала (который продается под торговой маркой ΗΕδΥΕΑΤΙΟΝ®) обеспечивают простой способ повышения гидродинамического объема полипептида ΑΑΚδ. Указанное дополнительное удлинение вносит объемную рандомную структуру, которая значительно увеличивает размер полученного в результате слитого белка. Указанным способом, как правило, быстрый клиренс более маленьких полипептидов ΑΑΚδ путем почечной фильтрации замедляется на несколько порядков величины. Кроме того, также было показано, что использование гибридизованных с 1д С белков обеспечивает проницаемость некоторых слитых белков через гематоэнцефалический барьер (Ри е( а1., (2010), ΒιΟη Ьек. 1352:208-13).

Примеры слитых белков, которые улучшают проницаемость через клеточные мембраны, включают слитые белки с последовательностями транслокации через мембрану. В указанном контексте, термин последовательности транслокации через мембрану относится к природным и синтетическим аминокислотным последовательностям, которые способны транслоцироваться через клеточную мембрану. Типичные последовательности транслокации через мембрану включают последовательности на основе природных последовательностей транслокации через мембрану, которые являются производными белка Τаΐ и белка гомеозисной транскрипции Αηΐеηηареб^а, так же как и синтетические последовательности, транслоцирующиеся через мембрану целиком или частично, на основе остатков полиаргинина и полилизина. Типичные последовательности транслокации через мембрану включают, например, последовательности, описанные в следующих патентах США: υδ 5652122; υδ 5670617; υδ 5674980; υδ 5747641; υδ 5804604; υδ 6316003; υδ 7585834; υδ 7312244; υδ 7279502; υδ 7229961; υδ 7169814; υδ 7453011; υδ 7235695; υδ 6982351; υδ 6605115; υδ 7306784; υδ 7306783; υδ 6589503; υδ 6348185; υδ 6881825; υδ 7431915 и публикациях международных заявок: АО 00/74701 Α2; АО 2007/111993 Α2; АО 2007/106554 Α2; АО 02/069930 Α1; АО 03/049772 Α2; АО 03/106491 Α2 и АО 2008/063113 Α1.

Необходимо понимать, что гибкий молекулярный линкер (или спейсер) необязательно ковалентно соединяет и располагается между полипептидом ΑΑΚδ и любым из слитых белков, описанными в настоящем документе.

Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации изобретения полипептид ΑΑΚδ может содержать синтетические или секретированные естественным образом сигнальные последовательности, которые являются производными других хорошо описанных секретируемых белков. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанные белки могут подвергаться процессингу путем протеолитического расщепления с образованием полипептида ΑΑΚδ ίη κίίυ. Указанные слитые белки включают, например, гибриды полипептида ΑΑΚδ с убиквитином с получением новых Ν-концевых аминокислот или применения секреции сигнала для обеспечения высокого уровня секреции полипептида ΑΑΚδ во внеклеточную среду или Ν- или С-концевыми эпитопными метками для облегчения очистки или выявления.

Полипептиды ΑΑΚδ, описанные в настоящем документе, могут быть получены с помощью любого подходящего способа, известного специалистам в данной области техники, такого как рекомбинантные технологии. Кроме способов рекомбинантной продукции, полипептиды согласно изобретению могут быть получены путем прямого синтеза пептида с использованием твердофазных методов (Метйе1б, ί. Αт. СЬет. δοο 85:2149-2154 (1963)). Синтез белка можно проводить с использованием неавтоматизированных или автоматизированных способов.

Автоматизированный синтез может осуществляться, например, с использованием пептидного синтезатора Αрр1^еб Β^ο8у8ΐет8 431Α (Регкт Е1тег). В альтернативном варианте различные фрагменты могут быть синтезированы химическим путем раздельно и объединены с использованием химических способов с получением желательной молекулы.

IV. Полинуклеотиды ΑΑΚδ.

Варианты реализации настоящего изобретения включают полинуклеотиды, которые кодируют один или более новых идентифицированных белковых фрагментов аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), а также соответствующие комплементарные последовательности, варианты и фрагменты. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полинуклеотид ΑΑΚδ кодирует целый или часть полипептида (полипептидов) эталонной последовательности ΑΑΚδ, приведенной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, которые представляют собой сплайс-варианты, протеолитические фрагменты или другие типы фрагментов аспартил-тРНК-синтетазы. Конкретные варианты реализации изобретения включают полинуклеотиды, кодирующие полипептиды или белки, которые содержат последовательность одной или более границ сплайсинга указанных сплайс-вариантов, а также соответствующие комплементарные последовательности, варианты и фрагменты. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, как правило, из-за

- 34 030461 уникальной природы выбранного сплайс-варианта ΑΑΚδ, в котором экзоны скомбинированы новым или исключительным образом, эталонные последовательности полинуклеотида ΑΑΚδ содержат уникальную или исключительную границу сплайсинга. Конкретные варианты реализации изобретения исключают соответствующий полноразмерный полинуклеотид ΑΑΚδ.

Также полинуклеотиды ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению включают праймеры, зонды, антисмысловые олигонуклеотиды и агенты на основе интерферирующей РНК, которые содержат целиком или частично указанные эталонные полинуклеотиды, которые являются комплементарными всему или части указанного эталонного полинуклеотида или которые специфично гибридизуются с указанными эталонными полинуклеотидами, описанными в настоящем документе.

Термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота в настоящем описании обозначает мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Термин, как правило, относится к полимерной форме нуклеотидов, состоящей по меньшей мере из 10 оснований в длину, либо к рибонуклеотидам или дезоксинуклеотидам или модифицированной форме любого типа нуклеотида. Термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Термины ДНК и полинуклеотид и нуклеиновая кислота относятся к молекуле ДНК, которая была изолирована в свободной от геномной ДНК конкретного вида форме. Таким образом, изолированный сегмент ДНК, кодирующий полипептид, относится к сегменту ДНК, который содержит одну или более кодирующих последовательностей и является при этом, по существу, изолированным от (или очищенным в форме, свободной от) тотальной геномной ДНК того вида, из которого указанный сегмент ДНК был получен. Также включены некодирующие полинуклеотиды (например, праймеры, зонды, олигонуклеотиды), которые не кодируют полипептид ΑΑΚδ. Термины сегмент ДНК и полинуклеотид включают сегменты ДНК и более маленькие фрагменты указанных сегментов, и также рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фагмиды, фаги, вирусы и т. п.

Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не должны, присутствовать в полинуклеотиде согласно настоящему изобретению, и указанный полинуклеотид может, но не обязательно связан с другими молекулами и/или поддерживающими материалами. Таким образом, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, независимо от самой длины кодирующей последовательности, могут быть комбинированы с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикции ферментом, множество сайтов клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., таким образом, что их общая длина может значительно варьировать.

Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент полинуклеотида почти любой длины; при этом общая длина предпочтительно ограничивается легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК. Включены полинуклеотиды, длина которых составляет примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 или более (включая все целые числа между ними) оснований, включая любую часть или фрагмент (например, более чем примерно 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов в длину) эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ (например, количество оснований Х-Υ, в которых X составляет примерно 1-3000 или более и Υ составляет примерно 10-3000 или более) или ее комплемента.

Варианты реализации настоящего изобретения также включают варианты последовательности эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ. Варианты полинуклеотида могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным полинуклеотидом. В целом, вариант последовательности эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ может являться по меньшей мере примерно на 30, 40 50, 55, 60, 65, 70%, в целом по меньшей мере примерно на 75, 80, 85%, желательно примерно от 90 до 95% или более и более предпочтительно примерно на 98% или более идентичным конкретной нуклеотидной последовательности, по результатам определения с помощью программ выравнивания последовательностей, описанных в другой части настоящего документа, с использованием параметров по умолчанию. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения варианты могут отличаться от эталонной последовательности примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (включая все целые числа между ними) или более оснований. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, например, когда вариант полинуклеотида кодирует полипептид ΑΑΚδ, обладающий неканонической активностью, желаемая активность кодируемого полипептида ΑΑΚδ, по существу, не уменьшается по сравнению с немодифицированным полипептидом. Влияние на активность закодированного полипептида, в целом, можно оценивать, как описано в настоящем документе.

Конкретные варианты реализации изобретения включают полинуклеотиды, которые гибридизуются с последовательностью эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ или с соответствующими комплементарными последовательностями, в условиях жесткости, описанных ниже. В настоящем описании термин гибридизуется в условиях низкой жесткости, средней жесткости, высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости описывает условия для гибридизации и промывки. Руководство для проведения реак- 35 030461 ций гибридизации можно найти в источнике Λπβπ^1 е! а1., (1998, выше), разделах 6.3.1-6.3.6. Водные и неводные способы описаны в указанной ссылке, и любые их них можно применять.

Ссылка в настоящем описании на условия низкой жесткости включает и охватывает по меньшей мере от примерно 1 об.% до по меньшей мере примерно 15 об.% формамида, и по меньшей мере от примерно 1 до по меньшей мере примерно 2 М соли для гибридизации при 42°С, и по меньшей мере от примерно 1 до по меньшей мере примерно 2 М соли для промывки при 42°С. Условия низкой жесткости также могут включать 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NаΗΡ0₄ (рН 7,2), 7% ДСН для гибридизации при 65°С и (ί) 2х88С, 0,1% ДСН или (ίί) 0,5% БСА, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ NаΗΡ04 (рН 7,2), 5% ДСН для промывки при комнатной температуре. Один вариант реализации условий низкой жесткости включает гибридизацию в 6хδδС (хлорид натрия/цитрат натрия) примерно при 45°С с последующими двумя промывками в 0,2х88С, 0,1% ДСН по меньшей мере при 50°С (температура промывок может быть повышена до 55°С для условия низкой жесткости).

Условия средней жесткости включают и охватывают от по меньшей мере примерно 16 до по меньшей мере примерно 30 об.%, и от по меньшей мере примерно 0,5 до по меньшей мере примерно 0,9 М раствора соли для гибридизации при 42°С, и от по меньшей мере примерно 0,1 до по меньшей мере примерно 0,2 М раствора соли для промывки при 55°С. Условия средней жесткости также могут включать 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NаΗΡ0₄ (рН 7,2), 7% ДСН для гибридизации при 65°С и (ί) 2х88С, 0,1% ДСН или (ίί) 0,5% БСА, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ NаΗΡ0₄ (рН 7,2), 5% ДСН для промывки при 60-65°С. Один вариант реализации условий средней жесткости включает гибридизацию в 6х88С примерно при 45°С, с последующей одной или более промывками в 0,2х88С, 0,1% ДСН при 60°С. Условия высокой жесткости включают и охватывают от по меньшей мере примерно 31 до по меньшей мере примерно 50 об.% формамида, и от примерно 0,01 до примерно 0,15 М раствора соли для гибридизации при 42°С, и от примерно 0,01 до примерно 0,02 М раствора соли для промывки при 55°С.

Условия высокой жесткости также могут включать 1% БСА, 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NаΗΡ0₄ (рН 7,2), 7% ДСН для гибридизации при 65°С и (ί) 0,2х88С, 0,1% ДСН или (й) 0,5% БСА, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ NаΗΡ04 (рН 7,2), 1 % ДСН для промывки при температуре выше 65°С. Один вариант реализации условий высокой жесткости включает гибридизацию в 6х88С примерно при 45°С, с последующей одной или более промывкой в 0,2х88С, 0,1% ДСН при 65°С. Один вариант реализации условий очень высокой жесткости включает гибридизацию в 0,5 М растворе фосфата натрия, 7% ДСН при 65°С, с последующей одной или более промывкой в 0,2х88С, 1% ДСН при 65°С.

Другие условия жесткости хорошо известны в данной области техники, и специалисту в данной области техники ясно, что различные факторы можно регулировать для оптимизации специфичности гибридизации. Оптимизация жесткости конечных промывок может осуществляться для обеспечения высокой степени гибридизации. Подробные примеры см. в источниках Λυβυ^1 е! а1., выше, р. 2.10.1-2.10.16 и δатЬ^оок е! а1. (1989, выше) в разделах 1.101-1.104.

Тогда как жесткие отмывки, как правило, осуществляют при температурах от примерно 42 до 68°С, специалистам в данной области техники очевидно, что другие температуры могут являться подходящими для жестких условий. Максимальная скорость гибридизации, как правило, происходит при температуре примерно на 20-25°С ниже Т_т для образования гибрида ДНК-ДНК. Хорошо известно в данной области техники, что Т_т представляет собой температуру плавления или температуру, при которой две комплементарные полинуклеотидные последовательности диссоциируют. Способы оценки Тт хорошо известны в данной области техники (см. Λυβυ^1 е! а1., выше, р. 2.10.8).

В целом, Тт идеального совпадающего дуплекса ДНК можно предсказать приближенно с помощью формулы Т_т=81,5+16,6 (1о§₁₀ М)+0,41(%С+С)-0,63 (% формамид)-(600/длина), где М представляет собой концентрацию №+, предпочтительно в диапазоне от 0,01 до 0,4 М; %С+С представляет собой процент суммы оснований гуанозина и цитозина от общего числа оснований в диапазоне между 30 и 75% С+С; % формамид представляет собой процентную концентрацию формамида по объему; длина представляет собой число пар оснований в ДНК-дуплексе. Тт дуплекса ДНК снижается приблизительно на 1°С с каждым повышением на 1% количества случайных несовпадений пар оснований. Отмывку в целом осуществляют при Т_т-15°С для условий высокой жесткости или Т_т-30°С для условий средней жесткости.

В одном примере способа гибридизации мембрану (например, нитроцеллюлозную мембрану или нейлоновую мембрану), содержащую иммобилизованную ДНК, гибридизовали в течение ночи при 42°С в буфере для гибридизации (50% деионизированный формамид, 5х88С, 5х раствор Денхардта (0,1% фиколл, 0,1% поливинилпирролидон и 0,1% бычий сывороточный альбумин), 0,1% ДСН и 200 мг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых), содержащую меченый зонд. Затем мембрану подвергали двум последовательным отмывкам средней жесткости (т.е. 2х88С, 0,1% ДСН в течение 15 мин при 45°С с последующей 2х88С, 0,1% ДСН в течение 15 мин при 50°С), с последующими двумя последовательными отмывками высокой жесткости (т.е. 0,2х88С, 0,1% ДСН в течение 12 мин при 55°С с последующей 0,2х88С и 0,1% раствора ДСН в течение 12 мин при 65-68°С).

Как отмечено выше, конкретные варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидам ΛΛΚδ, которые кодируют полипептид ΛΛΚδ. Среди других применений, указанные варианты реализа- 36 030461 ции изобретения можно использовать для рекомбинантной продукции желательного полипептида ААК8 или его варианта или для экспрессии полипептида ААК8 в выбранной клетке или субъекте. Специалистам в данной области техники очевидно, что из-за вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, описанный в настоящем документе. Некоторые из указанных полинуклеотидов могут иметь минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые различаются из-за различий в частоте использования кодонов, конкретно рассматриваются согласно настоящему изобретению, например, полинуклеотиды, которые оптимизированы для выбора кодона человека и/или примата.

Таким образом, множество полинуклеотидов может кодировать полипептиды ААК8 согласно изобретению. Более того, полинуклеотидные последовательности можно обрабатывать в различных целях. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными, встраивание предпочтительных кодонов для усиления экспрессии полинуклеотида в различных организмах (см., в целом №катига е! а1., Νιιο. Λαίά. Кек. (2000), 28(1):292). Кроме того, молчащие мутации можно встраивать для введения или устранения сайтов рестрикции, снижения плотности динуклеотидных мотивов СрС (см., например, Катеба е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип. (2006), 349(4):1269-1277) или снижения способности одноцепочечной последовательности формировать структуры типа стебель-петля: (см., например, 2икег М., №с1. Ас1б Кек. (2003); 31(13):3406-3415). Кроме того, экспрессию у млекопитающих можно также оптимизировать путем включения консенсусной последовательности Козака (Ко/ак) [т.е. (а/д)сс(а/д)ссАТОд] в стартовый кодон. Консенсусные последовательности Козака, применимые в указанных целях, известны в данной области техники (МайуЬ е! а1. ΡNА8, 92:2662-2666 (1995); МайуЬ е! а1. Рго!. Ехр. & РипГ. 6, 124 (1995)).

Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, независимо от длины самой кодирующей последовательности, можно комбинировать с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикции ферментами, множество сайтов клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., таким образом, что их общая длина может значительно варьировать. Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент полинуклеотида почти любой длины; при этом общая длина предпочтительно ограничивается легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантный ДНК.

Полинуклеотиды и их гибриды можно получать, обрабатывать и/или экспрессировать с использованием любого из различных общепринятых методов, известных и доступных в данной области техники. Например, полинуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды согласно изобретению или слитые белки или их функциональные эквиваленты, можно применять в рекомбинантных молекулах ДНК для направления экспрессии полипептида ААК8 в соответствующих клетках хозяина. Из-за присущей генетическому коду вырожденности могут быть получены другие ДНК последовательности, которые кодируют, по существу, такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и указанные последовательности можно применять для клонирования и экспрессии конкретного полипептида.

Специалистам в данной области техники очевидно, что может быть предпочтительным в некоторых примерах получать кодирующие полипептид нуклеотидные последовательности, имеющие неприродные кодоны. Например, кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина, могут быть выбраны для повышения скорости экспрессии белка или для продукции рекомбинантного РНК-транскрипта, имеющего желаемые свойства, такие как время полужизни, которое больше по сравнению с транскприптом, полученным из природной последовательности. Указанные полинуклеотиды обычно называют кодон-оптимизированные. Любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем документе, можно использовать в кодон-оптимизированной форме. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полинуклеотид может быть кодон-оптимизированным для использования в специфических бактериях, таких как Е.сой, или дрожжах, таких как 8.сегеу1К1ае (см., например, Вигдекк-Вго^п е! а1., Рго1еш Ехрг. РипГ. 59:94-102, 2008; Егто1аеуа Μ.Ό. (2001), Сигг. 1кк. Мо1. Вю1. 3(4):91-7; \\е1сП е! а1., РЬо8 ΟΝΕ, 4(9):е7007 бо1:10.1371/|оита1.ропе.0007002).

Более того, полинуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению могут быть сконструированы с использованием способов, в целом известных в данной области техники, для изменения кодирующих полипептидных последовательностей в различных целях, включая, но не ограничиваясь перечисленными: изменения, которые приводят к модификации клонирования, процессинга, экспрессии и/или активности генного продукта.

В соответствии с другим аспектом изобретения полинуклеотиды, кодирующие полипептиды согласно изобретению, можно доставлять субъекту ίη У1уо, например, с использованием методов генной терапии. Генная терапия, в целом, относится к переносу гетерологичных нуклеиновых кислот в конкретные клетки, клетки-мишени, млекопитающего, в частности, человека, страдающего нарушением или состоянием, для лечения которого требуется указанная терапия. Нуклеиновая кислота вводится в выбранные клетки-мишени таким образом, что экспрессируется гетерологичная ДНК, и, таким образом, продуцируется закодированный терапевтический продукт.

- 37 030461

Различные вирусные векторы, которые можно применять для генной терапии, как описано в настоящем документе, включают аденовирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы, аденоассоциированный вирус (ААУ) или предпочтительно РНК-вирус, такой как ретровирус. Предпочтительно ретровирусный вектор представляет собой производное ретровируса мышей или птиц или представляет собой лентивирусный вектор. Предпочтительный ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Примеры ретровирусных векторов, в которые может быть встроен один чужеродный ген, включают, но не ограничиваются ими: вирус мышиного лейкоза Молони (МоМиЬУ), вирус саркомы мышей Харви (НаМи8У), вирус мышиной опухоли молочной железы (МиМТУ), вирус иммунодефицита обезьян (8ГУ), бычий вирус иммунодефицита (ВЕУ), вирус иммунодефицита человека (ШУ) и вирус саркомы Рауса (К8У). Ряд дополнительных ретровирусных векторов может включать множество генов. Все из указанных векторов могут переносить или встраивать ген селективного маркера таким образом, что указанные трансдуцированные клетки могут быть идентифицированы и генерированы. Мишень-специфичный вектор может быть создан, например, путем встраивания интересующей последовательности полипептида, связывающегося с помощью цинкового пальца с ДНК, в вирусный вектор, наряду с другим геном, кодирующим лиганд рецептора специфической клетки-мишени. Могут быть созданы мишень-специфичные ретровирусные векторы путем встраивания, например, полинуклеотида, кодирующего белок (димер). В качестве примера направленность можно осуществлять путем использования антитела для направленности на ретровирусный вектор. Специалистам в данной области техники известно или же они могут с легкостью определить без излишней экспериментальной работы специфические полинуклеотидные последовательности, которые могут быть встроены в ретровирусный геном для обеспечения мишеньспецифической доставки ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид белка, связывающегося с нуклеотидом, имеющим цинковый палец.

Поскольку рекомбинантные ретровирусы являются дефектными, они требуют помощи для продукции инфекционных векторных частиц. Указанная помощь может быть обеспечена, например, путем использования хелперных клеточных линий, которые содержат плазмиды, кодирующие все структурные гены ретровируса под контролем регуляторных последовательностей внутри ЬТК. Указанные плазмиды лишены нуклеотидной последовательности, которая обеспечивает механизм упаковки для распознавания РНК-транскрипта для инкапсулирования. Хелперные клеточные линии, которые имеют делеции сигнала упаковки, включают, но не ограничиваются перечисленными, Р812, РА317 и РА12, например. Указанные клеточные линии продуцируют пустые вирионы, так как никакой геном не упаковывается. Если ретровирусный вектор вводится в такую клетку, в которой сигнал упаковки является интактным, но структурные гены не замещены другими интересующими генами, вектор может быть упакован, и векторный вирион продуцируется. Векторные вирионы, продуцированные указанным способом, могут затем использоваться для инфицирования тканевой клеточной линии, такой как клетки ШН 3Т3, для продукции больших количеств гибридных ретровирусных вирионов.

Для генной терапии также можно применять методы невирусной доставки, включая, например, комплексы ДНК-лиганд, комплексы аденовирус-лиганд-ДНК, непосредственную инъекцию ДНК, преципитацию СаРО₄, методы генной пушки, электропорацию, липосомы, липофекцию и т.п. Любой из указанных способов хорошо доступен специалистам в данной области техники и является подходящим для применения согласно настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники доступны другие подходящие способы, и необходимо понимать, что настоящее изобретение можно осуществлять с использованием любого из доступных способов трансфекции. Липофекцию можно осуществлять путем инкапсулирования изолированной молекулы ДНК в липосомную частицу и приведения указанной липосомной частицы во взаимодействие с клеточной мембраной клетки-мишени. Липосомы представляют собой самособирающиеся коллоидные частицы, в которых липидный бислой, состоящий из амфифильных молекул, таких как фосфатидилсерин или фосфатидилхолин, инкапсулирует часть окружающей среды, например, липидный бислой окружает гидрофильную внутреннюю часть. Могут быть сконструированы униламеллярные и мультиламеллярные липосомы таким образом, что внутренняя часть содержит желаемое химическое соединение, лекарственное средство или, как в примере изобретения, изолированную молекулу ДНК.

Согласно другому аспекту полинуклеотиды, кодирующие полипептиды согласно изобретению, можно применять для экспрессии и доставки полипептида ААК8 в рамках клеточной терапии. Соответственно, согласно другому аспекту настоящее изобретение включает клеточную терапию для лечения заболевания или нарушения, включающую введение хозяйских клеток, экспрессирующих или способных экспрессировать полипептид ААК8.

Клеточная терапия включает введение клеток, которые были селектированы, размножены и фармакологически обработаны или изменены (т.е. генетически модифицированы) вне организма (ВоМ1диои, С. е! а1., Се11 ТЬегару: АсЫеуетеШк ;πιά РегкресЬуек (1999), Наета1о1одюа, 84, р. 1110-1149). Указанные клетки-хозяева включают, например, первичные клетки, включая макрофаги и стволовые клетки, которые были генетически модифицированы для экспрессии полипептида ААК8. Целью клеточной терапии является замещение, восстановление или усиление биологической функции поврежденных тканей или органов.

- 38 030461

Применение трансплантированных клеток исследовали для лечения различных эндокринных нарушений, таких как анемия и карликовость, гематологических нарушений, почечной и печеночной недостаточности, недостаточности гипофиза и ЦНС и сахарного диабета (и1ийад е! а1., ΤесЬпо1оду оГ МаттаПаи Се11 Еисарки1аПои (2000), Айνапсей Эгид ОеПуегу ^ухете, 42, р. 29-64). Трансплантированные клетки могут функционировать путем высвобождения биоактивных соединений, таких как полипептид ΆΆΚδ согласно изобретению, для замещения эндогенных полипептидов ΆΆΚδ, которые отсутствуют или продуцируются в недостаточном количестве в поврежденной системе.

Варианты реализации настоящего изобретения также включают олигонуклеотиды для детектирования, амплификации, терапии с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, или для других целей. Для указанных и связанных целей предполагается, что термин олигонуклеотид, или олиго, или олигомер включает единственный олигонуклеотид, а также множество олигонуклеотидов и относится к любому полимеру, состоящему из двух или более нуклеотидов, нуклеозидов, нуклеотидных оснований или родственных соединений, используемых в качестве реагента в способах амплификации согласно настоящему изобретению, а также последующих способах выявления. Олигонуклеотид может представлять собой ДНК и/или РНК и/или их аналоги.

Термин олигонуклеотид необязательно обозначает любую конкретную функцию реагента, вместо этого он используется как общий термин для всех таких реагентов, которые описаны в настоящем документе. Олигонуклеотид может иметь различные функции, например, он может действовать как праймер, если он способен гибридизоваться с комплементарной цепочкой и может также быть удлинен в присутствии полимеразы нуклеиновых кислот, указанный олигонуклеотид может обеспечивать промотор, если он содержит последовательность, распознающуюся РНК-полимеразой, и позволяет транскрипцию, он может функционировать для предотвращения гибридизации или препятствовать удлинению праймера, если расположен и/или модифицирован соответствующим образом. Олигонуклеотид также может действовать в качестве зонда или антисмыслового агента. Олигонуклеотид может быть фактически любой длины, которая ограничивается только его специфической функцией, например, в реакции амплификации, в выявлении продукта реакции амплификации или при применении в качестве антисмыслового агента или РНК-интерферирующего агента. Любой из олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе, может использоваться в качестве праймера, зонда, антисмыслового олигомера или агента на основе интерферирующей РНК.

Термин праймер в настоящем описании относится к одноцепочечному олигонуклеотиду, способному действовать как точка инициации для зависимого от матрицы синтеза ДНК в подходящих условиях, определяемых, например, буфером и температурой, в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и агентов для полимеризации, таких как ДНК- или РНК-полимераза или обратная транскриптаза. Длина праймера в любом конкретном случае зависит, например, от предполагаемого применения праймера и в целом лежит в диапазоне от примерно 15 до 30 нуклеотидов, хотя можно применять более короткие и более длинные праймеры. Молекулы коротких праймеров, в целом, требуют более холодных температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Праймер не должен отображать точную последовательность матрицы, но должен быть достаточно комплементарным для гибридизации с указанной матрицей. Сайт праймера представляет собой участок матрицы, с которым праймер гибридизуется. Пара праймеров представляет собой набор праймеров, включая расположенный выше в направлении 5'-праймер, который гибридизуется с 5'-концом последовательности, которую предполагается амплифицировать, и расположенный ниже в направлении 3'-праймер, который гибридизуется с комплементом 3'-концом последовательности, которую предполагается амплифицировать.

Термин зонд в настоящем описании включает иммобилизованную на поверхности или растворимую, но способную быть иммобилизованной, молекулу, которая может быть распознана конкретной мишенью. См., например, патент США № 6582908 для примера чипов, имеющих все возможные комбинации зондов с 10, 12 и более основаниями. Зонды и праймеры в настоящем описании, как правило, содержат по меньшей мере 10-15 заменимых нуклеотидов известной последовательности. Для повышения специфичности также можно применять более длинные зонды и праймеры, такие как зонды и праймеры, которые содержат по меньшей мере 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или по меньшей мере 150 нуклеотидов эталонной последовательности ΆΆΚδ или ее комплемента. Зонды и праймеры могут быть значительно длиннее, чем указанные примеры, и необходимо понимать, что может использоваться любая длина в соответствии с уровнем техники и настоящим изобретением, включая таблицы, фигуры и перечень последовательностей.

Способы для получения и использования зондов и праймеров описаны в ссылках, например δатЪ^оок, 1. е! а1. (1989), Мо1еси1аг С1отид: Ά ЬаЪогаШгу Маииа1, 2^ий кир. ей., уо1. 1-3, Со1й δр^^ид НагЪог Ргекк, Р1а1иу1е№ Ν.Υ.; АиκиЪе1, Р.М. е! а1. (1987), Сиггет Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Огееие РиЪ1. Άδί^. & V^1еу-Iиίе^κс^еисеκ, №ν Υо^к Ν.Υ.; Тиигк, М. е! а1. (1990), РСИ Рго!осо1к. Ά Ошйе !о Ме!Иойк аий Λрр1^са!^оηκ. Лсайепис Ргекк, Сан-Диего, Калифорния. Пары праймеров для ПЦР могут представлять собой пары, которые были получены из известной последовательности, например, путем использования компьютерных программ, предполагаемых для указанных целей, таких как Рггтег (версия 0.5, 1991, Ин- 39 030461 ститут биохимических исследований Уайтхэда, Кембридж, Масачусетс).

Олигонуклеотиды для использования в качестве праймеров или зондов могут быть выбраны с использованием программ, известных в данной области техники. Например, программа ОЬЮО 4,06 применима для выбора пар праймеров для ПЦР, каждый из которых содержит вплоть до 100 нуклеотидов, и для анализа олигонуклеотидов и более больших полинуклеотидов, содержащих вплоть до 5000 нуклеотидов, из вводимой полинуклеотидной последовательности, содержащей вплоть до 32 тысяч пар нуклеотидов. Подобные программы для выбора праймеров включают дополнительные признаки для расширенных возможностей. Например, программа для выбора праймеров РптОИ (общедоступная из Центра изучения генома Юго-Западного Медицинского Центра Техасского Университета, Даллас, Техас) способна выбирать специфические праймеры из мегабазных последовательностей и, таким образом, применима для создания праймеров в масштабе полного генома.

Программа для выбора праймеров Рптег3 (общедоступная в Центре исследования генома Института Уайтхэда/Массачусетского технического института, Кэмбридж, Массачусетс) позволяет пользователю вводить библиотеку не связывающихся с праймером последовательностей, в которой пользователь выбирает избегаемые последовательности, такие как сайты связывания праймера. Программа Рптег3 применима, в частности, для выбора олигонуклеотидов для микрочипов (также может быть получен исходный код для последних двух программ для выбора праймеров из соответствующих источников и модифицирован для удовлетворения конкретным требованиям пользователя). Программа РптеОеп (общедоступная из Исследовательского центра Великобритании, Проект расшифровки генома человека, Кембридж, Великобритания) создает праймеры на основе множественного выравнивания последовательностей, таким образом, позволяя выбор праймеров, которые гибридизуются либо с наиболее консервативным, либо с наименее консервативными участками выровненной последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, указанная программа применима для идентификации как уникальных, так и консервативных фрагментов олигонуклеотидов и полинуклеотидов. Указанные фрагменты олигонуклеотидов и полинуклеотидов, идентифицированные с помощью любого из выше указанных способов выбора, применимы для использования в методах гибридизации, например, в качестве праймеров для ПЦР или секвенирования, элементов микрочипа или специфических зондов для идентификации полностью или частично комплементарных полинуклеотидов в образце нуклеиновых кислот. Способы выбора олигонуклеотидов не ограничиваются способами, описанными в настоящем документе.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотиды могут быть получены путем поэтапного твердофазного синтеза с использованием способов, подробно описанных в ссылках, цитированных выше и далее, имеющих отношение к синтезу олигонуклеотидов, имеющих как незаряженные, так и катионные скелетные связи. В некоторых случаях может быть желательным добавлять дополнительные химические фрагменты к олигонуклеотиду, например, для усиления фармакокинетики или для облегчения захвата или выявления соединения. Такой фрагмент может быть ковалентно связан, как правило, с концом олигомера в соответствии со стандартными способами синтеза. Например, добавление фрагмента полиэтиленгликоля или другого гидрофильного полимера, например полимера, содержащего 10-100 мономерных субъединиц, может применяться для повышения растворимости. Одна или более заряженных групп, например анионных заряженных групп, таких как органические кислоты, могут усиливать клеточный захват.

Для придания олигонуклеотиду или белку способности поддаваться выявлению можно применять различные поддающиеся выявлению молекулы, такие как радиоизотопы, флуорохромы, красители, ферменты, наночастицы, хемилюминесцентные маркеры, биотин или другие мономеры, известные в данной области техники, которые могут выявляться непосредственно (например, путем облучения светом) или не непосредственно (например, путем связывания флуоресцентно меченного антитела).

Радиоизотопы представляют собой примеры поддающихся выявлению молекул, которые можно использовать согласно конкретным аспектам настоящего изобретения. Некоторые радиоизотопы можно применять в качестве поддающихся выявлению молекул для мечения нуклеотидов или белков, включая, например, ³²Р, ³³Р, ³⁵δ, ³Н и ¹²⁵Р Указанные радиоизотопы имеют различные периоды полураспада, типы распада и уровни энергии, которые могут быть оптимизированы в соответствии с требованиями конкретного протокола. Например, ³Н представляет собой низкоэнергетический излучатель, который обеспечивает низкий фоновый уровень, однако указанное низкоэнергетическое излучение также обеспечивает длительные временные периоды для авторадиографии. Радиоактивно меченые рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды и аминокислоты являются коммерчески доступными. Доступны нуклеотиды, которые являются радиоактивно мечеными по первой, или а, фосфатной группе или третьей, или γ, фосфатной группе. Например, [а-³²Р] НΑΤР и [у-³²Р] НЛТР являются коммерчески доступными. Кроме того, радиоактивно меченые нуклеотиды, обладающие различными специфическими видам активности, также являются коммерчески доступными и могут быть адаптированы для различных протоколов.

Другие примеры поддающихся выявлению молекул, которые можно применять для выявления олигонуклеотида, включают флуорофоры. Некоторые флуорофоры можно применять для мечения нуклеотидов, включая, например, флуоресцеин, тетраметилродамин, краситель Теха8 ИеН и ряд других флуоро- 40 030461 форов (см., например, Наид1аиб, НапбЬоок оГ Р1иоге8сеп! РгоЬе8 - 9^|Ь Еб., 2002, Мо1ес. РгоЬе8, 1пс., Еидепе ΟΚ; Наид1аиб, ТЬе НапбЬоок: Α Сшбе !о Р1иоге8сеп! РгоЬе8 аиб НнЬеПид ТесЬпо1од1е8-10^|1' Еб., 2005, 1вдИгодеп, Карлсбад, Калифорния, США).

В качестве одного примера олигонуклеотиды могут быть флуоресцентно мечены в процессе химического синтеза, так как включение аминов или тиолов во время синтеза нуклеотидов обеспечивает добавление флуорофоров. Флуоресцентно меченые нуклеотиды являются коммерчески доступными. Например, доступны уридин- и дезоксиуридинтрифосфаты, конъюгированные с десятью различными флуорофорами, которые охватывают весь цветовой спектр. Флуоресцентные красители, которые могут быть связаны непосредственно с нуклеотидами, также можно применять в качестве поддающихся выявлению молекул. Например, красители РΑΜ, ГОЕ, ТΑΜΚΑ и ΚΟΧ представляют собой аминные реактивные флуоресцентные красители, которые были присоединены к нуклеотидам и используются для автоматизированного секвенирования ДНК. Указанные флуоресцентно меченые нуклеотиды, например ΚΟΧббЛТР, ΚΟΧ-ббСТР, ΚΟΧ-ббСТР и ΚΟΧ-ббИТР, являются коммерчески доступными.

Не радиоактивные и не флуоресцентные поддающиеся выявлению молекулы также доступны. Как отмечено выше, биотин может быть присоединен непосредственно к нуклеотидам и выявляться с помощью специфического и высоко аффинного связывания с авидином или стрепавидином, который химически связан с ферментом, катализирующим колориметрическую реакцию (таким как фосфатаза, люцифераза или пероксидаза). Меченные дигоксигенином нуклеотиды также можно применять подобным образом для не изотопного выявления нуклеиновых кислот. Биотинилированные и меченные дигоксигенином нуклеотиды являются коммерчески доступными.

Очень маленькие частицы, называемые наночастицами, также можно применять для мечения олигонуклеотидных зондов. Указанные частицы варьируют в размере от 1 до 1000 нм и включают различные химические структуры, такие как частицы золота и серебра и квантовые точки. При облучении случайным преломленным дневным светом указанные наночастицы золота и серебра, варьирующие по размеру от 40 до 120 нм, рассеивают монохроматический свет с высокой интенсивностью. Длина волны рассеянного света зависит от размера частицы. Каждая из четырех из пяти различных частиц в непосредственной близости рассеивает монохроматический свет, который при наложении дает специфический уникальный цвет. Частицы изготавливаются такими компаниями, как Сетсои δ^ΐ'^8 (Карлсбад, Калифорния). Дериватизированные частицы золота и серебра могут быть присоединены к широкому разнообразию молекул, включая белки, антитела, низкомолекулярные соединения, лиганды рецептора и нуклеиновые кислоты. Например, поверхность частицы может быть химически дериватизирована для обеспечения способности присоединения к нуклеотиду.

Другие типы наночастиц, которые можно применять для выявления поддающейся выявлению молекулы, включают квантовые точки. Квантовые точки представляют собой флуоресцирующие кристаллы диаметром 1-5 нм, которые возбуждаются светом в большом диапазоне длин волн. При возбуждении светом, имеющим соответствующую длину волны, указанные кристаллы испускают свет, такой как монохроматический свет, с длиной волны, зависящей от их химического состава и размера. Квантовые точки, такие как Сбδе, 2Юе, 1иР или ΙηΑ8, обладают уникальными оптическими свойствами; указанные и подобные квантовые точки доступны из ряда коммерческих источников (например, ΝΝ-Ετώ8, Фаеттевилл, Арканзас; Οсеаη №по!есЬ, Фаеттевилл, Арканзас; Ν-иосо ТесЬио1од1е8, Манчестер, Великобритания; δ^дта-Α1б^^сЬ, Сент-Луис, Миссури).

Множество классов частиц может быть создано в соответствии с несколькими классами размеров кристаллов из квантовых точек. Классы размеров кристаллов получают либо 1) путем строгого контроля параметров образования кристалла для создания частиц каждого желаемого класса размера, либо 2) путем создания серии кристаллов без строгого контроля параметров образования кристалла с последующим сортингом в соответствии с желаемым размером и/или длиной волны испускания. Два примера ссылок, в которых квантовые точки помещали в эпитаксиальные слои из кремния с собственной проводимостью полупроводникового испускающего свет/выявляющего устройства, представляют собой патенты США № 5293050 и 5354707, СЬарр1е δο1<ο1, е! а1.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотидные праймеры или зонды могут быть меченными одним или более светоизлучающими или другими детектируемыми красителями. Свет, испускаемый красителями, может представлять собой видимый свет или невидимый свет, например, ультрафиолет или инфракрасный свет. Согласно типичным вариантам реализации изобретения краситель может представлять собой краситель на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (РЕЕТ); ксантиновый краситель, такой как флуоресцеин и родамин; краситель, который содержит аминогруппу в альфа- или бета-положении (такой как нафтиламиновый краситель, 1-диметиламинонафтил-5сульфонат, 1-анилино-8-нафталинсульфонат и 2-п-толуидинил-6-нафталинсульфонат); краситель, который содержит 3-фенил-7-изоцианатокумарин; акридин, такой как 9-изотиоцианатоакридин и акридин оранжевый; пирен, бензоксадиазол и стилбен; краситель, который содержит 3-(е-карбоксипентил)-3'этил-5, 5'-диметилоксикарбоцианин (ΟΎΑ); 6-карбоксифлуоресцеин (РΑΜ); 5,6-карбоксиродамин-110 (Κ110); 6-карбоксиродамин-6С (Κ6Ο); ЮЮ№,№-тетраметил-6-карбоксиродамин (ТΑΜΚΑ); 6-карбокси- 41 030461

Х-родамин (ИОХ); 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (ГОЕ); ΑΕΕΧΑ РШОЕ™; Су2; Τеxа8 Ееб и родамин красный; 6-карбокси-2',4,7,7'-тетрахлорфлуоресцеин (ТЕТ); 6-карбокси-2',4,4',5',7,7'гексахлорфлуоресцеин (ΗΕΧ); 5-карбокси-2',4',5',7'-тетрахлорфлуоресцеин (ЙОЕ); ΝΑΝ; ΝΕΌ; Су3; Су3,5; Су5; Су5,5; Су 7 и Су7,5; Ж800СА, 1СС, Α1еxа РЕюг 350; Α1еxа РЕюг 488; Α1еxа РЬюг 532; Α1еxа РЕюг 546; Α1еxа РЕюг 568; Α1еxа РЕюг 594; Α1еxа РЬюг 647; Α1еxа РЬюг 680 или Α1еxа РЕюг 750.

Полинуклеотиды и олигонуклеотиды ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению могут применяться в любых терапевтических, диагностических, научно-исследовательских или связанных с поиском лекарственных средств композициях и способах, описанных в настоящем документе.

V. Антитела.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения также предложены антитела, которые проявляют специфичность связывания в отношении полипептида ΑΑΚδ или его нативного клеточного партнера по связыванию (т. е. партнера по связыванию, представляющего собой клеточной рецептор, липид, углевод, белок или нуклеиновую кислоту), или их комплексов, и способы их применения. Термин антитело включает его различные варианты, такие как ΡΑΒ, человеческие антитела, модифицированные человеческие антитела, одиночные цепи, нечеловеческие антитела и другие производные укладки иммуноглобулиновой молекулы, лежащие в основе лигандов антигенов иммунной системы, описанных в настоящем документе и известных в данной области техники. Антитела могут применяться в любом из терапевтических, диагностических способов, способов поиска лекарственных средств или способов экспрессии/очистки белков и в композициях, предложенных в настоящем описании.

Конкретные антитела согласно настоящему изобретению отличаются от конкретных ранее созданных антител, поскольку они могут распознавать белковые фрагменты ΑΑΚδ, приведенные в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и их соответствующий полноразмерный ΑΑΚδ, как правило, при связывании с большей аффинностью с белковыми фрагментами ΑΑΚδ, чем с соответствующим полноразмерным ΑΑΚδ. В целом, указанные антитела могут связываться с уникальными последовательностями или структурами, которые образуются или открываются в результате сплайсинга, протеолиза или другого клеточного процессинга, приводящего к образованию белкового фрагмента ΑΑΚδ согласно изобретению (например, посттрансляционного процессинга, включая, но не ограничиваясь перечисленными, фосфорилирование и другие модификации, которые изменяют структуру белка). Согласно некоторым аспектам антитела могут связываться с последовательностями вокруг уникальной границы сплайсинга (например, с одним или более участками, состоящими по меньшей мере из 5 последовательных аминокислот, выбранных из последовательностей границы сплайсинга, перечисленных в табл. 2В, 5В или 8В, или в альтернативном варианте с любой аминокислотной последовательностью С-конца указанного сайта сплайсинга, например, такой как перечисленные в табл. 2В, 5В или 8В. Например, указанные антитела могут иметь специфичность связывания с одной или более не открытыми для растворителя поверхностями, которые открыты в белковом фрагменте ΑΑΚδ, но не в полноразмерном ΑΑΚδ, или последовательностями, которые не обнаруживаются или являются другим образом недоступными в полноразмерном ΑΑΚδ. Антитела также могут связываться с уникальной трехмерной структурой, которая является результатом различий между укладкой белкового фрагмента ΑΑΚδ и полноразмерной ΑΑΚδ. Указанные различия в укладке могут быть локализованными (например, в специфическом домене или области) или глобальными. В качестве одного примера, укладка белковых фрагментов ΑΑΚδ может приводить к получению уникальных непрерывных или дискретных эпитопов, которые не обнаруживаются в соответствующей или исходной ΑΑΚδ. Примеры также включают антитела, которые специфично связываются с Ν- или С-концом, образованным в результате сплайсинга, протеолиза или другого клеточного процессинга; указанные концы могут являться уникальными по сравнению с полноразмерной ΑΑΚδ или могут не являться открытыми для связывания антитела в полноразмерной версии из-за того, что ее концы полностью или частично погружены в общую структуру более крупной исходной молекулы ΑΑΚδ.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения антитела, предложенные в настоящем описании, не образуют агрегатов, имеют желаемую растворимость и/или имеют профиль иммуногенности, который является подходящим для применения у людей, как описано в настоящем документе и известно в данной области техники. Также включены антитела, которые являются подходящими для способов обработки, например, для очистки белковых фрагментов ΑΑΚδ, описанных в настоящем документе. Предпочтительно активные антитела могут быть концентрированы по меньшей мере примерно до 10 мг/мл и необязательно представлены в виде лекарственной формы для биотерапевтического применения.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитела являются эффективными для модуляции одной или более из неканонических видов активности, опосредованных полипептидом ΑΑΚδ согласно изобретению. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело, например, представляет собой антитело, которое связывается с полипептидом ΑΑΚδ и/или его партнером по связыванию, ингибирует их способность взаимодействия друг с другом и/или проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело, например, связывается с клеточным партнером по связыванию полипептида ΑΑΚδ и имитирует активности полипептида ΑΑΚδ, например, путем повышения или проявления агонизма в отношении неканонической активности, опосредованной полипептидом ΑΑΚδ. Соответственно, антитела

- 42 030461 можно применять для диагностики, лечения или предотвращения заболеваний, нарушений или других состояний, которые опосредуются полипептидом ААК8 согласно изобретению, например, путем проявления частичного или полного анагонизма или агонизма в отношении его активности.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент называется специфично связывающимся, иммунологически связывающимся и/или иммунологически реактивным с полипептидом согласно изобретению, если оно реагирует на детектируемом уровне (например, с помощью анализа методом твердофазного ИФА) с полипептидом и не реагирует на детектируемом статистически значимом уровне с неродственными полипептидами при таких же условиях. В конкретных примерах связывающий агент значительно не взаимодействует с полноразмерной версией полипептида ААК8.

Иммунологическое связывание, при использовании в данном контексте, в целом относится к нековалентным взаимодействиям такого типа, которые возникают между молекулой иммуноглобулина и антигеном, к которому специфичен указанный иммуноглобулин. Сила или аффинность связывания таких взаимодействий, как иммунологическое связывание, может быть выражена с помощью константы диссоциации (КД взаимодействия, где меньшее значение Κι соответствует большей аффинности. Свойства иммунологического связывания выбранных полипептидов можно количественно оценить с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. См., например, Оа\ас5 с1 а1. (1990), Аηηиа1 Кеб. Вюсйет. 59:439-473. Согласно конкретным иллюстративным вариантам реализации изобретения аффинность антитела к белковому фрагменту ААК8 составляет по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 или 50 нМ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность антитела к белковому фрагменту ААК8 сильнее, чем его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ААК8, как правило, примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз (включая все целые числа между ними). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность антитела к соответствующему полноразмерному белку ААК8 составляет по меньшей мере примерно 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мкМ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело слабо связывается или, по существу, не связывается на выявляемом уровне с полноразмерным белком ААК8.

Сайт связывания антигена или связывающий участок антитела относится к части молекулы иммуноглобулина, которая принимает участие в связывании антигена. Сайт связывания антигена формируется аминокислотными остатками Ν-концевых вариабельных (V) участков тяжелой (Н) и легкой (Ь) цепи. Три высокодивергентные последовательности внутри ν-участков тяжелых и легких цепей называются гипервариабельными участками, которые располагаются между более консервативными фланкирующими последовательностями, известными как каркасные участки или РК. Таким образом, термин РК относится к аминокислотным последовательностям, которые в естественных условиях находятся между и прилегают к гипервариабельным участкам в иммуноглобулинах. В молекуле антитела три гипервариабельных участка легкой цепи и три гипервариабельных участка тяжелой цепи располагаются друг относительно друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность является комплементарной трехмерной поверхности связываемого антигена, и три гипервариабельных участка каждой из тяжелых и легких цепей называются определяющими комплементарность участками или СОК.

Антитела могут быть получены с помощью любого из различных методов, известных специалистам в данной области техники. См., например, Нагфу аЫ Ьаие, Аηΐ^Ъοά^еδ: А ^аЪο^аΐο^у Маииа1, СоИ §ргшд ΗηΛοΓ ^аЪο^аΐο^у, 1988. Моноклональные антитела, специфичные к интересующему полипептиду, могут быть получены, например, с использованием метода, предложенного Кохлером и Мильстейном (ΚοΙιΚγ ηηύ МПЦейг Еиг. ί. Iттиηο1. 5:511-519, 1976), и его усовершенствованных вариантов. Также включены способы, в которых используются трансгенные животные, такие как мыши, для экспрессии человеческих антител. См., например, №иЪег§ег с1 а1., ΝπΙιιιό ВюЮсйгюйду. 14:826, 1996; с1 а1., №η^οοΡ ο£

ЕхрспшспЦй ΡΙκιπίΓκοΙορν 113:49-101, 1994 и йюнЪегд с1 а1., йИегшй Ке\ае\у ο£ Iттиηο1ο§у, 13:65-93, 1995. Конкретные примеры включают технологию νΕΡΟΟΜΜυΝΕ®, разработанную компанией КЕОЕК№КЕХ® (см., например, патент США № 6596541). Антитела также могут быть созданы или идентифицированы путем использования библиотек фагового дисплея и дрожжевого дисплея (см., например, патент США № 7244592; Сйаο с1 а1., Ыа1иге ΡΐΌΐοΗδ. 1:755-768, 2006). Неограничивающие примеры доступных библиотек включают клонированные или синтетические библиотеки, такие как комбинаторная библиотека человеческих антител (НиСАР), в которой репертуар структурного разнообразия человеческих антител представлен генами семи вариабельных участков тяжелой цепи и семи вариабельных участков легкой цепи. Комбинация указанных генов дает начало 49 каркасам в основной библиотеке. Путем перекрывания высоко вариабельных генетических кассет (СОК = определяющие комплементарность участки = гипервариабельные участки) указанных каркасов, может быть получено большое количество разнообразных человеческих антител. Также включены человеческие библиотеки, созданные на основе фрагментов, полученных от доноров, представляющих собой людей, кодирующие вариабельный

- 43 030461 участок легкой цепи, СОК-3 тяжелой цепи, синтетическую ДНК, кодирующую разнообразие СОК-1 тяжелой цепи, и синтетическую ДНК, кодирующую разнообразие СОК-2 тяжелой цепи. Другие библиотеки, подходящие для использования, очевидны специалистам в данной области техники. Полипептиды согласно настоящему изобретению можно применять в процессе очистки, например на этапе аффинной хроматографии.

Фрагмент Ρν может быть получен путем предпочтительного протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина ЦМ и редко встречающихся молекул иммуноглобулинов ЦС или ЦА. Ρνфрагменты однако чаще получают с использованием рекомбинантных методов, известных в данной области техники. Ρν-фрагмент включает нековалентный гетеродимер У_Н::Уь, содержащий антигенсвязывающий сайт, который в значительной степени сохраняет способность нативной молекулы антитела распознавания и связывания антигена. См., например, !иЬаг е! а1. (1972), Ргос. №1. Αсаά. 8с1. И8А, 69:26592662; НосЬтаи е! а1. (1976), ВюсЬет. 15:2706-2710 и БЬгЬсЬ е! а1. (1980), ВюсЬет. 19:4091-4096.

Одноцепочечный полипептид Ρν (δΡν) представляет собой ковалентно связанный гетеродимер У_Н::У_Ъ, который получен из слитых генов, включающих У_Н- и У_ъ-кодирующие гены, связанные пептидкодирующим линкером. Ник!ои е! а1. (1988), РNΑ8 И8А. 85 (16):5879-5883. Был описан ряд способов для определения химической структуры для превращения природных ассоциированных, но химически отдельных, легких и тяжелых полипептидных цепей из вариабельной области антитела в молекулу δΡν, которая укладывает в трехмерную структуру, по существу, подобную структуре антигенсвязывающего сайта. См., например, патенты США № 5091513 и 5132405, Ник!ои е! а1. и патент США № 4946778, ЕШиег е! а1.

Каждая из описанных выше молекул включает набор СОК тяжелой цепи и легкой цепи соответственно, расположенный между набором РК указанных тяжелой и легкой цепей, который обеспечивает поддержку СОК и определяет пространственное расположение СОК относительно друг друга. В настоящем описании термин набор СОК относится к трем гипервариабельным участкам вариабельной области тяжелой и легкой цепей. Начиная с Ν-конца тяжелой и легкой цепи, указанные участки обозначаются как СОК1, СОК2 и СОК3 соответственно. Антигенсвязывающий сайт, таким образом, включает шесть СОК, включающих группу СОК из каждой вариабельной области тяжелой и легкой цепей. Полипептид, содержащий один СОК (например, СОК1, СОК2 или СОК3), называется в настоящем описании единицей молекулярного распознавания. Кристаллографический анализ ряда комплексов антигенантитело показал, что аминокислотные остатки СОК образуют сильный контакт со связанным антигеном, где наиболее сильный контакт с антигеном обеспечивает СОК3 тяжелой цепи. Таким образом, единицы молекулярного распознавания, главным образом, отвечают за специфичность антигенсвязывающего сайта.

В настоящем описании термин ряд РК относится к четырем фланкирующим аминокислотным последовательностям, которые ограничивают СОК группы СОК тяжелой и легкой цепей вариабельной области. Некоторые остатки РК могут контактировать со связанным антигеном; однако РК в первую очередь отвечают за укладку вариабельной области в антигенсвязывающем сайте, в частности остатков РК, непосредственно принадлежащих к СОК. Конкретные аминокислотные остатки в РК и конкретные структурные признаки являют очень высоко консервативными. В этом отношении все последовательности вариабельной области содержат внутреннюю дисульфидную петлю, содержащую примерно 90 аминокислотных остатков. Когда вариабельные области укладываются в сайт связывания, СОК образует выступающие петлевые мотивы, которые образуют антигенсвязывающую поверхность. В целом считается, что именно консервативные структурные участки РК влияют на укладку петлей СОК в конктреных традиционных структурах, независимо от точной аминокислотной последовательности СОК. Более того, конкретные остатки РК, как известно, принимают участки в нековалентных междоменных контактах, которые стабилизируют взаимодействие тяжелых и легких цепей антитела.

Конкретные варианты реализации изобретения включают однодоменное антитело (8ОАВ или нанотело), которое относится к фрагменту антитела, состоящему из одного мономерного вариабельного домена антитела (см., например, патенты США № 5840526; 5874541; 6005079; 6765087; 5800988; 5874541 и 6015695). Указанные ЩАВ, как правило, имеют молекулярную массу примерно 12-15 кДа. Согласно конкретным аспектам изобретения, кάΑВ и другие молекулы антител могут быть получены или изолированы из уникальной тяжелой цепи антител иммунизированных верблюдов и лам, которые часто называют камелидами. См., например, СоигаШ е! а1., 1ВС. 276:7346-7350, 2001.

Был описан ряд гуманизированных молекул антител, содержащих антигенсвязывающий сайт, произошедший из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, включая гибридные антитела, содержащие вариабельные области грызунов и ассоциированный с ними СОК, слитые с человеческим константными доменами (Аш!ег е! а1. (1991), №Лиге 349:293-299; ЬоЬидйо е! а1. (1989), Ргос. ΝηΙ. Αсаά. 8α. И8А 86:4220-4224; 8Ьау е! а1. (1987), I. ^тииоГ 138:4534-4538; Вгоуи е! а1. (1987), Саисег Кек. 47:3577-3583), СОК грызунов, привитые на человеческие поддерживающие РК-участки перед гибридизацией с соответствующим константным доменом человеческого антитела (КхесЬтаии е! а1. (1988), №1иге? 332:323-327; УегЬоеуеи е! а1. (1988), 8теисе 239:1534-1536; Шиек е! а1. (1986), Уинге 321:522525), и СОК грызунов, привитые на поддерживающие рекомбинантные человеческие РК-участки грызу- 44 030461 нов (публикация европейского патента № 519596, опубликованная 23 декабря 1992 г.). Указанные гуманизированные молекулы были созданы для минимизации нежелательной иммунологической реакции на молекулы античеловеческих антител грызунов, ограничивающей длительность и эффективность терапевтического применения указанных фрагментов у реципиентов, представляющих собой людей. См., например, патенты США № 5530101; 5585089; 5693762; 6180370 и 7022500.

Антитела согласно настоящему изобретению можно применять в любых терапевтических, диагностических целях для поиска лекарственных средств, очистки белка и в аналитических способах и композициях, описанных в настоящем документе.

VI. Альтернативы антител и другие связывающие агенты.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, также предложены альтернативы антител или другие связывающие агенты, такие как растворимые рецепторы, аднектины, пептиды, пептидомиметики, низкомолекулярные соединения, аптамеры и т.д., которые проявляют специфичность связывания в отношении полипептида ΛΛΚδ или его клеточного партнера по связыванию, описанного в настоящем документе, или в отношении его части, варианта или производного, и композиции и способы их применения. Связывающие агенты могут применяться в любой из терапевтических, диагностических целей, в целях поиска лекарственных средств или экспрессии/очистки белка и в аналитических способах и композициях, описанных в настоящем документе. Биологические связывающие агенты, такие как аднектины, растворимые рецепторы, авимеры и тринектины, являются особо применимыми.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанные связывающие агенты являются эффективными для модуляции одной или более неканонических видов активности, опосредуемых полипептидом ΛΛΚδ согласно изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения связывающий агент, например, представляет собой агент, который связывается с полипептидом ΛΛΚδ и/или его партнером по связыванию, ингибирует их способность взаимодействовать друг с другом и/или проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ΛΛΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения связывающий агент, например, связывается с клеточным партнером по связыванию полипептида ΛΛΚδ и имитирует активность полипептида ΛΛΚδ, например, путем повышения или проявления агонизма в отношении неканонической активности, опосредованной полипептидом ΛΛΚδ. Соответственно, такие связывающие агенты можно применять для диагностики, лечения или предотвращения заболеваний, нарушений или других состояний, которые являются опосредованными полипептидом ΛΛΚδ согласно изобретению, например, путем проявления частичного или полного антагонизма или агонизма в отношении его активности.

Считается, что связывающий агент специфично связывается с полипептидом ΛΛΚδ согласно изобретению или его клеточным партнером по связыванию, если он реагирует на детектируемом уровне (в рамках, например, анализа методом твердофазного ИФА) с полипептидом или его клеточным партнером по связыванию, и не реагирует на статистически значимом детектируемом уровне с неродственными полипептидами при таких же условиях. В конкретных примерах связывающий агент значительно не взаимодействует с полноразмерной версией полипептида ΛΛΚδ. Согласно конкретным иллюстративным вариантам реализации изобретения аффинность связывающего агента к белковому фрагменту ΛΛΚδ или его клеточному партнеру связывания составляет по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 или 50 нМ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность связывающего агента к белковому фрагменту ΛΛΚδ сильнее, чем его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ΛΛΚδ, как правило, примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз (включая все целые числа между ними). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность связывающего агента к соответствующему полноразмерному белку ΛΛΚδ составляет по меньшей мере примерно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мкМ.

Как отмечено выше, в качестве связывающих агентов включены пептиды. Термин пептид, как правило, относится к полимеру аминокислотных остатков и их вариантов и синтетических аналогов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения термин пептид относится к относительно коротким полипептидам, включая пептиды, которые состоят из примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот, включая все целые числа и диапазоны между ними (например, 5-10, 8-12, 10-15), и взаимодействуют с полипептидом ΛΛΚδ, его клеточным партнером по связыванию или обоими. Пептиды могут состоять из природных аминокислот и/или не природных аминокислот, описанных в настоящем документе.

Кроме пептидов, состоящих только из природных аминокислот, также предложены пептидомиметики или аналоги пептидов. Аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической индустрии как непептидные лекарственные средства, обладающие свойствами, аналогичными свойствам эталонного пептида. Указанные типы непептидных соединений называются миметиками пептидов или пептидомиметиками (ЬиШтаи, е! а1., Λ Те\Ьоок оГ Эгид Эевщп апй ^еνе1ортеηΐ, 14:386-406, 2'¹ Εά., Натеоой

- 45 030461

Асабетю РиЬйкЬегк (1996); касйт Огайе, Апдете. СЬет. 1й. Еб. Епд1., 33:1699-1720 (1994); РаисЬеге, ί., Абу. Эгид Кек., 15:29 (1986); УеЬег апб Рге1бшдег ΤΙΝ8, р. 392 (1985); Еуапк, е! а1., ί. Меб. СЬет. 30:229 (1987)). Пептидомиметик представляет собой молекулу, которая имитирует биологическую активность пептида, но не является пептидной по своей химической природе. Соединения, представляющие собой пептидомиметики, известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 6245886.

Настоящее изобретение также включает пептоиды. Пептоидные производные пептидов представляют собой другую форму модифицированных пептидов, которые сохраняют структурные детерминанты, важные для биологической активности, но не имеют пептидных связей, таким образом, приобретая устойчивость к протеолизу (81топ, е! а1., РNА8 И8А. 89:9367-9371, 1992). Пептоиды представляют собой олигомеры Ν-замещенных глицинов. Был описан ряд Ν-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты.

Пептидомиметики согласно настоящему изобретению включают соединения, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток, несколько аминокислотных остатков или все аминокислотные остатки замещены на соответствующие Ν-замещенные глицины. Пептоидные библиотеки описаны, например, в патенте США № 5811387.

Связывающий агент также может включать одну или более малых молекул. Малая молекула относится к органическому соединению, которое имеет синтетическую или биологическую природу (биомолекула), но, как правило, не является полимером. Органические соединения относятся к большому классу химических соединений, молекулы которых содержат углерод, как правило, за исключением тех молекул, которые содержат только карбонаты, простые оксиды углерода или цианиды. Термин биомолекула, в целом, относится к органической молекуле, которая продуцируется живым организмом, включая крупные полимерные молекулы (биополимеры), такие как пептиды, полисахариды и нуклеиновые кислоты, так же как и низкомолекулярные соединения, такие как первичные и вторичные метаболиты, липиды, фосфолипиды, гликолипиды, стерины, глицеринлипиды, витамины и гормоны. Термин полимер, в целом, относится к большой молекуле или макромолекуле, состоящей из повторяющихся структурных единиц, которые, как правило, связаны ковалентными химическими связями.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения молекулярная масса низкомолекулярного соединения составляет менее чем 1000-2000 Да, как правило, между примерно 300 и 700 Да, и включая примерно 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 650, 600, 750, 700, 850, 800, 950, 1000 или 2000 Да. Библиотеки малых молекул описаны в другой части настоящего документа.

В качестве связывающих агентов также предложены аптамеры (см., например, ЕШпд1оп е! а1., №-11иге. 346, 818-22, 1990 и Тиегк е! а1., 8аепсе. 249, 505-10, 1990). Примеры включенных аптамеров представляют собой аптамеры нуклеиновых кислот (например, ДНК-аптамеры, РНК-аптамеры) и пептидные аптамеры. Аптамеры нуклеиновых кислот, в целом, относятся к видам нуклеиновых кислот, которые были сконструированы с помощью повторяющихся циклов селекции ш ν Пго или эквивалентного способа, такого как 8ЕЬЕХ (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), для связывания с различными молекулярными мишенями, такими как низкомолекулярные соединения, белки, нуклеиновые кислоты и даже клетки, ткани и организмы. См., например, патенты США № 6376190 и 6387620. Таким образом, включены аптамеры нуклеиновых кислот, которые связываются с полипептидами ААК8, описанными в настоящем документе, и/или их партнерами по связыванию.

Пептидные аптамеры, как правило, включают вариабельную пептидную петлю, присоединенную с обоих концов к белковому каркасу, двойное закрепление структуры, которое, как правило, повышает аффинность связывания пептидного аптамера до уровня, сравнимого с уровнем для антитела (например, в наномолярном диапазоне). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения длина вариабельной петли может составлять примерно 10-20 аминокислот (включая все целые числа между ними), и каркас может включать любой белок, который имеет хорошие свойства растворимости и укладки. Конкретные типичные варианты реализации изобретения могут использовать бактериальный белок ТЬюгебохш-А в качестве белка каркаса, при этом вариабельная петля встроена в сайты пониженной активности (-Сук-О1у-Рго-Сук- петля в белке дикого типа), при этом боковые цепи двух цистеинов способны образовывать дисульфидный мостик. Способы идентификации пептидных аптамеров описаны, например, в заявке на патент США № 2003/0108532. Таким образом, включены пептидные аптамеры, которые связываются с полипептидами ААК8, описанными в настоящем документе и/или их партнерами по связыванию. Выбор пептидного аптамера может осуществляться с использованием различных систем, известных в данной области техники, включая дрожжевую двугибридную систему.

Также включены АДНЕКТИНЬР^М, АВИМЕРЫ'™. анафоны и антикалины, которые специфично связываются с белковым фрагментом ААК8 согласно изобретению. АДНЕКТИНЫ™ относятся к классу нацеленных биологических препаратов, производных человеческого фибронектина, распространенного внеклеточного белка, который в природе связывается с другими белками. См., например, заявки на патенты США № 2007/0082365; 2008/0139791 и 2008/0220049. АДНЕКТИНЫ™, как правило, состоят из природного скелета фибронектина, а также нескольких направленных доменов специфической части человеческого фибронектина. Направленные домены могут быть сконструированы для обеспечения спе- 46 030461 цифического распознавания АДНЕКТИНОМ'™ терапевтической интересующей мишени, такой как белковый фрагмент ΆΆΚδ согласно изобретению.

АВИМЕРЬР™ относятся к мультимерным связывающим белкам или пептидам, сконструированным путем перестановок экзонов 1и νίΠΌ и фагового дисплея. Несколько связывающих доменов соединяют, что приводит к большей аффинности и специфичности по сравнению с иммуноглобулиновыми доменами с одним эпитопом. См., например, δίΚτηΜαι·! е! а1., ЫаШге Вю!ес1то1оду. 23:1556-1561, 2005; патент США № 7166697 и заявки на патенты США № 2004/0175756, 2005/0048512, 2005/0053973, 2005/0089932 и 2005/0221384.

Также включены сконструированные белки с анкириновым повтором (дарпины), которые включают класс не иммуноглобулиновых белков, которые могут обеспечивать преимущество по сравнению с антителами с точки зрения связывания мишени в поиске лекарственных средств и разработке лекарственных средств. Среди других применений дарпины наилучшим образом изучены для ш νί\Ό отображения или доставки токсинов или других терапевтических грузов из-за их благоприятных молекулярных свойств, включая маленький размер и высокую стабильность. Малозатратная продукция в бактериях и быстрое производство большого количества мишень-специфичных дарпинов делают подход с использованием дарпинов применимым для поиска лекарственных средств. Кроме того, дарпины могут быть с легкостью получены в формах, обладающих множественной специфичностью, что дает возможность направлять эффекторный дарпин на множество рецепторов конкретного органа или ткани с помощью одной молекулы, состоящей из нескольких дарпинов. См., например, διитрр е! а1., Сигг Орт Эгид 01ксо\' Беге1. 10:153-159, 2007; заявки на патенты США № 2009/0082274 и РСТ/ЕР2001/10454.

Конкретные варианты реализации изобретения включают монотела, которые, как правило, используют 10-й домен фибронектина III типа человека (РЫГиЮ) в качестве каркаса для предоставления множества петель поверхности для связывания мишени. РМЛЮ представляет собой малый (94 остатка) белок с β-сэндвич структурой, подобной укладке иммуноглобулиновой цепи. Он является высокостабильным без дисульфидных связей или ионов металла, и он может экспрессироваться в правильно уложенной форме на высоком уровне в бактериях. Каркас РЫГи10 совместим фактически с любой технологией отображения. См., например, Ва!оп е! а1., Рго1еш Еид. 15:1015-20, 2002 и ναί^ е! а1., Να!. δΗ^Ι. Мо1. Вю1., 2010 и патент США № 6673901.

Антикалины относятся к классу миметиков антител, которые, как правило, синтезируют из человеческих липокалинов, семейства связывающих белков с гипервариабельным участком петли, поддерживаемым структурно жестким каркасным участком. См., например, заявку на патент США № 2006/0058510. Антикалины, как правило, имеют размер примерно 20 кДа. Антикалины характеризуются бочковидной структурой, образованной восьмью антипараллельными β-цепями (стабильный βбочковидиный каркас), которые попарно соединены четырьмя пептидными петлями, и присоединенной α-спиралью. Согласно конкретным аспектам изобретения, в гипервариабельный участок (участки) цепи внесены конформационные изменения для достижения специфического связывания. См., например, δίαιτα, ΡΕΒδ I. 275:2677-83, 2008, включенный в настоящее описание посредством ссылки.

VII. Биологические анализы и аналитические тест-системы для анализа высвобождения лекарственного средства и исследования продукта, диагностика и реагенты.

Также предложены способы биологического анализа, которые относятся к белковым фрагментам ΆΆΚδ и родственным агентам в качестве терапевтических и диагностических реагентов. Примеры включают биологические анализы и аналитические тест-системы, которые позволяют измерить чистоту, биологическую активность, аффинность, растворимость, рН, уровень эндотоксина и т. д., многие из которых описаны в настоящем документе. Также включены анализы, которые обеспечивают кривые зависимости доза-ответ и/или обеспечивают один или более параметров для сравнения между различными партиями агентов. Сравнения партий могут быть основаны на одной или более химической характеристике, биологической характеристике и клинической характеристике. Для белковых агентов также включены способы оценки активности, стабильности, фармакокинетики и иммуногенности выбранного агента. Среди других применений указанные и другие способы можно применять для тестирования уменьшения объема партии биологических или химических агентов, включая белковые фрагменты ΆΆΚδ, антитела, связывающие агенты, полинуклеотиды, а также антисмысловые агенты и векторы и другие, описанные в настоящем документе.

Конкретные варианты реализации изобретения включают применение анализов биоаффинности. Такие анализы можно применять для оценки аффинности связывания, например, между белковым фрагментом ΆΆΚδ и клеточным партнером по связыванию или между белковым фрагментом ΆΆΚδ и антителом. Аффинность связывания также можно измерить между белковым фрагментом ΆΆΚδ и предполагаемым связывающим агентом, таким как соединение-кандидат или перспективное исследуемое соединение (например, низкомолекулярный модулятор ΆΆΚδ) или между клеточным партнером по связыванию ΆΆΚδ и исследуемым соединением-кандидатом или перспективным исследуемым соединением. Конкретные типичные анализы аффинности связывания могут использовать анализы на основе твердофазного ИФА, как описано в настоящем документе и известно в данной области техники. В конкретных

- 47 030461 анализах используется высокоэффективная хроматография связывания с рецептором (см., например, Κο8υπ11 οί а1., Вюкдюак. 24:25-39, 1996). Согласно другим типичным анализам аффинности связывания можно применять методы на основе поверхностного плазмонного резонанса (ВРЩ. Примеры включают технологии компании ВТА^тс, некоторые из которых объединяют метод на основе δРΚ с микрофлюидной системой для наблюдения за молекулярными взаимодействиями в реальном времени при концентрациях, варьирующих от пМ до мМ. Также включены анализы ΚΓΝΕΧΑ™, которые обеспечивают точные измерения специфичности связывания, аффинности связывания и кинетики связывания/констант скорости.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к иммунологическим анализам для оценки или оптимизации иммуногенности белковых агентов. Примеры включают клеточные анализы человека ех νινο и иммуноферментные анализы ίη νίίΓο для получения полезной информации относительно потенциальной иммуногенности терапевтического белка. Анализы клеточного ответа ех νινο можно применять, например, для воспроизведения клеточной кооперации между антигенпрезентирующими клетками (АПК) и Т-клетками и, таким образом, измерения активации Т-клеток после контакта с интересующим белком. Конкретные ферментативные анализы ίη νίίΓο могут использовать коллекцию рекомбинантных молекул НЬА-ΌΚ, охватывающих значительную часть подходящей человеческой популяции, и могут включать автоматизированные иммуноферментные анализы для оценки связывания пептидов (образованных в результате фрагментации терапевтического белка) с молекулами НЬА-ΌΚ. Также включены способы снижения иммуногенности выбранного белка, например, с использованием указанных и связанных способов для идентификации и последующего удаления или изменения одного или более Тклеточных эпитопов белкового агента.

