EA030418B1 - ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, ПОЛИПЕПТИД АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ (AARS) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к терапевтической композиции для лечения воспалительного заболевания; изолированному полипептиду аминоацил-тРНК-синтетазы (AARS); клеточной композиции для рекомбинантной продукции полипептида аминоацил-тРНК-синтетазы (AARS); вектору экспрессии; способу идентификации соединения, которое специфично связывается с полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы (AARS); способу лечения воспалительного заболевания.

Description

Изобретение относится к терапевтической композиции для лечения воспалительного заболевания; изолированному полипептиду аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8); клеточной композиции для рекомбинантной продукции полипептида аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8); вектору экспрессии; способу идентификации соединения, которое специфично связывается с полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы (ААК8); способу лечения воспалительного заболевания.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Заявка на настоящий патент испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/363581, поданной 12 июля 2010 г.; предварительной заявке на патент США № 61/363585, поданной 12 июля 2010 г.; и предварительной заявке на патент США № 61/363587, поданной 12 июля 2010 г., полное содержание каждой из которых включено в настоящее изобретение посредством ссылки.

Положение относительно перечня последовательностей

Перечень последовательностей, приложенный к настоящему изобретению, представленный в текстовом формате, полностью соответствующем бумажной копии, и, таким образом, включен посредством ссылки. Текстовый файл, содержащий перечень последовательностей, имеет название 120161_450РС_8едиепсе_Ы81т§.1х1. Его размер составляет примерно 150 Кбайт. Указанный файл был создан 8 июля 2011 г. и представлен в электронном виде в системе ΕΡδ-ЛеЬ.

Область техники

Настоящее изобретение в целом относится к композициям, содержащим новые идентифицированные белковые фрагменты аминоацил-тРНК-синтетаз и другие белки, полинуклеотиды, которые их кодируют, и соответствующие комплементарные последовательности и родственные агенты, и к способам их применения в диагностических целях, в целях поиска лекарственных средств, в исследовательских и терапевтических целях.

Уровень техники

Более четырех десятилетий аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ) считаются важными белками домашнего хозяйства (йоикекеерщд), которые катализируют аминоацилирование молекул тРНК в рамках процесса декодирования генетической информации в процессе трансляции белка. ΑΑΚδ интенсивно исследовались в этом аспекте, и многие из их полноразмерных последовательностей клонировали для секвенирования, что обеспечило богатый источник для биохимических экспериментов. Однако некоторые фрагменты ΑΑΚδ, и другие белки, обладают неожиданными видами активности, не связанными с аминоацилированием, включая активность во внеклеточной передаче сигнала, модулирующую сигнальные пути не связанным с трансляцией белка образом. В целом указанные неожиданные виды активности не наблюдаются у полноразмерной или исходной последовательности белка; при этом они наблюдаются после удаления или резекции белковых фрагментов ΑΑΚδ из их исходной последовательности или при экспрессии и достаточной очистке фрагмента последовательности ΑΑΚδ и последующего исследования на предмет новых видов активности, не связанных с синтетазной активностью.

Несмотря на то что полноразмерные последовательности ΑΑΚδ известны в течение достаточного времени, не проводилось системного экспериментального анализа для выяснения таких белковых фрагментов ΑΑΚδ или белковых фрагментов из родственных или связанных белков или для оценки возможной роли полноразмерных белков ΑΑΚδ в новых видах биологической активности, не связанных с синтезом аминокислот. В некоторых частях настоящего изобретения, указанные белковые фрагменты ΑΑΚδ, домены ΆΛΚδ или варианты альтернативного сплайсинга ΆΛΚδ называются резектинами. Термин резектин в широком смысле относится к части белка, которая была вырезана или резектирована (путем протеолиза, альтернативного сплайсинга, мутагенеза или рекомбинантной генной инженерии) из контекста его нативной полноразмерной или исходной последовательности белка, которая, в противном случае, часто маскирует ее новые виды биологической активности. Также не было проведено системного экспериментального анализа для исследования применения указанных резектинов в качестве биотерапевтических агентов, диагностических агентов или мишеней лекарственных средств для лечения различных медицинских состояний или анализа их возможной связи с заболеваниями человека. Так как ΑΑΚδ являются важными генами домашнего хозяйства с известной функцией у млекопитающих, которая является критичной для жизни, они не рассматривались в качестве мишени для лекарственных средств у млекопитающих, и их не исследовали методом стандартного геномного секвенирования, биоинформатического или подобного анализа для идентификации резектинов, имеющих не синтетазную активность. Также стандартные биохимические исследования не были направлены на характеристику биологических свойств резектинов ΑΑΚδ и их возможного терапевтического и диагностического значения, главным образом, из-за ранее показанной роли соответствующих исходных полноразмерных ΑΑΚδ.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана доменная структура гистидиламиноацил-тРНК-синтетазы, с относительными положениями и размерами идентифицированных Ν-концевых полипептидов ΑΑΚδ, показанных схематически. На фиг. 1А представлены фрагменты, идентифицированные с помощью массспектрометрического анализа, на фиг. 1В представлены фрагменты, идентифицированные методом глубокого секвенирования транскриптомов, и на фиг. 1С представлены фрагменты, идентифицированные с помощью биоинформатического анализа.

На фиг. 2 показана доменная структура гистидиламиноацил-тРНК-синтетазы с относительными положениями и размерами идентифицированных С-концевых полипептидов ΑΑΚδ, показанных схематически. На фиг. 2А представлены фрагменты, идентифицированные с помощью глубокого секвенирования транскриптомов, и на фиг. 2В представлены фрагменты, идентифицированные с помощью биоинформатического анализа.

- 1 030418

На фиг. 3 показана доменная структура гистидиламиноацил-тРНК-синтетазы с относительными положениями и размерами внутренних полипептидов ΑΑΚδ, идентифицированных с помощью биоинформатического анализа.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для лечения воспалительного заболевания, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и изолированный полипептид аминоацил-тРНК-синтетазы (ΆΛΚδ), который по меньшей мере на 90, 95, 98 или 100% идентичен последовательности δΕΟ ГО N0: 64 или 83 или ее фрагменту, который представляет собой 100 или более смежных аминокислот последовательности δΕΟ ГО N0: 64 или 83, причем указанный полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала, выбранную из модуляции высвобождения цитокинов, модуляции клеточной адгезии.

Вариантом настоящего изобретения является терапевтическая композиция, где ΑΑΚδ полипептид слит с гетерологичным полипептидом, выбранным из группы, состоящей из меток аффинной очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).

Вариантом настоящего изобретения является терапевтическая композиция, где ΑΑΚδ полипептид по меньшей мере на 98 или 100% идентичен последовательности δΕΟ ГО N0: 64 или 83.

Настоящее изобретение относится к изолированному полипептиду аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), который является по меньшей мере на 90, 95, 98 или 100% идентичной последовательности δΕΟ ГО N0: 64 или 83 или ее фрагменту, который представляет собой 100 или более смежных аминокислот последовательности δΕΟ ГО N0: 64 или 83, причем имеет активность внеклеточной передачи сигнала, выбранную из модуляции высвобождения цитокинов, модуляции клеточной адгезии.

Вариантом настоящего изобретения является изолированный полипептид аминоацил-тРНКсинтетазы (ΑΑΚδ), где ΑΑΚδ полипептид слит с гетерологичным полипептидом, выбранным из группы, состоящей из меток аффинной очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).

Вариантом настоящего изобретения является изолированный полипептид аминоацил-тРНКсинтетазы (ΑΑΚδ), где ΑΑΚδ полипептид по меньшей мере на 98 или 100% идентичен последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 64 или 83.

Вариантом настоящего изобретения является изолированный полипептид аминоацил-тРНКсинтетазы (ΑΑΚδ), где к указанному полипептиду ковалентно или нековалентно присоединен по меньшей мере один фрагмент, или где к указанному полипептиду ковалентно или нековалентно присоединен твердый субстрат, где по меньшей мере один фрагмент представляет собой детектируемую метку или растворимый в воде полимер.

Настоящее изобретение относится к клеточной композиции для рекомбинантной продукции вышеуказанного полипептида аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), содержащая модифицированную популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит и экспрессирует полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид ΑΑΚδ, и бессывороточную среду, причем указанные клетки способны расти в бессывороточной среде.

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему:

(ί) нуклеотидную последовательность, которая кодирует вышеуказанный полипептид ΑΑΚδ.

Настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое специфично связывается с вышеуказанным полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), включающему:

a) объединение полипептида ΑΑΚδ по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях связывания и

b) детектирование связывания полипептида ΑΑΚδ с исследуемым соединением, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с полипептидом ΑΑΚδ.

Настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания путем введения вышеуказанного полипептида ΑΑΚδ.

Вариантом настоящего изобретения является способ лечения воспалительного заболевания, где воспалительным заболеванием является системный ювенильный артрит, системная красная волчанка, болезнь Крона и ревматоидный артрит.

Варианты реализации настоящего изобретения в целом относятся к открытию белковых фрагментов аминоацил-тРНК-синтетаз (ΑΑΚδ), которые обладают неканоническими видами биологической активности, такими как активность во внеклеточной передаче сигнала, и/или другими характеристиками терапевтического и диагностического значения. ΑΑΚδ являются универсальными и важными элементами системы синтеза белка, имеющейся во всех организмах, но ΑΑΚδ человека и связанные с ними белки имеют природные варианты, являющиеся результатом резекции, эффективно участвующие в клеточной передаче сигнала и принимающие участие в нормальном функционировании организма человека. Виды активности указанных белковых фрагментов отличаются от видов активности, связанных с синтезом белка, общеизвестных для ΑΑΚδ, и настоящее изобретение включает открытие и разработку указанных

- 2 030418 резектированных белков как новых биотерапевтических агентов, новых реагентов для поисковых исследований и новых антигенов/мишеней для биологических препаратов направленного действия и диагностических агентов, которые можно применять для потенциального лечения или диагностики большого количества разнообразных заболеваний человека, таких как воспалительные, гематологические, нейродегенеративные, аутоиммунные, гематопоэтические, сердечно-сосудистые и метаболические заболевания или нарушения.

Белковый фрагмент (фрагменты) ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению, таким образом, может назваться резектином или, в альтернативном варианте аппендакрином. Как отмечено выше, термин резектин происходит от процесса вырезания, или резекции, конкретного белкового фрагмент ΑΑΚδ из последовательности соответствующей полноразмерной исходной ΑΑΚδ, в которой, как правило, его неканонические виды активности маскированы. В конкретных примерах с помощью указанного процесса резекции были идентифицированы белковые фрагменты и полинуклеотиды ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению, как природные (например, протеолитические, сплайс-варианты), так и искусственные или предсказанные. Термин аппендакрин происходит от комбинации аппенд (от лат. аррепбег) и разделять или выявлять (от греч. оттек), и также отражает изолирование одного, или более, дополнительных доменов белковых фрагментов ΑΑΚδ из их соответствующей последовательности полноразмерного или исходного белка ΑΑΚδ.

Несмотря на то что ранее было показано, что некоторые фрагменты ΑΑΚδ обладают видами активности, не связанными с синтетазной функцией, экспрессия, изолирование, очистка и характеристика указанных фрагментов для биотерапевтического, научно-исследовательского или диагностического применения были ограничены, и для специалистов в данной области техники не является очевидным, что указанные активности связаны с каждым членом целого семейства ΑΑΚδ или с альтернативными фрагментами. В настоящем изобретении использовали методический подход для обнаружения и проверки белковых фрагментов ΆΛΚδ в 20 митохондриальных и 20 цитозольных ΆΛΚδ (и ассоциированных белках) для биотерапевтического применения, в целях поиска лекарственных средств и диагностического применения. Например, конкретный белковый фрагмент (фрагменты) ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению и полинуклеотиды, которые его кодируют, идентифицированы в биологических образцах с использованием масс-спектрометрии (МС), главным образом для идентификации протеолитических фрагментов, и другие были идентифицированы с помощью методов глубокого секвенирования, главным образом в случае идентификации сплайс-вариантов. Другой белковый фрагмент (фрагменты) ΑΑΚδ идентифицирован с использованием предсказаний с помощью компьютерного моделирования аминокислотных последовательностей, например, с помощью компьютерного сравнения синтетаз человека и низших организмов, наряду с определением основных границ (например, сайтов протеазы); указанный подход использовали для анализа последовательности полноразмерного ΑΑΚδ на основе специфических критериев для изолирования протеолитических фрагментов и функциональных доменов, обладающих неканоническими видами биологической активности.

Новые резектины ΑΑΚδ являются неожиданными, и их дифференциальная экспрессия также является непредвиденной. Специфические резекции, как правило, наблюдаются при различных способах обработки (например, в клетках, культивируемых в среде, содержащей и не содержащей сыворотку), на различных стадиях роста (например, мозг взрослого по сравнению с мозгом эмбриона) и в различных типах тканей (например, поджелудочная железа по сравнению с печенью). Паттерн экспрессии не одинаков для всех аминоацил-тРНК-синтетаз, несмотря на то, что канонические функции для всех аминоацилтРНК-синтетаз необходимы в одинаковых участках в клетке и на относительно пропорциональном уровне. Не следует ожидать повышения уровня активности аминоацил-тРНК-синтетазы без одновременного повышения уровня других видов активности аминоацил-тРНК-синтетазы. Данные масс-спектрометрии и глубокого секвенирования указывают на то, что резектины аминоацил-тРНК-синтетазы имеют различный уровень и встречаются в различных областях и на различных стадиях.

Кроме того, белковые фрагменты ΑΑΚδ могут быть экспрессированы и очищены до степени чистоты, достаточно высокой для распознавания их биологических свойств. Ранее фрагменты часто не соответствовали достаточной степени чистоты, укладки и стабильности для обеспечения возможности соответствующего биологического исследования несинтетазных видов активности. Клеточные анализы, например, используют в комбинации с достаточно чистыми, стабильными, растворимыми и правильно уложенными резектинами для выявления их функций, важных для биотерапевтического, научноисследовательского или диагностического применения.

В частности, варианты реализации настоящего изобретения относятся к белковым фрагментам гистидил-тРНК-синтетазы, родственным агентам и композициям, имеющим биотерапевтическую, научноисследовательскую или диагностическую применимость, и способам их применения. Композиции согласно настоящему изобретению применимы в различных диагностических целях, для разработки (поиска) лекарственных средств и в терапевтических целях, как описано в настоящем изобретении. Предпочтительно белки и фрагменты ΑΑΚδ очищают и хранят в подходящих условиях, если они требуются для указанного применения в биотерапевтических, научно-исследовательских или диагностических целях.

Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированный

- 3 030418 белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере примерно из 100, 90, 80, 70, 60, 50 или 40 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и имеет растворимость, составляющую по меньшей мере примерно 5 мг/мл, причем чистота композиции составляет по меньшей мере примерно 95% по белку, и композиция содержит меньше примерно 10 единиц эндотоксина (ЕЭ) на мг белка. Согласно одному аспекту композиция представляет собой терапевтическую композицию. Согласно конкретному варианту реализации изобретения композиция по существу не содержит сыворотки. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения белковый фрагмент ΑΑΚδ обладает неканонической активностью. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения неканоническая биологическая активность выбрана из модуляции внеклеточной передачи сигнала, модуляции пролиферации клеток, модуляции дифференцировки клеток, модуляции транскрипции генов, модуляции продукции или активности цитокинов, модуляции активности цитокиновых рецепторов и модуляции воспаления. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения ЕС₅₀ белкового фрагмента ΆΛΚδ составляет меньше примерно 1 нМ, примерно 5 нМ, примерно 10 нМ, примерно 50 нМ, примерно 100 нМ или примерно 200 нМ для клеточной неканонической биологической активности.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковый фрагмент ΑΑΚδ слит с гетерологичным полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения слитый белок ΑΑΚδ по существу сохраняет неканоническую активность белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения слитый белок ΑΑΚδ подавляет неканоническую активность белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения гетерологичный полипептид присоединен к Ν-концу белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения гетерологичный полипептид присоединен к С-концу белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно одному аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения гетерологичный полипептид выбран из группы, состоящей из меток очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция содержит белковый фрагмент ΑΑΚδ в концентрации, составляющей по меньшей мере примерно 10 мг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция содержит белковый фрагмент ΑΑΚδ, который является по меньшей мере на 90% монодисперсным. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция содержит меньше примерно 3% высокомолекулярных агрегированных белков. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция характеризуется менее чем 3% агрегацией при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при 4°С. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиция характеризуется менее чем 3% агрегацией при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при комнатной температуре.

Различные анализы для измерения указанных признаков резектинов описаны в настоящем изобретении и могут быть применены для определения аспектов изобретения. Согласно конкретным аспектам изобретения, указанные признаки являются предпочтительными для биотерапевтического применения белковых фрагментов ΑΑΚδ, описанных в настоящем изобретении.

Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который отличается от аминокислотной последовательности, описанной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9 заменой, делецией и/или добавлением примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот, причем измененный белковый фрагмент по существу сохраняет неканоническую активность неизмененного белка или имеет доминантный отрицательный фенотип в отношении неканонической активности, где растворимость указанного белкового фрагмента составляет по меньшей мере примерно 5 мг/мл, и где чистота композиции составляет по меньшей мере примерно 95% (на основе белка) и указанная композиция содержит меньше примерно 10 ЕЭ/мг белка эндотоксина. Согласно конкретному варианту реализации изобретения композиция по существу не содержит сыворотки.

Другие варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированное антитело, которое специфично связывается с изолированным белковым фрагментом аминоацил-тРНКсинтетазы (ΑΑΚδ), описанным в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, где аффинность указанного антитела к указанному белковому фрагменту ΑΑΚδ примерно в 10 раз превышает его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ΑΑΚδ. Один из неожиданных аспектов настоящего изобретения включает конкретные резектины, обладающие новыми поверхностями, доступными для антитела или других нацеленных биологических агентов, тогда как в полноразмерном белке ΑΑΚδ указанные поверхности спрятаны или закрыты другими последовательностями или соседними доменами. Процесс резекции также может приводить к получению большей доступности для воды, благодаря чему проявляются ранее не идентифицированные виды биологической активности. Некоторые варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие изолированное антитело, которое специфично связывается с изолированным белковым фрагментом аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), описанным в табл. 1-3, или 4-6,

- 4 030418 или 7-9, где аффинность антитела к белковому фрагменту ΑΑΚδ составляет по меньшей мере примерно 10 нМ, и аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ΆΛΚδ составляет по меньшей мере примерно 100 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения антитело связывается с эпитопом, расположенным в уникальной границе сплайсинга полипептида ΑΑΚδ, описанной в любой таблице (любых таблицах) из табл. 1-3, 4-6 и 7-9, или с аминокислотной последовательностью С-конца указанного сайта сплайсинга. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело проявляет антагонизм в отношении неканонической активности белкового фрагмента ΑΑΚδ. Указанные антагонисты могут необязательно связываться с соответствующей исходной или полноразмерной ΑΑΚδ.

Другие аспекты относятся к системам биоанализа, содержащим по существу чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и партнер по связыванию, который связывается с указанным белковым фрагментом ΑΑΚδ. Согласно одному аспекту, партнер по связыванию выбран из группы, состоящей из белка-рецептора клеточной поверхности, нуклеиновой кислоты, липидной мембраны, клеточного регуляторного белка, фермента и фактора транскрипции. Необязательно, указанный рецептор может являться частью клетки, предпочтительно клетки, подходящей для выявления биологической активности резектина.

Конкретные варианты реализации изобретения включают клеточные композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и модифицированную популяцию клеток, в которых по меньшей мере одна клетка содержит полинуклеотид, кодирующий указанный белковый фрагмент ΑΑΚδ. Согласно одному аспекту, указанные клетки способны расти в бессывороточной среде.

Также предложены системы выявления, содержащие по существу чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 50 или 100 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, клетку, которая содержит рецептор клеточной поверхности или его внеклеточную часть, которая связывается с белковым фрагментом, и молекулу, размер которой составляет меньше примерно 2000 дальтон, или второй полипептид, который модулирует связывание или взаимодействие между указанным белковым фрагментом ΑΑΚδ и указанным внеклеточным рецептором.

Конкретные варианты реализации включают диагностические системы, содержащие по существу чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и клетку, которая содержит рецептор клеточной поверхности или его внеклеточную часть, которая связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, где указанная система или клетка содержит индикаторную молекулу, которая позволяет детектирование изменения уровня или активности указанного рецептора клеточной поверхности или его внеклеточной части.

Конкретные варианты реализации изобретения включают устройства для выращивания клеток, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, модифицированную популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит полинуклеотид, кодирующий указанный белковый фрагмент ΑΑΚδ, по меньшей мере примерно 10 л бессывороточной среды для культивирования клеток и стерильный контейнер. Согласно конкретному варианту реализации изобретения клетки, используемые в любом из способов или композиций, описанных в настоящем изобретении, способны расти в бессывороточной среде, необязательно в присутствии антибиотика и индуктора.

Некоторые варианты реализации изобретения относятся к антисмысловым агентам или агентам РНК-интерференции (РНКи), содержащим последовательность, нацеленную против уникальной границы сплайсинга сплайс-варианта ΑΑΚδ, представленного в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9.

Также предложены терапевтические композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, где указанный белковый фрагмент специфично связывается с партнером по связыванию и имеет растворимость, составляющую по меньшей мере примерно 5 мг/мл, и при этом чистота указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 95% по белку. Согласно некоторым аспектам, композиция может содержать менее чем 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка.

Также предложены композиции, содержащие изолированный белковый фрагмент аминоацил-тРНКсинтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичным аминокислотной последовательности, приведенной табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, причем растворимость указанного белкового фрагмента составляет по меньшей мере примерно 5 мг/мл, и при этом чистота указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 95% (на основе белка), и указанная композиция содержит менее чем 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка. Согласно любому из указанных вариантов реализации изобретения композиции могут содержать белковый фрагмент ΑΑΚδ,

- 5 030418 который является по меньшей мере примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70%, примерно на 80%, примерно на 90% или примерно на 95% монодисперсным с точки зрения его определенной молекулярной массы. Согласно другому аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения композиции содержат меньше примерно 10% (на основе белка) высокомолекулярных агрегированных белков, или меньше примерно 5% высокомолекулярных агрегированных белков, или меньше примерно 4% высокомолекулярных агрегированных белков, или меньше примерно 3% высокомолекулярных агрегированных белков, или менее чем 2% высокомолекулярных агрегированных белков, или меньше примерно 1% высокомолекулярных агрегированных белков.

Согласно другому аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения композиция демонстрирует менее чем 10% агрегацию при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при 4°С, или демонстрирует менее чем 5% агрегацию при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при 4°С, или характеризуется менее чем 3% агрегацией при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при 4°С, или агрегирует меньше примерно на 2% при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при 4°С, или характеризуется менее чем 1% агрегацией при хранении в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл, в ФСБ в течение одной недели при 4°С.

Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие по существу чистый белковый фрагмент аминоацил-тРНК-синтетазы, состоящий по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9 и по меньшей мере один ковалентно или не ковалентно присоединенный к нему агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный агент представляет собой детектируемую метку. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный фрагмент представляет собой растворимый в воде полимер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный агент представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). Согласно одному аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения указанный фрагмент присоединен к Ν-концу белкового фрагмента. Согласно одному аспекту любого из указанных вариантов реализации изобретения указанный агент присоединен к С-концу белкового фрагмента.

Конкретные варианты реализации включают композиции, содержащие твердый субстрат, присоединенный к изолированному белковому фрагменту аминоацил-тРНК-синтетазы (ЛЛКБ), состоящему по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или его биологически активному фрагменту или варианту, причем растворимость указанного белкового фрагмента составляет по меньшей мере примерно 5 мг/мл, и при этом чистота композиции составляет по меньшей мере примерно 95% по белку.

Также предложены композиции, содержащие связывающий агент, который специфично связывается с изолированным белковым фрагментом аминоацил-тРНК-синтетазы (ЛЛКБ), приведенным в табл. 13, или 4-6, или 7-9, причем аффинность указанного связывающего агента к указанному белковому фрагменту составляет по меньшей мере примерно 1 нМ. Согласно одному аспекту, связывающий агент связывается с эпитопом, расположенным в уникальной границе сплайсинга полипептида ЛЛКБ, приведенной в любой таблице (любых таблицах) из табл. 1-3, 4-6 и 7-9, или с С-концом аминокислотной последовательности указанного сайта сплайсинга. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения связывающий агент проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ЛЛКБ.

Конкретные варианты реализации изобретения включают изолированный полипептид аминоацилтРНК-синтетазы (ЛЛКБ), содержащий аминокислотную последовательность белкового фрагмента ЛЛКБ, описанного в настоящем изобретении, аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом ЛЛКБ, описанным в настоящем изобретении, или его вариант или фрагмент. Конкретные полипептиды ЛЛКБ включают аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичной эталонной последовательности ЛЛКБ, приведенной в табл. 13, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2. Конкретные полипептиды ЛЛКБ по существу состоят из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичной эталонной последовательности ЛЛКБ, приведенной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанный полипептид обладает неканонической биологической активностью. Согласно конкретному варианту реализации изобретения указанная неканоническая биологическая активность выбрана из модуляции клеточной передачи сигнала (например, внеклеточной передачи сигнала), модуляции пролиферации клеток, модуляции миграции клеток, модуляции дифференцировки клеток, модуляции апоптоза или клеточной гибели, модуляции ангиогенеза, модуляции клеточного связывания, модуляции клеточного метаболизма, модуляции клеточного поглощения, модуляции транскрипции генов или секреции, модуляции продукции или активности цитокинов, модуляции активности цитокиновых рецепторов и модуляции воспаления.

Другие аспекты включают антитела и другие связывающие агенты, которые проявляют специфичность связывания в отношении изолированного полипептида ЛЛКБ, описанного в настоящем изобретении, партнера по связыванию полипептида ЛЛКБ, или их комплекса. Согласно некоторым вариантам

- 6 030418 реализации изобретения аффинность антитела или связывающего агента к полипептиду ΑΑΚδ примерно в 10 раз превышает его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ΆΛΚδ. Согласно конкретному варианту реализации изобретения связывающий агент выбран из пептида, пептидомиметика, аднектина, аптамера и низкомолекулярного соединения. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело или связывающий агент проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Согласно другим вариантам реализации изобретения антитело или связывающий агент проявляет агонизм в отношении неканонической активности полипептида ΑΑΚδ.

Конкретные варианты реализации изобретения включают изолированные полинуклеотиды аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), содержащие нуклеотидную последовательность полинуклеотида ΑΑΚδ, описанную в настоящем изобретении, нуклеотидную последовательность, кодирующую белковый фрагмент ΑΑΚδ, описанный в настоящем изобретении, или его вариант, фрагмент или соответствующий комплементарный полинуклеотид. Конкретные полинуклеотиды ΑΑΚδ содержат нуклеотидную последовательность, которая является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичной эталонной последовательности полинуклеотида ΑΑΚδ или соответствующей комплементарной последовательности, приведенной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной для бактериальной экспрессии. Согласно одному аспекту, нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80% идентичной полинуклеотидной последовательности, описанной в табл. Е2.

Конкретные полинуклеотиды ΑΑΚδ состоят по существу из нуклеотидной последовательности, которая является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичной эталонной последовательности полинуклеотида ΑΑΚδ или его комплемента, приведенной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2. Другие полинуклеотиды ΑΑΚδ содержат или по существу состоят из нуклеотидной последовательности, которая специфично гибридизуется с эталонным полинуклеотидом ΑΑΚδ, приведенным в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанный полинуклеотид выбран из праймера, зонда и антисмыслового олигонуклеотида. Согласно конкретному варианту реализации изобретения указанный праймер, зонд или антисмысловой олигонуклеотид нацелен против специфической или уникальной границы сплайсинга и/или последовательности, расположенной в 3'направлении от указанного сайта сплайсинга указанного полинуклеотида ΑΑΚδ.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ в образце, включающие осуществление контакта образца с одним или более связывающими агентами, которые специфично связываются с белковым фрагментом ΑΑΚδ, описанным в настоящем изобретении, детектирование присутствия или отсутствия указанного связывающего агента, что обеспечивает возможность определения или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ. Другие варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ в образце, включающие анализ образца с помощью детектора, способного специфично идентифицировать указанный белковый фрагмент, описанный в настоящем изобретении, обеспечивая, таким образом, определение присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно конкретному варианту реализации изобретения детектор представляет собой масс-спектрометр (МС), проточный цитометр, устройство визуализации белка, тест-системы для твердофазного иммуноферментного анализа (ΕΕΙδΑ) или белковый микрочип. Конкретные варианты реализации изобретения включают сравнение присутствия или уровня белкового фрагмента ΑΑΚδ с контрольным образцом или заранее определенным значением. Конкретные варианты реализации изобретения включают исследование состояния образца для различения его от контроля. Согласно конкретному варианту реализации изобретения образец и контроль включают клетку или ткань, и способ включает осуществление различения клеток или тканей различных видов, клеток различных тканей или органов, клеток на различных стадиях клеточного развития, клеток на различных стадиях дифференцировки клеток, клеток в различных физиологических состояниях или между здоровыми и больными клетками. Например, выбранные резектины могут являться более многочисленными при таких состояниях, как стресс или инсульт.

Конкретные варианты реализации изобретения включают разработку способов и соответствующих композиций для идентификации соединения, которое специфично связывается с полипептидом аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), описанным в настоящем изобретении, или одним, или более, из его клеточных партнеров по связыванию, включающих а) объединение полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию, или обоих по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях и Ь) детектирование связывания полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию, или обоих, с указанным исследуемым соединением, что обеспечивает идентификацию соединения, которое специфично связывается с полипептидом ΑΑΚδ или его клеточным партнером по связыванию, или обоими. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение представляет собой полипептид или пептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, пептидомиметик или низкомолекулярное соединение. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение является агонистом неканонической биологической активности полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию. Согласно другим вариантам реализации изобретения исследуемое соединение проявляет антагонизм в отношении неканонической биологической активности

- 7 030418 полипептида ΑΑΚδ или его клеточного партнера по связыванию. Конкретные варианты реализации изобретения включают соединение, идентифицированное с помощью указанного выше способа, такое как агонист (например, низкомолекулярное соединение, пептид).

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ΆΛΚδ в образце, включающие осуществление контакта образца с одним или более олигонуклеотидами, которые специфично гибридизуются с полинуклеотидом ΑΑΚδ, описанным в настоящем изобретении, детектирование присутствия или отсутствия указанных олигонуклеотидов в образце и что обеспечивает возможность определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ΑΑΚδ. Другие варианты реализации изобретения включают способы определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ΑΑΚδ в образце, включающие осуществление контакта образца по меньшей мере с двумя олигонуклеотидами, которые специфично амплифицируют полинуклеотид ΑΑΚδ, описанный в настоящем изобретении, проведение реакции амплификации, детектирование присутствия или отсутствия амплифицированного продукта, что обеспечивает возможность определения присутствия или уровня полинуклеотидной последовательности сплайс-варианта ΑΑΚδ. Согласно конкретному варианту реализации изобретения олигонуклеотид (олигонуклеотиды) специфично гибридизуется или специфично амплифицирует границу сплайсинга, которая является уникальной для сплайс-варианта ΑΑΚδ. Конкретные варианты реализации изобретения включают сравнение присутствия или уровня белкового фрагмента или сплайс-варианта ΑΑΚδ с контрольным образцом или заранее определенным значением. Конкретные варианты реализации изобретения включают исследование состояния образца для его отличия от контроля. Согласно конкретному варианту реализации изобретения указанный образец и контроль включают клетку или ткань, и указанный способ включает осуществление различения клеток или тканей различных видов, клеток различных тканей или органов, клеток на различных стадиях клеточного развития, клеток на различных стадиях дифференцировки клеток или здоровых и больных клеток.

Некоторые варианты реализации изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотид ΑΑΚδ, описанный в настоящем изобретении, полипептид ΑΑΚδ, описанный в настоящем изобретении, связывающий агент, описанный в настоящем изобретении, или соединение, идентифицированное с помощью указанного выше способа или описанное в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы модуляции клеточной активности клетки, включающие осуществление контакта указанной клетки с полинуклеотидом ΑΑΚδ, описанным в настоящем изобретении, полипептидом ΑΑΚδ, описанным в настоящем изобретении, связывающим агентом, описанным в настоящем изобретении, соединением, полученным согласно указанному выше способу или описанным в настоящем изобретении, или фармацевтической композицией, описанной в настоящем изобретении. Согласно конкретному варианту реализации изобретения клеточная активность выбрана из пролиферации клеток, миграции клеток, дифференцировки клеток, апоптоза или клеточной гибели, клеточной передачи сигнала, ангиогенеза, клеточного связывания, клеточного поглощения, клеточной секреции, метаболизма, продукции или активности цитокинов, активности цитокиновых рецепторов, транскрипции генов и воспаления. Согласно одному аспекту, клетка выбрана из группы, состоящей из преадипоцитов, клеток костного мозга, нейтрофилов, клеток крови, гепатоцитов, астроцитов, мезенхимальных стволовых клеток и клеток скелетной мускулатуры.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения клетка находится в теле субъекта. Конкретные варианты реализации изобретения включают лечение субъекта, где указанный субъект страдает состоянием, связанным с неопластическим заболеванием, заболеванием или состоянием иммунной системы, инфекционным заболеванием, метаболическим заболеванием, воспалительным нарушением, нервным/неврологическим заболеванием, мышечным/сердечно-сосудистым заболеванием, заболеванием, связанным с нарушением кроветворения, заболеванием, связанным с нарушением ангиогенеза, или заболеванием, связанным с нарушением выживаемости клеток.