Также предложены способы анализа биологического высвобождения (например, клеточные анализы) для измерения параметров, таких как значения специфической биологической активности, включая неканонические виды биологической активности и цитотоксичность. Конкретные специфические биологические анализы включают, например, клеточные анализы, в которых используется клеточный партнер по связыванию (например, рецептор клеточной поверхности), выбранный белковый фрагмент ΑΑΚδ, который функционально связан с индикатором, таким как флуоресцентный или люминесцентный индикатор неканонической биологической активности, описанный в настоящем документе. Например, конкретные варианты реализации изобретения включают клетку, которая содержит рецептор клеточной поверхности или его внеклеточную часть, которая связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, где указанная клетка содержит детектор или индикатор. Также включены биологические анализы ίη νινο для характеристики фармакокинетики агента, такого как полипептид ΑΑΚδ или антитело, в которых, как правило, используются трансгенные мыши или другие млекопитающие (см., например, Ьее οί а1., ТНе ίοιΐΓηα1 οΓ РНагтатокду. 281:1431-1439, 1997). Примеры биологических анализов на основе цитотоксичности включают анализы высвобождения (например, анализы высвобождения хрома или европия для оценки апоптоза; См., например, νοη Ζοη8 οί а1., С1ш О|адп ЬаЬ Iттиηο1, 4:202-201, 1997), среди других анализов, позволяющих оценивать цитотоксичность белковых фрагментов ΑΑΚδ для получения кривых зависимости доза-ответ, для сравнения партий продукта или анализа других свойств, связанных с получением одобрения различных органов управления, таких как Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (ΡΌΑ).

Такие анализы можно применять, например, для получения кривой зависимости доза-ответ для выбранного белкового фрагмента ΑΑΚδ или другого агента, и/или для сравнения кривых зависимости доза-ответ различных партий белков или других агентов. Кривая зависимости доза-ответ представляет собой график зависимости Χ от Υ, связывающий величину стрессорного агента с ответом рецептора; где указанный ответ может представлять собой физиологический или биохимический ответ, например неканоническую биологическую активность в клетке ίη νίίτο или в клетке, или ткани ίη νινο, терапевтически эффективное количество, измеренное ίη νινο (например, измеренное на основе ЕС₅₀) или смертность, измеренную ίη νίίτο или ίη νινο (например, клеточную гибель, гибель организма). Смертность обычно выражают как ЬО₅₀, статистически определенная дозы, которая является летальной для 50% смоделированной популяции, но также может обозначаться как ЬС₀₃ (летальная доза для 1% анализируемой популяции животных), ЬС₃₀₀ (летальная доза для 100% анализируемой популяции животных) или ЬС_ЪО (минимальная доза, вызывающая летальность). Почти все желательные эффекты или конечные точки можно охарактеризовать таким образом.

Измеренную дозу для кривой зависимости доза-ответ, как правило, наносят на ось X и ответ наносят на ось Υ. Чаще на ось X наносят логарифм дозы, что наиболее часто приводит к получению сигмоидальной кривой с крутым изгибом в средней части. Уровень отсутствия наблюдаемого эффекта (по ο^ογυπΝο еГГес! 1ονο1, ИОЕБ) относится к минимальной экспериментальной дозе, при которой не наблюдается поддающегося измерению эффекта, и пороговая доза относится к первой точке на графике, показывающей ответ выше нуля. Как правило, для более сильных лекарственных средств получаются более крутые кривые зависимости доза-ответ. Для многих лекарственных средств желательные эффекты наблюдаются при дозах, немного превышающих пороговую дозу, часто из-за того, что более низкие дозы являются относительно неэффективными, а более высокие дозы приводят к нежелательным побочным

- 48 030461 эффектам. Кривые зависимости доза-ответ, построенные для анализов ίη νινο, при желании могут характеризоваться такими значениями, как мкг/кг, мг/кг или г/кг массы тела.

Для сравнения партий может быть полезно рассчитывать коэффициент вариации (СУ) между различными кривыми зависимости доза-ответ для различных партий (например, между различными сериями белковых фрагментов ΑΑΚδ, антител или других агентов), отчасти благодаря тому, что СУ позволяет сравнивать наборы данных с различными единицами или данных, полученных различными способами. Например, согласно конкретным типичным вариантам реализации изобретения СУ между двумя или тремя или более различными партиями белковых фрагментов ΑΑΚδ или других агентов составляет меньше примерно 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% для 4, 5, 6, 7 или 8 точек кривой дозирования. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения кривую зависимости доза-ответ оценивают для клеточного анализа, и показатель указанного анализа относится к повышению или снижению выбранной неканонической активности белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения кривую зависимости доза-ответ измеряли для анализа высвобождения из клеток или на животной модели (например, мышиной модели), и показатель указанного анализа относится к клеточной гибели или смерти животного. Другие варианты очевидны специалистам в данной области техники.

VIII. Системы экспрессии и очистки.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы и связанные композиции для экспрессии и очистки белковых фрагментов ΑΑΚδ или других агентов на основе полипептидов согласно изобретению. Такие рекомбинантные полипептиды ΑΑΚδ могут быть легко получены с использованием стандартных протоколов, описанных, например, в источниках δηπΛίΌοΙο е( а1., (1989, выше), в частности разделах 16 и 17; е( а1., (1994, выше), в частности главах 10 и 16; и СоИдаи е( а1., Сиггеп! РюШ^к ίη Рго1еш δ^ι^ (ίοΐιη АПеу & δοηκ, Шс. 1995-1997), в частности главах 1, 5 и 6. В качестве одного общего примера полипептиды ΑΑΚδ могут быть получены способом, включающим один или более из этапов: (а) получения конструкции, содержащей полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ΑΑΚδ и которая функционально связана с регуляторным элементом; (Ь) введения конструкции в клетку хозяина; (с) культивирования клетки-хозяина для экспрессии полипептида ΑΑΚδ; и (б) выделения полипептида ΑΑΚδ из клетки-хозяина.

Полинуклеотиды ΑΑΚδ описаны в другой части настоящего документа. Для экспрессии желаемого полипептида можно встраивать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид или его функциональный эквивалент, в соответствующий вектор экспрессии, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, можно применять для конструирования векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие интересующий полипептид, и соответствующие элементы контроля транскрипции и трансляции. Указанные способы включают технологии получения рекомбинантной ДНК ίη νΐΐΓο, синтетические методы и генетическую рекомбинацию ίη νινο. Такие методы описаны в источнике δ;·ιπΛΓοο1< е( а1., ΜοΚαιΕπ Οοηίη§, Α ^аЬο^аΐο^у Маша1 (1989), и е( а1., СиггеШ Рю^^к ίη ΜοΚαιΕίΓ Βίο1οβ\· (1989).

Различные системы вектор экспрессии/хозяин известны и могут применяться для включения и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Указанные системы включают, но не ограничиваются перечисленными, микроорганизмы, такие как бактерия, трансформированная рекомбинантным бактериофагом, плазмидные или космидные векторы экспрессии ДНК; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусом); системы растительных клеток, трансформированные вирусными векторами экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом табачной мозаики, ΤΜν) или бактериальными векторами экспрессии (например, плазмидами Τι или рΒΚ322); или системы клеток животных, включая системы клеток млекопитающих и, более конкретно, человека.

Контрольные элементы или регуляторные последовательности, присутствующие в векторе экспрессии, представляют собой такие нетранслируемые участки вектора (энхансеры, промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые участки), которые взаимодействуют с белками клетки-хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут отличаться по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой векторной системы и хозяина может использоваться любое количество подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно применять индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды ΡΒ^υΕδСΚIΡΤ кЩ-Цадене, Ла Джола, Калифорния) или плазмиды ΡδΡΟΚΤ1 (СЬте ΒΚΕ, Гейтерсбург, Мэриленд) и т.п. В системах клеток млекопитающих промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих в целом являются предпочтительными. При необходимости получения клеточной линии, которая содержит множество копий последовательности, кодирующей полипептид, предпочтительно использовать векторы на основе δν40 или ΕΒν с соответствующим селективным маркером.

В бактериальных системах количество векторов экспрессии может быть выбрано в зависимости от предполагаемого применения экспрессированного полипептида. Например, в случае необходимости

- 49 030461 больших количеств можно применять векторы. направленные на высокий уровень экспрессии слитых белков. которые с легкостью могут быть очищены. Такие векторы включают. но не ограничиваются перечисленными. мультифункциональные векторы клонирования и экспрессии Е.соЬ. такие как ВЬиЕ8СК1РТ (81га1адепе). в которых последовательность. кодирующая интересующий полипептид. может быть лигирована в вектор в рамке с последовательностями для аминоконцевого Ме! и последующими 7 остатками β-галактозидазы. таким образом. что продуцируется слитый белок; векторы ρΙΝ (Уап Нееке & 8сЬик!ег. 1. Вю1. СЬет. 264:5503 5509 (1989)); и т.п. Также можно применять векторы рСЕХ (Рготеда. Мэдисон. Висконсин) для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-8-трансферазой (С8Т). В целом. такие слитые белки являются растворимыми и могут с легкостью быть очищены из лизированных клеток путем абсорбции на глутатион-агарозные гранулы с последующим вымыванием в присутствии свободного глутатиона. Белки. созданные в таких системах. могут быть сконструированы для включения гепарина. тромбина или сайтов расщепления протеазой фактором ХА таким образом. что клонированный интересующий полипептид может самопроизвольно высвобождаться из фрагмента С8Т.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять системы экспрессии на основе Е.соЬ (см.. например. 8!гис!ига1 Оепотюк СопкогЬит е! а1.. №-Ииге МеШобк. 5:135-146. 2008). Указанные и связанные варианты реализации изобретения могут основываться частично или полностью на лигазно-независимом клонировании (Ь1С) для продукции подходящего вектора экспрессии. Согласно конкретному варианту реализации изобретения экспрессию белка можно контролировать с помощью РНК-полимеразы Т7 (например. серия векторов рЕТ). Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения может использоваться экспрессия в хозяйском штамме ВЬ21(ЭЕ3). содержащем лизоген λΌΕ3 ВЬ21. который поддерживает Т7-опосредованную экспрессию и не имеет протеаз 1оп и отрТ. для улучшения стабильности белка-мишени. Также включена экспрессия хозяйских штаммов. содержащих плазмиды. кодирующие тРНК. которые редко используются в Е.соЬ. такие как штаммы КО8ЕТТА™ (ΌΕ3) и КокеЬа 2 (ΌΕ3). Лизис клеток и обработку образца также можно улучшить с использованием реагентов. которые продаются под торговыми марками нуклеаза ВΕNΖОNА8Ε® и реагент для белковой экстракции ВиОВИ8ТЕК®. Для клеточных культур самоиндуцирующая среда может улучшать эффективность многих систем экспрессии. включая высокоэффективные системы экспрессии. Среда указанного типа (например. система самоиндукции ОУЕРШОНТ ЕХРКЕ88™) постепенно вызывает экспрессию белка путем метаболического сдвига. без добавления искусственных индуцирующих агентов. таких как 1РТС. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения используются гексагистидиновые метки (такие как метки. которые продаются под торговой маркой гибридов Н18-ТАО®) с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (1МАС) или связанных методов. Однако согласно конкретным аспектам изобретения белки клинической степени чистоты могут быть изолированы из телец включения Е.соЬ. с использованием или без использования аффинной метки (см.. например. 8Ытр е! а1.. Рго!ет Ехрг. РипГ. 50:58-67. 2006). В качестве другого примера согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять индуцируемые холодовым шоком высокоэффективные системы продукции Е.соЬ. так как повышенная экспрессия белков в ЕксЬепсЫа соЬ при низкой температуре улучшает их растворимость и стабильность (см.. например. Оюд е! а1.. №Щ.1ге Вю!есЬпо1оду. 22:877-882. 2004). Также включены системы бактериальной ферментации с большой плотностью. Например. культивирование клеток Капота еи!горЬа при высокой плотности обеспечивает продукцию белка при плотности клеток больше 150 г/л и экспрессию рекомбинантных белков в титрах. превышающих 10 г/л.

В дрожжах 8ассЬаготусек сегеу181ае может использоваться ряд векторов. содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы. такие как альфа-фактор. алкогольоксидаза и РОН. Обзоры см. в источниках АикиЬе1 е! а1. (выше) и Огап! е! а1.. Ме!Ьобк Еп/уто1. 153:516-544 (1987). Также включены системы экспрессии РюЫа рапбопк (см.. например. Ы е! а1.. №Щ.1ге Вю!есЬпо1оду. 24. 210-215. 2006 и НапиЬоп е! а1.. 8аепсе. 301:1244. 2003). Конкретные варианты реализации изобретения включают дрожжевые системы. которые сконструированы для селективного гликозилирования белков. включая дрожжи. которые имеют гуманизированные пути Ν-гликозилирования. и другие (см.. например. НапиЬоп е! а1.. 8с1епсе. 313:1441-1443. 2006; ^ί16ΐ е! а1.. №·ι!ιηό Ре\ае\У5 М1сгоЬю1. 3:119-28. 2005 и Оегпдгокк е! а1.. №!иге-Вю!есЬпо1оду. 22:1409-1414. 2004; патенты США № 7629163; 7326681 и 7029872). Исключительно в качестве примера рекомбинантные дрожжевые культуры можно растить в колбах Фернбаха или ферментерах на 15Ь. 50Ь. 100Ь и 200Ь и т.д.

В случаях. когда используются растительные векторы экспрессии. экспрессия последовательности. кодирующей полипептиды. может быть запущена любым из ряда промоторов. Например. можно применять вирусные промоторы. такие как промоторы 358 и 198 СаМУ. отдельно или в комбинации с омегалидерной последовательностью из вируса табачной мозаики ТМУ (Таката!ки. ЕМВО к 6:301-311 (1987)). В альтернативном варианте можно применять растительные промоторы. такие как малая субъединица КИВ18СО. или промоторы теплового шока (Сои.1//1 е! а1.. ЕМВО Е 3:1671-1680 (1984); ВгодЬе е! а1.. 8с1епсе 224:838-843 (1984) и \Ут!ег е! а1.. КекиЬк РгоЬ1. Се11 ИГГег. 17:85-105 (1991)). Указанные кон- 50 030461 струкции могут быть введены в растительные клетки путем непосредственной трансформации ДНК или патоген-опосредованной трансфекции. Указанные методы описаны в ряде общедоступных обзоров (см., например, НоЬЬк ίη МсСгате Ηίίί, УеагЬоок оГ δαβηοβ и Тескпо1оду, р. 191-196 (1992)).

Для экспрессии целевого полипептида также может использоваться система на основе насекомых. Например, в одной указанной системе вирус ядерного полиэдроза (ΑсNΡV) ЛнЮдгарка саПГогшса используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках δрοάοрίе^а ГгищреШа или в клетках Тпскоркыа. Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в заменимый участок вируса, такой как ген полиэдрина, и помещать под контроль промотора полиэдрина. Успешное встраивание кодирующей полипептид последовательности приводит к инактивации гена полиэдрина и продукции рекомбинантного вируса, у которого отсутствует белок оболочки. Рекомбинантные вирусы могут затем использоваться для инфицирования, например, клеток δ.Г^ид^ре^άа или клеток ТпсЬор1и81а, в которых можно экспрессировать интересующий полипептид (ЕидеИагД еί а1., Ргос. Ναΐΐ. Αсаά. δα. υ.δ.Α. 91:3224-3227 (1994)). Также включены системы экспрессии бакуловируса, включая системы, которые используют клетки δΡ9, δΡ21 и Т. ηί (см., например, МигрПу аиТ РПушса-ХУопга Сшт Рго1ос Рго1еш δα. СПар1ег 5:υηίί5.4, 2001). Системы насекомых могут обеспечивать посттрансляционные модификации, подобные системам млекопитающих.

В целом, доступен ряд систем экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих на основе вирусов. Например, в случаях, когда используется аденовирус в качестве вектора экспрессии, последовательности, кодирующие интересующий полипептид, можно лигировать в комплекс транскрипции/трансляции аденовируса, состоящий из позднего промотора и тройной лидерной последовательности. Встраивание в заменимый участок Е1 или Е3 вирусного генома может использоваться для получения жизнеспособного вируса, который способен экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (Бодаи & δ^ηΕ Ргос. Αсаά. δα. υ.δ.Α. 81:3655-3659 (1984)). Кроме того, можно применять энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (Κδν), для повышения экспрессии в хозяйской клетке млекопитающего.

Примеры применимых хозяйских клеточных линий млекопитающих включают линию клеток почки обезьяны СТО, трансформированные δν40 (’Οδ-7, ΑΤ’’ СРБ 1651); линию человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, ОгаПат еί а1., ί. Сеη νίΐΌΐ. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомячка (ΒΗΚ, ΑΤ’’ ССЬ 10); клетки Сертоли мыши (ТМ4, МаШег, Вю1. РергоТ. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (СТО ΑΤ’’ ССЬ 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (νΕΚΟ-76, ΑΤ’’ СИЕ-1587); клетки карциномы шейки матки человека (ΗΕΤΑ, ΑΤ’’ ССЬ 2); клетки почки собаки (МБСК, ΑΤ’’ ССЬ 34); клетки печени крыс буфало (ΒΚΤ 3А, ΑΤ’’ ’ΚΤ 1442); клетки легкого человека (А138, ΑΤ’’ ССЬ 75); клетки печени человека (Нер С2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, ΑΤ’’ ССЬ51); клетки ΤΚ1 (МаШег еί а1., Αη^Π Ν.Υ. Αсаά. δα. 383:44-68 (1982)); клетки МРС 5; клетки Ρδ4 и клеточную линию гепатомы человека (Нер 02). Другие применимые хозяйские клеточные линии млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (’ΗΟ), включая клетки ΌΗΡΚ-’ΗΟ (иг1аиЬ еί а1., ΡΝΑδ υδΑ, 77:4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как ΝδΟ и δр2/0. Обзор конкретных хозяйских клеточных линий млекопитающих, подходящих для продукции антител, можно найти, например, в источниках Υаζак^ аиТ XV и, МеПюШ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Vο1. 248 (В. К.С Ьо, еТ., Η шпага Рге88, ^ота, Ν.Τ, 2003), р. 255-268. Конкретные предпочтительные системы экспрессии на основе клеток млекопитающих включают системы экспрессии на основе клеток ’ΗΟ и ΗΕΚ293. Системы экспрессии млекопитающих могут использовать адгезионные клеточные линии, выращенные, например, на Т-флаконах, роллерных флаконах или клеточных фабриках или суспензионные культуры, выращенные, например, во вращающихся флаконах на 1 и 5 л, биореакторах с механическим перемешиванием на 5, 14, 40, 100 и 200 л или биореакторах на 20/50 и 100/200 л ΑΑνΕ, среди прочего, известных в данной области техники.

Также включены бесклеточные системы экспрессии белков. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения, как правило, используют очищенную РНК-полимеразу, рибосомы, тРНК и рибонуклеотиды; указанные реагенты могут быть получены путем экстракции из клеток или их клеточной системы экспрессии.

Специфические инициирующие сигналы также можно применять для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих интересующий полипептид. Указанные сигналы включают инициирующий кодон ΑΤ0 и прилежащие последовательности. В случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и вышележащие последовательности, встраиваются в соответствующий вектор экспрессии, нет необходимости в дополнительных сигналах контроля транскрипции или трансляции. Однако в случаях, когда встраиваются только кодирующая последовательность или ее части, должны быть обеспечены экзогенные сигналы контроля трансляции, включая инициирующий кодон ΑΤ0. Более того, инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания для обеспечения трансляции целой встроенной последовательности. Экзогенные элементы трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, быть как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения энхансеров, которые соответствуют для конкретной используемой клеточной системы, такие как энхан- 51 030461 серы, описанные в литературе (ЪсЬагГ е! а1., Ре8и118 РгоЬ1. Се11 Э|ГГег. 20:125-162 (1994)).

Кроме того, может быть выбран штамм хозяйских клеток на основе их способности модулировать экспрессию встроенной последовательности или процессировать экспрессируемый белок желаемым образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются перечисленными, посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, присоединение липидов и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, обеспечивающий расщепление препро формы белка, может также использоваться для облегчения правильного встраивания, укладки и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как дрожжи, СТО, НеЬа, МЭСК, НЕК293 и У138, кроме бактериальных клеток, которые имеют или даже не имеют специальный клеточный аппарат и характерные механизмы для посттрансляционной активности, могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка.

Для длительной высокоэффективной продукции рекомбинантных белков стабильная экспрессия в целом является предпочтительной. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют интересующий полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием векторов экспрессии, которые могут содержать вирусные ориджины репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и выбранный маркерный ген в том же или в отдельном векторе. После встраивания вектора клеткам можно позволить расти в течение примерно 1-2 дней в богатой среде до их перевода на селективную среду. Целью селективного маркера является подтверждение устойчивости селекции, и его присутствие позволяет рост и репарацию клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток можно размножать с использованием методов тканевых культур, соответствующих данному типу клеток. Временная продукция, например, путем временной трансфекции или инфекции также может использоваться. Типичные системы экспрессии млекопитающих, которые являются подходящими для временной продукции, включают системы на основе клеток НЕК293 и С1ΙΟ.

Любое число систем селекции может использоваться для восстановления трансформированных или трансдуцированных клеточных линий. Указанные включают, но не ограничиваются перечисленными, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (\У1д1ег е! а1., Се11 11:223-232 (1977)) и аденинфосфорибозинтрансферазы (Ьо^у е! а1., Се11, 22:811-823 (1990)), которые можно применять в !к- или арй-клетках соответственно. Также антиметаболическая устойчивость, устойчивость к антибиотикам или гербицидам может использоваться в качестве основы для селекции; например, бЬГг, которая обеспечивает устойчивость к метотрексату (У1д1ег е! а1., Ргос. №б1. Αсаб. δα. υ.δ.Α. 77:3567-70 (1980)); пр!, который обеспечивает устойчивость к аминогликозидам, неомицину и С-418 (Со1Ьеге-Сагарш е! а1., ί. Мо1. Βίο1. 150:1-14 (1981)); и а18 или ра!, которые обеспечивают устойчивость к хлорсульфурону и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно (Мшту, выше). Были описаны другие селективные гены, например !грВ, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана, или 1ΐ8, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (Найтаи & МиШдаи, Ргос. №ιΐ1. Αсаб. δα. υ.δ.Α. 85:8047-51 (1988)). Применение видимых маркеров приобрело популярность с использованием таких маркеров, как зеленый флуоресцентный белок (дгееп Йиоге8сеп! рго!еш, СРР) и другие флуоресцентные белки (например, НРР, ΥΪΈ), антоцианины, β-глюкуронидаза и ее субстрат С% и люцифераза и ее субстрат люциферин, которые широко используются не только для идентификации трансформантов, но также для количественной оценки неустойчивой или стабильной экспрессии белка, обеспечиваемой конкретной векторной системой (см., например, ΚЬοбе8 е! а1., Ме!Ьоб8 Мо1. Βίο1. 55:121-131 (1995)).

Варианты реализации настоящего изобретения также включают высокоэффективные системы продукции белка или низкоэффективные системы продукции. Согласно конкретным аспектам можно применять, например, слитые с гексагистидином метки для экспрессии и очистки белка на модифицированных хелатом металла поверхностях скольжения или МадпеН18 Νί-частицах (см., например, 1<\νοη е! а1., ВМС Вю!есЬио1. 9:72, 2009 и Ьт е! а1., Ме!Ьоб8 Мо1 Βίο1. 498:129-41, 2009)). Также включены высокоэффективные бесклеточные белковые системы экспрессии (см., например, δ^ίа^атаи е! а1., Ме!Ьоб8 Мо1. Βίο1. 498:229-44, 2009). Указанные и связанные варианты реализации изобретения можно применять, например, для получения микрочипов белковых фрагментов ΑΑΚδ, которые могут затем использоваться для скрининга библиотек для идентификации агентов, которые взаимодействуют с белковым фрагментом (фрагментами) ΑΑΚδ.

Различные протоколы для детектирования и измерения экспрессии кодируемых полинуклеотидом продуктов с использованием связывающих агентов или антител, таких как поликлональные или моноклональные антитела, специфические для указанного продукта, известны в данной области техники. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ ^ΟδΑ), вестерн-иммуноблотинг, радиоиммунологические анализы (ΚΙΑ) и сортировку флуоресцентно-активированных клеток (РΑСδ). Эти и другие анализы описаны, среди других источников, в Натр!оп е! а1., δе^ο1οд^са1 Ме!Ьоб8, а ЬаЬога!огу Мапиа1 (1990) и Маббох е! а1., ί. Ехр. Меб. 158:1211-1216 (1983).

Широкое разнообразие меток и методов конъюгации известны специалистам в данной области техники, и их можно применять в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения зондов для меченой гибридизации или ПЦР для выявления последовательности, связанной с поли- 52 030461 нуклеотидами, включают олигомечение, ник-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. В альтернативном варианте последовательности или любые их части можно клонировать в вектор для продукции мРНК-зонда. Указанные векторы, известные в данной области техники, являются коммерчески доступными и их можно применять для синтеза РНК-зондов ίη νίίτο путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Указанные процедуры можно проводить использованием различных коммерчески доступных наборов. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые можно применять, включают радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.

Клетки-хозяева, трансформированные интересующей полинуклеотидной последовательностью, могут культивироваться в условиях, подходящих для экспрессии и восстановления белка из клеточной культуры. Согласно конкретному варианту реализации изобретения используется свободная от сыворотки клеточная система экспрессии. Примеры включают клетки НЕК293 и клетки СНО, которые можно растить в бессывороточной среде (см., например, ΚοδίΌΓ е! а1., Рго1еш Ехрг. РипГ. 40:237-43, 2005 и патент США № 6210922).

Белок, продуцированный рекомбинантной клеткой, может секретироваться или содержаться внутри клетки в зависимости от используемой последовательности и/или вектора. Специалистам в данной области техники ясно, что могут быть созданы векторы экспрессии, содержащие полинуклеотиды согласно изобретению, с включением сигнальных последовательностей, которые направляют секрецию закодированного полипептида через мембрану прокариотической или эукариотической клетки. Другие рекомбинантные конструкции можно применять для соединения последовательностей, кодирующих интересующий полипептид, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей домен полипептида, который будет облегчать очистку и/или детектирование растворимых белков. Примеры указанных доменов включают расщепляемые или не расщепляемые метки аффинной очистки и эпитопные метки, такие как авидин, РЬАО-метки, полигистидиновые метки (например, 6χΗίδ), сМус метки, У5-метки, глутатион-8трансферазные (О8Т) метки и другие.

Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может быть очищен и охарактеризован в соответствии с различными способами, известными в данной области техники. Типичные системы для проведения очистки белка и анализа чистоты белка, включают жидкостную экспресс-хроматография белков (ЖЭХБ) (например, системы для ЖЭХБ АКТА и Βίο-Каб), жидкостную хроматографию при высоком давлении (ЖХВД) (например, прибор для ЖХВД Βесктаη анб \Уа1ег5). Типичные химические анализы для очистки включают ионообменную хроматографию (например, Ц, 8), эксклюзионную хроматографию, солевые градиенты, аффинную очистку (например, Νί, ^, РЬАО, мальтоза, глутатион, белок А/О), гель-фильтрацию, обращенно-фазовую, керамическую НУРЕКЭ® ионообменную хроматографию и колонки для хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (Н1С), среди прочих, известных в данной области техники. Также включены аналитические способы, такие как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН) (например, окраска Кумасси, окрашивание серебром), иммуноблоттинг, метод Брэдфорда и ЕЬ18А, которые можно применять во время любого этапа продукции или процесса очистки, как правило, для измерения чистоты белковой композиции.

Также предложены способы концентрирования белковых фрагментов ААК8 и получения композиций, содержащих концентрированные растворимые белки. Согласно различным аспектам, такие концентрированные растворы полипептидов ААК8 могут содержать белки в концентрации, составляющей примерно 5 мг/мл, или примерно 8 мг/мл, или примерно 10 мг/мл; примерно 15 мг/мл или примерно 20 мг/мл.

Согласно одному аспекту указанные композиции могут являться, по существу, монодисперсным, что означает, что указанные композиции, содержащие полипептид ААК8, существуют в основном (т.е. по меньшей мере примерно на 90% или более) в форме, демонстрирующей одну очевидную молекулярную массу при анализе, например, с помощью эксклюзионной хроматографии, динамического рассеяния света или аналитического ультрацентрифугирования.

Согласно другому аспекту указанные композиции являются чистыми (на основе белка) по меньшей мере примерно на 90%, или согласно некоторым аспектам по меньшей мере примерно на 95% чистыми, или согласно некоторым вариантам реализации изобретения по меньшей мере на 98% чистыми. Чистоту можно определять с помощью любого стандартного аналитического способа, известного в данной области техники.

Согласно другому аспекту содержание высокомолекулярных агрегатов в указанных композициях составляет меньше примерно 10% от общего количества присутствующего белка или согласно некоторым вариантам реализации изобретения содержание высокомолекулярных агрегатов в указанных композициях составляет меньше примерно 5%, или согласно некоторым аспектам содержание высокомолекулярных агрегатов в указанных композициях составляет меньше примерно 3%, или согласно некоторым вариантам реализации изобретения содержание высокомолекулярных агрегатов составляет меньше примерно 1%. Содержание высокомолекулярных агрегатов можно определить с помощью различных аналитических методов, включая, например, эксклюзионную хроматографию, динамическое рассеяние света

- 53 030461 или аналитическое ультрацентрифугирование.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, как отмечено в настоящем описании, содержание эндотоксина в композициях полипептида ΛΛΚδ составляет меньше примерно 10 ЕЭ/мг полипептида ΛΛΚδ или меньше примерно 5 ЕЭ/мг полипептида ΛΛΚδ, меньше примерно 3 ЕЭ/мг полипептида ΛΛΚδ или меньше примерно 1 ЕЭ/мг полипептида ΛΛΚδ.

Примеры методов концентрирования, рассмотренных в настоящем описании, включают лиофилизацию, которую, как правило, используют, когда раствор содержит малорастворимые компоненты, отличные от интересующего белка. Лиофилизацию часто осуществляют после проведения ЖХВД, и с ее помощью можно удалять большую часть или все летучие компоненты из смеси. Также предусмотрены методы ультрафильтрации, которые, как правило, используют одну или более селективную проницаемую мембрану для концентрации белкового раствора. Мембрана позволяет прохождение воды и малых молекул, но не пропускает белок; раствор может пропускаться через мембрану с помощью механического насоса, давления газа или центрифугирования и других методов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения реагенты, белковые фрагменты ΛΛΚδ или родственные агенты (например, антитела) являются чистыми по меньшей мере примерно на 90%, по результатам измерения в соответствии со стандартными методами в данной области техники. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, таким как диагностические композиции или конкретные терапевтические композиции, композиции, содержащие ΛΛΚδ, согласно настоящему изобретению являются чистыми по меньшей мере примерно на 95%. Согласно конкретному варианту реализации изобретения, таким как терапевтические или фармацевтические композиции, композиции, содержащие ΛΛΚδ, согласно настоящему изобретению являются чистыми по меньшей мере примерно на 97% или 98%, или 99%. Согласно другим вариантам реализации изобретения, таким как применение в качестве эталонных реагентов или реагентов для исследований, белковые фрагменты ΛΛΚδ могут быть менее чистыми и могут являться чистыми по меньшей мере примерно на 50, 60, 70 или 80%. Можно измерять общую чистоту или чистоту на основе выбранных компонентов, таких как другие белки, например, чистоту на основе белка.

Очищенные белковые фрагменты ΛΛΚδ также могут быть охарактеризованы в соответствии с их биологическими характеристиками. Примеры включают аффинность связывания или кинетику связывания с выбранным лигандом (например, клеточным партнером по связыванию белкового фрагмента ΛΛΚδ, таким как рецептор клеточной поверхности или его внеклеточный домен) и присутствие уровня одной или более традиционной или неканонической биологической активности, описанной в настоящем документе. Аффинность связывания и кинетику связывания можно измерить в соответствии с различными способами, известными в данной области техники, такими как В1асоге® и связанные технологии, которые используют поверхностный плазмонный резонанс (δΡΚ), оптическое явление, которое обеспечивает детектирование немеченных интерактантов в реальном времени. Биосенсоры на основе δΡΚ могут применяться для определения активной концентрации, скрининга и исследования на предмет аффинности и кинетики. Присутствие уровня одной или более традиционных или нетрадиционных биологических видов активности можно измерить в соответствии с клеточными анализами, включая анализы, которые используют клеточный партнер по связыванию (например, рецептор клеточной поверхности), выбранный из белкового фрагмента ΛΛΚδ, который функционально сопряжен с выявляемым агентом или индикатором, таким как флуоресцентный или люминесцентный индикатор неканонической биологической активности, описанный в настоящем документе.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, как отмечено выше, композиции, содержащие полипептид ΛΛΚδ, являются, по существу, приблизительно свободными от эндотоксина, например, примерно на 95% свободными от эндотоксина, предпочтительно, примерно на 99% свободными от эндотоксина и более предпочтительно примерно на 99,99% свободными от эндотоксина. Присутствие эндотоксинов можно выявить в соответствии со стандартными методами, известными в данной области техники, как описано в настоящем документе. Согласно конкретному варианту реализации изобретения композиции, содержащие ΛΛΚδ, получены из эукариотической клетки, такой как клетка млекопитающего или клетка человека, по существу, в свободной от сыворотки среде.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиции, содержащие полипептид ΛΛΚδ, содержат меньше примерно 10 мас.% высокомолекулярных агрегатов или меньше примерно 5 мас.% высокомолекулярных агрегатов, или меньше примерно 2 мас.% высокомолекулярных агрегатов, или меньше примерно или меньше примерно 1 мас.% высокомолекулярных агрегатов.

Также предусмотрены способы анализа и тест-системы на основе белка, которые можно применять для оценки, например, чистоты белка, размера, растворимости и степени агрегации, а также другие характеристики. Чистоту белка можно оценить несколькими путями. Например, чистоту можно оценить на основе первичной структуры, структуры высоких порядков, размера, заряда, гидрофобности и гликозилирования. Примеры способов проведения оценки первичной структуры включают N и С-концевое секвенирование и пептид-картирование (см., например, Λ1Φη е! а1., Вю1одюа1в. 24:255-275, 1996)). Примеры способов проведения оценки структуры высоких порядков включают круговой дихроизм (см., например, Ке11у е! а1., ВюсЫт ВюрНув Λ^3. 1751:119-139, 2005), флуоресцентную спектроскопию (см., например,

- 54 030461

МеадИег е! а1., I. Вю1. СИет. 273:23283-89, 1998), ΡΤ4Κ, кинетику водородно-дейтериевого обмена в амидах, дифференциальную сканирующую калориметрию, ЯМР-спектроскопию, иммунореактивность с чувствительными к конформации антителами. Структуры высоких порядков также можно оценивать как функцию различных параметров, таких как рН, температура или добавленные соли. Примеры способов осуществления оценки характеристик белка, таких как размер, включают аналитическое ультрацентрифугирование и эксклюзионную ЖХВД (ЭХ-ЖХВД), и типичные способы для измерения заряда включают ионообменную хроматографию и изоэлектрическое фокусирование. Гидрофобность можно оценить, например, с помощью обращенно-фазовой ЖХВД и хроматографии гидрофобных взаимодействий ЖХВД. Гликозилирование может влиять на фармакокинетику (например, клиренс), конформацию или стабильность, связывание с рецептором и функцию белка и может быть оценено, например, с помощью масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Как отмечено выше, конкретные варианты реализации изобретения включают применение ЭХ-ЖХВД для оценки характеристик белка, таких как чистота, размер (например, гомогенность размера) или степень агрегации, и/или для очистки белков и другие применения. Эксклюзионная хроматография (ЭХ), также включая гель-фильтрационную хроматографию (ГФХ) и гель-проникающую хроматографию (ГПХ), относится к хроматографическому методу, в котором молекулы в растворе разделяются в пористом материале на основе их размера или, более конкретно, их гидродинамического объема, коэффициента диффузии и/или свойств поверхности. Процесс в целом используется для разделения биологических молекул и для определения молекулярных масс и распределения молекулярных масс полимеров. Как правило, биологический образец или белковый образец (такой как белковый экстракт, полученный в соответствии со способами экспрессии белка, предложенными в настоящем документе и известными в данной области техники) наносится на выбранную колонку для эксклюзионной хроматографии с определенной неподвижной фазой (пористым материалом), предпочтительно фазой, которая не взаимодействует с белками в образце. Согласно конкретным аспектам изобретения неподвижная фаза состоит из инертных частиц, упакованных в плотную трехмерную матрицу внутри стеклянной или стальной колонки. Подвижная фаза может представлять собой чистую воду, водный буфер, органический растворитель или их смесь. Частицы неподвижной фазы, как правило, имеют маленькие поры и/или каналы, которые только позволяют входить молекулам ниже конкретного размера. Большие частицы, таким образом, исключаются из указанных пор и каналов, и их ограниченное взаимодействие с неподвижной фазой приводит к их вымыванию в виде полностью исключенного пика в начале эксперимента. Более мелкие молекулы, которые могут вместиться в поры, удаляются из текущей подвижной фазы, и время, которое они проводят иммобилизованными в порах неподвижной фазы, зависит отчасти от того, как далеко они проникают в поры. Их удаление из тока подвижной фазы приводит к тому, что они дольше вымываются из колонки, что приводит к разделению частиц на основе различий в их размере. Конкретная колонка для эксклюзионной хроматографии имеет диапазон молекулярных масс, которые могут разделяться. В целом, молекулы, которые больше верхнего предела, не улавливаются неподвижной фазой молекулы, которые меньше нижнего предела, полностью заходят в твердую фазу и вымываются в виде одного бэнда и молекулы, находящиеся в пределах диапазона, вымываются с разными скоростями, которые определяются их свойствами, такими как гидродинамический объем. Примеры указанных способов, используемых на практике для фармацевтических белков, можно найти в источнике Вгииег е! а1., 1оита1 оГ РЬагтасеиПса1 аий Вютейюа1 Άиа1уκ^κ. 15: 1929-1935, 1997.

Чистота белка для клинического применения также обсуждается, например, Аницетти (Ашсе!!! е! а1., ШеГОк 1и Вю!ес1то1оду. 7:342-349, 1989). Более поздние методы анализа чистоты белка включают, но не ограничиваются перечисленными, ЬаЪСЫр ОХИ, автоматизированную платформу для быстрого анализа белков и нуклеиновых кислот, которая обеспечивает высокоэффективный анализ титра, распределение по размеру и анализ чистоты белков. Согласно конкретным неограничивающим вариантам реализации изобретения белки клинической степени чистоты, такие как белковые фрагменты и антитела, могут быть получены путем использования комбинирования хроматографических материалов по меньшей мере в двух независимых этапах, среди других способов (см., например, ΤИе^ареи!^с Рго1ешк: Ме!Иойк аий Рго!осо1к. Ш1. 308, Ейк., δта1еκ аий 1атек, Нитаиа Ргекк Ыс., 2005). Как правило, белковые агенты (например, белковые фрагменты ΆΆΚδ, антитела, связывающие агенты) и другие агенты (например, антисмысловые, РНКи, низкомолекулярные соединения), по существу, являются свободными от эндотоксинов, как измерено в соответствии со способами, известными в данной области техники и, описанными в настоящем документе.

Также включены способы анализа растворимости белков. Такие анализы можно применять, например, для определения оптимальных условий для роста и очистки для рекомбинантной продукции, для оптимизации выбора буфера (буферов) и для оптимизации выбора белковых фрагментов ΆΆΚδ или их вариантов. Растворимость или агрегацию можно оценить в соответствии с различными параметрами, включая температуру, рН, соли и присутствие или отсутствие других добавок. Примеры скрининговых анализов растворимости включают, но не ограничиваются перечисленными, способ измерения растворимости белка на основе микропланшетов с использованием степени прозрачности или других измерений в качестве конечной точки, высокоэффективные анализы для анализа растворимости очищенных

- 55 030461 рекомбинантных белков (см., например, 81епуа11 е! а1., ВюсЫт ВюрЬук Ас!а. 1752:6-10, 2005), анализы, которые используют структурную комплементарность генетического маркерного белка для отслеживания и измерения укладки белка и растворимости ш νί\Ό (см., например, ^1д1еу е! а1., №-1!иге Вю1есйпо1оду. 19:131-136, 2001) и электрохимический скрининг растворимости рекомбинантных белков в ЕксЬепсЫа сой с использованием сканирующей электрохимической микроскопии (ксапшпд е1ес!госЬетюа1 тюгоксору, 8ЕСМ) (см., например, N ада пипе е! а1., Вю!есНпо1оду апб Вюепдшееппд. 96:10081013, 2006), среди других способов. Белковые фрагменты ААК8, обладающие повышенной растворимостью (или пониженной агрегацией), могут быть идентифицированы или выбраны в соответствии со стандартными методами в данной области техники, включая простые анализы ш νί\Ό растворимости белка (см., например, Мах\уе11 е! а1., Рго1еш 8сг 8:1908-11, 1999).

Растворимость и агрегацию белка можно измерить с помощью методов на основе динамического рассеяния света. Агрегация представляет собой общий термин, который включает несколько типов взаимодействий или характеристик, включая растворимость/нерастворимость, ковалентные/нековалентные взаимодействия, обратимые/необратимые взаимодействия и нативное/денатурированное состояния. Для способов терапии с использованием белков присутствие агрегатов, как правило, считается нежелательным из-за того, что агрегаты могут вызывать иммуногенную реакцию (например, малые агрегаты) или могут вызывать неблагоприятные реакции на введение (например, частиц). Динамическое рассеяние света относится к методу, который может использоваться для определения профиля распределения по размерам малых частиц в суспензии или полимерах, таких как белки в растворе. Указанный метод, также называемый фотонно-корреляционной спектроскопией (РС8) или квазиупругим рассеянием света (ОЕЬ8), использует рассеянный свет для измерения скорости диффузии белковых частиц. Колебания интенсивности рассеивания могут наблюдаться из-за броуновского движения молекул и частиц в растворе. Указанные данные о движении могут стандартным способом обрабатываться для выведения распределения по размерам для образца, где указанный размер описывается радиусом Стокса или гидродинамическим радиусом белковой частицы. Гидродинамический размер зависит как от массы, так и от формы (конформации). Динамическое рассеивание может выявлять присутствие очень малых количеств агрегированного белка (<0,01 мас.%), даже в образцах, которые содержат большой диапазон масс. Его также можно использовать для сравнения стабильности различных лекарственных форм, включая, например, способы применения, которые основаны на наблюдении изменений в реальном времени при повышенных температурах. Соответственно, конкретные варианты реализации изобретения включают применение динамического рассеяния света для анализа растворимости и/или присутствия агрегатов в образце, который содержит белковый фрагмент ААК8, антитело или другой агент согласно изобретению.

IX. Диагностические способы и композиции.

АΛК8-агенты, такие как белковые фрагменты ААК8, полинуклеотиды ААК8 и антитела и другие связывающие агенты, описанные в настоящем документе, могут применяться в диагностических анализах и диагностических композициях. Включены биохимические, гистологические и клеточные способы и композиции, среди прочего.

Указанные и связанные варианты реализации изобретения включают детектирование последовательности (последовательностей) полинуклеотида ААК8 или соответствующей последовательности (последовательностей) полипептида ААК8 или его частей, одного или более новых идентифицированных белковых фрагментов ААК8, также называемых полипептидами ААК8. Например, конкретные аспекты включают детектирование последовательности (последовательностей) полинуклеотида ААК8 или соответствующей последовательности (последовательностей) полипептида или его частей, одного или более новых идентифицированных сплайс-вариантов ААК8, и/или одной или более границ сплайсинга указанных сплайс-вариантов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полинуклеотид или соответствующая последовательность (последовательности) полипептида по меньшей мере одной из границ сплайсинга является уникальной для указанного конкретного сплайс-варианта ААК8.

Также предложено непосредственное детектирование белковых фрагментов ААК8, включая сплайс-варианты, протеолитические фрагменты и др.. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения присутствие или уровень одного или более новых идентифицированных белковых фрагментов ААК8 связан или коррелирует с одним или более клеточным типом или состоянием клеток. Таким образом, присутствие или уровень полипептида или полинуклеотида ААК8 можно применять для различения разных типов клеток или разных состояний клеток. Присутствие или уровень белковых фрагментов ААК8 или родственных им полинуклеотидов может выявляться в соответствии с основанными на полинуклеотидах и/или полипептидах диагностическими методами, описанными в настоящем документе и известными в данной области техники.

Согласно конкретным аспектам белковые фрагменты ААК8, антитела или полинуклеотиды ААК8 можно применять как часть сопутствующего диагностического способа, обычно, для предсказания благоприятного ответа у субъекта или популяции субъектов на конкретное медицинское лечение. Например, конкретный терапевтический агент ААК8 (например, белковый фрагмент, антисмысловой агент, РНКиагент, антитело, связывающий агент) можно идентифицировать как подходящий для субъекта или конкретной популяции субъектов на основе того, будет ли субъект (субъекты) иметь один или более вы- 56 030461 бранных биомаркеров для конкретного заболевания или состояния. Примеры биомаркеров включают сывороточные/тканевые маркеры, а также маркеры, которые могут быть идентифицированы с помощью методов медицинской визуализации. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения природный белковый фрагмент ААК8 (или соответствующий полинуклеотид) может сам обеспечивать сывороточный и/или тканевой биомаркер, который можно использовать для измерения результата лекарственного средства или оценки целесообразности применения указанного лекарственного средства у конкретных субъектов или в конкретных популяциях субъектов. Согласно конкретным аспектам изобретения, идентификация эталонной последовательности полипептида или полинуклеотида ААК8 может включать характеризацию дифференциальной экспрессии указанной последовательности как в выбранном субъекте, так и в выбранной ткани, или другим способом, описанным в настоящем документе и известным в данной области техники.

Конкретные способы, предложенные в настоящем описании, основываются на различной экспрессии полипептида или полинуклеотида ААК8 для исследования состояния или стадии клетки, ткани или субъекта, и для различения их от других клеток, тканей или субъектов. Неограничивающие примеры включают способы выявления присутствия или уровня полипептида или полинуклеотида ААК8 в биологическом образце для различения клеток или тканей разных видов, клеток разных тканей или органов, стадий клеточного развития, например, клетками новорожденного и взрослого организма, стадий дифференцировки клеток, состояний, таких как здоровое, нездоровое и требующее лечения состояние, внутриклеточных и внеклеточных фракций, а также первичных клеточных культур, таких как иммортализованные клеточные культуры.

Дифференциальная экспрессия включает статистически значимое различие уровней экспрессии одного или более генов эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК8 по сравнению с уровнем экспрессии той же последовательности в соответствующем контроле. Статистически значимое различие может относиться либо к повышению, либо к снижению уровня экспрессии при измерении на основе уровня РНК, уровня белка, функции белка или любого другого подходящего способа измерения экспрессии гена, такого как способы измерения, описанные в настоящем документе. Также включено сравнение полинуклеотида или полипептида ААК8 согласно изобретению и последовательности полноразмерной цитозольной или митохондриальной ААК8 или цитозольной или митохондриальной ААК8 дикого типа, как правило, такого же или соответствующего типа. Дифференциальная экспрессия может быть выявлена с помощью различных способов, известных в данной области техники и описанных в настоящем документе, включая способы на основе полинуклеотидов и полипептидов, такие как ПЦР в реальном времени, вычитающая гибридизация, полинуклеотидные и полипептидные чипы и др.

Результат, как правило, называется статистически значимым, если он с низкой вероятностью является случайным. Уровень значимости теста или результата обычно относится к анализу частоты принятия статистической гипотезы. В простых случаях, статистическая значимость может быть определена как вероятность принятия решения отвержения нулевой гипотезы, когда указанная нулевая гипотеза является в действительности справедливой (решение, известное как ошибка I типа, ложноположительное определение). Указанное решение часто принимается на основе р-значения: если р-значение меньше уровня значимости, то нулевая гипотеза отвергается. Чем меньше р-значение, тем более значимым является результат. Коэффициенты Бейеса также можно применять для определения статистической значимости (см., например, Сοοάтаи 8., Аии ПЛет Меά. 130:1005-13, 1999).

В более сложных, но с практической точки зрения важных случаях уровень значимости критерия или результата может относиться к анализу, в котором вероятность принятия решения о том, что нулевую гипотезу следует отвергнуть, когда указанная нулевая гипотеза является в действительности справедливой, составляет не более чем установленное значение вероятности. Указанный тип анализа обеспечивает возможность указанных применений, в которых вероятность принятия решения отвержения может быть намного меньше уровня значимости для некоторых наборов допущений, включенных в нулевую гипотезу.

Согласно конкретным типичным вариантам реализации изобретения статистически значимая дифференциальная экспрессия может включать ситуации, когда уровень экспрессии данной последовательности ААК8 обеспечивает по меньшей мере примерно 1,2х, 1,3х, 1,4х, 1,5х, 1,6х, 1,7х, 1,8х, 1,9х, 2,0х, 2,2х, 2,4х, 2,6х, 2,8х, 3,0х, 4,0х, 5,0х, 6,0х, 7,0х, 8,0х, 9, 0х, 10,0х, 15,0х, 20,0х, 50,0х, 100,0х или больше, в отличие от экспрессии (т.е. обеспечивает дифференциальную экспрессию, которая может быть выше или ниже экспрессии) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с соответствующим контролем, включая все целые числа и десятичные дроби между ними (например, 1,24х, 1,25х, 2,1х, 2,5х, 60,0х, 75,0х и т.д.). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения статистически значимая дифференциальная экспрессия может включать ситуации, когда уровень экспрессии конкретной последовательности ААК8 обеспечивает по меньшей мере примерно на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000% или больше различие в экспрессии (т. е. дифференциальную экспрессию, которая может быть выше или ниже) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с соответствующим контролем, включая все

- 57 030461 целые числа и десятичные дроби между ними.

В качестве дополнительного примера дифференциальную экспрессию также можно определить путем проведения Ζ-тестирования, т.е. расчета абсолютного Ζ-показателя, как описано в настоящем документе и известно в данной области техники (см. пример 1). Ζ-тестирование, как правило, используется для идентификации достоверных различий между средним для образца и средним для популяции. Например, по сравнению со стандартной нормальной таблицей (например, контрольной тканью), при доверительном интервале 95% (т.е. при уровне значимости 5%), Ζ-показатель с абсолютным значением более 1,96 указывает на неслучайность. Для доверительного интервала 99%, если абсолютный Ζ-показатель больше 2,58, это означает, что р<0,01, и различие даже более достоверно - нулевая гипотеза может быть отвергнута с большим доверием. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения абсолютный Ζ-показатель, равный 1,96, 2, 2,58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более, включая все десятичные дроби между ними (например, 10,1, 10,6, 11,2 и т.д.), может обеспечивать высокое значение статистической значимости. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения абсолютный Ζ-показатель, равный более чем 6, может обеспечить крайне высокую статистическую значимость.

По существу аналогичный, в целом, относится к отсутствию статистически значимого различия в уровне экспрессии между биологическим образцом и эталонным контролем. Примеры фактически одинакового уровня экспрессии могут включать ситуации, где уровень экспрессии данного δδΟΟδ обеспечивает меньше примерно 0,05х, 0,1х, 0,2х, 0,3х, 0,4х, 0,5х, 0, 6х, 0,7х, 0,8х, 0,9х, 1,0х, 1,1х, 1,2х, 1,3х или 1,4х различие в экспрессии (т.е. дифференциальную экспрессию, которая может представлять собой более высокую или более низкую экспрессию) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с эталонным образцом, включая все десятичные дроби между ними (например, 0,15х, 0,25х, 0,35х и т.д.). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения дифференциальная экспрессия может включать ситуации, где уровень экспрессии данной последовательности ΑΑΚδ обеспечивает меньше примерно на 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50% различие в экспрессии (т.е. дифференциальную экспрессию, которая может представлять собой более высокую или более низкую экспрессию) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с эталонным образцом, включая все десятичные дроби между ними.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, например, когда используют микрочип АГГутеЫх для измерения уровня экспрессии эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ, дифференциальная экспрессия может также быть определена с помощью среднего значения экспрессии, суммированного с помощью программы АГГуте1п.\ Мюгоаггау διιίΐο 5 (АГГутейгх, Санта Клара, Калифорния) или других подобных программ, как правило, при определенном среднем значении экспрессии, равном 1000.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы детектирования присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ или его части для различения клеток или тканей или других биологических образцов различных организмов или видов, где присутствие или уровень указанной последовательности связан с выбранным организмом или видом. Общие примеры включают способы различения между человеком и любой комбинацией бактерий, грибов, растений и других животных, отличных от человека. Для животных включены способы проведения различия между человеком и любой комбинацией позвоночных и беспозвоночных, включая позвоночных, таких как рыбы, амфибии, рептилии, птицы и млекопитающие, отличные от человека, и беспозвоночных, таких как насекомые, моллюски, ракообразные и кораллы. Для млекопитающих, отличных от человека, включены способы проведения различия между человеком и любой комбинацией млекопитающих, отличных от человека, из порядка ΑΓ^080^^с^На, Мас^ο8се1^Неа, ТиЬиННеп1а1а, Нуга^^а, Р^οЬο8с^Неа, δίΓοπία, СшдиЩа, Р^а, δсаηНеηί^а, ^е^тορίе^а, Р^^таίе8, Κο^πύ^ ^адοтο^ρΗа, Ε^^ηасеοтο^ρΗа, δο^^сοтο^ρΗа, СΗ^^ορίе^а, РΗο1^Нοίа, Сеίасеа, Са^π^νο^а, Ре^^88οНасίу1а или Α^ι^οНасίу1а. В порядок приматов (Рпта1с) включены мартышки, обезьяны, гориллы и шимпанзе, среди прочих, известные в данной области техники. Соответственно, присутствие или уровень эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ или варианта, описанного в настоящем документе, может использоваться для идентификации источника конкретного биологического образца, такого как клетка, ткань или орган, путем проведения различия между любой комбинацией указанных организмов или путем проведения различия между человеком и любым одним или более из указанных организмов, например группой организмов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения источник конкретного биологического образца может также быть определен путем сравнения присутствия или уровня последовательности ΑΑΚδ или ее части с заранее определенным значением.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы выявления присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ или его части для проведения различия между клетками или другими биологическими образцами, которые происходят из различных тканей или органов. Неограничивающие примеры включают способы проведения различия между клеткой или другим биологическим образцом, который происходит из любой комбинации из кожи

- 58 030461 (например, дермы, эпидермиса, подкожного слоя), волосяных фолликулов, нервной системы (например, мозга, спинного мозга, периферических нервов), слуховой системы или органов равновесия (например, внутреннего уха, среднего уха, наружного уха), респираторной системы (например, носа, трахеи, легких), гастроэзофагальных тканей, желудочно-кишечной системы (например, рта, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки), сосудистой системы (например, сердца, кровеносных сосудов и артерий), печени, мочевого пузыря, лимфатической/иммунной системы (например, лимфатических узлов, лимфоидных фолликулов, селезенки, тимуса, костного мозга), мочеполовой системы (например, почек, мочеточника, мочевого пузыря, уретры, шейки матки, фаллопиевых труб, яичников, матки, вульвы, предстательной железы, бульбоуретральных желез, придатка семенника, предстательной железы, семенных пузырьков, яичек), скелетно-мышечной системы (например, скелетных мышц, гладких мышц, костей, хряща, связок, сухожилий), жировой ткани, ткани молочной железы и эндокринной системы (например, гипоталамуса, гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, надпочечников). Таким образом, на основе связи с последовательностью полинуклеотида или полипептида ААК8, описанной в настоящем документе, указанные способы можно применять для идентификации или исследования ткани или органа, из которого была получена клетка или другой биологический образец.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы выявления присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК8 или его части для исследования или проведения различия между стадиями развития или дифференцировки клетки. Также включены способы проведения различия между зародышевыми клетками, стволовыми клетками и соматическими клетками. Примеры стадии развития включают стадию новорожденного и взрослого организма. Примеры стадий дифференцировки клеток включают все из отдельных и идентифицируемых состояний между тотипотентной клеткой, плюрипотентной клеткой, мультипотентной прогениторной стволовой клеткой и зрелой, полностью дифференцированной клеткой.

Тотипотентная клетка, имеющая общий потенциал, как правило, возникает в результате полового и неполового размножения и включает споры и зиготы, хотя в конкретных примерах указанные клетки могут дедифференцироваться и восстанавливать тотипотентность. Плюрипотентная клетка включает стволовую клетку, которая имеет способность дифференцироваться в любой из трех зародышевых листков, включая эндодерму (внутренняя выстилка желудка, желудочно-кишечный тракт, легкие), мезодерму (мышцы, кость, кровь, мочеполовая система) и эктодерму (эпидермальные ткани и нервная система).

Мультипотентные клетки-предшественники, как правило, способны дифференцироваться в ограниченное число типов тканей. Примеры мультипотентных клеток включают, но не ограничиваются перечисленными, гематопоэтические стволовые клетки (взрослые стволовые клетки) из костного мозга, которые дают начало клеткам иммунной системы, таким как эритроциты, лейкоциты крови и тромбоциты, мезенхимальные стволовые клетки (взрослые стволовые клетки) из костного мозга, которые дают начало стромальным клеткам, жировым клеткам и различным типам клеток кости, эпителиальные стволовые клетки (клетки-предшественники), которые дают начало различным типам клеток кожи, и мышечные сателлитные клетки (клетки-предшественники), которые вносят вклад в дифференцированную мышечную ткань. Соответственно, присутствие или уровень конкретной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК8 (например, границы сплайсинга сплайс-варианта ААК8, протеолитического фрагмента ААК8) может использоваться для исследования или проведения различия между вышеуказанными стадиями дифференцировки клеток и контролем или предварительно определенным уровнем.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы выявления присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК8 для исследования или диагностирования состояния или клетки, ткани, органа или субъекта, в котором указанное состояние может быть охарактеризовано как здоровое, не здоровое, подверженное риску заболевания или подверженное лечению. Для указанных диагностических целей термин диагностический или диагностировать включает идентификацию присутствия или природы патологического состояния, определение риска развития указанного состояния и/или измерение изменения (или отсутствия изменения) патологического состояния в ответ на лечение. Диагностические способы могут отличаться по чувствительности и специфичности. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения чувствительность диагностического анализа относится к проценту больных клеток, тканей или субъектов, которые имеют положительный ответ в указанном анализе (процент истинно положительных). Больные клетки, ткани или субъекты, не выявляемые с помощью анализа, как правило, называются ложноотрицательными. Клетки, ткани или субъекты, которые не являются больными и которые имеют отрицательный ответ в анализе, могут называться истинно отрицательными. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения специфичность диагностического анализа может быть определена как один (1) минус частота встречаемости ложнопозитивных, где частота встречаемости ложнопозитивных определяется как отношение образцов или субъектов, не являющимися больными, которые имеют положительный ответ в анализе. Поскольку конкретные диагностические способы могут не обеспечивать точного диагностирования состояния, является достаточным, если способ обеспечивает положительную индикацию, способствующую диагностированию.

- 59 030461

В конкретных примерах существование риска развития патологического состояния можно диагностировать путем сравнения присутствия или уровня одной или более выбранной эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ или его частей, который коррелирует с состоянием на основе повышенного или пониженного уровня по сравнению с подходящим контролем. Подходящий контроль или соответствующий контроль включает значение, уровень, признак, характеристику или свойство, определенное в клетке или другом биологическом образце ткани или организма, например контрольная или нормальная клетка, ткань или организм, проявляющий, например, нормальные признаки, такие как отсутствие состояния. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения подходящий контроль или соответствующий контроль представляет собой предварительно определенное значение, уровень, признак, характеристику или свойство. Другие подходящие контроли очевидны специалистам в данной области техники. Примеры заболеваний и состояний описаны в другой части настоящего документа.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы детектирования на основе полинуклеотида или нуклеиновой кислоты ΑΑΚδ, которые обеспечивают конкретные преимущества благодаря чувствительности детектирования. Таким образом, конкретные варианты реализации изобретения относятся к применению или детектированию полинуклеотидов ΑΑΚδ как части способа диагностики или диагностической тест-системы. Присутствие и/или уровень полинуклеотидов ΑΑΚδ можно измерять с помощью любого способа, известного в данной области техники, включая гибридизационные анализы, такие как нозерн-блоттинг, количественная или качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР), количественная или качественная ПЦР с обратной транскриптазой (ΚΤ-ПЦР), микрочип, дот- или спотблоттинг или ίη 81ки гибридизация, такая как флуоресцентная ίη κίΐυ гибридизация (Р^Н), среди других способов. Конкретные из указанных способов описаны более подробно ниже.

Полинуклеотиды ΑΑΚδ, такие как ДНК и РНК, могут быть собраны и/или получены из крови, биологических жидкостей, тканей, органов, клеточных линий или других подходящих образцов с использованием методов, известных в данной области техники, таких как методы, описанные в источнике (КтдкЮц 2002, СиггеШ РюШ^к ίη ΜοΚαιΕίΓ Β^ο1ο§у, Сгеене РиЬ1. Ακκοο Бгс. & ίοΐιη АПеу & δοηκ, Шс., ΝΥ, ΝΥ (см., например, как описано в №1κοη ек а1. Ргос. Ν;·ι(1. Αсаб. δα. υδΑ, 99:11890-11895, 2002)) и в других источниках. Более того, различные коммерчески доступные наборы для конструирования РНК применимы для создания РНК для использования согласно настоящему изобретению. РНК может быть создана из органов/тканей/клеток, полученных из нормальных здоровых субъектов; однако настоящее изобретение также рассматривает конструирование РНК из не здоровых субъектов. Конкретные варианты реализации изобретения предполагают использование любого типа органа из любого типа субъекта или животного. Для тестируемых образцов РНК может быть получена из индивида (например, животного, включая млекопитающих), страдающего или не страдающего видимым заболеванием, и из образцов ткани, биологических жидкостей (например, цельной крови) или т.п.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения амплификация или конструирование последовательности кДНК могут быть полезными для повышения детектирующей способности. Согласно настоящему изобретению, так же как и в данной области техники, предложен необходимый уровень детализации для осуществления указанных задач. Согласно одному типичному варианту реализации изобретения цельная кровь используется в качестве источника РНК и, соответственно, необязательно используются РНК-стабилизирующие реагенты, такие как РАХ-пробирки, как описано, например, в источниках Τίκκίι ек а1., I. Iттиηο1. ΜекЬοб8. Пес. 283 (1-2):269-279, 2003 и Скат ек а1., I. С1ш. ЬаЬ. Αηа1. 19(5):182-188, 2005 (оба из которых включены посредством ссылки). Библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) могут быть созданы с использованием методов, известных в данной области техники, таких как методы, описанные в Αυκυ^1 ек а1. (2001, СиггеШ РюШ^к ίη ΜοΚαιΕίΓ Β^ο1ο§у, Сгееие РиЬ1. Ακκοα Бгс. & ίοίιη АПеу & δοηκ, Шс., ΝΥ, ΝΥ); δ;·ιιη0Γοο1< ек а1. (1989, ΜοΚαιΕίΓ Οοηί^, δесοηб Еб., Со1б δр^^ηд ΗπγΕογ Ба^гат^, Р1а1те1е№, ΝΥ); Μаη^ак^8 ек а1. (1982, ΜοΚαιΕίΓ Οοηί^, Со1б δр^^ηд ΗπγΕογ ^аЬο^акο^у, Р1и1пу|е^, ΝΥ), а также в других источниках. Кроме того, различные коммерчески доступные наборы для создания библиотеки кДНК являются применимыми для создания библиотеки кДНК согласно настоящему изобретению. Могут быть созданы библиотеки из органов/тканей/клеток, полученных от нормальных здоровых субъектов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять способы гибридизации для детектирования полинуклеотидных последовательностей ΑΑΚδ. Способы проведения анализов гибридизации полинуклеотидов хорошо развиты в данной области техники. Методы и условия гибридизационого анализа варьируют в зависимости от применения и выбраны в соответствии с общими известными методами связывания, включая методы, на которые ссылаются в источниках Μ;·ιηί;·ιΙί5 ек а1. Μο^^α Οοηίηβ: Α Ε;Λογ;·ιΙογυ Μаηиа1 (2^п6 Еб. СШб δр^^ηд Η-ιΛοη Ν.Υ., 1989); Бегдег ;тб Кипте1 [Небюбк ίη Εηζутο1ο§у, νο1. 152, Сшбе ϊο ΜοΚαιΕίΓ Οοηίηβ ΤесЬη^^ие8 ^сабеттс Ргекк, Шс., δаη ^^едο, СаПС 1987); Υοιιηβ ;тб Паук, ΡNΑδ. 80:1194 (1983). Способы и приборы для осуществления воспроизводимых и контролируемых реакций гибридизации были описаны в патентах США № 5871928, 5874219, 6045996 и 6386749, 6391623, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.

- 60 030461

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять способы амплификации нуклеиновых кислот для детектирования полинуклеотидных последовательностей ААК8. Термин амплификация или амплификация нуклеиновых кислот относится к продукции множества копий нуклеиновой кислоты-мишени, которая содержит по меньшей мере часть предполагаемой специфической последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Множество копий может называться ампликоном или продуктами амплификации. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения амплифицированная мишень содержит неполную последовательность гена-мишени (интроны и экзоны) или экспрессированную последовательность гена-мишени (сплайсированный транскрипт экзонов и фланкирующих нетранслируемых последовательностей). Например, специфические ампликоны могут продуцироваться путем амплификации части интересующий полинуклеотид при использовании праймеров для амплификации, которые гибридизуются и инициируют полимеризацию с внутренних сайтов интересующего полинуклеотида.

Предпочтительно амплифицируемая часть содержит поддающуюся выявлению последовательность-мишень, которая может быть выявлена с использованием любого из различных хорошо известных способов.

Селективная амплификация или специфичная амплификация в настоящем описании относится к амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, где выявляемая амплификация последовательности-мишени, по существу, ограничена амплификацией последовательности-мишени, в которую вносит вклад интересующий образец нуклеиновой кислоты, подверженный тестированию, и не вносит вклад последовательность нуклеиновой кислотымишени, полученная из другого источника образца, например загрязнения, присутствующего в реагентах, используемых во время реакций амплификации, или в окружении, в котором проводят указанные реакции амплификации.

Термин условия амплификации относится к условиям, обеспечивающим амплификацию нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. Условия амплификации согласно некоторым вариантам реализации изобретения могут быть менее жесткими по сравнению с жесткими условиями гибридизации, описанными в настоящем документе. Олигонуклеотиды, используемые в реакциях амплификации согласно настоящему изобретению, гибридизуются с их предполагаемыми мишенями в условиях амплификации, но могут или не могут гибридизоваться при жестких условиях гибридизации. С другой стороны, зонды для детектирования согласно настоящему изобретению, как правило, гибридизуются при жестких условиях гибридизации. Приемлемые условия для осуществления амплификации нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением могут быть с легкостью определены специалистом в данной области техники в зависимости от конкретного используемого способа амплификации.

Многие хорошо известные способы амплификации нуклеиновых кислот требуют термоциклирования для чередования циклов денатурации двухцепочечной нуклеиновой кислоты и гибридизации праймеров; однако другие хорошо известные способы амплификации нуклеиновых кислот являются изотермическими. Полимеразная цепная реакция (патенты США № 4683195; 4683202; 4800159; 4965188), обычно называемая ПЦР, использует множество циклов денатурации, отжига пар праймеров с комплементарной цепочкой и удлинения праймеров с экспоненциальным увеличением числа копий последовательности-мишени. В вариации, называемой КТ-ПЦР, обратная транскриптаза (КТ) используется для создания комплементарной ДНК (кДНК) на основе мРНК, и указанная кДНК затем амплифицируется с помощью ПЦР для продукции множества копий ДНК.

Как отмечено выше, термин ПЦР относится к множеству циклов амплификации, которые селективно амплифицируют намеченный вид нуклеиновой кислоты. Включены количественная ПЦР (кПЦР), ПЦР в реальном времени, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и количественная ПЦР с обратной транскрипцией (аРВ-ПЦР), хорошо описанные в данной области техники. Термин рПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции и термин кОТ-ПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. кПЦР и кОТ-ПЦР можно применять для амплификации и одновременной количественной оценки молекулы кДНК-мишени. Она обеспечивает и детектирование, и количественную оценку специфической последовательности в пуле кДНК, таком как выбранный ген или транскрипт.

ПЦР в реальном времени может использовать ДНК-связывающий краситель для связывания со всеми двухцепочечными (дц) ДНК в ПЦР, приводя к флуоресценции красителя. Увеличение количества продукта ДНК во время ПЦР, следовательно, приводит к повышению интенсивности флуоресценции и измеряется в каждом цикле, таким образом позволяя количественно оценивать концентрацию ДНК. Однако красители дцДНК, такие как 8УВК Огееи, связываются со всеми ПЦР-продуктами дцДНК. Флуоресценцию выявляют и измеряют в термоциклере для ПЦР в реальном времени и ее возрастание в геометрической прогрессии, соответствующее экспоненциальному росту количества продукта, используется для определения порогового цикла (СП) в каждой реакции.

Термин значение С! относится к значению порогового цикла, который представляет собой цикл, при котором ПЦР-амплификация превосходит пороговый уровень. Если присутствует более высокое количество мРНК для конкретного гена в образце, то она превысит порог раньше по сравнению с геном,

- 61 030461 экспрессируемым на низком уровне, из-за большего количества исходной РНК для амплификации. Таким образом, низкое значение С! указывает на высокий уровень экспрессии гена в образце, и высокое значение С! указывает на низкий уровень экспрессии гена.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения может использоваться лигазная цепная реакция (Ае1вв, 8с1спсс. 254:1292, 1991), обычно называемая ЛЦР, которая использует два набора комплементарных олигонуклеотидов ДНК, которые гибридизуются с соседними участками нуклеиновой кислоты-мишени. Олигонуклеотиды ДНК ковалентно связываются с помощью ДНК-лигазы в повторяющихся циклах термической денатурации, гибридизации и лигирования для получения поддающегося выявлению двухцепочечного лигированного олигонуклеотидного продукта.

Другой способ представляет собой амплификацию с перемещением цепи (Аа1кег, С. е! а1., 1992, Ργθο. №ιΐ1. Λсай. δα. υδΛ, 89:392-396; патенты США № 5270184 и 5455166), обычно называемую δΌΛ, которая использует циклы отжига последовательностей пар праймеров с комплементарными цепочками последовательности-мишени, удлинения праймера в присутствии йNТΡαδ для продукции дуплекса гемифосфоротиотированного продукта удлинения праймера, опосредованное эндонуклеазами внесение одноцепочечного разрыва в гемимодифицированный сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазы и опосредованное полимеразой удлинение праймера от 3'-конца одноцепочечного разрыва с перемещением существующей цепочки и созданием цепочки для следующего цикла отжига праймеров, внесения одноцепочечного разрыва и перемещения цепочки, которая приводит к амплификации продукта в геометрической прогрессии. Термофильная δΌΛ (!δΌΛ) использует термофильные эндонуклеазы и полимеразы при более высоких температурах, по существу, таким же способом (европейский патент № 0684315).

Другие способы амплификации включают, например, амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (патент США № 5130238), обычно называемую NΛδВΛ; амплификацию, которая использует РНК-репликазу для амплификации самой молекулы зонда (Ы/агйк Ρ. е! а1., 1988, ВюТесНпок 6:1197-1202), обычно называемую Οβ-репликаза; способ амплификации на основе транскрипции (КуоН, Ό. е! а1., 1989, ΡΐΌα №!1. Λсай. 8ск υδΛ, 86:1173-1177); самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Сиа!еШ, 1. е! а1., 1990, Ργόο. №ιΐ1. Λсай. 8ск υδΛ 87:1874-1878); и опосредованную транскрипцией амплификацию (патент США № 5480784 и 5399491), обычно называемую ТМА. Более подробное обсуждение известных способов амплификации можно найти в источнике Ρе^в^ηд, Όηνίά Н., 1993, Ιη νίΙΐΌ №с1ею Λαά Λтр1^йсаί^оη ТесНпкщев ίη О1адповйс Мей1са1 М1сгоЫо1оду: Ρππαр1ев апй Λрр1^саί^оηв (Гегвтд е! а1., Εάβ.), р. 51-87 ^тейса 8ос1с1у Гог М1сгоЬю1оду, АавЫпд!оп, ОС)).

Иллюстративные системы амплификации на основе транскрипции согласно настоящему изобретению включают ТМА, которая использует РНК-полимеразу для продукции множества РНК-транскриптов участка-мишени (патент США № 5480784 и 5399491). ТМА использует промотор-праймер, который гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью в присутствии обратной транскриптазы и РНКполимеразы для образования двухцепочечного промотора, из которого РНК-полимераза продуцирует РНК- транскрипты. Указанные транскрипты могут становиться матрицей для дальнейших циклов ТМА в присутствии второго праймера, способного гибридизоваться с РНК-транскриптами. В отличие от ПЦР, ЛЦР или других способов, которые требуют термической денатурации, ТМА представляет собой изотермический способ, использующий активность РНКазы Н для расщепления цепочки РНК гибрида РНК:ДНК, таким образом создавая цепочку ДНК, доступную для гибридизации с праймером или промотором-праймером. В целом, используется активность РНКазы Н вместе с обратной транскриптазой, обеспечивающей амплификацию.

В иллюстративном способе ТМА один праймер для амплификации представляет собой олигонуклеотидный промотор-праймер, который содержит последовательность промотора, которая становится функциональной, когда является двухцепочечной, расположенную со стороны 5' по отношению к связывающейся с мишенью последовательности, которая способна гибридизоваться с сайтом связывания РНКмишени в положении 3' по отношению к последовательности, которую предполагается амплифицировать. Промотор-праймер может называться Т7-праймер, когда он является специфичным для распознавания РНК-полимеразы Т7. При конкретных обстоятельствах 3'-конец промотора-праймера или субпопуляции указанных промоторов-праймеров может быть модифицирован для блокировки или уменьшения удлинения праймера. Из немодифицированного промотора-праймера обратная транскриптаза создает копию кДНК РНК-мишени, тогда как активность РНКазы Н деградирует РНК-мишень. Второй праймер для амплификации затем связывается с кДНК. Указанный праймер может называться не-Т7-праймер для отличия его от Т7-праймера. Из указанного второго праймера для амплификации обратная транскриптаза создает другую цепочку ДНК, что приводит к образованию двухцепочечной ДНК, содержащей функциональный промотор на одном конце. Когда последовательность промотора является двухцепочечной, она способна связываться с РНК-полимеразой для начала транскрипции последовательностимишени, с которой был гибридизован промотор-праймер. РНК-полимераза использует указанную последовательность промотора для продукции множества РНК-транскриптов (т. е. ампликонов), в целом, примерно от 100 до 1000 копий. Каждый новый синтезированный ампликон может гибридизоваться со вто- 62 030461 рым праймером для амплификации. Обратная транскриптаза затем может создавать копию ДНК, тогда как активность РНК-азы приводит к деградации РНК указанного дуплекса РНК: ДНК. Промотор-праймер затем может связываться с новой синтезированной ДНК, позволяя обратной транскриптазе создавать двухцепочечную ДНК, из которой РНК-полимераза продуцирует множество ампликонов. Таким образом, изотермическая амплификация в миллиард раз может достигаться с использованием двух праймеров для амплификации.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения другие методы можно применять для оценки РНК-транскриптов из транскриптов из конкретной библиотеки кДНК, включая анализ с использованием микрочипа (Нап, М., е! а1., Ыа1. Вю!есЬпо1., 19:631-635, 2001; Вао, Р., е! а1., Αηαΐ. СЬет., 74:1792-1797, 2002; ЗсЬепа е! а1., Ргос. ЫаД. Αсаб. 8ά. υδΑ, 93:10614-19, 1996 и Не11ег е! а1., Ргос. Ν!1. Αсаб. δα. υδΑ, 94:2150-55, 1997) и δΑΟΕ (серийный анализ экспрессии генов). Подобно ΜΡδδ, метод δΑΟΕ является цифровым и может производить большое количество специфической последовательности (см., например, Уе1си1екси, У.Е., е! а1., Тгепбк Сепе!, 16:423-425., 2000; Ти!е.)а Κ. апб Ти!е.)а N. В1ое88ау8. 2004 Αιι^; 26(8): 916-22), несмотря на то, что порядки величин для указанного анализа ниже по сравнению с методами, такими как ΜΡδδ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения термин микрочип включает микрочип нуклеиновых кислот, содержащий множество связанных с субстратом нуклеиновых кислот, где гибридизация с каждой из множества связанных нуклеиновых кислот отдельно поддается выявлению. Субстрат может быть твердым или пористым, плоским или неплоским, цельным или дискретным. Микрочипы нуклеиновых кислот включают все устройства, указанные в источниках δсЬепа (еб.), ΌΝΑ Мюгоаггаук: Α Ргасбса1 Αρρ^оасЬ (РгасЛса1 Αρρ^оасЬ δе^^е5), ОхГогб ищуегкЛу Ргекк (1999); №Циге Сепе!. 21(1) (кирр1.):1-60 (1999); ЗсЬепа (еб.), Мюгоаггау ВюсЫр: Тоо1к апб ТесЬпо1оду, Еа!оп РиЪЛкЫпд Сотрапу/ВюТесЫисщек Воокк Н1У1кюп (2000). Микрочипы нуклеиновых кислот могут включать множество связанных с субстратом нуклеиновых кислот, в которых множество нуклеиновых кислот расположены на множестве гранул вместо цельного плоского субстрата, как описано, например, в источнике Вгеппег е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Αсаб. δα. υδΑ 97(4): 1665-1670 (2000). Примеры микрочипов нуклеиновых кислот могут быть найдены в патентах США № 6391623, 6383754, 6383749, 6380377, 6379897, 6376191,

6372431, 6351712 6344316, 6316193, 6312906, 6309828, 6309824, 6306643, 6300063, 6287850, 6284497,

6284465, 6280954, 6262216, 6251601, 6245518, 6263287, 6251601, 6238866, 6228575, 6214587, 6203989,

6171797, 6103474, 6083726, 6054274, 6040138, 6083726, 6004755, 6001309, 5958342, 5952180, 5936731,

5843655, 5814454, 5837196, 5436327, 5412087 и 5405783, описания которых включены посредством ссылки.

Дополнительные примеры включают чипы нуклеиновых кислот, которые являются коммерчески доступными из компании ΛГГутеι^^x (Санта-Клара, Калифорния) под брендовым названием СЕ№СН1Р™. Другие типичные способы изготовления и применения чипов предложены, например, в патентах США № 7028629; 7011949; 7011945; 6936419; 6927032; 6924103; 6921642 и 6818394.

Настоящее изобретение в отношении чипов и микрочипов также предполагает различные способы применения полимеров, присоединенных к твердым субстратам. Способы применения включают мониторинг экспрессии генов, анализ уровня экспрессии, скрининг библиотек, генотипирование и диагностику. Способы мониторинга и анализа уровня экспрессии генов и способы, применимые для мониторинга и анализа уровня экспрессии генов, описаны в патентах США № 5800992, 6013449, 6020135, 6033860, 6040138, 6177248 и 6309822. Генотипирование и способы его применения описаны в патентах США № 10/442021, 10/013598 (публикация заявки на патент США № 2003/0036069) и патентах США № 5925525, 6268141, 5856092, 6267152, 6300063, 6525185, 6632611, 5858659, 6284460, 6361947, 6368799, 6673579 и 6333179. Другие способы амплификации нуклеиновых кислот, мечения и анализа, которые можно применять в комбинации со способами, раскрытыми в настоящем описании, описаны в патентах США № 5871928, 5902723, 6045996, 5541061 и 6197506.

Как очевидно специалистам в данной области техники, согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять олигонуклеотиды, такие как праймеры или зонды, для амплификации или детектирования, как описано в настоящем документе. Олигонуклеотиды определенной последовательности и химической структуры могут быть получены с помощью методов, известных специалистам в данной области техники, таких как химический или биохимический синтез и ш уЛго или ш У1уо экспрессия из молекул рекомбинантных нуклеиновых кислот, например бактериальных или вирусных векторов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотид не состоит только из хромосомной ДНК дикого типа или продуктов ее ш У1уо транскрипции.

Олигонуклеотиды или праймеры могут быть модифицированы любым образом при условии, что данная модификация является совместимой с желаемой функцией конкретного олигонуклеотида. Специалист в данной области техники может с легкостью определить, является ли данная модификация подходящей или желаемой для любого конкретного олигонуклеотида согласно настоящему изобретению. Подходящие олигонуклеотиды ΑΑΚδ описаны более подробно в другой части настоящего документа.

- 63 030461

В то время как структура и последовательность олигонуклеотидов зависит от их функции, описанной в настоящем документе, в целом, учитываются некоторые параметры. Примерами наиболее подходящих параметров является длина, температура плавления (Т_т), специфичность, комплементарность другим олигонуклеотидам в системе, содержание О/С, полипиримидиновые (Т, С) или полипуриновые (А, О) участки и 3'-концевая последовательность. Контроль указанных и других параметров представляет собой стандартный и хорошо известный аспект конструкции олигонуклеотидов, и различные компьютерные программы с легкостью доступны для скрининга большого количества потенциальных олигонуклеотидов для поиска оптимальных вариантов.

Конкретные варианты реализации изобретения, таким образом, включают способы детектирования интересующего полинуклеотида ААК8 в образце, полинуклеотида, содержащего последовательность эталонного полинуклеотида ААК8, описанного в настоящем документе, включающие а) гибридизацию образца с зондом, содержащим последовательность, комплементарную полинуклеотиду-мишени в образце, где указанный зонд специфично гибридизуется с указанным полинуклеотидом-мишенью, в условиях, при которых образуется комплекс гибридизации между указанным зондом и указанным полинуклеотидом-мишенью, или его фрагментом; и Ь) детектирование присутствия или отсутствия указанного комплекса гибридизации и, необязательно, при его наличии определение его количества. Также включены способы детектирования интересующего полинуклеотида ААК8 в образце, полинуклеотида, содержащего последовательность эталонного полинуклеотида ААК8, описанного в настоящем документе, включающие а) амплификацию полинуклеотида-мишени или его фрагмента и Ь) детектирование присутствия или отсутствия указанного амплифицированного полинуклеотида-мишени или его фрагмента, и, необязательно, при его наличии, определение его количества. Конкретные варианты реализации изобретения относятся к выявлению сплайс-вариантов ААК8, например к выявлению уникальной границы сплайсинга сплайс-варианта, путем гибридизации, амплификации или других способов детектирования.

Варианты реализации настоящего изобретения включают различные методы детектирования на основе полипептидов ААК8, включая методы детектирования на основе антител. Согласно указанным вариантам реализации изобретения включено применение полипептидов ААК8 для создания антитела или других связывающих веществ, которые затем можно использовать в диагностических способах и композициях для детектирования или количественной оценки выбранных полипептидов ААК8 в клетке или другом биологическом образце, как правило, полученном из субъекта.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять стандартные методики и детекторы, такие как вестерн-блоттинг и иммунопреципитация, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), проточная цитометрия и иммунофлуоресцентные анализы (1РА), в которых используется устройство визуализации. Указанные хорошо известные способы, как правило, используют одно или более моноклональных или поликлональных антител, как описано в настоящем документе, которые специфично связываются с выбранным полипептидом ААК8 согласно изобретению или уникальным участком указанного полипептида ААК8 и в целом значительно не связываются с другими полипептидами ААК8, такими как полноразмерный полипептид ААК8. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения уникальный участок полипептида ААК8 может представлять сбой уникальную трехмерную структуру, которую содержит новый идентифицированный белковый фрагмент ААК8.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять чипы, такие как микрочипы. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения микрочип также может относиться к пептидному микрочипу или белковому микрочипу, имеющему набор или множество связанных с субстратом полипептидов, где связывание с каждым из множества связанных полипептидов отдельно поддается выявлению. В альтернативном варианте пептидный микрочип может содержать множество связывающих веществ, включая, но не ограничиваясь перечисленными, моноклональные антитела, поликлональные антитела, связывающие вещества из фагового дисплея, связывающие вещества из дрожжевых двухгибридных систем и аптамеры, которые могут специфично выявлять связывание полипептидов ААК8, описанных в настоящем документе. Чип может быть основан на выявлении с помощью аутоантител указанных полипептидов ААК8, как описано, например, в источнике ΚοΜηκοη е( а1., №Циге Мебюше, 8(3):295-301 (2002). Примеры пептидных чипов могут быть найдены в публикациях международных заявок на патент АО 02/31463, АО 02/25288, АО 01/94946, АО 01/88162, АО 01/68671, АО 01/57259, АО 00/61806, АО 00/54046, АО 00/47774, АО 99/40434, АО 99/39210 и АО 97/42507 и патентах США № 6268210, 5766960 и 5143854, каждый из которых включен посредством ссылки.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять массспектрометрические или другие способы, основанные на определении молекулярной массы, для диагностического детектирования последовательностей полипептида ААК8. Масс-спектрометрия (МС) в целом относится к аналитическому методу определения элементарного состава образца или молекулы. МС также может использоваться для определения химических структур молекул, таких как пептиды и другие химические соединения.

В целом, масс-спектрометрия (МС) основана на ионизации химических соединений с образованием заряженных молекул или фрагментов молекул и последующем измерении отношения их массы к заряду. Согласно иллюстративному МС-методу образец наносили на прибор МС и испаряли, компоненты образ- 64 030461 ца ионизировали с помощью одного из различных способов (например, путем воздействия на них электронным лучом), которые приводят к формированию положительно заряженных частиц, положительные ионы затем ускоряются магнитным полем. Расчет отношения массы частиц к заряду (т/ζ) проводили на основе деталей перемещения ионов по мере их прохождения через электромагнитные поля, и детектирования ионов, которые не были отсортированы на предыдущем этапе в соответствии с т/ζ.

Иллюстративные МС-приборы имеют три модуля: ионный источник, который превращает газовую фазу образца молекулы в ионы (или в случае ионизации электрораспылением перемещает ионы, которые существуют в растворе, в газовую фазу); массовый анализатор, который сортирует ионы по их массе путем приложения электромагнитных полей; и детектор, который измеряет значение количества индикатора и, таким образом, обеспечивает данные для расчета относительно содержания избытка каждого присутствующего иона.

Метод МС имеет как качественное, так и количественное применения, включая идентификацию неизвестных соединений, определение изотопного состава элементов в молекуле и определение структуры соединения путем наблюдения его фрагментации. Другие применения включают количественную оценку соединения в образце или исследование основ химии ионов газовой фазы (химии ионов и нейтронов в вакууме). Включены газовая хроматография-масс-спектрометрия (СС/М8 или СС-М8), жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (БС/М8 или ЖХ/МС) и спектрометрия ионной подвижности/массспектрометрия ДМ8/М8 или ЕММ8). Соответственно, МС-методы можно применять в соответствии с любым из способов, предложенных в настоящем описании, для измерения присутствия или уровня полипептида ААК8 согласно изобретению в биологическом образце и для сравнения указанных уровней с контрольным образцом или заранее определенным значением.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять устройства/способы сортировки клеток или визуализации клеток или отображения для детектирования или количественной оценки присутствия или уровня полинуклеотидов или полипептидов ААК8. Примеры включают проточную цитометрию с активированной флюоресценцией или РАС8, иммунофлуоресцентный анализ (ЕРА) и метод ш кйи гибридизации, такой как флуоресцентная ш кйи гибридизация (Л8Н).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять стандартные биологические способы, программы и системы для диагностических целей. Продукты компьютерного программного обеспечения согласно изобретению, как правило, включают машиночитаемый носитель, содержащий выполняемые компьютером программы для проведения логических этапов способа согласно изобретению. Подходящие машиночитаемые носители включают гибкий диск, СИ-КОМ/ОУО/ОУО-КОМ, жесткий диск, флэш-память, КОМ/КАМ, магнитные ленты и т.д. Выполняемые компьютером программы могут быть написаны на подходящем компьютерном языке или комбинации нескольких языков. Основные методы вычислительной биологии описаны, например, в источниках 8е!иЬа1 ;·ιπά Ме^άаη^к е! а1., Iи!^οάисί^οи !о Сотрц1айоиа1 Вю1оду Ме!Ьοάк (РА8 РиЬйкЫид Сотраиу, Вок!ои, 1997); 8аИЬегд, 8еаг1ек, КакГ, (Εά.), Сотрц1айоиа1 МеίЬοάк т Мо1еси1аг Вю1оду, (Ε1кеν^е^, Атк!еМат, 1998); КакЬ^ά^ ;·ιπά ВиеЫег, ВюшГогтаИск Вакюк: Аррйсайои т Вю1одюа1 8теисе агД Меά^с^ие (СКС Ргекк, Ьо^ои, 2000) и Оие1е!!е аМ Вζеνаи^к ВюшГогтаИск: А Ргасйса1 &Ше Еог Аиа1уык оГ Сеие аЫ РгсЛетк (Айеу & 8оик, Шс., 2^и<1 еά., 2001). См. патент США № 6420108.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять различные компьютерные программные продукты и обеспечения для различных целей, таких как создание зонда, управление данными, анализ и работа прибора. См. патенты США № 5593839, 5795716, 5733729, 5974164, 6066454, 6090555,6185561, 6188783, 6223127, 6229911 и 6308170.

Дискретный анализ полного генома (АС8А) описан, например, в источниках Кеиηеάу е! а1., Ν!. Вю!есЬ. 21, 1233-1237 (2003), Ма!к^акЕ е! а1., Сеи. Кек. 14: 414-425, (2004), и Ма!к^акЕ, е! а1., №йиге МеίЬοάк, 1:109-111 (2004). Алгоритмы для использования в методах картирования описаны, например, в источниках Ьш е! а1., ВхохиГогшаДск. 19: 2397-2403 (2003) и Όί е! а1. ВхотГогтайск. 21:1958 (2005). Дополнительные способы, связанные с АС8А, и чипы, применимые для АС8А, и области применения АС8А описаны, например, в заявке на патент США № 60/676058, поданной 29 апреля 2005 г., 60/616273, поданной 5 октября 2004 г., 10/912445, 11/044831, 10/442021, 10/650332 и 10/463991. Полногеномные исследования связей генотипа с различными фенотипическими признаками (Сеиоте \\Ме аккоаайои кйШ1ек) с использованием методов картирования описаны, например, в источниках Ни е! а1., Саисег Кек.; 65(7):2542-6 (2005), Мйга е! а1., Саисег Кек., 64(21):8116-25 (2004), Ви!сЬег е! а1., Нит Мо1 Сеие!., 14(10):1315-25 (2005), и К1еш е! а1., 8аеисе. 308(5720):385-9 (2005).

Кроме того, конкретные варианты реализации изобретения могут включать способы предоставления генетической информации в сети, такой как интернет, как описано, например, в заявках на патент США № 10/197621, 10/063559 (публикация заявки на патент США № 2002/0183936), 10/065856, 10/065868, 10/328818, 10/328872, 10/423403 и 60/482389.

X. Антисмысловые и РНКи-агенты.

Варианты реализации настоящего изобретения также включают антисмысловые олигонуклеотиды и РНКи-агенты, которые направлены на полинуклеотидные последовательности ААК8, и способы их применения для снижения экспрессии выбранного транскрипта и/или белкового фрагмента ААК8. Конкрет- 65 030461 ные варианты реализации изобретения относятся к одной или более границам сплайсинга (часто уникальным), которые генерируют сплайс-вариант белкового фрагмента ΆΆΚδ согласно настоящему изобретению. Также включены способы ингибирования на основе антисмысловых или РНКи агентов, которые направлены на конкретные сплайс-формы, для стимуляции или подавления сплайсинга выбранного белкового фрагмента. Согласно конкретным предпочтительным вариантам реализации изобретения границы сплайсинга, которые генерируют белковые фрагменты ΆΆΚδ, экспрессируются на повышенном уровне в конкретных тканях и являются уникальными для указанного сплайс-варианта. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения указанные сплайс-варианты не только являются источником цитозольной активности ΆΆΚδ в интересующем типе клеток. Например, конкретные сплайсварианты, которые являются предполагаемой мишенью, могут составлять примерно 10-50% общего числа копий сплайс-вариантов РНК ΆΆΚδ в конкретной клетке или ткани, предпочтительно примерно 1-10% общего числа копий сплайс-варинтов РНК ΆΆΚδ в конкретной клетке или ткани. Сплайсварианты, которые составляют примерно <1% общего числа копий сплайс-вариантов РНК ΆΆΚδ в конкретной клетке или ткани, также могут являться мишенью.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые или РНКи агенты не направлены на полноразмерный белок, так как полноразмерные белки отвечают за ключевые этапы синтеза белка, что, таким образом, позволяет избежать летальности, которая часто является результатом нокаута ΆΆΚδ дикого типа. Конкретные способы, описанные в настоящем документе, таким образом, можно применять для избежания нежелательных эффектов, таких как токсичность, как при лечении хронических, так и острых заболеваний и для селективной модуляции неканонических видов активности белкового фрагмента ΆΆΚδ. Однако конкретные варианты реализации изобретения могут в общем быть направлены на последовательности ΆΆΚδ, включая полноразмерные последовательности ΆΆΚδ, например на уничтожение или существенное нарушение физиологии клетки- или ткани-мишени.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения сплайс-вариант ΆΆΚδ, являющийся предполагаемой мишенью, обладает неканонической биологической активностью. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения сплайс-вариант ΆΆΚδ имеет пониженную или не поддающуюся выявлению традиционную активность ΆΆΚδ, и связанный с использованием антисмысловых или РНКиагентов способ, в частности, модулирует его неканоническую активность. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые или РНКи-агенты могут комбинироваться с подходом направленной или местной доставки для снижения системных нежелательных эффектов в отношении клеток и тканей, не являющихся мишенью. Среди прочего, как описано в настоящем документе, типичные клетки или ткани, на которые может быть таким образом направлено действие, включают раковые клетки и клетки или ткани, на которые может быть локально направлено действие путем местного применения, такие как опухоли или эпителий.

А. Антисмысловые агенты.

Термины антисмысловой олигомер, или антисмысловое соединение, или антисмысловой олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми и относятся к последовательности циклических субъединиц, каждая из которых содержит фрагменты спаривания оснований, соединенные межсубъединичными связями, которые позволяют фрагментам спаривания оснований гибридизоваться с последовательностьюмишенью в нуклеиновой кислоте (как правило, РНК) путем спаривания оснований Уотсона-Крика, с образованием гетеродуплекса нуклеиновая кислота:олигомер в последовательности-мишени и, как правило, таким образом, предотвращением трансляции указанной РНК. Также включены способы их применения для модуляции экспрессии выбранного транскрипта ΆΆΚδ, такого как сплайс-вариант или протеолитический фрагмент, и/или его соответствующего полипептида.

Антисмысловые олигонуклеотиды могут содержать примерно 8-40 субъединиц, как правило, примерно 8-25 субъединиц и предпочтительно примерно 12-25 субъединиц. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотиды могут иметь точную комплементарность последовательности-мишени или приблизительную комплементарность, как определено ниже. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения степень комплементарности между последовательностью-мишенью и антисмысловой направленной последовательностью является достаточной для образования стабильного дуплекса. Участок комплементарности антисмысловых олигомеров с последовательностью-мишенью РНК может быть не меньше 8-11 оснований, но предпочтительно содержит 12-15 оснований или более, например 12-20 оснований или 12-25 оснований, включая все целые числа между указанными диапазонами. Антисмысловой олигомер, состоящий примерно из 14-15 оснований, в целом является достаточно длинным для того, чтобы иметь уникальную комплементарную последовательность для направленности против выбранного гена ΆΆΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения минимальная длина комплементарных оснований может требоваться для достижения требуемой Τ связывания, как обсуждается в настоящем описании.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые олигомеры длиной в 40 оснований могут являться подходящими, где, по меньшей мере, минимальное число оснований, например 10-12 оснований, являются комплементарными последовательности-мишени. В целом, однако, облегченный или активный захват в клетках оптимален при длине олигомера меньше примерно 30 основа- 66 030461 ний. Для конкретных олигомеров, дополнительно описанных ниже, оптимальный баланс связывания стабильности и захвата в целом происходит при длине в 18-25 оснований. Включены антисмысловые олигомеры (например, ПНК, ΕΝΑ, 2'-ОМе, МОЕ), которые состоят примерно из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 оснований, в которых по меньшей мере примерно 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 заменимых или незаменимых оснований являются комплементарными их последовательности-мишени ΑΑΚδ или ее вариантам.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые олигомеры могут быть на 100% комплементарными последовательности-мишени нуклеиновых кислот ΑΑΚδ или могут включать несоответствия, например, для включения вариантов при условии, что гетеродуплекс, образованный между олигомером и последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты ΑΑΚδ, является достаточно стабильным, чтобы являться устойчивым к действию клеточных нуклеаз и других способов деградации, которые могут происходить ίη νίνο. Термин последовательность-мишень относится к части РНКмишени, против которой направлен олигонуклеотид, т.е. последовательности, с которой олигонуклеотид будет гибридизоваться путем спаривания оснований комплементарной последовательности УотсонаКрика. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень может представлять собой заменимый участок мРНК ΑΑΚδ (например, уникальную границу сплайсинга мРНК ΑΑΚδ) или может состоять из незаменимых участков мРНК.

Олигомерные каркасы, которые менее чувствительны к расщеплению нуклеазами, описаны ниже. Несоответствия, в случае их присутствия, являются менее дестабилизирующими в направлении концевых участков гибридного дуплекса по сравнению со средней частью. Количество разрешенных несоответствий будет зависеть от длины олигомера, процента пар оснований С:С в дуплексе и положения несоответствия (несоответствий) в дуплексе, в соответствии с хорошо известными правилами стабильности дуплекса. Несмотря на то что указанный антисмысловой олигомер необязательно является на 100% комплементарным последовательности-мишени нуклеиновой кислоты ΑΑΚδ, он является эффективным для того, чтобы стабильно и специфично связываться с последовательностью-мишенью, приводя, таким образом, к модулированию биологической активности нуклеиновой кислоты-мишени, например экспрессии белка (белков) ΑΑΚδ.

Стабильность дуплекса, образованного между олигомером и последовательностью-мишенью, представляет собой функцию Т_т связывания и чувствительности дуплекса к клеточному ферментативному расщеплению. Тт антисмыслового олигонуклеотида для комплементарной последовательности РНК можно измерять с помощью общепринятых способов, таких как способы, описанные в Нате8 е! а1., ШсЫс Α^ НуЬг1б1/абоп, ΙΚΣ Рге88, 1985, р. 107-108 или в М1уаба С.С. апб \Уа11асе Κ.Β., 1987, Ο1^дοηис1еοί^бе ЬуЬпб1/а1юп !есЬтдие8, Ме!Ьоб8 Еп/уто1. Уо1. 154 р. 94-107. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые олигомеры могут иметь Т_т связывания для комплементарной последовательности РНК больше температуры тела, предпочтительно больше 50°С. Т_т в диапазоне 60-80°С или более является предпочтительной. В соответствии с хорошо известными принципами Т_т олигомерного соединения для основанного на комплементарности РНК-гибрида может быть повышена путем повышения отношения пар оснований С:С в дуплексе и/или путем повышения длины (в парах оснований) гетеродуплекса. В то же время в целях оптимизации клеточного поглощения может являться предпочтительным ограничивать размер антисмыслового олигомера. По указанной причине соединения, которые имеют высокую Т_т (50°С или более) при длине 25 оснований или менее, являются в целом предпочтительными по сравнению с теми, которые требуют более чем 25 оснований для высоких значений Тт.

Могут быть сконструированы антисмысловые олигомеры для блокировки или подавления трансляции мРНК или для подавления сплайс-процессинга природной пре-мРНК или индукции деградации мРНК-мишеней и могут называться направленными на или нацеленными против последовательности-мишени, с которой они гибридизуются. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень может включать любую кодирующую или некодирующую последовательность мРНК транскрипта ΑΑΚδ и может, таким образом, находиться внутри экзона или внутри интрона. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень является относительно уникальной или исключительной среди последовательностей ΑΑΚδ (например, полноразмерной ΑΑΚδ) и является селективной в отношении уменьшения экспрессии выбранного белкового фрагмента ΑΑΚδ, такого как протеолитический фрагмент или сплайс-вариант. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения сайт-мишень включает 3'- или 5'-сайт сплайсинга препроцессированной мРНК или точку ветвления. Последовательность-мишень для сайта сплайсинга может включать мРНК последовательность, имеющую на 5'-конце от 1 до примерно 25, до примерно 50 пар оснований после акцепторного соединения сплайсинга или перед донорным соединением сплайсинга в препроцессированной мРНК. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень может включать границу сплайсинга альтернативно сплайсированной мРНК ΑΑΚδ, такую как граница сплайсинга, которая не встречается в полноразмерной ΑΑΚδ или является уникальной или исключительной для указанного транскрипта, в котором она либо не встречается, либо только редко встречается в других

- 67 030461 сплайс-вариантах ААК§. Олигомер более обобщенно называется нацеленным против биологически подходящей мишени, такой как эталонный полинуклеотид ААК§, когда он нацелен против нуклеиновой кислоты-мишени таким образом, как описано в настоящем документе.

Олигонуклеотид, как правило, является комплементарным последовательности-мишени, такой как ДНК- или РНК-мишень. Термины комплементарный и комплементарность относятся к полинуклеотидам (т.е. последовательностям нуклеотидов), соединенным по правилам спаривания оснований. Например, последовательность А-О-Т является комплементарной последовательности Т-С-А. Комплементарность может быть частичной, когда только некоторые из оснований нуклеиновой кислоты не соответствуют согласно правилами спаривания оснований. Или же указанные последовательности нуклеиновых кислот могут иметь идеальную или полную комплементарность (100%). Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительное влияние на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Тогда как идеальная комплементарность часто является желательной, некоторые варианты реализации изобретения могут включать один или более, но предпочтительно 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 несоответствий в отношении последовательности-мишени. Включены вариации в любом положении олигомера. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариации последовательности вблизи конца олигомера в целом являются предпочтительными по сравнению с вариациями в начале последовательности и при их наличии, как правило, составляют в пределах примерно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотида со стороны 5'- и/или 3'-конца.

Термин направленная (нацеленная) последовательность или согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловая направленная последовательность относится к последовательности в олигонуклеотиде, которая является комплементарной (что означает, кроме того, по существу, комплементарной) последовательности-мишени в молекуле-мишени ДНК или РНК. Целая последовательность или только часть антисмыслового соединения может быть комплементарной последовательностимишени. Например, в олигонуклеотиде, содержащем 20-30 оснований, примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 оснований могут составлять направленные последовательности, которые являются комплементарными области-мишени. Как правило, направленная последовательность образована из заменимых оснований, но в альтернативном варианте может быть образована из незаменимых последовательностей, которые при объединении, например, из противоположных концов олигонуклеотида составляют последовательность, которая захватывает последовательностьмишень.

Последовательность-мишень и направленная последовательность описаны как комплементарные друг другу при гибридизации в антипараллельной конфигурации. Направленная последовательность может иметь приблизительную или значительную комплементарность последовательности-мишени, но все еще функционировать в целях настоящего изобретения, т.е. она может все еще являться функционально комплементарной. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотид может иметь не более одного несоответствия с последовательностью-мишенью из 10 нуклеотидов, предпочтительно не больше одного несоответствия из 20. В альтернативном варианте олигонуклеотид может являться по меньшей мере примерно на 80, 85, 90% гомологичным последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичным последовательности эталонного полинуклеотида ААК§, описанного в настоящем документе, или его комплемента.

Олигонуклеотид специфично гибридизуется с интересующим полинуклеотидом, если олигомер гибридизуется с намеченным (например, эталонным полинуклеотидом ААК§ или его комплементом) в физиологических условиях, при этом Т_т составляет, по существу, больше 45°С, предпочтительно по меньшей мере 50°С и, как правило, 60-80°С или больше. Указанная гибридизация предпочтительно соответствует строгим условиям гибридизации. При конкретной ионной силе и рН Т_т представляет собой температуру, при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с комплементарным полинуклеотидом. Опять же, указанная гибридизация может происходить с приблизительной или значительной комплементарностью антисмыслового олигомера последовательности-мишени, так же как и с точной комплементарностью.

Термины специфично связывается или специфично гибридизуется, в целом, относятся к олигонуклеотидному зонду или полинуклеотидной последовательности, которая не только связывается с ее предполагаемой последовательностью-мишенью гена в образце при выбранных условиях гибридизации, но и не связывается значительно с другими последовательностями-мишенями в образце и, таким образом, отличает ее предполагаемую мишень от всех других мишеней в пуле-мишени. Зонд, который специфично гибридизуется с его предполагаемой последовательностью-мишенью, может также выявлять различия в концентрации при выбранных условиях гибридизации, описанных в настоящем документе.

Устойчивая к действию нуклеаз олигомерная молекула (олигомер) относится к молекуле, скелет которой является, по существу, устойчивым к расщеплению нуклеазами, в негибридизованной или гибридизованной форме; общими внеклеточными и внутриклеточными нуклеазами в теле организма; т.е. олигомер мало поддается или не поддается расщеплению при нормальных условиях нуклеазами в теле организма, действию которых подвергается указанный олигомер.

- 68 030461

Гетеродуплекс относится к дуплексу между олигонуклеотидом и комплементарной частью интересующего полинуклеотида, такого как ДНК- или РНК-мишень. Устойчивый к действию нуклеаз гетеродуплекс относится к гетеродуплексу, образованному путем связывания олигомера с комплементарной ему мишенью, таким образом, что указанный гетеродуплекс, по существу, является устойчивым к деградации ш У1уо внутриклеточными и внеклеточными нуклеазами, такими как РНКазаН, которая способна разрезать двухцепочечные комплексы РНК/РНК или РНК/ДНК.

Субъединица олигонуклеотида относится к одной единице нуклеотида (или аналога нуклеотида). Термин может относиться к нуклеотидной единице, содержащей или не содержащей присоединенную межсубъединичную связь, несмотря на то, что при ссылке на заряженную субъединицу, заряд, как правило, принадлежит межсубъединичной связи (например, фосфатной или фосфоротиоатной связи или катионной связи).

Циклические субъединицы олигонуклеотидов могут представлять собой группы на основе рибозы или другого пентозного сахара или согласно конкретным вариантам реализации изобретения альтернативные или модифицированные группы. Примеры модифицированных олигонуклеотидных скелетов включают, но не ограничиваются перечисленными, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, 2'-5'-связанные их аналоги и группы, которые имеют противоположную ориентацию, где смежные пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Также рассматриваются пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), запертые нуклеиновые кислоты (^NА), 2'-О-метилолигонуклеотиды (2'-ОМе), 2'-метоксиэтоксиолигонуклеотиды (МОЕ), среди других олигонуклеотидов, известных в данной области техники.

Пуриновый или пиримидиновый фрагмент спаривания оснований, как правило, представляет собой аденин, цитозин, гуанин, урацил, тимин или инозин. Также включены основания, такие как пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенил, псевдоурацил, 2,4,6-триметилэтоксибензол, 3-метилурацил, дигидроуридин, нафтил, аминофенил, 5-алкилцитидины (например, 5-метилцитидин), 5-алкилуридины (например, риботимидин), 5-галоуридин (например, 5-бромуридин) или 6-азапиримидины или 6-алкилпиримидины (например, 6-метилуридин), пропин, квеозин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, вибутозин, вибутоксозин, 4-ацетилтидин, 5-(карбоксигидроксиметил)уридин, 5'-карбоксиметиламинометил-2тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилуридин, β-Ό-галактозилквеозин, 1-метиладенозин,

1-метилинозин, 2,2-диметилгуанозин, 3-метилцитидин, 2-метиладенозин, 2-метилгуанозин, ^-метиладенозин, 7-метилгуанозин, 5-метоксиаминометил-2-тиоуридин, 5-метиламинометилуридин, 5-метилкарбонилметилкарбонилметилуридин, 5-метилоксиуридин, 5-метил-2-тиоуридин, 2-метилтио^-изопентениладенозин, β-Ό-маннозилквеозин, уридин-5-оксиуксусную кислоту, 2-тиоцитидин, треониновые производные и т.д. (Вигдш е! а1., 1996, ВюсЬешЩгу, 35, 14090; ИЬ1тап & Реутап, выше). Под термином модифицированные основания в указанном аспекте подразумевается нуклеотидное основание, отличное от аденина (А), гуанина (О), цитозина (С), тимина (Т) и урацила (И), как показано выше; указанные основания можно применять в любом положении в антисмысловой молекуле. Специалистам в данной области техники очевидно, что в зависимости от применения олигомера Тк и Ик являются взаимозаменяемыми. Например, в случае других антисмысловых химических соединений, таких как 2'-О-метильные антисмысловые олигонуклеотиды, которые являются более подобными РНК, Т основание может обозначаться как и.

Как отмечено выше, конкретные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем описании, включают пептидонуклеиновые кислоты (ПНК). Пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) представляют собой аналоги ДНК, в которых скелет является структурно гомоморфным скелету дезоксирибозы, состоящие из ^(2-аминоэтил)глициновых единиц, к которым присоединены пиримидиновые или пуриновые основания. ПНК, содержащие природный пиримидиновые и пуриновые основания, гибридизуются с комплементарными олигонуклеотидами, удовлетворяя правилам спаривания оснований Уотсона-Крика и имитируют ДНК с точки зрения распознавания пар оснований (ЕдЬо1т, ВисЬагб! е! а1. 1993). Скелет ПНК образован пептидными связями вместо фосфодиэфирных связей, что делает их походящими для применения в качестве антисмысловых агентов (см. структуру ниже). Скелет является незаряженным, что приводит к получению дуплексов ПНК/ДНК или ПНК/РНК, которые обладают большей термальной стабильностью по сравнению с нормой. ПНК не распознаются нуклеазами или протеазами.

ПНК могут быть получены синтетическим путем с использованием любого метода, известного в данной области техники. ПНК представляет собой аналог ДНК, в котором полиамидный скелет замещает традиционное фосфатно-рибозное кольцо ДНК. Несмотря на радикальные структурные изменения природной структуры, ПНК способна к последовательность-специфическому связыванию с ДНК в спиральной форме или РНК. Характеристики ПНК включают высокую аффинность связывания с комплементарными ДНК или РНК, дестабилизирующий эффект, вызванный несоответствием одного основания, ус- 69 030461 тойчивость к нуклеазам и протеазам, гибридизацию с ДНК или РНК, независимо от концентрации соли, и формирование триплекса с гомопуриновой ДНК. Раш^е^™ разработали их собственные Βΐκ ПНК мономеры (В1к; бензотиазол-2-сульфонильная группа) и запатентованный способ олигомеризации. Олигомеризация ПНК с использованием Βΐκ-ПНК мономеров состоит из повторяющихся циклов удаления защитной группы, сочетания и кэпирования. Патенты компании Раηадеηе™, относящиеся к указанной технологии, включают патенты США № 6969766, 7211668, 7022851, 7125994, 7145006 и 7179896. Примеры патентов США, в которых описаны способы получения ПНК-соединений, включают, но не ограничиваются перечисленными, патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Дополнительное описание ПНК-соединений можно найти в №е1кеи с1 а1., 8с1Спсс, 1991, 254, 1497.

Также включены субъединицы запертых нуклеиновых кислот (ΣΝΑ). Структуры ЬЫА известны в данной области техники, например Жеидек с1 а1., Сйет1са1 Ο'οιηιηιιηιο;ιΐίοη$ (1998), 455; Теΐ^айеά^οη (1998), 54, 3607 и Ас^итк ο£ Сйет. Кекеагсй (1999), 32, 301); ОЫка. с1 а1., ТеРайс^)! Ьейегк (1997), 38, 8735; (1998), 39, 5401 и Вюсгдатс Мейюша1 Сйет15йу (2008), 16, 9230.

Олигонуклеотиды могут включать одну или более ЬЫА; в некоторых случаях соединения могут быть полностью составлены из ЬЫА. Способы синтеза отдельных нуклеозидных субъединиц ЬЫА и их включения в олигонуклеотиды известны в данной области техники: патенты США № 7572582; 7569575; 7084125; 7060809; 7053207; 7034133; 6794499 и 6670461. Типичные межсубъединичные линкеры включают сложные фосфодиэфирные и фосфоротиоатные фрагменты. В альтернативном варианте можно применять не содержащие фосфор линкеры. Предпочтительный вариант реализации изобретения представляет собой ЙКА-содержащее соединение, где каждая субъединица ЬЫА отделена субъединицей ДНК (т.е. нуклеотидом дезоксирибозы). Другие предпочтительные соединения состоят из чередующихся ЬЫА и ДНК субъединиц, где межсубъединичный линкер представляет собой фосфоротиоат.

Конкретные олигонуклеотиды могут содержать морфолиновые субъединицы, содержащие фрагменты спаривания оснований, соединенные не заряженными или по существу не заряженными связями. Термины морфолиновый олигомер или РМО (фосфорамидат- или фосфородиамидатморфолиновый олигомер) относятся к аналогу олигонуклеотида, состоящему из структур морфолиновых субъединиц, где (ί) указанные структуры связаны вместе с помощью фосфорсодержащих связей длиной от одного до трех атомов, предпочтительно два атома в длину и предпочтительно незаряженными или катионными, соединяющими атом азота морфолиновой группы одной субъединицы с 5' экзоциклическим атомом углерода соседней субъединицы; и (ίί) каждое морфолиновое кольцо содержит пурин, или пиримидин, или эквивалентный фрагмент спаривания оснований, эффективный для связывания с помощью специфических для оснований водородных связей, с основаниями в полинуклеотиде.

Указанные связи могут быть модифицированы, при условии, что они не препятствуют связыванию или активности. Например, кислород, присоединенный к фосфору, может содержать в качестве заместителя серу (тиофосфородиамидат). 5'-кислород может содержать в качестве заместителя амино или амино, содержащий в качестве заместителя низший алкил. Азот боковой цепи, присоединенный к фосфору, может являться незамещенным, монозамещенным или дизамещенным (необязательно замещенным) низшим алкилом. Фрагмент, спариваемый с пуриновым или пиримидиновым основанием, как правило, представляет собой аденин, цитозин, гуанин, урацил, тимин или инозин. Синтез, структуры и характеристики связывания морфолиновых олигомеров подробно описаны в патентах США № 5698685, 5217866, 5142047, 5034506, 5166315, 5521063 и 5506337 и заявке на патент РСТ РСТ/и807/11435 (катионные связи) и патенте США № 08/012804 (улучшенный синтез), все из которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Морфолиновые субъединицы также могут быть связаны с помощью межсубъединичных связей не на основе фосфора, как дополнительно описано ниже, где по меньшей мере одна связь является модифицированной катионной группой боковой цепи, как описано выше. Можно применять другие связи олигонуклеотидных аналогов, которые являются незаряженными в своем немодифицированном состоянии, но которые могут также содержать аминный заместитель группы боковой цепи. Например, 5'-атом азота на морфолиновом кольце может использоваться в сульфамидной связи или мочевинной связи (где фосфор замещен атомом углерода или серы, соответственно) и модифицированные аналогичным 5'-атому азота в структуре (Ъ3) образом, выше.

Конкретные варианты реализации изобретения включают, по существу, незаряженные морфолиновые олигомеры, такие как, по существу, незаряженный фосфородиамидат-связанный морфолиновый олигомер. По существу, незаряженный, содержащий фосфор скелет в аналоге олигонуклеотида представляет собой скелет, в котором большинство субъединичных связей, например между 50-100%, как правило, по меньшей мере 60-100%, или 75%, или 80% его связей, являются незаряженными при физиологических значениях рН и содержат один атом фосфора. Примеры морфолиновых олигонуклеотидов, имеющих фосфорсодержащие связи скелета, включают фосфороамидат- и фосфородиамидат-связанные морфолиновые олигонуклеотиды.

- 70 030461

Конкретные варианты реализации изобретения могут включать положительно заряженные группы, предпочтительно примерно в 10-50% связей их скелета.

Свойства субъединиц, обусловленные присутствием морфолино-, включают, например, способность быть связанными в олигомерной форме с помощью стабильных, незаряженных или положительно заряженных связей скелета, способность поддерживать нуклеотидное основание (например, аденин, цитозин, гуанин, тимидин, урацил и гипоксантин) таким образом, что образующийся полимер может гибридизоваться с комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью, включая РНК-мишень, значения Τ_η выше примерно 45°’ в относительно коротких олигонуклеотидах (например, 10-15 оснований), способность олигонуклеотида активно или пассивно транспортироваться в клетки млекопитающих и способность гетеродуплекса антисмысловой олигонуклеотид:РНК быть устойчивым к деградации РНКазами и РНКазойН соответственно.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, по существу, незаряженный олигонуклеотид может быть модифицирован для включения заряженных связей, например, вплоть до примерно 1 на каждую 2-5 незаряженных связей, например примерно 4-5 на каждые 10 незаряженных связей. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения оптимальное улучшение антисмысловой активности может наблюдаться, когда примерно 25% связей скелета являются катионными. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения усиление может наблюдаться при малом количестве, например 1020%, катионных связей или где число катионных связей находится в диапазоне 50-80%, например примерно 60%. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения катионные заряды скелета могут быть дополнительно усилены путем распределения объема зарядов вблизи связей центральной области скелета антисмыслового олигонуклеотида, например в 20-мерном олигонуклеотиде с 8 катионными связями скелета, по меньшей мере 70% указанных заряженных связей которого расположены в 10 наиболее центральных связях.

Олигонуклеотиды, которые направлены на одну или более частей полинуклеотида эталонной последовательности ΑΑΚδ или ее комплемента, можно применять в любых терапевтических, диагностических способах или способах скрининга лекарственных средств, описанных в настоящем документе и очевидных специалистам в данной области техники.

В. Агенты РНК-интерференции.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к агентам на основе интерферирующей РНК (РНКи), которые направлены на один или более мРНК транскриптов эталонного полинуклеотида аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑ^δ), включая его фрагменты и сплайс-варианты. Также включены способы их применения для модуляции уровня выбранного транскрипта ΑΑ^δ, такого как сплайс-вариант ΑΑΚδ или эндогенный протеолитический фрагмент.

Термин двухцепочечный обозначает две отдельные цепочки нуклеиновых кислот, содержащие участок, в котором по меньшей мере часть цепочек являются достаточно комплементарными для образования водородных связей и формирования дуплексной структуры. Термин дуплекс или дуплексная структура относится к участку двухцепочечной молекулы, где две отдельные цепочки являются, по существу, комплементарными и, таким образом, гибридизуются друг с другом. дцРНК относится к молекуле рибонуклеиновой кислоты, имеющей дуплексную структуру, содержащей две комплементарные и антипараллельные цепочки нуклеиновых кислот (т.е. смысловая и антисмысловая цепочки). Не все нуклеотиды дцРНК должны иметь пары оснований Уотсона-Крика; две цепи РНК могут являться, по существу, комплементарными. Цепи РНК могут иметь одинаковое или разное число нуклеотидов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения дцРНК представляет собой или включает участок, который является, по меньшей мере частично, комплементарным РНК-мишени. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения дцРНК является полностью комплементарной РНК-мишени. Нет необходимости в идеальной комплементарности между дцРНК и мишенью, но соответствие должно быть достаточным для возможности дцРНК или продукта ее расщепления направлять специфический сайленсинг последовательности, например РНКи-расщепление РНК-мишени. Комплементарность или степень гомологии с цепью-мишенью, как правило, является наиболее критичной в антисмысловой цепи. Тогда как идеальная комплементарность, в частности, в антисмысловой цепи часто является желательной, некоторые варианты реализации изобретения могут включать одно или более, но предпочтительно 6, 5, 4, 3, 2 или менее несоответствий относительно РНК-мишени. Несоответствия наиболее допустимы в концевых участках и при наличии предпочтительно находятся в концевом участке или участках, например, в пределах 6, 5, 4 или 3 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца. Смысловая цепочка должна быть только, по существу, комплементарной с антисмысловой цепью для поддержания общей двухцепочечности молекулы.

В настоящем описании модифицированная дцРНК относится к молекуле дцРНК, которая содержит по меньшей мере одно изменение, которое делает ее более устойчивой к действию нуклеаз (например, протеинкиназ) по сравнению с идентичной молекулой дцРНК, которая распознает эту же РНКмишень. Модифицированные дцРНК могут содержать одноцепочечный нуклеотидный липкий конец и/или по меньшей мере один замещенный нуклеотид.

- 71 030461

В настоящем описании нуклеотидный липкий конец относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выступают за пределы дуплексной структуры, когда 3'-конец цепи РНК выходит за пределы 5'-конца другой комплементарной цепи, или наоборот. Тупой или тупой конец означает отсутствие неспаренных нуклеотидов на указанном конце дцРНК, т.е. отсутствие нуклеотидного липкого конца. дцРНК с тупыми концами представляет собой дцРНК, которая является двухцепочечной по всей длине, т.е. не имеет нуклеотидного липкого конца ни на одном конце молекулы.

Термин концевая пара оснований в настоящем описании относится к последней паре оснований нуклеотидов на одном конце дуплексного участка двухцепочечной молекулы. Например, если дцРНК или другая молекула представляет собой молекулу с тупыми концами (т.е. не имеет нуклеотидных липких концов), последние пары оснований нуклеотидов на обоих концах молекулы представляют собой концевые пары оснований. Когда дцРНК или другая молекула имеет нуклеотидный липкий конец на одном, или на обоих, концах дуплексной структуры, последняя пара (пары) оснований нуклеотидов, непосредственно прилегающая к нуклеотидному липкому концу (концам), представляет собой концевую пару оснований на указанном конце (концах) молекулы.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения способы, предложенные в настоящем описании, могут использовать двухцепочечную молекулу рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) в качестве модулирующего агента, для уменьшения экспрессии транскрипта ААК8, такого как выбранный фрагмент или сплайс-вариант. дцРНК, в целом, включает две отдельные цепочки. Одна цепочка дцРНК содержит нуклеотидную последовательность, которая является по существу идентичной части генамишени или участка-мишени (смысловая цепочка), и другая цепочка (комплементарная или антисмысловая цепочка) содержит последовательность, которая является, по существу, комплементарной части участка-мишени. Цепочки являются достаточно комплементарными для гибридизации с образованием дуплексной структуры. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения комплементарная цепочка РНК может иметь длину менее 30 нуклеотидов, менее чем 25 нуклеотидов или даже от 19 до 24 нуклеотидов. Согласно конкретным аспектам изобретения комплементарная нуклеотидная последовательность может иметь длину 20-23 нуклеотидов или 22 нуклеотида.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения по меньшей мере одна из цепочек РНК содержит нуклеотидный липкий конец, длина которого составляет от 1 до 4 нуклеотидов. Согласно другим вариантам реализации изобретения дцРНК также может содержать по меньшей мере один химически модифицированный нуклеотид. Согласно конкретным аспектам изобретения дцРНК, содержащая одноцепочечный липкий конец, состоящий из 1-4 нуклеотидов, может включать молекулу, где неспаренный нуклеотид одноцепочечного липкого конца, который непосредственно прилегает к концевой нуклеотидной паре, содержит пуриновое основание. Согласно другим аспектам последние комплементарные нуклеотидные пары на обоих концах дцРНК представляют собой пары О-С или по меньшей мере две из последних четырех концевых пар нуклеотидов представляют собой пары О-С.

Конкретные варианты реализации настоящего изобретения могут включать микроРНК. МикроРНК представляют собой большую группу малых РНК, продуцирующихся в естественных условиях в организмах, некоторые из которых регулируют экспрессию генов-мишеней. МикроРНК образуются из одноцепочечного транскрипта-предшественника, содержащего шпильки, состоящего примерно из 70 нуклеотидов, с помощью Э|сег. (V. АтЬгок е! а1. Сиггеп! Вю1оду 13:807, 2003). Конкретные микроРНК могут транскрибироваться как предшественники РНК, содержащие шпильки, которые затем подвергаются процессингу с помощью фермента Эюег с образованием их зрелых форм.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения также можно применять малые интерферирующие РНК (миРНК). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения первая цепочка двухцепочечного олигонуклеотида содержит на два нуклеозидных остатка больше по сравнению со второй цепочкой. Согласно другим вариантам реализации изобретения первая цепочка и вторая цепочка имеют одинаковое количество нуклеозидов; однако первая и вторая цепочки могут быть смещены таким образом, что два концевых нуклеозида на первой и второй цепочках не являются спаренными с остатком на комплементарной цепочке. В конкретных примерах два нуклеозида, которые не являются спаренными, представляют собой остатки тимидина.

Также включены короткие РНК, содержащие шпильки (8ЙРНК), и микроРНК (т1РНК). Двухцепочечная структура 8ЙРНК образована одной самокомплементарной цепочкой РНК, и образование дуплекса РНК может инициироваться либо внутри, либо снаружи клетки. МикроРНК (пнРНК) представляют собой малые некодирующие РНК, состоящие из 20-22 нуклеотидов, как правило, вырезанных самогибридизующихся структур предшественника РНК, состоящих из ~70 нуклеотидов и известных как препиРНК.

В примерах, когда модулирующий агент содержит миРНК, указанный агент должен включать участок достаточной гомологии с участком-мишенью и иметь достаточную длину в пересчете на нуклеотиды таким образом, что миРНК-агент или его фрагмент могут опосредовать подавление РНК-мишени. Необходимо понимать, что термин рибонуклеотид или нуклеотид может также относиться, в случае модифицированных РНК или имитатора нуклеотида, к модифицированному нуклеотиду или фрагменту замещения имитатором в одном или более положениях. Таким образом, миРНК-агент представляет со- 72 030461 бой или включает участок. который является. по меньшей мере частично. комплементарным РНКмишени. как описано в настоящем документе.

Кроме того. модулирующий миРНК-агент может быть модифицирован или включать имитаторы нуклеозидов.

Одноцепочечные участки миРНК-агента могут быть модифицированы или включать имитаторы нуклеозидов. например неспаренный участок или участки структуры шпильки. например участок. который связывает два комплементарных участка. может иметь модификации или содержать имитаторы нуклеозидов. Также применимы модификации для стабилизации одного или более 3'- или 5'-концов миРНК-агента. например. против действия экзонуклеаз или для облегчения входа антисмыслового миРНК-агента в К18С. Модификации могут включать С3 (или С6. С7. С12) аминолинкеры. тиоловые линкеры. карбоксильные линкеры. не нуклеотидные спейсеры (С3. С6. С9. С12. без основания. триэтиленгликолиевые. гексаэтиленгликолиевые). специальные биотиновые или флуоресцеиновые реагенты. которые становятся фосфорамидитами и которые содержат другую ОМТ-защищенную гидроксильную группу. позволяя множественные сочетания во время синтеза РНК.

миРНК агенты могут включать. например. молекулы. которые являются достаточно длинными для возбуждения ответа интерферона (которые могут расщепляться Эюег (Вегпк!е1п е! а1. 2001. №Циге. 409:363-366) и которые могут входить в К18С (РНКи-индуцированный комплекс сайлансинга)). кроме молекул. которые являются достаточно короткими и не возбуждают ответ интерферона (которые также могут расщепляться Окег и/или входить в К18С). например молекулы. которые имеют размер. позволяющий им входить в К18С. например молекулы. которые похожи на продукты расщепления Э|сег. Модулирующие миРНК-агенты или продукты их расщепления могут подавлять ген-мишень. например. путем индуцирования РНКи в отношении РНК-мишени. предпочтительно ААК8-мишени. такой как выбранный сплайс-вариант.

Каждая цепочка миРНК-агента может быть равна или составлять менее 35. 30. 25. 24. 23. 22. 21. 20. 19. 18. 17. 16 или 15 нуклеотидов в длину. Длина цепочки предпочтительно составляет по меньшей мере 19 нуклеотидов. Например. длина каждой цепочки может составлять 21-25 нуклеотидов. Предпочтительные миРНК-агенты имеют дуплексный участок. состоящий из 17. 18. 19. 29. 21. 22. 23. 24 или 25 пар нуклеотидов и один или более липких концов. предпочтительно один или два 3'-липких конца. состоящих из 2-3 нуклеотидов.

Помимо гомологии РНК-мишени и способности подавлять ген-мишень. миРНК-агент может обладать одним или более из следующих свойств: он может. несмотря на модификации даже очень большого числа или всех нуклеозидов. содержать антисмысловую цепочку. которая может предоставлять основания (или модифицированные основания) с подходящим трехмерным каркасом таким образом. что она способна формировать правильное спаривание оснований и образовывать дуплексную структуру с гомологичной РНК-мишенью. которая является достаточной для того. чтобы обеспечить подавление мишени. например. путем расщепления РНК-мишени; он может. несмотря на модификации. даже очень большого числа или всех нуклеозидов. все еще обладать РНК-подобными свойствами. т.е. он может обладать всеми структурными. химическими и физическими свойствами. присущими молекуле РНК. несмотря на то. что он состоит не только из или даже только частично состоит из рибонуклеотидов. Например. миРНК-агент может содержать. например. смысловую и/или антисмысловую цепочку. в которой все сахара нуклеотидов содержат. например. 2'-фтор вместо 2'-гидроксила. Указанный дезоксирибонуклеотидсодержащий агент все еще может быть способен проявлять РНК-подобные свойства. Без ограничения конкретной теорией. электроотрицательный фтор предпочтительно имеет аксиальную ориентацию при присоединении к положению С2' рибозы. Указанное пространственное предпочтение фтора. в свою очередь. может заставлять сахар образовывать С3'-концевой излом плоскости углеводного кольца. Это такой же тип излома. который наблюдается в молекулах РНК и дает начало характерному для РНК типу спирали семейства А. Кроме того. так как фтор представляет собой хороший акцептор водородной связи. он может принимать участие в таких же взаимодействиях водородного связывания с молекулами воды. которые. как известно. стабилизируют структуры РНК. В целом. является предпочтительным. что модифицированный фрагмент в положении 2' сахара является способным участвовать в Н-связывании. которое является более характерным для ОН-фрагмента рибонуклеотида. чем для Н-фрагмента дезоксирибонуклеотида.

Одноцепочечный РНКи-агент в настоящем описании представляет собой РНКи-агент. который состоит из одноцепочечной молекулы. Он может включать дуплексный участок. образованный путем внутрицепочечного спаривания. например. он может представлять собой или включать структуру шпильки или ручки сковороды. Одноцепочечные РНКи модулирующие агенты предпочтительно являются антисмысловыми по отношению к молекуле-мишени. Одноцепочечный РНКи-агент должен быть достаточно длинным для того. чтобы он мог входить в К18С и принимать участие в К18Сопосредованном расщеплении мРНК-мишени. Длина одноцепочечного РНКи агента составляет по меньшей мере 14. более предпочтительно по меньшей мере 15. 20. 25. 29. 35. 40 или 50 нуклеотидов. Его длина предпочтительно составляет менее чем 200. 100 или 60 нуклеотидов.

- 73 030461

Модулирующие РНКи-агенты. содержащие шпильки. могут иметь дуплексный участок. который равен или по меньшей мере составляет 17. 18. 19. 29. 21. 22. 23. 24 или 25 нуклеотидных пар. Дуплексный участок может предпочтительно быть равным или составлять менее чем 200. 100 или 50 в длину. Конкретные диапазоны длины дуплексного участка составляют 15-30. 17-23. 19-23 и 19-21 нуклеотидных пар. Шпилька может иметь одноцепочечный липкий конец или концевой неспаренный участок. предпочтительно 3' и предпочтительно на антисмысловой стороне шпильки. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения липкие концы составляют 2-3 нуклеотида в длину.

Конкретные модулирующие агенты. используемые в соответствии со способами. предложенными в настоящем документе. могут включать РНКи-олигонуклеотиды. такие как гибридные олигонуклеотиды или химеры. которые содержат два или более химически отдельных участка. каждый из которых состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы. т. е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Указанные олигонуклеотиды. как правило. содержат по меньшей мере один участок. модифицированный таким образом. что обеспечивает повышенную устойчивость к деградации указанного олигонуклеотида под действием нуклеаз. повышение клеточного поглощения и/или повышение аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Таким образом. сравнимые результаты часто могут быть получены при использовании более коротких олигонуклеотидов. когда используются гибридные олигонуклеотиды по сравнению с фосфоротиоатными олигодезоксинуклеотидами. Гибридные олигонуклеотиды могут быть образованы как составные структуры из двух или более олигонуклеотидов. модифицированных олигонуклеотидов. олигонуклеотидов и/или миметиков олигонуклеотидов. описанных выше. Указанные олигонуклеотиды также называются в данной области техники гибридами или гапмерами. Примеры патентов США. в которых описаны способы получения таких гибридных структур. включают. но не ограничиваются перечисленными. патенты США № 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; 5700922 и 5955589. каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения гибридный олигонуклеотид представляет собой РНК-ДНК. ДНК-РНК. РНК-ДНК-РНК. ДНКРНК-ДНК или РНК-ДНК-РНК-ДНК. где длина указанного олигонуклеотида составляет между 5 и 60 нуклеотидами.

Согласно одному аспекту согласно изобретению РНКи-агенты относятся к олигонуклеотиду. содержащему по меньшей мере один лиганд. связанный с измененным или неприродным нуклеотидным основанием. Большое количество соединений могут функционировать как измененное основание. Структура измененного основания является важной при условии. что измененное основание. по существу. не препятствует связыванию олигонуклеотида с его мишенью. например мРНК. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения измененное основание представляет собой дифтортолил. нитропирролил. нитроимидазолил. нитроиндолил. нафталенил. антраценил. пиридинил. хинолинил. пиренил или бивалентный радикал любого из неприродных нуклеотидных оснований. описанных в настоящем документе. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения неприродные нуклеотидные основания представляют собой дифтортолил. нитропирролил или нитроимидазолил. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения неприродное нуклеотидное основание представляет собой дифтортолил. Широкое разнообразие лигандов известно в данной области техники и включено согласно настоящему изобретению. Например. лиганд может представлять собой стероид. желчную кислоту. липид. фолиевую кислоту. пиридоксал. В12. рибофлавин. биотин. ароматическое соединение. полициклическое соединение. краун-эфир. интеркалятор. расщепляющую молекулу. связывающийся с белком агент или углевод. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения лиганд представляет собой стероидное или ароматические соединение. В конкретных примерах лиганд представляет собой холесерил.

Согласно другим вариантам реализации изобретения РНКи-агент представляет собой олигонуклеотид. связанный с лигандом в целях улучшения клеточной направленности и захвата. Например. РНКиагент может быть связан с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В качестве дополнительного примера РНКи-агент может быть связан со специфической лигандсвязывающей молекулой. такой как полипептид или фрагмент полипептида. который специфично связывается с конкретным рецептором клеточной поверхности.

Согласно другим вариантам реализации изобретения модулирующий агент содержит неприродное нуклеотидное основание. описанное в настоящем документе. В конкретных примерах фрагмент рибозного сахара. который в природе встречается в нуклеозидах. замещен на гексозный сахар. Согласно конкретным аспектам изобретения гексозный сахар представляет собой аллозу. альтрозу. глюкозу. маннозу. гулозу. идозу. галактозу. талозу или их производное. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения гексоза представляет собой Ό-гексозу. В конкретных примерах рибозный сахарный фрагмент. который в природе встречается в нуклеозидах. замещен на полициклическое гетероалкильное кольцо или циклогексенильную группу. В конкретных примерах полициклическая гетероалкильная группа представляет собой бициклическое кольцо. содержащее один атом кислорода в кольце. В конкретных примерах полициклическая гетероалкильная группа представляет собой бицикло[2.2.1]гептан. бицикло [3.2.1] октан или бицикло[3.3.1]нонан. Примеры модифицированных РНКи-агентов также включают олигонуклеотиды. содержащие модифицированные скелеты или неприродные межнуклеозидные

- 74 030461 связи, описанные в настоящем документе.

Настоящее изобретение также включает использующие олигонуклеотиды рибозимы. Синтетические молекулы РНК и их производные, которые могут катализировать высокоспецифичные эндорибонуклеазные активности, известны как рибозимы. (см., например, патент США № 5543508, НаБсЬГГ οί а1. и патент США № 5545729, Οοο^ΗΜ οί а1.). Реакции расщепления катализируются самими молекулами РНК. В природных молекулах РНК сайты аутокатализируемого расщепления локализованы в высококонсервативных участках вторичной структуры РНК (Ви/ауап οί а1., Ргос. Νηΐ1. АсаН. δα. и.δ.А., 1986, 83, 8859; ΡοιΝογ οί а1., Се11, 1987, 50, 9). Природные аутокаталитические молекулы РНК были модифицированы для генерации рибозимов, которые могут быть направлены на конкретную клеточную или патогенную молекулу РНК с высокой степенью специфичности. Таким образом, рибозимы служат таким же общим целям, как и антисмысловые олигонуклеотиды (т. е. модуляцию экспрессии конкретного гена), и подобно олигонуклеотидам представляют собой нуклеиновые кислоты, значительная часть которых является одноцепочечной.

В конкретных примерах РНКи-агенты или антисмысловые олигонуклеотиды для применения в способах, предложенных в настоящем описании, могут быть модифицированы с помощью группы, не являющейся лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, конъюгировали с олигонуклеотидами для повышения активности, клеточного распределения, клеточной направленности или клеточного поглощения указанного олигонуклеотида, и способы осуществления указанных конъюгаций доступны в специальной литературе. Указанные фрагменты, не являющиеся лигандом, включают липидные фрагменты, такие как холестерин (Бс181пдег οί а1., Ргос. Νηΐ1. АсаН. δα. υδΑ, 1989, 86:6553), аргинин-богатые пептиды, холевая кислота (МатНагап οί а1., Βίοοι^. МеН. СНет. Ьей., 1994, 4:1053), тиоэфир, например гексил5-тритилтиол (МатоНагап οί а1., Αππ. Ν.Υ. АсаН. δά., 1992, 660:306; МагюНагап οί а1., Βίοοι^. МеН. СНет. Ьей, 1993, 3:2765), тиохолестерин (ОЬегНаи8ег οί а1., Ыис1. АаН8 Κο8., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например остатки додекандиола или ундецила (δαί8οη-Βο1ιιηοαπΐ8 οί а1., ЕМВО I, 1991, 10:111; ΚаЬаπον οί а1., ΡΕΒδ Ьей., 1990, 259:327; δν^ηа^сΗик οί а1., ВюсЫт1е, 1993, 75:49), фосфолипид, например дигексадецил-гас-глицерин или триэтиламмония 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Н-фосфонат (МагюНагап οί а1., ΤеίρаΗеН^οη Ьей., 1995, 36:3651; δ1ιοη οί а1., Ыис1. Ас1Н8 Κο8., 1990, 18:3777), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (МагюНагап οί а1., Nис1еο8^Не8 & Nис1еοйНе8, 1995, 14:969) или уксусная кислота адамантана (МагюНагап οί а1., ТейаНеНгоп Ьей., 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (М18Нга οί а1., ВгосНпп. ВюрНу8. Асйк 1995, 1264:229) или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент (Сгоюко οί а1., I РΗа^тасο1. Εxρ. ТНег., 1996, 277:923). Примеры патентов США, в которых описаны способы получения указанных олигонуклеотидных конъюгатов, перечислены выше. Типичные протоколы конъюгации включают синтез олигонуклеотида, содержащего аминолинкер в одном или более положениях последовательности. Аминогруппа затем подвергается реакции с молекулой для конъюгации, с использованием соответствующих реагентов для сочетания и активации. Реакция конъюгации может осуществляться либо с олигонуклеотидом, все еще связанным с твердым носителем, либо после ухода олигонуклеотида в фазу раствора. Очистка олигонуклеотидного конъюгата с помощью ЖХВД, как правило, приводит к получению чистого конъюгата.

Дополнительные примеры РНКи агентов могут быть найдены в публикациях заявок на патент США № 2007/0275465, 2007/0054279, 2006/0287260, 2006/0035254, 2006/0008822, которые включены посредством ссылки. Также включены векторные системы доставки, которые способны экспрессировать направленные на ΑΑΚδ последовательности, описанные в настоящем документе. Включены векторы, которые экспрессируют миРНК или другие образующие дуплексы молекулы интерферирующей РНК.

Система векторной конструкции или система конструкции на основе нуклеиновой кислоты может включать единственный вектор или плазмиду, два или более вектора или плазмиды, которые вместе содержат тотальную ДНК для введения в геном хозяйской клетки или транспозон. Выбор вектора, как правило, зависит от совместимости вектора с хозяйской клеткой, в которую предполагается вводить указанный вектор. В настоящем случае векторная конструкция или конструкция на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой конструкцию, которая является эффективно функциональной в клетке млекопитающих, такой как мышечная клетка. Вектор также может включать селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику или лекарственной устойчивости или репортерный ген (т.е. зеленый флуоресцентный белок, люцифераза), которые можно применять для селекции или идентификации подходящих трансформантов или трансфектантов. Типичные системы доставки могут включать вирусные векторные системы (т.е. опосредованная вирусом трансдукция) включая, но не ограничиваясь перечисленными, ретровирусные (например, лентивирусные) векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы и герпес-вирусные векторы, среди прочих, известных в данной области техники.

XI. Разработка лекарственных средств.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к применению полипептидов, антител или полинуклеотидов ΑΑΚδ для разработки лекарственных средств, как правило, для идентификации агентов, которые модулируют один или более неканонических видов активности эталонного полипептида ΑΑΚδ, например белкового фрагмента ΑΑΚδ. Например, конкретные варианты реализации изобретения

- 75 030461 включают способы идентификации одного или более клеточных партнеров по связыванию эталонного полипептида ААК8, таких как клеточный белок, липид, нуклеиновая кислота или другие молекулы хозяина, которые непосредственно или физически взаимодействуют с указанным полипептидом ААК8. Конкретные примеры включают, например, рецепторы клеточной поверхности, такие как рецепторы, сопряженные с О-белком (ОРСК), домены белок-белкового взаимодействия и их внеклеточные или внутриклеточные домены.

Также предусмотрены способы идентификации хозяйской молекулы, которая принимает участие в одном или более видов неканонической активности полипептида ААК8, включая молекулы, которые прямо или не прямо взаимодействуют с клеточным партнером по связыванию и либо регулирует его роль в неканонической активности, либо регулируются партнером по связыванию. Такие молекулы хозяина включают компоненты как предшествующих, так и последующих этапов неканонического пути по отношению к этапу взаимодействия клеточный партнер по связыванию/белок ААК8, как правило, связанных примерно с 1, 2, 3, 4, 5 или более определяемыми этапами пути.

Конкретные аспекты включают способы идентификации соединения (например, полипептида) или другого агента, который проявляет агонизм или антагонизм в отношении неканонической активности эталонного полипептида ААК8 или его активного варианта, например, путем взаимодействия с полипептидом ААК8 и/или одним или более из его клеточных партнеров по связыванию. Также предусмотрены способы идентификации агентов, которые модулируют экспрессию (например, сплайсинг) сплайсвариантов ААК8 или модулируют активность протеазы, которая в противном случае регулирует продукцию эндогенных белковых фрагментов ААК8 (резектинов) на уровне белка.

Конкретные варианты реализации изобретения, таким образом, включают способы идентификации партнера по связыванию эталонного полипептида ААК8, включающие а) объединение полипептида ААК8 с биологическим образцом в подходящих условиях и Ь) детектирование специфического связывания полипептида ААК8 с указанным партнером по связыванию и идентификацию на основании предшествующих этапов партнера по связыванию, который специфично связывается с эталонным полипептидом ААК8. Также включены способы скрининга соединения, которое специфично связывается с эталонным полипептидом ААК8 или партнером по связыванию полипептида ААК8, включающие а) объединение полипептида или партнера по связыванию по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях и Ь) детектирование связывания полипептида или партнера по связыванию с исследуемым соединением и, таким образом, идентификацию соединения, которое специфично связывается с полипептидом или его партнером по связыванию. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения соединение представляет собой полипептид или пептид. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения соединение представляет собой низкомолекулярное или другое (например, небиологическое) химическое соединение. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения соединение представляет собой пептидомиметик.