Также предложены способы получения фармацевтического соединения, включающие: а) проведение скрининга ίη νίίτο одного или более кандидатов соединения в присутствии белкового фрагмента ΑΑΚδ, состоящего по меньшей мере из 60 аминокислот, который содержит аминокислотную последовательность, описанную в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ; Ь) проведение клеточного или биохимического или рецепторного анализа соединения, идентифицированного на этапе а), с идентификацией соединения, которое модулирует один или более видов неканонической активности белкового фрагмента ΑΑΚδ; с) необязательно оценку зависимости активности от структуры (51гис1иге-асй\'йу ΓοΙαίίοηδΗίρ. δΑΚ) соединения, идентифицированного на этапе Ь), с соотнесением его структуры со способностью к модуляции неканонической активности, и, необязательно, дериватизацию соединения с изменением его способности модулировать неканоническую активность; и ά) производство достаточного количества соединения, идентифицированного на этапе Ь) или дериватизация соединения, полученного на этапе с), для применения у людей, таким образом, для изготовления фармацевтического соединения.

Другие варианты реализации изобретения включают способы получения фармацевтического соеди- 8 030418 нения, включающие: а) проведение скрининга ίη νίίτο одного или более кандидатов соединения в присутствии рецептора клеточной поверхности или его внеклеточной части, которая специфично связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, описанным в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с рецептором клеточной поверхности или его внеклеточной частью; Ь) проведение клеточного или биохимического или рецепторного анализа с соединением, идентифицированным на этапе а), с идентификацией соединения, которое модулирует один или более видов неканонической активности белкового фрагмента ΆΛΚδ; с) необязательно оценку зависимости активности от структуры (δΑΚ) соединения, идентифицированного на этапе Ь), с соотнесением его структуры с модуляцией неканонической активности, и, необязательно, дериватизацию соединения с изменением его способности модулировать указанную неканоническую активность; и ά) производство достаточного количества соединения, идентифицированного на этапе Ь) или дериватизированного соединения, полученного на этапе с), для применения у людей, таким образом, для изготовления фармацевтического соединения.

Некоторые варианты реализации изобретения включают клеточную композицию, содержащую модифицированную популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит полинуклеотид, кодирующий гетерологичный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), где указанные клетки способны расти в бессывороточной среде. Согласно одному аспекту, полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ) содержит гетерологичную метку очистки или эпитопную метку, обеспечивающую облегчение очистки белкового фрагмента ΑΑΚδ. Согласно другому аспекту, полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ) содержит гетерологичный сайт протеолиза, обеспечивающий продукцию белкового фрагмента ΑΑΚδ при расщеплении.

Некоторые варианты реализации изобретения включают способ получения полипептида ΑΑΚδ, приведенного в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2, ίη δίίπ в клетке, включающий: ί) экспрессию гетерологичного полноразмерного белка аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ) в клетке, причем указанная клетка содержит протеазу, способную расщеплять указанный гетерологичный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ) с получением полипептида ΑΑΚδ.

Некоторые варианты реализации изобретения включают способ продукции полипептида ΑΑΚδ, приведенного в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, или табл. Е2, включающий осуществление контакта изолированного полноразмерного белка аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ) с протеазой, которая способна расщеплять полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), и продукцию полипептида ΑΑΚδ.

Некоторые варианты реализации изобретения включают модифицированный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), содержащий гетерологичный сайт протеолиза для обеспечения протеолитической генерации белкового фрагмента ΑΑΚδ, приведенного в любой таблице (любых таблицах) из табл. 1-3, 4-6 и 7-9 или табл. Е2.

Некоторые варианты реализации изобретения включают композицию, содержащую изолированный полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы, причем чистота указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 95% (на основе белка), и указанная композиция содержит меньше примерно 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка и по существу не содержит сыворотки. Согласно одному аспекту, полноразмерный белок аминоацил-тРНК-синтетазы присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мг/мл и является по меньшей мере на 90% монодисперсным. Другой вариант реализации изобретения включает способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного нарушенной регуляцией экспрессии, активности или пространственно-временного расположения тРНК-синтетазы, посредством введения белкового фрагмента ΑΑΚδ или нуклеиновой кислоты, кодирующей белковый фрагмент ΑΚΚδ, приведенный в любой таблице (любых таблицах) из табл. 1-3, 4-6 и 7-9 или Е2. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, нейропатии, диабета и воспалительных нарушений.

Подробное описание изобретения

I. Введение.

Настоящее изобретение относится, по меньшей мере, отчасти к поиску новых полипептидов ΑΑΚδ и способов их получения и применения, которые включают трансформацию нативных белков дикого типа в новые формы, которые проявляют значительно отличающиеся характеристики по сравнению с природными генами полноразмерной гистидил-тРНК-синтетазы. Указанные полипептиды ΑΑΚδ были идентифицированы на основе глубокого анализа последовательности и масс-спектрометрического анализа экспрессированной гистидил-тРНК-синтетазы в различных тканях, с последующей системной продукцией и тестированием каждого потенциального полипептида ΑΑΚδ для идентификации белковой последовательности, которая предоставляет стабильные и растворимые белковые домены, проявляющие новые биологические активности и благоприятные терапевтические характеристики для лекарственного средства.

На основе указанного анализа был идентифицирован ряд новых семейств полипептидов ΑΑΚδ, полученных из гистидил-тРНК-синтетазы.

Согласно первому аспекту, указанные производные от гистидил-тРНК-синтетазы полипептиды ΑΑΚδ включают полипептидные последовательности, содержащие приблизительно 1-141, 1-408, 1-113, 1-244+26 аа, 191-333, 405-509, (1-60+175-509), (1-100+211-509), (1-60+101-509), (1-100+175-509), (1- 9 030418

60+399-509), (1-100+399-509) или 369-509 аминокислот гистидил-тРНК-синтетазы. Указанные новые семейства полипептидов ΑΑΚδ представляют собой новые, ранее неизвестные белковые продукты, которые проявляют, среди прочего, ί) новую биологическую активность, ίί) благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка и ίίί) способность экспрессироваться и продуцироваться на высоком уровне в прокариотических системах экспрессии, которые являются по существу отличающимися характеристиками, не обнаруживаемыми в интактных белках дикого типа.

II. Определения.

Если иное не указано, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют такое же значение, как и общепринятое значение для специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем изобретении, могут применяться для практического осуществления или проверки настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. В целях настоящего изобретения, следующие термины определены ниже.

Употребление существительного в единственном числе в настоящем изобретении относится к одному или более чем одному (т.е. по меньшей мере одному) указанному существительному. В качестве примера, элемент означает один элемент или более одного элемента.

Термин примерно подразумевает количество, уровень, значение, число, частоту, процент, расстояние, размер, содержание, массу или длину, которая варьирует не более чем на 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% по сравнению с указанным количеством, уровнем, значением, числом, частотой, процентом, расстоянием, размером, содержанием, массой или длиной.

Термин агонист относится к молекуле, которая усиливает или имитирует активность. Например, неканоническую биологическую активность ΆΛΚδ или другого белка. Агонисты могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводороды, низкомолекулярные соединения или любое другое соединение или композицию, которая модулирует активность ΑΑΚδ либо путем непосредственного взаимодействия с ΑΑΚδ или его партнером по связыванию, либо путем действия на компоненты биологического пути, в котором ΑΑΚδ принимает участие. Включены частичные и полные агонисты.

В настоящем изобретении термин аминокислота означает как природные, так и неприродные аминокислоты, также как и аминокислотные аналоги и миметики. Природные аминокислоты включают 20 (Ь)-аминокислот, которые используются в ходе биосинтеза белка, также как и другие, такие как 4гидроксипролин, гидроксилизин, десмозин, изодесмозин, гомоцистеин, цитруллин и орнитин, например. Неприродные аминокислоты включают, например, (О)-аминокислоты, норлейцин, норвалин, пфторфенилаланин, этионин и т.п., которые известны специалистам в данной области техники. Аминокислотные аналоги включают модифицированные формы природных и неприродных аминокислот. Указанные модификации могут включать, например, замену или замещение химических групп и фрагментов аминокислот или дериватизацию аминокислот. Аминокислотные миметики включают, например, органические структуры, которые обладают функционально сходными свойствами, такие как заряд и расстояние между зарядами эталонной аминокислоты. Например, органическая структура, которая имитирует аргинин (Αγ§ или Κ), имеет положительно заряженный фрагмент, расположенный в таком же молекулярном пространстве и имеющий такую же степень подвижности, как е-амино группа боковой цепи природных Αγ§ аминокислот. Миметики также включают неестественные структуры, созданные для поддержания оптимального расстояния и взаимодействия между зарядами аминокислоты или функциональных групп аминокислоты. Специалисты в данной области техники знают или могут определить, какие структуры составляют функционально эквивалентные аналоги и миметики аминокислот.

Согласно конкретным аспектам изобретения применение неприродных аминокислот может использоваться для модификации (например, повышения) выбранной неканонической активности белкового фрагмента ΑΑΚδ или для изменения ίη νίνο или ίη νίίτο периода полувыведения белка. Неприродные аминокислоты также можно применять для облегчения (селективного) химических модификаций (например, пэгилирования) белка ΑΑΚδ. Например, конкретные неприродные аминокислоты позволяют селективное присоединение полимеров, таких как полиэтиленгликоль, ПЭГ, к данному белку и, таким образом, улучшают их фармакокинетические свойства.

Конкретные примеры аминокислотных аналогов и миметиков могут быть найдены, например, в источниках КоЬсПз апб Уе11ассю, ТЬе Рерббез: Αηαίνδίδ. δνηΐΐιοδίδ. Βίοίοβν. Ебз. Огозз апб МстЬоГсг. νοί. 5, р. 341, Лсабепис Ргезз, 1пс., Νου ΥοτΕ Ν.Υ. (1983), которые полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Другие примеры включают пералкилированные аминокислоты, в частности, перметилированные аминокислоты. См., например, СοтЬ^ηаίο^^а1 СЬет1зЬу, Ебз. ΧνίΕοη анб С/апЫт СЬ. 11, р. 235, ίοΐιη ^беу & δοι^ 1пс., №υ Υοτίτ Ν.Υ. (1997), полностью включенный в настоящее изобретение посредством ссылки. Другие примеры включают аминокислоты, амидная часть которых (и, следовательно, амидный каркас полученного в результате пептида) замещена, например, на сахарное кольцо, стероид, бензодиазепин или карбоцикл. См., например, Вигдег'з Мебюша1 СЬепнзНу аиб Эгид ^^зсονе^у, Еб. МааГтеб Е. \νο1ΓΓ„ СЬ. 15, р. 619-620, ίοΐιη \УПеу & δοι^ 1пс., Νου Υοτίτ Ν.Υ. (1995), которые полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Способы синтеза пептидов, полипептидов, пептидомиметиков и белков хорошо известны в данной области техники (см., например, патент

- 10 030418

США № 5420109; М. Во4ап/кку. Ргтс1р1ек οί РерОйе δνηΐΐιοκίκ (1κΐ ей. & 2й теу. ей.), 8ргтдег-Уег1ад, Νονν Уогк, Ν.Υ. (1984 & 1993), см. Главу 7; 5>1е\уаг1 апй Уоипд, δοϊίά РЬаке Рерййе 8уп1Ье515, (2й ей.), Р1егсе СЬеш1са1 Со., Воск Го гй, 111. (1984), каждый из которых включен в настоящее изобретение посредством ссылки). Соответственно, полипептиды ААВ5 согласно настоящему изобретению могут состоять из природных и неприродных аминокислот, также как и аминокислотных аналогов и миметиков.

Термин антагонист относится к молекуле, которая снижает или ослабляет активность. Например, неканоническую биологическую активность ААВ5 или другого белка. Антагонисты могут включать белки, такие как антитела, нуклеиновые кислоты, углеводороды, низкомолекулярные соединения или любое другое соединение или композицию, которая модулирует активность ААВ5 или его партнера по связыванию, либо путем непосредственного взаимодействия ААВ5 или его партнера по связыванию, либо путем действия на компоненты биологического пути, в котором ААВ§ принимает участие. Включены частичные и полные антагонисты.

Термин аминоацил-тРНК-синтетаза (ААВ§) в целом относится к ферментам, которые в своей природной форме или форме дикого типа способны катализировать сложную этерификацию конкретной аминокислоты или ее предшественника с одной из всех совместимых с ней узнаваемых молекул тРНК с образованием аминоацил-тРНК. В соответствии с указанной традиционной активностью, аминоацилтРНК-синтетаза катализируют двухэтапную реакцию: во-первых, они активируют соответсвующие аминокислоты путем образования аминоациладенилата, в котором карбоксил аминокислоты связывается с альфа-фосфатом АТФ путем замещения пирофосфата, и затем, когда связывается правильная тРНК, аминоацильная группа аминоациладенилата превращается в 2'- или З'-концевой ОН тРНК.

Аминоацил-тРНК-синтетазы I класса, как правило, содержат два мотива с высоко консервативными последовательностями. Указанные ферменты аминоацилируют аденозиновый нуклеотид в положении 2'ОН и обычно являются мономерными или димерными. Аминоацил-тРНК-синтетазы II класса, как правило, содержат три мотива с высоко консервативными последовательностями. Указанные ферменты аминоацилируют тот же аденозин в положении З'-ОН и обычно являются димерными или тетрамерными. Активные сайты ферментов II класса в основном состоят из β-листа, состоящего из семи антипараллельных цепей, фланкируемого α-спиралями. Несмотря на то что фенилаланин-тРНК-синтетаза относится ко II классу, она производит аминоацилирование в положении 2'-ОН.

Полипептиды ААВ§ включают источники митохондриальных и цитоплазматических форм тирозил-тРНК-синтетаз (ТутВ§), триптофанил-тРНК-синтетаз (ТтрВ§), а глутаминил-тРНК-синтетаз (О1пВ§), глицил-тРНК-синтетаз (О1уВ§), гистидил-тРНК-синтетаз (ΗίδΚδ), серил-тРНК-синтетаз (8етВ§), фенилаланил-тРНК-синтетаз (РйеВ§), аланил-тРНК-синтетаз (А1аВ8), аспарагинил-тРНК-синтетаз (АкпКБ), гистидил-тРНК-синтетаз (АкрКБ), цистеинил-тРНК-синтетаз (СукКБ), глутамил-тРНК-синтетаз (О1иВ8), пролил-тРНК-синтетаз (РтоВ§), аргинил-тРНК-синтетаз (Ат§В§), изолейцил-тРНК-синтетаз (ПеВ§), лейцил-тРНК-синтетаз (ЬеиК8), лизил-тРНК-синтетаз (Ьу8В§), треонил-тРНК-синтетаз (ТЬтВ§), метионилтРНК-синтетаз (Ме1В8) или валил-тРНК-синтетаз (Уа1В8). Последовательности дикого типа или исходные последовательности указанных полипептидов ААВ§ известны в данной области техники.

Кодирующая последовательность означает любую последовательность нуклеиновых кислот, которая участвует в кодировании полипептидного продукта гена. Термин некодирующая последовательность, наоборот, относится к любой последовательности нуклеиновых кислот, которая не участвует в кодировании полипептидного продукта гена.

В тексте настоящего изобретения, если иное не вытекает из контекста, следует понимать, что слова включает, содержит и содержащий подразумевают включение приведенного этапа или элемента, или группы этапов или элементов, но не исключение любых других этапов или элементов, или групп этапов или элементов.

Состоящий из означает включение и ограничение теми элементами, которые следуют за фразой состоящий из. Таким образом, фраза состоящий из указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или являются обязательными, и что другие элементы не могут присутствовать. Состоящий по существу из означает включение любых элементов, перечисленных после указанной фразы, и ограничение другими элементами, которые не препятствуют или не вносят вклад в активность или действие, заявленное в настоящем изобретении для перечисленных элементов. Таким образом, фраза по существу состоящий из указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или являются обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать в зависимости от того, влияют ли они значительно на активность или действие перечисленных элементов.

Фраза свободный от эндотоксина или по существу не содержащий эндотоксина в целом относится к композициям, растворителям и/или емкостям, которые содержат не более чем следовые количества (например, количества, не оказывающие клинических нежелательных физиологических эффектов у субъекта) эндотоксина и предпочтительно не поддающиеся выявлению количества эндотоксина. Эндотоксины представляют собой токсины, связанные с конкретными бактериями, как правило, грамотрицательными бактериями, несмотря на то, что эндотоксины могут быть найдены в грамположительных бактериях, таких как Ш1епа топосу!одепе§. Наиболее распространенные эндотоксины представляют собой

- 11 030418 липополисахариды (ЬР8) или липоолигосахариды (ЬО8), обнаруживаемые в наружной мембране различных грамотрицательных бактерий, и являющиеся основным патогенным элементом, придающим способность указанным бактериям вызывать заболевание. Малые количества эндотоксина у людей могут вызывать лихорадку, снижение кровяного давления и активацию воспаления и коагуляцию, среди прочих нежелательных физиологических эффектов.