Любой способ, подходящий для детектирования белок-белковых взаимодействий, может использоваться для идентификации клеточных белков, которые взаимодействуют с эталонным полипептидом ААК8, с одним или более его клеточными партнерами по связыванию или обоими. Примеры обычных способов, которые можно применять, включают совместную иммунопреципитацию, перекрестное связывание и совместную очистку с помощью градиентов или хроматографических колонок клеточных лизатов или белков, полученных их клеточных лизатов, главным образом для идентификации белков в лизате, которые взаимодействуют с полипептидом ААК8.

Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения по меньшей мере часть аминокислотной последовательности белка, который взаимодействует с полипептидом ААК8 или его партнером по связыванию, может быть выявлена с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как метод расщепления по Эдману. См., например, С^е^дЬίοη Рго1ебъ: 81гис1игек алб ΜοΕαιΕίΓ Ргшар1ек, А.Н. Егеетаа & СЬ., Ν.Υ., ρ. 34 49, 1983. Полученная аминокислотная последовательность может использоваться в качестве направляющей для генерации смесей олигонуклеотидов, которые можно применять для скрининга на предмет последовательности гена, кодирующей указанные белки. Скрининг может осуществляться, например, с помощью методов стандартной гибридизации или ПЦР, описанных в настоящем документе и известных в данной области техники. Методы получения олигонуклеотидных смесей и скрининга хорошо известны. См., например, АикиЬе1 е( а1. СиггеШ ΡΐΌΐο^Η ίη ΜοΕαιΕίΓ Βίο1οβ\' Огееи РиЬйкЬтд Άκκο^-ιΝδ аиб Айеу Iηίе^δс^еηсе, Ν.Υ., 1989; аиб Ιηηίδ е( а1., ебк. РСК ΡΓοΐο^1δ: А Ошбе ίο Мебюбк апб АррЕсиШ^ Асабеппс Ргекк, 1пс., №\υ ΥογΕ, 1990.

Кроме того, способы одновременно можно применять для идентификации генов, кодирующих партнеров по связыванию или другие полипептиды. Указанные способы включают, например, зондирование библиотеки экспрессии в соответствии со способом, аналогичным хорошо известному методу зондирования с помощью антител библиотеки лямбда-д!11, с использованием меченого белка или другого полипептида, пептида или слитого белка ААК8, например, варианта полипептида ААК8 или домена ААК8, слитого с маркером (например, ферментом, фтором, люминесцентным белком или красителем) или доменом Ιβ-Ес.

- 76 030461

Один способ, позволяющий выявлять белковые взаимодействия ш νί\Ό - двугибридная система, подробно описан, исключительно в качестве иллюстрации, а не в целях ограничения. Был описан один пример указанной системы (СЫеи е! а1., ΡNΆδ υδΆ 88:9578-9582, 1991), который можно приобрести в компании С1ои!есИ (Пало-Альто, Калифорния).

Вкратце, при использовании такой системы могут быть сконструированы плазмиды, которые кодируют два гибридных белка: одна плазмида состоит из нуклеотидов, кодирующих ДНК-связывающий домен белка активации транскрипции, слитого с эталонной нуклеотидной последовательностью ΆΆΚδ (или согласно конкретным вариантам реализации изобретения его партнера по связыванию) или ее вариантом, и другая плазмида состоит из нуклеотидов, кодирующих домен активации белка активации транскрипции, слитый с кДНК (или набором кДНК), кодирующей неизвестный белок (белки), которые были рекомбинантно встроены в плазмиду как часть библиотеки кДНК. Плазмида слияния с ДНК-связывающим доменом и библиотека активатора кДНК могут быть трансформированы в штамм дрожжей δассЬа^отусеκ сеге'Шае, который содержит репортерный ген (например, Μδ или 1ас2), регуляторная область которого содержит сайт связывания активатора транскрипции. Каждый слитый белок отдельно не может активировать транскрипцию репортерного гена: гибрид ДНК-связывающего домена не может активировать транскрипцию репортерного гена, так как он не обеспечивает функцию активации, и гибридный домен активации не может активировать транскрипцию репортерного гена, так как он не может располагаться на сайтах связывания активатора. Взаимодействие двух слитых белков восстанавливает функциональный белок-активатор и приводит к экспрессии репортерного гена, который выявляется с помощью анализа продукта репортерного гена.

Двугибридная система или другие подобные методы можно применять для скрининга библиотеки домена активации в поисках белков, которые взаимодействуют с генным продуктом - приманкой. В качестве примера, но не в качестве ограничения, может использоваться эталонный полипептид или вариант ΆΆΚδ в качестве генного продукта - приманки. Партнер по связыванию ΆΆΚδ также может использоваться в качестве генного продукта - приманки. Общая геномная или кДНК-последовательность сливается с ДНК, кодирующей домен активации. Указанная библиотека и плазмида, кодирующая гибрид генного продукта приманки ΆΆΚδ, слитый с ДНК-связывающим доменом, совместно трансформируется в дрожжевой репортерный штамм, и полученные трансформанты подвергаются скринингу для поиска экспрессирующих репортерный ген.

Библиотека кДНК клеточной линии, в которой предстоит детектировать белки, которые взаимодействуют с генным продуктом - приманкой ΆΆΚδ, может быть создана с использованием стандартных способов, используемых в данной области техники. Например, фрагменты кДНК могут быть встроены в вектор таким образом, что они трансляционно слиты с доменом активации транскрипции ΟΆΣ4. Указанная библиотека может быть трансформирована совместно с геном-приманкой плазмиды слияния ΟΆΕΠ в дрожжевой штамм, который содержит ген 1ас2, запускаемый промотором, который содержит последовательность активации βΆΡΑ. Кодируемый кДНК белок, слитый с доменом активации транскрипции ΟΆΕ® который взаимодействует с генным-продуктом-приманкой, восстанавливает активный белок βΆΡΗ и, таким образом, запускает экспрессию гена НШ3. Колонии, которые экспрессируют НШ3, могут быть выявлены на основании их роста на чашках Петри, содержащих полужидкую среду на основе агара в отсутствие гистидина. кДНК может затем быть очищена из указанных штаммов и использоваться для продукции и изолирования белков, взаимодействующих с генным продуктом-приманкой ΆΆΚδ, с использованием стандартных методов, используемых в данной области техники.

Также предусмотрены тригибридные системы, которые обеспечивают детектирование взаимодействий РНК-белок в дрожжах. См., например, Ноок е! а1., ΚΝΆ. 11:227-233, 2005. Соответственно, указанные и связанные способы можно применять для идентификации клеточного партнера по связыванию полипептида ΆΆΚδ и для идентификации других белков или нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с полипептидом ΆΆΚδ, его клеточным партнером по связыванию или обоими.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к применению метода скрининга интерактома. Конкретные примеры включают скрининг на основе белковых доменов (см., например, Вохет е! а1., Се11. 134:534-545, 2008 и Υυ е! а1., δс^еисе. 322:10-110, 2008).

Как отмечено выше, изолированные партнеры по связыванию могут быть идентифицированы, и, в свою очередь, их можно применять вместе со стандартными методами идентификации белков или других соединений, с которыми они взаимодействуют. Конкретные варианты реализации изобретения, таким образом, относятся к способам скрининга соединений, которые специфично связываются с партнером по связыванию эталонного полипептида ΆΆΚδ, включающим а) объединение партнера по связыванию по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях и Ъ) детектирование связывания партнера по связыванию с исследуемым соединением с идентификацией на основании предшествующих этапов соединений, которые специфично связываются с партнером по связыванию. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение представляет собой полипептид. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение представляет собой химическое соединение, такое как низкомолекулярное соединение или пептидомиметик.

- 77 030461

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы скрининга для поиска соединений, которые модулируют активности эталонного полипептида ΛΛΚδ, включающие а) объединение полипептида по меньшей мере с одним исследуемым соединением в условиях, допускающих активность полипептида, Ь) осуществление оценки активности полипептида в присутствии исследуемого соединения и с) сравнение активности полипептида в присутствии исследуемого соединения с активностью полипептида в отсутствие исследуемого соединения, причем изменение активности полипептида в присутствии исследуемого соединения указывает на то, что указанное соединение модулирует активность указанного полипептида. Конкретные варианты реализации изобретения включают способы скрининга для поиска соединения, которое модулирует активность партнера по связыванию эталонного полипептида ΛΛΚδ, включающие а) объединение полипептида по меньшей мере с одним исследуемым соединением в условиях, допускающих активность партнера по связыванию, Ь) осуществление оценки активности партнера по связыванию в присутствии исследуемого соединения и с) сравнение активности партнера по связыванию в присутствии исследуемого соединения с активностью партнера по связыванию в отсутствие исследуемого соединения, где изменение активности партнера по связыванию в присутствии исследуемого соединения указывает на то, что указанное соединение модулирует активность партнера по связыванию. Как правило, указанные и связанные варианты реализации изобретения включают оценку выбранной неканонической активности, которая связана с полипептидом ΛΛΚδ или его партнером по связыванию. Включены условия ш νίΙΐΌ и ш νίνΌ, такие как условия культивирования клеток.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы скрининга соединения на предмет его эффективности как полного или частичного агониста эталонного полипептида ΛΛΚδ или его активного фрагмента или варианта, включающие а) обработку образца, содержащего полипептид, соединением и Ь) детектирование активности на основе агонизма в образце, как правило, путем измерения повышения неканонической активности полипептида ΛΛΚδ. Конкретные способы включают а) обработку образца, содержащего партнер по связыванию полипептида ΛΛΚδ, соединением и Ь) детектирование активности на основе агонизма в образце, как правило, путем измерения повышения выбранной неканонической активности полипептида ΛΛΚδ. Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, которые содержат соединение, представляющее собой агонист, идентифицированное указанным способом, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Также включены способы скрининга соединения на предмет его эффективности как полного или частичного антагониста эталонного полипептида ΛΛΚδ, включающие а) обработку образца, содержащего полипептид, соединением и Ь) детектирование активности на основе антагонизма в образце, как правило, путем измерения снижения в неканонической активности полипептида ΛΛΚδ. Конкретные способы включают а) обработку образца, содержащего партнера по связыванию полипептида ΛΛΚδ соединением и Ь) детектирование активности на основе антагонизма в образце, как правило, путем измерения снижения выбранной неканонической активности полипептида ΛΛΚδ. Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, которые содержат соединение, представляющее собой антагонист, идентифицированное указанным способом, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения могут быть созданы системы ш νίΙΐΌ для идентификации соединений, способных взаимодействовать с или модулировать эталонные последовательности ΛΛΚδ или его партнера по связыванию. Примеры соединений, идентифицированных с использованием указанных систем, могут применяться, например, для модуляции активности пути и для разработки самих компонентов указанного пути. Их также можно применять в скрининге на соединения, которые нарушают взаимодействия между компонентами пути или могут непосредственно нарушать такие взаимодействия. Один типичный подход включает получение реакционной смеси полипептида ΛΛΚδ и исследуемого соединения в условиях и в течение времени, достаточного для возможности их взаимодействия и связывания, таким образом, с образованием комплекса, который может быть удален и/или выявлен из реакционной смеси.

Можно осуществлять скрининговые анализы ш ν 11го различными путями. Например, полипептид ΛΛΚδ, клеточный партнер по связыванию или исследуемое соединение (соединения) могут быть заякорены на твердой фазе. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения, полученные комплексы могут быть захвачены и детектироваться на твердой фазе в конце реакции. В одном примере указанного способа полипептид ΛΛΚδ и/или его партнер по связыванию связан с твердой поверхностью, и исследуемое соединение (соединения), которое связано с указанной поверхностью, может быть меченным, прямо или не прямо, таким образом, что его захват компонентом на твердой поверхности может быть выявлен. В других примерах исследуемое соединение (соединения) связано с твердой поверхностью, и полипептид ΛΛΚδ и/или его партнер по связыванию, которые не связаны с поверхностью, являются меченными или детектируемыми. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения для удобства в качестве твердой фазы можно использовать титрационные микропланшеты. Заякоренный компонент (или исследуемое соединение) может быть иммобилизован путем нековалентного или ковалентного связывания. Нековалентное связывание может быть осуществлено путем простого покрытия твердой фазы раствором белка и высушивания. В альтернативном варианте иммобилизованное антитело, предпочтительно моноклональные антитело, специфичное для белка, который предполагается иммоби- 78 030461 лизовать, может использоваться для связывания белка с твердой поверхностью. Поверхности могут быть приготовлены заранее и храниться.

Для проведения типичного анализа неиммобилизованный компонент, как правило, добавляют к покрытой поверхности, содержащей связанный компонент. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют (например, путем отмывки) в условиях, таких, что любые образовавшиеся специфические комплексы остаются иммобилизованными на твердой поверхности. Детектирование связанных комплексов на твердой поверхности можно осуществлять несколькими способами. Например, когда предварительно неиммобилизованный компонент является предварительно меченым, детектирование метки, иммобилизованной на твердой поверхности, указывает на образование комплексов. Когда предварительно неиммобилизованный компонент не является предварительно меченым, может использоваться непрямая метка для детектирования комплексов, связанных на поверхности; например меченое антитело, специфичное к предварительно не иммобилизованному компоненту (антитело, в свою очередь, может быть прямо или не прямо меченым с помощью меченого анти-1д антитела).

В альтернативном варианте присутствие или отсутствие связывания исследуемого соединения можно определить, например, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (δРΚ), где изменение угла резонанса используется в качестве показателя и где полипептид ΑΑΚδ или клеточный партнер по связыванию иммобилизуют на поверхности коммерчески доступного сенсорного чипа (например, изготовленного компанией ΒIΑСΟΚΕ™) в соответствии со стандартным способом. Исследуемое соединение приводят в контакт с указанным чипом, и указанный сенсорный чип освещают светом конкретной длины волны под конкретным углом. Связывание исследуемого соединения также можно измерить путем детектирования пика, соответствующего исследуемому соединению, с помощью способа, согласно которому полипептид ΑΑΚδ или клеточный партнер по связыванию иммобилизуется на поверхности белкового чипа, адаптируемого для масс-спектрометра, исследуемое соединение приводят в контакт с указанным чипом, и способ ионизации, такой как ΜΑ^^I-ΜС (МС с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы), ИЭР-МС, МС с бомбардировкой ускоренными атомами и т.п., используется вместе с масс-спектрометром (например, масс-спектрометром двойного фокусирования, квадрупольным масс-спектрометром, времяпролетным масс-спектрометром, масс-спектрометром преобразования Фурье, ионно-циклотронным масс-спектрометром и т.п.).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения клеточные анализы, анализы на основе мембранных везикул или анализы на основе мембранной фракции можно применять для идентификации соединений, которые модулируют взаимодействия в нетрадиционном пути выбранного полипептида ΑΑΚδ. Для указанных целей можно применять клеточные линии, которые экспрессируют полипептид ΑΑΚδ и/или партнер по связыванию или слитый белок, содержащий домен или фрагмент указанных белков (или их комбинацию), или клеточные линии (например, клетки СΟδ, клетки СТО, клетки НЕК293, клетки Не1а и т.д.), которые были генетически трансформированы для экспрессии указанного белка (белков) или слитого белка (белков). Исследуемое соединение (соединения), которое влияет на неканоническую активность, можно идентифицировать путем наблюдения за изменением (например, статистически значимым изменением) указанной активности по сравнению с контролем или предварительно определенным уровнем.

Варианты реализации изобретения, которые относятся, например, к антисмысловым и РНКиагентам, также включают способы скрининга соединения на предмет его эффективности в изменении экспрессии эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ, включающие а) обработку образца, содержащего эталонный полинуклеотид ΑΑΚδ соединением, таким как потенциальный антисмысловой олигонуклеотид, и Ь) детектирование измененной экспрессии полинуклеотида ΑΑΚδ. В конкретных неограничивающих примерах указанные и связанные варианты реализации изобретения можно применять в клеточных анализах или в бесклеточных анализах трансляции в соответствии со стандартными методами в данной области техники. Также включены антисмысловые и РНКи-агенты, идентифицированные с помощью указанных способов.

Антитела к белковым фрагментам ΑΑΚδ также можно применять в скрининговых анализах, например, для идентификации агента, который специфично связывается с ΑΑΚδ, подтверждения специфичности или аффинности агента, который связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, или идентификации сайта взаимодействия между агентом и белковым фрагментом ΑΑΚδ. Предусмотрены анализы, в которых антитело используется в качестве конкурентного ингибитора агента. Например, антитело, которое специфично связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ с известной аффинностью, может действовать в качестве конкурентного ингибитора выбранного агента и использоваться для расчета аффинности агента к белковому фрагменту ΑΑΚδ. Также одно или более антител, которые специфично связываются с известными эпитопами или сайтами белкового фрагмента ΑΑΚδ, можно применять в качестве конкурентного ингибитора для подтверждения связывания указанного агента с тем же сайтом. Другие варианты очевидны специалистам в данной области техники.

Также включены любые из указанных выше способов или другие способы скрининга, известные в данной области техники, адаптированные для высокоэффективного скрининга (НТ5). ΗТδ, как правило, использует автоматизированный скрининговый анализ библиотеки соединений-кандидатов, например

- 79 030461 анализ, который измеряет повышение или снижение неканонической активности, описанной в настоящем документе.

В любом из способов скрининга, предложенных в настоящем описании, можно применять низкомолекулярные библиотеки или библиотеки, созданные с помощью комбинаторной химии. Библиотеки химических и/или биологических смесей, таких как грибковые, бактериальные, водорослевые экстракты, известны в данной области техники и могут подвергаться скринингу с помощью любого из способов анализа согласно изобретению. Примеры способов создания молекулярной библиотеки могут быть найдены в источниках Саге11 еί а1., 1994а; Саге11 еί а1., 1994Ь; СЛо еί а1., 1993; Ие\УП1 еί а1., 1993; 0а11ор еί а1., 1994; Ζικί^πικιηη еί а1., 1994.

Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (ΗοидЛίеи еί а1., 1992) или на гранулах (Бат еί а1., 1991), на чипах (РоТог еί а1., 1993), бактериях, спорах (БаТаег еί а1., патент США № 5223409, 1993), плазмидах (Си11 еί а1., 1992) или на фагах (СТОг1а еί а1., 1990; ИехЛа еί а1., 1990; РеЛа еί а1., 1991; БаТаег еί а1., патент США № 5223409, 1993; δ^ίί и δηίίΡ, 1990). Варианты реализации настоящего изобретения включают применение различных библиотек для идентификации низкомолекулярных модуляторов одного или более белковых фрагментов ΑΑΚδ, их партнеров по связыванию и/или связанных с ними неканонических видов активности. Библиотеки, которые можно применять в целях изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленными, (1) химические библиотеки, (2) библиотеки природных продуктов и (3) комбинаторные библиотеки, состоящие из случайных пептидов, олигонуклеотидов и/или органических молекул.

Химические библиотеки состоят из структурных аналогов известных соединений или соединений, которые идентифицированы как искомые или перспективные посредством скрининга природных продуктов. Библиотеки природных продуктов представляют собой библиотеки, которые получены из коллекций микроорганизмов, животных, растений или морских организмов, которые используются для создания смесей для скрининга путем (1) культивирования и экстракции жидкой среды из почвы, растений или морских микроорганизмов или (2) экстракции растений или морских организмов. Библиотеки природных продуктов включают поликетиды, не рибосомальные пептиды и их варианты (неприродные). См., например, Саие е1 а1., δ^ι^ 282:63-68, 1998. Комбинаторные библиотеки могут состоять из большого количества пептидов, олигонуклеотидов или органических соединений в виде смеси. Их относительно легко можно получать с помощью стандартных автоматизированных способов синтеза, ПЦР, клонирования или собственных синтетических способов.

Более конкретно, библиотека на основе комбинаторной химии представляет собой коллекцию различных химических соединений, созданных либо путем химического синтеза или биологического синтеза, либо путем объединения ряда химических структурных элементов, таких как реагенты. Например, линейная комбинаторная химическая библиотека, такая как библиотека пептидов, образована путем объединения набора химических структурных элементов (аминокислот) каждым возможным образом для конкретной длины соединения (т.е. количества аминокислот в полипептидном соединении). Миллионы химических соединений можно синтезировать путем такого комбинаторного перемешивания химических структурных элементов.

Обзор способов комбинаторной химии и библиотек, созданных на их основе, можно найти, например, в источниках Инс, I. аий Nдиуеη, Κ. (2001), СотЬ. СЛет. ШдЛ ΤЛ^οидЛриί δс^ееη, 4:53-74; Берге, С.А. (2001), Игид Όίδ^ν. ШТау, 6:133-140; Реад, δ.Χ. (2000), ВютеТ. СЛготаФдг. 14:430-441; ВоЛт, Η.Γ ааТ δίΗΜ, М. (2000), Сигг. Οр^и. СЛет. Вю1. 4:283-286; Вате5, С. ааТ Βа1а5иЬ^атаи^аи, δ. (2000), Сигг. Οр^и. СЛет. Вю1. 4:346-350; Берге, Еп)а1Ьа1, ’., е1 а1. (2000), Ма55 δерί^οт Яет. 19:139-161; ШЛ, И.О. (2000), №Б ВюШсЛио1. 18:262-262; Ба/о, ί.δ., ааТ А1рГ, Р. (2000), ί. РЛагтасо1. Ехр. Щеп 293:705-709; ΗοидЛίеи, Κ.Α. (2000), Αηη. Κν. РЛагтасо1. ШхЕок 40:273-282; КоЬауакЫ, δ. (2000), Сигг. Οр^и. СЛет. Вю1. (2000), 4:338-345; Кору^, ΑΜ аЩ δр^^^Тοиονа, ν.Α. (2000), Мо1. Вю1. (Мокк) 34:1097-1113; АеЬег, Б. (2000), Сигг. С)рт. СЛет. Вю1. 4:295-302; Ио11е, Κ.Ε. (2000), ί. СотЬ. СЛет. 2:383-433; Р1оуТ, С.И., е1 а1. (1999), Ргод. МеТ. СЛет. 36:91-168; КииТи, В., е1 а1., (1999) Ргод. Игид Рек. 53:89-156; СаЬШу, δ. (1999) Мо1. ВюйсЬиоГ 12:143-148; Бо^е, О. (1999), №к РгоТ. Яер. 16:641-651; Ио11е, Κ.Ε. аМ №15ои, К.Н. (1999), ί. СотЬ. СЛет. 1:235-282; С/.апасБ Α.Α. аМ Кеега, БИ. (1998), Сигг. Вю1. 8:Κ705Κ707; Ио11е, Κ.Ε. (1998), Мо1. ϋΐναδ. 4:233-256; Муегк, Р.Б. (1997), Сигг. С)рш. ВюйсЬиоБ 8:701-707 и РШсЙЛии, Α. ааТ Сойеке, Κ. (1997), Вю1. СЛет. 378:443.

Устройства для получения комбинаторных библиотек являются коммерчески доступными (см., например, 357 МΡδ, 390 МΡδ, ΑТνаисеТ СЛет. ΤесЛ., БошкгШе Ку., δутрЛοиу, Κ^ηώ, Уоберн, Массачусетс, 433А Αрр1^еТ Вю5у51ет5, Фостер Сити, Калифорния, 9050 Р1и5, МЛЛроге, Бэдфорд, Массачусетс). Кроме того, множество самих комбинаторных библиотек является коммерчески доступным (см., например, СотОегах, Ρ^^исеίοи, Ν.Ι, Λ5^ηеx. Москва, Россия, Τ^^рο5, 1ис., Сент-Льюис, Миссури, СЛетδίа^, БШ., Москва, Россия, 3И РЛагтасеиЛсаИ, Ех1оа, Ра., МаПек Β^ο5с^еисе5, Колумбия, Мэрилэнд, и т.д.).

XII. Способы применения.

Варианты реализации настоящего изобретения включают терапевтические способы лечения. Соответственно, агенты ΑΛРδ, описанные в настоящем документе, включая полипептиды ΑЛРδ, полинуклеотиды ΑЛРδ, векторы на основе полинуклеотидов ΑЛРδ, экспрессирующие ΑΑΚδ клетки-хозяева,

- 80 030461 антисмысловые олигонуклеотиды, РНКи-агенты, а также связывающие агенты, такие как пептиды, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, пептидомиметики и другие низкомолекулярные соединения, можно применять для лечения различных неограничивающих заболеваний или состояний, связанных с неканоническими видами активности эталонной ААК§. Примеры указанных неканонических видов активности включают модуляцию внеклеточной передачи сигнала, модуляцию пролиферации клеток, модуляцию миграции клеток, модуляцию дифференцировки клеток (например, гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза), модуляцию апоптоза или других форм клеточной гибели, модуляцию ангиогенеза, модуляцию клеточного связывания, модуляцию клеточного метаболизма, модуляцию продукции или активности цитокинов, модуляцию активности цитокиновых рецепторов, модуляцию клеточного поглощения или секреции, иммуномодуляцию, модуляцию воспаления, модуляцию метаболических процессов, таких как контроль глюкозы и т. п.

Предусмотрены терапевтические средства на основе полинуклеотидов, такие как терапевтические средства на основе антисмысловых агентов и РНКи-агентов, которые, как правило, относятся к снижению экспрессии молекулы-мишени, такой как эндогенный фрагмент ААК§ или клеточный партнер по связыванию полипептида ААК§, который в противном случае вносит вклад в его неканоническую активность. Терапевтические средства на основе антисмысловых или РНКи-агентов, как правило, проявляют антагонизм в отношении неканонической активности, например, путем уменьшения экспрессии эталонного полипептида ААК§. Также предусмотрены терапевтические средства на основе полипептидов или пептидов, антител или антигенсвязывающего фрагмента, пептидомиметиков или других малых молекул, которые проявляют агонизм или антагонизм в отношении неканонической активности эталонного полипептида ААК§, например, путем взаимодействия непосредственно с полипептидом ААК.8, его клеточным партнером по связыванию (партнерами), или обоими.

Указанные и связанные варианты реализации изобретения включают способы применения ААК§агентов или композиций согласно настоящему изобретению для лечения клетки, ткани или субъекта. Клетки или ткани, которые можно лечить или модулировать согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой клетки или ткани млекопитающих или более предпочтительно клетки или ткани человека. Указанные клетки или ткани могут находиться в здоровом или нездоровом состоянии.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, например, предложены способы модуляции терапевтически релевантных видов активности клетки, включая, но не ограничиваясь перечисленными, клеточный метаболизм, дифференцировку клеток, пролиферацию клеток, поглощение клеткой, клеточную секрецию, клеточную гибель, подвижность клетки, миграцию клеток, транскрипцию генов, трансляцию мРНК, сопротивление клетки, иммунные ответы, воспалительные ответы и т.п., включающие осуществление контакта клетки с агентом или композицией ААК§, описанной в настоящем документе. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения клетка находится в теле субъекта. Соответственно, композиция на основе ААК§ может применяться для лечения, по существу, любой клетки, или ткани, или субъекта, у которого может быть получен благоприятный эффект от модуляции одного или более указанных видов активности.

Агенты и композиции ААК.8 также можно применять в любом из ряда терапевтических контекстов, включая, например, случаи, связанные с лечением или предотвращением неопластических заболеваний, заболеваний или состояний иммунной системы (например, аутоиммунных заболеваний и воспалений), инфекционных заболеваний, метаболических заболеваний, нервных/неврологических заболеваний, мышечных/сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний, связанных с нарушением кроветворения, заболеваний, связанных с нарушением миогенеза, заболеваний, связанных с нарушением нейрогенеза, заболеваний, связанных с нарушением адипогенеза, заболеваний, связанных с нарушением остеогенеза, заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза, заболеваний, связанных с нарушением выживаемости клеток, заболеваний, связанных с нарушением захвата липидов, заболеваний, связанных со старением (например, потери волос, периферической или вегетативной невропатии, старческой деменции, ретинопатии) и других заболеваний.

Например, согласно конкретным иллюстративным вариантам реализации изобретения композиции, содержащие ААК§, согласно изобретению можно применять для модуляции ангиогенеза, например, путем модуляции пролиферации и/или передачи сигнала клеток эндотелия. За пролиферацией и/или передачей сигнала клеток эндотелия можно наблюдать с использованием соответствующей клеточной линии (например, клеток эндотелия микрососудов легкого человека (НМУЕС-Ь) и клеток эндотелия пупочной вены человека (НИУЕС)) и с помощью соответствующего анализа (например, анализа миграции клеток эндотелия, анализа пролиферации клеток эндотелия, анализа формирования сосудов, анализа с использованием бляшек матригеля и т.д.), многие из которых известны и доступны в данной области техники.

Таким образом, согласно связанным вариантам реализации изобретения композиции согласно изобретению можно применять для лечения, по существу, любой клетки или ткани или субъекта, который будет иметь благоприятный эффект от модуляции ангиогенеза. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения клетка или ткань или субъект, подверженный или чувствительный к ангиогенезу (например, ангиогенным состояниям), может подвергаться контактированию с подходящей ком- 81 030461 позицией согласно изобретению для подавления ангиогенного состояния. Типичные ангиогенные состояния включают возрастную макулярную дистрофию (ΑΜΌ, ВМД), рак, нарушения развития (органогенеза), диабетическую слепоту, эндометриоз, неоваскуляризацию глазного яблока, псориаз, ревматоидный артрит и нарушение окраски кожи (например, гемангиому, пламенеющий невус или простой невус). Согласно другим вариантам реализации изобретения клетка или ткань, подверженная или чувствительная к недостаточному ангиогенезу (например, ангиостатическому состоянию), может подвергаться контактированию с соответствующей композицией согласно изобретению для препятствования ангиостатической активности и/или обеспечения ангиогенеза. Типичные ангиостатические состояния включают сердечно-сосудистое заболевание, рестеноз, тканевое повреждение после реперфузии ишемизированной ткани или сердечную недостаточность, хронические воспаления, заживление ран и лечение диабетических язв.

Также включены способы модуляции гематопоэза и связанных состояний. Примеры гематопоэтических процессов, которые могут модулироваться полипептидами ΑΑΚδ согласно изобретению, включают, но не ограничиваются перечисленными, образование миелоидных клеток (например, эритроидных клеток, тучных клеток, моноцитов/макрофагов, миелоидных дендритных клеток, гранулоцитов, таких как базофилы, нейтрофилы и эозинофилы, мегакариоцитов, тромбоцитов) и лимфоидных клеток (например, естественных киллеров, лимфоидных дендритных клеток, В-клеток и Т-клеток). Конкретные специфические гематопоэтические процессы включают эритропоэз, гранулоцитопоэз, лимфопоэз, мегакариоцитопоэз, тромбоцитопоэз и т.д. Также включены способы модуляции траффика или мобилизации гематопоэтических клеток, включая гематопоэтические стволовые клетки, клетки-предшественники, эритроциты, гранулоциты, лимфоциты, мегакариоциты и тромбоциты.

Способы модуляции гематопоэза можно осуществлять на практике ίη νινο, ίη νΐΐΓο, ех νινο или в любой комбинации. Указанные способы могут осуществляться на практике на любом биологическом образце, клеточной культуре или ткани, которая содержит гематопоэтические стволовые клетки, гематопоэтические клетки-предшественники или другие стволовые клетки или клетки-предшественники, которые способны дифференцироваться в гематопоэтическом направлении (например, произошедшие из жировой ткани стволовые клетки). Для осуществления способов ίη νίϋΌ и ех νινο стволовые клетки и клетки-предшественники, гематопоэтического или другого происхождения, могут быть изолированы и/или идентифицированы в соответствии со способами и характеристиками, описанными в настоящем документе и известными в данной области техники.

Композиции согласно изобретению также могут применяться в качестве иммуномодуляторов для лечения противо- или провоспалительных симптомов путем модуляции клеток, которые опосредуют, непосредственно или опосредованно, аутоиммунные и/или воспалительные заболевания, состояния и нарушения. Применимость композиций согласно изобретению в качестве иммуномодуляторов или модуляторов воспаления можно оценивать с использованием любого из ряда известных и доступных методов в данной области техники, включая, например, анализы миграции (например, с использованием лейкоцитов или лимфоцитов) или анализы выживаемости клеток (например, с использованием В-клеток, Т-клеток, моноцитов или ΝΚ-клеток).

Воспаление в целом относится к биологическому ответу тканей на вредоносные стимулы, такие как патогены, повреждение клетки (например, раны) и раздражители. Термин воспалительный ответ относится к специфическим механизмам, посредством которых достигается и регулируется воспаление, включая исключительно в качестве примера активацию и миграцию клеток иммунной системы, продукцию цитокинов, расширение просвета сосудов, включая высвобождение кининов, фибринолиз и коагуляцию, среди других механизмов, описанных в настоящем документе и известных в данной области техники.

Клинические признаки хронического воспаления зависят от продолжительности заболевания, воспалительных повреждений, причины и анатомической области повреждения (см., например, Китаг ек а1., Κο№ίη8 Бакю Ра^Фду, 8'¹' Еб., 2009, Ε15еν^е^, ΕοιΜοη; Μί1^Γ, ΚΜ., РабюЬду Ьескиге ΝοΚκ, Α^ηκ Уекегтагу С^Педе, СЬа^1οккекΟ№η, РЕ^ Канада). Хронические воспаления связаны с различными патологическими состояниями или заболеваниями, включая, например, аллергии, болезнь Альцгеймера, анемию, стеноз аортального клапана, артрит, такой как ревматоидный артрит и остеоартрит, рак, застойную сердечную недостаточность, фибромиалгию, фиброз, инфаркт миокарда, почечную недостаточность, волчанку, панкреатит, инсульт, хирургические осложнения, воспалительное заболевание легких, воспалительное заболевание кишечника, атеросклероз, неврологические нарушения, диабет, метаболические нарушения, ожирение и псориаз, среди других, описанных в настоящем документе и известных в данной области техники. Таким образом, композиции ΑΑΚδ можно применять для лечения или контроля хронического воспаления путем модуляции любого из одного или более отдельных хронических воспалительных ответов или лечения любого одного или более заболеваний или состояний, связанных с хроническим воспалением.

Критерии для оценки признаков и симптомов воспалительных и других состояний, например, для осуществления дифференциальной диагностики, а также для мониторинга лечения, например, для определения того, является ли доза, вводимая во время лечения, терапевтически эффективной, например, пу- 82 030461 тем оценки улучшения в соответствии с принятыми клиническими критериями, очевидны специалистам в данной области техники и их примеры приведены, например, в источниках Вегко\у е! а1., ебк., ТЬе Мегск Мапиа1, 16^!Ь ебйюп, Мегск апб Со., КаЬтеау, Ν.Ι, 1992; Оообтап е! а1., ебк., Оообтап апб ОПтап'к ТЬе РЬагтасо1од1са1 Вайк оГ ТЬегареийск, 10^!Ь ебйюп, Регдатоп Ргекк, 1пс., Е1ткГогб, Ν.Υ., (2001); Ауегу'к Огид Тгеа!теп!: Рйпйр1ек апб Ргасйсе оГ Сйтса1 РЬагтасо1оду апб ТЬегареийск, 3гб ебйюп, АО18 Ргекк, Ыб., ^ййатк апб ХУПктк, Ва1йтоге, МО. (1987); ЕЬабП РЬагтасо1оду, Ьййе, Вготеп апб Со., Вок!оп, (1985); Око1с1 а1., ебк., Кетшдкп'к РЬагтасеийса1 8аепсек, 18^!Ь ебйюп, Маск РиЬйкЫпд Со., Еак!оп, РА (1990); Ка!/ипд, Вайс апб Сйтса1 РЬагтасо1оду, Арр1е!оп апб Ьапде, ШпуаПу СТ (1992).

Согласно другим вариантам реализации изобретения композиции, содержащие ААК8, согласно изобретению можно применять для модуляции пролиферации и/или выживаемости клеток и соответственно для лечения или предотвращения заболеваний, нарушений или состояний, характеризующихся нарушениями пролиферации и/или выживаемости клеток. Например, согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиции, содержащие ААК8, можно применять для модуляции апоптоза и/или для лечения заболеваний или состояний, связанных с нарушением апоптоза. За процессом апоптоза можно наблюдать с помощью любого из ряда доступных методов, известных и доступных в данной области техники, включая, например, анализы, которые измеряют фрагментацию ДНК, изменения мембранной асимметрии, активацию апоптотических каспаз и/или высвобождение цитохрома С и фактора индукции апоптоза (А1Р).

За прогрессом указанных и других видов и средств терапии (например, видов терапии ех У1уо) можно с легкостью наблюдать с помощью стандартных способов и анализов и на основе критериев, известных врачам или другим специалистам в данной области техники.

XIII. Фармацевтические лекарственные формы, введение и наборы.

Варианты реализации настоящего изобретения включают полинуклеотиды ААК8, полипептиды ААК8, клетки-хозяева, экспрессирующие полипептиды ААК8, связывающие агенты, модулирующие агенты или другие соединения, описанные в настоящем документе, представленные в виде фармацевтически приемлемых или физиологически приемлемых растворов для введения в клетку или животному, отдельно или в комбинации с одним или более другими средствами терапии. Также необходимо понимать, что, при желании, композиции согласно изобретению также можно вводить в комбинации с другими агентами, такими как, например, другие белки или полипептиды или различные фармацевтически активные агенты. По существу, не существует ограничений для других компонентов, которые могут быть дополнительно включены в композиции при условии, что указанные дополнительные агенты не оказывают неблагоприятного влияния на модулирующие или другие эффекты, достижение которых является желательным.

Способы получения фармацевтически приемлемых наполнителей и носителей для растворов для фармацевтических композиций согласно изобретению хорошо известны специалистам в данной области техники, так же как и разработка подходящих режимов дозирования и схем лечения для применения конкретных композиций, описанных в настоящем документе, для различных способов лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное, подкожное и внутримышечное введение и получение лекарственных форм.

В конкретных приложениях фармацевтические или терапевтические композиции согласно изобретению не стимулируют иммунную реакцию. Согласно другим вариантам реализации изобретения фармацевтические или терапевтические композиции согласно изобретению, как правило, содержащие один или более полипептидов или полинуклеотидов ААК8, стимулируют иммунную реакцию, например действуя в качестве адъюванта в вакцине или связанной композиции или присутствуя в композиции вместе с отдельным адъювантом или агентом, стимулирующим иммунный ответ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения ААК8-агенты, такие как полипептиды ААК8, полинуклеотиды ААК8 и антитела, имеют растворимость, которая является желательной для конкретного способа введения, такого как внутривенное введение. Примеры желательной растворимости включают растворимость, составляющую по меньшей мере примерно 1 мг/мл, по меньшей мере примерно 10 мг/мл, по меньшей мере примерно 25 мг/мл и по меньшей мере примерно 50 мг/мл.

Для конкретных способов применения фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут доставляться субъекту путем перорального введения. В этом случае указанные композиции могут быть представлены вместе с инертным разбавителем или с усваиваемым съедобным носителем, или могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу или спрессованы в таблетки, или же могут быть непосредственно включены в еду пищевого рациона субъекта.

В определенных обстоятельствах желательно доставлять фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутриартериальным, интратекальным, интрапаренхимальным, интрацистернальным, внутрижелудочковым, интрауретральным, внутригрудинным, интракраниальным, интрасиновиальным или даже внутрибрюшинным путем, как описано, например, в патентах США № 5543158; 5641515 и 5399363 (каждый из которых полностью и конкретно включен в настоящее описание посредством ссылки). Подходящие устройства для парентерального введения включают устройства для инъекций с иглой (включая микроиглу), устрой- 83 030461 ства для инъекций без иглы и методы инфузии.

Могут быть получены водные растворы активных соединений, представленных в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей, перемешанных подходящим образом с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также могут быть получены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения указанные составы содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для применения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для не замедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций (патент США № 5466468, полностью и конкретно включенный в настоящее описание посредством ссылки). Во всех случаях форма должна являться стерильной и жидкой при условии, что существует возможность ее легкого введения с помощью шприца. Указанная форма должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищенной от заражения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено путем использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т. п. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия. Замедленная абсорбция композиций для инъекций может осуществляться путем использования в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

Для парентерального введения, например в водном растворе, указанный раствор, при необходимости, должен быть забуферен подходящим образом, и жидкий разбавитель должен исходно являться изотоничным, что достигается с помощью достаточного количества соли или глюкозы. Указанные конкретные водные растворы являются особо подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. Стерильные водные среды, которые можно применять для указанных целей, очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора ΝαΟ и либо добавлена к 1000 мл жидкости для подкожного введения, либо инъецирована в предполагаемое место инфузии (см., например, Кет1п§1оп'8 РПагтасеиПса1 Заепсех 15* Εάίΐίοη, р. 1035-1038 апб 1570-1580). В зависимости от состояния субъекта, подвергаемого лечению, могут потребоваться некоторые вариации в размере дозы. В любом случае соответствующая доза для конкретного субъекта определяется человеком, ответственным за введение указанной дозы. Более того, композиции для введения человеку должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты в соответствии с требованиями Отдела биологических стандартов Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США, РЭА.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активных соединений в требуемом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией посредством фильтрования. В целом, дисперсии готовят путем включения различных стерильных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную среду для дисперсии и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше ингредиентов. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций предпочтительные способы получения представляют собой методы вакуумной сушки и лиофилизации, которые приводят к получению порошка активного ингредиента вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом из предварительно стерилизованного посредством фильтрования раствора.

Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть представлены в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислота, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут представлять собой соли, произошедшие из неорганических оснований, таких как, например, гидроксид натрия, калия, аммония, кальция или железа, и указанных органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После получения лекарственной формы растворы вводят путем, который является совместимым с указанной лекарственной формой дозирования, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Лекарственные формы с легкостью вводят в различных формах дозирования, таких как растворы для инъекций, капсулы для высвобождения лекарственного средства и т.п.

В настоящем описании термин носитель включает все растворители, среды для дисперсий, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и

- 84 030461 замедляющие абсорбцию агенты, буферы, несущие растворы, суспензии, коллоиды и т.п. Применение указанных сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известны в данной области техники. За исключением тех случаев, когда любая обычная среда или агент являются совместимыми с активным ингредиентом, предполагается их применение в терапевтической композиции. Вспомогательные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции.

Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным соединениям и композициям, которые не вызывают аллергической реакции или подобной нежелательной реакции при введении человеку. Получение водной композиции, содержащей белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области техники. Как правило, указанные композиции готовят в виде растворов для инъекций или в виде жидких растворов или суспензий; также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкостях до их инъецирования. Композиция также может быть эмульгированной.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения фармацевтические композиции могут доставляться с помощью интраназальных спреев, ингаляторов и/или других носителей для доставки аэрозолей. Способы непосредственной доставки в легкие композиций генов, полинуклеотидов и пептидов через назальные аэрозольные спреи описаны, например, в патентах США № 5756353 и 5804212 (каждый из которых полностью и конкретно включен в настоящее описание посредством ссылки). Подобным образом, доставка лекарственных средств с использованием микрочастиц смолы для интраназального введения (Такепада е! а1., 1998) и лизофосфатидилглицериновых соединений (патент США № 5725871, полностью и конкретно включенный в настоящее описание посредством ссылки) также хорошо известны в области фармацевтики. Подобным образом, доставка лекарственного средства через слизистые оболочки в форме матрицы на основе политетрафторэтилена описана в патенте США № 5780045 (полностью и конкретно включенном в настоящее описание посредством ссылки).

Фармацевтические композиции могут быть представлены в виде композиций с быстрым и/или замедленным высвобождением. Композиции с замедленным высвобождением включают композиции с отсроченным, модифицированным, импульсным, контролируемым, направленным и программируемым высвобождением. Таким образом, композиции могут быть представлены в виде суспензии или твердого вещества, полужидкого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантируемого депо, обеспечивающего замедленное высвобождение полинуклеотидов ΑΑΚδ, полипептидов ΑΑΚδ, связывающих агентов, модулирующих агентов и других активных агентов. Примеры указанных лекарственных форм включают, но не ограничиваются перечисленными, покрытые лекарственным средством стенты, полужидкости и суспензии, содержащие ламеллярные везикулы или микрочастицы на основе поли(ЭЬ-молочной-ко-гликолевой)кислоты ^ΟΕΑ), полиЩЬ-лактид-ко-гликолида) (РЬС) или поли( лактида) ^ΕΑ) с нагрузкой лекарственного средства, гидрогели (НоГГтап Αδ: Алл. Ν.Υ. Αсаб. δα. 944:62-73 (2001)), системы полиаминокислотных наночастиц, которые продаются под торговой маркой ΜΕΌυδΑ®, разработанной компанией Р1ате1 ТесЬпо1од1ек 1пс., неводные гелевые системы, которые продаются под торговой маркой ΑΊΚΙΌΕΕ®, разработанной компанией Α6τχ, 1пс., и лекарственные формы на основе изобутирата ацетата сахарозы пролонгированного действия, которые продаются под торговой маркой δΑВΕΚ®, разработанной компанией Энгес! Согрогабоп, и системы на основе липидов, разработанные компанией δкуеΡЬа^та и которые продаются под торговой маркой ^ΕΡОΡОЛΜ®.

Устройства для замедленного высвобождения, способные доставлять желаемые дозы фармацевтических композиций в течение длительных периодов времени, известны в данной области техники. Например, в патентах США № 5034229; 5557318; 5110596; 5728396; 5985305; 6113938; 6156331; 6375978 и 6395292 описаны устройства на основе осмотического давления, способные доставлять лекарственную форму активного агента, такую как раствор или суспензия, с желаемой скоростью в течение длительного периода времени (т.е. периода, варьирующего от более чем одной недели вплоть до одного года или более). Другие типичные устройства замедленного высвобождения включают насосы регулируемого типа, которые обеспечивают постоянный ток, регулируемый ток или программируемый ток лекарственной формы благоприятного агента, которые доступны из компании Мебблтс, включая интратекальные насосы, которые продаются под торговой маркой δΥNСНΚΟΜΕ^ ΙΝΡυδΙΟΝ δΥδТΕΜ®, системы 1оЬпкоп апб 1оЬпкоп, которые продаются под торговыми марками СΟ^ΜΑN® бМкюп ритрк и INδΕТ® !есЬпо1од1ек ритрк. Дополнительные примеры устройств описаны в патентах США № 6283949; 5976109; 5836935 и 5511355.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения доставка может осуществляться с использованием липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и т.п. для введения композиций согласно настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в инкапсулированной форме для доставки в виде липидных частиц, липосом, везикул, наносфер, наночастиц и т.п. Получение и применение указанных везикул для доставки можно осуществлять с использованием известных и стандартных методов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения агенты, предложенные в настоящем опи- 85 030461 сании. могут быть присоединены к фармацевтически приемлемому твердому субстрату. включая биосовместимые и биодеградируемые субстраты. такие как полимеры и матрицы. Примеры указанных твердых субстратов включают. но не ограничиваются перечисленными. полиэфиры. гидрогели (например. поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(винилспирт)). полилактиды (патент США № 3773919). сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-глутамата. не деградируемый этиленвинилацетат. деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты. такие как поли(молочная-ко-гликолевая кислота) (РЬОА) и ^υРКОN ЭЕРОТ™ (микросферы для инъекций. состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата). поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. коллаген. металл. гидроксиапатит. биостекло. алюминат. биокерамические материалы и очищенные белки.

Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения твердый субстрат содержит биодеградируемые полимеры. продающиеся под торговой маркой АТКЮЕЬ™ (ОБТ. 1пс.. Ванкувер. Канада). Система доставки лекарственных средств АТКЮЕЬ® состоит из биодеградируемых полимеров. растворенных в биосовместимых носителях. Фармацевтические препараты могут быть замешаны в указанную жидкую систему доставки во время изготовления или. в зависимости от продукта. могут позже добавляться врачом во время применения. Когда жидкий продукт инъецируют в подкожное пространство через малокалиберную иглу или помещают в доступные области ткани с помощью канюли. вода в тканевых жидкостях вызывает преципитацию полимера и фиксацию лекарственного средства в твердом импланте. Лекарственное средство. инкапсулированное в имплант. затем высвобождается контролируемым образом по мере того. как полимерная матрица со временем биодеградирует.

Фармацевтические композиции для применения согласно настоящему изобретению также можно вводить местным. (внутри)кожным или трансдермальным путем на кожу или слизистые. Типичные лекарственные формы для указанной цели включают гели. гидрогели. лосьоны. растворы. крема. мази. присыпки. бинты. пены. пленки. кожные пластыри. брикеты. импланты. губки. волокна. повязки и микроэмульсии. Также можно применять липосомы. Типичные носители включают спирт. воду. минеральное масло. жидкий вазелин. белый вазелин. глицерин. полиэтиленгликоль и пропиленгликоль. Могут быть включены усилители проникновения. см.. например. Ρίηηίη апб Могдап: Ь РЬагт. 8сЕ 88(10):955958 (1999). Другие пути местного введения включают доставку путем электропорации. ионофорез. фонофорез. сонофорез и инъекцию через микроиглу или без иглы. например. с использованием систем. продаваемых под торговыми марками РОУЭЕКГЕСТ™ и В1О.ГЕСТ™.

Способы получения лекарственных форм хорошо известны в данной области техники и описаны. например. в источнике Веттд!оп: ТЬе 8аепсе и Ргасбсе оГ РЬагтасу. Маск РиЬЬкЫпд Сотрапу. Еак!оп. Ра.. 20'¹' еббюп. 18В№ 0683306472 (2000). Композиции и агенты. предложенные в настоящем описании. могут вводиться в соответствии со способами настоящего изобретения в соответствии с терапевтически эффективным режимом дозирования. Количество и частота введения дозы выбираются для достижения эффективного уровня агента при отсутствии неблагоприятного эффекта. Эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению зависит от пути введения. типа теплокровного животного. подвергаемого лечению. и физических характеристик конкретного рассматриваемого теплокровного животного. Указанные факторы и их соотношение для определения указанного количества хорошо известны квалифицированным практикам в области медицины. Указанное количество и способ введения могут быть оптимизированы для достижения оптимальной эффективности. но зависят от таких факторов. как масса тела. диета. сопутствующее лечение и другие факторы. которые очевидны специалистам в области медицины.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения количество вводимой композиции или агента в целом варьирует от примерно 0.1 до примерно 100 мг/кг/день и. как правило. от примерно 0.1 до 10 мг/кг при пероральном или внутривенном введении. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения доза составляет 5 или 7.5 мг/кг. Согласно различным вариантам реализации изобретения доза составляет примерно 50-2500. 100-2500. 300-1800 или 500-1800 мг/день. Согласно одному варианту реализации изобретения доза составляет примерно 100-600 мг/день. Согласно другому варианту реализации изобретения доза составляет примерно 300-1200 мг/день. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в дозе 100. 240. 300. 600. 1000. 1200 или 1800 мг/день. в одной или более доз в день (т. е. когда комбинированные дозы достигают желательной суточной дозы). Согласно связанным вариантам реализации изобретения доза составляет 100. 150. 240. 300. 500 или 600 мг два раза в день. Согласно различным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в виде одной или нескольких доз. Исходная доза и последующие дозы могут быть одинаковыми или разными.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в одной дозе. составляющей 0.1-10 или 0.5-5 мг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в дозе 0.1-50. 0.5-20 или 5-20 мг/кг/день.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят перорально или внутривенно. например. путем инфузии в течение периода времени. составляющего. например. примерно от 10 до 90 мин. Согласно другим связанным вариантам реализации изобретения композицию

- 86 030461 или агент вводят путем непрерывной инфузии. например. в дозе между от примерно 0.1 до примерно 10 мг/кг/ч в течение периода времени. Несмотря на то что период времени может варьировать. согласно конкретным вариантам реализации изобретения период времени может составлять между примерно 10 мин и примерно 24 ч или между примерно 10 мин и примерно тремя днями.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество. достаточное для достижения общей концентрации композиции или агента в плазме крови субъекта при С_тах. составляющей примерно 0.1-20 мкг/мл или примерно 0.3-20 мкг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения пероральная доза представляет собой количество. достаточное для достижения концентрации в плазме крови (0^). примерно 0.1-5 мкг/мл или примерно 0.3-3 мкг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения внутривенная доза представляет собой количество. достаточное для достижения концентрации в плазме крови (С_тах). примерно 1-10 мкг/мл или примерно 2-6 мкг/мл. Согласно связанным вариантам реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации меньше примерно 20 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии меньше примерно 20 мкг/мл. Согласно другому варианту реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации менее примерно 10 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии меньше примерно 10 мкг/мл.

Согласно другому варианту реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации от примерно 1 нг/мл до примерно 10 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии между примерно 1 нг/мл и примерно 10 мкг/мл. Согласно одному варианту реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации в диапазоне от примерно 0.3 до примерно 3 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии примерно 0.3-3 мкг/мл.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в количестве. достаточном для достижения у млекопитающего концентрации в плазме крови. соответствующей средней минимальной концентрации в диапазоне от примерно 1 нг/мл и до примерно 10 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии от примерно 1 нг/мл и до примерно 10 мкг/мл. Согласно связанным вариантам реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови млекопитающего соответствует средней минимальной концентрации в диапазоне от примерно 0.3 до примерно 3 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии от примерно 0.3 до примерно 3 мкг/мл.

Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения эффективное количество композиции или агента или концентрация в плазме крови указанной композиции или агента достигаются или поддерживаются. например. в течение по меньшей мере 15 мин. по меньшей мере 30 мин. по меньшей мере 45 мин. по меньшей мере 60 мин. по меньшей мере 90 мин. по меньшей мере 2 ч. по меньшей мере 3 ч. по меньшей мере 4 ч. по меньшей мере 8 ч. по меньшей мере 12 ч. по меньшей мере 24 ч. по меньшей мере 48 ч. по меньшей мере 3 дней. по меньшей мере 4 дней. по меньшей мере 5 дней. по меньшей мере 6 дней. по меньшей мере одной недели. по меньшей мере 2 недель. по меньшей мере 1 месяца. по меньшей мере 2 месяцев. по меньшей мере 4 месяцев. по меньшей мере 6 месяцев. по меньшей мере 1 года. по меньшей мере 2 лет или более чем 2 лет.

Согласно конкретным основанным на полипептидах вариантам реализации изобретения количество вводимого полипептида. как правило. лежит в диапазоне от примерно 0.1 мкг/кг до примерно 0.1-50 мг/кг массы тела пациента. В зависимости от типа и тяжести заболевания от примерно 0.1 мкг/кг до примерно 0.1-50 мг/кг массы тела (например. примерно 0.1-15 мг/кг/доза) полипептида может являться начальной предполагаемой дозой для введения пациенту как путем. например. одного или более отдельных введений. так и путем непрерывной инфузии. Например. режим дозирования может включать введение начальной нагрузочной дозы. составляющей примерно 4 мг/кг. с последующим поддержанием в течение недели дозы. составляющей примерно 2 мг/кг полипептида. или примерно половины нагрузочной дозы. Однако можно применять другие режимы дозирования. Типичная суточная доза может варьировать от примерно 0.1 мкг/кг до примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от факторов. перечисленных выше. В случае повторных введений в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния лечение продолжают до достижения желаемого подавления симптомов заболевания.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения в плазме крови достигается уровень эффективной дозы или средняя минимальная концентрация композиции или агента. описанного в настоящем документе. Указанный уровень с легкостью можно определить с использованием стандартных методов.

Согласно другим аспектам вариантов реализации настоящего изобретения предложены наборы. содержащие один или более контейнеров. наполненных одним или более из полипептидов. полинуклеотидов. антител. многокомпонентных комплексов. их композиций и т. д.. согласно изобретению. как описано в настоящем документе. Наборы могут включать письменные инструкции по применению указанных композиций (например. для модуляции клеточной передачи сигнала. ангиогенеза. рака. воспалительных состояний. диагностирования и т.д.).

Наборы в настоящем описании также могут содержать один или более дополнительных терапевти- 87 030461 ческих агентов или других компонентов, подходящих или желательных для подвергаемого лечению симптома или для желаемого диагностического применения. Дополнительный терапевтический агент может, при желании, содержаться во втором контейнере. Примеры дополнительных терапевтических агентов включают, но не ограничиваются перечисленными, антинеопластические агенты, противовоспалительные агенты, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, ангиогенные агенты и т.д.

Наборы в настоящем описании могут также включать один или более шприцов или других компонентов, необходимых или желательных для облегчения предполагаемого способа доставки (например, стентов, имплантируемых депо и т.д.).

Все публикации, патентные заявки и выданные патенты, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы было конкретно указано, что каждая указанная публикация, патентная заявка или выданный патент отдельно включена посредством ссылки.

Хотя раскрытое выше изобретение для его лучшего понимания было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров, специалистам в данной области техники очевидно, что в свете идеи настоящего изобретения возможны конкретные изменения и модификации в пределах сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры приведены исключительно в качестве иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение. Специалисты в данной области техники с легкостью определят различные не критичные параметры, которые могут быть изменены или модифицированы для получения, по существу, таких же результатов.

XIV. Примеры.

Общие методы, если иное не указано в приведенных ниже примерах, следующие общие методы оптимизации генов, низкопроизводительной или более масштабной экспрессии белков, очистки белков, анализа транскрипционной активности и скрининга использовали для создания и описания полипептидов ААК8, описанных в приведенных ниже примерах.

Синтез генов и клонирование в векторах экспрессии.

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие содержащие эпитопные метки варианты полипептидов ААК8, были кодон-оптимизированы и клонированы в бактериальных векторах экспрессии с использованием способов, перечисленных ниже.

Согласно способу (1) кодон-оптимизированную ДНК Κοοίί (Же1сй с1 а1., !Ι.οδ ΟΝΗ, 4(9):е7007 άο^:10,1371/^οи^ηа1.ροηе, 0007002), кодирующую каждый полипептид АА^, синтезировали с помощью ДНК 2,0 (Менло-Парк, СА) и синтезировали два варианта каждого полипептида АА^, содержащие Ν-концевую или С-концевую комбинированную эпитопную метку, содержащую как гистидиновый маркер, так и эпитопную метку ν5.

ДНК, кодирующая меченые по Ν-концу полипептиды АА^, синтезировали с 5'-удлинением, кодирующим в направлении 5'-3' сайт связывания рибосом (гЪк (подчеркнутый ниже)), сайт рестрикции Ше1, метку, содержащую шесть гистидинов, и эпитопную метку ν5, (АССАС С ТААААСАТАТ ССАТ САТ САТ САТ САТ С АС С С ТАЛ СССТАТСССТААСССТТТССТСССТСТССАТТСТАСС) (δΗΟ ΙΌ ΝΟ: 1), который слит в рамке с предсказанной открытой рамкой считывания полипептида АА1^. В случаях, когда полипептид содержит предсказанный нативным инициирующий остаток метионина (АТО) или первый аминокислотный остаток предсказанного полипептида представляет собой Мс1, указанный остаток удаляли. На конец предсказанной открытой рамки считывания полипептида добавляли два стоп-кодона и сайт Х1ю1 (ТААТОАСТСОАО) (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 2).

ДНК, кодирующую меченые по С-концу полипептиды АА^, синтезировали с 5'-удлинением, кодирующим гЪк (подчеркнутый ниже) и сайт рестрикции Ше1, который либо повторяет предсказанный нативный старт-кодон для полипептида АА^, либо встраивает АТО в рамке с открытой рамкой считывания предсказанного полипептида ААК5, (ассасатаааасататс ) (§е(^) цд ΝΟ: 3). Согласно различным вариантам реализации изобретения сайт связывания рибосом может содержать последовательности АООАООТААААСАТ (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 4), АООАОАТААААСАТ (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 5) или ОААООАОАТАТАСАТ (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 6). На 3'-конце открытой рамки считывания предсказанного полипептида АА^ синтезировали 3'-удлинение, кодирующее в направлении 5'-3' эпитопную метку ν5, маркер, содержащий шесть гистидинов, два стоп-кодона и сайт ХМ, (ООТААОССТАТСССТААСССТСТССТСООТСТСОАТТСТАСОСАССАССАТСАТСАССАТТААТОАСТСОАО) (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 7), который слит в рамке с предсказанной открытой рамкой считывания полипептида АА^. Если полипептид АА^ включал предсказанный нативный стоп-кодон, указанный кодон удаляли.

Синтезированные последовательности ДНК, кодирующие полипептиды АА^, субклонировали в векторе р1Ехрге88 411 (ДНК 2,0). После секвенирования для подтверждения синтеза правильного продукта векторы экспрессии трансформировали в бактерии для экспрессии белка, как описано более подробно ниже. В способе (2), кодон-оптимизированную ДНК Е.сο1^ (Ε^тο1аеνа ΜΌ (2001), Сигг. Ιδδ. Μοί. Βίοί. 3 (4) 91-7), кодирующую каждый полипептид АА^, синтезировали с помощью ОЕНЕЖК (Саус-Плейнфилд, Нью-Джерси). Каждую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид АА^, синтезировали с короткими 5'- и 3'-удлинениями, содержащими уникальные сайты рест- 88 030461 рикции для последующего клонирования.

В частности, на 5'-конце предсказанной открытой рамки считывания встраивали сайт рестрикции ΒатΗI. В случаях, когда полипептид ΑΑΚδ содержал предсказанный нативный инициирующий остаток метионина АТС) или первый аминокислотный остаток предсказанного полипептида ΑΑΚδ представлял собой Ме!, указанный остаток удаляли. Кроме того, на 3'-конце предсказанной открытой рамки считывания встраивали сайт рестрикции Χ1οΙ. В случаях, когда полипептид ΑΑΚδ содержал предсказанный нативный стоп-кодон, указанный стоп-кодон удаляли.

После расщепления рестриктазами полученные последовательности ДНК субклонировали в модифицированных векторах рЕТ-24Ь (ЕМО, С|ЬЬ81оип, N1), содержащих либо Ν-концевую (рЕТ24Ь N-6XΗ^8/V5), либо С-концевую (рЕТ24Ь С-У5/6хН18) комбинированную эпитопную метку, содержащую как шесть гистидинов, так и эпитопную метку У5 (вектор, модифицированный с помощью СΕNΕ\VIΖ. (Саус-Плейнфилд, Нью-Джерси).

После расщепления рестриктазами и клонирования ДНК, кодирующую Ν-меченый полипептид ΑΑΚδ, клонировали в Ν-меченом векторе (рЕТ24Ь Ю6хН18/У5), который содержит 5' последовательность ДНК, кодирующую шесть гистидинов и эпитопную метку У5, (СΑТΑТССΑТСΑТСΑТСΑТСΑТСΑСССТΑΑСССТΑТСССТΑΑСССТСТССТСССТСТССΑТТСТΑССССΑТСС) (^ЕО ΙΌ ΝΟ: 8), в рамке с инициирующим кодоном АТС), встроенным в сайт рестрикции №е1. Указанное 5'-удлинение слито с открытой рамкой считывания предсказанного полипептида ΑΑΚδ с помощью короткого линкера, состоящего из двух аминокислот, (Όδ).

На 3'-конце предсказанной открытой рамки считывания ДНК, кодирующая Ν-меченый полипептид ΑΑΚδ, содержит последовательность ДНК, кодирующую участок из двух аминокислот (ЬЕ), за которым следуют два терминирующих кодона (СТССΑСТΑΑТСΑ) (ЪЕО ГО ΝΟ: 9).

После рескрикционного расщепления и клонирования ДНК, кодирующая С-меченый полипептид ΑΑΚδ, клонировали в С-меченном векторе (рЕТ24Ь С-У5/6XΗ^8), содержащем 5' последовательность, кодирующую инициирующий кодон АТС), встроенный в сайт рестрикции Шс1, который слит с открытой рамки считывания предсказанного полипептида ΑΑΚδ с помощью короткого линкера, состоящего из двух аминокислот, (08), (СΑТΑТСССΑТСС) АУ) ΙΌ ΝΟ: 10).

На 3'-конце предсказанной открытой рамки считывания кодирующая С-меченый полипептид ΑΑΚδ ДНК содержит 3'-последовательность ДНК, кодирующую короткий линкер, состоящий из двух аминокислот (ЬЕ), за которым следует эпитопная метка У5, за которой следуют шесть гистидинов и два стопкодона, СТССΑСССТΑΑСССТΑТСССТΑΑСССТСТССТСССТСТССΑТТСТΑСССΑССΑССΑССΑССΑССΑСТΑΑТСΑ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11).

Экспрессия, очистка и биофизические характеристики полипептида ΑΑΚδ.

6хН18-меченые полипептиды ΑΑΚδ экспрессируют в бактериях в среднепроизводительном формате и/или в культуре большего масштаба во флаконах в зависимости от требуемого количества белка. Полипептиды ΑΑΚδ очищают с помощью аффинной и ионообменной хроматографии, как описано ниже и как специально указано для конкретных экспериментов.

Бактериальные культуры.

100 нг вектора экспрессии, содержащего кодон-оптимизированную ДНК, кодирующую каждый полипептид ΑΑΚδ (как описано выше), трансформировали в компетентные клетки бактерии Е.соН ΒΕ21 ЩЕ3) (ЕМО сЬет1са18, кат. № 69450) при 42°С в течение 30 с в планшетах для ПЦР. Также оценивали штаммы С41 ЩЕ3) (Ьиадеи, кат. № 60442), НМ8174 (ЮЕ3) (ЕМО сЬетюаН, кат. № 69453) и ΟΑηιηί 2 (ЮЕ3) (ЕМО сЬетка18, кат. № 71345). Планшеты помещали на лед на 2 мин и добавляли 100 мкл среды δΟС с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37°С. В каждую лунку 24-луночного термоблока ^адеи, кат. № 19583) добавляли 5 мл автоиндукционной среды (ЕМО сЬетка18, кат. № 71491) с добавлением канамицина (100 мкг/мл). Реагенты для трансформации добавляли в отдельные лунки, термоблок запечатывали с помощью клейкой пленки (У\УК кат. № 60941-078) и инкубировали в течение ночи при 250 об/мин на шейкере при 37°С. При использовании низкотемпературных условий (25°С) инкубацию осуществляли в течение 48 ч.

Для более масштабной экспрессии 200 мл автоиндукционной среды с добавлением канамицина (100 мкг/мл) добавляли во флаконы на 500 мл Ег1ептеуег с вентиляционными крышками (Согшид, кат. № 431401). Реагенты для трансформации добавляли в отдельные флаконы и инкубировали в течение 30 ч при 250 об/мин на шейкере при 37°С. Для объема 1 л использовали среду ТВ (ΒΌ Β^ο8с^еηсе8, кат. № 243820) вместо автоиндукционной среды и инициировали 4-часовую индукцию (0,5 мМ ГРТС) при достижении культурой 0,6-1 ΟΌ₆₀₀.

Изолирование белка.

После того как культура достигала стационарной фазы (как правило, ΟΌ₆₀₀ 3-6), термоблоки центрифугировали при 3600хд в течение 10 мин. Среду осторожно отбирали и термоблоки замораживали при -80 или -20°С в течение 10 мин. Затем указанным термоблокам позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую лунку добавляли 1 мл лизирующего буфера (100 мл БидЬиШег с добавлением 200 мкл лизоназы (ЕМО сЬетюак, кат. № 71370) и полную смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА сотр1е!е ιηίηί Ε^ТΑ-Г^ее (ЕосЬе, кат. № 11836170001)). Осадки ресуспендировали путем многократно- 89 030461 го пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, и переносили в пробирки Эппендорфа, с последующей инкубацией в течение 10-20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 16000хд в течение 10 мин при 4°С, лизаты наносили на 96-луночный планшет ТигЬоРШег 96, включенный в набор N^-NТΛ 8ирсгГ1оу 96 ВюРоЬо! Оаден кат. № 969261), и центрифугировали при 500хд в течение 5-10 мин.

Для более масштабной экспрессии культуру в фазе стационарного роста переносили в колбы на 500 мл и центрифугировали при 6000хд в течение 10 мин. Среду сливали и осадок хранили при -80 или -20°С до дальнейшей обработки. Затем осадку позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую колбу добавляли 20 мл лизирующего буфера. Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, с последующей инкубацией в течение 20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 10000хд в течение 30 мин при 4°С лизаты переносили в чистые пробирки или колбы. Если следовые количества обломков клеток оставались после переноса, образец центрифугировали повторно или пропускали через целлюлозноацетатную мембрану, 0,45 мкм (Согтпд, кат. № 430314), для дополнительной очистки. Для объема 1 л использовали микрофлюидизацию при 14000 фунтов/кв. дюйм (Мюгойшйюв, кат. № 110Ь) вместо лизирующего буфера.

Аффинная очистка.

96-луночный планшет ОМННег покрывали 200 мкл суспензии N^-NТΛ 8ирсгйоу, включенной в набор №-№1^. 8ирсгГ1оу 96 ВюВоЬо! и ионообменную смолу уравновешивали путем добавления 600 мкл связывающего буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия и 10 мМ имидазол, рН 7,5). Вакуумировали (-15 дюймов рт. ст.) до тех пор, пока весь буфер не проходил через смолу. Очищенные клеточные лизаты из предварительного этапа затем наносили на 96-луночный планшет ОНЕШег® и позволяли связываться в течение 5 мин. Вакуумировали (-3 дюймов рт. ст.) в течение приблизительно 5 мин до тех пор, пока все образцы не проходили через смолу. Указанную смолу затем промывали 1 мл связывающего буфера с последующими двумя промывками 1 мл связывающего буфера, содержащего 0,1% Тритон Х100. Смолу затем промывали 10 раз 1 мл связывающего буфера без Тритона Х-100. Связанные 6\Швмеченые полипептиды ΛΛΚδ вымывали 450 мкл элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия и 500 мМ имидазол, рН 7,5) и хранили при 4°С.

Для более масштабной экспрессии на пустую одноразовую колонку Ρо1у-Ρ^ер (Вю-Иай, кат. № 731-1550) наносили 1 мл суспензии Μ-ΚΙΆ 8ирсгПоу Оаден кат. № 30450) и 0,5 мл ионообменной смолы уравновешивали путем добавления 5 мл связывающего буфера. Затем на колонку наносили очищенный клеточный лизат с предыдущего этапа и пропускали под действием силы тяжести. Смолу сначала промывали 50 мл связывающего буфера вместе с 0,1% Тритоном Х-100, затем промывали 50 мл связывающего буфера без Тритона Х-100. Связавшиеся 6\Н1в-меченые полипептиды ΛΛΚδ вымывали с помощью 2 мл элюирующего буфера и хранили при 4°С.

Этапы обессоливания и доочистки.

Для полипептидов ΛΛΚδ с молекулярной массой >10 кДа мембрану Отеда 10К 96-луночного фильтрационного планшета Λ^Ρι^ ^аП, кат. № 5034) промывали 20 мкл 1Х ΡВδ и планшет помещали на вакуумный коллектор (>10 дюймов рт. ст.) до полного прохождения жидкости. Элюаты из предыдущего этапа (N^-NТΛ) распределяли в каждую лунку и вакуумировали до полного прохождения жидкости. Указанные этапы повторяли до тех пор, пока весь объем элюата (450 мкл) не был обработан. Полипептиды ΛΛΚδ восстанавливали путем добавления в каждую лунку 180 мкл 1Х ΡВδ, рН 7,4, осторожно пипетируя 10 раз, и затем переносили в чистый термоблок. Указанный этап повторяли для получения общего объема 360 мкл/лунку и термоблок хранили при 4°С. Для полипептидов ΛΛΚδ с молекулярной массой <10 кДа, элюаты из N^-NТΛ наносили на центрифужный фильтр Λт^соη иИга-15 с мембраной и1!гасе1-3 (Мййроге, кат. № иРС900308), с последующим добавлением 10 мл 1Х ΡВδ и центрифугированием при 3600хд в течение 10-30 мин до получения объема менее чем 360 мкл. Образцы восстанавливали и добавляли 1Х ΡВδ с получением конечного объема 360 мкл.