Таким образом, при фармацевтическом получении полипептидов ΆΆΚ8 часто является желательным удалять большую часть или все следы эндотоксина из лекарственных продуктов и/или лекарственных контейнеров, так как даже малые количества могут вызывать нежелательные эффекты у людей. Для указанной цели может использоваться печь для удаления пирогенов, так как для разрушения большинства эндотоксинов, как правило, требуются температуры выше 300°С. Например, в случае материалов первичной упаковки, такой как шприцы или ампулы, комбинация температуры стекла 250°С и время выдержки 30 мин часто является достаточной для достижения снижения уровня эндотоксина на 3 1од. Предусмотрены и другие способы удаления эндотоксинов, включая, например, способы хроматографии и фильтрации, описанные в настоящем изобретении и известные в данной области техники. Также включены способы производства полипептидов ΆΆΚ8 в и изолирование их из указанных эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих, со сниженным, если не устраненным, риском присутствия эндотоксинов в композиции согласно изобретению. Предпочтительными являются способы производства полипептидов ΆΆΚ8 в свободных от сыворотки клетках и изолирования их из указанных свободных от сыворотки клеток. Указанные композиции, содержащие полипептиды ΆΆΚ8, представляют собой новые лекарственные формы, которые проявляют новые биологические и терапевтические характеристики, не наблюдаемые у композиций на основе полипептида ΆΆΚ8, загрязненных сывороткой или эндотоксином, который имеет потенциальную способность связываться с полипептидами ΆΆΚ8 и изменять их новые биологические свойства.

Эндотоксины могут быть детектированы с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Например, анализ лизата амебоцитов мечехвоста Ыти1и8 ро1уркети8, в котором используется кровь указанного мечехвоста, представляет собой очень чувствительный анализ для выявления присутствия эндотоксина, и реагенты, наборы и приборы для выявления эндотоксина на основе указанного анализа являются коммерчески доступными, например, в компании Ьоп/а Огоир. В указанном анализе очень низкий уровень ЬР8 может вызывать поддающуюся выявлению коагуляцию лизата Ь1ти1и8 из-за интенсивного ферментативного каскада, амплифицирующего указанную реакцию. Эндотоксины также можно количественно оценивать с помощью иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Уровень эндотоксина по существу в свободной от эндотоксина композиции может быть меньше примерно 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ЕЭ эндотоксина/мг белка. Как правило, 1 нг липополисахарида (ЬР8) соответствует примерно 1-10 ЕЭ (единицам эндотоксина).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения чистота любого конкретного агента (например, белкового фрагмента ААК8) в композиции может быть специально определена. Например, конкретные композиции могут содержать агент, который является по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% чистым, включая все десятичные дроби между ними, по результатам измерения с помощью методов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД), хорошо известную форму колоночной хроматографии, часто используемую в биохимии и аналитической химии для разделения, идентификации и количественной оценки соединений.

В настоящем изобретении термины функция и функциональный и т.п. относятся к биологической, ферментативной или терапевтической функции.

Ген означает единицу наследования, которая может занимать специфический локус хромосомы и содержит транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности и/или кодирующую область и/или нетранслируемые последовательности (т.е. интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности).

Гомология относится к процентному числу аминокислот, которые являются идентичными или составляют консервативные замены. Гомологию можно определить с использованием программ для сравнения последовательностей, таких как ОАР (Эеуегаих е1 а1., 1984, Ыис1ею Ашбк Кекеагск 12, 387-395), которые включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Таким образом, последовательности одинаковой или по существу разной длины с последовательностями, приведенными в настоящем изобретении, можно сравнивать путем внесения пропусков в выравнивание, где указанные пропуски определяются, например, с помощью алгоритма сравнения, используемого программой ОАР.

Термин клетка-хозяин включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть реципиентом любого рекомбинантного вектора (векторов), изолированного полинуклеотида или полипептида согласно изобретению. Клетки-хозяева включают потомство одной хозяйской клетки и указанное потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по общей комплементарности ДНК) оригинальной исходной клетке из-за природной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения. Клетка хозяина включает клетки, трансфицированные или инфицированные ίη

- 12 030418 νΐνο или ίη νίΐΓο рекомбинантным вектором или полинуклеотидом согласно изобретению. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор согласно изобретению, представляет собой рекомбинантную клетку хозяина.

Термин изолированный обозначает материал, который по существу или не по существу свободен от компонентов, которые в норме окружают его в его нативном состоянии. Например, изолированный полинуклеотид в настоящем изобретении включает полинуклеотид, который был очищен из последовательности, фланкирующей его в его природном состоянии, например, фрагмент ДНК, который был выделен из последовательностей, которые в норме находятся рядом с фрагментом. В альтернативном варианте изолированный пептид или изолированный полипептид и т.п., в настоящем изобретении включает ίη νίΐτο изолирование и/или очистку молекулы пептида или полипептида из ее природного клеточного окружения и от ее связи с другими компонентами клетки; т.е. указанная молекула является значительно не связанной с веществами ш νΐνο.

Термин мРНК или иногда употребляемый термин мРНК-транскрипт в настоящем изобретении включает, но не ограничивается перечисленными: пре-мРНК-транскрипт (транскрипты), промежуточные продукты процессинга транскрипта, зрелую (зрелые) мРНК, готовую к трансляции и транскрипции гена или генов, или нуклеиновые кислоты, которые являются производными транскрипта (транскриптов) мРНК. Процессинг транскриптов может включать сплайсинг, редактирование и разрушение. В настоящем изобретении нуклеиновая кислота, произошедшая из мРНК-транскрипта, относится к нуклеиновой кислоте, для синтеза которой мРНК-транскрипт или его субпоследовательность в конечном итоге служит в качестве матрицы. кДНК обратно транскрибированная из мРНК, РНК, транскрибированная из указанной кДНК, ДНК, амплифицированная из кДНК, РНК, транскрибированная из амплифицированной ДНК, и т.д., являются произошедшими из мРНК-транскрипта, и детектирование таких производных продуктов указывает на присутствие и/или избыток исходного транскрипта в образце. Таким образом, полученные из мРНК образцы включают, но не ограничиваются перечисленными: мРНК-транскрипты гена или генов, кДНК, обратно транскрибированную из мРНК, кРНК, транскрибированную из кДНК, ДНК, амплифицированную из генов, РНК, транскрибированную из амплифицированной ДНК и т. п.

Неканонические виды активности в настоящем изобретении в целом относятся либо ί) к новым видам активности, которыми обладает полипептид ΆΛΚδ согласно изобретению, которыми не обладает в какой-либо значительной степени интактный нативный полноразмерный исходный белок, либо ίί) виды активности, которыми обладал интактный нативный полноразмерный исходный белок, причем полипептид ААК.8 либо проявляет значительно более высокую (т.е. по меньшей мере на 20% превышающую) специфическую активность по сравнению с интактным нативным полноразмерным исходным белком, либо проявляет активность в новом контексте; например, в результате выделения указанной активности из других видов активности, которыми обладает интактный нативный полноразмерный исходный белок. В случае полипептидов ААК§ неограничивающие примеры неканонических видов активности включают внеклеточный сигналинг, связывание с РНК, связывание с аминокислотами, модуляцию пролиферации клеток, модуляцию миграции клеток, модуляцию дифференцировки клеток (например, гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза), модуляцию транскрипции генов, модуляцию апоптоза или других форм клеточной гибели, модуляцию клеточной передачи сигнала, модуляцию клеточного поглощения или секреции, модуляцию ангиогенеза, модуляцию клеточного связывания, модуляцию клеточного метаболизма, модуляцию продукции или активности цитокинов, модуляцию активности цитокиновых рецепторов, модуляцию воспаления и т. п.

Термин полумаксимальная эффективная концентрация или ЕС₅₀ относится к концентрации белкового фрагмента ААК.8, антитела или другого агента, описанного в настоящем изобретении, при которой вызываемый им эффект находится посередине между исходным и максимальным эффектом после некоторого определенного времени воздействия; ЕС₅₀ для кривой зависимости эффекта от определенной дозы, таким образом, обозначает концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения ЕС₅₀ агента, предложенного в настоящем изобретении, указывается в отношении неканонической активности, как отмечено выше. ЕС₅₀ также обозначает плазматическую концентрацию, необходимую для достижения 50% максимального эффекта ίη νΐνο. Подобным образом, ЕС₉₀ относится к концентрации агента или композиции, при которой наблюдается 90% ее максимального эффекта. ЕС₉₀ можно рассчитать из ЕС₅₀ и наклона кривой зависимости или можно определить непосредственно из данных с использованием стандартных навыков в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения значение ЕС₅₀ белкового фрагмента ААК.8, антитела или другого агента составляет меньше примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нМ. Предпочтительно, значение ЕС₅₀ биотерапевтической композиции составляет примерно 1 нМ или менее.

Термин модуляция включает повышение или стимулирование, а также снижение или уменьшение, как правило, на статистически значимом или физиологически значимом уровне, по сравнению с контролем. Соответственно, модулятор может представлять собой агонист, антагонист или любую их смесь в зависимости от используемых условий. Повышенное или увеличенное количество,

- 13 030418 как правило, является статистически значимым количеством и может включать повышение в 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, в 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные дроби между ними, превышающие 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, и т.д.) количества, продуцируемого в отсутствие композиции (в отсутствие агента или соединения), или контрольной композиции. Сниженное или уменьшенное количество, как правило, представляет собой статистически значимое количество и может включать снижение на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% количества, продуцируемого в отсутствие композиции (в отсутствие агента или соединения) или в присутствии контрольной композиции, включая все целые числа между ними. В качестве одного неограничивающего примера, контроль для сравнения традиционных и неканонических видов активности может включать сравнение интересующего белкового фрагмента ΑΑΚδ с его соответствующим полноразмерным белком ΑΑΚδ, или фрагмента ΑΑΚδ, обладающего сравнимыми традиционными видами активности, с его соответствующим полноразмерным ΑΑΚδ. Другие примеры статистически значимых количеств описаны в настоящем изобретении.

Полученный из (производный) означает, что образец, такой как, например, полинуклеотидный экстракт или полипептидный экстракт, был выделен или получен из конкретного источника субъекта. Например, экстракт может быть получен из ткани или биологической жидкости, непосредственно изолированной из субъекта. Производный или полученный из также может относиться к источнику полипептидной или полинуклеотидной последовательности. Например, последовательность ΆΛΚδ согласно настоящему изобретению может происходить из информации последовательности протеолитического фрагмента ΑΑΚδ или сплайс-варианта ΑΑΚδ, или его части, полученной естественным или искусственным путем и, таким образом, может содержать, по существу состоять из или состоять из указанной последовательности.

Термины полипептид и белок являются взаимозаменяемыми в настоящем изобретении и относятся к полимеру аминокислотных остатков и к их вариантам и синтетическим и природным аналогам. Таким образом, указанные термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются синтетическими неприродными аминокислотами, такими как химический аналог соответствующей природной аминокислоты, также как и природным аминокислотным полимерам и их природным химическим производным. Указанные производные включают, например, продукты пост-трансляционной модификации и разрушения, включая пироглутамил, изо-гистидил, протеолитические, фосфорилированные, гликозилированные, окисленные, изомеризованные и дезаминированные варианты эталонного фрагмента ΑΑΚδ.

Фразы идентичная по последовательности или, например, содержащий последовательность, на 50% идентичную в настоящем изобретении относятся к тому, насколько последовательности являются идентичными на основе нуклеотидов или аминокислот в области окна сравнения. Таким образом, процентная идентичность по последовательности может быть рассчитана путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, Α, Т, С, С, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Αία, Рго, δοΓ. ТЬт, С1у, Уа1, Ьеи, 11е, РНс. Туг, Тгр, Ьу8, Лгд. Ηίδ, Αδρ. С1и, Αδη, С1п, Су8 и Ме1) встречается в обеих последовательностях, для получения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 для получения процентной идентичности по последовательности.

Термины, используемые для описания отношений между двумя или более последовательностями полинуклеотидов или полипептидов, включают эталонную последовательность, окно сравнения, идентичность по последовательности, процентную идентичность по последовательности и фактическую идентичность. Эталонная последовательность составляет по меньшей мере 12, но часто от 15 до 18 и часто по меньшей мере 25 мономерных единиц, включая нуклеотиды и аминокислотные остатки, в длину. Так как каждый из двух полинуклеотидов может содержать (1) последовательность (т.е. только часть полной полинуклеотидной последовательности), которая является одинаковой между двумя полинуклеотидами и (2) последовательность, которая различается между двумя полинуклеотидами, сравнения по последовательности между двумя (или более) полинуклеотидами, как правило, проводится путем сравнения по последовательности двух полинуклеотидов в пределах окна сравнения для идентификации и сравнения ограниченных участков подобия по последовательности. Окно сравнения относится к смысловому сегменту, состоящему по меньшей мере из 6 заменимых положений, обычно примерно от 50 до примерно 100, чаще от примерно 100 до примерно 150, в которых данная последовательность сравнивается с эталонной последовательностью, содержащей такое же количество заменимых положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Окно сравнения может включать добавления или делеции (т.е. пропуски), составляющие примерно 20% или менее, по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательности для выравнивания окна сравнения можно проводить путем компьютерного применения алгоритмов ^ΑΡ, ΒΕδТΡIТ, ΡΑδТΑ и ТΡΑδТΑ в программе Αίδοοηδίη Сепейс8 δοΠ\ν;·ιΐΌ Раскаде Ке1еа8е 7.0, Сепейс8 СотрШег Сгоир, 575 δ<^η<^ Опте Маб18оп, Висконсин, США) или путем проверки и оптимального выравнивания (т.е. полученного при

- 14 030418 максимальной процентной гомологии в пределах окна сравнения), осуществленного с помощью любого из различных выбранных способов. Также следует отметить семейство программ ВЬА8Т, например, описанных Альтшулем (А11кс1ш1 е! а1., 1997, Νιιοί. Аабк Кек. 25:3389). Подробное обсуждение анализа последовательности можно найти в источнике υηίΐ 19,3 οί АикиЬе1 е! а1., СнггеШ Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп \Убеу & 8опк 1пс, 1994-1998, глава 15.

Расчет подобия последовательности или идентичности последовательности между последовательностями (термины являются взаимозаменяемыми в настоящем изобретении) проводили, как описано далее. Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивали для оптимального сравнения (например, пропуски (дарк) могут вводиться в одну, или в обе, из первой и второй последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания и не гомологичные последовательности могут быть исключены из сравнения). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения длина эталонной последовательности, которую выравнивают в целях сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50, 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными по этому положению.

Процентная идентичность между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, одинаковых в последовательностях, с учетом числа пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей.

Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием математического алгоритма. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями определяли с использованием алгоритма Нидлмана и Вунша (№еб1етап апб ХУипкск 1970, 1. Мо1. Вю1. 48: 444-453), который был включен в программу САР пакета программного обеспечения ССС (доступного по электронному адресу Ьбр://№№№.дсд.сот), с использованием либо матрицы В1оккит 62, либо матрицы РАМ250 и цены пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и цены длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Согласно другому предпочтительному варианту реализации изобретения процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяли с использованием программы САР пакета программного обеспечения ССС (доступного по ссылке Ьбр://№№№.дсд.сот), с использованием матрицы N^§дар-ДНК.СМР и цены пропуска 40, 50, 60, 70 или 80 и цены длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особо предпочтительный набор параметров (и тот, который следует использовать, если иное не указано) представляет собой матрицу счета В1оккит 62 (штраф за пропуск 12, штраф за продолжение пропуска 4, и штраф за пропуск сдвига рамки считывания 5).

Процентную идентичность между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями можно определить с использованием алгоритма Мейерса и Миллера (Е. Меуегк апб МШег, 1989, СаЬюк, 4: 11-17), который был включен в программу Α^IСN (версия 2,0), с использованием таблицы цены остатков РАМ120, штрафа за длину пропуска, равного 12, и штрафа за пропуск, равного 4.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков, описанные в настоящем изобретении, можно применять как искомые последовательности для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Указанные поиски можно проводить с использованием программ NВ^Α§Т и ХВЬА8Т (версия 2,0) согласно Альтшулю (А11ксйи1, е! а1., 1990, 1. Мо1. Вю1, 215: 403-10). Поиски нуклеотида в базе ВЬА8Т можно осуществить с помощью программы NВ^Α§Т (очки = 100, длина слова = 12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Поиски белка в базе ВЬА8Т можно осуществлять с помощью программы ХВЬА8Т (очки = 50, длина слова = 3) для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка согласно изобретению. Для получения выравнивания с пропусками (дарк) для сравнения можно использовать программу Сарреб ВЬА8Т, как описано в источнике А11кс1ш1 е! а1., 1997, №с1ею Аабк Кек, 25: 3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т можно применять параметры, установленные по умолчанию для соответствующих программ (например, ХВЬА8Т и NВ^Α§Т).

Термин растворимость относится к способности агента, предложенного в настоящем изобретении, растворяться в жидком растворителе и образовывать гомогенный раствор. Растворимость, как правило, выражается как концентрация на основе массы растворенного вещества на единицу объема растворителя (г растворенного вещества на кг растворителя, г на дл (100 мл), мг/мл и т.д.), молярности, моляльности, мольной доли или других подобных единиц концентрации. Максимальное равновесное количество растворенного вещества, которое может раствориться, на количество растворителя, представляет собой растворимость указанного растворенного вещества в указанном растворителе при конкретных условиях, включая температуру, давление, рН и природу растворителя. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения растворимость измеряют при физиологическом рН. Согласно конкретным вари- 15 030418 антам реализации изобретения измеряют растворимость в воде или физиологическом буфере, таком как ФСБ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения измеряют растворимость в биологической жидкости (растворителе), таком как кровь или сыворотка. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения температура может быть примерно равна комнатной температуре (например, примерно 20, 21, 22, 23, 24, 25°С) или примерно равна температуре тела (37°С). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения агент, такой как белковый фрагмент ΑΑΚδ, имеет растворимость по меньшей мере примерно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 25 или 30 мг/мл при комнатной температуре или при 37°С.

Граница сплайсинга в настоящем изобретении включает область зрелого мРНК-транскрипта или кодируемого полипептида, в котором 3'-конец первого экзона соединяется с 5'-концом второго экзона. Размер участка может варьировать и может включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более (включая все целые числа между ними), нуклеотидных или аминокислотных остатков с любой стороны конкретных остатков, где 3'конец одного экзона соединяется с 5'-концом другого экзона. Термин экзон относится к последовательности нуклеиновых кислот, которая представлена в зрелой форме молекулы РНК после того, как какие-либо части предшественника РНК (интроны) были удалены путем цис-сплайсинга, или две или более молекулы предшественников РНК были лигированы путем транс-сплайсинга. Зрелая молекула РНК может представлять собой матричную РНК или функциональную форму некодирующей РНК, такую как рРНК или тРНК. В зависимости от контекста, экзон может относиться к последовательности в ДНК или ее РНК-транскрипте. Термин интрон относится к некодирующему участку нуклеиновой кислоты в гене, который не транслируется в белок. Некодирующие интронные участки транскрибируются с получением предшественника мРНК (пре-мРНК) и некоторых других РНК (таких как длинные некодирующие РНК) и затем удаляются путем сплайсинга во время процессинга с образованием зрелой РНК.

Термин сплайс-вариант относится к зрелой мРНК и кодируемому ею белку, который продуцируется путем альтернативного сплайсинга, процесса, в результате которого экзоны РНК (первичного транскрипта гена или пре-мРНК) заново соединяются несколькими путями во время сплайсинга РНК. Полученные в результате разные мРНК могут транслироваться в различные изоформы белка, позволяя одному гену кодировать несколько белков.

Термин субъект в настоящем изобретении включает любое животное, которое проявляет симптом или находится в группе риска проявления указанного симптома, который можно лечить или диагностировать с помощью полинуклеотида полипептида ΆΛΚδ или согласно изобретению. Также включены субъекты, для которых является желательным анализ уровня полипептидов и/или полинуклеотидов ΑΑΚδ согласно изобретению, в диагностических или других целях. Подходящие субъекты (пациенты) включают лабораторных животных (таких как мышь, крыса, кролик или морская свинка), сельскохозяйственных животных и домашних животных или питомцев (таких как кошка или собака). Включены приматы, отличные от человека, и, предпочтительно, пациенты, представляющие собой человека.

Лечение или осуществление лечения в настоящем изобретении включает любой желательный эффект на симптомы или патологию заболевания или состояния, на которые могут влиять неканонические виды активности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ, описанного в настоящем изобретении, и может включать даже минимальные изменения или улучшения одного или более измеряемых маркеров заболевания или состояния, подвергаемого лечению. Также включено лечение, которое относится к терапии без использования ΑΑΚδ, в котором последовательность ΑΑΚδ, описанная в настоящем изобретении, обеспечивает клинический маркер лечения. Лечение или проведение лечения не обязательно означает полное устранение или вылечивание заболевания или состояния или связанных с ними симптомов. Субъект, получающий указанное лечение, представляет собой любого субъекта, нуждающегося в указанном лечении. Примеры маркеров клинического улучшения очевидны специалистам в данной области техники.

Для практического осуществления настоящего изобретения, если иное специально не указано, используют стандартные методы молекулярной биологии и рекомбинантной ДНК в пределах данной области техники, многие из которых описаны ниже в качестве иллюстрации. Указанные методы подробно описаны в литературе. См., например,

- 16 030418

ЗатЬгоок, ек а!., Мо1еси1аг С1оп!пд:

А ЬаЬогаЁогу Мапиа1 (3^Γά Εάίίίοη, 2000); ΌΝΑ С1оп!пд: А РгасИса! Арргоаск, νοί. I & II (ϋ. 61ονβΓ, θά.);

ОИдопис1еоИРе ЗупЁкезпз (Ν. 6а1к, θά., 1984); ОИдопис1еоИРе Зуп!кез!з: МеЁкоРз апс1 АррИсаНопз (Ρ. ΗθτάθΜί^η, θά., 2004);

Νιιοίθίο Ас!Р НуРг!Р!га!!оп (В. Натез & 3. Н1дд1пз, θάε. , 1985);

Νιιοίθίο Αοίά. НуРг!Р!га!!оп: МоРегп АррИсаНопз (Βυιζάίη θηά Ρυ^γθηον, θάε. , 2009); ТгапзсгпрИоп апр Тгапз1а1:!оп (В. Натез & 3. Н1дд1пз, θά3., 1984); Аппта1 Се11 СиНиге (К. ЕгезЬпеу, θά., 1986); ЕгезЬпеу, Η.Ι. (2005) СиНиге ок Ап1та1 Се11з, а Мапиа! ок Вазас Тескпадие, 5^ΐΗ Εά. НоЬокеп Νά, ЬоЬп ИПеу &

Зопз; В. РегЬа1, А Ргас!аса1 СиаРе ίο Мо1еси1аг С1опапд (З^гс1 ΕάίΕίοη 2010); Еагге11, К., ΚΝΑ Ме!коРо1одаез: А РаЬогаЁогу йлке Рог 1зо1а!аоп апр Скагас!егага!аоп (З^гс1 ΕάίΕίοη 2005),

МеЁкоРз оР Епгуто1оду: ΌΝΑ 3!гис!иге Раг! А: ЗупДаезаз агар Ркузаса1 Апа1узаз оР ΌΝΑ ΜθΕΗοά3 ίη Епгуто1оду, Αθθάθΐηίθ Ргезз; изапд АпИЪоРаез: А РаЬогаЁогу Мапиа!: РогЁаЫе РгсПосо1 № I Ьу ΕάΜθτά Наг1ом, ϋθνίά Ьапе, Εά Наг1ом (1999, <3ο1ά Зрг1пд НагЬог ЬаЬогакогу Ргезз, Ι3ΒΝ 0-87 969-544-7) ; АпИРоРаез: А РаРогаЁогу Мапиа1 Ьу Εά Наг1ом (ΕάίΕοΓ) , ϋθνίά Ьапе (ΕάίΕοΓ) (1988, Οοΐά Зрг1пд НагЬог ЬаЬогакогу Ргезз, Ι3ΒΝ 0-87969-3, 4-2), 1855.

НапсИзоок оР Ргид Зсгеепапд, θάίΕθά Ьу Ватакг1зЬпа ЗеекЬа1а,

ΡηηάΗηνθΕΗί В. ЕегпапЬез (2001, Νθμ Уогк, Ν.Υ., Магсе1 Оеккег,

Ι3ΒΝ 0-8247-0562-9) ; и ЬаЬ КеР: А НапРЪоок оР Кесарез,

Кеадеп!з, апр СПкег КеРегепсе Тоо1з Рог изе ак кЬе Вепск,

ЕЬ1кеЬ Ьапе Нозкатз апЬ ЫпЬа НоЬдегз, (2002, <3ο1ά Зрг1пд НагЬог ЬаЬогакогу, Ι3ΒΝ 0-87969-630-3) .

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем изобретении, таким образом, полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки.

III. Очищенные белковые фрагменты ΑΑΚδ и варианты для терапевтического и других применений.

Неожиданным образом было обнаружено, что фрагменты ΑΑΚδ, в отличие от их исходных полноразмерных последовательностей, для которых известны только виды активности, связанные с аминоацилированием, обладают биологическими видами активности, важными для применения в биотерапевтических, исследовательских и диагностических целях. Варианты реализации настоящего изобретения, таким образом, включают полноразмерные белки, зрелые изоформы белков и белковые фрагменты аминоацилтРНК-синтетаз (ΑΑΚδ), а также их биологически активные варианты и их фрагменты. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанные белки и фрагменты могут образовываться в результате эндогенного протеолиза, ίη νίΐΓΟ протеолиза, сплайсинга или предсказания с помощью компьютерного моделирования, и другими путями. Белковые фрагменты ΑΑΚδ, описанные в настоящем изобретении, и их варианты, могут обладать по меньшей мере одной неканонической биологической активностью. Белковый фрагмент (фрагменты) ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению также называется в настоящем изобретении полипептидом ΑΑΚδ или эталонным полипептидом ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полипептиды ΑΑΚδ, предложенные в настоящем изобретении, содержат или по существу состоят из всего или части полипептида эталонной последовательности (последовательностей) ΑΑΚδ, описанной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, ниже, которая представляет собой аминокислотную последовательность (последовательности) различных фрагментов гистидил-тРНКсинтетазы. Белковые последовательности ΑΑΚδ мыши и человека являются сильно родственными, различаясь, как правило, не более чем по нескольким аминокислотам в целой последовательности, конкретном домене или конкретном белковом фрагменте.

Аконцевые полипептиды ΑΑΚδ: (табл. 1, 2 и 3).

- 17 030418

Таблица 1А

Полипептиды ΑΑΚδ, идентифицированные с помощью МС

Ηί5Κ31Ν2

ДНК/Человек/

АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСА6ССАСА6ССССТСССА ССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССА6САССТ6СССАААСТС СТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТΤТСТССТСААА АСССССААССССАСААСАСАСТАТАСТСССССССАСАТСССАСТТССССАСААССТС ТТТСАССТААТСАТСССТТССТТСААСССССАСССТССАСААСТСАТТСАТАСАССТ СТАТΤТСААСТАААС6АААСАСТСАТСССАААСТАТ6СССААСАСТССААССТТАТС ТАТСАССТСААССАССАССССССССАССТССТСТСССТТСССТАТСАССТСАСТСТТ ССТТТТССТСССТАТТТСССААТСААТАААСТСАССААСАТТАААСССТАССАСАТА 6СААА66ТАТАТС66С666АТААСССА6ССАТ6АССС6Т66СС6АТАСС666ААТТС ТАССАСТСТСАТТТТСАСАТТССТСССААСТТТСАТСССАТСАТСССТСАТССАСАС ТСССТСААСАТСАТСТСССА6АТССТСАСТТСАСТТСАСАТАССССАСТТССТССТС ААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТ6СТАТСТСТССТСТТТСТСАС АССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТССАСААССТ6ТССТ6ССАА САССТСААСААТСАСАТССТ6ССАСАСААСС6ССТТ6САССТСАССТ6ССТСАСССС АТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСССТССТССААСАССТССТССАС САТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСССССТСССАСАССТСААСТТС СТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАСААААТСТССТТТСАССТСАСС СТТССТССАССССТС6АТТАСТАСАСТССССТСАТСТАТСАСССАСТ6СТССТАСАС АССССАССССАСССА6СССААСАСССССТСС6ТСТС6ССАСТСТСССТССТС6АССА СССТАТСАТССССТА6ТССССАТСТТССАССССААА6СССССААССТ6ССАТ6ТСТС ССССТСАССАТТССС6ТССА6СССАТТТТСТССАТС6ТССААСАСАСАСТАСАСССТ ТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАС

ЗЕО Ю N0: 15

Таблица 1В

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды Ηΐ§Κδ1^Ν1 и предполагаемые связывающие пептиды

Тип/вид	Последовательность	ЗЕО ΙΌ N0:
Белок/мышь	Α5ΑΕζ)ΙΕΕΕνΤΚ	5Е0 Ю N0: 16
Белок/мышь	ЬЬКЬКАОЬСООЕСКОКЕУЬКТРКСТКОУЗРКОМАУКЕКУЕОУЫКСЕКК	ЗЕО Ю N0: 17
Белок/мышь	НСАЕУЮТРЧЕЕЬК	ЗЕО Ю N0: 18
Белок/мышь	ЕТЬТСКУСЕОЗКЫ УОЬК	ЗЕО Ю N0: 19
Белок/мышь	ООССЕЬЬЗЬН	ЗЕО Ю N0: 20

- 18 030418

Таблица 1С

Составленные последовательности ΗΐδΚδ1^Ν1 на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов

Тип/вид	Последовательность	ЗЕО Ю N0:
Белок/мышь	А5АЕ01ЕЕЕУТКЬЬКЬКА0Ь60ОЕ6К0КЕУЬКТРК6ТКО¥5РК0МАУКЕКУЕОУ11НСЕКНН6АЕУЮТРУ ЕЕЬКЕТЬТбКУбЕОЗКЫУОЬКООббЕЬЬЗЬН	5Е0 Ю N0: 21

Таблица 1Ό

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды ΗΐδΚδ1^Ν21 и предполагаемые связывающие пептиды

Тип/вид	Последовательность	ЗЕО Ιϋ N0:
Белок/мышь	НбАЕУЮТРУЕЕЬК	ЗЕО Ю N0: 22
Белок/мышь	ЕТЬТ6К¥6Е05КЬ1ΥΟΕΚΟ066ΕΕΕ5ΕΚΥΟΕΤνΡΕΑΚΥ1ΑΜΝΚΕΤΝΙΚΚΥΗΙΑΚνΥΚΚΟΝΡΑΜΤΚ6ΚΥΚ ЕЕ¥0СОЕО1А60ЕОРМ1РОАЕСЬК1МСЕ1Ь55Ь016ЕЕ1ЛААЖОКК1ЬО6МЕАУССУРО5КЕКТ1С55У ОКЬОКУЗИЕЕУКЫЕМУбЕКбЬАРЕУАОН	ЗЕО Ю N0: 23
Белок/мышь	тсоууоонссузьуеоььоорк	ЗЕО Ю N0: 24

Таблица 1Е

Составленные последовательности ΗΐδΚδ1^Ν1 на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов

Тип/вид	Последовательность	ЗЕО Ιϋ N0:
Белок/мышь	НбАЕУЮТРУЕЕЬКЕТЬТбКУбЕОЗКЫ УОЬКООббЕЬЬЗЬКУОЬТУРЕАКУЬАМЕКЬТШгатПАК νΥΚΚΟΝΡΑΜΤΚ6ΚΥΚΕΕΥ0ΟΟΕΟΙΑΟ0ΕΟΡΜΙΡΟΑΕΟΕΚΙΜΟΕΙΕ33Ε0Ι6ΝΕΕνκνΝΏΚΚΙΕΟ6ΜΕΑ УССУРОЗКЕНТЮЗЗУОКЬОКУЗИЕЕУКЕЕМУСЕКСЬАРЕУАОНЮОУУООНССУЗЬУЕОЬЬООРК	ЗЕО Ю N0: 25

Таблица 2 А

Полипептиды и альтернативные транскрипты ΑΑΚδ, идентифицированные методом глубокого секвенирования