Для удаления эндотоксинов фильтровальный планшет Λ^Ρι^ Λйνаηсе с мембраной Мив!апд О (Ρа11, кат. № 8171) промывали 300 мкл 1Х ΡВδ и центрифугировали при 1000хд в течение 5 мин для удаления буфера. В указанный фильтровальный планшет добавляли обессоленные полипептиды ΛΛΚδ (360 мкл/лунку) и инкубировали на шейкере в течение 5-10 мин. Планшет затем центрифугировали при 1000хд в течение 5-10 мин и прошедшие через фильтр фракции, содержащие полипептиды ΛΛΚδ, собирали и хранили при 4°С.

Для более масштабной экспрессии элюаты из N^-NТΛ наносили на центрифужный фильтр Λт^соη и1!га-15 с мембраной иИгасе1-3 или и1!гасе1-10 (МННроге, кат. № ОТС900308 или иРС901008), в зависимости от молекулярной массы полипептида ΛΛΚδ, и затем центрифугировали при 3600хд в течение 10-30 мин до уменьшения объема до 250 мкл. Образцы перемешивали в 10 мл 1Х ΡВδ, рН 7,4, и снова центрифугировали при 3600хд в течение 10-30 мин до получения объема примерно 250 мкл. Указанный этап повторяли еще один раз, супернатанты восстанавливали и добавляли 1Х ΡВδ до получения конечного объема 1,5 мл. Для объема 1 л элюат N^-NТΛ диализовали против 1Х ΡВδ в течение ночи вместо

- 90 030461 использования фильтрования.

Для удаления эндотоксинов сильную анионообменную мембрану 8аг1оЬиЛ 05 (8агЮгшк, кат. № 05Р) промывали 1 мл 1Х РВ8 и через указанную мембрану медленно пропускали полипептиды ААК8 с использованием пластикового шприца. Прошедшую через мембрану фракцию, содержащую полипептиды ААК8, собирали в 96-луночный термоблок с глубокими лунками, который запечатывали и хранили при 4°С.

6хН1к-меченые полипептиды ААК8, экспрессируемые в бактериях и обнаруженные в тельцах включения, очищали с использованием аффинной хроматографии и ряда этапов повторной укладки, как описано ниже.

Бактериальные культуры.

100 нг плазмид, кодирующих каждый полипептид ААК8, трансформировали в компетентные клетки бактерии Е.соЬ В^21(^Ε3) (ЪМЭ сЬетюа1к, кат. № 69450) или С41(^Ε3) (Ьиадеи, кат. № 60442) при 42°С в течение 30 с в ПЦР-планшетах. Указанные планшеты помещали на лед на 2 мин и добавляли 100 мкл среды 80С с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37°С. В каждую лунку 24-луночного термоблока (Цгадеи, кат. № 19583) добавляли 5 мл автоиндукционной среды (ЪМЭ сЬетка1к, кат. № 71491) с добавлением канамицина (100 мкг/мл). В отдельные лунки добавляли реагенты для трансформаци, термоблок запечатывали с помощью клейкой пленки (УАК, кат. № 60941-078) и инкубировали в течение ночи при 250 об/мин на шейкере при 37°С.

Для более масштабной экспрессии добавляли 200 мл автоиндукционной среды с добавлением канамицина (100 мкг/мл) во флаконы Ε^1еишеуе^ на 500 мл с вентиляционными крышками (Согтид, кат. № 431401). Реагенты для трансформации добавляли в отдельные флаконы и инкубировали в течение 30 ч при 250 об/мин на шейкере при 37°С. Для объема 1 л использовали среду ТВ (ВО Вюкаеисек, кат. № 243820) вместо автоиндукционной среды и инициировали 4-часовую индукцию (0,5 мМ ]РТС) при достижении культурой 0,6-1 ΟΌ₆₀₀.

Изолирование.

После достижения культурами фазы стационарного роста (как правило, ΟΌ₆₀₀ 3-6) термоблоки центрифугировали при 3600хд в течение 10 мин. Среду осторожно отбирали и термоблоки замораживали при -80 или -20°С в течение 10 мин. Затем указанным термоблокам позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую лунку добавляли 1 мл лизирующего буфера (100 мл ВидЬик!ег, с добавлением 200 мкл лизоназы (ЪМЭ сЬет1са1к, кат. № 71370) и полную смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА сотр1е!е т1т Ε^ТΑ-Е^ее (КосЬе, кат. № 11836170001)). Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, и переносили в пробирки Эппендорфа, с последующей инкубацией в течение 10-20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 16000хд в течение 10 мин при 4°С растворимые лизаты удаляли и тельца включения тщательно ресуспендировали в денатурирующем связывающем буфере (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 6 М гидрохлорид гуанидина, 10 мМ имидазол, рН 7,5). Образцы центрифугировали при 16000хд в течение 10 мин и супернатанты наносили на 96-луночный планшет ТигЬоРШег, включенный в набор Νΐ-ΝΊΆ 8ирегГ1оу 96 ВюКоЬо! (Цгадеи, кат. № 969261), с последующим центрифугированием при 500хд в течение 5-10 мин. Фильтраты собирали в чистый 96-луночный термоблок (Сгешег, кат. № 780286).

Для более масштабной экспрессии культуру в фазе стационарного роста переносили в колбы на 500 мл и центрифугировали при 6000хд в течение 10 мин. Среду сливали и осадок хранили при -80 или -20°С до дальнейшей обработки. Затем осадку позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую колбу добавляли 20 мл лизирующего буфера. Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, с последующей инкубацией в течение 20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 10000хд в течение 30 мин при 4°С растворимые лизаты удаляли и нерастворимые тельца включения тщательно ресуспендировали в денатурирующем связывающем буфере. Для объема 1 л использовали микрофлюидизацию при 14000 фунтов/кв. дюйм (М^с^οЕ1и^ά^ск, кат. № 110Ь) вместо использования лизирующего буфера. После ресуспендирования телец включения проводили этап центрифугирования при 10000хд в течение 30 мин с последующим фильтрованием через 0,45 мкм мембрану РΕ8 (УАК, кат. № 87006).

Аффинная очистка.

На 96-луночный планшет ОШРШег наносили 200 мкл суспензии №-№ТА 8ирегГ1оу, включенной в набор №-№ТА 8ирегГ1оу 96 ВюКоЬо!, и ионообменную смолу уравновешивали путем добавления 600 мкл денатурирующего связывающего буфера (см. выше). Вакуумировали (-15 дюймов рт. ст.) до тех пор, пока весь буфер не проходил через смолу. Очищенные денатурированные образцы из предыдущего этапа затем наносили на 96-луночный планшет Ц^РЬ^® и позволяли связываться в течение 5 мин. Вакуумировали (приблизительно 3 дюйма рт. ст.) в течение приблизительно 5 мин до тех пор, пока все образцы не проходили через смолу. Указанную смолу затем промывали 1 мл денатурирующего связывающего буфера с последующими пятью промывками 1 мл денатурирующего связывающего буфера, содержащего 0,1% Тритон Х-100. Затем смолу промывали 15 раз 1 мл денатурирующего связывающего буфе- 91 030461 ра без Тритона Х-100. Связавшиеся 6хШк-меченые полипептиды ААК8 затем вымывали с помощью 450 мкл денатурирующего элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 6 М гидрохлорид гуанидина и 500 мМ имидазол, рН 7,5) и хранили при 4°С.

Для более масштабной экспрессии на пустую одноразовую колонку Ρο1у-Ρ^еρ (Βίο-Каб, кат. № 731-1550) наносили 1 мл суспензии Νί-ΝΤΆ 8иρе^Г1ογ (О1адец кат. № 30450) и 0,5 мл смолы уравновешивали путем добавления 5 мл денатурирующего связывающего буфера (см. выше). Затем на колонку наносили денатурированные тельца включения из предыдущего этапа и позволяли проходить под действием силы тяжести. Смолу сначала промывали 50 мл денатурирующего связывающего буфера с 0,1% Тритоном Х-100, затем промывали 50 мл денатурирующего связывающего буфера без Тритона Х-100. Связавшиеся 6хШк-меченые полипептиды ААК8 вымывали с помощью 2 мл денатурирующего элюирующего буфера и хранили при 4°С.

Повторная укладка (рефолдинг).

Для полипептидов ААК8>10 кДа, мембрану Отеда 10К 96-луночных фильтрационных планшетов АсгоРгер (Ра11, кат. № 5034) промывали 20 мкл 1Χ РВ8 и планшет помещали на вакуумный коллектор (>10 дюймов рт. ст.) до полного прохождения жидкости. Элюаты из предыдущего этапа (Νί-ΝΤΆ) распределяли в каждую лунку и вакуумировали до полного прохождения жидкости. Указанные этапы повторяли до тех пор, пока общий объем элюата (450 мкл) не был обработан. Полипептиды ААК8 восстанавливали путем добавления в каждую лунку 200 мкл буфера для повторной укладки, содержащего 50 мМ Ττίδ, 250 мМ хлорид натрия, 10 мМ хлорид калия, 2 мМ хлорид магния, 2 мМ хлорид кальция, 400 мМ сахароза, 500 мМ аргинин, 1 мМ ΌΤΤ и 0,01% полисорбат 80, рН 7,4, осторожно пипетируя 10 раз, и затем переносили в чистый термоблок. Указанный этап повторяли для получения общего объема 400 мкл/лунку и термоблок помещали на шейкер на ночь при 4°С. Для полипептидов ААК8<10 кДа, элюаты из №-ЭТА наносили на центрифужный фильтр Ап^л И1!га-15 с мембраной И1!гасе1-3 (Μί11ίροΐΌ, кат. № ИЕС900308) с последующим добавлением 10 мл буфера для повторной укладки и центрифугированием при 3600хд в течение 10-30 мин до получения объема менее чем 400 мкл. Образцы восстанавливали и дополнительную порцию буфера для повторной укладки добавляли до получения конечного объема 400 мкл. Образцы переносили в 96-луночный термоблок, запечатывали пленкой и помещали на шейкер на ночь при 4°С.

Для более масштабных культур элюаты из №-№ГА наносили на центрифужный фильтр Атон И1!га-15 с мембраной ИИгасе1-3 или ИИгасе1-10 (Μί11ίροΐΌ, кат. № ИЕС900308 или ИЕС901008, в зависимости от молекулярной массы полипептида ААК8) и затем центрифугировали при 3600хд в течение 10-30 мин до уменьшения объема примерно до 500 мкл. Для олигопептидов ААК8 с ρΙ>7 образцы разбавляли в 20 раз в следующем буфере: 50 мМ ацетат натрия, 10 мМ хлорид натрия, 0,4 мМ хлорид калия, 1 мМ ЭДТА, 400 мМ сахароза, 500 мМ аргинин, 1 мМ ΌΤΤ и 0,01% полисорбат 80, рН 6,0. Для полипептидов ААК8 с ρΙ<7, образцы разбавляли в 20 раз в следующем буфере: 50 мМ Τήδ, 250 мМ хлорид натрия, 10 мМ хлорид калия, 2 мМ хлорид магния, 2 мМ хлорид кальция, 400 мМ сахароза, 500 мМ аргинин, 1 мМ ΌΤΤ и 0,01% полисорбат 80, рН 8,0. Образцы инкубировали на шейкере при 4°С в течение ночи.

Этапы обессоливания и доочистки.

После инкубации в течение ночи 96-луночный термоблок центрифугировали при 3600хд для удаления любых возможных агрегатов. Для супернатантов затем проводили смену буфера на 1Χ РВ8 (Ιηνίίτοдеа кат. № 10010). Для полипептидов ААК8>10 кДа мембрану Отеда 10К 96-луночного фильтрационного планшета АстоРш]} промывали 20 мкл 1Χ РВ8 и указанный планшет помещали на вакуумный коллектор (>10 дюймов рт. ст.) до полного прохождения жидкости. Образцы в буфере для повторной укладки распределяли в каждую лунку и вакуумировали до полного прохождения жидкости. Указанные этапы повторяли до тех пор, пока весь объем образца (400 мкл) не был обработан. Полипептиды ААК8 восстанавливали путем добавления 180 мкл 1Χ РВ8, рН 7,4, в каждую лунку, осторожно пипетируя 10 раз, и затем переносили в чистый термоблок. Указанный этап повторяли для получения общего объема 360 мкл на лунку и термоблок хранили при 4°С. Для полипептидов ААК8<10 кДа образцы, подвергнутые повторной укладке, наносили на центрифужный фильтр Ап^л иИга-15 с мембраной иШасе1-3 (Μί11ίροΐΌ, кат. № ИЕС900308) с последующим добавлением 10 мл 1Χ РВ8 и центрифугированием при 3600хд в течение 10-30 мин до получения объема менее чем 360 мкл. Образцы восстанавливали и добавляли 1Χ РВ8 до получения конечного объема 360 мкл.

Для удаления эндотоксинов фильтрационный планшет АстоРш]} Абνаηсе с мембраной Миδίаηд О (Ра11, кат. № 8171) промывали 300 мкл 1Χ РВ8 и центрифугировали при 1000хд в течение 5 мин для удаления буфера. В фильтрационный планшет добавляли полипептиды ААК8 (360 мкл/лунку) и инкубировали на шейкере в течение 5-10 мин. Планшет затем центрифугировали при 1000хд в течение 5-10 мин и фракции, прошедшие через фильтр, содержащие полипептиды ААК8, собирали и хранили при 4°С.

Для более масштабных культур после инкубации в течение ночи образцы, подвергнутые повторной укладке, центрифугировали при 10000хд в течение 10 мин для удаления любых нерастворимых агрегатов. Супернатант наносили на центрифужный фильтр Ап^л иШа-15 и центрифугировали при 3600хд

- 92 030461 до снижения объема до 250 мкл. Образцы перемешивали в 10 мл 1Х РВЗ и снова центрифугировали 3600хд в течение 10-30 мин до получения объема примерно 250 мкл. Необходимо отметить, что рН 1Х РВЗ подводили для его соответствия значению рН буфера для повторной укладки (рН 6,0 или 8,0). Указанный этап повторяли еще раз, супернатанты восстанавливали и добавляли 1Х РВЗ до получения конечного объема 1,5 мл. Для объема 1 л образцы, подвергнутые повторной укладке, диализовали против 1Х РВЗ в течение ночи, вместо использования фильтрации.

Для удаления эндотоксинов сильную анионообменную мембрану ЗайоЬшб О 5 (Зайогшк, кат. № О5Р) промывали 1 мл 1Х РВЗ и полипептиды ААКЗ медленно пропускали через указанную мембрану с использованием пластикового шприца. Прошедшую через мембрану фракцию, содержащую полипептиды ААКЗ, собирали в 96-луночный термоблок с глубокими лунками, который запечатывали и хранили при 4°С.

Биофизическая характеристика.

Все очищенные полипептиды ААКЗ исследовали с помощью ДСН-ПААГ, их концентрацию определяли на основе А₂₈₀ и рассчитывали коэффициент экстинкции (программа Рго!Рагат на сервере ЕхРАЗу). Уровень эндотоксина измеряли с помощью хромогенного анализа БАР ОСЬ-1000 (Ьоп/а. кат. № 50-648И) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Динамическое рассеяние света.

Прибор \УуаП ТесПпо1оду ЭупаРго 99 и датчик температуры (20°С) нагревали в течение 15 мин до начала эксперимента с последующим присоединением программного обеспечения к прибору Эу папист. Время экспозиции устанавливали на 10 с для множественной экспозиции и мощность лазера устанавливали на 100%. Кварцевые кюветы тщательно промывали деионизированной водой и метанолом до добавления белкового образца (15 мкл в концентрации приблизительно 1 мг/мл в РВЗ). Пузырьки воздуха удаляли путем простукивания кюветы до ее помещения в держатель непрозрачной стороной налево. Если интенсивность была слишком высокой (предупреждающее сообщение, показанное на экране), образец дополнительно разбавляли в РВЗ до снижения интенсивности до нормального диапазона. Полученные данные включали гидродинамический радиус, полидисперность, предсказанную среднюю молекулярную массу, процентную интенсивность и процентную массу.

Эксклюзионная хроматография.

Образец белка разбавляли до концентрации примерно 5-10 мг/мл в РВЗ до нанесения на пробоотборную петлю на 100 мкл на хроматограф для ЖЭХБ АКТА, Оепега1 Е1есПгс. Для разделения использовали колонку для эксклюзионной хроматографии Зирегбех 200 10/300 ОЬ (Оепега1 Е1ес1г1с, кат. № 17-5175-01). Колонку сначала уравновешивали с помощью 1,5 объемов колонки (Ον) 1Х буфера РВЗ с последующим вводом образца. Колонку промывали 1 Ον 1Х буфера РВЗ (изократический ток) с мониторингом абсорбции при 280 нм. Площадь пика интегрировали и рассчитывали процент с помощью программы Итсот. Элюирующий объем использовали для оценки молекулярной массы на основе сравнения с калибровочными наборами для гель-фильтрации (Оепега1 Е1ес1г1с, кат. № 28-4038-41 и 28-4038-42).

Восстановление белка после хранения в высокой концентрации.

мкл полипептидов ААКЗ, концентрированных до >10 мг/мл с использованием устройства для фильтрации Анисом иПга-15 (МПНроге, кат. № ИРС901024 или ИРС900324, в зависимости от молекулярной массы), переносили в чистую микроцентрифужную пробирку. Образец хранили при комнатной температуре в течение одной недели с последующим центрифугированием при 16000хд в течение 10 мин для осаждения любых преципитатов. Концентрацию супернатанта определяли с помощью анализа белка по Брэдфорду и сравнивали с концентрацией, измеренной до воздействия комнатной температуры в течение недели. Восстановление выражали в виде процента от исходной концентрации.

Характеристика полипептидов ААКЗ с помощью ЖХ/МС.

Очищенные полипептиды ААКЗ (1 мг/мл) разбавляли в отношении 1:10 в 0,1% муравьиной кислоте и 0,6 мкг белка наносили с помощью автоматического дозатора ЭШпех на капиллярную колонку С4. Указанную капиллярную колонку готовили путем вырезания 150 мм из трубки из кварцевого стекла (внешний диаметр, ΘΌ, - 0,36 мм, внутренний диаметр, ГО, - 0,1 мм, Ро1ут1сго ТесЬпо1од1ек, кат. № 2000023). Один конец капилляра вытягивали с помощью прибора для вытягивания Зи!ег 1п51гитеп1 Ьакег РШег и отрезали с помощью резца из кварцевого стекла с получением наконечника диаметром 5 мкм. Капилляр наполняли на длину 75 мм смолой С4 (5 мкм, 300 А, МюЬгот, кат. № РМ5/64300/00) с использованием баллона высокого давления. ЖХ/МС-анализ проводили на масс-спектрометре типа ионной ловушки ТерМоРЕНег ЬТЦ, сопряженного с системой для ЖХВД ЭШпех иШта!е 3000. Анализируемое вещество вымывали из колонки с использованием 35-минутного градиента 5-70% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте при скорости потока 0,9 мкл/мин. Масс-спектрометр ЬТЦ работал в режиме полного МС-сканирования (300-2,000 т/ζ) с напряжением при распылении 2,5 кВ.

Сбор данных и анализ.

Необработанные масс-спектрометрические данные хранили в файлах КАХУ, полученных с помощью программы ХСаПЬиг на масс-спектрометре ЬТЦ ХЬ. МС-спектры основных пиков, полученных с помощью хроматографа, далее анализировали с помощью деконволюционного алгоритма РгоМакк,

- 93 030461

ТерМоНвНет с получением молекулярных масс полипептидов ААК§.

Функциональный анализ полипептидов ААК§.

Анализ транскрипции.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Кроме традиционных направленной идентификации мишеней, недавно появившиеся геномные технологии обеспечивают важный подход к объяснению механизма действия полипептидов ААК§ и могут обеспечить непосредственное понимание терапевтического значения на начальных этапах поиска лекарственных средств. Для лучшего понимания возможной терапевтической применимости первичные клетки человека культивировали в присутствии полипептидов ААК§ и проводили оценку транскрипционной активности в два отдельных момента времени после инкубации с полипептидами ААК§.

Выбор типов клеток для анализа транскрипционной активности основан на плюрипотентных способностях представляющих интерес клеток и потенциальной возможности идентификации полипептидов ААК§ прямого терапевтического значения. Например, мезенхимальные стволовые клетки (М8С) могут дифференцироваться в остеогенном, адипогенном, хондрогенном, миокардиальном или нейтрональном направлении при подвержении воздействию специфических стимулов, что делает их привлекательным объектом для исследования потенциальной значимости полипептидов ААК§ для широкого диапазона типов клеток и заболеваний.

Кроме поддержания гематопоэтических клеток, клетки костного мозга также могут быть стимулированы к дифференцировке в стромальные клетки костного мозга в различные линии клеток соединительной ткани, такие как кость, хрящ и жир. Потенциальная способность мезенхимальных стволовых клеток человека (НМ8С) сохранять мультипотентность и интенсивно пролиферировать ίη νίίτο обеспечивает новые пути для клеточной терапии в восстановлении поврежденных или больных тканей. Недавние сообщения также указывают на то, что НМ8С способны становиться клетками, пересекающими границы зародышевого листка. Кроме способности дифференцироваться во многие линии мезодермального происхождения, указанные клетки также могут дифференцироваться в нейроны эктодермального происхождения и гепатоцит-подобные клетки эндодермального происхождения. Во время процесса дифференцировки, указанные клетки могут модифицировать паттерны экспрессии специфических транскриптов конкретных линий.

Соответственно, способность конкретных полипептидов ААК§ модулировать активность конкретных генов в клетках НМ8С зависимым от времени образом демонстрирует, что указанные белки играют потенциально важные роли в широком круге путей дифференцировки, а также в заболеваниях и нарушениях, вызванных дисфункцией или нарушением указанных процессов или соответствующего типа клеток. Более того, полипептиды ААК5, обладающие способностью модулировать транскрипцию генов в клетках М8С, имеют высокий потенциал терапевтического применения для обеспечения ίη νίίτο или ίη νίνο модуляцию гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза, так же как и в широком диапазоне нарушения и заболевания, включая, например, воспалительные ответы, аутоиммунные заболевания, рак, нейрональную дегенерацию, мышечную дистрофию, остеопороз и липодистрофию.

Человеческие клетки скелетной мускулатуры (Н§кМС) могут дифференцироваться с появлением актомиозиновых миофиламентов, указанные клетки использовались в исследовании генетических мышечных заболеваний, таких как злокачественная гипертермия 1. Клетки Н§кМС также потенциально можно использовать в качестве сердечного трансплантата, обеспечивающего восстановление поврежденной ткани сердца. В недавних экспериментах культивируемые человеческие клетки скелетной мускулатуры использовались в исследовании микрогравитации для изучения эффектов условий низкой гравитации на скелетные мышцы человека.

Соответственно, способность конкретных полипептидов ААК.8 модулировать активность конкретных генов в клетках Н§кМС зависимым от времени образом демонстрирует, что указанные белки играют потенциально важные роли в процессах миогенеза, так же как и заболеваниях и нарушениях, вызванных дисфункцией или нарушением указанных процессов, а также развития или метаболизма мышечных клеток. Соответственно, полипептиды ААК§, обладающие способностью модулировать транскрипцию генов в мышечных клетках, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая например, лечение метаболических заболеваний, кахексии, различных состояний мышечной атрофии, так же как и скелетно-мышечного заболеваний.

Методы.

Способность полипептидов ААК§ модулировать экспрессию генов оценивали с использованием высокоэффективного микроструйного метода количественной ПЦР в реальном времени (ИшФдт СотротаНоп). (См. Ρβΐτίν с( а1., (2010), ΡNА§ (άοί/10.1073/ρηαβ.1009320107) в стромальных клетках костного мозга человека (НМ8С) и человеческих скелетно-мышечных клетках (Н§кМС). В экспериментах, описанных в настоящем документе, человеческие Н§кМС (кат. № 150-05Г) и НМ8С (кат. № 49205Г) получали из Се11 АррНсаНощ. Клетки НМ8С замораживали на втором пассаже, и их можно культивировать и размножать до 10 удвоений популяции. В настоящем эксперименте использовали НМ8С на 6 пассаже. Человеческие клетки скелетной мускулатуры (Н§кМС) замораживали на втором пассаже, и их можно культивировать и размножать в течение по меньшей мере 15 удвоений популяции. В описанных в

- 94 030461 настоящем документе экспериментах использовали клетки ЖкМС на 6 пассаже после забора от здорового донора, представляющего собой человека.

В обоих случаях клетки высевали в концентрации 50000 клеток/мл в объеме 100 мкл ростовой среды и подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в концентрации 250 нМ или, как специально указано ниже, в течение 24 и 72 ч. Контроли включали среды для дифференцировки со стандартной смесью для обеспечения (1) адипогенеза, (2) остеогенеза, (3) хондрогенеза и (4) образования миотрубочек скелетной мускулатуры. Дополнительные контроли включали необработанные лунки, содержащие только ростовую среду. Для каждого контроля дифференцировки анализировали по две лунки. Контроли: все среды готовили с использованием среды 1)МНМ в качестве основной среды. Эксперименты проводили в соответствии со стандартными литературными данными, среды для дифференцировки получали из Се11 АррИса^^. В зависимости от поставщика, среды для дифференцировки содержали следующие добавки: смесь для скелетно-мышечной дифференцировки: эмбриональная бычья сыворотка, инсулин, глутамин, ΡΟΡ, ΕΟΡ; смесь для адипогенеза: инсулин, дексаметазон и ГВМХ; смесь для остеогенеза: эмбриональная бычья сыворотка, дексаметазон, аскорбат-2-фосфат, β-глицерофосфат; смесь для хондрогенеза: инсулин, аскорбат-2-фосфат и ТОР-βΕ

Стандартные протоколы для использования набора для экспрессии генов ΊΆ^^ΑΝ® Се118-ίο-СΤ™ ΑВI (АррНеН В^ο8у8ίет8, № АМ1728) использовали для лизиса клеток и сбора генетического материала. Смесь ΑВI Рге-Атр М1х (АррНеН В^ο8у8ίет8, Пет # 4391128) использовали для инициации преамплификации. Ген-специфичные праймеры создавали с использованием программы Рптег 3 и получали из ГОТ ίесΗπο1οд^е8. Чипы для анализа Р1шН1дт (Пет # ВМК-М-96,96) использовали для действительной количественной ПЦР с использованием стандартных нагрузочных реагентов Р1шН1дт и пипетирующих устройств. В приведенной ниже табл. Е1 перечислены проанализированные гены.

Таблица Ε1

Список генов, которые оценивали в анализе транскрипции

Составленный уникальный перчень	геЕзец пб	Полное название	Синонимы
АВСА1	ΝΜ 005502	АТФ-связывающая кассета, подсемейство А (АВС1), член 1	АВС-1 | АВС1 | СЕВР | ЕЪЛ4958 | НОЪОТ1 М6С164864 М6С165011|ТСО
АСТВ	ΝΜ_001101	актин, бета	Р31ТР5ВР1
АСТ61	ΝΜ_001614	актин, гамма 1	АСТ|АСТ6|ΏΕΝΑ2 0|ΏΕΝΑ2 6
АСУК2В	ΝΜ 001106	рецептор активина А, тип ΙΙΒ	АСТН11В АсЕН-ΙΙΒ М6С116908
АРОА1	ΝΜ_000039	аполипопротеин Α-Ι	М6С117399
ΑΗΝΤ	ΝΜ_178427	ядерный транслокатор арил- гидрокарбонового рецептора	Н1Е-1ЬеЕа|ΗΙΕ1Β|ΗΙΕ1ΒΕΤΑ ΤΑΝ60 |ЬНЬНе2
ΒΑϋ	ΝΜ_032989	ВСЪ2-ассоциированный агонист клеточной гибели	ВВС2|ВСЬ2Ь8
ВСЬ2	ΝΜ_000657	В-клеточный хронический лимфоидный лейкоз/лимфома 2	Вс1-2
ВМР2	ΝΜ_001200	костный морфогенетический белок 2	ВМР2А
ВМР4	ΝΜ_130851	костный морфогенетический белок 4	ВМР2В|ВМР2В1|МСОР36|ОЕС11| ΖΥΜΕ

- 95 030461

СЗАВ1	ΝΜ 004054	рецептор компонента комплемента За 1	ΑΖ3Β|СЗАВ ΗΝΕΑ609
САЗРЗ	ΝΜ 032991	каспаза 3, связанная с апоптозом цистеиновая пептидаза	СРР32|СРР32В|ЗСА-1
САД1	ΝΜ_001753	кавеолин 1,белок кавеол, 22 кДа	ВЗСЬЗ|ССЬЗ МЗТР085 νΐΡ21
СБН5	ΝΜ_001795	кадгерин 5, тип 2 (эндотелий сосудов)	7В4 | СШ44 | ЕЕЛ7376
СПАВ	ΝΜ 003879	САЗР8 и ΕΑΟϋ-подобный регулятор апоптоза	САЗН|САЗР8АР1|СЬАВР|Сазрег| ПАМЕ | ПАМЕЛ | ПАМЕ1 | ЕЫР | Ι-ЕЫСЕ ΜΒΙΤ | с-ЕЫР | с-ЕЫРЬ | с-ЕЫРВ| с-ЕЫРЗ
СОМР	ΝΜ_000095	олигомерный матриксный белок хряща	ΕΏΜ1|ΕΡϋΙ ΜΕϋ МСС131819 МСС149768|РЗАСН|ТНВ35
СЗЕ1	ΝΜ_172212	колониестимулирующий фактор 1 (макрофаги)	МСЗЕ МСС31930
СТСЕ	ΝΜ_001901	фактор роста соединительной ткани	ССД2 НС324 | Ι6ΕΒΡ8 МСС102839 N0112
ΟΤΝΝΒ1	ΝΜ 001904	катенин (кадгерин- ассоциированный белок), бета 1, 88 кДа	ΟΤΝΝΒ | ϋΚΕΖρδδ6Ώ02253 | ПД25606 | ЕЬЬ37923
ϋΑΑΜΙ	ΝΜ 014992	01з]аече11еб-ассоциированный активатор морфогенеза 1	ЕЬЬ41657|ΚΙΑΑ0666
ЕЪЫ	ΝΜ_001081755	эластин	ЕЬЬ38671|ЕЬЬ43523|ЗДАЗ| ИВЗИЗ
ΕΝΟ1	ΝΜ 001428	енолаза 1, (альфа)	ΕΝ0Π1 | МРВ1 | ΝΝΕ | РРН
ЕАВРЗ	ΝΜ_004102	белок, связывающий жирные кислоты, 3, мышцы и сердце (ингибитор роста, произошедший из молочной железы)	ЕАВР11|Н-ЕАВР Μϋ6Ι|О-ЕАВР
ВАК	ΝΜ 001199649	киназа фокальной адгезии	£ак1
ЕСЕ4	ΝΜ 002007	фактор роста фибробластов 4	НВ6Е-4|НЗТ|НЗТ-1|НЗТЕ1|К-ЕСЕ | ВЕСЕ
ПСЕ	ΝΜ 004469	с-£оз-индуцированный фатор роста (сосудистый фактор роста эндотелия ϋ)	ДЕСЕЛ | νΕ6Εϋ
ЕЬТ1	ΝΜ 002019	£шз-связанная тирозинкиназа 1 (сосудистый фактор роста эндотелия/рецептор фактора проницаемости сосудов)	ЕЬТ|УЕ6ЕВ1
ЕОХА1	ΝΜ 004496	ЕогкЬеаб-бокс А1	ΗΝΕ3Α М6С33105|ТСЕЗА

- 96 030461

6ΑΡΏΗ	ΝΜ 002046	глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа	33Ρϋ|6ΑΡΏ М6С88685
6ГАР	ΝΜ_002055	глиальный фибриллярный кислый белок	РР.Д45472
		Семейство переносчиков
ЗЬС2А4	ΝΜ 001042	растворенных веществ 2 (ускоряющий переносчик глюкозы), член 4	сьит4
ΗΑΝϋΙ	ΝΜ 004821	экспрессируемый производными сердца и нервного гребня 1	Нхб | ТЫпд1 | ЬНЪНа27 | еНапб
		индуцируемый гипоксией фактор
ΗΙΡ1Α	ΝΜ_181054	1, альфа субъединица (основной ЬеИх-1оор-]ае11х - транскрипционный фактор)	Н1Р-1а1£а|ΗΙΡ1|ΗΙΡ1- АЬРНА|МОР1|ΡΑ3Ό8|ЬНЬНе7 8
НК2	ΝΜ_000189	гексокиназа 2	ϋΚΓΖρ686М1669|ΗΚΙΙ|НХК2
НМ6В1	ΝΜ_002128	бокс группы белков с высокой подвижностью 1	ϋΚΡΖρδ86А04236|НМ61|НМСЗ| ЗВР-1
			РЬЙ39654|ΗΝΒ4|НМВ4а7|НМВ4а8|
ΗΝΡ4Α	ΝΜ_178850	ядерный фактор гепатоцитов 4, альфа	НМВ4а9| НЫГ4а1рЬа|ΜΟϋΥ|ΜΟϋΥΙ|ΝΗ2Α1| ΝΚ2Α21|ТСР|ТСР14
НРНТ1	ΝΜ 000194	Гипоксантинфосфорибозилтранс- фераза 1	НСРКТ|НРКТ
НЗРВ1	ΝΜ 001540	белок теплового шока 1, 27 кДа	СМТ2В ϋΚΡΖρ586Р1322|ΗΜΝ2Β| НЗ,76067| НЗР27|НЗР28|Нзр25|ЗКР27
1САМ1	ΝΜ_000201	молекула межклеточной адгезии 1	ВВ2|СО54|РЗ,58
ΙΡΝ3	ΝΜ 000619	интерферон, гамма	1РС|ΙΡΙ
1СР1	ΝΜ 001111285	инсулин-подобный фактор роста 1 (соматомедин С)	1СР-1|1СР1А 1СР1
1СР2	ΝΜ 001127598	инсулин-подобный фактор роста 2 (соматомедин А)	С11ог£43|РЬД22066|РЬД44734|ΙΝ3Ι3ΡΙ рр9974
Ι6ΡΒΡ3	ΝΜ 001013398	связывающий инсулин-подобный фактор роста белок 3	ВР-53|ΙΒΡ3
1СЕВР5	ΝΜ 000599	связывающий инсулин-подобный фактор роста белок 5	ΙΒΡ5
ΙΚΒΚΒ	ΝΜ_001556	ингибитор энхансера гена легкой цепи каппа в В- клетках, киназа бета	РЬД33771|РЬД36218|РЬД38368 |РЬД40509| ΪΚΚ-Ъеба ! ΙΚΚ2 | ΙΚΚΒ |МС-С1318 01 ΝΡΚΒΙΚΒ
1Ъ10	ΝΜ_000572	интерлейкин 10	С31Р| 1Ь-10 | 1Ы0А МСС126450 | МСС126451|ТС1Р

- 97 030461

Ю1В	ΝΜ 000576	интерлейкин 1, бета	1Ь-1 | 1Ы-ВЕТА 1ЫЕ2
ЮЗ	ΝΜ_000588	интерлейкин 3 (колониестимулирующий фактор, множественное распространение)	1Ь-3 МССЕ МСС79398|МСС79399| миью-сзв
Ю4	ΝΜ_172348	интерлейкин 4	ВС6Е-1|ВС6Е1|ВЗЕ1|1Ь-4|МСС79402
Ю5	ΝΜ 000879	интерлейкин 5 (колониестимулирующий фактор, эозинофил)	ΕϋΕ Ю-5|ТКЕ
Ю6Н	ΝΜ_181359	рецептор интерлейкина 6	СО12 6Ю-6К-1|Ю-6К-а1£а|Ю6КА| МСС104991
Ю8	ΝΜ_000584	интерлейкин 8	СХСЬ8|ССР-1|ССР1|ЬЕСТ| ьист| ΙΑΝΑΡ ΜϋΝΟΕ |ΜΟΝΑΡ|ΝΑΕ|ΝΑΡ-1|ΝΑΡ1
1ТСА5	ΝΜ 002205	интегрин, альфа 5 (рецептор фибронектина, альфа полипептид)	СБ4 9е|ΕΝΚΑ УЬА5А
ΚϋΚ	ΝΜ_002253	рецептор, содержащий киназный домен (рецепторная тирозинкиназа III типа)	СОЗ 0 9|ЕЬК1|УЕСЕК|УЕСЕК2
ЬЕР	ΝΜ_000230	лептин	ЕЬД94114|ОВ|ОВЗ
ЬРЬ	ΝΜ 000237	липопротеиновая липаза	НОЬС<211 | ΙΜΡϋ
МАРКИ	ΝΜ_002751	митоген-активируемая протеинкиназа 11	Р38В|Р38БЕТА2|РККМ11|ЗАРК2| 3ΑΡΚ2Β|р38-2|р38Ве£а
ММР1	ΝΜ 002421	матриксная металлопептидаза 1 (интерстициальная коллагеназа)	СЬС|СЬСБ
ММРЗ	ΝΜ_002422	матриксная металлопептидаза 3 (стромелизин 1, прожелатиназа)	СНО36 МСС126102|МСС126103| МСС126104| ММР-3|ЗЬ-1|3ΤΜΥ|3ΤΜΥ1|ЗТК1
ΜΥΗ1	ΝΜ 005963	миозин, тяжелая цепь 1, скелетно-мышечный, взрослый	МСС133384 ΜΥΗ3Α1|МУНа| МуНС-2Х/О|МуНС-2х
ΜΥΗ11	ΝΜ_022844	миозин, тяжелая цепь 11, гладкимышечный	ААТ4|ΏΚΕΖρ686Ώ10126 ΏΚΕΖρ686ϋ19237| ΕΑΑ4|ЕЬД35232|МСС126726|МСС32963| ЗМНС|ЗММНС
ΜΥΗ7	ΝΜ_000257	миозин, тяжелая цепь 7, сердечно-мышечный, бета	СМО13|СМН1|ΏΚΕΖρ451Ε047| МСС138376| МСС138378|ΜΡϋ1ΜΥΗΟΒ|3ΡΜϋ| 3ΡΜΜ
ΜΥΟΏ1	ΝΜ 002478	фактор миогенной дифференцировки 1	ΜΥΕ31ΜΥΟϋ|РимΙЬНЬНс!

- 98 030461

ΝΕΑΤΟ1	ΝΜ_172390	ядерный фактор активированных Т-клеток, цитоплазматический, кальцинейрин-зависимый 1	М6С138448ΙΝΕ-АТСΙΝΕΑΤ2|ΝΕΑΤο
ΝΕΑΤΟ2	ΝΜ 173091	ядерный фактор активированных Т-клеток, цитоплазматический, кальцинейрин-зависимый 2	ΝΕΑΤ1ΙΝΕΑΤΡ
ΝΓΚΒ1	ΝΜ_003998	энхансер гена ядерного фактора легкой цепи каппа полипептида в В-клетках 1	ϋΚΕΖρ686С01211|ЕВР-1|КВЕ1| МСС54151| ΝΕ-карра-В|ΝΕ-карраВ|ΝΕΚΒ-ρΙ05| ΝΕΚΒ-ρ50|ρΐ05|ρ50
N032	ΝΜ 000625	синтаза оксида азота 2, индуцибельная	ΗΕΡ-ΝΟ3!ΙΝΟ3!N03!ΝΟ32Α
ΝΟΤΟΗ1	ΝΜ_017617	побей 1	ΤΑΝ1|ΗΝ1
ΝΚ3Ο1	ΝΜ_001024094	ядерный рецептор подсемейства 3, группа С, член 1 (глюкокортикоидный рецептор)	СССР|ССН|ОН|СНЬ
ΝΗΡ2	ΝΜ 201279	нейропилин 2	М6С126574 ΝΡ2|ΝΡΝ2|ΡΗΟ2714| УЕСЕ165Н2
ΡΑΧ7	ΝΜ_013945	спаренный бокс 7	ЕЫ37460|ΗυΡΙ|ΡΑΧ7Β|ΚΜ32
ΡϋΟΕΒ	ΝΜ_033016	бета-полипептид фактора роста тромбоцитов (гомолог онкогена вируса саркомы обезьян (ν-	ЕЫГ12858 | ΡϋΟΕ2 | 313 | ЗЗУ| с-313
		313) )
ΡϋΚ4	ΝΜ 002612	киназа пируватдегидрогеназы, изозим 4	ЕЫ40832
ΡΙΑ.261Β	ΝΜ 000928	фосфолипаза А2, группа ΙΒ (поджелудочная железа)	М6С119834 М6С119835|РЬА2|РЬА2А| ΡΡ1Α.2
ΡΙΑΝ1	ΝΜ 002666	белок, ассоциированый с липидными каплями	перилипин
ΡΡΑΗ6	ΝΜ_138712	активируемый п р о л и ф е р а т о р о м пероксисом рецептор гамма	С1МТ1|С1М1|ΝΗ1Ο3|РРАНС1|РРАНС2| РРАНдатта
0ΑΗ3	ΝΜ 005051	глут аминил-т РНК-синт е таза	СЬИКЗ|ΡΗΟ2195
ΗΗΟΑ	ΝΜ 001664	семейство генов гомологии газ, член А	ΑΗΗ12|АННА ΗΗΟ12|ΗΗΟΗ12
КШХ1	ΝΜ 001754	гипб-связанный фактор транскрипции 1	АМЫ АМЫ-Ενΐ-Ι АМЬСК1 | СВЕА2 | Ενΐ-1|РЕВР2аВ
ΗΧΗΑ	ΝΜ 002957	ретиноидный рецептор X, альфа	ЕЫГ00280 | ЕЫГ00318 | ЕЫГ16020 | ЕЫГ16733 МСС102720|ΝΗ2Β1
3ΕΗΡΙΝΕ1	ΝΜ_001165413	ингибитор серпиновой пептидазы, ветвь Е (нексин, ингибитор активатора плазминогена 1 типа), член 1	ΡΑΙ|ΡΑΙ-1|ΡΑΙ1|Ρ1ΑΝΗ1
3ΜΑΡ2	ΝΜ_005901	семество ЗМАБ, член 2	σνίδ|σνΐ8-1ΜΑΡΗ2ΜΑΡΗ2ι М6С22139 М6С34440|ΗΜΑΡ-2|Η5ΜΑΡ2

- 99 030461

3ΜΑΏ4	ΝΜ 005359	семейство 3ΜΑϋ, член 4	ОРС4 | ЛР |ΜΑϋΗ4
ТЕНТ	ΝΜ_198255	теломераза-обратная транскриптаза	ЕЗТ2|ТС31|ТР2|ТНТ|НЕЗТ2
Т6ЕВ1	ΝΜ 000660	трансформирующий фактор роста, бета 1	СЕО|ϋΡϋΙ|ЬАР|ТСЕВ|ТСЕЬеЬа
ТСЕВЗ	ΝΜ_003239	трансформирующий фактор роста, бета 3	АРУМ | ЕЬЛ 6571 | ТСЕ-ЬеЬаЗ
ТНВ34	ΝΜ 003248	тромбоспондин 4	ТЗР4
ΤΝΕ	ΝΜ_000594	фактор некроза опухоли	ШЕ| ΤΝΕ-аЛа | ΤΝΕΑ| ΤΝΕ3Ε2
тивв	ΝΜ 178014	тубулин, бета	М40 МСС117247|МСС16435|ОК/ЗИ- с1,56|тивв1|тивв5
тивв1	ΝΜ 030773	тубулин, бета 1	бета-изоформа тубулина (1)
тивс1	ΝΜ_001070	тубулин, гамма 1	сср-1|тивс|тивссР1
УСАМ1	ΝΜ_080682	сосудистая молекула клеточной адгезии 1	С0Ю6 | ОКЕЬр779С2333 | ΙΝΟΑΜ-100 | МСС99561
УЕСЕА	ΝΜ 003376	сосудистый фактор роста эндотелия А	МСС70609 МУСО1|УЕСЕ|УРЕ
У1М	ΝΜ_003380	виментин	ЕЬЛ 6605
И13Р1	ΝΜ 080838	белок ТОГИ-индуцибельного сигнального пути 1	ΟΟΝ4|И13Р1с1И13РИ|И13Р1Ьс
ΜΝΤ1	ΝΜ_005430	семейство сайтов встраивания ММТУ м1пд1езз-типа, член 1	ΙΝΤ1

Биоинформатический анализ.

Данные. полученные в формате.сзу с прибора Вютагк (Р1шб1дт). преобразовывали в табличный формат. включающий информацию для образца. мРНК и репликации. наряду с необработанным значением флуоресценции. Реакции ПЦР. которые не проходили. отмечали как отсутствующие. Несколько экспериментов объединяли после нормировки по отношению к общей экспрессии видов мРНК. Все изменения экспрессии мРНК отфильтровывали на основе требований детектирования по меньшей мере в двух из всех тестируемых биологических повторов. Авторы оценивали среднее отклонение для технического. биологического и отклонения по надорву в целом наборе данных.

Для анализа данных значения С! для всех интересующих генов сначала нормировали по отношению к средним значениям С! для генов домашнего хозяйства из соответствующего образца для получения значений АС! (АС!=С! для ген - С! для среднего генов домашнего хозяйства). Гены из каждого образца затем нормировали к такому же гену в необработанном контроле для получения значений ААС! (ААС!=АС! контрольный образец - АС! обработанный образец).

Для получения значений кратности изменения активируемые гены (т.е. ААС! более 0) подвергали следующему расчету: Кратность изменения = 2^ЛААС!. Для подавляемых генов (т.е. ААС!к менее 0): Кратность изменения = -(2Л|ААС!|).

Анализы пролиферации клеток (анализы А1-А11 в таблицах данных ниже).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Способность модулировать скорость пролиферации клеток и апоптоз различных типов клеток является фундаментальным свойством многих терапевтических соединений и имеет прямое значение для лечения и предотвращения широкого диапазона заболеваний и нарушений.

Соответственно. полипептиды ААК8. обладающие способностью модулировать скорость пролиферации клеток и/или апоптоза. имеют значительный потенциал терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний. включая использование в качестве факторов роста и факторов дифференцировки для стволовых клеток и в схемах лечения для усиления или подавления пролиферации конкретных представляющих интерес типов клеток т νινί) или т укго. включая. например. гемопоэтические клетки. иммуномодулирующие клетки. раковые клетки. и для лечения и предотвращения заболеваний. связанных с возрастом. включая. например. нейродегенерацию. периферическую нейропатию и потерю мышечного тонуса и тонуса мягких тканей.

Методы.

Влияние полипептидов ААК8 на пролиферацию клеток оценивали с использованием одного или более методов. перечисленных ниже и более конкретно описанных в приведенных ниже методах.

НоесЬк! 33432. Стандартные методы подсчета клеток для оценки пролиферации осуществляли с использованием красителя НоесЬк! 33432. который представляет собой проникающий в клетки ядерный контрастный краситель. который испускает синюю флуоресценцию при связывании с дцДНК. Он доступен в виде раствора (1пу1!годеп кат. № Н-3570). который используется в конечной концентрации 1 мкг/мл в среде или РВ8. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в присутствии полипептидов ААК8 в течение стандартного времени роста. составляющего 48 ч или более в зависимости от типа клеток. как описано в приведенных ниже примерах.

- 100 030461

ΑТΡ-1^!е. Клеточный уровень АТФ коррелирует с состоянием здоровья клетки и может быть с легкостью определен с использованием различных коммерчески доступных наборов. Смесь ΑТΡ-1^!е (^11011^111^1: кат. № 6016947 Вок!оп, ΜΑ 02481), которая представляет собой гомогенную смесь лизирующего раствора и реагента, детектирующего АТФ, предварительно перемешивали перед применением и использовали в отношении 1:1 (по объему) с культивируемыми клетками. Планшеты инкубировали в течение 5 мин для обеспечения лизиса и планшеты анализировали с использованием люминесцентного спектрофотометра для прочтения планшетов. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в присутствии полипептидов ΑΑΚδ в течение стандартного времени роста, составляющего 48 ч или более в зависимости от типа клеток, как описано в приведенных ниже примерах.

Л^ЛΜЛΚВ^υΕ® (Резазурин) представляет собой индикатор выживаемости клеток, который основан на оксилительно-восстановительном состоянии клеток. Резазурин, активный ингредиент, представляет собой нетоксичное, способное проникать в клетки соединение, которое имеет синий цвет и, по существу, не флуоресцирует при существовании в окисленной форме. Однако при проникновении в нормальные жизнеспособные клетки резазурин быстро восстанавливается до резоруфина, который продуцирует красный флуоресцентный сигнал. Жизнеспособные клетки непрерывно превращают резазурин в резоруфин, таким образом, обеспечивая количественную меру выживаемости и цитотоксичности. Отсутствие токсичности обеспечивает возможность длительной обработки клеток резазурином без негативного влияния; было обнаружено, что клетки, которые выращивали в присутствии резазурина, производили такое же количество жизнеспособных клеток, что и контрольные клетки, при определении с помощью проточного цитометрического анализа.

Измерения проводили путем добавления раствора резазурин/Л^ЛΜΑΚВ^υΕ® к клеткам, инкубирования их в течение 1-4 ч и считывания флуоресценции или поглощения. Значение флуоресценции или поглощения пропорционально количеству живых клеток и соответствует метаболической активности клеток. Поврежденные и нежизнеспособные клетки имеют более низкую собственную метаболическую активность и, соответственно, генерируют пропорционально более низкий сигнал по сравнению со здоровыми клетками. После инкубации в присутствии Л^ЛΜЛΚВ^υΕ® образцы можно с легкостью анализировать с помощью приборов измерения флуоресценции и абсорбции. Для прочтения флуоресценции использовали следующие параметры для фильтров: возбуждение при 530 нм и испускание при 590 нм.

Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в присутствии полипептидов ΑΑΚδ в течение стандартного времени роста, составляющего 48 ч или более в зависимости от типа клеток, и как описано в примерах ниже.

Захват ацетилированных ЛПНП в гепатоцитах человека НерС2С3а (анализ В1 в приведенных ниже таблицах данных).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Липопротеины низкой плотности, ЛПНП, являются основным переносчиком холестерина в крови и отвечают более чем за 60% холестерина плазмы крови. У людей рецептор ЛПНП в печени отвечает за клиренс примерно 70% плазматического ЛПНП из циркулирующей крови. Интернализированные ЛПНП разрушаются до свободного холестерина и аминокислот в лизосоме. Печень является основным органом катаболизма ЛПНП и активности рецептора ЛПНП у людей. ЛПНП, которые не интернализируются и остаются в циркулирующей крови, могут транспортироваться эндотелиальными клетками в стенку сосуда, приводя к формированию атеросклеротических бляшек. Циркулирующие ЛПНП также могут захватываться макрофагами, что также может вносить вклад в формирование бляшек. Повышение захвата ЛПНП в ткани печени считается благоприятным для здоровья человека, и разработка безопасных и эффективных способов терапии, которые могут положительно регулировать указанный процесс, может обеспечить новые способы лечения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний. Для исследования того, могут ли уникальные свойства полипептидов ΑΑΚδ регулировать захват ацетилированного ЛПНП, использовали стандартный анализ для измерения захвата ацетилированного ЛПНП в клетках НерС2С3а.

Таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать захват ЛПНП, могут иметь высокий потенциал терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 1 и 2 типа, метаболического синдрома и сосудистых заболеваний, включая атеросклероз.

Методы.

Клетки ЖРС2С3а ^ТСС # СИЬ-10741) поддерживали в минимальной питательной среде Игла ^ад1ек М1тта1 Εκ^ιιΙίη1 тебшт, ΕΜΕΜ) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (НуС1опе кат. № ЗН30910,03), 50 мкг/мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина, (1пуЦгодеп) в 15 мл среды во флаконах на 75 мл. Клетки выращивали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха, соответствующих второму классу биологической защиты ВЗЬ2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. НΕΡС2С3а экспрессируют рецептор ЛПНП и могут захватывать ацетилированный ЛПНП при их культивировании на покрытых коллагеном планшетах с

- 101 030461 прозрачным дном. Клетки в объеме 100 мкл высевали на покрытые коллагеном планшеты (Iην^ί^οдеη кат. № А11428) на ночь в полной среде (выше) при плотности посева 50000 клеток/мл. Клетки промывали один раз РΒδ (Iην^1^οдеη кат. № 10010) и в каждую лунку добавляли 80 мкл свободной от сыворотки среды ЕМЕМ. В каждую лунку добавляли полипептиды ААКЗ в конечной концентрации 250 нМ на лунку в одинаковом объеме в стерильном РΒδ. В каждую лунку наносили уникальный полипептид ААКЗ. Клетки инкубировали без сыворотки и подвергали воздействию полипептидов ААКЗ в течение 16 ч. Через 16 ч инкубации собирали супернатант и растворимые молекулы ЮАМ измеряли с использованием стандартного набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫЗА) фирмы ΡΝΩ ЗукЮтк (кат. № ΌΥ643) и в каждую лунку добавляли бессывороточную среду с добавлением 5 мкг/мл ас-ЛПНП (А1еха ΡΙηογ 488-меченых, кат. № Ь23380, Iην^1^οдеη). Через 2 ч инкубации при 37°С 5% СО₂ клетки промывали дважды стерильным РΒδ перед добавлением 100 мкл РΒδ в каждую лунку для количественной оценки. Планшеты анализировали на предмет общей интенсивности флуоресценции с помощью прочтения дна на флуоресцентном спектрофотометре для прочтения планшетов νίΟοΓ Х5 (Регк1 η Е1тег) при длине волны возбуждения примерно 485 нм и длине волны испускания примерно 535 нм. Клетки окрашивали красителем ^ссйк! и анализировали интенсивность флуоресценции при возбуждении при 405 нм/испускании при 450 нм для подтверждения стабильности количества клеток по всему планшету.

Регуляция кислородного взрыва нейтрофилов и продукции эластазы у человека (анализы С1-С3 в таблицах данных ниже).

Кислородный взрыв нейтрофилов.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Фагоцитоз полиморфо-ядерными нейтрофилами и моноцитами представляет собой важную составляющую иммунной защиты организма от инфекций, вызванных микроорганизмами, включая бактерии и грибы. Процесс фагоцитоза может быть разделен на несколько основных этапов: хемотаксис (миграция фагоцитов к сайтам воспаления), присоединение частиц к клеточной поверхности фагоцитов, поглощение (фагоцитоз) и внутриклеточное уничтожение по кислород-зависимым (окислительный взрыв) и кислород-независимым механизмам. Снижение или отсутствие активности кислородного взрыва наблюдается при врожденных дефектах, таких как хронические грануломатозные заболевания (СОЭ). СОЭ представляют собой гетерогенную группу наследуемых нарушений, которые обычно проявляются во время первых двух лет жизни. Заболевание характеризуется повторяющимися и угрожающими жизни инфекциями, вызванными бактериальными и грибковыми организмами. Указанные инфекции, как правило, включают пневмонию, лимфаденит или абсцесс, который поражает лимфатические узлы, легкие и печень. ЫАОРН-оксидаза представляет собой ферментативную систему, отвечающую за продукцию супероксид-аниона, который быстро превращается в перекись водорода и гидроксильные радикалы. Нарушения пептидов, входящих в состав ферментативной системы НАОРН-оксидазы, приводит к дисфункциям, характерным для СОЭ. Нейтрофилы, полученные от пациентов, страдающих СОЭ. не могут обеспечивать значительные реакции окислительного взрыва после стимуляции. Описаны различные формы СОЭ (классический Х-связанный СОЭ и аутосомные рецессивные варианты). Реакции окислительного взрыва гранулоцитов нарушены при трансплантации, на поздних стадиях ВИЧ-инфекции и у пожилых людей, что делает указанные популяции более чувствительными ко вторичной инфекции и обострениям воспалительного заболевания. Различные иммуномодуляторы (например, цитокины (ОΜ-СδР, О-СЗР. ΨΝΡ) или лекарственные средства) также оказывают эффекты на окислительный взрыв. Существуют белки, обладающие потенциальной способностью активировать или подавлять окислительный взрыв на терапевтическом уровне, применимые для различных стадий заболеваний.

Способы.

Лиганд протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) может использоваться в указанном анализе в качестве агониста процесса окислительного взрыва. Гепаринизированную цельную кровь перемешивали со стерильным декстраном (конечная концентрация 0,6%) в течение 1 ч и позволяли разделяться на слои. Нижний слой содержал нейтрофилы, моноциты и эритроциты. Для удаления всех эритроцитов проводили этап лизиса с использованием хлорида аммония, и после указанного этапа лизиса оставалась на 97% чистая популяция нейтрофилов, загрязненная моноцитами примерно на 3%. При стимуляции гранулоциты и моноциты продуцируют реактивные метаболиты кислорода (супероксид-анион, перекись водорода, гипохлорную кислоту), которые разрушают бактерии внутри фагосомы. За образованием реактивных оксидантов во время окислительного взрыва можно наблюдать путем добавления и окисления Атр1ех Кей. Затем анализировали процент клеток, которые продуцировали реактивные кислородные радикалы, а также их среднюю интенсивность флуоресценции с использованием флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов. Как правило, время указанной реакции составляло мин, при этом очевидный кислородный взрыв наблюдали в течение 2 мин, а уменьшение сигнала наблюдали в течение 20 мин. Указанный анализ можно проводить по принципу агонизма в отсутствие РМА или по принципу антагонизма с сопутствующим введением полипептидов ААКЗ и РМА в концентрации, которая является ниже ЕС₅₀ для указанного соединения.

- 102 030461

Регуляция продукции эластазы нейтрофилами человека.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Эластаза нейтрофилов представляет собой сериновую протеазу, которая, как считается, играет специфическую роль в развитии широкого диапазона заболеваний человека, включая воспалительные нарушения легких и сердечно-сосудистой системы. Несмотря на ее ключевую физиологическую роль во врожденной иммунной защите организма, она также может принимать участие в ремоделировании тканей и обладает стимулирующим влиянием на секрецию, которые сейчас считаются важными сигналами для локального воспаления. В течение нескольких десятилетий считается, что активность эластазы нейтрофилов вовлечена в развитие эмфиземы, однако только относительно недавно была признана патогенная функция указанной сериновой протеазы в ситуациях, когда происходит избыточное отложение внеклеточного матрикса. Благодаря применению моделей генетически модифицированных животных начинают объясняться возможные пути влияния ее действия на фиброзную репарацию легких. Появляющиеся доказательства дают основания полагать, что вовлечение клеточных путей, имеющих более прямое действие на продукцию фиброгенного медиатора и синтез коллагена, содействует обеспечению накопления легочного матрикса под действием эластазы нейтрофилов. Эластаза нейтрофилов человека также присутствует в атеросклеротических бляшках, где она вносит вклад в разрушение матрикса и ослабление стенки сосуда, ассоциированное с осложнениями образования аневризмы и разрывом атеросклеротической бляшки. Эластаза связана с другими внеклеточными протеазами в указанных процессах, но широкий диапазон субстратов и ее активность, сопряженная с дегрануляцией нейтрофилов, позволяет выделять указанную деструктивную протеазу как терапевтическую мишень при атеросклеротическом заболевании.

Методы.

В указанном анализе использовали набор ЕЖСБЕК® (Iиν^ί^οдеи кат. № Е-12056) для анализа эластазы. Нейтрофилы получали из свежей крови человека с использованием 6% раствора декстрана и эритроциты лизировали до помещения клеток в среду ΚΡМI (среда должна быть без добавления сыворотки и антибиотиков). Исходный раствор субстрата эластина ИО (1,0 мг/мл) готовили путем добавления 1,0 мл деионизированной воды (^Η₂Ο) непосредственно к одной из трех пробирок, содержащих лиофилизированный субстрат, и перемешивания для достижения растворения. Однократный реакционный буфер готовили путем разбавления 6 мл 10Х реакционного буфера в 54 мл ^Η₂Ο. 100 мкг/мл рабочего раствора субстрата эластина ИО готовили путем разбавления исходного раствора эластина ИО в десять раз 1Χ реакционным буфером. Исходный раствор свиной панкреатической эластазы готовили путем приготовления исходного раствора 100 Ед./мл в ^Η₂Ο. Для анализа на предмет эластазной активности, 50 мкл 1Χ реакционного буфера наносили в каждую аналитическую лунку, содержащую 500000 нейтрофилов/мл в объеме 30 мкл. Добавляли 8 мкл каждого полипептида ΑΑΚδ на лунку и образец инкубировали в течение 20 мин при 37°’. В каждую лунку добавляли 50 мкл рабочего раствора (100 мкг/мл) эластина ИО и перемешивали. Образцы инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 30 мин. Интенсивность флуоресценции можно измерять на флуоресцентном спектрофотометре для считывания планшетов, снабженном стандартными флуоресцеиновыми фильтрами (возб. 485/исп.535), для нескольких временных точек.

Связывание с ЩИ-подобными рецепторами и активация ΝΡ-кВ (анализы Ό1-Ό4 в таблицах данных, ниже).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Макрофаги играют основную роль во врожденном иммунитете и экспрессируют большой набор различных классов рецепторов распознавания структур (РИН), включая семейство ЩИ-подобных рецепторов (ΤΕΚ), которые являются мощными регуляторами и контролерами иммунного ответа.

Стимуляция ΊΈΚ. микробными патогенами и эндогенными лигандами инициирует сигнальные каскады, которые вызывают секрецию провоспалительных цитокинов и эффекторных цитокинов, которые направляют последующие реакции приобретенного иммунитета. Эндогенные лиганды, так же как и микробные компоненты, распознаются ΤΕΚ и могут активировать ΤΕΚ, что дает возможность предполагать, что указанные рецепторы могут представлять собой ключевую мишень для разработки новых терапий для множества заболеваний.

Таким образом, полипептиды ΑЛΚδ, которые модулируют активность рецепторов ΤΕΚ, обладают потенциалом терапевтического применения для широкого круга заболеваний и нарушений, включая, например, воспалительные заболевания и нарушения, аутоиммунные заболевания, отторжение тканевого трансплантата/отторжение органа, предотвращение или лечение рака, модуляцию гематопоэза и инфекцию.

Измерение активации ΤΕΚ в клетках ΚΑΑ^ΕυΕ.

Мышиные макрофаги, продающиеся под торговой маркой ΚΑ^^ΕυΕ™ (Iиν^νοдеи, Са1а1од соТе: га№-5р), экспрессируют все ΤΕΚ, за исключением ΤΕΚ5, и включают ген секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (δΕЛΡ), который индуцируется транскрипционными факторами ΝΡ-кВ и АР-1. При стимуляции ΤΕΚ клетки ΚΑ^^ΕυΕ™ активируют ΝΡ-кВ и/или АР-1, приводя к секреции δΕЛΡ, кото- 103 030461 рый поддается измерению с помощью среды для детектирования 8ΕΑР.

Методы.

Клетки РАА-ВР-υΕ'™ промывали дважды РВ8, трипсинизировали и ресуспендировали в свежей ростовой среде (ростовая среда: ^МΕМ, 4,5 г/л глюкоза, 10% термоинактивированная эмбриональная бычья сыворотка (30 мин при 56°С), 100 мг/мл ΖΕΟΟΝ™, 2 мМ Ь-глутамин). Клетки высевали в концентрации 50000 клеток/лунку в 96-луночных планшетах в общем объеме 100 мкл и в каждую лунку добавляли полипептиды ААК8, контроли или полипептиды ААК8 (+ЬР8) в концентрациях, показанных в экспериментах, изложенных ниже. Клетки инкубировали при 37°С в инкубаторе при 5% СО₂ в течение 18 ч. На 2 день эксперимента готовили среду для детектирования 8ΕΑР (^υΑNТI-В^υВ™) Д^тодеи Са!а1од сοάе: гер-с|Ь 1) в соответствии с инструкциями и добавляли в 96-луночный планшет с плоским прозрачным дном в объеме 120 мкл/лунку, затем добавляли супернатант клеток (20 мкл). Образцы инкубировали при 37°С в течение от примерно 30 мин до 2 ч. Уровень 8ΕΑР определяли с использованием спектрофотометра и путем считывания абсорбции при 650 нм.

Для детектирования полипептидов ААК8, которые специфично блокируют активацию ТЬК, указанный анализ можно модифицировать для идентификации потенциальных антагонистов ТЬК. В указанном случае полипептиды ААК8 добавляли к клеткам в конечной концентрации примерно 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах) за 1 ч до добавления 50 нг/мл ЬР8. Клетки инкубировали и выявляли 8ΕΑР, как описано выше. Контрольные лунки, содержащие РВ8 в отсутствие ЬР8 или только добавленный полипептид ААК8, использовали для оценки фонового уровня стимуляции ТЬК во время измерения. Контрольные лунки предварительно обрабатывали РВ8 и известными агонистами и анатагонистами ТЬК. Отношение вычитаемого фона [сигнал РВ8 плюс ЬР8] к [сигналу полипептида ААК8 плюс ЬР8] использовали для определения процентного антагонизма.

Скрининг ТЬК человека в клетках НΕК293.

Клетки человека НΕК293 представляют собой генетически модифицированные клетки и продаются под торговой маркой клетки НИК-Иие™ ТЬК Д^гуодеи). Варианты ТЬК2 и ТЬК4 указанного типа клеток селективно экспрессируют все ТЬК2 или ТЬК4 и содержат репортерный ген секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (8ΕΑР) под контролем минимального промотора ШШбета, слитого с пятью сайтами связывания транскрипционных факторов ΝΤ-кВ и АР-1. При использовании специфических агонистов ТЬК 2 или 4 (соответственно), клетки ΚΕΚ^^Σ™ ТЬК2 и ^Κ^ΡυΕ™ ТЬК4 активируют NΡ-кВ и/или АР-1, приводя к секреции 8ΕΑР, который поддается измерению при использовании реагента для детектирования 8ΕΑР. Клетки ΒΕΚ-ΡΡυΕ'™ ТЬК2 являются ко-трансфицированными ЬР8-корецепторным белком СЭ14 для усиления чувствительности ТЬК2 и улучшения качества сигнала. Исходная клетка экспрессируют эндогенный уровень ТЬК1, 3, 5, 6, а также NО^1.

Методы.

Клетки НВК-ВЬиВ™-ТЬК2 или НВΚ-В^υВ™-Т^К4 промывали дважды РВ8, трипсинизировали и ресуспендировали в свежей ростовой среде (ростовая среда: ^МВМ, 4,5 г/л глюкоза, 10% термоинактивированная эмбриональная бычья сыворотка (30 мин при 56°С), 100 мг/мл ΖΕОСIN™. 2 мМ Ь-глутамин). Клетки высевали в концентрации 50000 клеток/лунку в 96-луночный планшет в общем объеме 100 мкл и в каждую лунку добавляли полипептиды ААК8, контроли или полипептиды ААК8 (+ЬР8) в концентрациях, показанных в экспериментах, изложенных ниже. Клетки инкубировали при 37°С в инкубаторе при 5% СО₂ в течение 18 ч. На 2 день эксперимента готовили среду для детектирования 8ВΑР (01,-741/-151,0/% Д^Аодеи Са!а1од сοάе: гер-дЫ) в соответствии с инструкциями и добавляли в 96-луночный планшет с плоским прозрачным дном по 120 мкл на лунку, затем добавляли клеточный супернатант (20 мкл). Образцы инкубировали при 37°С в течение примерно 30 мин вплоть до 2 ч. Уровень 8ВΑР определяли с использованием спектрофотометра и путем считывания абсорбции при 650 нм. Контрольные лунки предварительно обрабатывали РВ8 и известными агонистами ТЬК, такими как иЬгаРиге ЬР8 (ТЬК-4) или РАМ3С8К4 (ТЬК-2). Отношение вычитаемого фона [сигнал РВ8 плюс ЬР8] к [сигналу полипептида ААК8 плюс ЬР8] использовали для определения процентного агонизма.

Высвобождение цитокинов (анализы Е1-Е17 в таблицах данных ниже).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Цитокины представляют собой набор разнообразных низкомолекулярных белковых молекул клеточной передачи сигнала, которые широко используются для межклеточного взаимодействия и играют важные роли в поддержании нормального гомеостаза тела, включая иммуномодуляцию и регуляцию. Таким образом, полипептиды ААК8, которые модулируют высвобождение или биологическую активность цитокинов, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний и нарушений, включая, например, воспалительные заболевания и нарушения, аутоиммунные заболевания, отторжение тканевого трансплантата/отторжение органа, предотвращение или лечение рака, модуляцию гематопоэза и инфекции.

- 104 030461

Высвобождение цитокинов из клеток в культуре.

Методы.

Анализируемые клетки высевали в 24-луночный планшет при плотности примерно 1 млн клеток/лунку в 1 мл ростовой среды. Клетки обрабатывали либо полипептидом ΑΑΚδ (в концентрациях, показанных в приведенных ниже примерах), либо равным объемом РΒδ и инкубировали в течение ночи при 37°, 5% ί'.’Ο₂. После обработки клеток образцы центрифугировали при 4°С на центрифуге с бакетротором при 2000хд в течение 5 мин. Среду осторожно собирали таким образом, чтобы не разрушить клеточный осадок, и переносили в новую пробирку. Образцы сразу исследовали или быстро замораживали в жидком азоте для последующего анализа. Высвобождение цитокинов (включая цитокины МГР, ГО-8, ГО-10, серпин Е1, СМ-С8Р, ϋΚΟ, ГО-1альфа, ГО-1бета, ГО-1га, ГО-6, МСР-1, МГО-1, ΚΑΝΙΈδ и ΊΝΡ-альфа) оценивали с использованием коммерчески доступных наборов (Κ&Ό δу8!ет8, ГОс, МЮ США) или на основании контракта при помощи исследовательской организации (МО Βίο8^ΐ'^8 (СентПол, Миннесота).

Высвобождение цитокинов из цельной крови человека.

Методы.

Цельную кровь человека получали от здоровых доноров, представляющих собой людей, и собирали в стандартные пробирки с гепарином для сбора образцов. Кровь использовали в день ее получения, чтобы гарантировать адекватное состояние здоровья клеток. Кровь осторожно перемешивали и помещали в объеме 100 мкл в 96-луночные поликарбонатные планшеты с У-образным дном. Добавляли полипептиды ΑΑΚδ и медленно перемешивали их с кровью 2 раза с использованием многоканальной пипетки, установленной на 50 мкл. Для всех экспериментальных работ использовали наконечники с фильтром и полный комплект средств индивидуальной защиты (РРЕ). Вся экспериментальные работы проводились в вытяжном шкафу соответствующего класса биозащиты, который являлся подходящим для проведения экспериментальной работы с кровью человека. Кровь инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СΟ₂. После обработки клеток образцы центрифугировали на центрифуге с бакет-ротором при 2000хд в течение 5 мин. Супернатант собирали для проведения иммуноферментных анализов ^ΟδΑ) цитокинов. Ε^IδΑ проводили, как описано ранее.

Высвобождение цитокинов из мононуклеаров периферической крови.

Методы.

Для изолирования мононуклеаров периферической крови свежеполученную человеческую цельную кровь медленно наносили на ΗIδТΟРΑ^υΕ®-1077 (δίβίικι) в отношении 1:1 в конические пробирки на 50 мл при комнатной температуре. Нанесенные образцы центрифугировали при 400хд в клинической центрифуге, снабженной бакет-ротором, в течение 30 мин при комнатной температуре без торможения. Затем слой лейкоцитов на границе раздела между плазмой и градиентом плотности удаляли с помощью пипетки. Указанные клетки, представляющие собой мононуклеары периферической крови, промывали дважды средой ГОРМЫ640 Д^бгодеп, кат. № 22400-105) посредством разбавления и центрифугирования в течение 10 мин при 250хд. Промытые РВМС ресуспендировали в среде ΚРΜI-1640+10% эмбриональной бычьей сыворотки и высевали в концентрации 1х10⁶ клеток/мл.

Высвобождения цитокинов из клеток ТНР-1 и НЬ60.

Методы.