Название	Тип/вид/Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	ЗЕО Ιϋ N0:
Ηί5Η31Ν4	Белок/Человек/ 1-60	МАЕНААЬЕЕЬУКЬОСЕНУНСЬКООКАЗАЕЫЕЕЕУАКЬЬКЬКАОЬСРОЕЗКОКЕУ ЬКТРК	ЗЕО Ю N0: 26
Ηί5Η31Ν4	ДНК/Человек	АТ66СА6А6С6Т6С66С6СТ66А66А6СТ66Т6АААСТТСА666А6А6С6С6Т6С 6А66ССТСАА6СА6СА6АА66ССА6С6СС6А6СТ6АТС6А66А66А66Т66С6АА АСТССТСАААСТ6АА66САСА6СТ666ТССТСАТ6ААА6САААСА6АААТΤТСТС С Т СААААС С С С СААС	ЗЕО Ю N0: 27
Ηί5Κ31Ν5	Белок/Человек/ 1-243+27аа	МАЕНААЬЕЕЬУКЬОСЕНУНСЬКООКАЗАЕЫЕЕЕУАКЬЬКЬКАОЬСРОЕЗКОКЕУ ЬКТРКбТНОУЗРНОМАУНЕКУЕОУИНСЕКННбАЕУЮТРУЕЕЬКЕТЬМбКУбЕО ЗКЫ УОЬКООССЕЬЬЗЬКУОЬТУРЕАКТЬАМЕКЬТШгатПАКУУККОЕРАМТК 6К¥КЕЕ¥0СОЕО1А6ЕЕОРМ1РОАЕСЬК1МСЕ1Ь55Ь016ОЕ1ЛААЖОКК1ЬО6М ЕА1С6УЗОЗКЕНТ1СЗЗУОКЕОКУ6¥Р№ИЫЗСЗН1ЬЫ¥РКТЗНРИНАИЕТ	ЗЕО Ю N0: 28
Ηί5Κ31Ν5	ДНК/Человек	АТ66СА6А6С6Т6С66С6СТ66А66А6СТ66Т6АААСТТСА666А6А6С6С6Т6С 6А66ССТСАА6СА6СА6АА66ССА6С6СС6А6СТ6АТС6А66А66А66Т66С6АА АСТССТ6АААСТ6АА66САСА6СТ666ТССТ6АТ6ААА6САААСА6АААТТТ6Т6 СТСААААСССССАА666САСАА6А6АСТАТА6ТСССС66СА6АТ66СА6ТТС6С6 А6АА66Т6ТТТ6АС6ТААТСАТСС6ТТ6СТТСАА6С6ССАС66Т6СА6АА6ТСАТ Т6АТАСАССΤ6ТАТΤТ6ААСТААА66АААСАСΤ6АТ666ААА6ТАТ6666АА6АС ТССАА6СТТАТСТАТ6АССТ6АА66АССА666С6666А6СТССТ6ТСССТТС6СТ АТ6АССТСАСТ6ТТССТТТТ6СТС66ТАТТТ66СААТ6ААТАААСТ6АССААСАТ	ЗЕО Ю N0: 29
		ТАААС6СТАССАСАТА6СААА66ТАТАТС66С666АТААСССА6ССАТ6АССС6Т 66СС6АТАСС666ААТТСТАССА6Т6Т6АТТТТ6АСАТТ6СТ666ААСТТТ6АТС ССАТ6АТСССТ6АТ6СА6А6Т6ССТ6АА6АТСАТ6Т6С6А6АТССТ6А6ТТСАСТ ТСА6АТА66С6АСТТССТ66ТСАА66ТАААС6АТС6АС6САТТСТА6АТ666АТ6 ТТТ6СТАТСТ6Т66Т6ТТТСТ6АСА6САА6ТТСС6ТАССАТСТ6СТССТСА6ТА6 АСАА6СТ66АСАА66Т6666ТАТСССТ66Т66ААСА6СТ6СТССА66АТССТААА СТАТСССААААСАА6СА66ССТТ66А666ССТ666А6АССТ6А

- 19 030418

Таблица 2В

Уникальные границы сплайсинга полипептидов ΑΑΚδ

Название	Тип/вид	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот в области уникальной границы сплайсинга	3ΕΩ	Ю	ΝΟ:
Н1-ЗЧ09	ДНК/Человек/	САААТТТСТССТСААААСССССААС|ТАСАСАССАССТТТСАССАТСТТСС	5Е<2 Ю	N0:	30
	Белок/Человек	КЕЧЬКТРК	5Е<2 Ю	N0:	31
Н1-А305	ДНК/Человек/	СТССТСАСТАСАСААССТССАСААС|СТССССТАТСССТССТССААСАССТ	5Е<2 Ю	N0:	32
	Белок/Человек	5 5УОКББКУСУРИИЫЗ	5Е<2 Ю	N0:	33

Таблица 3

Полипептиды и нуклеиновые кислоты ΑΑΚδ, идентифицированные с помощью биоинформатики

Название	Тип/ вид/остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	3Εζ) Ю N0:
Ηί3Ρ31Ν3	Белок/Человек/ 1-113	МАЕНААНЕЕНУКНаСЕНУКСНКООКАЗАЕЫЕЕЕУАКННКНКАОЬСРОЕЗКОКЕ ЧЬКТРКСТРОУЗРКОМАЧКЕКЧЕОЧЫРСЕКРНСАЕЧЮТРУЕЕЬКЕТЬМСКДС ЕОЗКЬ	ЗЕО ΙΌ N0: 34
Ηί5Κ51Ν3	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТС ССАССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТСССС АААСТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТΤТ СТССТСААААСССССААССССАСААСАСАСТАТАСТСССССССАСАТСССАСТТ ССССАСААССТСТТТСАССТААТСАТСССТТССТТСААСССССАСССТССАСАА С Т САТ Т САТАСАС СТСТАТТТ СААС ТАААС САААСАС Т САТ С С САААС ТАТ С С С СААСАСТССААССТТ	3Εζ) Ю N0: 35

С-концевые полипептиды ΑΑΚδ: (табл. 4, 5 и 6).

Таблица 4 А

Полипептиды ΑΑΚδ, идентифицированные с помощью МС

Название

Тип/ вид/остатки

Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот

ЗЕО Ю N0:

Таблица 4В

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды и предполагаемые связывающие пептиды

Тип/вид

Последовательность

ЗЕО ΙΌ N0:

Таблица 4С

Составленные последовательности на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов .

Тип/вид

Последовательность

3Εζ) Ιϋ N0:

Таблица 5А

Полипептиды и альтернативные транскрипты ΑΑΚδ, идентифицированные методом глубокого секвенирования

Название	Тип/вид/ Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	ЗЕО Ιϋ N0:
Н1зН31с2	Белок/ Человек/ 1-60+175-509	МАЕНААЬЕЕЬУКЬОСЕНУНСЬКООКАЗАЕЫЕЕЕЧАКЬЬКЬКАОЬСРОЕЗКОКЕЧЬ КТРКОЕО1АСНЕОРМ1РОАЕСЬК1МСЕ1Ь55Ь<21СОЕЬУКУКОКК1ЬОСМЕА1ССЧ ЗОЗКЕНТ1СЗЗУОКЬОКУЗИЕЕУКЫЕМУСЕКСЬАРЕУАОН1СО¥У00НССУЗЕЧЕ0 ЬЬаОРКЬЗаКК0АЬЕСЬСОЬКЬЬЕЕУЬТЬЕСЮОК13ЕОЬЗЬАНСЬОУУТСУ1УЕА УЬЬ<2ТРА<2АСЕЕРЬСУСЗУААССКУОСЬУСМЕОРКСККЧРСЧСЬЗ 1СЧЕК1ЕЗ1ЧЕ 0НЬЕАЬЕЕК1НТТЕТ0УЬУАЗА0ККЬЬЕЕНЬКЬЧЗЕЬИОАС1КАЕЬЬУККНРКЬЬН 0Ь0УСЕЕАС1РЬУА11СЕ0ЕЬКОСУ1КЬРЗЧТЗРЕЕУОУРРЕОЬЧЕЕ1КРРТС0РЬ СТС	3Εζ) Ю N0: 4 8

- 20 030418

Н1зН31с2	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТΤТСТССТС ААААСССССААССАТТТТСАСАТТССТСССААСТТТСАТСССАТСАТСССТСАТСС АСАСТСССТСААСАТСАТСТСССАСАТССТСАСТТСАСТТСАСАТАССССАСТТСС ТССТСААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТАТСТСТССТСТТ ТСТСАСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТССАСААССТСТС СТСССААСАССТСААСААТСАСАТССТСССАСАСААСССССТТССАССТСАССТСС СТСАССССАТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСССТССТССААСАС СТССТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСССССТСССАСА ССТСААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАСААААТСТССТ ТТСАССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССССТСАТСТАТСАСССА СТССТССТАСАСАССССАССССАСССАССССААСАСССССТСССТСТССССАСТСТ СССТССТССАССАСССТАТСАТССССТАСТССССАТСТТССАССССАААССССССА АССТСССАТСТСТСССССТСАССАТТССССТССАССССАТТТТСТССАТССТССАА САСАСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАСАССТССТТСТ 66САТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСАСТАААССΤТСТСТСАСААСТСТ СССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССАААССТАСТСААС САСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСАТСССССАССА ССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССААСАССТСС АТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАССССАСССССТС Т6САТСТ6СТ6А	5Е0 Ю N0: 4 9
Н1зН31сз	Белок/ Человек/ 1-60+211-509	МАЕКААЬЕЕЬУКЬ<2СЕКУКСЬК<2<2КА5АЕЬ1ЕЕЕУАКЬЬКЬКА<2ЬСРОЕ5К<2КЕЧЬ КТ ΡΚνΝϋΚΚΙЬОСМЕА1ССЧЗ ϋ3ΚΕΚΤIСЗ 3УОКЬОКУЗИЕЕУКЫЕМУСЕКСЬАРЕ УАОК1СО¥У<2<2НССУ51ЛЖ<2ЬИ2ОРКЬ5<2МК<2АЬЕСЬСОЬКЬЬЕЕ¥ЬТЬЕС1ООК1 ЗЕОЬЗЬАКСЬО¥¥ТСУ1¥ЕАУЬЬ0ТРА0АСЕЕРЬСУСЗУААССК¥ОСЬУСМЕОРКС ККЧРСЧСЬЗ ΐσνΕΗΙ ЕЗ1УЕ<2КЬЕАЬЕЕК1КТТЕТ<2УЬУА5А<2ККЬЬЕЕКЬК1Л¥ЗЕ ЬИОАС1КАЕЬЬ¥КККРКЬЬК<2Ь<2¥СЕЕАС1РЬУА11СЕ0ЕЬКОСУ1КЬКЗЧТЗКЕЕ УОЧККЕО1ЛЖЕ1КККТС<2РЬС1С	ЗЕО Ю ΝΟ: 50
Н1зК51сз	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТ6ААА6САААСА6АААТΤТСТССТС ААААСССССААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТАТСТСТСС ТСТТТСТСАСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТССАСААСС ТСТССТСССААСАССТСААСААТСАСАТССТСССАСАСААСССССТТССАССТСАС СТСССТСАССССАТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСССТССТССА АСАССТССТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСССССТСС САСАССТСААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАСААААТС ТССТТТСАССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССССТСАТСТАТСА СССАСТССТССТАСАСАССССАССССАСССАССССААСАСССССТСССТСТССССА СТСТСССТССТССАССАСССТАТСАТССССТАСТССССАТСТТССАССССАААССС СССААССТСССАТСТСТСССССТСАССАТТССССТССАССССАТТТТСТССАТССТ ССААСАСАСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАСАССТСС ΤТСТ66САТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСАСТАААССΤТСТСТСАСАА СТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССАААССТАСТ	ЗЕО Ю ΝΟ: 51

- 21 030418

		СААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСАТССССС АССАССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССААСАС СТССАТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАССССАССС ССТСТ6САТСТ6СТ6А
Н1зН51с4	Белок/ Человек/ 1-100+211- 509	МАЕКААЬЕЕЬУКЬ<2СЕКУКСЬК<2<2КА5АЕЬ1ЕЕЕУАКЬЬКЬКА<2ЬСРОЕ5К<2КЕУЬ КТРКСТКО¥5РК<2МАУКЕКУЕОУ11НСЕКННСАЕУ1ОТРУЕЕЬКУЫОНН1ЬОСМЕА IССЧ5 ϋΕΚΕΗΤIС5 5УОКЬОКУ5ИЕЕУКЫЕМУСЕКСЬАРЕУАОН1СОУУООНССУЗ ЬУЕ0ЬЬ0ОРКЬ5<2ЕК<2АЬЕСЬСОЬКЬЬЕЕУЬТЬЕС1ООК15ЕОЬ5ЬАКСЬОУУТСУ IУЕАУЬЬОТРАОАСЕЕРЬСУСЗУААССНУОСЬУСМЕОРКСНКУРСУСЬЗ1СЧЕН1Е 51УЕ0КЬЕАЬЕЕК1КТТЕТ0УЬУА5А<2ККЬЬЕЕКЬКЬУ5ЕЬИОАС1КАЕЬ1ЛККЕР КЬЬЕ<2И2УСЕЕАС1РЬУА11СЕ<2ЕЬКОСУ1КЬК5УТ5КЕЕУОУККЕО1ЛЖЕ1КККТ С<2РЬС1С	5Е<2 Ю ΝΟ: 52
Н1зН51с4	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТТТСТССТС ААААСССССААССССАСААСАСАСТАТАСТСССССССАСАТСССАСТТССССАСАА ССТСТТТСАССТААТСАТСССТТССТТСААСССССАСССТССАСААСТСАТТСАТА САССТСТАТТТСААСТАААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТ АТСТСТССТСТТТСТСАСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТ ееАСААеететсстеееААеАеетеААСААтеАеАтеетеееАеАеААееесстте САССТСАССТСССТСАССССАТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСС СТССТССААСАССТССТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССА СССССТСССАСАССТСААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТС	5Е<2 Ю ΝΟ: 53
		АСААААТСТССТТТСАССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССССТС АТСТАТСАСССАСТССТССТАСАСАССССАССССАСССАССССААСАСССССТССС ТСТССССАСТСТСССТССТССАССАСССТАТСАТССССТАСТССССАТСТТССАСС ССАААССССССААССТСССАТСТСТСССССТСАССАТТССССТССАССССАТТТТС ТССАТССТССААСАСАСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАС АСАССТССТТСТСССАТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСАСТАААССТТС ТСТСАСААСТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССА ААССТАСТСААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТ САТСССССАССАССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССА СССААСАССТССАТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСА ССССАСССССТСТССАТСТССТСА
Н1зК51с5	Белок/ Человек/ 1-174+211- 509	МАЕКААЬЕЕЬУКЬ<2СЕКУКСЬК<2<2КА5АЕЬ1ЕЕЕУАКЬЬКЬКА<2ЬСРОЕ5К<2КЕУЬ ΚΤΡΚσΤΚϋΥ5ΡΚ<2ΜΑνΚΕΚνΕ0νΐ 1НСЕКННСАЕУ1ОТРУЕЕЬКЕТЬМСКУСЕО5К Ь1 Υ0ΕΚϋζ)66ΕΕΕ5ΕΚΥ0ΕΤνΡΕΑΚΥ1ΑΜΝΚΕΤΝΙΚΚΥΗΙΑΚνΥΚΚ0ΝΡΑΜΤΚ6ΚΥ НЕ ΕΥΟΟνΝϋΚΚΙЬОСМЕА1ССЧ5 ϋΕΚΕΚΤIС5 5УОКЬОКУЕИЕЕУКЫЕМУСЕКСЬА РЕУАОК1СОУУ<2<2НССУ51ЛЖ<2ЬИ2ОРКЬ5<2иК<2АЬЕСЬСОЬКЬЬЕЕУЬТЬЕС1ОО К15ЕОЪ5ЬАНСЪОУУТСУ1УЕАУШ(2ТРА(2АСЕЕРЪСУС5УААССНУОСЪУСМЕОР КСНКУРСЧСЬЗ ΐσνΕΗΙ Е51УЕ<2КЬЕАЕЕЕК1КТТЕТ<2УЬУА5А<2ККЬЬЕЕКЬКЬУ 5ЕЬТОАС1КАЕЬЬУККЕРКЬЬЕ<2Ь<2УСЕЕАС1РЬУА11СЕ<2ЕЬКОСУ1КЬК5УТ5К ЕЕУОУККЕО1ЛЖЕ1КККТС<2РЬС1С	5Е<2 Ю N0: 54

- 22 030418

Н1зК31с5	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТΤТСТССТС ААААСССССААССССАСААСАСАСТАТАСТСССССССАСАТСССАСТТССССАСАА ССТСТТТСАССТААТСАТСССТТССТТСААСССССАСССТССАСААСТСАТТСАТА САССТСТАТΤТ6ААСТАААССАААСАСТСАТСССАААСТАТССССААСАСТССААС СТТАТСТАТСАССТСААССАССАССССССССАССТССТСТСССТТСССТАТСАССТ САСТСТТССТТТТССТСССТАТТТСССААТСААТАААСТСАССААСАТТАААСССТ АССАСАТАССАААССТАТАТСССССССАТААСССАСССАТСАССССТСССССАТАС ССССААТТСТАССАСТСТСТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТАТ СТСТССТСТТТСТСАСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТСС АС ААС СТСТССТСС СААСАС С Т СААСААТ САСАТ С С Т С С САСАСААС С С С С Τ Т С С А ССТ6А66Т66СТ6АСС6САТТ6666АСТАТ6ТССА6СААСАТ66Т6666ТАТСССТ ССТССААСАССТССТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСС СССТСССАСАССТСААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАС ААААТСТССТТТСАССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССССТСАТ СТАТ6А66СА6Т6СТ6СТАСА6АССССА6СССА66СА6666АА6А6ССССТ666Т6 Т666СА6Т6Т66СТ6СТ66А66АС6СТАТ6АТ666СТА6Т666САТ6ТТС6АСССС ААА666С6САА66Т6ССАТ6Т6Т6666СТСА6САТТ6666Т66А6С66АТТТТСТС САТССТССААСАСАСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАС АССТССТТСТСССАТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСАСТАААССТТСТС ТСАСААСТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССААА ССТАСТСААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСА	ЗЕО Ю ΝΟ: 55
		ТСССССАССАССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСС СААСАССТССАТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАСС ССА6ССССТСТ6САТСТ6СТ6А
Н1зН31с6	Белок/ Человек/ 1-60+101-509	МАЕКААЬЕЕЬУКЬ<2СЕКУКСЬК<2<2КА5АЕЬ1ЕЕЕУАКЬЬКЬКА<2ЬСРОЕ5К<2КЕЧЬ КТРКЕТЬМСКЧСЕОЗКЫ УОЬКООССЕЬЬЗЬКУОЬТУРЕАКУЬАМЕКЬТШККУН! АКУ¥ККОЕРАМТКСК¥КЕЕ¥<2СОЕО1АСЕЕОРМ1РОАЕСЬК1МСЕ1Ь55Ь<21СОЕЬ νκνΝϋΚΚΙЬОСМЕА1ССЧЗ ϋ5ΚΕΚΤIС5 5УОКЬОКУЗИЕЕУКЫЕМУСЕКСЬАРЕУА ΟΗΙ6ΟΥν00Η66ν5ΕνΕ0ΕΕ0ϋΡΚΕ50ΝΚ0ΑΕΕ6Ε6ΟΕΚΕΕΕΕΥΕΤΕΕ6ΙΟΟΚΙ5Ε 0Ε51Α.Κ6ΕϋΥΥΤ6νΐ УЕАУЬЬОТРАОАбЕЕРЬбУбЗЧААббВАОбЬУбМЕОРКбКК ЧРСЧСЬЗ ΐσνΕΚΙ ЕЗ 1УЕ0КЬЕАЬЕЕК1КТТЕТ0УЬУА5А<2ККЬЬЕЕКЬКЬУ5ЕЬИ ОАС1КАЕЬ1АККЕРКЬЬЕ<2Ь<2ЕСЕЕАС1РЬУА11СЕ<2ЕЬКОСУ1КЬК5УТ5КЕЕУО ЧККЕО1ЛЖЕ1КККТС<2РЬС1С	ЗЕО Ю ΝΟ: 5 6
Н1зН51с6	ДНК/Человек	АТ66СА6А6С6Т6С66С6СТ66А66А6СТ66Т6АААСТТСА666А6А6С6С6Т6С6 А66ССТСАА6СА6СА6АА66ССА6С6СС6А6СТ6АТС6А66А66А66Т66С6АААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТ6ААА6САААСА6АААТΤТСТССТС ААААСССССААССАААСАСТСАТСССАААСТАТССССААСАСТССААССТТАТСТА ТСАССТСААССАССАССССССССАССТССТСТСССТТСССТАТСАССТСАСТСТТС СТТТТССТСССТАТТТСССААТСААТАААСТСАССААСАТТАААСССТАССАСАТА ССАААССТАТАТСССССССАТААСССАСССАТСАССССТСССССАТАСССССААТТ СТАССАСТСТСАТТТТСАСАТТССТСССААСТТТСАТСССАТСАТСССТСАТССАС АСТСССТСААСАТСАТСТСССАСАТССТСАСТТСАСТТСАСАТАССССАСТТССТС СТСААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТАТСТСТССТСТТТС ТСАСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТССАСААССТСТССТ	ЗЕО Ю N0: 57

- 23 030418

		СССААСАССТСААСААТСАСАТССТСССАСАСААСССССТТССАССТСАССТСССТ САССССАТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСССТССТССААСАССТ ССТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСССССТСССАСАСС ТСААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАСААААТСТССТТТ САССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССССТСАТСТАТСАСССАСТ ССТССТАСАСАССССАССССАСССАССССААСАСССССТСССТСТССССАСТСТСС СТССТССАССАСССТАТСАТССССТАСТССССАТСТТССАССССАААССССССААС СТСССАТСТСТСССССТСАССАТТССССТССАССССАТТТТСТССАТССТССААСА САСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАСАССТССТТСТСС САТ С Т ССАСАСААСААСС Т СС ТАСАССАААСАС ТАААСС ΤТ СТ С Т САСААС Т СТ СС САТССТСССАТСААСССТСАССТ6СТ6ТАСАА6АА6ААСССААА6СТАСТСААССА СТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСАТСССССАССАСС ААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССААСАССТССАТ СТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАССССАСССССТСТС САТСТ6СТ6А
Н1зН31с7	Белок/ Человек/ 1-100+ 175-509	МАЕКААЪЕЕЪУКЪ<2СЕКУКСЪК<2<2КА5АЕЪ1ЕЕЕУАКЪЪКЪКА<2ЪСРОЕ5К<2КЕЧЪ ΚΤΡΚσΤΚϋΥ5ΡΚ<2ΜΑνΚΕΚνΕ0νΐ 1НСЕКННСАЕУ1ОТРУЕЕЬКОЕО1АСЫЕОРМ1 РОАЕСЬК1МСЕ1Ь55Ь01СОЕ1ЛААЖОКК1ЬОСМЕА1ССУ5О5КЕКТ1С55УОКЬО КУ5ЖЕУКЕЕМУСЕКСЬАРЕУАОК1СО¥У<2<2НССУ51ЛЖ<2ЬЬ<2ОРКЬ5<2ЕК<2АЬЕС ЬСОЬКЬЬЕЕУЬТЬЕСЮОКТЗЕОЬЗЬАНСЬОУУТСУТУЕАУЬЬОТРАОАСЕЕРЬСУ СЗУААССРУОСЪУСМЕОРКСРКУРСУСЪЗ1СЧЕР1ЕЗ1ЧЕ0РЪЕАЪЕЕК1РТТЕТ0 УЬУАЗА0ККЬЬЕЕКЬКЬУЗЕЬИОАС1КАЕЬЬ¥ККЕРКЬЬЕ<2Ь<2¥СЕЕАС1РЬУА11 СЕ<2ЕЬКОСУ1КЬКЗУТЗКЕЕУОУККЕО1ЛЖЕ1КККТС<2РЬС1С	ЗЕО Ю ΝΟ: 58
Н1зК51с7	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТ6АААСТ6АА66САСА6СТСССТССТСАТ6ААА6САААСА6АААТΤТСТССТС ААААСССССААССССАСААСАСАСТАТАСТСССССССАСАТСССАСТТССССАСАА ССТСТТТСАССТААТСАТСССТТССТТСААСССССАСССТССАСААСТСАТТСАТА САССТСТАТТТСААСТАААССАТТТТСАСАТТССТСССААСТТТСАТСССАТСАТС С С Т САТ С САСАС Т С С С Т СААСАТ САТ С Т С С САСАТ ССТ САС Τ Т САС Τ Т САСАТАС 6 ССАСТТССТССТСААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТАТСТ СТССТСТТТСТСАСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТССАС ААССТСТССТСССААСАССТСААСААТСАСАТССТСССАСАСААСССССТТССАСС ТСАССТСССТСАССССАТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСССТСС ТССААСАССТССТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСССС СТСССАСАССТСААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАСАА ААТСТССТТТСАССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССССТСАТСТ АТСАСССАСТССТССТАСАСАССССАССССАСССАССССААСАСССССТСССТСТС СССАСТСТСССТССТССАССАСССТАТСАТССССТАСТССССАТСТТССАССССАА АССССССААССТСССАТСТСТСССССТСАССАТТССССТССАССССАТТТТСТССА ТССТССААСАСАСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАСАС СТССТТСТСССАТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСАСТАААССТТСТСТС АСААСТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССАААСС ТАСТСААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСАТС ССССАССАССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССА АСАССТССАТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАСССС АСССССТСТССАТСТССТСА	ЗЕО Ю ΝΟ: 59

- 24 030418

Н1зН31с8	Белок/ Человек/ 1-60+399-509	МАЕНААЬЕЕНУКНОСЕНУНСНКООКАЗАЕЫЕЕЕУАКННКНКАОНСРРЕЗКОКЕУЬ ΚΤΡΚΑΗΕΕΚΙΗΤΤΕΤΟνΗνΑΒΑΟΚΚΗΗΕΕΗΗΚΙΛΥΟΕΗΜΡΑΟΙΚΑΕΗΗΥΚΚΝΡΚΗΗΝ 0Н0¥СЕЕАС1Р1АА11СЕ0ЕНКРСУ1КННЗУТЗНЕЕУРЧННЕР1ЛЖЕ1КННТС0РН С1С	ЗЕО ΙΠ ΝΟ: 60
Н1зН31с8	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТТТСТССТС ААААСССССААСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАСАССТССТТСТ СССАТ С Т ССАСАСААСААСС Т СС ТАСАССАААСАС ТАААСС Τ Т СТ С Т САСААС ТСТ СССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССАААССТАСТСААС САСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСАТСССССАССА ССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССААСАССТСС АТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАССССАСССССТС ТССАТСТССТСА	ЗЕО ΙΠ N0: 61
Н1зН31с9	Белок/ Человек/ 1-100+399- 509	МАЕНААЬЕЕНУКНОСЕНУНСНКООКАЗАЕЫЕЕЕУАКННКНКАОНСРРЕЗКОКЕУЬ КТ РКСТНЕУЗ ΡΚΟΜΑνΚΕΚνΕΡνίIНС ЕКННСАЕУ!РТ РУЕЕНКАНЕЕК!НТ ТЕ ТО νΗνΑ3Α<2ΚΚΗΗΕΕΗΗΚΗν3ΕΗΜΡΑΟΙΚΑΕΗΗΥΚΚΝΡΚΗΗΝ<2Η<2ΥΟΕΕΑΟΙΡΗνΑΙ I СЕ0ЕРКПСУ1КРНЗУТЗНЕЕУПЧННЕП1ЛЖЕ1КННТС0РРС1С	ЗЕО ΙΡ N0: 62
Н1зН31с9	ДНК/Человек	АТСССАСАСССТСССССССТССАССАССТССТСАААСТТСАСССАСАСССССТССС АССССТСААССАССАСААССССАССССССАССТСАТССАССАССАССТССССАААС ТССТСАААСТСААСССАСАССТСССТССТСАТСАААССАААСАСАААТΤТСТССТС ААААСССССААССССАСААСАСАСТАТАСТСССССССАСАТСССАСТТССССАСАА ССТСТТТСАССТААТСАТСССТТССТТСААСССССАСССТССАСААСТСАТТСАТА	ЗЕО ΙΠ N0: 63
		САССТСТАТТТСААСТАААСССТТТССАССАСААСАТАСССАССАСССАСАСАСАС СТССТТСТСССАТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСАСТАААССТТСТСТС АСААСТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСААСААСААСССАААСС ТАСТСААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАСТССТСССТАТСАТС ССССАССАССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССА АСАССТССАТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСААААССАСААСАСССС АСССССТСТССАТСТССТСА
Н1зН31с1°	Белок/ Человек/ 369-509	МЕПРКСНКУРСУСЬЗ1СЧЕН1 ЕЗ 1УЕ<2ННЕАНЕЕК1НТТЕТ<2Ч1ААЗА<2ККННЕЕН ΡΚΙΛΥΟΕΡΜΠΑΟΙΚΑΕΡΡΥΚΚΝΡΚΡΡΝΟΡΟΥΟΕΕΑΟΙΡΡνΑΙ 1СЕ0ЕЬКРСЧ1КЬНЗ ЧТЗНЕЕУПЧННЕП1ЛЖЕ1КННТС0РРС1С	ЗЕО ΙΠ N0: 64
Н1зН31с1°	ДНК/Человек	АТСТТССАССССАААССССССААССТСССАТСТСТСССССТСАССАТТССССТССА ССССАТТТТСТССАТССТССААСАСАСАСТАСАСССТТТССАССАСААСАТАСССА ССАСССАСАСАСАССТССТТСТСССАТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАААСА СТАААССТТСТСТСАСААСТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАСАА СААСААСССАААССТАСТСААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССАС ТССТСССТАТСАТСССССАССАССААСТСААССАТССССТСАТСААССТСССТТСА СТСАССАССАСССААСАССТССАТСТСССААСАСААСАССТТСТССАССАААТСАА ААССАСААСАССССАСССССТСТССАТСТССТСА	ЗЕО ΙΠ N0: 65

- 25 030418

Таблица 5В

Уникальные границы сплайсинга полипептидов ЛЛН5

Название	Тип/ вид	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот в области уникальной границы сплайсинга	5Е0 Ιϋ ΝΟ:
Н1-А301	ДНК/ Человек	САААТТТСТССТСААААСССССААС	|САТТТТСАСАТТССТСССААСТТТС	5Е<2	Ю	N0:	бб
	Белок/ Человек	КБУЕКТРКОЕОТАСЫЕ	5Е<2	Ю	N0:	67
Н1-А302	ДНК/ Человек	САААТΤТСТССТСААААСССССААС	|СТАААССАТССАСССАТТСТАСАТС	5Е<2	Ю	N0:	68
	Белок/ Человек	КБУЕКТРКУБОННТБО	5Е<2	Ю	N0:	69
Н1-А303	ДНК/ Человек	Т САТАСАС СТСТАТТТ СААС ТАААС	|СТАААССАТССАСССАТТСТАСАТС	5Е<2	Ю	N0:	70
	Белок/ Человек	ОТРУЕЕБКУБОННТБО	5Е<2	Ю	N0:	71
Н1-А307	ДНК/ Человек	СССАТАСССССААТТСТАССАСТСТ	|СТАААССАТССАСССАТТСТАСАТС	5Е<2	Ю	N0:	72
	Белок/ Человек	ΚΥΚΕ ЕУОСУЫОККТ ЕО	ЗЕС	ТО	N0:	73
Н1-ЗУ04	ДНК/ Человек	САААТΤТСТССТСААААСССССААС	|САААСАСТСАТСССАААСТАТСССС	5Е<2	Ю	N0:	74
	Белок/ Человек	КЕУБКТРКЕТБМСКУС	5Е<2	Ю	N0:	75
Н1-ЗУ10	ДНК/ Человек	Т САТАСАС СТСТАТТТ СААС ТАААС	|САТТТТСАСАТТССТСССААСТТТС	5Е<2	Ю	N0:	76
	Белок/ Человек	ОТРУБЕБКОББТАСББ	5Е<2	Ю	N0:	77
Н1-ЗУ11	ДНК/ Человек	САААТΤТСТССТСААААСССССААС	|ССТТТССАССАСААСАТАСССАССА	5Е<2	Ю	N0:	78
	Белок/ Человек	КБУБКТРКАБЕЕКТНТ	5Е<2	Ю	N0:	79
Н1-ЗУ14	ДНК/ Человек	Т САТАСАС СТСТАТТТ СААС ТАААС	|ССТТТССАССАСААСАТАСССАССА	5Е<2	Ю	N0:	80
	Белок/ Человек	БТРУБЕБКАБЕЕКТЕТ	5Е<2	Ю	N0:	81
Н1-А305	ДНК/ Человек	С Т С С Т САС ТАСАСААС С Т С САСААС	|СТССССТАТСССТССТССААСАССТ	5Е<2	Ю	N0:	82
	Белок/ Человек	Ν/Α

Таблица 6

Полипептиды и нуклеиновые кислоты ЛЛНУ идентифицированные с помощью биоинформатики

Название	Тип/ вид/остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	5Е0 Ιϋ N0:
Н1зН31С1	Белок/ Человек/ 405-509	ΚΤΤΕΤ0νΕνΑ5Α0ΚΚΕΕΕΕΚΕΚΕν5ΕΕΜ0Α0ΙΚΑΕΕΕΥΚΚΝΡΚΕΕΝ0Ε0Υ0ΕΕΑ0ΙΡ БУА11СЕ<2ЕБКЕ)СУ1КБК5УТ5КЕЕУ0УНКЕЕ)БУЕЕ1КККТС<2РБС1С	ЗЕО Ю N0: 8 3
Н1зН31с1	ДНК/ Человек/	СССАССАСССАСАСАСАССТССТТСТСССАТСТССАСАСААСААССТССТАСАССАА АСАСТАААССТТСТСТСАСААСТСТСССАТССТСССАТСААСССТСАССТССТСТАС ААСААСААСССАААССТАСТСААССАСТТАСАСТАСТСТСАССАСССАСССАТСССА СТССТСССТАТСАТСССССАССАССААСТСААССАТССС СТСАТСААССТСССТТСАСТСАССАССАСССААСАССТССАТСТСССААСАСААСАС СТТСТССАССАААТСААААССАСААСАССССАСССССТСТССАТСТССТСА	ЗЕО Ю N0: 8 4

- 26 030418

Внутренние полипептиды ΑΑΚδ: (табл. 7, 8 и 9).