Клетки ТНР1 и НЬ60 выращивали в среде ΚРΜI-1640+10% эмбриональной бычьей сыворотки и высевали в концентрации 1х10⁶ клеток/мл в 96-луночные планшеты. Клетки обрабатывали в течение 48 ч полипептидами ΑΑΚδ в концентрации 250 нМ, если иное не указано. Указанные два типа клеток, как правило, считаются моноцитоподобными или макрофагподобными и имеют много маркеров, которые дают основания считать их клетками миелоидного ряда. Таким образом, указанные клетки производят многочисленные различные цитокины в ответ на различные биологические стимулы и часто используются для исследования воспалительных и противовоспалительных ответов ίη νίΐτο. Высвобождение цитокинов (включая цитокины МГО, ГО-8, ГЬ-10, серпин Е1, СМ-С8Р, СΚΟ, ГЪ-1 альфа, ГО-1 бета, !И-1 га, ГО-6, МСР-1, МГО-1, ΚΑNТΕδ и ТОТ-альфа) определяли с использованием коммерчески доступных наборов (Κ&Ό δу8!ет8, ГОс, Миннесота, США) или на основании контракта при помощи исследовательской организации (МО Βίο8^ι^8 (Сент-Пол, Миннесота).

Высвобождение цитокинов из синовиоцитов человека.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Большое количество исследований показало, что ГО-6 и ГО-8 продуцируются на повышенном уровне при некоторых заболеваниях и, таким образом, могут играть фундаментальную роль в патогенезе воспалительного заболевания. ГО-6 активирует продукцию клеток эндотелия, приводя к высвобождению ГО-8 и белков-хемоаттрактанов моноцитов, экспрессии молекул адгезии и привлечения лейкоцитов в места воспаления. Указанные цитокины экспрессируются в типах клеток, ассоциированных с воспалительными заболеваниями, включая клетки, вовлеченные в патогенез системного ювенильного артрита, системной красной волчанки, болезни Крона и ревматоидного артрита. Одним из наиболее важных системных эффектов продукции цитокинов является индукция ответа острой фазы. Белки острой фазы в основном

- 105 030461 продуцируются печенью и включают белки, которые обеспечивают иммунный ответ путем активации компонентов комплемента, индукции провоспалительных цитокинов и стимуляции хемотаксиса нейтрофилов. В альтернативном варианте ответ острой фазы может иметь полезное действие, и белки острой фазы, такие как антагонисты протеиназы, опсонины и прокоагулянты, помогают ограничивать разрушение ткани путем разрешения воспаления. В частности, 1Ь-6 может стимулировать пролиферацию синовиоцитов и активацию остеокластов, приводя к образованию синовиального паннуса и репарации. 1Ь-6 действует вместе с 1Ь-1 для повышения продукции матриксных металлопротеиназ, которые могут вносить вклад в разрушение суставов и хряща. Однако 1Ь-6 также может оказывать защитное действие в суставах, что было предположено на основании открытия, что указанный цитокин вызывает экспрессию тканевого ингибитора металлопротеиназ и стимулирует синтез протеогликанов при инъекции в суставы мышей, страдающих антиген-индуцированным артритом. Фибробласто-подобные синовиоциты ревматоидного артрита человека (ΗΡ^δ-ΚΛ) выделяли из синовиальных тканей, полученных от пациентов, страдающих ревматоидным артритом (ΚΛ). Они были заморожены на втором пассаже и их можно культивировать и размножать по меньшей мере в течение 5 удвоений популяции. Давно известна роль НРЬ8 в разрушении суставов путем продукции цитокинов и металлопротеиназ, которые вносят вклад в деградацию хряща.

Соответственно, полипептиды ΛΛΚδ, обладающие способностью модулировать рост, дифференцировку или профиль высвобождения цитокинов фибробластоподобных синовиоцитов ревматоидного артрита (ΗΡ^δ-ΚΛ), обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение воспалительных заболеваний и нарушений, включая системный ювенильный артрит, системную красную волчанку, болезнь Крона и ревматоидный артрит.

Методы.

Взрослые клетки ΗΡ^δ-ΚΛ (Се11 Λрр1^са!^оηβ, кат. № 408ΚΛ-05а) поддерживали в ростовой среде для синовиоцитов (Се11 Λрр1^са!^оηβ, кат. № 415-50) в 15 мл среды во флаконах на 125 мл в течение 1 пассажа до использования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты В8Ь2 с использованием стерильных методов и соответствующих средства индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл высевали на ночь в ростовой среде при плотности клеток примерно 50000 клеток/мл. После прикрепления в течение ночи в каждую лунку добавляли полипептиды ΛΛΚδ в стерильном ΡВδ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах). Контрольные лунки содержали необработанные клетки и инкубировались с эквивалентным объемом ΡВδ. Клетки подвергали воздействию белков или ΡВδ в основной среде (Се11 Λрр1^саί^оηβ, кат. № 310-470) в течение 24 ч. Супернатант удаляли и проводили ΕΡΙδΛ-анализ 1Ь-8, 1Ь-6 и ЮТ-а в соответствии с инструкциями производителя (^N0 δуβ!етβ, кат. № ΌΥ206 и с наборами Оио-ве! ΌΥ-208, ΌΥ-210). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΛΛΚδ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценции лунок, обработанных только ΡВδ.

Пролиферация и продукция воспалительных цитокинов астроцитами человека.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Астроциты человека (НА) представляют собой астроциты, которые являются производными коры головного мозга человека. Их замораживают на втором пассаже и их можно культивировать и размножать до 10 удвоений популяции. НА являются наиболее многочисленными клетками в центральной нервной системе и выполняют много функций, таких как обеспечение механической поддержки и доставка питательных веществ нейронам и удаление продуктов жизнедеятельности из нейронов. Помимо того, что астроциты играют важную поддерживающую роль для оптимального функционирования нейронов, они также обеспечивают снабжение биохимическими веществами клеток эндотелия, которые формируют гематоэнцефалический барьер. Недавние исследования показали, что астроциты способны регулировать нейрогенез путем запуска нейрогенной дифференцировки стволовых клеток и контроля функции одиночных синапсов, принимать активное участие в передаче и хранении информации в мозге. Осознание важной роли астроцитов в функционировании нервной системы повышается. НА могут служить полезной моделью для исследования разнообразия функций астроцитов ш νίΙΐΌ. Было показано, что астроциты пролиферируют в ответ на Ш6 и ЮТ-а. Кроме того, указанные клетки способны создавать свой собственный ГО6 и ЮТ¹- а. Таким образом, полипептиды ΛΛΚδ, которые модулируют пролиферацию и продукцию цитокинов в клетках НА, обладают потенциалом терапевтического применения для различных нейрологических заболеваний, включая нейровоспаление, нейродегенерацию, образование опухоли мозга и ишемию и регенерацию мозга.

- 106 030461

Методы.

Астроциты человека (НА) из Се11 Аррйсайощ (кат. № 882К-05Г) поддерживали в ростовой среде для клеток НА (Се11 АррНсайощ, кат. № 821-500) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты В§Ь2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл высевали на покрытые коллагеном планшеты на ночь в полной среде (выше) при плотности клеток 50000 клеток/мл. Клетки промывали один раз РВ§ и в каждую лунку добавляли 80 мкл бессывороточной ростовой среды. В каждую лунку добавляли полипептиды ААК§ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально описано в приведенных ниже примерах) в постоянном объеме в стерильном РВ§. Клетки подвергали воздействию полипептидов ААК§ в течение 48 ч и отработанную среду удаляли для анализа цитокинов (как описано ранее). Клетки подвергали воздействию белков или РВ§ в основной среде (Се11 Аррйсайощ, кат. № 310-470) в течение 48 ч. Супернатант удаляли и проводили анализы на 1Ь-8 и 1Ь-6 методом твердофазного ИФА в соответствии с инструкциями производителя (ΚΝΏ §у81ет8, кат. № ΌΥ206 и наборы Био-ве1 ΌΥ-208, ΌΥ-210). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ААК§ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только РВ§.

Пролиферация и продукция воспалительных цитокинов клетками эндотелия микрососудов легкого человек (НЬМУЕС).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Легочная сосудистая система имеет огромное физиологическое/патологическое значение. Сейчас считается, что она представляет собой ткань, которая состоит из метаболически активных, функционально эффективных клеток, которые взаимодействуют с циркулирующими субстратами и форменными элементами крови таким образом, что регулируют состав системной артериальной крови, влияют на функции органа-мишени и вносят вклад в тромбоз, гемостаз и иммунные реакции, в также опухолевый метастаз. Эндотелиальные клетки микрососудов легкого человека (НЬМУЕС) обладают повышенной экспрессией хемоаттрактантных цитокинов и молекул клеточной адгезии, которые обеспечивают ключевой сигнал для направления миграции лейкоцитов в легкое во время острого повреждения легких. Эти первичные клетки могут быть полезным инструментом для изучения различных аспектов патологии и биологии легочной микроваскуляризации ίη νίίΐΌ. Изменение в структуре и функции микроваскуляризации в ответ на воспалительные стимулы считается ключевым фактором в повреждении органов и при соответствующих условиях может обеспечивать стимул для репарации. Важной причиной указанных сосудистых изменений является индукция воспалительной реакции, вовлекающей инфильтрацию лейкоцитов. С помощью различных исследований, сфокусированных на адгезии гранулоцитов к эндотелию, было выявлено, что в привлечение и эмиграцию лейкоцитов вовлечен хорошо организованный адгезионный каскад. Указанный адгезионный каскад инициируется, когда гранулоцит прикрепляется к эндотелию и начинает катиться в направлении тока жидкости с низкой скоростью. По мере качения гранулоцита он активируется, затем плотно адгезирует к эндотелию и мигрирует через эндотелий во внесосудистое пространство. Указанные адгезионные события опосредуются, отчасти, молекулярными взаимодействиями, которые происходят между САМ на поверхности гранулоцитов и соответствующими гликопротеинами, присутствующими на эндотелии. Различные исследования показали, что молекула клеточной адгезии эндотелия Е-селектин может взаимодействовать с лигандами гранулоцитов, презентирующих гликан типа §Ьех для опросредования этапов прикрепления и качения в адгезионном каскаде. Последующие этапы каскада вовлекают взаимодействие экспрессируемых эндотелием молекул межклеточной адгезии с экспрессируемыми гранулоцитами интегринами СБ18.

Таким образом, полипептиды ААК§, которые модулируют пролиферацию и/или продукцию цитокинов в клетках эндотелия микрососудов легкого человека обладают потенциалом терапевтического применения при различных сосудистых и легочных заболеваниях, включая воспалительные и обструктивные заболевания легких, включая, например, легочную гипертензию, хроническое обструктивное заболевание легких, идиопатический фиброз легких и астму.

Методы.

Клетки НЬМУЕС (Се11 АррНсайощ, кат. № 540-05) поддерживали в ростовой среде для клеток эндотелия микрососудов Се11 АррНсайощ (кат. № 111-500). Для приемлемого роста клеток использовали раствор фактора для прикрепления клеток, содержащий коллаген (Се11 АррНсайощ, кат. № 123-100), для покрытия планшетов и флаконов до помещения на них клеток. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО2, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты В§Ь2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл помещали на покрытые коллагеном планшеты на ночь в полной среде (выше) при плотности клеток 50000 клеток/мл. Клетки

- 107 030461 промывали один раз РВЗ и в каждую лунку добавляли 80 мкл бессывороточной ростовой среды. В каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ в стерильном РВЗ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально описано в приведенных ниже примерах) в постоянном объеме. Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в течение 48 ч и отработанную среду удаляли для анализа методом твердофазного ИФА для оценки молекул клеточной адгезии и цитокинов (как описано ранее). Молекулы клеточной адгезии, включая растворимые УСΑΜ и/или IСΑΜ, измеряли с использованием стандартного набора для ΕΟδΑ, полученного из ΚΝΏ ЗукЮшк (кат. № ΌΥ643 и ΌΥ720 соответственно). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΑΑΚδ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только РВЗ.

Адгезия клеток (анализы Ρ1-Ρ7 в таблицвх данных ниже).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Молекулы клеточной адгезии (САМ) представляют собой белки, расположенные на поверхности клетки, которые вовлечены в связывание с другими клетками или с внеклеточным матриксом (ВКМ) в процесс, называемый клеточной адгезией. Указанные белки, как правило, представляют собой трансмембранные рецепторы и состоят из трех доменов: внутриклеточного домена, который взаимодействует с цитоскелетом, трансмембранного домена и внеклеточного домена, который взаимодействует либо с другими молекулами САМ того же типа (гомофильное связывание), либо с другими САМ или внеклеточным матриксом (гетерофильное связывание). Большинство САМ принадлежит четырем семействам белков: суперсемейство 1д (иммуноглобулинов) (^δΡ СЛΜ), интегринов, кадгеринов и селектинов. Молекулы клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов (^δΡ) представляют собой кальций-независимые трансмембранные гликопротеины, включая нейрональные молекулы клеточной адгезии (NСЛΜ), межклеточные молекулы клеточной адгезии (IСЛΜ), сосудистые молекулы клеточной адгезии (УСЛΜ), молекулы клеточной адгезии тромбоцитов/клеток эндотелия (РЕСАМ-1), селективные для клеток эндотелия молекулы адгезии (ΕδЛΜ), молекулы адгезии контактов (1АМ), нектины и другие молекулы клеточной адгезии.

Молекулы клеточной адгезии представляют собой гликопротеины клеточной поверхности, которые являются критичными для адгезии лейкоцитов к эндотелию синусоидов и трансмиграции и цитотоксичности при различных воспалительных заболеваниях печени. IСЛΜ-1 играет важную роль в воспалении, и повышенная экспрессия IСЛΜ-1 на эндотелиальных клетках отражает активацию клеток эндотелия. IСΑΜ-1 имеет особое значение, так как они опосредуют прочную адгезию к эндотелию и облегчают трансмиграцию лейкоцитов. Исследования показали, что существует положительная регуляция IСЛΜ-1 как на синусоидальных клетках, так и на гепатоцитах, при воспалительных состояниях печени, таких как вирусная инфекция гепатитом В, аутоиммунные нарушения печени, алкогольный гепатит и отторжение трансплантата печени.

Таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, которые модулируют продукцию молекул клеточной адгезии и клеточную адгезию к эндотелиальным клеткам, обладают потенциалом терапевтического применения при различных воспалительных заболеваниях, включая, например, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, аутоиммунные заболевания и легочную гипертензию.

Методы.

Клетки пуповинной вены человека (АТСС, кат. № СИР-2873) (ΠυνΕΟ) высевали в концентрации примерно 1,2х10⁵ клеток/на лунку в 12-луночные планшеты, покрытые раствором человеческого фибронектина для прикрепления клеток в предложенной АТСС среде с добавками и выращивали в соответствии с инструкциями производителя. Клетки стимулировали полипептидами ΑΑΚδ в указанных концентрациях или только РВЗ и инкубировали в течение ночи в ростовой среде. Клетки острого моноцитарного лейкоза человека (ТНР-1 (Т1В-202)) ресуспендировали в 0,1% БСА/бессывороточной среде ИРМ1 с кальцеином ЛΜ (6 мкл/мл; 1пукгодеп, кат. № С1430) и инкубировали в течение 30 мин. Меченые клетки собирали и ресуспендировали в среде ИРМ1, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и плотность доводили до 2х10⁶ клеток/мл.

100 мкл (2х10⁵) меченых ТНР-1 клеток помещали в каждую лунку монослоя НυУΕС в 1 мл ростовой среды и инкубировали в течение 15 мин. Лунки промывали дважды РВЗ для удаления несвязанных клеток и затем клетки анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 530 нм.

Высвобождение молекул клеточной адгезии из клеток ТНР-1.

Методы.

Клетки ТНР1 выращивали в среде ИРМ1-1640 с 10% эмбриональной бычьей сыворотки и высевали в концентрации 1х10⁶ клеток/мл. Клетки обрабатывали в течение 48 ч полипептидами ΑΑΚδ в концентрации 250 нМ, если иное не указано, и с помощью анализа методом твердофазного ИФА оценивали

- 108 030461

ΊΝΡ-α, 1Ь-6 и 1Ь-8, а также различные молекулы клеточной адгезии, как описано ранее. Клетки указанного типа, как правило, считаются моноцитоподобными или макрофагподобными и имеют много маркеров, которые дают основания считать их клетками миелоидного ряда. Впоследствии указанные клетки продуцируют многочисленные различные цитокины в ответ на различные биологические стимулы и часто используются для наблюдения за воспалительными и противовоспалительными ответами ш убго, включая регуляцию и продукцию молекул клеточной адгезии.

Дифференцировка клеток (анализы О1-О4 в таблицах данных ниже).

Дифференцировка и пролиферация адипоцитов в первичных пре-адипоцитах человека.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Ожирение и липодистрофия обычно связаны с патологиями, включающими диабет и сердечнососудистые заболевания. На сегодняшний день признано, что жировая ткань представляет собой эндокринный орган, который секретирует множество различных факторов, и нарушенная регуляция секреции влияет на адипогенез, а также на гомеостаз глюкоза/инсулин во всем организме. Избыток жировой ткани, ведущий к ожирению, стал серьезной угрозой общественному здоровью. На развитие жировой ткани может влиять генетический фон, гормональный баланс, диета и физическая активность. Масса жировой ткани повышается, когда жировые клетки увеличиваются в размере из-за повышенного накопления триацилглицеринов. Кроме того, повышение количества жировых клеток, возникающих путем дифференцировки клеток-предшественников в адипоциты, также может происходить даже у взрослых организмов, что наблюдается при тяжелом ожирении человека и у крыс, которых содержат на рационе с высоким содержанием углеводов или жиров. Считается, в частности, что адипоциты возникают из мезенхимальных клеток, которые претерпевают процесс коммитирования и дифференцировки, адипогенеза. Клеточные линии пре-адипоцитов могут дифференцироваться в адипоциты при обработке адипогенными агентами, состоящими из синтетического глюкокортикоида, дексаметазона (ИЕХ), изобутилметилксантина (1ВМХ) и инсулина, которые оценивались в указанных исследованиях. Было доказано, что активируемый пролифератором пероксисом рецептор γ (РРАКу) и связывающийся с энхансером ССААТ белок (С/ЕВР) семейства факторов транскрипции играет основную роль в дифференцировке адипоцитов. На ранних этапах дифференцировки адипоцитов С/ЕВРр и С/ЕВР5 индуцируются ИЕХ и 1ВМХ соответственно, которые затем вместе индуцируют РРАК,/ и С/ЕВРа для активации различных маркеров адипоцитов, которые требуются для их функционирования. Также было описано, что другие факторы транскрипции отрицательно или положительно регулируют адипогенез, и различные факторы роста и гормоны могут влиять на дифференцировку адипоцитов путем регулирования экспрессии адипогенными транскрипционными факторами. Таким образом, помимо того, что жировая ткань является основным депо энергии у млекопитающих благодаря запасанию триацилглицеринов и высвобождению жирных кислот в необходимое время, жировая ткань секретирует широкий набор молекул, которые вовлечены в различные физиологические процессы, включая иммунный ответ, функцию сосудов и энергетический гомеостаз. Цитокины, такие как ФНО-а и 1Ь-6, секретируются из адипоцитов. Некоторые из указанных факторов также могут влиять на рост и развитие жировой ткани путем аутокринного/паракринного действия.

Таким образом, полипептиды ААКЗ, обладающие способностью модулировать дифференцировку и/или пролиферацию нормальных пре-адипоцитов человека, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение и предотвращение метаболических заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения и липодистрофии, так же как и длительных осложнений диабета.

Методы.

Клетки НРАб (пре-адипоциты человека) (Се11 АррНсабоп, кат. № 803кИ) содержали в соответствии с рекомендациями поставщика. Для культивирования клетки быстро размораживали и сразу переносили в 15 мл ростовой среды для адипоцитов (Се11 АррНсабоп, кат. № 811М-250) и высевали в стандартный стерильный флакон с обработанной для тканевых культур поверхностью. Среду заменяли на свежую ростовую среду для адипоцитов каждые вторые сутки до достижения клетками >60% монослоя. Клетки выращивали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты ВЗЬ2 с использованием стерильных методов и соответствующие средства индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки высевали для дифференцировки на 96-луночные аналитические планшеты с прозрачным дном и черными стенками, обработанные для оптимального прикрепления тканевых культур, в концентрации примерно 50000 клеток/мл. Полипептиды ААКЗ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах) добавляли в каждую аналитическую лунку. Все клетки поддерживали в ростовой среде в течение 2 дней, за исключением положительных контролей, которые стимулировали средой для адипогенной дифференцировки (Се11 АррНсабопк, кат. № 811Ό-250). Клетки подвергали воздействию полипептидов ААКЗ в течение 48 ч. Молекулы клеточной адгезии, включая растворимые VСЛМ и/или 1САМ, измеряли с использованием стандартного набора ЕЫЗА из ΡΝΌ Зук1етк (кат. № ΌΥ643 и ΌΥ720 соответственно). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и

- 109 030461 инкубирования в течение 3 ч при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ААК8 лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только РВ8. Добавляли свежую среду и дифференцировку поддерживали в течение 16 дней после изначальной смены среды, при этом смену среды проводили каждые вторые сутки для поддержания клеток в здоровом состоянии. На 15 день клетки помещали в свободную от сыворотки среду. На 16 день дифференцировку в зрелые адипоциты оценивали с помощью окраски №1е Кеб (Iην^ί^οдеη, конечная концентрация 3 мкМ) и подсчитывали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов при соответствующих длинах волн. Для проведения указанного анализа клетки фиксировали 10% параформальдегидом, промывали в РВ8 и пермеабилизировали с помощью РВ8, содержащим 0,5% БСА и 0,1% Тритон Х-100. Пролиферацию клеток оценивали с помощью измерения интенсивности на флуоресцентном спектрофотометре при использовании красителя ГОесШ! 33432 в конечной концентрации 1 мкг/мл, как описано ранее. Адипогенез выражали как интенсивность сигнала №1е Кеб. Сигнал красителя ГОесйк! использовали для оценки количества клеток.

Дифференцировка и пролиферация клеток скелетной мускулатуры человека.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Развитие скелетной мускулатуры представляет собой многоэтапный процесс, который вовлекает детерминирование плюрипотентных мезодермальных клеток, дающих начало миобластам, выведение миобластов из клеточного цикла и дифференцировку в мышечные клетки и, в конечном итоге, рост и созревание скелетно-мышечных волокон. Скелетно-мышечная дифференцировка включает выравнивание миобластов, удлинение и слияние в многоядерные мышечные трубочки, вместе с индукцией регуляторных и структурных специфичных генов мышц. На молекулярном уровне миогенное коммитирование и уровень экспрессии специфичных мышечных генов вовлекает специфичные скелетно-мышечные белки семейства Μ\όΌ, содержащие домен спираль-петля-спираль (Μίχ-1οορ-Μίχ, ЬНЬН), которые включают Μ\όΌ, миогенин, туГ-5 и МКЕ4 и фактор связывания энхансера миоцитов 2 (МЕЕ2). Активность связывания ДНК белками семейства Μ\όΌ ослабляется 1б, который формирует комплексы с продуктами гена Е2а в пролиферирующих клетках и подавляется при индукции их дифференцировки. На запуск дифференцировки в мышечные трубочки отрицательно влияют некоторые факторы. Обработки миобластов эмбриональной бычьей сывороткой, основными факторами роста фибробластов 2 или трансформирующим фактором роста β1, как известно, подавляет дифференцировку миобластов. Миогенез также отрицательно регулируется онкогенами, такими как с-тус, с^ищ с-Γοδ, Н-гак и Е1а. Существует очень мало информации относительно сигнальных путей, которые запускаются в миобласте при удалении сыворотки, что приводит к индукции экспрессии гена семейства ΜνοΌ и мышечной дифференцировке. Оказывается, что миогенная дифференцировка зависит от активации интегринов, присутствующих на плазматической мембране миобластов, что указывает на функционирование биохимического пути снаружи внутрь, в котором интегрин представляет собой более раннюю молекулярную частицу. Взаимодействия инсулиноподобных факторов роста (ΙΟΕ)-Ι и -II с их рецепторами также являются положительными регуляторами скелетно-мышечной дифференцировки.

Соответственно, полипептиды ААК8, обладающие способностью модулировать развитие мышц, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение метаболических заболеваний, кахексии, различных состояний, связанных с мышечной атрофией, так же как и заболеваний скелетной мускулатуры, где мышечная атрофия играет ключевую роль в патогенезе и симптомологии. Человеческие клетки скелетной мускулатуры (Н8кМС) могут дифференцироваться с появлением актомиозиновых миофиламентов. Н8кМС использовались в исследовании генетических мышечных заболеваний, таких как злокачественная гипертермия. Н8кМС также можно использовать в качестве сердечного трансплантата, обеспечивающего восстановление поврежденной ткани сердца, и, таким образом, полипептиды ААК8, обладающие способностью модулировать развитие мышц, также применимы в качестве ίη νίίτο и ίη νίνο регуляторов миогенеза.

Методы.

Для оценки возможной роли полипептидов ААК8 в указанном процессе использовали стандартный анализ дифференцировки клеток скелетной мускулатуры. Для указанного анализа клетки скелетной мускулатуры взрослого человека (Н8кМС, Се11 Аρρ1^саί^οη, кат. № 150-05Г) изолировали из скелетных мышц конечностей здоровых доноров, представляющих собой людей. Клетки поддерживали в ростовой среде для Н8кМС (Се11 Аρρ1^саί^οηδ, кат. № 151-500). Указанные клетки можно культивировать и размножать в течение по меньшей мере 15 удвоений популяций. Для дифференцировки клетки поддерживали в ростовой среде в течение одного пассажа и затем высевали в концентрации 50000 клеток на мл среды в 96луночные обработанные (ТС) планшеты с прозрачным дном и черными стенками, обработанные коллагеном в концентрации 100 мкл/лунку. Клеткам позволяли прикрепляться в течение ночи. Полипептиды ААК8 в РВ8 или только РВ8 добавляли в каждую лунку в конечной концентрации 250 нМ белка (или как специально указано в примерах ниже). В контрольные лунки наносили такой же объем среды для дифференцировки (Се11 Аρρ1^саί^οηδ, кат. № 151Ό-250) в это же время. Клетки инкубировали с белком или средой для дифференцировки в течение 48 ч. Через 48 ч супернатант клеточной культуры собирали изо

- 110 030461 всех лунок и добавляли среду для дифференцировки в объеме 150 мкл на весь планшет, за исключением контрольных лунок, которые оставляли только в ростовой среде. Супернатант использовали для оценки продукции цитокинов, включая ГБ6 и ГБ8, как описано ранее. Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. За клетками наблюдали под микроскопом и смену среды на свежую среду для дифференцировки проводили каждые вторые сутки. На 10 день среду удаляли и клетки фиксировали 10% парафармальдегидом в течение 30 мин. Клетки пермеабилизировали 0,1% Тритон Х-100 в РВδ в течение 15 мин и окрашивали ТР-меченым фаллоидином и красителем ^00^1 33432 (как описано ранее) для детектирования актина и ядер соответственно. Интенсивность окраски ядер использовали для определения пролиферации клеток в каждой лунке, и интенсивность окраски фаллоидином использовали для определения общего содержания актина. Клетки также окрашивали с помощью антител против скелетно-мышечного альфа-актина (СепТех, кат. № СТХ101362). Получали цифровые фотографии с использованием флуоресцентного микроскопа, а также проводили зрительное наблюдение и оценку всех лунок.

Дифференцировка и пролиферация мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Мезенхимальные стволовые клетки (МЗС) являются мультипотентными стволовыми клетками, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая остеобласты, хондроциты, миоциты, адипоциты, бета-клетки островков поджелудочной железы и, возможно, нервные клетки. Многие различные события вносят вклад в коммитирование МЗС в направлении других линий дифференцировки, включая координацию сложной сети транскрипционных факторов, кофакторов и сигнальных посредников многочисленных путей. МЗС привлекают повышенный интерес с точки зрения терапевтического значения, так как они представляют собой популяцию клеток, имеющих потенциальную способность лечения широкого диапазона острых и дегенеративных заболеваний.

Более того, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать дифференцировку МδС в различных направлениях развития, имеют высокий потенциал терапевтического применения для обеспечения ίη νίίτο или ίη νινο модуляции гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза, так же как и в широком диапазоне нарушений и заболеваний, включая, например, воспалительные ответы, аутоиммунные заболевания, рак, нейрональную дегенерацию, мышечную дистрофию, остеопороз и липодистрофию. Человеческие МБС являются иммунологически привилегированными и представляют собой предпочтительный тип клеток для аллогенной трансплантации, обеспечивающих снижение риска отторжения и осложнений после трансплантации. Недавно также были получены значительные достижения в применении аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для регенерации тканей человека, включая хрящ и мениск, связки и переломанную кость. Многие исследователи также изучали применение МБС для генной терапии, включая трансплантацию МБС, трансфицированых фактором роста сосудов эндотелия для улучшения функции сердца после инфаркта миокарда у крыс, использование МδС как носители для доставки интерферона-β в опухоли у мышей и генную терапию с помощью МБС, экспрессирующих ВМР для обеспечения формирования кости. Соответственно, в связи с повышенным интересом к МБС как к прямым и модифицированным терапевтическим агентам, а также потенциальной способностью полипептидов ΑΑΚδ действовать в качестве терапевтических агентов для регуляции дифференцировки МБС ίη νινο, полипептиды ΑΑΚδ тестировали как потенциальные индукторы пролиферации и дифференцировки МδС.

Методы: ΗМδС (стромальные клетки костного мозга человека) (Се11 Арр1юа1юп, кат. № 492-05Г) поддерживали в соответствии рекомендациями поставщика. Для культивирования клетки быстро размораживали и сразу переносили в 15 мл ростовой среды для стромальных клеток костного мозга (Се11 АррНса1юп, кат. № 419-500) и высевали в стандартный стерильный флакон с обработанной для тканевых культур поверхностью. Среду заменяли на свежую ростовую среду для стромальных клеток костного мозга каждые вторые сутки до достижения клетками >60% монослоя.

Клетки выращивали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты, ΒδΕ2, с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки высевали в 96-луночные аналитические планшеты с прозрачным дном и черными стенками, обработанные для оптимального прикрепления тканевых культур, для дифференцировки в концентрации 50000 клеток/мл. Произошедшие из тРНК-синтетазы белки в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах) добавляли в каждую аналитическую лунку. Все клетки поддерживали в ростовой среде в течение 2 дней, за исключением положительных контролей, которые стимулировали средой для остеогенной или хондрогенной дифференцировки (δΙοαΓίο, [ηγίΐτοдеп, кат. № А10072-01 и А10071-01 соответственно). Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в течение 48 ч. Растворимые молекулы УСАМ измеряли с использованием стандартного набора для твердофазного ИФА фирмы ΚΝΏ δу8ίοт8 (кат. № ΌΥ643). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. Планшеты анализировали с помо- 111 030461 щью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΑΑΚδ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только ΡΒδ. После оценки клеточной выживаемости резазурин удаляли с двумя сменами среды и добавляли 0,5Х среды для дифференцировки во все лунки. За дифференцировкой следили путем зрительного наблюдения всех лунок в течение 10 дней после смены среды, при смене на свежую среду каждые вторые сутки для поддержания клеток в здоровом состоянии. Дифференцировку оценивали с помощью окраски на щелочную фосфатазу с использованием окраски ЕЬР-97 (Iиν^ί^οдеη, кат.№ Ε6601) на 10 день после первой смены среды для дифференцировки. ^а^ е1 а1., №Щце РгоФсок, (6)187-213 (2011) То1:10,1038/прго1, 2010, 189).

Пролиферация и дифференцировка гладкомышечных клеток легочной артерии человека (ЬΡΑδМС).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Гладкомышечные клетки легочной артерии (ΡΑδМС) в нормальных кровеносных сосудах легкого взрослого человека являются наиболее неподвижными, не мигрирующими и сильно коммитированы в направлении выполнения их сократительной функции в легких. Однако ΡΑδМС являются не окончательно дифференцированными клетками и обладают способностью модулировать свой фенотип и выходить из состояния покоя в ответ на изменение локальных сигналов из окружающей среды. Указанное состояние дифференцировки может возникать в ходе развития, при повреждении ткани и ремоделировании сосудов в ответ на изменения в потребностях ткани. Легочная гипертензия (РН) связана с различными первичными состояниями, включая повышение легочного сопротивления периферических сосудов как результат повышения сосудистого тонуса и сократимости ΡΑδМС и ремоделирования сосудов. Ремоделирование сосудов включает рост ΡΑδМС, синтез материала матрикса и изменения во взаимодействиях клетка-клетка и клетка-матрикс в стенках малых легочных артерий (РА), что приводит к повышенной толщине гладкомышечного компонента стенки сосудов и нарушенной мускуляризации в норме не мускуляризованных дистальных РА. Указанный процесс вносит вклад в снижение диаметра просвета и повышение сопротивления периферических сосудов. Несмотря на то что конкретное участие ΡΑδМС в изначальной индукции заболевания является неоднозначным, происходящие изменения играют ключевую роль в клинических последствиях заболевания. Решающим этапом в изучении дифференцировки клеток является идентификация набора специфичных для клеток или селективных для клеток генов, которые вносят вклад в функцию (функции) дифференцировки клеток. Были идентифицированы различные гены гладкомышечных клеток ©МС), которые служат в качестве применимых маркеров относительного состояния дифференцировки или созревания сосудистых δМС, такие как гены гладкомышечного альфаактина, δМ МНС, Л1-кальпонина, δМ22-альфа, десмина, метавинкулина, смутелина и др. Наиболее широко используемый маркер представляет собой гладкомышечный альфа-актин, частично из-за коммерческой доступности ряда очень высокоаффинных и высокоселективных антител для указанного белка. Вопрос, являются ли изменения в ΡΑδМС результатом их собственных характеристик или дисрегуляции молекулярных событий, которые управляют ростом ΡΑδМС, остается открытым. Однако понимание регуляторных сигналов и механизмов нарушения регуляции их возможностей имеет важное терапевтическое значение для лечения различных сосудистых и легочных заболеваний, включая легочную гипертензию, сосудистые заболевания.

Таким образом, полипептиды ΑΑ^δ, которые способны модулировать дифференцировку и/или пролиферацию нормальных человеческих клеток ΡΑδМС, полученных от взрослого человека, обладают потенциалом терапевтического применения при различных сосудистых и легочных заболеваниях, включая воспалительные и обструктивные заболевания легких, включая, например, легочную гипертензию, хроническое обструктивное заболевание легких, идиопатический легочный фиброз и астму.

Методы.

Клетки ΗΡΑδМС (Се11 Αрр1^саί^οи5, кат. № 352-05а) поддерживали в ростовой среде ΗΡΑδМС (Се11 Αрр1^саί^οи5, кат. № 352-05а) в 15 мл среды во флаконах на 125 мл в течение 1 пассажа до использования. Клетки поддерживали при 37°’, 5% ’Ο₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты, Βδ^2, с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл помещали на покрытые коллагеном планшеты на ночь в ростовой среде при плотности клеток 50000 клеток/мл. В каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ в стерильном ΡΒδ в конечной концентрации 250 нМ (или как специально указано в приведенных ниже примерах). Контрольные лунки содержали только эквивалентный объем ΡΒδ. Образцы положительного контроля инкубировали в среде для дифференцировки ΗΡΑδМС, полученной от поставщика (Се11 Αрр1^саί^οи5, кат. № 311Ό-250). Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ или ΡΒδ в основной среде (Се11 Αрр1^саί^οи5, кат. № 310-470) в течение 48 ч с последующей сменой среды на среду для дифференцировки во всем планшете. Супернатант собирали и использовали для оценки продукции цитокинов, включая ГЬ6 и ГЬ8, как описано ранее. Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. За клетками наблюдали в течение 10 дней при смене среды каждый вторые сутки. Дифференцировку оценивали после фиксации, как описано выше, и пермеабилизации с помощью 0,1% Тритона

- 112 030461

Х-100, путем количественной оценки окраски на гладкомышечный альфа-актин с использованием антиЗМА-альфа антител (ОенеТех, кат. № ОТХ101362) и А1еха 405-конъюгированных вторых антител. Пролиферацию оценивали с помощью окрашивания красителем ^ссйк! после фиксации клеток в 10% формальдегиде в течение 30 мин. Краситель ^ссйк! выявляли с использованием флуоресцентного спектрофотометра для прочтения дна планшетов при длине волны возбуждения (Ех) 405 нм и длине волны испускания (Ет) 450 нм. Общую окраску на актин оценивали путем использования окрашивания А1еха-488-меченым фаллоидином (Iην^ΐ^οдеη, ка. № А12379).

Анализ связывания полипептидов ААКЗ с клетками (анализы Н1-Н10 в таблицах данных ниже).

Уровень техники и терапевтическое значение.

Связывание полипептидов ААКЗ с конкретными типами клеток демонстрирует, что рассматриваемый тип клеток экспрессирует специфические рецепторы для рассматриваемого полипептида ААКЗ. В зависимости от рассматриваемого типа клеток, клеточное связывание подразумевает потенциальную роль для полипептида ААКЗ в регуляции активности или поведения клетки или подобных типов клеток, ίη νίνο. Конкретные примеры указанных регуляторных ролей включают, например, связывание и модуляцию В-клеток и Т-клеток (иммуномодуляцию/хемотаксис/аутоиммунные заболевания/воспаления); клеток НерО2 (контроль метаболизма, захвата холестерина или метаболизма); клеток ТНР-1, Лцкак Кац (иммуномодуляцию/хемотаксис/аутоиммунные заболевания/воспаления), тромбоцитов (тромбоцитопоэз), адипоцитов 3Т3Ь1 (липогенез/метаболизм) и мышиных миобластов С2С12 (миогенез, остеогенез).

Связывание с клетками крови.

Методы.

Кровь от здоровых доноров собирали в пробирки, содержащие ЭДТА. 2 мл цельной крови помещали в пробирку РАСЗ на 5 мл (ΈηΚοη). Добавляли 2 мл буфера для окрашивания (РВЗ +2% эмбриональной бычьей сыворотки), перемешивали на вортексе в течение 3-5 с, центрифугировали в течение 5 мин при 300хд. Супернатант удаляли, повторяли промывку и осадок ресуспендировали в 2 мл буфера для окрашивания.

100 мкл отмытой крови переносили в чистые пробирки для образцов РАЗС на 5 мл. В пробирки добавляли Шк6- или V5-Н^56-меченные полипептиды ААКЗ в концентрациях, указанных в конкретных экспериментах, описанных ниже, и инкубировали на льду в течение 45 мин. После инкубации в пробирки добавляли антитела к поверхностным маркерам различных типов клеток (ΒΌ Рйагт1деи, кат. № 560910, 555398, 555415, 340953, 560361) и РГГС-меченные антиН5-антитела (ν5-ΡΠΌ, Ιηνίΐπ^η. кат. № К96325) или ПТС-меченые анти-Н156-антитела (АЪСат кат. № 1206), инкубировали в темноте на льду в течение 30 мин. После инкубации в пробирки добавляли 2 мл лизирующего раствора ΒΌ РАСЗ (кат. № 349202). Образцы перемешивали на вортексе и помещали на лед на 15 мин. Образцы промывали 1х2 мл РВЗ и ресуспендировали в 2 мл 2% формальдегида в РВЗ до проведения РАСЗ-анализа. Полипептиды ААКЗ, которые связывались более чем с 25% клеточной популяции, где антитело отдельно не имело значительного сигнала, считали искомыми.

Анализы связывания тромбоцитов.

мкл отмытой крови переносили в чистые пробирки для образцов РАСЗ на 5 мл, в пробирки добавляли Шк6- или V5-Н^56-меченные полипептиды ААКЗ в концентрациях, указанных в конкретных экспериментах, описанных ниже, и пробирки помещали на лед на 45 мин. В каждую пробирку добавляли 20 мкл СЭ61-пан-антител к тромбоцитам (ВЭ Рйагт1деи, кат. № 555754) и 0,5 мкл антиН5-ИТСмеченых антител (Iην^1^οдеη. К96325) или меченных РТТС анти-Н156 антител (АЪСат, кат. № 1206). Пробирки помещали на лед в защищенном от света месте на 30 мин. Образцы доводили до общего объема 2 мл 1% формальдегидом в РВЗ и анализировали с помощью проточной цитометрии в течение 24 ч. Полипептиды ААКЗ, которые связывались более чем с 25% клеточной популяции, где антитело отдельно не имело значительного сигнала, считали целевыми.

Связывание с клетками в культуре.

Приблизительно 1х10⁶ клеток в 100 мкл полной среды КРΜI помещали в пробирки РАСЗ на 5 мл. Шк6- или полипептиды ААКЗ добавляли в пробирки в концентрациях, указанных в конкретных экспериментах, приведенных ниже, и указанные пробирки помещали на лед на 45 мин. Образцы клеток промывали дважды 1 мл буфера для окрашивания (РВЗ + 2% эмбриональной бычьей сыворотки) и затем добавляли 0,5 мкл антиН5-ИТС антител (Iην^1^οдеη К96325) или меченых НТС антиШк6-антител (АЪСат, кат. № 1206) в буфере для окрашивания с 200 мкг/мл человеческого ЦС. образцы инкубировали на льду в защищенном от света месте в течение 30 мин. Образцы промывали дважды 1 мл буфера для окрашивания и затем доводили до общего объема 2 мл 1% формальдегида в РВЗ и анализировали с помощью проточной цитометрии в пределах 24 ч. Полипептиды ААКЗ, которые связывались более чем с 25% клеточной популяции, где антитело отдельно не имело значительного сигнала, считали искомыми.

- 113 030461

Исследования на животных: модуляция гематопоэза и циркулирующих цитокинов.

Уровень техники и терапевтическое значение.

Гематопоэз (в альтернативном варианте кроветворение или гемопоэз) представляет собой формирование клеточных компонентов крови. Все клеточные компоненты крови происходят из гематопоэтических стволовых клеток (Н8С), которые находятся в срединной части кости (костном мозге) и имеют уникальную способность давать начало всем различным зрелым типам клеток крови. Н8С являются самообновляющимися клетками: когда они пролиферируют, по меньшей мере некоторые из их дочерних клеток сохраняются как Н8С, таким образом, пул стволовых клеток не истощается. Каждая из других дочерних клеток Н8С (миелоидные и лимфоидные клетки-предшественники), однако, может быть коммитирована в направлении любого из альтернативных путей дифференцировки, что приводит к появлению одного или более специфических типов клеток крови, но не может самообновляться. Изменение компонентов крови в ответ на воздействие полипептида ΛΛΚδ, таким образом, предполагает, что полипептид ΛΛΚδ способен модулировать гематопоэз и регулировать развитие стволовых клеток гематопоэза.

Все клетки крови можно разделить на три линии: эритроидные клетки, лимфоциты и миелоциты.

Эритроидные клетки представляют собой переносящие кислород эритроциты. Как ретикулоциты, так и эритроциты являются функциональными и высвобождаются в кровь. Соответственно, содержание ретикулоцитов оценивает скорость эритропоэза, и изменение содержания эритроцитов предполагает, что полипептид ΛΛΚδ модулирует эритропоэз.

Лимфоциты являются основой приобретенной иммунной системы. Они происходят из общих лимфоидных предшественников. Лимфоидный ряд в основном состоит из Т-клеток и В-клеток (типы лейкоцитов крови). Соответственно, изменения количества или состава лейкоцитов в ответ на подвержение воздействию полипептида ΛΛΚδ предполагает, что указанный полипептид ΛΛΚδ модулирует лимфопоэз.

Миелоциты, которые включают гранулоциты, мегакариоциты и макрофаги и происходят из общего миелоидных предшественников, вовлечены в различные процессы, включая врожденный иммунитет, приобретенный иммунитет и свертывание крови. Соответственно, изменения содержания или состава миелоидных клеток в ответ на воздействие полипептида ΛΛΚδ предполагает, что указанный полипептид ΛΛΚδ модулирует миелопоэз. Такое же обоснование может использоваться для определения того, модулируют ли полипептиды ΛΛΚδ гранулопоэз, путем измерения изменений количества гранулоцитов в ответ на воздействие полипептидов ΛΛΚδ. Роль полипептида ΛΛΚδ в модулировании мегакариоцитопоэза можно прогнозировать на основании изменения состава или количества мегакариоцитов или тромбоцитов в крови.

Высвобождение цитокинов у мышей либо дикого типа, либо в различных системах животных моделей воспаления обеспечивает изначальную оценку потенциальной способности полипептидов ΛΛΚδ модулировать воспалительные ответы. Роль полипептидов ΛΛΚδ в модулировании острых хронических воспалительных процессов, например, можно с легкостью оценить с использованием мышиной модели алиментарного ожирения (ЭЮ). Модель ΌΙΟ основана на переводе грызунов на рацион с высоким содержанием жиров в течение нескольких месяцев, что приводит к повышенному ожирению, устойчивости к инсулину и дисфункции иммунной системы. Конкретное последствие указанной дисрегуляции иммунной системы приводит к повышенной продукции провоспалительных цитокинов у животных, страдающих ΌΙΟ, приводя к состоянию хронического системного воспаления. Увеличивается количество доказательств, указывающих на то, что слабовыраженное воспаление вносит вклад в развитие и поддержание ожирения и диабетического фенотипа, который подобным образом наблюдается при состоянии человека, называемом метаболическим синдромом. Таким образом, способность полипептидов ΛΛΚδ модулировать иммунную систему и восстанавливать гомеостатический баланс в сторону нормализации указанного хронического воспалительного состояния, может являться особо благоприятным при многих заболеваниях и нарушениях, включая, но не ограничиваясь перечисленными, лечение и предотвращение симптомов и побочных эффектов метаболических заболеваний, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, ожирения, а также различных аутоиммунных заболеваний и нарушений, включая, например, рассеянный склероз, сосудистые и аллергические нарушения.

Методы.

Самцов контрольных мышей дикого типа (С57ВЬ/6) или мышей с алиментарным ожирением (С57В^/6NΗβά) получали из лаборатории Наг1ап (Индианаполис, Индиана) и держали по отдельности. Мышей ΌΙΟ содержали на рационе с повышенным содержанием жиров (кат. № ТО,06414-60% ккал из жира) и контрольных мышей содержали на нормальном рационе (кат. № 2018δ-18% ккал из жира). Мышей ΌΙΟ переводили на рацион с высоким содержанием жиров, начиная с 6-недельного возраста, на период в общей сложности 10 недель. Мыши ΌΙΟ и контрольные мыши имели неограниченный доступ к пище и воде. На 16-недельном возрасте мышей сортировали и случайным образом делили в группы по 5 животных на основе массы тела. На 2 день мышей взвешивали и собирали кровь из хвостовой вены (100 мкл) для предварительной обработки общего анализа крови (СВС). На 1 день мышей взвешивали и внутривенно инъецировали через хвостовую вену носитель ^В8) или отдельные полипептиды ΛΛΚδ в концентрации 10 мг/кг. Через 4 ч после инъекции у мышей собирали кровь из лицевой вены

- 114 030461 (150-200 мкл) для последующего анализа цитокинов. На 2, 3 и 4 день, мышей внутривенно дозировали так же, как на 1 день. На 5 день мышей взвешивали, умерщвляли и собирали кровь посредством пункции сердца для общего анализа крови (СВС анализ) (плазма-ЭДТА) и оценки цитокинов (сыворотка).

Клинический анализ крови (общий анализ крови, СВС) и анализ цитокинов.

Клинический анализ крови проводили на образцах крови, полученных до инъекций (день -2) и через 24 ч после последней инъекции (день 5). С помощью СВС оценивали общее содержание лейкоцитов крови и общую морфологию эритроцитов крови. Лейкоциты крови дополнительно охарактеризовывали по общему и относительному процентному содержанию нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов. Анализ эритроцитов включал измерение гемоглобина (бЬ), гематокрита (%), средний объем эритроцитов (ГО), среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (%) и общее количество тромбоцитов (10³/мкл). Анализ СВС проводили с помощью ΑηΚΛ Όί;·ΐ8ηο8ΐΧ8 (р18Ьег8, ΙΝ).

Уровень циркулирующих цитокинов оценивали через 4 ч после инъекции (1 день) и через 24 ч после последней инъекции (5 день). Сыворотку выделяли, мгновенно замораживали и отправляли в центр Ри1е8 Βа8еб Мебюше (Остин, Техас) для проведения множественного анализа. Образцы сыворотки анализировали с использованием панели ЕобейМар, включающей 59 уникальных биомаркеров, включая Аро А-1, СЭ40, СО40-Ь, СЕР, ЕТ-1, эотаксин, ЕСР, Фактор УН, фибриноген, РСР-9, РСР-основный, С8Т-и, ССР-2, СМ-С8Р, КС/СРПа, гаптоглобин, Ι§Α, ΙΡΝγ, ΙΓ-10, ГО-1а, ГО-Щ, ΙΕ-10, ΙΕ-11, ГО-12р70, Ι1-17Α, ΙΕ-18, ГО-2, ГО-3, ГО-4, ГО-5, ГО-6, ГО-7, ЬГО, лимфотактин, М-С8Р-1, МГО-1а, МГО-Щ, МТО-Ц, МГР-2, МГО^, МОС, ММР-9, МСР-1, МСР-3, МСР-5, ΜРΟ, миоглобин, δΑΕ 8СОТ, 8СР, ΚΑNТΕδ, ТРО, тканевой фактор, ИМР-Е ТОТ-а, УСΑΜ-1, УЕСР-Α и у\УР. Изменение уровня цитокинов считали искомым, если цитокин повышался по меньшей мере в 2 раза или понижался по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем носителя.

Пример 1.

Идентификация протеолитических фрагментов и продуктов альтернативного сплайсинга ΑΑΚδ с использованием платформ анализа топографии и миграции белка.

Для идентификации фрагментов ΑΑΚδ из клеточных линий, кондиционированной среды и тканей, образцы готовили следующим образом.

Мышиные макрофаги (ΚΑν 264,7), цитозоль и кондиционированные среды.

Клетки обрабатывали бессывороточной средой ЭМЕМ в плотности 15х10⁶ клеток/флакон. Через 48 ч кондиционированную среду и клеточные осадки собирали и обрабатывали. 200 мкг белка из секретированной и цитозольной протеомной фракции разделяли с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии ДСН и готовили кусочки геля для анализа с помощью масс-спектрометрии.

Ткань поджелудочной железы мыши: Поджелудочную железу из трех мышей разрезали, гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и обрабатывали ультразвуком в РΒδ с ингибиторами протеаз. Белки цитозоля выделяли путем центрифугирования и 200 мкг белка разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и готовили кусочки геля для анализа с помощью масс-спектрометрии. Ткань печени мыши: печени трех мышей вырезали, гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и обрабатывали ультразвуком в РΒδ с протеазными ингибиторами. Белки цитозоля выделяли посредством центрифугирования и 200 мкг белка разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и готовили кусочки геля для анализа с помощью масс-спектрометрии.

Гелевые гидролизаты анализировали с помощью масс-спектрометра с ионной ловушкой БТО ΧΣ (ТЬегтоР18Ьег), снабженного собранной системой 3000 цЬС (Эюпех). Образцы сначала наносили на РерТгар (тюЬгот) в течение 10 мин с 5% ацетонитрилом в 0,1% муравьиной кислоте с использованием автоматического дозатора Эюпех. Затем образцы анализировали с использованием капиллярной колонки из кварцевого стекла, 100 мкм (внутренний диаметр), содержащей 10 см смолы С18 (тюЬгот). Пептиды вымывали из колонки в масс-спектрометре при скорости тока 0,45 мкл/мин с использованием линейного градиента 5-33,5% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте в пределах 110 мин.

БТО работает в зависимом от данных режиме сканирования таким образом, что за одним полным МС сканом следует семь МС/МС сканов семи наиболее распространенных ионов. Динамическое исключение обеспечивается при числе повторов, равном 1, длительности повтора, равном 20 с, размер эксклюзионного списка составляет 300 и длительность эксклюзии составляет 60 с.

После анализа ЖХ/МС/МС необработанные данные обрабатывали с помощью Βίο\νοιΊ<8 3.3.1 (8ЕС)ЕЕ8Т) с использованием составленного варианта базы данных реальных/ложных мышиных ГРГ Данные 8ЕОЕЕ8Т фильтровали и сортировали с помощью программы ^ТΑδе1ес!. В табл. 1, 4 и 7 показаны последовательности, идентифицированные указанным способом.

Пример 2.

Идентификация сплайс-вариантов с использованием глубокого секвенирования.

Сплайс-варианты аминоацил-тРНК-синтетазы идентифицировали с использованием высокоэффективного секвенирования библиотеки кДНК для транскриптов аминоацил-тРНК-синтетазы. Матрицы

- 115 030461 кДНК готовили из общих экстрактов РНК тканей, таких как мозг взрослого человека и эмбриона, и обогащенных аминоацил-тРНК-синтетазой транскриптов с использованием последовательностей праймеров, специфичных для всех отмеченных экзонов всех указанных человеческих аминоацил-тРНК-синтетаз и ассоциированных с ними белков.

Тотальную РНК человека получали из С1оп!есЬ. Для образцов клеточной линии и ткани мыши тотальную РНК экстрагировали с использованием набора для экстракции ΚΝΑ ΕχΙκ-ια II (МЩ. Геномную ДНК расщепляли в образцах тотальной РНК с помощью ДНКазы I. Для получения зрелой матричной РНК (мРНК) образцы РНК обогащали дважды путем связывания полиА+ РНК и расщепления РНК без 5'-кэпа с помощью 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазы. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из зрелой РНК с использованием праймеров, которые гибридизуются с последовательностями экзонов генов аминоацил-тРНК-синтетазы. Транскрипты, обогащенные генами аминоацил тРНК-синтетазы, амплифицировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием специфичной к экзону аминоацилтРНК-синтетазы кДНК и различных комбинаций праймеров экзонов аминоацил-тРНК-синтетазы.

Двухцепочечные транскриптомные продукты ПЦР, обогащенные аминоацил-тРНК-синтетазой, ферментативно восстанавливали по обоим концам перед добавлением А-липкого конца к 3'-концам восстановленных фрагментов. Затем добавляли адаптеры секвенирования и индексированные последовательности к транскриптомным продуктам ПЦР, обогащенным аминоацил-тРНК-синтетазой для получения библиотеки кДНК для глубокого секвенирования с использованием набора для мультиплексного секвенирования Шитша. Вкратце, транскриптомные продукты ПЦР, обогащенные аминоацил-тРНКсинтетазой с 3'-А липкими концами лигировали с адаптерными нуклеотидами IηΡΕ, предложенными в наборах. Индексированные последовательности добавляли к продуктам ПЦР с адаптерами IηΡΕ. Для получения достаточного количества фрагментов ДНК для глубокого секвенирования продуктов ПЦР с индексированной последовательностью далее амплифицировали с помощью ПЦР. Обогащенную аминоацил-тРНК-синтетазой библиотеку кДНК с различными индексами объединяли и секвенировали с использованием ДНК-секвенатора Шитта для получения концевых считываний, содержащих 50 пар оснований. Считывания (геабк), полученные в результате секвенирования, картировали для генома человека или мыши для идентификации событий альтернативного сплайсинга. Программное обеспечение δ|31^ιη;·ΐ|3 (общедоступное для скачивания на 1Ш|з:/Λγ\γ\γ-кιаι.кιа11Го^б.еби/~ктГа^/δ|з1^сеΜа|з/) используется для идентификации границ сплайсинга.

Глубокое секвенирование указанной кДНК проводили для получения примерно 1 миллиона считываний секвенирования, состоящих примерно из 50 нуклеотидов в длину.

Последовательности, специфичные для экзонов аминоацил-тРНК-синтетазы, сравнивали с аннотированными экзонами соединений и новые границы экзонов идентифицировали как варианты альтернативного сплайсинга.

Колонки в табл. 2, 5 и 8, обозначенные 5'-экзон и 3'-экзон, указывают, какие экзоны (при их наличии) сливаются в последовательности кДНК. В табл. 2, 5 и 8 показаны последовательности, которые были идентифицированы как варианты альтернативного сплайсинга, транскрипты, содержащие указанные варианты сплайсинга, и полипептиды, экспрессированные указанными транскриптами. Варианты альтернативного сплайсинга, идентифицированные с помощью глубокого секвенирования, обозначены в табл. 2, 5 и 8 как варианты, для которых в колонках считываний секвенирования соответствует значение больше нуля, для мозга взрослого и эмбриона человека.

Пример 3.

Идентификация полипептидов ΑΑΚδ с использованием биоинформатики.

Белковые фрагменты ΑΑΚδ (резектины или аппендакрины) идентифицировали с использованием биоинформатических подходов. Аминокислотные последовательности полноразмерной человеческой аминоацил-тРНК-синтетазы выравнивали с полноразмерной аминокислотной последовательностью ее ортолога из бактерии ΕκΗκπΗιίίΐ соП с использованием таких программ, как ΡΑδТΑ (доступна на сайте в интернете 1Шр://Гак1а.Ыос11лагд1ша.еби/Гак1а_\у\у\у2/Гак1а_\у\у\у.сд1) или программы В^ΑδТΡ из NСВI (доступна на сайте в интернете

Ь!!ρ://№№№.псЪ^.η1т.шЬ.доν/Ъ1акί/В1ак!.сд^?ΡΚΟСΚЛΜ=Ъ1акίρ&В^ΑδТ_ΡΚΟСΚЛΜδ=Ъ1акίρ&ΡΑСΕ_ТΥΡΕ =В1ак!δеа^сЬ&δНΟ^_^ΕΡΑυ^Тδ=оп&^INΚ_^ΟС=Ъ1ак!Ьот ). Последовательности резектина из человеческих белков идентифицировали как покрывающие участки последовательности при наличии при выравнивании пропусков в бактериальной последовательности или области с низкой гомологией между двумя видами. Указанные пептиды и соответствующие последовательности ДНК в табл. 3, 6 и 9 включают примеры, идентифицированные таким образом.

Пример 4.

Дифференциальная экспрессия полипептидов ΑΑΚδ, идентифицированных с помощью массспектрометрии.

Для сравнения дифференциальной экспрессии аспартил-тРНК-синтетазы в различных тканях/клеточных типах (последовательности и сравнения в табл. 1, 4 и 7) использовали технологию ΡΚΟТΟΜΑΡ, как описано в примере 1: экспрессию резектина аминоацил-тРНК-синтетазы сравнивали между тканью мышиной печени и тканью мышиной поджелудочной железы. Экспрессию резектина аминоацил- 116 030461 тРНК-синтетазы сравнивали между цитозолем клеток ΚΑν264.7 и кондиционированной средой от клеток ΚΑν264.7. собранной через 48 ч после инкубации в бессывороточной среде.

Пример 5.

Дифференциальная экспрессия полипептидов ΑΑΚδ. идентифицированных путем глубокого секвенирования.

Для анализа дифференциальной экспрессии сплайс-вариантов проводили глубокое секвенирование для кДНК. полученных из различных тканей.

Экспрессия конкретных вариантов альтернативного сплайсинга аминоацил-тРНК-синтетазы является не ожидаемым явлением и указывает на биологическую важность. Различие относительного числа считываний. наблюдаемых при глубоком секвенировании различных образцов транскриптома. указывает на то. что события альтернативного сплайсинга аминоацил-тРНК-синтетазы дифференциально регулируются и не являются просто артефактами. связанными с обработкой образца.

Пример 6.

Скрининг антител.

Для облегчения поиска антител. проявляющих предпочтительное связывание со специфическими фрагментами аминоацил-тРНК-синтетазы (например. повышенная в >10 раз аффинность по сравнению с исходным полноразмерным ферментом). проводили скрининг библиотеки фагового дисплея человеческих антител с помощью ΑЬ^ δοΓΟΙοα (подразделение ΜΘΚΡΗΘδΥδ™. Магйикпей/Иапедд. Германия) с использованием методов аффинного обогащения (пэннинга). Антитела. после множества циклов скрининга. обогащенные фрагментами аминоацил-тРНК-синтетазы. затем исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа на предмет реактивности с фрагментами и с исходным полноразмерным ферментом. Клоны. демонстрирующие предпочтительное связывание (например. в >10 раз повышенную аффинность) с фрагментами аминоацил-тРНК-синтетазы. дополнительно охарактеризовывали.

Если необходимая специфичность не достигалась в конце процесса. использовали стратегии вычитания. такие как этапы предварительной абсорбции с полноразмерным ферментом и/или контрскрининга. для устранения перекрестно реагирующих антител. и запускали процесс селекции в отношении уникального эпитопа (эпитопов) на фрагментах аминоацил-тРНК-синтетазы.

Пример 7.

Идентификация сплайс-вариантов с использованием системной ПЦР.

Матрицы кДНК для реакций ПЦР были обратно транскрибированы из экстрактов тотальной РНК тканей или клеток (например. мозга человека. ΙΜΚ-32 и НЕК293Т). Реакции ПЦР проводили с использованием специфических праймеров аминоацил-тРНК-синтетазы. с прямым праймером (ΡΡ1). сконструированным для гибридизации с 5'-нетранслируемым участком или экзонами в 5'-половине гена. и с обратным праймером (ΚΡ1). сконструированным для гибридизации с экзонами в 3'-половине гена или 3'υΤΚ. Амплифицированные продукты ДНК анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле для идентификации продуктов ПЦР. которые отличаются по размеру от фрагментов. амплифицированных из традиционных транскриптов. Указанные различные продукты ПЦР вырезали и очищали из геля и лигировали в стандартный вектор клонирования для анализа последовательности ДНК. Варианты альтернативного сплайсинга идентифицировали как разные последовательности из традиционных транскриптов. Сплайс-варианты. идентифицированные с помощью указанного метода системной ПЦР. показаны в табл. 2. 5 и 8.

Пример 8.

Кодон-оптимизация выбранных полинуклеотидов ΑΑΚδ.

Типичные полипептиды ΑΑΚδ (суммированные в табл. Е2) выбраны для дальнейшего биохимического. биофизического и функционального анализа на основе одного или более из следующих критериев: ί) идентификация протеолитических фрагментов полипептида ΑΑΚδ. ίί) идентификация сплайсвариантов полипептида ΑΑΚδ. ίίί) идентификация полипептидов ΑΑΚδ путем биоинформатического анализа. ίν) доказательство дифференциальной экспрессии конкретных полипептидов ΑΑΚδ. ν) доменная структура белка ΑΑΚδ. νί) размер полипептида ΑΑΚδ и νίί) минимизация одинаковых дублирующихся последовательностей.

- 117 030461

Таблица Е2

Полипептиды ААН8, выбранные для кодон-оптимизации и бактериальной экспрессии

Название полипептида ААНЗ	ЗЕ<2 Ю N0: для эпитопно меченных полипептидов ААНЗ	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: для поли- нуклеотидов ААНЗ	Остатки белка ААНЗ	Положение эпитопной метки	Используемый способ клонирования/синтеза
АзрНЗ!142	8Εζ) Ιϋ N0: 52	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 66	1-274	Ν-концевое	2
АзрНЗ 1Ν2	5Ες Ιϋ ΝΟ: 53	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 66	1-274	С-концевое	2
АзрНЗ 1Ν3	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 54	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 67	1-224	Ν-концевое	2
АзрНЗ 1Ν3	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 55	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 67	1-224	С-концевое	2
АзрНЗ 1Ν4	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 56	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 68	1-184	Ν-концевое	2
АзрНЗ 1Ν4	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 57	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 68	1-184	С-концевое	2
АзрНЗ!146	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 58	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 69	1-41+73-501	Ν-концевое	2
Α3ρΗ31Ν6	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 59	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 69	1-41+73-501	С-концевое	2
АзрНЗ 1Ν7	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 60	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 70	1-141+189-501	Ν-концевое	2
АзрНЗ 1Ν7	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 61	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 70	1-141+189-501	С-концевое	2
АзрНЗ!148	3ΕΟ Ιϋ ΝΟ: 62	3ΕΟ Ιϋ ΝΟ: 71	1-319+369-501	Ν-концевое	2
АзрНЗ!148	3Ες Ιϋ ΝΟ: 63	3Ες Ιϋ ΝΟ: 71	1-319+369-501	С-концевое	2
АзрНЗ!149	3Ες Ιϋ ΝΟ: 64	3Ες Ιϋ ΝΟ: 72	1-22+63 аа	Ν-концевое	2
АзрНЗ!149	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 65	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 72	1-22+63 аа	С-концевое	2
АзрН31с1	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 82	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 86	297-501	Ν-концевое	2
АзрН31с1	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 83	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 86	297-501	С-концевое	2
АзрНЗ Iе2	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 84	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 87	101-501	Ν-концевое	2
АзрНЗ 1е2	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 85	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 87	101-501	С-концевое	2
АзрН3121	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 100	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 104	38-292	Ν-концевое	2
АзрН3121	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 101	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 104	38-292	С-концевое	2
АзрН3113	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 102	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 105	23-154	Ν-концевое	2
АзрНЗ!13	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 103	5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 105	23-154	С-концевое	2

Полинуклеотиды, кодирующие выбранные полипептиды ААК8, перечисленные в табл. Е2, наряду с соответствующей Ν- или С-концевой эпитопной меткой, синтезировали и клонировали, как описано в разделе Общие материалы и способы, с использованием метода синтеза генов, указанного в табл. Е2.

Пример 9.

Низкопроизводительная бактериальная экспрессия и очистка.

Полипептиды ААК8, перечисленные в табл. Е2, экспрессируются в Е.соН, как описано в разделе Общие материалы и способы. Относительная экспрессия растворимых и локализованных в тельцах включения полипептидов ААК8 суммирована в табл. Е3.

- 118 030461

Таблица Е3

Суммарные характеристики бактериальной экспрессии полипептида ААКЗ

++ обозначает экспрессию 1-5 мг/л полипептида ААКЗ;

+++ обозначает экспрессию 5-10 мг/л полипептида ААКЗ;

++++ обозначает экспрессию 10-15 мг/л полипептида ААКЗ;

+++++ обозначат экспрессию >15 мг/л полипептида ААКЗ;

N1): не определено.

Неожиданным образом данные по экспрессии белка показали существование по меньшей мере одного семейства белковых доменов, для которых наблюдается высокий уровень экспрессии растворимого белка при экспрессии в Е.соП. В частности, указанные данные демонстрируют, что АзрКЗ1^№ (аминокислоты 1-224) и АзрКЗ1^ж (аминокислоты 1-184) полипептидов ААКЗ определяют границу первого нового белкового домена, который на высоком уровне экспрессируется в Е.соП. Кроме того, большинство остальных белков может с легкостью экспрессироваться в тельцах включения для последующей повторной укладки.

Пример 10.

Крупномасштабная продукция полипептидов ААКЗ.

Типичные полипептиды ААКЗ получали в большем количестве для проведения дальнейшего функционального и биофизического исследования. Полипептиды ААКЗ, перечисленные в табл. Е4, экспрессировали в более масштабной культуре Е.соП, как описано в разделе Общие материалы и способы. Выход и конкретные биофизические характеристики для каждого экспрессируемого растворимого белка суммированы в табл. Е4.

- 119 030461

Суммарные данные выхода и биофизической характеристики типичных

Таблица Е4 полипептидов ААК8

ААКЗ поли- пептид	Положение эпитопной метки	Выход [мг/л] (1)	Чистота [%]	Эндотоксин [ЕЭ/мг]	Молекулярная масса	Рабочая исходная концентрация [мг/мл]	Стабильность [процентное восстановления] (2)	Агрегация [ОЬЗ]
АзрКЗ 1Ν4	Ν-концевой	15, 5	95	0, 8	С: 23392 М: 23396	22	92	+
АзрКЗ 1Ν4	С-концевой	14,4	95	0, 8	С: 23392 М:23266(4)	20	84	+
АзрК.3113	Ν-концевой	6, 6	95	1,5	С: 16573 М: 16575	11	8	+ + + + +
АзрК.3113	С-концевой	5, 1	95	1,9	С: 16573 Μ: 16445'4’	11	2	+ + + + +
АзрК31с1	Ν-концевой	0,2	95	49	Νϋ	Νϋ	ΝΌ	Νϋ

(1) : Выход, определенный путем измерения восстановления белка после последнего этапа очистки.

(2) : Определена как процентное восстановление не агрегированного материла через 1 неделю при 25°С.

(4): Вероятно, представляет собой МА без Ν-концевого метионина.

С: Рассчитано.

М: Определенная молекулярная масса (массы).

+ обозначает менее 1% высокомолекулярных белковых агрегатов.

++ обозначает менее 2% высокомолекулярных белковых агрегатов.

+++ обозначает менее 5% высокомолекулярных белковых агрегатов.

++++ обозначает менее 10% высокомолекулярных белковых агрегатов.

+++++ обозначает более 10% высокомолекулярных белковых агрегатов.

ΝΏ: Не определено.

Результаты указанных исследований показали, что типичные белки ААК8 из семейств белков ААК8 ΆδрΚ81^N4 и ΆδрΚ81^I3 имеют приемлемый изначальный уровень белковой экспрессии и характеристики растворимости.

Пример 11.

Анализ транскрипции типичных полипептидов ААК8.

Для тестирования способности полипептидов ААК8 модулировать экспрессию генов, выбранные полипептиды ААК8 инкубировали с мезенхимальными стволовыми клетками или человеческими клетками скелетной мускулатуры в течение времени и в концентрации, показанными в табл. Е5.

Таблица Е5

Анализ уровня транскрипции типичных полипептидов ААК8 в мезенхимальных стволовых клетках или человеческих скелетно-мышечных клетках (Н8кМС)

Описание исследуемого образца	Тип клеток и время воздействия
Полипептиды ААКЗ	Положение эпитопной метки	Концентрация, нМ	МЗС 24 часа	МЗС 72 часа	НЗкМС 24 часа	НЗкМС 72 часа
АзрКЗ 1Ν2	Ν-концевое	250	>20	0	6	6
АзрКЗ 1Ν3	Ν-концевое	250	18	20	4	4
АзрКЗ 1Ν3	С-концевое	250	22	20	2	5
АзрКЗ 1Ν4	Ν-концевое	250	18	10	4	7
АзрКЗ 1Ν4	С-концевое	250	14	8	6	4
АзрКЗ 1Ν6	Ν-концевое	250	Νϋ	3	2	6
АзрКЗ 1Ν/	С-концевое	250	>20	1	5	3
АзрКЗ 1Ν8	Ν-концевое	250	>20	1	7	3
АзрКЗ 1Ν9	Ν-концевое	250	>20	1	6	4
АзрКЗ!149	С-концевое	250	16	0	7	2
АзрК31с1	Ν-концевое	250	16	2	4	4
АзрК31с1	С-концевое	250	>20	1	9	2
АзрКЗ Iе2	Ν-концевое	250	Νϋ	6	3	6

- 120 030461

АзрВ.3111	Ν-концевое	250	15	7	6	4
АзрВ.5113	Ν-концевое	250	15	2	2	3
АзрНЗ!13	С-концевое	250	8	2	7	3
Контроли
Среднее для всех подверженных скринингу полипептидов ААНЗ	6	2	5	4
Смесь для остеогенеза	16	18	ΝΑ	ΝΑ
Смесь для хондрогенеза	11	16	ΝΑ	ΝΑ
Смесь для адипогенеза	11	11	ΝΑ	ΝΑ
Смесь для дифференцировки ЗКМС	ΝΑ	ΝΑ	32	20
Необработанные	0	0	8	3

В табл. Е5 значения в каждой колонке обозначают число генов, активность которых была модулирована, положительно или отрицательно по меньшей мере в 4 раза по сравнению с контрольными образцами, как описано в разделе Общие способы. Данные показывают, что конкретные формы исследуемых полипептидов ΑΑΚδ имеют непредвиденную способность регулировать транскрипцию и, таким образом, потенциально могут модулировать направление развития или состояние дифференцировки при их добавлении к мезенхимальным стволовым клеткам (Μδ^ и/или человеческим скелетно-мышечным клеткам (ΗδкΜС). Закрашенные ячейки с изолированными жирным шрифтом номерами в таблице представляют собой примеры, где полипептид ΑΑΚδ оказывает значительное влияние на регуляцию транскрипции генов в клеточных линиях, с такой кратностью, как указано в таблице.

Был сделан вывод, что ΑκρΚδ1^Ν2, ΑκρΚδ1^Ν3, ΑκρΚδ1^Ν4, ΑκρΚδ1^Ν6, ΑκρΚδ1^Ν7, ΑκρΚδ1^Ν8, ΑκρΚδ1^Ν9, ΑκρΚδ1^α, ΑκρΚδ1^, ΑκρΕ-δ^¹, ΑκρΚδΓ² и ΑκρΚδΓ³ являются важными регуляторами экспрессии генов мезенхимальных стволовых клеток и/или человеческих клеток скелетной мускулатуры.

Пример 12.

Функциональный анализ полипептидов ΑΑΚδ.

Для анализа способности полипептидов ΑΑΚδ модулировать ряд фенотипических процессов выбранные полипептиды ΑΑΚδ инкубировали с клеточными типами и при условиях, представленных в разделе Общие способы и в табл. Е5 и Е6.

Таблица Е6

Принципы анализов и критерии для детектирования искомого соединения

Анализы пролиферации
Источник и тип клеток	Номер анализа
Клетки мегакариоцитарного лейкоза человека/Мо7е	А1
Клетки острого промиелоцитарного лейкоза человека/НЪбО	А2
Клетки лимфобласта человека (раковая клеточная линия)/НРМ18226	АЗ
Мезенхимальные стволовые клетки человека/ПМЗС
Астроциты человека	А5
Клетки острого моноцитарного лейкоза человека/ТНР1	Аб
Клетки аспирата костного мозга человека/клетки костного мозга (долговременная культура)	А7
Синовиоциты человека/НБИЗ-ЗупНА	А8
Пре-адипоциты человека/ΗΡΑϋ	А9
Гладкомышечные клетки легочной артерии человека/ПРАЗМС	А10
Клетки скелетной мускулатуры человека/ПЗКМС	А11
Анализ данных анализов пролиферации проводили путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААНЗ считали стимуляторами пролиферации, если измеренные значения более чем на 3 3Ό отличалось от значения для ФСБ в положительном направлении. Произошедший из тРНК-синтетазы полипептид ААНЗ считали цитотоксичным, если наблюдали отличие более чем на 3 3Ό от значения для ФСБ в отрицательном направлении. Цитотоксические соединения использовали в качестве отрицательного контроля и среднее

- 121 030461 значение для указанного соединения всегда больше чем на 3 ЗВ отличалось от среднего значения для ФСБ.

Анализы дифференцировки клеток и фенотипа

Описание анализа

Захват ацетилированного ЛПНП гепатоцитами человека (клетками НерС2СЗа)

Номер анализа

В1

Анализ данных анализа захвата Ас-ЛПНП осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААКЗ считали модуляторами захвата Ас-ЛПНП, если измеренное значение более чем на 2 ЗВ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении. Визуальный контроль для подтверждения результатов, полученных с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов, осуществляли с использованием флуоресцентного микроскопа.

Анализы нейтрофилов человека

Описание анализа «Кислородный взрыв» нейтрофилов (агонист) «Кислородный взрыв» нейтрофилов (антагонист)

Эластаза нейтрофилов

Номер анализа

С1

С2

СЗ

Анализ данных анализа нейтрофилов осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААКЗ считали модуляторами продукции эластазы нейтрофилами или биологии окислительного взрыва, если измеренные значения более чем на 2 ЗБ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении.

Модуляцию То11-подобных рецепторов (ТЬК)
Описание анализа	Номер анализа
Активация ТЬК в клетках КАК ВЪиЕ	В1
Антагонизм в отношении ТЬК в клетках КАК ВЪиЕ	В2
Активация ПТБК2	ВЗ
Активация ПТБК4	В4
Анализ данных для анализов модуляции ТЬК осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААКЗ считали модуляторами специфической биологии ТЬК, если измеренные значения более чем на 3 ЗБ отличилось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении. Положительные контроли, включая БРЗ и выявляющий реагент, всегда имели значительное отличие и на > 3 ЗБ отличались от среднего значения для ФСБ.
Высвобождение цитокинов
Описание анализа	Номер анализа
Продукция цитокинов синовиоцитами человека (высвобождение 1Б6)	Е1
Продукция цитокинов гладкомышечными клетками легочной артерии человека (ПРАЗМС) (высвобождение 1Б6)	Е2
Продукция цитокинов клетками скелетной мускулатуры человека (ПЗКМС) (высвобождение 1Б6)	ЕЗ
Продукция цитокинов астроцитами человека (высвобождение 1Б6)	Е4
Общее высвобождение 1Б6 из крови	Е5

- 122 030461

Продукция цитокинов (высвободение 1Ь8) гладкомышечными клетками легочной артерии человека (ПРАЗМС), инкубация в течение 72 часов	Е6
Продукция 1Ь8
Описание анализа	Номер анализа
Продукция цитокинов синовиоцитами человека (высвобождение 1Ь8)	Е7
Гладкомышечные клетки легочной артерии человека/ПРАЗМС (высвобождение 1Ь8)	Е8
Продукция цитокинов клетками скелетной мускулатуры человека (П5КМС) (высвобождение IЪ 8)	Е9
Продукция цитокинов астроцитами человека (высвобождение 1Ь8)	ЕЮ
Клетки острого моноцитарного лейкоза человека/ΤΗΡΙ (высвобождение 1Ь8)	Е11
Клетки острого промиелоцитарного лейкоза человека/НЬбО (высвобождение 1Ь8)	Е12
Клетки лимфобласта человека/КРМ18226 (высвобождение 1Ь8)	Е13
Продукция ΤΝΓ-альфа
Гепатоциты человека/клетки Нер62СЗа (высвобождение ΤΝΚ-альфа)	Е14
Клетки острого моноцитарного лейкоза человека/ΤΗΡΙ (высвобождение ΤΝΓ-альфа)	Е15
Высвобождение 1Ъ10
Высвобождение 1Ъ10 из клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека/НЬбО	Е16
Первичные мононуклеары крови человека (высвобождение ШО)	Е17
Анализ данных анализов высвобождения цитокинов осуществляли путем деления числового значения для
аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета.
Полипептиды ААНЗ считали модуляторами продукции цитокинов или связанной с цитокинами биологии, если
измеренное значение больше, чем 2 ЗГ отличалось от значения для ФСБ в	положительном или

отрицательном направлении. Проводили анализ белкового стандарта (конкретного для каждого набора анализа) на каждом планшете для подтверждения хорошего качества анализа. Только анализы, кривые белковых стандартов для которых имели значение Н2>0,9, были выбраны для анализа данных.
Адгезия клеток и хемотаксис
Описание анализа	Номер анализа
Адгезия клеток моноцитов ТНР 1/эндотелиальнрых клеток пупочной вены человека (НиУЕС)	Е1
Гепатоциты человека (Нер62СЗа клеток) (высвобождение 1САМ)	Е2
Регуляция клеточной адгезии клеток эндотелия микрососудов легкого человека (НЬМУЕС) (высвобождение 1САМ)	ЕЗ
Регуляция клеточной адгезии клеток эндотелия пупочной вены человека (НТЗУЕС) (высвобождение УСАМ)	Е4
Регуляция клеточной адгезии мезенхимальных стволовых клеток человека (ПМЗС) (высвобождение 1САМ)	Е5
Регуляция клеточной адгезии клеток эндотелия микрососудов легкого человека (НТСУЕС) (высвобождение 1САМ)	Е6
Регуляция клеточной адгезии гладкомышечных клеток легочной артерии человека (ПРАЗМС) (высвобождение УСАМ)	Е7
Анализ данных анализа ре±'уляции клеточной адгеши оиущеызляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААНЗ считали модуляторами клеточной адгезии или регуляторами биологии, связанной с клеточной адгезией, если получали значение, более чем на 2 ЗГ отличное от значения для ФСБ, в

- 123 030461

положительном или отрицательном направлении. В случае ЕЫЗА-анализов, проводили анализ белкового стандарта (конкретного для каждого набора анализа) на каждом планшете для подтверждения хорошего качества анализа. Только анализы кривые белковых стандартов для которых имели значение К2 > 0,9, были выбраны для анализа данных.
Дифференцировка клеток
Описание анализа	Номер анализа
Дифференцировка клеток пре-адипоцитов человека (ΠΡΑϋ)	С1
Дифференцировка клеток скелетной мускулатуры человека (НЗКМС)	02
Дифференцировка клеток мезенхимальных стволовых клеток человека (ПМЗС)	03
Дифференцировка гладкомышечных клеток легочной артерии человека (ПРАЗМС)	04
Анализ данных анализа дифференцировки клеток осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Анализы дифференцировки оценивали на основе флуоресцентной или колориметрической интенсивности конкретных антител, описанных в разделе способов. Полипептиды ААКЗ считали модуляторами дифференцировки клеток, если значение интенсивности для специфического маркера дифференцировки более чем на 2 3ϋ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении в конкретной обработанной лунке.
Клеточное связывание
Описание анализа	Номер анализа
РВМС	Н1
Первичные Т-клетки	Н2
Первичные В-клетки	НЗ
Первичные моноциты	Н4
НерС2	Н5
ЗТЗЫ	Н6
С2С12	Н7
ТНР1	Н8
ДигкаД	Н9
Раз ί	НЮ
Полипептиды ААКЗ считали связанными с конкретным типом клеток, если средняя связанная с клетками интенсивность флуоресценции более чем на 2 3ϋ отличалась от контрольных значений для реагента для указанного типа клеток.

Таблица Е7

Результаты функционального анализа . полипептидов ΑΑΚδ

Полипептиды ААКЗ	Положение эпитопной метки	Концентрация [нМ]	Критерии анализа
АзрК31ы2	Ν-концевое	250	В1 (Захват Ас-ЛПНП) Ό2 (Модификация ТЬК-подобного рецептора) Е12 (Высвобождение цитокинов) Е2 (Адгезия клеток) 01(Дифференцировка клеток)
АзрК31ыз	Ν-концевое	250	А4, А7, А10 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЛПНП) Е13 (Высвобождение цитокинов)
АзрК31ыз	С-концевое	250	Ώ1 (Модификатция ТЬК-подобного рецептора) Е12 (Высвобождение цитокинов) ЕЗ (Адгезия клеток) 03 (Дифференцировка клеток)
АзрКЗ!144	Ν-концевое	250	АЗ, А5, А7, А10 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЛПНП) Ώ1 (Модификация ТЬК-подобного рецептора) Е13 (Высвобождение цитокинов) Е4, Е5, Еб (Адгезия клеток) 04 (Дифференцировка клеток)

- 124 030461

АзрНЗ!144	С-концевое	250	А7 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЛПНП) Е13 (Высвобождение цитокинов) 62 (Дифференцировка клеток)
АзрНЗ 1Ν6	Ν-концевое	250	С2 («кислородный взрыв» нейтрофилов) Е12 (Высвобождение цитокинов) Е2, Еб (Адгезия клеток)
АзрНЗ Iм7	С-концевое	250	В1 (Захват Ас-ЛПНП) С2 («кислородный взрыв» нейтрофилов)
АзрНЗ 1Ν8	Ν-концевое	250	В1 (Захват Ас-ЛПНП) С2 («кислородный взрыв» нейтрофилов)
АзрНЗ 1Ν9	Ν-концевое	250	А4 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЛПНП) ϋΐ (Биология ТЬН-подобного рецептора) Е1, Е7, Е12, Е13 (Высвобождение цитокинов) Е2, ЕЗ, Е4, Е5, Еб, Е7 (Адгезия клеток)
АзрНЗ!149	С-концевое	250	А4, А7 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЛПНП) Ь1 (Биология ТЬН-подобного рецептора) Е1, Е7, ЕЮ, Е12, Е13 (Высвобождение цитокинов) Е2, ЕЗ, Е5, Еб, Е7 (Адгезия клеток)

АзрН31с1	Ν-концевое	250	Е1, Е12, Е15 (Высвобождение цитокинов) Е2, Е5 (Адгезия клеток)
АзрНЗ!с1	С-концевое	250	Е14 (Высвобождение цитокинов) Е2 (Адгезия клеток)
АзрНЗ Iе2	Ν-концевое	250	Ό2 (Модификация ТЬН-подобного рецептора) Е1, Е2 (Высвобождение цитокинов)
АзрНЗ!11	Ν-концевое	250	АЗ, Аб (Пролиферация) Е1, Е7, ЕЮ, Е12, Е13 (Высвобождение цитокинов) ЕЗ, Е5, Еб, Е7 (Адгезия клеток)
АзрН3113	Ν-концевое	250	А4 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЛПНП) ϋΐ (Модификация ТЬН-подобного рецептора) Е1, Е11, Е12 (Высвобождение цитокинов) ЕЗ, Е5 (Адгезия клеток) 61 (Дифференцировка клеток)
АзрНЗ!13	С-концевое	250	Е1 (Высвобождение цитокинов)

Был сделан вывод, что АзрК§Ю, АзрКЗ1“, АзрКЗ 1^Ν4, АзрКЗ 1^Ν6, АзрКЗЮ, АзрКЗЮ, АзрКЗЮ, АзрКЗ1 , АзрКЗ1 , АзрКЗ 1 и АзрКЗ 1 являются важными регуляторами пролиферации, дифференцировки, высвобождения цитокинов, активации нейтрофилов, захвата ацетилированного ЛПНП, клеточной адгезии и хемотаксиса. Следует отметить, что во многих случаях слитые по Ν- и С-концу белки имеют разные паттерны активности как в экспериментах по анализу уровня транскрипции, так и в экспериментах фенотипического скрининга. Указанные данные соответствуют гипотезе, что новая биологическая активность полипептидов ААКЗ подавляется, когда указанный полипептид ААКЗ является частью интактной тРНК-синтетазы или в процессе трансляции сливается по любому концу с другим белком, но что указанная биологическая активность восстанавливается, когда полипептиды ААКЗ имеют свободный амино- или карбоксиконец.

При рассмотрении в контексте анализа уровня транскрипции данные фенотипического скрининга демонстрируют, что полипептиды ААКЗ АзрКЗ 1^Ν2 (аминокислоты 1-274), АзрКЗ1^№ (аминокислоты 1224) и АзрКЗ1^ж (аминокислоты 1-184) определяют границу первого нового белкового домена, который является высокоактивным в широком диапазоне фенотипических скрининговых анализов.

Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ААКЗ, содержащие аминокислоты 1-274 аспартил-тРНК-синтетазы, определяют приблизительные границы (т.е. в пределах примерно ±5 аминокислот) первого нового высокоактивного домена полипептида ААКЗ, который является ΐ) высокофункционально активным, ϋ) может быть с легкостью создан и продуцирован в Е.соП и ΐΐΐ) проявляет благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка. Специалистам в данной области техники очевидно, что любые полипептиды ААКЗ, от содержащих первые 184 аминокислот аспартил-тРНК-синтетазы до

- 125 030461 содержащих первые 274 аминокислоты аспартил-тРНК-синтетазы, представляют собой функциональные эквиваленты конкретных описанных полипептидов ΑΑΚδ.

Данные фенотипического скрининга также демонстрируют, что полипептиды ΑΑΚδ Α5рΚδ1^N6 (аминокислоты 1-41+73-501), Α5рΚδ1^N7 (аминокислоты 1-141+189-501), Α5рΚδ1^N8 (аминокислоты 1-319+369-501) определяют границы второго набора новых белковых доменов, являющихся результатом альтернативного сплайсинга, которые являются высокоактивными в большом наборе фенотипических скрининговых анализов. Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑΚδ, описанные выше, определяют приблизительные границы (т.е. в пределах примерно ±5 аминокислот) второго нового набора белков, являющихся результатом альтернативного сплайсинга, которые ί) являются высокофункционально активными, ϋ) могут быть с легкостью сконструированы и продуцированы в Е.сой и ίίί) проявляют благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка.

Данные фенотипического скрининга также демонстрируют, что полипептид ΑΑΚδ Α5рΚδ 1^Ν9 (аминокислоты 1-22+63 аа) определяет границы третьего нового белкового домена, который является высокоактивным в широком диапазоне фенотипических скрининговых анализов. Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑ^δ, содержащие аминокислоты 1-22 аспартил-тРНК-синтетазы (плюс примерно до 63 аминокислот, являющихся результатом альтернативного сплайсинга последовательности), определяют приблизительные границы (т. е. в пределах примерно ±5 аминокислот) третьего нового высокоактивного домена полипептида ΑΑ^δ, который является ί) высокофункционально активным, й) может быть с легкостью создан и продуцирован в Е.сой и ίίί) проявляет благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка. Специалистам в данной области техники очевидно, что любой полипептид ΑЛΚδ, от содержащих аминокислоты 1-22 аспартил-тРНК-синтетазы, до полипептидов, содержащих дополнительные 63 аминокислоты представляют собой функциональные эквиваленты конкретных описанных полипептидов ΑΑΚδ.

Данные фенотипического скрининга также демонстрирует, что полипептид ΑΑΚδ Α5рΚδ1^С1 (аминокислоты 297-501) определяет границу четвертого нового белкового домена, который является высокоактивным в широком диапазоне фенотипических скрининговых анализов.

Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑΚδ, содержащие аминокислоты 297-501 аспартил-тРНК-синтетазы определяют приблизительные границы (т.е. в пределах примерно ±5 аминокислот) четвертого нового высокоактивного домена полипептида ΑΑ^δ, который является ί) высоко функционально активным, ΐΐ) может быть с легкостью создан и продуцирован в Е.сой и ίίί) проявляет благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка.

Данные фенотипического скрининга также демонстрируют, что полипептид ΑΑΚδ Α5рΚδ1^С2 (аминокислоты 101-501) определяет границу пятого нового белкового домена, который является высокоактивным в широком диапазоне фенотипических скрининговых анализах. Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑΚδ, содержащие аминокислоты 101-501 аспартил-тРНК-синтетазы, определяют приблизительные границы (т.е. в пределах примерно ±5 аминокислот) пятого нового высокоактивного домена полипептида ΑΑ^δ, который является ΐ) высокофункционально активным, ίί) может быть с легкостью создан и продуцирован в Е.сой и ΐΐΐ) проявляет благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка.

Данные фенотипического скрининга также демонстрируют, что полипептид ΑΑΚδ Α5рΚδ1^Iί (аминокислоты 38-292) определяет границу шестого нового белкового домена, который является высокоактивным в широком диапазоне фенотипических скрининговых анализах. Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑΚδ, содержащие аминокислоты 38-292 аспартил-тРНК-синтетазы, определяют приблизительные границы (т.е. в пределах примерно ±5 аминокислот) шестого нового высокоактивного домена полипептида ΑΑ^δ, который является ΐ) высокофункционально активным, ίί) может быть с легкостью создан и продуцирован в Е.сой и ΐΐΐ) проявляет благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка.

Данные фенотипического скрининга также демонстрируют, что полипептид ΑΑΚδ Α5рΚδ1^I3 (аминокислоты 23-154) определяет границу седьмого нового белкового домена, который является высокоактивным в широком диапазоне фенотипических скрининговых анализов. Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑΚδ, содержащие аминокислоты 38-292 аспартил-тРНК-синтетазы, определяют приблизительные границы (т. е. в пределах примерно ±5 аминокислот) седьмого нового высокоактивного домена полипептида ΑΑΚδ, который является ΐ) высокофункционально активным, ίί) может с легкостью быть получен и продуцирован в Е.сой и ΐΐΐ) проявляет благоприятные характеристики стабильности белка и агрегации.

- 126 030461

<110>

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ аТуг РЪагта 1пс. Рапди В1орЪагтаа ^ίтίЕеά. Сгеепе, ЬееМе Апп СЫапд, Ку1е Р. Нопд, Реί УаззегоЕ, А1а1п Р. Ьо, ^пд-Зце ИаШпз, ЛеЕЕгу Ό. |2иппп, СЪегу1 Ь. МепЛегп, ЛоЪп Ό.

<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО НАРУШЕНИЯ, ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ, ГИПЕРЛИПИДЕМИИ, ДИАБЕТА 1 И 2 ТИПА, ПОЛИПЕПТИД АМИНОАЦИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ (ААКЗ)

<130>	120161.432РС
<140> <141>	РСТ 2011-07-12
<150> <151>	из 61/363,589 2010-07-12
<150> <151>	из 61/363,586 2010-07-12
<150> <151>	из 61/363,583 2010-07-12
<160>	105
<170>	РазЕЗЕ12 для ЕНпДоу-’з, версии 4.0
<210> <211> <212> <213>	1 77 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>

Олигонуклеотид

<400> 1 аддаддЕааа асаЕаЕдсаЕ саЕсаЕсаЕс аЕсасддЕаа дссЕаЕсссЕ аасссЕЕЕдс 60 ЕсддЕсЕсда ЕЕсЕасд 77

<210> <211> <212> <213>

2 12 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>

Олигонуклеотид

<400> 2

ЕааЕдасЕсд ад 12 <210> 3 <211> 17 <212> ДНК

- 127 030461 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 3 аддадабааа асабабд 17 <210> 4 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 4 аддаддбааа асаб 14 <210> 5 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 5 аддадабааа асаб 14 <210> 6 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 6 дааддадаба басаб 15 <210> 7 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 7 ддбаадссба бсссбаассс бсбссбсддб сбсдаббсба сдсассасса бсабсассаб 60 баабдасбсд ад 72 <210> 8 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 8 сабабдсабс абсабсабса бсасддбаад ссбабсссба асссбсбссб сддбсбсдаб 60

- 128 030461

ЕсЕасдддаЕ сс 72 <210> 9 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 9 сЕсдадЕааЕ да 12 <210> 10 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 10 саЕаЕдддаЕ сс 12 <210> 11 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 11 сЕсдадддЕа адссЕаЕссс ЕаасссЕсЕс сЕсддЕсЕсд аЕЕсЕасдса ссассассас 60 сассасЕааЕ да 72 <210> 12 <211> 154 <212> Белок <213> Ното заряепз <400> 12

МеЕ 1

Рго

Бег

А1а

Бег 5

А1а

Бег Агд

Ьуз

Бег 10

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Агд 15

О1и

11е

МеЕ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

35

40

45

Агд

Азр

Ьеи

ТЕг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

50

55

60

Агд

Уа1

Н1з

ТЕг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЕе

Ьеи

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Агд

О1п

О1п

О1п

РЕе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Н1з

85

90

95

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЕ

Уа1

Ьуз

РЕе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

100

105

110

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

115

120

125

Бег

Суз

ТЕг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

130

135

140

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

145

150

- 129 <210> 13 <211> 462 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 13 аЁдсссадсд ссадсдссад ссдсаададЁ саддадаадс сдсдддадаЁ саЁддасдсд 60 дсддаадаЁЁ аЁдсЁааада дадаЁаЁдда аЁаЁсЁЁсаа ЁдаЁасааЁс асаадааааа 120 ссадаЁсдад ЁЁЁЁддЁЁсд ддЁЁададас ЁЁдасааЁас ааааадсЁда ЁдаадЁЁдЁЁ 180

ЁдддЁасдЁд саададЁЁса Ёасаадсада дсЁаааддда аасадЁдсЁЁ сЁЁадЁссЁа 240 сдЁсадсадс адЁЁЁааЁдЁ ссаддсЁсЁЁ дЁддсддЁдд дадассаЁдс аадсаадсад 300 аЁддЁЁаааЁ ЁЁдсЁдссаа саЁсаасааа дададсаЁЁд ЁддаЁдЁада аддЁдЁЁдЁд 360 адаааадЁда аЁсадааааЁ ЁддаадсЁдЁ асасадсаад асдЁЁдадЁЁ асаЁдЁЁсад 420 аадаЁЁЁаЁд ЁдаЁсадЁЁЁ ддсЁдаассс сдЁсЁдсссс Ёд 462 <210> 14 <211> 274 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 14

МеЁ 1

Рго

Бег А1а

Бег 5

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег О1п О1и 10

Ьуз

Рго

Агд 15

О1и

11е

МеЁ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

МеЁ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

35

40

45

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

50

55

60

Агд

Уа1

Н1з

ТЬг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Агд

О1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Н1з

85

90

95

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЁ

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

100

105

110

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

115

120

125

Бег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

130

135

140

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

145

150

155

160

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЬг

Уа1

Азп

О1п

165

170

175

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЬг

Бег

ТЬг

Бег

180

185

190

О1п

А1а

Уа1

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

Н1з

Ьеи

РЬе

Агд

О1и

195

200

205

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЬг

Рго

Ьуз

11е

11е

210

215

220

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЬе

ТЬг

Уа1

Бег

Туг

РЬе

225

230

235

240

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

МеЁ

245

250

255

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЬе

260

265

270

Агд

А1а

<210> 15 <211> 822 <212> ДНК

- 130 030461 <213> Ното зарчепз <400> 15 а+дсссадсд ссадсдссад ссдсаадад+ саддадаадс сдсдддада+ са+ддасдсд 60 дсддаада++ а+дс+ааада дада+а+дда а+а+с++саа +да+асаа+с асаадааааа 120 ссада+сдад ++++дд++сд дд++ададас ++дасаа+ас ааааадс+да +даад++д++ 180 +ддд+асд+д саадад++са +асаадсада дс+аааддда аасад+дс++ с++ад+сс+а 240 сд+садсадс ад+++аа+д+ ссаддс+с++ д+ддсдд+дд дадасса+дс аадсаадсад 300 а+дд++ааа+ ++дс+дссаа са+саасааа дададса++д +дда+д+ада адд+д++д+д 360 адаааад+да а+садаааа+ +ддаадс+д+ асасадсаад асд++дад++ аса+д++сад 420 аада+++а+д +да+сад+++ ддс+даассс сд+с+дсссс +дсадс+дда +да+дс+д++ 480 сддсс+дадд садааддада ададдаадда ададс+ас+д ++аассадда +асаада++а 540 дасаасадад +са++да+с+ +аддаса+са ас+ад+садд сад+с++ссд +с+ссад+с+ 600 ддса+с+дсс а+с+с++ссд адааас+++а а++аасааад д++++д+дда аа+ссааас+ 660 сс+аааа++а +++садс+дс сад+даадда ддадссаа+д +++++ас+д+ д+са+а++++ 720 ааааа+аа+д са+асс+ддс +сад+сссса садс+а+а+а адсааа+д+д са+++д+дс+ 780 да++++дада адд++++с+с +а++ддасса д+а++садад сд 822 <210> 16 <211> 224 <212> Белок <213> Ното зарчепз <400> 16

Ме+ 1

Рго

Бег

А1а

Бег 5

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег О1п 10

О1и

Ьуз

Рго

Агд 15

О1и

11е

Ме+

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

Ме+

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

35

40

45

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

50

55

60

Агд

Уа1

Н1з

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Нчз

85

90

95

А1а

Бег

Ьуз

О1п

Ме+

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

100

105

110

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

115

120

125

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Нчз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

130

135

140

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

145

150

155

160

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

165

170

175

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

180

185

190

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

Нчз

Ьеи

РЪе

Агд

О1и

195

200

205

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

210

215

220

<210> 17 <211> 672 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 17 а+дсссадсд ссадсдссад ссдсаадад+ саддадаадс сдсдддада+ са+ддасдсд 60 дсддаада++ а+дс+ааада дада+а+дда а+а+с++саа +да+асаа+с асаадааааа 120 ссада+сдад ++++дд++сд дд++ададас ++дасаа+ас ааааадс+да +даад++д++ 180

- 131 030461

ЬдддЬасдЬд саададЬЬса Ьасаадсада дсбаааддда аасадЬдсЬЬ сЬЬадЬссЬа 240 сдбсадсадс адЬЬЬааЬдЬ ссаддсЬсЬЬ дЬддсддЬдд дадассабдс аадсаадсад 300 аЬддЬЬаааЬ ЬЬдсЬдссаа сабсаасааа дададсаЬЬд ЬддаЬдЬада аддЬдЬЬдЬд 360 адаааадЬда аЬсадааааЬ ЬддаадсЬдЬ асасадсаад асдЬЬдадЬЬ асаЬдЬЬсад 420 аадаЬЬЬаЬд ЬдаЬсадЬЬЬ ддсЬдаассс сдЬсЬдсссс ЬдсадсЬдда ЬдаЬдсЬдЬЬ 480 сддссЬдадд садааддада ададдаадда ададсЬасЬд ЬЬаассадда ЬасаадаЬЬа 540 дасаасадад ЬсаЬЬдаЬсЬ ЬаддасаЬса асЬадЬсадд садЬсЬЬссд ЬсЬссадЬсЬ 600 ддсаЬсЬдсс аЬсЬсЬЬссд адааасЬЬЬа аЬЬаасааад дЬЬЬЬдЬдда ааЬссааасЬ 660 ссЬааааЬЬа ύύ 672 <210> 18 <211> 15 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 18

11е О1у Бег Суз ТЪг Ο1η Ο1η Азр Уа1 О1и Ьеи Н1з Уа1 Ο1η Ьуз 1 5 10 15 <210> 19 <211> 81 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 19

11е 1

Туг

Уа1

11е

Бег 5

Ьеи А1а О1и

Рго

Агд 10

Ьеи

Рго

Ьеи

Ο1η Ьеи Азр 15

Азр

А1а

11е

Агд

Рго

О1и

Уа1

О1и

О1у

О1и

О1и

Азр

О1у

Агд

А1а

ТЪг

20

25

30

Уа1

Азп

Ο1η

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

35

40

45

Бег

ТЪг

Бег

Ο1η

А1а

11е

РЪе

Агд

Ьеи

Ο1η

Бег

О1у

11е

Суз

Н1з

Ьеи

50

55

60

РЪе

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

Ο1η

ТЪг

Рго

65

70

75

80

Ьуз <210> 20 <211> 19 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 20

11е 11е Бег А1а А1а Бег О1и О1у О1у А1а Азп Уа1 РЪе ТЪг Уа1 Бег 1 5 10 15

Туг РЪе Ьуз

<210> <211> <212> <213>	21 11 Белок Миз тизси1из
<400> 21 О1и Бег 11е 11е Азр Уа1	О1и О1у Уа1 Уа1 Агд
1	5	10

<210> 22

- 132 <211> 5 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 22

Ьуз Уа1 Азп О1п Ьуз 1 5 <210> 23 <211> 15 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 23

11е О1у Бег Суз ТЪг О1п О1п Азр Уа1 О1и Ьеи Нчз Уа1 О1п Ьуз 1 5 10 15 <210> 24 <211> 115 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 24

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Нчз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

1 Туг

Уа1

11е

Бег

5 Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

10 Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

15 Азр

Азр

А1а

11е

Агд

20 Рго

О1и

Уа1

О1и

О1у

25 О1и

О1и

Азр

О1у

Агд

30 А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

35 Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

40 Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

45 Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

50 Бег

О1п

А1а

11е

РЪе

55 Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

60 11е

Суз

Нчз

Ьеи

РЪе

65 Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

70 Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

75 О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

80 Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

85 А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

90 А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

95 Уа1

Бег

Туг

РЪе

Ьуз 115

100

105

110

<210> 25 <211> 31 <212> Белок <213> Миз тизси1из
<400> 25
О1и Бег 11е 1	11е	Азр 5	Уа1	О1и	О1у
11е О1у Бег	Суз 20	ТЪг	О1п	О1п	Азр

Уа1 Уа1	Агд	Ьуз	Уа1	Азп О1п Ьуз 15
	10
Уа1	О1и	Ьеи	Нгз	Уа1	О1п	Ьуз
25					30

<210> 26 <211> 31 <212> Белок <213> Ното зарчепз <400> 26

Меб Рго Бег А1а Бег А1а Бег Агд Ьуз Бег О1п О1и Ьуз Рго Агд О1и

- 133

5 10 15

11е Ме5 Азр А1а А1а О1и 11е О1и РЬе Тгр РЬе О1у Ьеи О1и ТЬг

25 30 <210> 27 <211> 96 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 27 аЬдсссадсд ссадсдссад ссдсаададЬ саддадаадс сдсдддадаЬ саЬддасдсд 60 дсддаааЬсд ад5555дд55 сддд55адад ас55да 96 <210> 28 <211> 470 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 28

Ме5 1

Рго

Бег

А1а

Бег А1а 5

Бег

Агд

Ьуз

Бег 10

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Агд 15

О1и

11е

Ме5

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

Ме5

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

35

40

45

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

50

55

60

Н1з

А1а

Бег

Ьуз

О1п

Ме5

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

65

70

75

80

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

85

90

95

О1у

Бег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

100

105

110

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

115

120

125

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЬг

Уа1

Азп

130

135

140

О1п

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЬг

Бег

ТЬг

145

150

155

160

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

Н1з

Ьеи

РЬе

Агд

165

170

175

О1и

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЬг

Рго

Ьуз

11е

180

185

190

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЬе

ТЬг

Уа1

Бег

Туг

195

200

205

РЬе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

210

215

220

Ме5

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

225

230

235

240

РЬе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЬг

Н1з

Агд

Н1з

Ьеи

ТЬг

О1и

РЬе

Уа1

245

250

255

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

Ме5

А1а

РЬе

Азп

Туг

Н1з

Туг

Н1з

О1и

Уа1

Ме5

260

265

270

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЬг

Ме5

Уа1

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

275

280

285

Агд

РЬе

О1п

ТЬг

О1и

11е

О1п

ТЬг

Уа1

Азп

Ьуз

О1п

РЬе

Рго

Суз

О1и

290

295

300

Рго

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

305

310

315

320

Ьеи

А1а

Ме5

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

Ме5

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

325

330

335

Ьеи

Бег

ТЬг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

Нгз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

- 134

340

345

350

Туг

Азр

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

355

360

365

Рго

РЬе

Туг

ТЬг

МеЕ

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Бег

370

375

380

Туг

Азр

МеЕ

РЬе

МеЕ

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

Агд

385

390

395

400

11е

Нчз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

Н1з

Н1з

О1у

11е

405

410

415

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЬе

Агд

РЬе

О1у

А1а

420

425

430

Рго

Рго

Н1з

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЬг

МеЕ

Ьеи

435

440

445

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

Н1з

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЬг

Бег

МеЕ

РЬе

Рго

Агд

Азр

450

455

460

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

465

470

<210> 29 <211> 1413 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 29 аЕдсссадсд ссадсдссад ссдсаададЕ саддадаадс сдсдддадаЕ саЕддасдсд 60 дсддаадаЕЕ аЕдсЕааада дадаЕаЕдда аЕаЕсЕЕсаа ЕдаЕасааЕс асаадааааа 120 ссадддааас адЕдсЕЕсЕЕ адЕссЕасдЕ садсадсадЕ ЕЕааЕдЕсса ддсЕсЕЕдЕд 180 дсддЕдддад ассаЕдсаад саадсадаЕд дЕЕаааЕЕЕд сЕдссаасаЕ саасааадад 240 адсаЕЕдЕдд аЕдЕадаадд ЕдЕЕдЕдада ааадЕдааЕс адааааЕЕдд аадсЕдЕаса 300 садсаадасд ЕЕдадЕЕаса ЕдЕЕсадаад аЕЕЕаЕдЕда ЕсадЕЕЕддс ЕдаассссдЕ 360 сЕдссссЕдс адсЕддаЕда ЕдсЕдЕЕсдд ссЕдаддсад ааддадаада ддааддаада 420 дсЕасЕдЕЕа ассаддаЕас аадаЕЕадас аасададЕса ЕЕдаЕсЕЕад дасаЕсаасЕ 480 адЕсаддсад ЕсЕЕссдЕсЕ ссадЕсЕддс аЕсЕдссаЕс ЕсЕЕссдада аасЕЕЕааЕЕ 540 аасаааддЕЕ ЕЕдЕддаааЕ ссааасЕссЕ ааааЕЕаЕЕЕ садсЕдссад Едааддадда 600 дссааЕдЕЕЕ ЕЕасЕдЕдЕс аЕаЕЕЕЕааа ааЕааЕдсаЕ ассЕддсЕса дЕссссасад 660 сЕаЕаЕаадс аааЕдЕдсаЕ ЕЕдЕдсЕдаЕ ЕЕЕдадаадд ЕЕЕЕсЕсЕаЕ ЕддассадЕа 720

ЕЕсададсдд аадасЕсЕаа ЕасссаЕада саЕсЕаасЕд адЕЕЕдЕЕдд ЕЕЕддасаЕЕ 780 даааЕддсЕЕ ЕЕааЕЕасса ЕЕассасдаа дЕЕаЕддаад аааЕЕдсЕда сассаЕддЕа 840 саааЕаЕЕса ааддасЕЕса адаааддЕЕЕ садасЕдааа ЕЕсааасадЕ дааЕааасад 900

ЕЕсссаЕдЕд адссаЕЕсаа аЕЕЕЕЕддад ссаасЕсЕаа дасЕадааЕа ЕЕдЕдаадса 960

ЕЕддсЕаЕдс ЕЕадддаадс ЕддадЕсдаа аЕдддадаЕд аадасдаЕсЕ дадсасасса 1020 ааЕдаааадс ЕдЕЕдддЕса ЕЕЕддЕааад даааадЕаЕд аЕасадаЕЕЕ ЕЕаЕаЕЕсЕЕ 1080 даЕаааЕаЕс саЕЕддсЕдЕ аадассЕЕЕс ЕаЕассаЕдс сЕдасссаад аааЕсссааа 1140 садЕссаасЕ сЕЕасдаЕаЕ дЕЕсаЕдада ддадаадааа ЕаЕЕдЕсадд адсЕсааада 1200 аЕасаЕдаЕс сЕсаасЕдсЕ аасададада дсЕЕЕасаЕс аЕддааЕЕда ЕЕЕддадааа 1260 аЕЕааддсЕЕ асаЕЕдаЕЕс сЕЕссдсЕЕЕ ддадссссЕс сЕсаЕдсЕдд ЕддаддсаЕЕ 1320 ддаЕЕддаас дадЕЕасЕаЕ дсЕдЕЕЕсЕд ддаЕЕдсаЕа аЕдЕЕсдЕса дассЕссаЕд 1380

ЕЕсссЕсдЕд аЕсссааасд асЕсасЕссЕ Еаа 1413 <210> 30 <211> 454 <212> Белок <213> Ното зарчепз <400> 30

МеЕ

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Агд

О1и

1

5

10

15

11е

МеЕ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

35

40

45

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

- 135

55 60

Агд

Уа1

Н1з

ТЬг

Зег

Агд А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Агд

О1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Н1з

85

90

95

А1а

Зег

Ьуз

О1п

Мек

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Зег

100

105

110

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

115

120

125

Зег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

О1п

Ьуз

ТЬг

Зег

ТЬг

130

135

140

Зег

О1п

А1а

Уа1

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Зег

О1у

11е

Суз

Н1з

Ьеи

РЬе

Агд

145

150

155

160

О1и

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЬг

Рго

Ьуз

11е

165

170

175

11е

Зег

А1а

А1а

Зег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

Туг

180

185

190

РЬе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Зег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

195

200

205

Мек

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Зег

11е

О1у

Рго

Уа1

210

215

220

РНе

Агд

А1а

О1и

Азр

Зег

Азп

ТЬг

Н1з

Агд

Н1з

Ьеи

ТЬг

О1и

РЬе

Уа1

225

230

235

240

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

Мек

А1а

РЬе

Азп

Туг

Н1з

Туг

Н1з

О1и

Уа1

Мек

245

250

255

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЬг

Мек

Уа1

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

260

265

270

Агд

РЬе

О1п

ТЬг

О1и

11е

О1п

ТЬг

Уа1

Азп

Ьуз

О1п

РЬе

Рго

Суз

О1и

275

280

285

Рго

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

290

295

300

Ьеи

А1а

Мек

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

Мек

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

305

310

315

320

Ьеи

Зег

ТЬг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

Н1з

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

325

330

335

Туг

Азр

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

340

345

350

Рго

РЬе

Туг

ТЬг

Мек

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Зег

Азп

Зег

355

360

365

Туг

Азр

Мек

РЬе

Мек

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Зег

О1у

А1а

О1п

Агд

370

375

380

11е

Н1з

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

Н1з

Н1з

О1у

11е

385

390

395

400

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Зег

РЬе

Агд

РЬе

О1у

А1а

405

410

415

Рго

Рго

Н1з

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЬг

Мек

Ьеи

420

425

430

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

Н1з

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЬг

Зег

Мек

РЬе

Рго

Агд

Азр

435

440

445

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

450 <210> 31 <211> 1365 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 31 акдсссадсд ссадсдссад ссдсаададк саддадаадс сдсдддадак сакддасдсд 60 дсддаадакк акдскааада дадакакдда акакскксаа кдакасаакс асаадааааа 120 ссадаксдад ккккддкксд ддккададас ккдасаакас ааааадскда кдаадккдкк 180 кдддкасдкд саададккса касаадсада дскаааддда аасадкдскк сккадксска 240

- 136 030461 сдЕсадсадс адЕЕЕааЕдЕ ссаддсЕсЕЕ дЕддсддЕдд дадассаЕдс аадсаадсад 300 аЕддЕЕаааЕ ЕЕдсЕдссаа саЕсаасааа дададсаЕЕд ЕддаЕдЕада аддЕдЕЕдЕд 360 адаааадЕда аЕсадааааЕ ЕддаадсЕдЕ асасадсаад асдЕЕдадЕЕ асаЕдЕЕсад 420 аадасаЕсаа сЕадЕсаддс адЕсЕЕссдЕ сЕссадЕсЕд дсаЕсЕдсса ЕсЕсЕЕссда 480 дааасЕЕЕаа ЕЕаасааадд ЕЕЕЕдЕддаа аЕссааасЕс сЕааааЕЕаЕ ЕЕсадсЕдсс 540 адЕдааддад дадссааЕдЕ ЕЕЕЕасЕдЕд ЕсаЕаЕЕЕЕа ааааЕааЕдс аЕассЕддсЕ 600 садЕссссас адсЕаЕаЕаа дсаааЕдЕдс аЕЕЕдЕдсЕд аЕЕЕЕдадаа ддЕЕЕЕсЕсЕ 660 аЕЕддассад ЕаЕЕсададс ддаадасЕсЕ ааЕасссаЕа дасаЕсЕаас ЕдадЕЕЕдЕЕ 720 ддЕЕЕддаса ЕЕдаааЕддс ЕЕЕЕааЕЕас саЕЕассасд аадЕЕаЕдда адаааЕЕдсЕ 780 дасассаЕдд ЕасаааЕаЕЕ саааддасЕЕ саадаааддЕ ЕЕсадасЕда ааЕЕсаааса 840 дЕдааЕааас адЕЕсссаЕд ЕдадссаЕЕс аааЕЕЕЕЕдд адссаасЕсЕ аадасЕадаа 900

ЕаЕЕдЕдаад саЕЕддсЕаЕ дсЕЕадддаа дсЕддадЕсд аааЕдддада ЕдаадасдаЕ 960 сЕдадсасас саааЕдаааа дсЕдЕЕдддЕ саЕЕЕддЕаа аддаааадЕа ЕдаЕасадаЕ 1020

ЕЕЕЕаЕаЕЕс ЕЕдаЕаааЕа ЕссаЕЕддсЕ дЕаадассЕЕ ЕсЕаЕассаЕ дссЕдассса 1080 адаааЕссса аасадЕссаа сЕсЕЕасдаЕ аЕдЕЕсаЕда даддадаада ааЕаЕЕдЕса 1140 ддадсЕсааа дааЕасаЕда ЕссЕсаасЕд сЕаасадада дадсЕЕЕаса ЕсаЕддааЕЕ 1200 даЕЕЕддада аааЕЕааддс ЕЕасаЕЕдаЕ ЕссЕЕссдсЕ ЕЕддадсссс ЕссЕсаЕдсЕ 1260 ддЕддаддса ЕЕддаЕЕдда асдадЕЕасЕ аЕдсЕдЕЕЕс ЕдддаЕЕдса ЕааЕдЕЕсдЕ 1320 садассЕсса ЕдЕЕсссЕсд ЕдаЕсссааа сдасЕсасЕс сЕЕаа 1365 <210> 32 <211> 452 <212> Белок <213> Ното зартепз <400> 32

МеЕ 1

Рго

Бег

А1а

Бег 5

А1а

Бег Агд

Ьуз

Бег О1п О1и 10

Ьуз

Рго

Агд 15

О1и

11е

МеЕ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

35

40

45

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

50

55

60

Агд

Уа1

Н1з

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Нтз

85

90

95

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЕ

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

100

105

110

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

115

120

125

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

130

135

140

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

145

150

155

160

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

165

170

175

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

180

185

190

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

Нтз

Ьеи

РЪе

Агд

О1и

195

200

205

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

210

215

220

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

Туг

РЪе

225

230

235

240

Буз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

МеЕ

245

250

255

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЪе

260

265

270

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЪг

Н1з

Агд

Н1з

Ьеи

ТЪг

О1и

РЪе

Уа1

О1у

275

280

285

Беи

Азр

11е

О1и

МеЕ

А1а

РЪе

Азп

Туг

Нтз

Туг

Нтз

О1и

Уа1

МеЕ

О1и

- 137

290

295

300

О1и

11е

А1а

Азр

ТЪг

МеБ

Уа1

О1п

11е

РЪе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

Бег

305

310

315

320

ТЪг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

Н1з

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

325

330

335

ТЪг

Азр

РЪе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЪе

340

345

350

Туг

ТЪг

МеБ

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Бег

Туг

Азр

355

360

365

МеБ

РЪе

МеБ

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

Агд

11е

Н1з

370

375

380

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЪг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

Н1з

Н1з

О1у

11е

Азр

Ьеи

385

390

395

400

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЪе

Агд

РЪе

О1у

А1а

Рго

Рго

405

410

415

Н1з

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЪг

МеБ

Ьеи

РЪе

Ьеи

420

425

430

О1у

Ьеи

Н1з

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЪг

Бег

МеБ

РЪе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

435 440 445

Агд Ьеи ТЪг Рго 450 <210> 33 <211> 1359 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 33 аБдсссадсд ссадсдссад ссдсаададБ саддадаадс сдсдддадаБ саБддасдсд 60 дсддаадаББ аБдсБааада дадаБаБдда аБаБсББсаа БдаБасааБс асаадааааа 120 ссадаБсдад ББББддББсд ддББададас ББдасааБас ааааадсБда БдаадББдББ 180

БдддБасдБд саададББса Басаадсада дсБаааддда аасадБдсББ сББадБссБа 240 сдБсадсадс адБББааБдБ ссаддсБсББ дБддсддБдд дадассаБдс аадсаадсад 300 аБддББаааБ ББдсБдссаа саБсаасааа дададсаББд БддаБдБада аддБдББдБд 360 адаааадБда аБсадааааБ БддаадсБдБ асасадсаад асдББдадББ асаБдББсад 420 аадаБББаБд БдаБсадБББ ддсБдаассс сдБсБдсссс БдсадсБдда БдаБдсБдББ 480 сддссБдадд садааддада ададдаадда ададсБасБд ББаассадда БасаадаББа 540 дасаасадад БсаББдаБсБ БаддасаБса асБадБсадд садБсББссд БсБссадБсБ 600 ддсаБсБдсс аБсБсББссд адааасБББа аББаасааад дББББдБдда ааБссааасБ 660 ссБааааББа БББсадсБдс садБдаадда ддадссааБд БББББасБдБ дБсаБаББББ 720 аааааБааБд саБассБддс БсадБсссса садсБаБаБа адсаааБдБд саБББдБдсБ 780 даББББдада аддББББсБс БаББддасса дБаББсадад сддаадасБс БааБасссаБ 840 адасаБсБаа сБдадБББдБ БддБББддас аББдаааБдд сББББааББа ссаББассас 900 даадББаБдд аадаааББдс БдасассаБд дБасаааБаБ БсаааддасБ Бсаадааадс 960 асассаааБд аааадсБдББ дддБсаБББд дБаааддааа адБаБдаБас адаБББББаБ 1020 аББсББдаБа ааБаБссаББ ддсБдБаада ссБББсБаБа ссаБдссБда сссаадаааБ 1080 сссааасадБ ссаасБсББа сдаБаБдББс аБдададдад аадаааБаББ дБсаддадсБ 1140 сааадааБас аБдаБссБса асБдсБааса дадададсББ БасаБсаБдд ааББдаБББд 1200 дадааааББа аддсББасаБ БдаББссББс сдсБББддад ссссБссБса БдсБддБдда 1260 ддсаББддаБ БддаасдадБ БасБаБдсБд БББсБдддаБ БдсаБааБдБ БсдБсадасс 1320

БссаБдББсс сБсдБдаБсс сааасдасБс асБссББаа 1359 <210> 34 <211> 85 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 34

МеБ 1

Рго

Бег

А1а

Бег 5

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег 10

О1п

О1и

Ьуз

Рго Агд О1и 15

11е

МеБ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Тгр

Азп

О1и

Ьеи

Ьеи

Суз

Суз

РЪе

Тгр

20

25

30

- 138 030461

Азр

Суз

11е 35

Ме5

РЪе

Уа1

Агд

Рго 40

Рго

Суз

Бег

Ьеи

Уа1 45

11е

Рго

Азп

Азр

Бег

Ьеи

Ьеи

Ьуз

РЪе

ТЪг

Ьеи

Суз

Н1з

Ьеи

ТЪг

Рго

Уа1

Тгр

Ме5

50

55

60

ТЪг

О1и

Агд

Азр

Рго

А1а

Бег

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Ьуз

О1и

Бег

Н1з

65

70

75

80

ТЪг

Туг

Бег

РЪе

О1п

<210> <211> <212> <213>	35 258 ДНК Ното	зар1епз
<400>	35
аЬдсссадсд	ссадсдссад ссдсаададЬ саддадаадс сдсдддадаЬ саЬддасдсд 60
дсддаада55	ддаасдад55 ас5а5дс5д5 55с5ддда55 дса5аа5д55 сд5садасс5 120
сса5д55ссс	5сд5да5ссс ааасдасЬса с5сс55ааа5 5сасас555д ссас55аас5 180
ссад5д5дда	Ьдасададсд адасссЬдсс Ьсаааааааа аааааааааа адааадссас 240
ас55а55с55	55сад5аа 258
<210>	36
<211>	27
<212>	Белок
<213>	Ното	заргепз

<400> 36

Ме5 1	Рго	Бег А1а	Бег 5	А1а	Бег Агд Ьуз	Бег 10	О1п О1и Ьуз	Рго Агд О1и 15
11е	Ме5	Азр	А1а	А1а	О1и	О1у Азп	Бег	А1а	Бег
			20				25

<210> 37 <211> 84 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 37 аЬдсссадсд ссадсдссад ссдсаададЬ саддадаадс сдсдддадаЬ саЬддасдсд 60 дсддааддаа асад5дс55с 55ад 84 <210> 38 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 38 дсдддадаЬс аЬддасдсдд сддаааЬсда д5555дд55с ддд55адада 50 <210> 39 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 39

Агд О1и 11е Ме5 Азр А1а А1а О1и 11е О1и РЪе Тгр РЪе О1у Ьеи О1и 1 5 10 15 <210> 40 <211> 50

- 139 030461 <212> ДНК <213> Ното заρίеηз <400> 40 аЕдаЕасааЕ сасаадаааа ассадддааа садЕдсЕЕсЕ ЕадЕссЕасд <210> 41 <211> 16 <212> Белок <213> Ното заρίепз <400> 41

МеЕ 11е С1п Зег С1п С1и Ьуз Рго С1у Ьуз С1п Суз РЪе Ъеи Уа1 Ьеи 1 5 10 15 <210> 42 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното заρίеηз <400> 42 адасдЕЕдад ЕЕасаЕдЕЕс адаадасаЕс аасЕадЕсад дсадЕсЕЕсс <210> 43 <211> 16 <212> Белок <213> Ното заρίепз <400> 43

Азр Уа1 С1и Ьеи Н18 Уа1 С1п Ьуз ТЪг Зег ТЪг Зег С1п А1а Уа1 РЪе 1 5 10 15 <210> 44 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарίеηз <400> 44 аааЕаЕЕсаа аддасЕЕсаа дааадсасас саааЕдаааа дсЕдЕЕдддЕ <210> 45 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зарίепз <400> 45

11е РЪе Ьуз С1у Ьеи С1п С1и Зег ТЪг Рго Азп С1и Ьуз Ьеи Ьеи С1у 1 5 10 15 <210> 46 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарίепз <400> 46 дсдддадаЕс аЕддасдсдд сддаадаЕЕд даасдадЕЕа сЕаЕдсЕдЕЕ <210> 47 <211> 16

- 140 030461 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 47

Агд О1и 11е Мер Азр А1а А1а О1и Азр Тгр Азп О1и Ьеи Ьеи Суз Суз 1 5 10 15 <210> 48 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 48 дсдддадарс арддасдсдд сддааддааа садРдсРРсР РадРссРасд <210> 49 <211> 13 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 49

Агд О1и 11е Мер Азр А1а А1а О1и О1у Азп Бег А1а Бег 1 5 10 <210> 50 <211> 184 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 50

Мер 1

Рго

Бег А1а

Бег 5

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег О1п О1и 10

Ьуз

Рго

Агд 15

О1и

11е

Мер

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

20

25

30

Бег

Мер

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

35

40

45

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

50

55

60

Агд

Уа1

Н1з

ТЬг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

Агд

С1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Н1з

85

90

95

А1а

Бег

Ьуз

О1п

Мер

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

100

105

110

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

115

120

125

Бег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Н1з

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

130

135

140

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

145

150

155

160

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЬг

Уа1

Азп

О1п

165

170

175

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

180

<210> 51 <211> 552 <212> ДНК <213> Ното заргепз

- 141 <400> 51 аЬдсссадсд ссадсдссад ссдсаададЬ саддадаадс сдсдддадаЬ саЬддасдсд 60 дсддаадаЬЬ аЬдсЬааада дадаЬаЬдда аЬаЬсЬЬсаа ЬдаЬасааЬс асаадааааа 120 ссадаЬсдад ЬЬЬЬддЬЬсд ддЬЬададас ЬЬдасааЬас ааааадсЬда ЬдаадЬЬдЬЬ 180

ЬдддЬасдЬд саададЬЬса Ьасаадсада дсЬаааддда аасадЬдсЬЬ сЬЬадЬссЬа 240 сдЬсадсадс адЬЬЬааЬдЬ ссаддсЬсЬЬ дЬддсддЬдд дадассаЬдс аадсаадсад 300 аЬддЬЬаааЬ ЬЬдсЬдссаа саЬсаасааа дададсаЬЬд ЬддаЬдЬада аддЬдЬЬдЬд 360 адаааадЬда аЬсадааааЬ ЬддаадсЬдЬ асасадсаад асдЬЬдадЬЬ асаЬдЬЬсад 420 аадаЬЬЬаЬд ЬдаЬсадЬЬЬ ддсЬдаассс сдЬсЬдсссс ЬдсадсЬдда ЬдаЬдсЬдЬЬ 480 сддссЬдадд садааддада ададдаадда ададсЬасЬд ЬЬаассадда ЬасаадаЬЬа 540 дасаасадад Ьс 552 <210> 52 <211> 298 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНтз <400> 52

МеЬ 1

Няз

Няз

Няз

Няз 5

Няз

Няз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

О1у

Бег

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

20

25

30

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Агд

О1и

11е

МеЬ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

35

40

45

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

Бег

МеЬ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

50

55

60

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

65

70

75

80

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

Няз

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

85

90

95

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

100

105

110

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Няз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЬ

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

115

120

125

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

130

135

140

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Няз

145

150

155

160

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

165

170

175

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

180

185

190

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

195

200

205

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

210

215

220

Суз

Няз

Ьеи

РЪе

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

225

230

235

240

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

245

250

255

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

260

265

270

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

МеЬ

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

275

280

285

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

Ьеи

О1и

290

295

<210> 53

- 142 <211> 298 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий

Ν-концевую аффинную метку <400> 53

6хН18

МеЕ 1	С1у	Зег	Рго	Зег 5	А1а	Зег	А1а
Агд	С1и	11е	МеЕ 20	Азр	А1а	А1а	С1и
11е	Зег	Зег 35	МеЕ	11е	С1п	Зег	С1п 40
Агд	Уа1 50	Агд	Азр	Ьеи	ТЪг	11е 55	С1п
Агд 65	А1а	Агд	Уа1	Н18	ТЪг 70	Зег	Агд
Уа1	Ьеи	Агд	С1п	С1п 85	С1п	РЪе	Азп
Азр	Н18	А1а	Зег 100	Ьуз	С1п	МеЕ	Уа1
С1и	Зег	11е 115	Уа1	Азр	Уа1	С1и	С1у 120
11е	С1у 130	Зег	Суз	ТЪг	С1п	С1п 135	Азр
Туг 145	Уа1	11е	Зег	Ьеи	А1а 150	С1и	Рго
А1а	Уа1	Агд	Рго	С1и 165	А1а	С1и	С1у
Азп	С1п	Азр	ТЪг 180	Агд	Ьеи	Азр	Азп
ТЪг	Зег	С1п 195	А1а	Уа1	РЪе	Агд	Ьеи 200
Агд	С1и 210	ТЪг	Ьеи	11е	Азп	Ьуз 215	С1у
11е 225	11е	Зег	А1а	А1а	Зег 230	С1и	С1у
Туг	РЪе	Ьуз	Азп	Азп 245	А1а	Туг	Ьеи
С1п	МеЕ	Суз	11е 260	Суз	А1а	Азр	РЪе
Уа1	РЪе	Агд 275	А1а	Ьеи	С1и	С1у	Ьуз 280
Ьеи	Азр 290	Зег	ТЪг	Нтз	Нтз	Н1з 295	Нтз

Зег	Агд 10	Ьуз	Зег	С1п	С1и	Ьуз 15	Рго
Азр 25	Туг	А1а	Ьуз	С1и	Агд 30	Туг	С1у
С1и	Ьуз	Рго	Азр	Агд 45	Уа1	Ьеи	Уа1
Ьуз	А1а	Азр	С1и 60	Уа1	Уа1	Тгр	Уа1
А1а	Ьуз	С1у 75	Ьуз	С1п	Суз	РЪе	Ьеи 80
Уа1	С1п 90	А1а	Ьеи	Уа1	А1а	Уа1 95	С1у
Ьуз 105	РЪе	А1а	А1а	Азп	11е 110	Азп	Ьуз
Уа1	Уа1	Агд	Ьуз	Уа1 125	Азп	С1п	Ьуз
Уа1	С1и	Ьеи	Н1з 140	Уа1	С1п	Ьуз	11е
Агд	Ьеи	Рго 155	Ьеи	С1п	Ьеи	Азр	Азр 160
С1и	С1и 170	С1и	С1у	Агд	А1а	ТЪг 175	Уа1
Агд 185	Уа1	11е	Азр	Ьеи	Агд 190	ТЪг	Зег
С1п	Зег	С1у	11е	Суз 205	Н1з	Ьеи	РЪе
РЪе	Уа1	С1и	11е 220	С1п	ТЪг	Рго	Ьуз
С1у	А1а	Азп 235	Уа1	РЪе	ТЪг	Уа1	Зег 240
А1а	С1п 250	Зег	Рго	С1п	Ьеи	Туг 255	Ьуз
С1и 265	Ьуз	Уа1	РЪе	Зег	11е 270	С1у	Рго
Рго Нтз	11е Нтз	Рго	Азп	Рго 285	Ьеи	Ьеи	С1у

<210> 54 <211> 248 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хН1з <400> 54

МеЕ

Н1з

Н1з

Н1з

Н1з

Н18

Н1з

С1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

С1у

Ьеи

Азр

Зег

ТЪг

С1у

Зег

Рго

Зег

А1а

Зег

А1а

Зег

Агд

Ьуз

Зег

- 143 030461

20

25

30

Θΐπ

О1и

Ьуз

Рго

Агд

О1и

11е

Мек

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

35

40

45

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Зег

Зег

Мек

11е

Θ1η

Зег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

50

55

60

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

65

70

75

80

ναι

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

Η18

ТЬг

Зег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

85

90

95

Θΐπ

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

Θ1η

Θ1η

Θ1η

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

100

105

110

ναι

А1а

Уа1

О1у

Азр

Η18

А1а

Зег

Ьуз

Θ1η

Мек

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

115

120

125

Азп

Не

Азп

Ьуз

О1и

Зег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

130

135

140

ναι

Азп

Θΐη

Ьуз

11е

О1у

Зег

Суз

ТЬг

Θ1η

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Нтз

145

150

155

160

ναι

Θΐη

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Зег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

165

170

175

Θΐη

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

180

185

190

Агд

А1а

ТЬг

Уа1

Азп

Θ1η

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

195

200

205

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

ТЬг

Зег

Θ1η

А1а

Уа1

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Зег

О1у

11е

210

215

220

Суз

НФз

Ьеи

РЬе

Агд

О1и

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

Уа1

О1и

11е

225

230

235

240

Θΐη

ТЬг

Рго

Ьуз

11е

11е

Ьеи

О1и

245

<210> 55 <211> 248 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий
Ν-концевую аффинную метку 6хНтз
<400> 55
Мек О1у Зег Рго Зег	А1а Зег А1а Зег Агд Ьуз Зег О1п О1и Ьуз Рго
1 5	10 15
Агд О1и 11е Мек Азр	А1а А1а О1и Азр Туг А1а Ьуз О1и Агд Туг О1у
20	25 30
11е Зег Зег Мек 11е	О1п Зег О1п О1и Ьуз Рго Азр Агд Уа1 Ьеи Уа1
35	40 45
Агд Уа1 Агд Азр Ьеи	ТЬг 11е О1п Ьуз А1а Азр О1и Уа1 Уа1 Тгр Уа1
50	55 60
Агд А1а Агд Уа1 НФз	ТЬг Зег Агд А1а Ьуз О1у Ьуз О1п Суз РЬе Ьеи
65	70 75 80
Уа1 Ьеи Агд О1п О1п	О1п РЬе Азп Уа1 О1п А1а Ьеи Уа1 А1а Уа1 О1у
85	90 95
Азр НФз А1а Зег Ьуз	О1п Мек Уа1 Ьуз РЬе А1а А1а Азп 11е Азп Ьуз
100	105 110
О1и Зег 11е Уа1 Азр	Уа1 О1и О1у Уа1 Уа1 Агд Ьуз Уа1 Азп О1п Ьуз
115	120 125
11е О1у Зег Суз ТЬг	О1п О1п Азр Уа1 О1и Ьеи НФз Уа1 О1п Ьуз 11е
130	135 140
Туг Уа1 11е Зег Ьеи	А1а О1и Рго Агд Ьеи Рго Ьеи О1п Ьеи Азр Азр
145	150 155 160
А1а Уа1 Агд Рго О1и	А1а О1и О1у О1и О1и О1и О1у Агд А1а ТЬг Уа1
165	170 175

- 144

Азп Ο1η

Азр

ТЪг 180

Агд

Ьеи

Азр Азп Агд 185

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд 190

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

Ο1η

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

Ο1η

Бег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

РЪе

195

200

205

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

Ο1η

ТЪг

Рго

Ьуз

210

215

220

11е

11е

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

225

230

235

240

Бег

ТЪг

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

245 <210> 56 <211> 208 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 56

МеЬ 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

О1у

Бег

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

20

25

30

Ο1η

О1и

Ьуз

Рго

Агд

О1и

11е

МеЬ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

35

40

45

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

Бег

МеЬ

11е

Ο1η

Бег

Ο1η

О1и

Ьуз

Рго

Азр

50

55

60

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

Ο1η

Ьуз

А1а

Азр

О1и

65

70

75

80

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

85

90

95

Ο1η

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

Ο1η

Ο1η

Ο1η

РЪе

Азп

Уа1

Ο1η

А1а

Ьеи

100

105

110

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

Ο1η

МеЬ

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

115

120

125

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

130

135

140

Уа1

Азп

Ο1η

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

Ο1η

Ο1η

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

145

150

155

160

Уа1

Ο1η

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

165

170

175

Ο1η

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

180

185

190

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

Ο1η

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

Ьеи

О1и

195 200 205 <210> 57 <211> 208 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 57

МеЬ

О1у

Бег

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

Ο1η

О1и

Ьуз

Рго

1

5

10

15

Агд

О1и

11е

МеЬ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

- 145 030461

20

25

30

11е

Бег

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

35

40

45

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЕг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

50

55

60

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЕг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЕе

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЕе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

85

90

95

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЕ

Уа1

Ьуз

РЕе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

100

105

110

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

115

120

125

11е

О1у

Бег

Суз

ТЕг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

130

135

140

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

145

150

155

160

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЕг

Уа1

165

170

175

Азп

О1п

Азр

ТЕг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

180

185

190

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЕг

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

195 200 205 <210> 58 <211> 494 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 58

МеЕ 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЕг

О1у

Бег

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

20

25

30

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Агд

О1и

11е

МеЕ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

35

40

45

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

О1у

50

55

60

Ьуз

О1п

Суз

РЕе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЕе

Азп

Уа1

О1п

А1а

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЕ

Уа1

Ьуз

РЕе

А1а

85

90

95

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

100

105

110

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЕг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

115

120

125

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

130

135

140

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

145

150

155

160

О1у

Агд

А1а

ТЕг

Уа1

Азп

О1п

Азр

ТЕг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

165

170

175

Азр

Ьеи

Агд

ТЕг

Бег

ТЕг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЕе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

180

185

190

11е

Суз

НФз

Ьеи

РЕе

Агд

О1и

ТЕг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЕе

Уа1

О1и

195

200

205

11е

О1п

ТЕг

Рго

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

210 215 220

- 146

Уа1 225

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

Туг 230

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а 235

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег 240

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

Меб

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

245

250

255

РЪе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЪг

НФз

Агд

260

265

270

НФз

Ьеи

ТЪг

О1и

РЪе

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

Меб

А1а

РЪе

Азп

Туг

275

280

285

НФз

Туг

НФз

О1и

Уа1

Меб

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЪг

Меб

Уа1

О1п

11е

290

295

300

РЪе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

Агд

РЪе

О1п

ТЪг

О1и

11е

О1п

ТЪг

Уа1

Азп

305

310

315

320

Ьуз

О1п

РЪе

Рго

Суз

О1и

Рго

РЪе

Ьуз

РЪе

Ьеи

О1и

Рго

ТЪг

Ьеи

Агд

325

330

335

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

Ьеи

А1а

Меб

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

340

345

350

Меб

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

Ьеи

Бег

ТЪг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

355

360

365

НФз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЪг

Азр

РЪе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

370

375

380

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЪе

Туг

ТЪг

Меб

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

385

390

395

400

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Бег

Туг

Азр

Меб

РЪе

Меб

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

405

410

415

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

Агд

11е

НФз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЪг

О1и

Агд

420

425

430

А1а

Ьеи

НФз

НФз

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

435

440

445

Бег

РЪе

Агд

РЪе

О1у

А1а

Рго

Рго

НФз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

450

455

460

О1и

Агд

Уа1

ТЪг

Меб

Ьеи

РЪе

Ьеи

О1у

Ьеи

НФз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЪг

465

470

475

480

Бег

Меб

РЪе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЪг

Рго

Ьеи

О1и

485

490

<210> <211> <212> <213>	59 494 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий
	Ν-концевую аффинную метку 6хНФз
<400>	59
Меб О1у Бег Рго Бег	А1а Бег А1а Бег Агд Ьуз Бег О1п О1и Ьуз Рго
1	5	10 15
Агд О1и 11е Меб Азр	А1а А1а О1и Азр Туг А1а Ьуз О1и Агд Туг О1у
	20	25 30
11е Бег Бег Меб 11е	О1п Бег О1п О1и Ьуз Рго О1у Ьуз О1п Суз РЪе
	35	40 45
Ьеи Уа1 Ьеи Агд О1п	О1п О1п РЪе Азп Уа1 О1п А1а Ьеи Уа1 А1а Уа1
50	55 60
О1у Азр НФз А1а Бег	Ьуз О1п Меб Уа1 Ьуз РЪе А1а А1а Азп 11е Азп
65		70 75 80
Ьуз О1и Бег 11е Уа1	Азр Уа1 О1и О1у Уа1 Уа1 Агд Ьуз Уа1 Азп О1п
	85	90 95
Ьуз 11е О1у Бег Суз	ТЪг О1п О1п Азр Уа1 О1и Ьеи НФз Уа1 О1п Ьуз
	100	105 110
11е Туг Уа1 11е Бег	Ьеи А1а О1и Рго Агд Ьеи Рго Ьеи О1п Ьеи Азр
	115	120 125
Азр А1а Уа1 Агд Рго	О1и А1а О1и О1у О1и О1и О1и О1у Агд А1а ТЪг

- 147

130 135 140

УаФ

Азп

О1п

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

УаФ

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЬг

145

150

155

160

Бег

ТЬг

Бег

О1п

А1а

УаФ

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

165

170

175

РЬе

Агд

О1и

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

УаФ

О1и

11е

О1п

ТЬг

Рго

180

185

190

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

УаФ

РЬе

ТЬг

УаФ

195

200

205

Бег

Туг

РЬе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

210

215

220

Ьуз

О1п

МеЕ

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

УаФ

РЬе

Бег

11е

О1у

225

230

235

240

Рго

УаФ

РЬе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЬг

НФз

Агд

НФз

Ьеи

ТЬг

О1и

245

250

255

РЬе

УаФ

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

МеЕ

А1а

РЬе

Азп

Туг

НФз

Туг

НФз

О1и

260

265

270

УаФ

МеЕ

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЬг

МеЕ

УаФ

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

275

280

285

О1п

О1и

Агд

РЬе

О1п

ТЬг

О1и

11е

О1п

ТЬг

УаФ

Азп

Ьуз

О1п

РЬе

Рго

290

295

300

Суз

О1и

Рго

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

305

310

315

320

О1и

А1а

Ьеи

А1а

МеЕ

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

УаФ

О1и

МеЕ

О1у

Азр

О1и

325

330

335

Азр

Азр

Ьеи

Бег

ТЬг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

НФз

Ьеи

УаФ

Ьуз

340

345

350

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

355

360

365

УаФ

Агд

Рго

РЬе

Туг

ТЬг

МеЕ

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

370

375

380

Азп

Бег

Туг

Азр

МеЕ

РЬе

МеЕ

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

385

390

395

400

О1п

Агд

11е

НФз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

НФз

НФз

405

410

415

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЬе

Агд

РЬе

420

425

430

О1у

А1а

Рго

Рго

НФз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

УаФ

ТЬг

435

440

445

МеЕ

Ьеи

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

НФз

Азп

УаФ

Агд

О1п

ТЬг

Бег

МеЕ

РЬе

Рго

450

455

460

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

465

470

475

480

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

485 490 <210> 60 <211> 478 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 60

МеЕ 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

20

25

30

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Агд

О1и

11е

МеЕ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

35

40

45

- 148

О1и Агд 50

Туг

О1у

11е

Бег

Бег 55

МеЬ

11е

О1п

Бег

О1п 60

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

65

70

75

80

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

Няз

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

85

90

95

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

100

105

110

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Няз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЬ

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

115

120

125

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

130

135

140

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Няз

145

150

155

160

Уа1

О1п

Ьуз

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

165

170

175

11е

Суз

Няз

Ьеи

РЪе

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

180

185

190

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

195

200

205

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

210

215

220

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

МеЬ

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

225

230

235

240

РЪе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЪг

Няз

Агд

245

250

255

Няз

Ьеи

ТЪг

О1и

РЪе

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

МеЬ

А1а

РЪе

Азп

Туг

260

265

270

Няз

Туг

Няз

О1и

Уа1

МеЬ

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЪг

МеЬ

Уа1

О1п

11е

275

280

285

РЪе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

Агд

РЪе

О1п

ТЪг

О1и

11е

О1п

ТЪг

Уа1

Азп

290

295

300

Ьуз

О1п

РЪе

Рго

Суз

О1и

Рго

РЪе

Ьуз

РЪе

Ьеи

О1и

Рго

ТЪг

Ьеи

Агд

305

310

315

320

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

Ьеи

А1а

МеЬ

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

325

330

335

МеЬ

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

Ьеи

Бег

ТЪг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

340

345

350

Няз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЪг

Азр

РЪе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

355

360

365

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЪе

Туг

ТЪг

МеЬ

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

370

375

380

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Бег

Туг

Азр

МеЬ

РЪе

МеЬ

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

385

390

395

400

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

Агд

11е

Няз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЪг

О1и

Агд

405

410

415

А1а

Ьеи

Няз

Няз

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

420

425

430

Бег

РЪе

Агд

РЪе

О1у

А1а

Рго

Рго

Няз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

435

440

445

О1и

Агд

Уа1

ТЪг

МеЬ

Ьеи

РЪе

Ьеи

О1у

Ьеи

Няз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЪг

450

455

460

Бег

МеЬ

РЪе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЪг

Рго

Ьеи

О1и

465

470

475

<210> 61 <211> 478 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий

- 149 030461

Ν-концевую аффинную метку

6хНФз

<400> 61

МеБ

О1у

Бег

Рго

Бег

А1а

Бег

А1а

Бег

Агд

Ьуз

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

1

5

10

15

Агд

О1и

11е

МеБ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

20

25

30

11е

Бег

Бег

МеБ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

35

40

45

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

50

55

60

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

85

90

95

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеБ

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

100

105

110

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

115

120

125

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

ТЪг

130

135

140

Бег

ТЪг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

145

150

155

160

РЪе

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

165

170

175

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

180

185

190

Бег

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

195

200

205

Ьуз

О1п

МеБ

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Бег

11е

О1у

210

215

220

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЪг

НФз

Агд

НФз

Ьеи

ТЪг

О1и

225

230

235

240

РЪе

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

МеБ

А1а

РЪе

Азп

Туг

НФз

Туг

НФз

О1и

245

250

255

Уа1

МеБ

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЪг

МеБ

Уа1

О1п

11е

РЪе

Ьуз

О1у

Ьеи

260

265

270

О1п

О1и

Агд

РЪе

О1п

ТЪг

О1и

11е

О1п

ТЪг

Уа1

Азп

Ьуз

О1п

РЪе

Рго

275

280

285

Суз

О1и

Рго

РЪе

Ьуз

РЪе

Ьеи

О1и

Рго

ТЪг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

290

295

300

О1и

А1а

Ьеи

А1а

МеБ

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

МеБ

О1у

Азр

О1и

305

310

315

320

Азр

Азр

Ьеи

Бег

ТЪг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

НФз

Ьеи

Уа1

Ьуз

325

330

335

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЪг

Азр

РЪе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

340

345

350

Уа1

Агд

Рго

РЪе

Туг

ТЪг

МеБ

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

355

360

365

Азп

Бег

Туг

Азр

МеБ

РЪе

МеБ

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

370

375

380

О1п

Агд

11е

НФз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЪг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

НФз

НФз

385

390

395

400

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЪе

Агд

РЪе

405

410

415

О1у

А1а

Рго

Рго

НФз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЪг

420

425

430

МеБ

Ьеи

РЪе

Ьеи

О1у

Ьеи

НФз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЪг

Бег

МеБ

РЪе

Рго

435

440

445

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЪг

Рго

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

450

455

460

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

Нтз

Нтз

НФз

Нтз

Нтз

Нтз

465

470

475

- 150 <210> 62 <211> 476 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий

Ν-концевую аффинную метку

6хНчз <400> 62

Ме+ 1	Нчз	Нчз	Нчз	Нчз 5	Нчз	Нчз	О1у
О1у	Ьеи	Азр	Бег 20	ТЪг	О1у	Бег	Рго
О1п	О1и	Ьуз 35	Рго	Агд	О1и	11е	Ме+ 40
О1и	Агд 50	Туг	О1у	11е	Бег	Бег 55	Ме+
Агд 65	Уа1	Ьеи	Уа1	Агд	Уа1 70	Агд	Азр
Уа1	Уа1	Тгр	Уа1	Агд 85	А1а	Агд	Уа1
О1п	Суз	РЪе	Ьеи 100	Уа1	Ьеи	Агд	О1п
Уа1	А1а	Уа1 115	О1у	Азр	Нчз	А1а	Бег 120
Азп	11е 130	Азп	Ьуз	О1и	Бег	11е 135	Уа1
Уа1 145	Азп	О1п	Ьуз	11е	О1у 150	Бег	Суз
Уа1	О1п	Ьуз	11е	Туг 165	Уа1	11е	Бег
О1п	Ьеи	Азр	Азр 180	А1а	Уа1	Агд	Рго
Агд	А1а	ТЪг 195	Уа1	Азп	О1п	Азр	ТЪг 200
Ьеи	Агд 210	ТЪг	Бег	ТЪг	Бег	О1п 215	А1а
Суз 225	Нчз	Ьеи	РЪе	Агд	О1и 230	ТЪг	Ьеи
О1п	ТЪг	Рго	Ьуз	11е 245	11е	Бег	А1а
РЪе	ТЪг	Уа1	Бег 260	Туг	РЪе	Ьуз	Азп
О1п	Ьеи	Туг 275	Ьуз	О1п	Ме+	Суз	11е 280
Бег	11е 290	О1у	Рго	Уа1	РЪе	Агд 295	А1а
Ьеи 305	ТЪг	О1и	РЪе	Уа1	О1у 310	Ьеи	Азр
Туг	Нчз	О1и	Уа1	Ме+ 325	О1и	О1и	11е
Ьуз	О1у	Ьеи	О1п 340	О1и	Бег	ТЪг	Рго
Уа1	Ьуз	О1и 355	Ьуз	Туг	Азр	ТЪг	Азр 360
Ьеи	А1а 370	Уа1	Агд	Рго	РЪе	Туг 375	ТЪг
О1п 385	Бег	Азп	Бег	Туг	Азр 390	Ме+	РЪе
О1у	А1а	О1п	Агд	11е	Нчз	Азр	Рго

Ьуз	Рго 10	11е	Рго	Азп	Рго	Ьеи 15	Ьеи
Бег 25	А1а	Бег	А1а	Бег	Агд 30	Ьуз	Бег
Азр	А1а	А1а	О1и	Азр 45	Туг	А1а	Ьуз
11е	О1п	Бег	О1п 60	О1и	Ьуз	Рго	Азр
Ьеи	ТЪг	11е 75	О1п	Ьуз	А1а	Азр	О1и 80
Нчз	ТЪг 90	Бег	Агд	А1а	Ьуз	О1у 95	Ьуз
О1п 105	О1п	РЪе	Азп	Уа1	О1п 110	А1а	Ьеи
Ьуз	О1п	Ме+	Уа1	Ьуз 125	РЪе	А1а	А1а
Азр	Уа1	О1и	О1у 140	Уа1	Уа1	Агд	Ьуз
ТЪг	О1п	О1п 155	Азр	Уа1	О1и	Ьеи	Нчз 160
Ьеи	А1а 170	О1и	Рго	Агд	Ьеи	Рго 175	Ьеи
О1и 185	А1а	О1и	О1у	О1и	О1и 190	О1и	О1у
Агд	Ьеи	Азр	Азп	Агд 205	Уа1	11е	Азр
Уа1	РЪе	Агд	Ьеи 220	О1п	Бег	О1у	11е
11е	Азп	Ьуз 235	О1у	РЪе	Уа1	О1и	11е 240
А1а	Бег 250	О1и	О1у	О1у	А1а	Азп 255	Уа1
Азп 265	А1а	Туг	Ьеи	А1а	О1п 270	Бег	Рго
Суз	А1а	Азр	РЪе	О1и 285	Ьуз	Уа1	РЪе
О1и	Азр	Бег	Азп 300	ТЪг	Нчз	Агд	Нчз
11е	О1и	Ме+ 315	А1а	РЪе	Азп	Туг	Нчз 320
А1а	Азр 330	ТЪг	Ме+	Уа1	О1п	11е 335	РЪе
Азп 345	О1и	Ьуз	Ьеи	Ьеи	О1у 350	Нчз	Ьеи
РЪе	Туг	11е	Ьеи	Азр 365	Ьуз	Туг	Рго
Ме+	Рго	Азр	Рго 380	Агд	Азп	Рго	Ьуз
Ме+	Агд	О1у 395	О1и	О1и	11е	Ьеи	Бег 400
О1п	Ьеи	Ьеи	ТЪг	О1и	Агд	А1а	Ьеи

- 151

405

410

415

НФз

НФз

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЬе

420

425

430

Агд

РЬе

О1у

А1а

Рго

Рго

НФз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

435

440

445

Уа1

ТЬг

МеЁ

Ьеи

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

НФз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЬг

Бег

МеЁ

450

455

460

РЬе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

О1и

465 470 475 <210> 63 <211> 476 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 63

МеЁ 1

О1у

Бег

Рго

Бег 5

А1а

Бег А1а

Бег

Агд 10

Ьуз

Бег

О1п

О1и

Ьуз 15

Рго

Агд

О1и

11е

МеЁ

Азр

А1а

А1а

О1и

Азр

Туг

А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

20

25

30

11е

Бег

Бег

МеЁ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

35

40

45

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

50

55

60

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЬг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

85

90

95

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЁ

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

100

105

110

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

115

120

125

11е

О1у

Бег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

130

135

140

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

145

150

155

160

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЬг

Уа1

165

170

175

Азп

О1п

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЬг

Бег

180

185

190

ТЬг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

РЬе

195

200

205

Агд

О1и

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЬг

Рго

Ьуз

210

215

220

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЬе

ТЬг

Уа1

Бег

225

230

235

240

Туг

РЬе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

245

250

255

О1п

МеЁ

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Бег

11е

О1у

Рго

260

265

270

Уа1

РЬе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЬг

НФз

Агд

НФз

Ьеи

ТЬг

О1и

РЬе

275

280

285

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

МеЁ

А1а

РЬе

Азп

Туг

НФз

Туг

НФз

О1и

Уа1

290

295

300

МеЁ

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЬг

МеЁ

Уа1

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

305

310

315

320

О1и

Бег

ТЬг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

Нтз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

325

330

335

- 152

Туг

Азр

ТЬг

Азр 340

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр 345

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а 350

Уа1

Агд

Рго

РЬе

Туг

ТЬг

Мер

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Бег

355

360

365

Туг

Азр

Мер

РЬе

Мер

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

Агд

370

375

380

11е

Нгз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

Нгз

Нгз

О1у

11е

385

390

395

400

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЬе

Агд

РЬе

О1у

А1а

405

410

415

Рго

Рго

Нгз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЬг

Мер

Ьеи

420

425

430

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

Нгз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЬг

Бег

Мер

РЬе

Рго

Агд

Азр

435

440

445

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

450

455

460

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

465

470

475

<210> <211> <212> <213>	64 109 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий
	Ν-концевую аффинную метку 6хНгз
<400>	64
Мер Нгз Нгз Нгз Нгз	Нгз Нгз О1у Ьуз Рго 11е Рго Азп Рго Ьеи Ьеи
1	5	10 15
О1у Ьеи Азр Бег ТЪг	О1у Бег Рго Бег А1а Бег А1а Бег Агд Ьуз Бег
	20	25 30
О1п О1и Ьуз Рго Агд	О1и 11е Мер Азр А1а А1а О1и Азр Тгр Азп О1и
	35	40 45
Ьеи Ьеи Суз Суз РЪе	Тгр Азр Суз 11е Мер РЪе Уа1 Агд Рго Рго Суз
50	55 60
Бег Ьеи Уа1 11е Рго	Азп Азр Бег Ьеи Ьеи Ьуз РЪе ТЪг Ьеи Суз Нгз
65		70 75 80
Ьеи ТЪг Рго Уа1 Тгр	Мер ТЪг О1и Агд Азр Рго А1а Бег Ьуз Ьуз Ьуз
	85	90 95
Ьуз Ьуз Ьуз О1и Бег	Нгз ТЪг Туг Бег РЪе О1п Ьеи О1и
	100	105

<210> <211> <212> <213>	65 109 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий
	С-концевую аффинную метку 6хНгз
<400>	65
Мер О1у Бег Рго Бег	А1а Бег А1а Бег Агд Ьуз Бег О1п О1и Ьуз Рго
1	5	10 15
Агд О1и 11е Мер Азр	А1а А1а О1и Азр Тгр Азп О1и Ьеи Ьеи Суз Суз
	20	25 30
РЪе Тгр Азр Суз 11е	Мер РЪе Уа1 Агд Рго Рго Суз Бег Ьеи Уа1 11е
	35	40 45
Рго Азп Азр Бег Ьеи	Ьеи Ьуз РЪе ТЪг Ьеи Суз Нгз Ьеи ТЪг Рго Уа1

- 153

50

55

60

Тгр

МеЕ

ТЪг

О1и

Агд

Азр

Рго

А1а

Бег

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Ьуз

О1и

65

70

75

80

Бег

Н1з

ТЪг

Туг

Бег

РЪе

О1п

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

85

90

95

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

Нтз

Н1з

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

100

105

<210> 66 <211> 831 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 66 ддаЕссссаЕ садссЕсадс аЕсЕсдЕааа адссаддааа аассдсдсда ааЕсаЕддас 60 дсЕдссдаад аЕЕаЕдссаа ададсдсЕаЕ ддЕаЕсадЕЕ сдаЕдаЕсса дЕсасаадад 120 ааассадаЕс дЕдЕдсЕддЕ ссдЕдЕЕсдЕ дассЕдасса Ессадааадс ддаЕдаадЕЕ 180 дЕЕЕдддЕсс дЕдсЕсдЕдЕ ЕсаЕасаадс сдЕдссааад дсааасадЕд сЕЕссЕддЕЕ 240 сЕдсдЕсаас адсадЕЕЕаа сдЕЕсаддсс сЕддЕадссд ЕЕддЕдаЕса сдссЕсаааа 300 саааЕддЕда ааЕЕсдссдс саасаЕсаас ааадададса ЕсдЕсдасдЕ ЕдааддЕдЕс 360 дЕссдЕааад ЕдааЕсадаа ааЕсддсЕсс ЕдЕасасадс аадаЕдЕдда дсЕдсаЕдЕс 420 сааааааЕсЕ аЕдЕсаЕсЕс асЕддссдаа ссЕсдЕсЕдс сЕсЕдсаасЕ ддаЕдаЕдсЕ 480 дЕасдсссЕд аадсЕдаадд сдаадаадаа ддЕсдЕдсЕа сддЕЕааЕса ддаЕасЕсдс 540 сЕддасаасс дЕдЕсаЕЕда ЕсЕдсдсасс ЕсаассЕсЕс аадсддЕаЕЕ ссдссЕдсаа 600

ЕссддсаЕсЕ дЕсассЕдЕЕ ссдЕдааасд сЕдаЕсааса аадддЕЕЕдЕ ддадаЕЕсад 660 ассссдаааа ЕсаЕЕадЕдс сдссадсдаа ддЕддадсаа аЕдЕдЕЕЕас сдЕдЕссЕаЕ 720

ЕЕсаааааса аЕдссЕаЕсЕ ддсасадЕсЕ ссЕсадсЕдЕ аЕааасаааЕ дЕдЕаЕсЕдЕ 780 дсЕдасЕЕсд адааадЕдЕЕ сЕсааЕсддд ссддЕаЕЕсс дЕдсасЕсда д 831 <210> 67 <211> 681 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 67 ддаЕссссаЕ садссЕсадс аЕсЕсдЕааа адссаддааа аассдсдсда ааЕсаЕддас 60 дсЕдссдаад аЕЕаЕдссаа ададсдсЕаЕ ддЕаЕсадЕЕ сдаЕдаЕсса дЕсасаадад 120 ааассадаЕс дЕдЕдсЕддЕ ссдЕдЕЕсдЕ дассЕдасса Ессадааадс ддаЕдаадЕЕ 180 дЕЕЕдддЕсс дЕдсЕсдЕдЕ ЕсаЕасаадс сдЕдссааад дсааасадЕд сЕЕссЕддЕЕ 240 сЕдсдЕсаас адсадЕЕЕаа сдЕЕсаддсс сЕддЕадссд ЕЕддЕдаЕса сдссЕсаааа 300 саааЕддЕда ааЕЕсдссдс саасаЕсаас ааадададса ЕсдЕсдасдЕ ЕдааддЕдЕс 360 дЕссдЕааад ЕдааЕсадаа ааЕсддсЕсс ЕдЕасасадс аадаЕдЕдда дсЕдсаЕдЕс 420 сааааааЕсЕ аЕдЕсаЕсЕс асЕддссдаа ссЕсдЕсЕдс сЕсЕдсаасЕ ддаЕдаЕдсЕ 480 дЕасдсссЕд аадсЕдаадд сдаадаадаа ддЕсдЕдсЕа сддЕЕааЕса ддаЕасЕсдс 540 сЕддасаасс дЕдЕсаЕЕда ЕсЕдсдсасс ЕсаассЕсЕс аадсддЕаЕЕ ссдссЕдсаа 600

ЕссддсаЕсЕ дЕсассЕдЕЕ ссдЕдааасд сЕдаЕсааса аадддЕЕЕдЕ ддадаЕЕсад 660 ассссдаааа ЕсаЕЕсЕсда д 681 <210> 68 <211> 561 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 154 030461 <223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 68 ддаЕссссаЕ садссЕсадс аЕсЕсдЕааа адссаддааа аассдсдсда ааЕсаЕддас 60 дсЕдссдаад аЕЕаЕдссаа ададсдсЕаЕ ддЕаЕсадЕЕ сдаЕдаЕсса дЕсасаадад 120 ааассадаЕс дЕдЕдсЕддЕ ссдЕдЕЕсдЕ дассЕдасса Ессадааадс ддаЕдаадЕЕ 180 дЕЕЕдддЕсс дЕдсЕсдЕдЕ ЕсаЕасаадс сдЕдссааад дсааасадЕд сЕЕссЕддЕЕ 240 сЕдсдЕсаас адсадЕЕЕаа сдЕЕсаддсс сЕддЕадссд ЕЕддЕдаЕса сдссЕсаааа 300 саааЕддЕда ааЕЕсдссдс саасаЕсаас ааадададса ЕсдЕсдасдЕ ЕдааддЕдЕс 360 дЕссдЕааад ЕдааЕсадаа ааЕсддсЕсс ЕдЕасасадс аадаЕдЕдда дсЕдсаЕдЕс 420 сааааааЕсЕ аЕдЕсаЕсЕс асЕддссдаа ссЕсдЕсЕдс сЕсЕдсаасЕ ддаЕдаЕдсЕ 480 дЕасдсссЕд аадсЕдаадд сдаадаадаа ддЕсдЕдсЕа сддЕЕааЕса ддаЕасЕсдс 540 сЕддасаасс дЕдЕссЕсда д 561 <210> 69 <211> 1419 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 69 ддаЕссссаЕ садссЕсадс аЕсЕсдЕааа адссаддааа аассдсдсда ааЕсаЕддас 60 дсЕдссдаад аЕЕаЕдссаа ададсдсЕаЕ ддЕаЕсадЕЕ сдаЕдаЕсса дЕсасаадад 120 ааассаддса аасадЕдсЕЕ ссЕддЕЕсЕд сдЕсаасадс адЕЕЕаасдЕ ЕсаддсссЕд 180 дЕадссдЕЕд дЕдаЕсасдс сЕсаааасаа аЕддЕдаааЕ Есдссдссаа саЕсаасааа 240 дададсаЕсд ЕсдасдЕЕда аддЕдЕсдЕс сдЕааадЕда аЕсадааааЕ сддсЕссЕдЕ 300 асасадсаад аЕдЕддадсЕ дсаЕдЕссаа ааааЕсЕаЕд ЕсаЕсЕсасЕ ддссдаассЕ 360 сдЕсЕдссЕс ЕдсаасЕдда ЕдаЕдсЕдЕа сдсссЕдаад сЕдааддсда адаадааддЕ 420 сдЕдсЕасдд ЕЕааЕсадда ЕасЕсдссЕд дасаассдЕд ЕсаЕЕдаЕсЕ дсдсассЕса 480 ассЕсЕсаад сддЕаЕЕссд ссЕдсааЕсс ддсаЕсЕдЕс ассЕдЕЕссд ЕдааасдсЕд 540 аЕсаасааад ддЕЕЕдЕдда даЕЕсадасс ссдааааЕса ЕЕадЕдссдс садсдааддЕ 600 ддадсаааЕд ЕдЕЕЕассдЕ дЕссЕаЕЕЕс ааааасааЕд ссЕаЕсЕддс асадЕсЕссЕ 660 садсЕдЕаЕа аасаааЕдЕд ЕаЕсЕдЕдсЕ дасЕЕсдада аадЕдЕЕсЕс ааЕсдддссд 720 дЕаЕЕссдЕд сададдаЕад саасасасас сдссаЕсЕда ссдааЕЕЕдЕ аддссЕддас 780 аЕсдаааЕдд ссЕЕсаасЕа ЕсаЕЕаЕсас даддЕдаЕдд аадаааЕсдс ЕдаЕасааЕд 840 дЕасадаЕсЕ ЕЕааадддсЕ дсаадаасдс ЕЕЕсааасад адаЕЕсааас сдЕсааЕааа 900 садЕЕсссдЕ дЕдаассдЕЕ саааЕЕЕсЕд даассдассс ЕдсдЕсЕдда аЕаЕЕдЕдаа 960 дсасЕддсЕа ЕдсЕдсдсда адсЕддЕдЕс даааЕдддЕд аЕдаддаЕда ссЕдЕсЕасс 1020 ссЕаасдааа аасЕдсЕддд ссассЕддЕа ааадаааааЕ аЕдасасада сЕЕсЕаЕаЕс 1080 сЕддасаааЕ аЕссдсЕддс адЕЕсдЕссд ЕЕЕЕаЕасда ЕдссЕдаЕсс ЕсдЕааЕссд 1140 ааасааадса асЕссЕаЕда саЕдЕЕсаЕд сдЕддЕдаад адаЕссЕдЕс ЕддЕдсЕсаа 1200 сдЕаЕссаЕд аЕссасадсЕ дсЕдасадаа сдЕдсасЕдс аЕсасддЕаЕ ЕдаЕсЕддад 1260 ааааЕсааад ссЕаЕаЕсда сЕссЕЕЕсдс ЕЕЕддЕдссс сЕссасаЕдс сддЕддЕдда 1320 аЕЕдддсЕдд адсдЕдЕаас ааЕдсЕдЕЕс сЕдддасЕдс асаасдЕссд ЕсааассЕса 1380 аЕдЕЕЕссас дЕдасссЕаа асдЕсЕдаса ссЕсЕсдад 1419 <210> 70 <211> 1371 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 70 ддаЕссссаЕ садссЕсадс аЕсЕсдЕааа адссаддааа аассдсдсда ааЕсаЕддас 60 дсЕдссдаад аЕЕаЕдссаа ададсдсЕаЕ ддЕаЕсадЕЕ сдаЕдаЕсса дЕсасаадад 120 ааассадаЕс дЕдЕдсЕддЕ ссдЕдЕЕсдЕ дассЕдасса Ессадааадс ддаЕдаадЕЕ 180

- 155 030461 дбббдддбсс дбдсбсдбдб бсабасаадс сдбдссааад дсааасадбд сббссбддбб 240 сбдсдбсаас адсадбббаа сдббсаддсс сбддбадссд ббддбдабса сдссбсаааа 300 сааабддбда ааббсдссдс саасабсаас ааадададса бсдбсдасдб бдааддбдбс 360 дбссдбааад бдаабсадаа аабсддсбсс бдбасасадс аадабдбдда дсбдсабдбс 420 саааааассб саассбсбса адсддбаббс сдссбдсааб ссддсабсбд бсассбдббс 480 сдбдааасдс бдабсаасаа адддбббдбд дадаббсада ссссдааааб саббадбдсс 540 дссадсдаад дбддадсааа бдбдбббасс дбдбссбабб бсааааасаа бдссбабсбд 600 дсасадбсбс сбсадсбдба бааасааабд бдбабсбдбд сбдасббсда дааадбдббс 660 бсаабсдддс сддбаббссд бдсададдаб адсаасасас ассдссабсб дассдааббб 720 дбаддссбдд асабсдаааб ддссббсаас бабсаббабс асдаддбдаб ддаадааабс 780 дсбдабасаа бддбасадаб сбббаааддд сбдсаадаас дсбббсааас ададаббсаа 840 ассдбсааба аасадббссс дбдбдаассд ббсааабббс бддаассдас ссбдсдбсбд 900 даабаббдбд аадсасбддс бабдсбдсдс даадсбддбд бсдааабддд бдабдаддаб 960 дассбдбсба ссссбаасда аааасбдсбд ддссассбдд баааадаааа абабдасаса 1020 дасббсбаба бссбддасаа абабссдсбд дсадббсдбс сдббббабас дабдссбдаб 1080 ссбсдбаабс сдааасааад саасбссбаб дасабдббса бдсдбддбда ададабссбд 1140 бсбддбдсбс аасдбабсса бдабссасад сбдсбдасад аасдбдсасб дсабсасддб 1200 аббдабсбдд адаааабсаа адссбабабс дасбссбббс дсбббддбдс сссбссасаб 1260 дссддбддбд дааббдддсб ддадсдбдба асаабдсбдб бссбдддасб дсасаасдбс 1320 сдбсааассб саабдбббсс асдбдасссб ааасдбсбда сассбсбсда д 1371 <210> 71 <211> 1365 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 71 ддабссссаб садссбсадс абсбсдбааа адссаддааа аассдсдсда аабсабддас 60 дсбдссдаад аббабдссаа ададсдсбаб ддбабсадбб сдабдабсса дбсасаадад 120 ааассадабс дбдбдсбддб ссдбдббсдб дассбдасса бссадааадс ддабдаадбб 180 дбббдддбсс дбдсбсдбдб бсабасаадс сдбдссааад дсааасадбд сббссбддбб 240 сбдсдбсаас адсадбббаа сдббсаддсс сбддбадссд ббддбдабса сдссбсаааа 300 сааабддбда ааббсдссдс саасабсаас ааадададса бсдбсдасдб бдааддбдбс 360 дбссдбааад бдаабсадаа аабсддсбсс бдбасасадс аадабдбдда дсбдсабдбс 420 саааааабсб абдбсабсбс асбддссдаа ссбсдбсбдс сбсбдсаасб ддабдабдсб 480 дбасдсссбд аадсбдаадд сдаадаадаа ддбсдбдсба сддббаабса ддабасбсдс 540 сбддасаасс дбдбсаббда бсбдсдсасс бсаассбсбс аадсддбабб ссдссбдсаа 600 бссддсабсб дбсассбдбб ссдбдааасд сбдабсааса аадддбббдб ддадаббсад 660 ассссдаааа бсаббадбдс сдссадсдаа ддбддадсаа абдбдбббас сдбдбссбаб 720 ббсаааааса абдссбабсб ддсасадбсб ссбсадсбдб абааасаааб дбдбабсбдб 780 дсбдасббсд адааадбдбб сбсаабсддд ссддбаббсс дбдсададда бадсаасаса 840 сассдссабс бдассдаабб бдбаддссбд дасабсдааа бддссббсаа сбабсаббаб 900 сасдаддбда бддаадаааб сдсбдабаса абддбасада бсбббааадд дсбдсаадаа 960 бсбассссба асдааааасб дсбдддссас сбддбаааад ааааабабда сасадасббс 1020 бабабссбдд асааабабсс дсбддсадбб сдбссдбббб абасдабдсс бдабссбсдб 1080 аабссдааас ааадсаасбс сбабдасабд ббсабдсдбд дбдаададаб ссбдбсбддб 1140 дсбсаасдба бссабдабсс асадсбдсбд асадаасдбд сасбдсабса сддбаббдаб 1200 сбддадаааа бсааадссба бабсдасбсс бббсдсбббд дбдссссбсс асабдссддб 1260 ддбддааббд ддсбддадсд бдбаасаабд сбдббссбдд дасбдсасаа сдбссдбсаа 1320 ассбсаабдб ббссасдбда сссбааасдб сбдасассбс бсдад 1365 <210> 72 <211> 264 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы

- 156 030461 <400> 72 ддаЕссссаЕ садссЕсадс аЕсЕсдЕааа адссаддааа аассдсдсда ааЕсаЕддас 60 дсЕдссдаад аЕЕддааЕда асЕдсЕдЕдс ЕдсЕЕсЕддд аЕЕдЕаЕсаЕ дЕЕсдЕасдс 120 ссдссЕЕдЕЕ сЕсЕддЕЕаЕ сссдаасдаЕ адссЕдсЕда ааЕЕсасссЕ дЕдЕсаЕсЕд 180 ассссЕдЕЕЕ ддаЕдасЕда асдЕдаЕссд дсаадсаааа аааааааааа аааададЕсЕ 240 сасассЕаЕЕ ссЕЕЕсаасЕ сдад 264 <210> 73 <211> 401 <212> Белок <213> Ното зарίеηз <400> 73

МеЕ 1

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а А1а Азп 5

11е

Азп

Ьуз 10

С1и

Зег

11е

Уа1

Азр 15

Уа1

С1и

С1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

С1п

Ьуз

11е

С1у

Зег

Суз

ТЪг

С1п

20

25

30

С1п

Азр

Уа1

С1и

Ьеи

Н1з

Уа1

С1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Зег

Ьеи

А1а

35

40

45

С1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

С1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

С1и

А1а

50

55

60

С1и

С1у

С1и

С1и

С1и

С1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

С1п

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

65

70

75

80

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Зег

ТЪг

Зег

С1п

А1а

Уа1

РЪе

85

90

95

Агд

Ьеи

С1п

Зег

С1у

11е

Суз

Н1з

Ьеи

РЪе

Агд

С1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

100

105

110

Ьуз

С1у

РЪе

Уа1

С1и

11е

С1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

Зег

А1а

А1а

Зег

115

120

125

С1и

С1у

С1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Зег

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

130

135

140

Туг

Ьеи

А1а

С1п

Зег

Рго

С1п

Ьеи

Туг

Ьуз

С1п

МеЕ

Суз

11е

Суз

А1а

145

150

155

160

Азр

РЪе

С1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Зег

11е

С1у

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

С1и

Азр

165

170

175

Зег

Азп

ТЪг

Н1з

Агд

Н1з

Ьеи

ТЪг

С1и

РЪе

Уа1

С1у

Ьеи

Азр

11е

С1и

180

185

190

МеЕ

А1а

РЪе

Азп

Туг

Н1з

Туг

Н1з

С1и

Уа1

МеЕ

С1и

С1и

11е

А1а

Азр

195

200

205

ТЪг

МеЕ

Уа1

С1п

11е

РЪе

Ьуз

С1у

Ьеи

С1п

С1и

Агд

РЪе

С1п

ТЪг

С1и

210

215

220

11е

С1п

ТЪг

Уа1

Азп

Ьуз

С1п

РЪе

Рго

Суз

С1и

Рго

РЪе

Ьуз

РЪе

Ьеи

225

230

235

240

С1и

Рго

ТЪг

Ьеи

Агд

Ьеи

С1и

Туг

Суз

С1и

А1а

Ьеи

А1а

МеЕ

Ьеи

Агд

245

250

255

С1и

А1а

С1у

Уа1

С1и

МеЕ

С1у

Азр

С1и

Азр

Азр

Ьеи

Зег

ТЪг

Рго

Азп

260

265

270

С1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

С1у

Н1з

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЪг

Азр

РЪе

275

280

285

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЪе

Туг

ТЪг

МеЕ

290

295

300

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

С1п

Зег

Азп

Зег

Туг

Азр

МеЕ

РЪе

МеЕ

305

310

315

320

Агд

С1у

С1и

С1и

11е

Ьеи

Зег

С1у

А1а

С1п

Агд

11е

Н1з

Азр

Рго

С1п

325

330

335

Ьеи

Ьеи

ТЪг

С1и

Агд

А1а

Ьеи

Н1з

Н1з

С1у

11е

Азр

Ьеи

С1и

Ьуз

11е

340

345

350

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Зег

РЪе

Агд

РЪе

С1у

А1а

Рго

Рго

Н1з

А1а

С1у

355

360

365

С1у

С1у

11е

С1у

Ьеи

С1и

Агд

Уа1

ТЪг

МеЕ

Ьеи

РЪе

Ьеи

С1у

Ьеи

Н1з

370

375

380

Азп

Уа1

Агд

С1п

ТЪг

Зег

МеЕ

РЪе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЪг

- 157

385 390 395 400

Рго <210> 74 <211> 1206 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 74 аЕддЕЕаааЕ ЕЕдсЕдссаа саЕсаасааа дададсаЕЕд ЕддаЕдЕада аддЕдЕЕдЕд адаааадЕда аЕсадааааЕ ЕддаадсЕдЕ асасадсаад асдЕЕдадЕЕ асаЕдЕЕсад аадаЕЕЕаЕд ЕдаЕсадЕЕЕ ддсЕдаассс сдЕсЕдсссс ЕдсадсЕдда ЕдаЕдсЕдЕЕ сддссЕдадд садааддада ададдаадда ададсЕасЕд ЕЕаассадда ЕасаадаЕЕа дасаасадад ЕсаЕЕдаЕсЕ ЕаддасаЕса асЕадЕсадд садЕсЕЕссд ЕсЕссадЕсЕ ддсаЕсЕдсс аЕсЕсЕЕссд адааасЕЕЕа аЕЕаасааад дЕЕЕЕдЕдда ааЕссааасЕ ссЕааааЕЕа ЕЕЕсадсЕдс садЕдаадда ддадссааЕд ЕЕЕЕЕасЕдЕ дЕсаЕаЕЕЕЕ аааааЕааЕд саЕассЕддс ЕсадЕсссса садсЕаЕаЕа адсаааЕдЕд саЕЕЕдЕдсЕ даЕЕЕЕдада аддЕЕЕЕсЕс ЕаЕЕддасса дЕаЕЕсадад сддаадасЕс ЕааЕасссаЕ адасаЕсЕаа сЕдадЕЕЕдЕ ЕддЕЕЕддас аЕЕдаааЕдд сЕЕЕЕааЕЕа ссаЕЕассас даадЕЕаЕдд аадаааЕЕдс ЕдасассаЕд дЕасаааЕаЕ ЕсаааддасЕ Есаадааадд ЕЕЕсадасЕд аааЕЕсааас адЕдааЕааа садЕЕсссаЕ дЕдадссаЕЕ саааЕЕЕЕЕд дадссаасЕс ЕаадасЕада аЕаЕЕдЕдаа дсаЕЕддсЕа ЕдсЕЕаддда адсЕддадЕс даааЕдддад аЕдаадасда ЕсЕдадсаса ссаааЕдааа адсЕдЕЕддд ЕсаЕЕЕддЕа ааддаааадЕ аЕдаЕасада ЕЕЕЕЕаЕаЕЕ сЕЕдаЕаааЕ аЕссаЕЕддс ЕдЕаадассЕ ЕЕсЕаЕасса ЕдссЕдассс аадаааЕссс ааасадЕсса асЕсЕЕасда ЕаЕдЕЕсаЕд ададдадаад аааЕаЕЕдЕс аддадсЕсаа адааЕасаЕд аЕссЕсаасЕ дсЕаасадад ададсЕЕЕас аЕсаЕддааЕ ЕдаЕЕЕддад ааааЕЕаадд сЕЕасаЕЕда ЕЕссЕЕссдс ЕЕЕддадссс сЕссЕсаЕдс ЕддЕддаддс аЕЕддаЕЕдд аасдадЕЕас ЕаЕдсЕдЕЕЕ сЕдддаЕЕдс аЕааЕдЕЕсд ЕсадассЕсс аЕдЕЕсссЕс дЕдаЕсссаа асдасЕсасЕ ссЕЕаа <210> 75 <211> 24 <212> Белок <213> Ното зартепз

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1206

<400> 75 МеЕ Ьеи РЪе 1 Агд Азр Рго	Ьеи О1у Ьеи Нтз Азп Уа1 Агд О1п ТЪг Бег МеЕ РЪе Рго
5 Ьуз Агд Ьеи ТЪг Рго 20	10	15
<210> 76 <211> 75 <212> ДНК <213> Ното	зартепз
<400> 76 аЕдсЕдЕЕЕс сдасЕсасЕс	ЕдддаЕЕдса ЕааЕдЕЕсдЕ сЕЕаа	садассЕсса	ЕдЕЕсссЕсд	ЕдаЕсссааа
<210> 77 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното	зартепз
<400> 77 дсдддадаЕс	аЕддасдсдд сддаааЕсда	дЕЕЕЕддЕЕс	дддЕЕадада
<210> 78

- 158 030461 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 78 дсдддадакс акддасдсдд сддаадаккд даасдадкка скакдскдкк 50 <210> 79 <211> 2 <212> Белок <213> Ното зарчепз <400> 79

Мек Ьеи <210> 80 <211> 205 <212> Белок <213> Ното зарчепз <400> 80

Туг 1

Нчз

Туг

Нчз

О1и 5

Уа1

Мек

О1и

О1и

11е 10

А1а

Азр

ТЬг

Мек

Уа1 15

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

Агд

РЬе

О1п

ТЬг

О1и

11е

О1п

ТЬг

Уа1

20

25

30

Азп

Ьуз

О1п

РЬе

Рго

Суз

О1и

Рго

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

35

40

45

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

Ьеи

А1а

Мек

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

50

55

60

О1и

Мек

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

Ьеи

Зег

ТЬг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

65

70

75

80

О1у

Нчз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр

85

90

95

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЬе

Туг

ТЬг

Мек

Рго

Азр

Рго

Агд

100

105

110

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Зег

Азп

Зег

Туг

Азр

Мек

РЬе

Мек

Агд

О1у

О1и

О1и

115

120

125

11е

Ьеи

Зег

О1у

А1а

О1п

Агд

11е

Нчз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

130

135

140

Агд

А1а

Ьеи

Нчз

Нчз

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

145

150

155

160

Азр

Зег

РЬе

Агд

РЬе

О1у

А1а

Рго

Рго

Нчз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

165

170

175

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЬг

Мек

Ьеи

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

Нчз

Азп

Уа1

Агд

О1п

180

185

190

ТЬг

Зег

Мек

РЬе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

195

200

205

<210> 81 <211> 618 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 81 кассаккасс асдаадккак ддаадааакк дскдасасса кддкасааак акксааадда 60 скксаадааа ддккксадас кдааакксаа асадкдаака аасадккссс акдкдадсса 120 кксааакккк кддадссаас кскаадаска даакаккдкд аадсаккддс какдсккадд 180 даадскддад ксдааакддд адакдаадас дакскдадса сассааакда ааадскдккд 240 ддксакккдд каааддаааа дкакдакаса дакккккака кксккдакаа акакссаккд 300

- 159 030461 дсбдбаадас сбббсбабас сабдссбдас ссаадааабс ссааасадбс саасбсббас 360 дабабдббса бдададдада адааабаббд бсаддадсбс ааадаабаса бдабссбсаа 420 сбдсбаасад адададсббб асабсабдда аббдабббдд адааааббаа ддсббасабб 480 даббссббсс дсбббддадс сссбссбсаб дсбддбддад дсаббддабб ддаасдадбб 540 асбабдсбдб ббсбдддабб дсабаабдбб сдбсадассб ссабдббссс бсдбдабссс 600 ааасдасбса сбссббаа 618 <210> 82 <211> 230 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 82

Меб 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

О1у

Бег

Туг

НФз

Туг

НФз

О1и

Уа1

Меб

О1и

О1и

20

25

30

11е

А1а

Азр

ТЪг

Меб

Уа1

Ο1η

11е

РЪе

Ьуз

О1у

Ьеи

Ο1η

О1и

Агд

РЪе

35

40

45

Ο1η

ТЪг

О1и

11е

Ο1η

ТЪг

Уа1

Азп

Ьуз

Ο1η

РЪе

Рго

Суз

О1и

Рго

РЪе

50

55

60

Ьуз

РЪе

Ьеи

О1и

Рго

ТЪг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

Ьеи

А1а

65

70

75

80

Меб

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

Меб

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

Ьеи

Бег

85

90

95

ТЪг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

НФз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

100

105

110

ТЪг

Азр

РЪе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЪе

115

120

125

Туг

ТЪг

Меб

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

Ο1η

Бег

Азп

Бег

Туг

Азр

130

135

140

Меб

РЪе

Меб

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

Ο1η

Агд

11е

НФз

145

150

155

160

Азр

Рго

Ο1η

Ьеи

Ьеи

ТЪг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

НФз

НФз

О1у

11е

Азр

Ьеи

165

170

175

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЪе

Агд

РЪе

О1у

А1а

Рго

Рго

180

185

190

НФз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЪг

Меб

Ьеи

РЪе

Ьеи

195

200

205

О1у

Ьеи

НФз

Азп

Уа1

Агд

Ο1η

ТЪг

Бег

Меб

РЪе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

210

215

220

Агд

Ьеи

ТЪг

Рго

Ьеи

О1и

225

230

<210> 83 <211> 230 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий

6хНФз

С-концевую аффинную метку

<400> 83
Меб О1у Бег	Туг	НФз	Туг	НФз	О1и
1		5
Меб Уа1 Ο1η	11е	РЪе	Ьуз	О1у	Ьеи
	20

Уа1	Меб 10	О1и О1и	11е А1а	Азр 15	ТЪг
Ο1η	О1и	Агд	РЪе	Ο1η	ТЪг	О1и	11е
25					30

- 160 030461

О1п

ТЪг

Уа1 35

Азп

Ьуз

О1п

РЪе

Рго 40

Суз

О1и

Рго

РЪе

Ьуз 45

РЪе

Рго

ТЪг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

Ьеи

А1а

МеЕ

Ьеи

50

55

60

А1а

О1у

Уа1

О1и

МеЕ

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

Ьеи

Бег

ТЪг

Рго

65

70

75

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

НФз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЪг

Азр

85

90

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЪе

Туг

ТЪг

100

105

110

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Бег

Туг

Азр

МеЕ

РЪе

115

120

125

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

Агд

11е

НФз

Азр

Рго

130

135

140

Ьеи

ТЪг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

НФз

НФз

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

145

150

155

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЪе

Агд

РЪе

О1у

А1а

Рго

Рго

НФз

А1а

165

170

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЪг

МеЕ

Ьеи

РЪе

Ьеи

О1у

Ьеи

180

185

190

Уа1

Агд

О1п

ТЪг

Бег

МеЕ

РЪе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

195

200

205

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

210

215

220

НФз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

НФз

225

230

Ьеи О1и

Агд О1и

Азп О1и

РЪе Туг 95

МеЕ Рго

МеЕ Агд

О1п Ьеи

11е Ьуз 160

О1у О1у

175

НФз Азп

ТЪг Рго

Бег ТЪг <210> 84 <211> 425 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 84

МеЕ 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

О1у

Бег

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

20

25

30

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

35

40

45

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

50

55

60

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

65

70

75

80

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

85

90

95

Азп

О1п

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

100

105

110

ТЪг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

РЪе

115

120

125

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

130

135

140

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

145

150

155

160

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

165

170

175

О1п

МеЕ

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Бег

11е

О1у

Рго

180

185

190

Уа1

РЪе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЪг

Нтз

Агд

Нтз

Ьеи

ТЪг

О1и

РЪе

- 161

195

200

205

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

Меб

А1а

РЬе

Азп

Туг

НФз

Туг

НФз

О1и

Уа1

210

215

220

Меб

О1и

О1и

11е

А1а

Азр

ТЬг

Меб

Уа1

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

225

230

235

240

О1и

Агд

РЬе

О1п

ТЬг

О1и

11е

О1п

ТЬг

Уа1

Азп

Ьуз

О1п

РЬе

Рго

Суз

245

250

255

О1и

Рго

РЬе

Ьуз

РЬе

Ьеи

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

260

265

270

А1а

Ьеи

А1а

Меб

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

Меб

О1у

Азр

О1и

Азр

275

280

285

Азр

Ьеи

Бег

ТЬг

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

НФз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

290

295

300

Ьуз

Туг

Азр

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

305

310

315

320

Агд

Рго

РЬе

Туг

ТЬг

Меб

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Бег

Азп

325

330

335

Бег

Туг

Азр

Меб

РЬе

Меб

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Бег

О1у

А1а

О1п

340

345

350

Агд

11е

НФз

Азр

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

НФз

НФз

О1у

355

360

365

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Бег

РЬе

Агд

РЬе

О1у

370

375

380

А1а

Рго

Рго

НФз

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЬг

Меб

385

390

395

400

Ьеи

РЬе

Ьеи

О1у

Ьеи

НФз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЬг

Бег

Меб

РЬе

Рго

Агд

405

410

415

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

О1и

420

425

<210> 85 <211> 425 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий
С-концевую аффинную метку 6хНФз
<400> 85
Меб О1у Бег Уа1 Ьуз	РЬе А1а А1а Азп 11е Азп Ьуз О1и Бег 11е Уа1
1 5	10 15
Азр Уа1 О1и О1у Уа1	Уа1 Агд Ьуз Уа1 Азп О1п Ьуз 11е О1у Бег Суз
20	25 30
ТЬг О1п О1п Азр Уа1	О1и Ьеи НФз Уа1 О1п Ьуз 11е Туг Уа1 11е Бег
35	40 45
Ьеи А1а О1и Рго Агд	Ьеи Рго Ьеи О1п Ьеи Азр Азр А1а Уа1 Агд Рго
50	55 60
О1и А1а О1и О1у О1и	О1и О1и О1у Агд А1а ТЬг Уа1 Азп О1п Азр ТЬг
65	70 75 80
Агд Ьеи Азр Азп Агд	Уа1 11е Азр Ьеи Агд ТЬг Бег ТЬг Бег О1п А1а
85	90 95
Уа1 РЬе Агд Ьеи О1п	Бег О1у 11е Суз НФз Ьеи РЬе Агд О1и ТЬг Ьеи
100	105 110
11е Азп Ьуз О1у РЬе	Уа1 О1и 11е О1п ТЬг Рго Ьуз 11е 11е Бег А1а
115	120 125
А1а Бег О1и О1у О1у	А1а Азп Уа1 РЬе ТЬг Уа1 Бег Туг РЬе Ьуз Азп
130	135 140
Азп А1а Туг Ьеи А1а	О1п Бег Рго О1п Ьеи Туг Ьуз О1п Меб Суз 11е
145	150 155 160
Суз А1а Азр РЬе О1и	Ьуз Уа1 РЬе Бег 11е О1у Рго Уа1 РЬе Агд А1а
165	170 175

- 162

О1и

Азр

Зег

Азп 180

ТЬг

Нтз

Агд

Нтз

Ьеи 185

ТЬг О1и

РЬе

Уа1

О1у 190

Ьеи

Азр

11е

О1и

Мек

А1а

РЬе

Азп

Туг

Нтз

Туг

Нтз

О1и

Уа1

Мек

О1и

О1и

11е

195

200

205

А1а

Азр

ТЬг

Мек

Уа1

О1п

11е

РЬе

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

О1и

Агд

РЬе

О1п

210

215

220

ТЬг

О1и

11е

О1п

ТЬг

Уа1

Азп

Ьуз

О1п

РЬе

Рго

Суз

О1и

Рго

РЬе

Ьуз

225

230

235

240

РЬе

Ьеи

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

О1и

Туг

Суз

О1и

А1а

Ьеи

А1а

Мек

245

250

255

Ьеи

Агд

О1и

А1а

О1у

Уа1

О1и

Мек

О1у

Азр

О1и

Азр

Азр

Ьеи

Зег

ТЬг

260

265

270

Рго

Азп

О1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1у

Нтз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

Ьуз

Туг

Азр

ТЬг

275

280

285

Азр

РЬе

Туг

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Рго

РЬе

Туг

290

295

300

ТЬг

Мек

Рго

Азр

Рго

Агд

Азп

Рго

Ьуз

О1п

Зег

Азп

Зег

Туг

Азр

Мек

305

310

315

320

РЬе

Мек

Агд

О1у

О1и

О1и

11е

Ьеи

Зег

О1у

А1а

О1п

Агд

11е

Нтз

Азр

325

330

335

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

ТЬг

О1и

Агд

А1а

Ьеи

Нтз

Нтз

О1у

11е

Азр

Ьеи

О1и

340

345

350

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Туг

11е

Азр

Зег

РЬе

Агд

РЬе

О1у

А1а

Рго

Рго

Нтз

355

360

365

А1а

О1у

О1у

О1у

11е

О1у

Ьеи

О1и

Агд

Уа1

ТЬг

Мек

Ьеи

РЬе

Ьеи

О1у

370

375

380

Ьеи

Нтз

Азп

Уа1

Агд

О1п

ТЬг

Зег

Мек

РЬе

Рго

Агд

Азр

Рго

Ьуз

Агд

385

390

395

400

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

405

410

415

Азр

Зег

ТЬг

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

420

425

<210> 86 <211> 627 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 86 ддаксскакс аккаксасда ддкдакддаа даааксдскд акасаакддк асадаксккк 60 ааадддскдс аадаасдскк ксааасадад акксааассд ксаакаааса дкксссдкдк 120 даассдккса аакккскдда ассдассскд сдкскддаак аккдкдаадс аскддскакд 180 скдсдсдаад скддкдксда аакдддкдак даддакдасс кдкскасссс каасдааааа 240 скдскдддсс асскддкааа адааааакак дасасадаск кскакаксск ддасааакак 300 ссдскддсад кксдкссдкк ккакасдакд сскдаксскс дкаакссдаа асааадсаас 360 ксскакдаса кдкксакдсд кддкдаадад аксскдкскд дкдсксаасд какссакдак 420 ссасадскдс кдасадаасд кдсаскдсак сасддкаккд акскддадаа ааксааадсс 480 какаксдаск ссккксдскк кддкдсссск ссасакдссд дкддкддаак кдддскддад 540 сдкдкаасаа кдскдкксск дддаскдсас аасдкссдкс ааассксаак дкккссасдк 600 дассскааас дкскдасасс ксксдад 627 <210> 87 <211> 1212 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы

- 163 030461 <400> 87 ддарссдрда ааррсдссдс саасарсаас ааадададса рсдрсдасдр рдааддрдрс 60 дрссдрааад рдаарсадаа аарсддсрсс рдрасасадс аадардрдда дсрдсардрс 120 саааааарср ардрсарсрс асрддссдаа ссрсдрсрдс срсрдсааср ддардардср 180 драсдсссрд аадсрдаадд сдаадаадаа ддрсдрдсра сддрраарса ддарасрсдс 240 срддасаасс дрдрсаррда рсрдсдсасс рсаассрсрс аадсддрарр ссдссрдсаа 300 рссддсарср дрсассрдрр ссдрдааасд срдарсааса аадддрррдр ддадаррсад 360 ассссдаааа рсаррадрдс сдссадсдаа ддрддадсаа ардрдрррас сдрдрссрар 420 ррсаааааса ардссрарср ддсасадрср ссрсадсрдр арааасааар дрдрарсрдр 480 дсрдасррсд адааадрдрр срсаарсддд ссддраррсс дрдсададда радсаасаса 540 сассдссарс рдассдаарр рдраддссрд дасарсдааа рддссррсаа срарсаррар 600 сасдаддрда рддаадааар сдсрдараса арддрасада рсрррааадд дсрдсаадаа 660 сдсрррсааа сададаррса аассдрсаар ааасадррсс сдрдрдаасс дррсаааррр 720 срддаассда сссрдсдрср ддаараррдр даадсасрдд срардсрдсд сдаадсрддр 780 дрсдааардд дрдардадда рдассрдрср ассссраасд ааааасрдср дддссассрд 840 драааадааа аарардасас адасррсрар арссрддаса аарарссдср ддсадррсдр 900 ссдррррара сдардссрда рссрсдраар ссдааасааа дсаасрссра рдасардррс 960 ардсдрддрд аададарсср дрсрддрдср саасдрарсс ардарссаса дсрдсрдаса 1020 даасдрдсас рдсарсасдд раррдарсрд дадаааарса аадссрарар сдасрссррр 1080 сдсрррддрд ссссрссаса рдссддрддр ддааррдддс рддадсдрдр аасаардсрд 1140 ррссрдддас рдсасаасдр ссдрсааасс рсаардрррс сасдрдассс рааасдрсрд 1200 асассрсрсд ад 1212 <210> 88 <211> 255 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 88

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

1

5

10

15

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

Нгз

ТЪг

Бег

20

25

30

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

35

40

45

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Нгз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

Мер

50

55

60

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

65

70

75

80

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

85

90

95

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Нгз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

100

105

110

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

115

120

125

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

130

135

140

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

О1п

А1а

Уа1

РЪе

Агд

145

150

155

160

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

Нгз

Ьеи

РЪе

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

165

170

175

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

180

185

190

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

195

200

205

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

Мер

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

210

215

220

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

О1и

Азр

Бег

225

230

235

240

Азп

ТЪг

Нгз

Агд

Нгз

Ьеи

ТЪг

О1и

РЪе

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

245

250

255

- 164 <210> 89 <211> 765 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 89 саадааааас садаЕсдадЕ ЕЕЕддЕЕсдд дЕЕададасЕ ЕдасааЕаса аааадсЕдаЕ 60 даадЕЕдЕЕЕ дддЕасдЕдс аададЕЕсаЕ асаадсадад сЕааадддаа асадЕдсЕЕс 120

ЕЕадЕссЕас дЕсадсадса дЕЕЕааЕдЕс саддсЕсЕЕд ЕддсддЕддд адассаЕдса 180 адсаадсада ЕддЕЕаааЕЕ ЕдсЕдссаас аЕсаасааад ададсаЕЕдЕ ддаЕдЕадаа 240 ддЕдЕЕдЕда даааадЕдаа ЕсадааааЕЕ ддаадсЕдЕа сасадсаада сдЕЕдадЕЕа 300 саЕдЕЕсада адаЕЕЕаЕдЕ даЕсадЕЕЕд дсЕдаасссс дЕсЕдссссЕ дсадсЕддаЕ 360 даЕдсЕдЕЕс ддссЕдаддс адааддадаа даддааддаа дадсЕасЕдЕ ЕаассаддаЕ 420 асаадаЕЕад асаасададЕ саЕЕдаЕсЕЕ аддасаЕсаа сЕадЕсаддс адЕсЕЕссдЕ 480 сЕссадЕсЕд дсаЕсЕдсса ЕсЕсЕЕссда дааасЕЕЕаа ЕЕаасааадд ЕЕЕЕдЕддаа 540 аЕссааасЕс сЕааааЕЕаЕ ЕЕсадсЕдсс адЕдааддад дадссааЕдЕ ЕЕЕЕасЕдЕд 600

ЕсаЕаЕЕЕЕа ааааЕааЕдс аЕассЕддсЕ садЕссссас адсЕаЕаЕаа дсаааЕдЕдс 660 аЕЕЕдЕдсЕд аЕЕЕЕдадаа ддЕЕЕЕсЕсЕ аЕЕддассад ЕаЕЕсададс ддаадасЕсЕ 720 ааЕасссаЕа дасаЕсЕаас ЕдадЕЕЕдЕЕ ддЕЕЕддаса ЕЕдаа 765 <210> 90 <211> 15 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 90

11е О1у Бег Суз ТЪг О1п О1п Азр Уа1 О1и Ьеи НФз Уа1 О1п Ьуз
1	5	10	15

<210> 91 <211> 10 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 91

11е Туг Уа1 11е Бег Ьеи А1а О1и Рго Агд 1 5 10 <210> 92 <211> 20 <212> Белок <213> Миз тизси1из

<400> 92
Ьеи Рго Ьеи	О1п	Ьеи Азр Азр А1а	11е Агд Рго О1и Уа1	О1и О1у О1и
1		5	10	15
О1и Азр О1у	Агд
	20

<210> 93 <211> 54 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 93

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

1

5

10

15

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

О1п

А1а

11е

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

- 165 030461

НФз	Ьеи	РЪе	20 Агд	О1и	ТЪг Ьеи	11е	25 Азп Ьуз	О1у РЪе Уа1	30 О1и 11е О1п
ТЪг	Рго 50	35 Ьуз	11е	11е	Бег	40		45

<210> 94 <211> 16 <212> Белок <213> Миз тизси1из
<400>	94
А1а А1а Бег О1и О1у О1у А1а Азп Уа1	РЪе ТЪг Уа1	Бег Туг РЪе Ьуз
1	5	10	15

<210> 95 <211> 115 <212> Белок <213> Миз тизси1из

<400> 95

11е

О1у Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

1

5

10

15

Туг

Уа1 11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

20

25

30

А1а

11е Агд

Рго

О1и

Уа1

О1и

О1у

О1и

О1и

Азр

О1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

35

40

45

Азп

О1п Азр

ТЪг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

50

55

60

ТЪг

Бег О1п

А1а

11е

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

РЪе

65

70

75

80

Агд

О1и ТЪг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

85

90

95

11е

11е Бег

А1а

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

100

105

110

Туг

РЪе Ьуз

115

<210> 96 <211> 132 <212> Белок <213> Ното

зартепз

<400> 96

Азр

Туг А1а

Ьуз

О1и

Агд

Туг

О1у

11е

Бег

Бег

Меб

11е

О1п

Бег

О1п

1

5

10

15

О1и

Ьуз Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

20

25

30

Ьуз

А1а Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЪг

Бег

Агд

35

40

45

А1а

Ьуз О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

50

55

60

Уа1

О1п А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

Меб

Уа1

65

70

75

80

Ьуз

РЪе А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

85

90

95

Уа1

Уа1 Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

100

105

110

Уа1

О1и Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

115

120

125

- 166

Агд Ьеи Рго Ьеи 130 <210> 97 <211> 396 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 97 даЕЕаЕдсЕа аадададаЕа ЕддааЕаЕсЕ ЕсааЕдаЕас ааЕсасаада аааассадаЕ 60 сдадЕЕЕЕдд ЕЕсдддЕЕад адасЕЕдаса аЕасааааад сЕдаЕдаадЕ ЕдЕЕЕдддЕа 120 сдЕдсаадад ЕЕсаЕасаад сададсЕааа дддааасадЕ дсЕЕсЕЕадЕ ссЕасдЕсад 180 садсадЕЕЕа аЕдЕссаддс ЕсЕЕдЕддсд дЕдддадасс аЕдсаадсаа дсадаЕддЕЕ 240 аааЕЕЕдсЕд ссаасаЕсаа сааадададс аЕЕдЕддаЕд ЕадааддЕдЕ ЕдЕдадаааа 300 дЕдааЕсада аааЕЕддаад сЕдЕасасад саадасдЕЕд адЕЕасаЕдЕ ЕсадаадаЕЕ 360

ЕаЕдЕдаЕса дЕЕЕддсЕда ассссдЕсЕд ссссЕд 396 <210> 98 <211> 122 <212> Белок <213> Ното зарФепз <400> 98

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

УаФ

Ьеи

УаФ

Агд

УаФ

1

5

10

15

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

УаФ

УаФ

Тгр

УаФ

Агд

А1а

20

25

30

Агд

УаФ

НФз

ТЬг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

УаФ

Ьеи

35

40

45

Агд

О1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

УаФ

О1п

А1а

Ьеи

УаФ

А1а

УаФ

О1у

Азр

НФз

50

55

60

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЕ

УаФ

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

65

70

75

80

11е

УаФ

Азр

УаФ

О1и

О1у

УаФ

УаФ

Агд

Ьуз

УаФ

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

85

90

95

Бег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

УаФ

О1и

Ьеи

НФз

УаФ

О1п

Ьуз

11е

Туг

УаФ

100

105

110

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

115

120

<210> 99 <211> 366 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 99

ЕсааЕдаЕас ааЕсасаада аааассадаЕ сдадЕЕЕЕдд ЕЕсдддЕЕад адасЕЕдаса 60 аЕасааааад сЕдаЕдаадЕ ЕдЕЕЕдддЕа сдЕдсаадад ЕЕсаЕасаад сададсЕааа 120 дддааасадЕ дсЕЕсЕЕадЕ ссЕасдЕсад садсадЕЕЕа аЕдЕссаддс ЕсЕЕдЕддсд 180 дЕдддадасс аЕдсаадсаа дсадаЕддЕЕ аааЕЕЕдсЕд ссаасаЕсаа сааадададс 240 аЕЕдЕддаЕд ЕадааддЕдЕ ЕдЕдадаааа дЕдааЕсада аааЕЕддаад сЕдЕасасад 300 саадасдЕЕд адЕЕасаЕдЕ ЕсадаадаЕЕ ЕаЕдЕдаЕса дЕЕЕддсЕда ассссдЕсЕд 360 ссссЕд 366 <210> 100 <211> 280 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий

- 167 030461

Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 100

Мек 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Зег

ТЬг

О1у

Зег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

20

25

30

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

35

40

45

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЬг

Зег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

50

55

60

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

65

70

75

80

Азр

НФз

А1а

Зег

Ьуз

О1п

Мек

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

85

90

95

О1и

Зег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

100

105

110

11е

О1у

Зег

Суз

ТЬг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

115

120

125

Туг

Уа1

11е

Зег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

130

135

140

А1а

Уа1

Агд

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЬг

Уа1

145

150

155

160

Азп

О1п

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

165

170

175

ТЬг

Зег

О1п

А1а

Уа1

РЬе

Агд

Ьеи

О1п

Зег

О1у

11е

Суз

НФз

Ьеи

РЬе

180

185

190

Агд

О1и

ТЬг

Ьеи

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЬе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЬг

Рго

Ьуз

195

200

205

11е

11е

Зег

А1а

А1а

Зег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

210

215

220

Туг

РЬе

Ьуз

Азп

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Зег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

225

230

235

240

О1п

Мек

Суз

11е

Суз

А1а

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Зег

11е

О1у

Рго

245

250

255

Уа1

РЬе

Агд

А1а

О1и

Азр

Зег

Азп

ТЬг

Нтз

Агд

Нтз

Ьеи

ТЬг

О1и

РЬе

260

265

270

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1и

Ьеи

О1и

275

280

<210>	101
<211>	280
<212>	Белок
<213>	Искусственная последовательность
<220> <223>	полипептид	аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий
	С-концевую	аффинную метку 6хНФз

<400> 101

Мек

О1у

Зег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

1

5

10

15

Ьеи

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

20

25

30

НФз

ТЬг

Зег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

35

40

45

О1п

О1п

РЬе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

НФз

А1а

Зег

50

55

60

Ьуз

О1п

Мек

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Зег

11е

Уа1

65

70

75

80

- 168

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1 85

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп 90

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег 95

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

Нчз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

100

105

110

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

О1п

Ьеи

Азр

Азр

А1а

Уа1

Агд

Рго

115

120

125

О1и

А1а

О1и

О1у

О1и

О1и

О1и

О1у

Агд

А1а

ТЪг

Уа1

Азп

О1п

Азр

ТЪг

130

135

140

Агд

Ьеи

Азр

Азп

Агд

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Агд

ТЪг

Бег

ТЪг

Бег

О1п

А1а

145

150

155

160

Уа1

РЪе

Агд

Ьеи

О1п

Бег

О1у

11е

Суз

Нчз

Ьеи

РЪе

Агд

О1и

ТЪг

Ьеи

165

170

175

11е

Азп

Ьуз

О1у

РЪе

Уа1

О1и

11е

О1п

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

11е

Бег

А1а

180

185

190

А1а

Бег

О1и

О1у

О1у

А1а

Азп

Уа1

РЪе

ТЪг

Уа1

Бег

Туг

РЪе

Ьуз

Азп

195

200

205

Азп

А1а

Туг

Ьеи

А1а

О1п

Бег

Рго

О1п

Ьеи

Туг

Ьуз

О1п

Ме+

Суз

11е

210

215

220

Суз

А1а

Азр

РЪе

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Бег

11е

О1у

Рго

Уа1

РЪе

Агд

А1а

225

230

235

240

О1и

Азр

Бег

Азп

ТЪг

Нчз

Агд

Нчз

Ьеи

ТЪг

О1и

РЪе

Уа1

О1у

Ьеи

Азр

245

250

255

11е

О1и

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

260

265

270

Бег

ТЪг

Нчз

Нчз

Нчз

Нчз

Нчз

Нчз

275

280

<210> 102

<211> 147

<212> Белок

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий

Ν-

-концевую аффинную метку

6хНчз

<400> 102

Ме+

Нчз

Нчз

Нчз

Нчз

Нчз

Нчз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

О1у

Бег

Бег

Ме+

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

20

25

30

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

35

40

45

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

Нчз

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

50

55

60

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

О1у

Азр

Нчз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

Ме+

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

85

90

95

А1а

Азп

11е

Азп

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

100

105

110

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

115

120

125

Нчз

Уа1

О1п

Ьуз

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

130

135

140

Ьеи Ьеи О1и 145 <210> 103

- 169 <211> 147 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> полипептид аспартил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку 6хНФз

<400> 103

МеЕ

О1у

Бег

Бег

МеЕ

11е

О1п

Бег

О1п

О1и

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

1

5

10

15

Уа1

Агд

Уа1

Агд

Азр

Ьеи

ТЪг

11е

О1п

Ьуз

А1а

Азр

О1и

Уа1

Уа1

Тгр

20

25

30

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

НФз

ТЪг

Бег

Агд

А1а

Ьуз

О1у

Ьуз

О1п

Суз

РЪе

35

40

45

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

О1п

О1п

О1п

РЪе

Азп

Уа1

О1п

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

50

55

60

О1у

Азр

НФз

А1а

Бег

Ьуз

О1п

МеЕ

Уа1

Ьуз

РЪе

А1а

А1а

Азп

11е

Азп

65

70

75

80

Ьуз

О1и

Бег

11е

Уа1

Азр

Уа1

О1и

О1у

Уа1

Уа1

Агд

Ьуз

Уа1

Азп

О1п

85

90

95

Ьуз

11е

О1у

Бег

Суз

ТЪг

О1п

О1п

Азр

Уа1

О1и

Ьеи

НФз

Уа1

О1п

Ьуз

100

105

110

11е

Туг

Уа1

11е

Бег

Ьеи

А1а

О1и

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьеи

О1и

О1у

115

120

125

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

НФз

НФз

НФз

130

135

140

НФз

НФз

НФз

145

<210> 104 <211> 777 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы <400> 104 ддаЕсссаад адааассада ЕсдЕдЕдсЕд дЕссдЕдЕЕс дЕдассЕдас саЕссадааа 60 дсддаЕдаад ЕЕдЕЕЕдддЕ ссдЕдсЕсдЕ дЕЕсаЕасаа дссдЕдссаа аддсааасад 120

ЕдсЕЕссЕдд ЕЕсЕдсдЕса асадсадЕЕЕ аасдЕЕсадд сссЕддЕадс сдЕЕддЕдаЕ 180 сасдссЕсаа аасаааЕддЕ даааЕЕсдсс дссаасаЕса асааададад саЕсдЕсдас 240 дЕЕдааддЕд ЕсдЕссдЕаа адЕдааЕсад ааааЕсддсЕ ссЕдЕасаса дсаадаЕдЕд 300 дадсЕдсаЕд ЕссааааааЕ сЕаЕдЕсаЕс ЕсасЕддссд аассЕсдЕсЕ дссЕсЕдсаа 360 сЕддаЕдаЕд сЕдЕасдссс ЕдаадсЕдаа ддсдаадаад ааддЕсдЕдс ЕасддЕЕааЕ 420 саддаЕасЕс дссЕддасаа ссдЕдЕсаЕЕ даЕсЕдсдса ссЕсаассЕс ЕсаадсддЕа 480

ЕЕссдссЕдс ааЕссддсаЕ сЕдЕсассЕд ЕЕссдЕдааа сдсЕдаЕсаа сааадддЕЕЕ 540 дЕддадаЕЕс адассссдаа ааЕсаЕЕадЕ дссдссадсд ааддЕддадс аааЕдЕдЕЕЕ 600 ассдЕдЕссЕ аЕЕЕсааааа сааЕдссЕаЕ сЕддсасадЕ сЕссЕсадсЕ дЕаЕааасаа 660 аЕдЕдЕаЕсЕ дЕдсЕдасЕЕ сдадааадЕд ЕЕсЕсааЕсд ддссддЕаЕЕ ссдЕдсадад 720 даЕадсааса сасассдсса ЕсЕдассдаа ЕЕЕдЕаддсс ЕддасаЕсда асЕсдад 777 <210> 105 <211> 378 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид аспартил-тРНК-синтетазы

- 170 030461 <400> 105 ддаЕссЕсда ЕдаЕссадЕс асаададааа ссадаЕсдЕд ЕдсЕддЕссд ЕдЕЕсдЕдас 60 сЕдассаЕсс адааадсдда ЕдаадЕЕдЕЕ ЕдддЕссдЕд сЕсдЕдЕЕса ЕасаадссдЕ 120 дссаааддса аасадЕдсЕЕ ссЕддЕЕсЕд сдЕсаасадс адЕЕЕаасдЕ ЕсаддсссЕд 180 дЕадссдЕЕд дЕдаЕсасдс сЕсаааасаа аЕддЕдаааЕ Есдссдссаа саЕсаасааа 240 дададсаЕсд ЕсдасдЕЕда аддЕдЕсдЕс сдЕааадЕда аЕсадааааЕ сддсЕссЕдЕ 300 асасадсаад аЕдЕддадсЕ дсаЕдЕссаа ааааЕсЕаЕд ЕсаЕсЕсасЕ ддссдаассЕ 360 сдЕсЕдссЕс ЕдсЕсдад 378

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтическая композиция для лечения воспалительного нарушения. гиперхолестеринемии. гиперлипидемии. диабета 1 и 2 типа. метаболического синдрома или сосудистых заболеваний. содержащая фармацевтически приемлемый носитель и изолированный полипептид аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8). который является по меньшей мере на 90. 95. 98 или 100% идентичным последовательности 8Еф ГО ΝΌ: 16 или 14 или ее фрагменту. который представляет собой 220 или более смежных аминокислот последовательности 8Еф ГО ΝΌ: 16 или 14. причем указанный полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала. выбранную из модуляции захвата ацетилированных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). модуляции высвобождения цитокинов. модуляции клеточной адгезии.
2. 2. Терапевтическая композиция по п.1. где ААК8 полипептид слит с гетерологичным полипептидом. выбранным из группы. состоящей из меток аффинной очистки. эпитопных меток. нацеливающих последовательностей. сигнальных пептидов. последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).
3. 3. Терапевтическая композиция по п.1. где аминокислотная последовательность ААК8 полипептида имеет по меньшей мере 98 или 100% идентичность последовательности 8Еф ГО ΝΌ: 16 или 14.
4. 4. Изолированный полипептид аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8). аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 90. 95. 98 или 100% идентичность последовательности 8Еф ГО ΝΌ: 16 или 14 или ее фрагменту. который представляет собой 220 или более смежных аминокислот последовательности 8Еф ГО ΝΌ: 16 или 14. причем полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала. выбранную из модуляции захвата ацетилированных ЛПНП. модуляции высвобождения цитокинов. модуляции клеточной адгезии.
5. 5. Изолированный ААК8 полипептид по п.4. где ААК8 полипептид слит с гетерологичным полипептидом. выбранным из группы. состоящей из меток аффинной очистки. эпитопных меток. нацеливающих последовательностей. сигнальных пептидов. последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).
6. 6. Изолированный ААК8 полипептид по п.4. где аминокислотная последовательность ААК8 полипептида имеет по меньшей мере 98 или 100% идентичность последовательности 8Еф ГО ΝΌ: 16 или 14.
7. 7. Изолированный ААК8 полипептид по п.4. где к указанному полипептиду ковалентно или нековалентно присоединен по меньшей мере один фрагмент. где по меньшей мере один фрагмент представляет собой детектируемую метку или растворимый в воде полимер и где детектируемую метку выбирают из радиоизотопов. флуорохромов. красителей. ферментов. наночастиц. хемилюминесцентных маркеров.
8. 8. Клеточная культура для рекомбинантной продукции полипептида аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8) по любому одному из пп.4-6. содержащая популяцию клеток. в которой по меньшей мере одна клетка содержит и экспрессирует полинуклеотид. кодирующий указанный полипептид ААК8. и бессывороточную среду. причем указанные клетки способны расти в бессывороточной среде.
9. 9. Вектор экспрессии. содержащий нуклеотидную последовательность. которая кодирует полипептид ААК8 по любому из пп.4-6.
10. 10. Способ идентификации соединения. которое специфично связывается с полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8) по любому из пп.4-6. включающий:

    a) объединение полипептида ААК8 по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях связывания и

    b) детектирование связывания полипептида ААК8 с исследуемым соединением с идентификацией соединения. которое специфично связывается с полипептидом ААК8.
11. 11. Способ лечения воспалительного нарушения. гиперхолестеринемии. гиперлипидемии. диабета 1 и 2 типа. метаболического синдрома или сосудистых заболеваний путем введения полипептида ААК8 по любому из пп.4-6.