Таблица 7 А

Полипептиды ΑΑΚδ, идентифицированные с помощью МС

Название

Тип/ вид/Остатки

Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот

ЗЕО ΙΌ ΝΟ:

Таблица 7В

Выявленные с помощью масс-спектрометрии пептиды Α§ρΚδ1^η и предполагаемые связывающие пептиды

Тип/вид

Последовательность

3Ες Ιϋ ΝΟ:

Таблица 7С

Составленные последовательности на основе выявленных с помощью масс-спектрометрии пептидов

Тип/вид

Последовательность

ЗЕО Ιϋ ΝΟ:

Таблица 8А

Полипептиды ΑΑΚδ и альтернативные транскрипты, идентифицированные методом глубокого секвенирования

Название

Тип/ вид/Остатки

Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот

ЗЕО Ιϋ ΝΟ:

Таблица 8В

Уникальные границы сплайсинга полипептидов ΑΑΚδ

Название

Тип/ вид

Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот в области уникальной границы сплайсинга

3Ες Ιϋ ΝΟ:

Таблица 9

Полипептиды . и нуклеиновые кислоты ΑΑΚδ, идентифицированные с помощью биоинформатики

Название	Тип/вид/ Остатки	Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот	ЗЕО Ιϋ ΝΟ:
Н13К3111	Белок/ Человек/ 191-333	СЪК1МСЕ1ЪЗЗЬ01СОЕЬУКУЫОКК1ЪОСМЕА1ССУЗОЗКЕКТ1СЗЗУОКЪОКУЗИ ЕЕУКЕЕМУСЕКСЬАРЕУАОК1СОУУ<2<2НССУ31ЛЖ(2ЬЬ<2ОРКЬЗ<2ЕК0АЬЕСЬСОЬ КЪЪЕЕУЪТЪЕСЮОШЗГОЪЗЪАКСЪОУУТС	3Εζ) Ю N0: 109
ΗΪ3Κ3111	ДНК/Человек	ТСССТСААСАТСАТСТСССАСАТССТСАСТТСАСТТСАСАТАССССАСТТССТССТ СААССТАААССАТССАСССАТТСТАСАТСССАТСТТТССТАТСТСТС6ТСТТТСТС АСАССААСТТСССТАССАТСТССТССТСАСТАСАСААССТССАСААС6ТСТССТСС СААСАССТСААСААТСАСАТССТСССАСАСААСССССТТССАССТСА6СТСССТСА ССССАТТССССАСТАТСТССАССААСАТССТССССТАТСССТССТССААСАССТСС ТССАССАТССТАААСТАТСССААААСААССАССССТТССАСССССТС6САСАССТС ААСТТССТСТТТСАСТАССТСАСССТАТТТСССАТТСАТСАСААААТСТССТТТСА ССТСАСССТТССТССАССССТССАТТАСТАСАСТССС	ЗЕ<2 Ю N0: 110

Белковые фрагменты или аминокислотные последовательности белковых фрагментов, такие как протеолитические фрагменты или фрагменты вариантов сплайсинга, могут быть охарактеризованы, идентифицированы или получены в соответствии с различными методами. Например, варианты сплайсинга могут быть идентифицированы с помощью таких методов, как глубокое секвенирование (см., например, Χΐη§ е! а1., ΚΝΑ. 14:1470-1479, 2008; и /Канд е! а1., Оепоте ^зеа-сЬ. 17:503-509, 2007). В качестве другого примера, белковые фрагменты, такие как протеолитические фрагменты, могут быть идентифицированы ΐη νΐΐΓο, например, посредством инкубации полноразмерных или других полипептидов ΑΑΚδ с выбранными протеазами, или они могут быть идентифицированы эндогенно (например, ΐη νΐνο). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты, такие как эндогенные протеолитические фрагменты, могут быть созданы или идентифицированы, например, путем рекомбинантной экспрессии полноразмерных или других полипептидов ΑΑΚδ в выбранном микроорганизме или эукариотической клетке, который либо был модифицирован для включения одной или более выбранных протеаз, либо естественным образом содержит одну или более протеаз, которые способны действовать на выбранный полипептид ΑΑΚδ, и изолирования и характеристики эндогенно продуцированных его белковых фрагментов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты, такие как эндогенные (например, природные) протеолитические фрагменты, могут быть созданы или идентифицированы, например, в различных клеточных фракциях (например, цитозольной, мембранной, ядерной) и/или ростовой среде различных клеточных типов, включая, например, иммунные клетки, такие как моноциты, дендритные клетки, макрофаги (например, макрофаги ΚΑΆ 264,7), нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и лимфоциты, такие как В-клетки и Т-клетки (например, ΟΌ4+ хелперные и ΟΌ8+ киллерные клетки), включая первичные Т-клетки и Т-клеточные линии, такие как Т-клетки .1игка1, также как и естественные

- 27 030418 киллеры (иа!ига1 кШег, ΝΚ-клетки).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты, такие как эндогенные протеолитические фрагменты, полученные любым способом, могут быть идентифицированы с помощью методов, таких как масс-спектрометрия или эквивалентные методы. После получения ίη νίίτο или идентификации эндогенно идентифицированного белкового фрагмента, его можно картировать или секвенировать и, например, клонировать в векторе экспрессии для рекомбинантной продукции или получать синтетическим путем.

Широкое разнообразие протеаз может использоваться для продукции, идентификации, изолирования или исследования последовательности белковых фрагментов ΆΛΚδ, таких как протеолитические фрагменты. В целом протеазы обычно классифицируют по трем основным критериям: (ί) катализируемая реакция, (ίί) химическая природа каталитического сайта и (ίίί) эволюционные отношения, выявленные на основе структуры. Общие примеры протеаз или протеиназ при классификации по механизму катализа включают аспарагиновые протеазы, сериновые протеазы, цистеиновые протеазы и металлопротеазы.

Большинство аспарагиновых протеаз принадлежат к семейству пепсинов. Указанное семейство включает пищеварительные ферменты, такие как пепсин и химозин, также как и лизосомальные катепсины Ό и ферменты процессинга, такие как ренин, и ключевые грибковые протеазы (например, пенициллопепсин, ризопуспепсин, эндотиапепсин). Второе семейство аспарагиновых протеаз включает вирусные протеазы, такие как протеаза из вируса СПИДа (ИГУ), также называемая ретропепсином.

Сериновые протеазы включают два отдельных семейства. Первое семейство химотрипсинов, которое включает ферменты млекопитающих, такие как химотрипсин, трипсин, эластазу и калликреин, и второе семейство субстилизинов, которое включает бактериальные ферменты, такие как субстилизин. Общая трехмерная структура различается между указанными двумя классами, но они имеют одинаковую геометрию активного сайта, и катализ проходит по одинаковому механизму. Сериновые протеазы проявляют разную субстратную специфичность, что связано, главным образом с аминокислотными заменами в различных субсайтах фермента (сайтах взаимодействия с остатком субстрата). Некоторые сериновые протеазы имеют расширенный сайт взаимодействия с субстратом, тогда как другие имеют специфичность, которая ограничивается остатком субстрата Р1.

Семейство цистеиновых протеаз включает протеазы растений, такие как папаин, актинидии и бромелаин, некоторые лизосомальные катепсины млекопитающих, цитозольные кальпаины (кальцийактивируемые), также как и некоторые протеазы паразитов (например, Ттурапокота, 5>с1икЮкота). Папаин представляет собой архетипичный и наиболее изученный член семейства. Недавнее раскрытие рентгеновский структуры превращающего интерлейкин-1-бета фермента выявило новый тип укладки цистеиновых протеиназ.

Металлопротеазы являются одним из наиболее древних классов протеаз, обнаруженных в бактериях, грибах и высших организмах. Они значительно различаются по их последовательностям и трехмерным структурам, но значительное большинство ферментов содержит атом цинка, который является каталитически активным. В некоторых случаях, цинк может быть замещен другим металлом, таким как кобальт или никель, без потери протеолитической активности. Бактериальный термолизин был хорошо охарактеризован и его кристаллографическая структура указывает на то, что цинк связан двумя гистидинами и одной глутаминовой кислотой. Многие металлопротеазы содержат мотив последовательности НЕХХН, который обеспечивает два гистидиновых лиганда для цинка. Третий лиганд либо представляет собой глутаминовую кислоту (термолизин, неприлизин, аланиламинопептидаза), либо гистидин (астацин, серрализин).

Типичные протеазы включают, например, ахромопептидазу, аминопептидазу, анкрод, ангиотензинпревращающий фермент, бромелаин, кальпаин, кальпаин Г, кальпаин ГГ, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В, карбоксипептидазу О, карбоксипептидазу Р, карбоксипептидазу ^, карбоксипептидазу Υ, каспазу 1, каспазу 2, каспазу 3, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 6, каспазу 7, каспазу 8, каспазу 9, каспазу 10, каспазу 11, каспазу 12, каспазу 13, катепсин В, катепсин С, катепсин Ό, катепсин Е, катепсин О, катепсин Н, катепсин Ь, химопапаин, химазу, химотрипсин, клострипаин, коллагеназу, компонент комплемента С1г, компонент комплемента С1к, фактор комплемента И, фактор комплемента Г, кукумизин, дипептидилпептидазу ГУ, эластазу (лейкоцитарную), эластазу (панкреатическую), эндопротеиназу Атд-С, эндопротеиназу Акр-Ν, эндопротеиназу О1и-С, эндопротеиназу Ьук-С, энтерокиназу, фактор Ха, фицин, фурин, гранзим А, гранзим В, протеазу ВИЧ, ГОа3у, тканевой калликреин, лейциновую аминопептидазу (общую), лейциновую аминопептидазу (цитозольную), лейциновую аминопептидазу (микросомальную), матриксную металлопротеазу, метиониновую аминопептидазу, нейтразу, папаин, пепсин, плазмин, пролидазу, проназу Е, простатоспецифический антиген, алкалофильную протеазу из 81тер1отусек дпкеик, протеазу из АкретдШик, протеазу из АкрегдШик каПок протеазу из АкрегдШик ко)ае, протеазу (В. йскетГогпик) (щелочную, или алкалазу), протеазу из ВасШик ро1утуха, протеазу из ВасШик кр., протеазу из Ρΐιί/орик кр., протеазу 8, пртеасомы, протеиназу из АкретдШик оту/ае, протеиназу 3, протеиназу А, протеиназу К, протеин С, пироглутаматаминопептидазу, ренин, стрептокиназу, субтилизин, термолизин, тромбин, тканевой активатор плазминогена, трипсин, триптазу и урокиназу.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к изолированным полипептидам ААК8,

- 28 030418 содержащим, по существу состоящим из или состоящим из аминокислотных последовательностей, которые являются производными эндогенных природных полипептидных фрагментов ААК8, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные фрагменты, и способам их применения. Указанные и родственные варианты реализации изобретения могут быть получены или идентифицированы ΐη νΐνο, ех νΐνο и/или ΐη νίΐτο. Согласно конкретным предпочтительным вариантам реализации изобретения ίη νίΐτο получают или идентифицируют протеолитические фрагменты ААК8 путем инкубирования полипептида ААК8, такого как полноразмерный полипептид ААК8, с одной или более изолированными человеческими протеазами, главным образом, эндогенными для человека или природными протеазами, такими как эластаза и другие, описанные в настоящем изобретении и известные в данной области техники. Другие варианты реализации изобретения относятся к изолированным полипептидам ААК8, содержащим, по существу состоящим из или состоящим из аминокислотных последовательностей, которые являются производными эндогенных природных сплайс-вариантов ААК8, и фармацевтическим композициям, содержащим указанные фрагменты, и способам их применения. По существу, белковый фрагмент ААК8 может быть изолирован из образцов, которые подвергали действию протеаз, ίη νΐνο или ίη νίΐτο.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения белковые фрагменты ААК8 могут быть идентифицированы с помощью методов, таких как масс-спектрометрия или эквивалентные методы. Исключительно в качестве иллюстрации, но не ограничения, согласно конкретным вариантам реализации изобретения тотальные белки из различных типов клеток, тканей или жидкостей организма в различных физиологических состояниях (например, гипоксия, диета, возраст, заболевание) или их фракции могут быть разделены с помощью одномерного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, и гелевые дорожки могут быть нарезаны на полосы с фиксированными интервалами; после чего указанные полосы могут быть необязательно расщеплены соответствующей протеазой, такой как трипсин, для высвобождения пептидов, которые затем можно анализировать с помощью одномерной обращеннофазовой ЖХ/МС/МС. Полученные данные протеомного анализа можно вводить в так называемые пептографы, которые наносят на график, в левой панели, частоту встречаемости последовательности для конкретного белка в горизонтальном направлении (от Ν-конца к С-концу, слева направо) в зависимости от перемещения в процессе электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальном направлении (от больших к маленьким молекулярным массам, сверху вниз). Конкретные пептидные фрагменты могут затем быть секвенированы или картированы. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения эталонный фрагмент ААК8 может характеризоваться уникальной молекулярной массой, по сравнению, например, с молекулярной массой соответствующего полноразмерного ААК8.

Как отмечено выше, варианты реализации настоящего изобретения включают полипептиды ААК8, представленные в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9. Также включены варианты эталонных полипептидов ААК8. Термин вариант полипептида относится к полипептидам, которые отличаются от эталонного полипептида ААК8 в результате добавления, делеции и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, и которые, как правило, сохраняют (например, имитируют) или модулируют (например, проявляют антагонизм) один или более видов неканонической активности эталонного полипептида ААК8.

Кроме того, человеческие гистидил-тРНК-синтетазы включают несколько сотен высоко родственных полиморфных форм и указанные формы, как известно в данной области техники, являются, по меньшей мере, частично функционально взаимозаменимыми. Таким образом, выбор природного варианта гистидил-тРНК-синтетазы является обычной задачей, включая, например, однонуклеотидные полиморфные формы, перечисленные в табл. А, для создания полипептида ААК8, содержащего одно или более аминокислотные изменений, на основе последовательности любого из гомологов, ортологов и природных изоформ человека, также как и других видов гистидил-тРНК-синтетазы.

Таблица А

Однонуклеотидные полиморфные формы (8ΝΡ) человеческих гистидил-тРНК -синтетаз

Код доступа СепеВапк	Замена нуклеотида
гз78741041	С/Т
гз347908б4	С/С
гз34732372	С/Т
гз11548125	А/С
гз11548124	С/С

- 29 030418

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариант полипептида отличается от эталонного полипептида одной или более заменами, которые могут быть консервативными или не консервативными, как описано в настоящем изобретении и известно в данной области техники. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариант полипептида содержит консервативные замены, при этом, совершенно очевидно в данной области техники, что некоторые аминокислоты могут быть заменены на другие, в целом обладающие такими же свойствами, без изменения природы активности полипептида.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариантный полипептид содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или более идентичную или подобную по последовательности соответствующей эталонной последовательности полипептида ΑΑΚδ, описанного в настоящем изобретении, и по существу сохраняет неканоническую активность указанного эталонного полипептида. Также включены последовательности, отличающиеся от эталонной последовательности ΑΑΚδ в результате добавления, делеции или замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или более аминокислот, но сохраняющие свойства эталонного полипептида ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения добавления или делеции аминокислот происходят на С-конце и/или Ν-конце эталонного полипептида ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения присоединения аминокислот включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более остатков дикого типа (т.е. от соответствующего полноразмерного полипептида ΑΑΚδ), которые являются наиболее приближенными к С-концу и/или Ν-концу эталонного полипептида ΑΑΚδ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариантные полипептиды отличаются от соответствующей эталонной последовательности ΑΑΚδ по меньшей мере на 1%, но менее чем на 20, 15, 10 или 5% по остаткам. (Если указанное сравнение требует выравнивания, то последовательности следует выравнивать с обеспечением максимального подобия. Выпетленные последовательности в результате делеции или вставки или несовпадений считаются различиями). Различия предпочтительно представляют собой различия или изменения в заменимых остатках или консервативную замену. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения молекулярная масса варианта полипептида ΑΑΚδ отличается от молекулярной массы эталонного полипептида ΑΑΚδ примерно на 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20% или более.

- 30 030418

Также предложены биологически активные фрагменты эталонных полипептидов ААК8, т.е. биологически активные фрагменты белковых фрагментов ААК8. Типичные биологически активные фрагменты в целом принимают участие во взаимодействии, например, внутримолекулярном или межмолекулярном взаимодействии. Межмолекулярное взаимодействие может представлять собой специфическое связывание или ферментативное взаимодействие. Межмолекулярное взаимодействие может представлять собой взаимодействие между полипептидом ААК8 и клеточным партнером по связыванию, таким как клеточный рецептор или другие хозяйские молекулы, которые принимают участие в неканонической активности полипептида ААК8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения белки ААК8, их варианты и биологически активные фрагменты, связываются с одним или более клеточными партнерами связывании с аффинностью, составляющей по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 или 50 нМ. Аффинность связывания белкового фрагмента ААК8 с выбранным клеточным партнером по связыванию, в частности, партнером по связыванию, который принимает участие в неканонической активности, как правило, сильнее, чем аффинность белкового фрагмента ААК8 к соответствующему полноразмерному полипептиду ААК8 по меньшей мере примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз (включая все целые числа между указанными). Аффинность связывания белкового фрагмента ААК8 с партнером по связыванию, который принимает участие по меньшей мере в одной традиционной активности ААК8, как правило, меньше аффинности указанного белкового фрагмента ААК8 к соответствующему полноразмерному полипептиду ААК8 по меньшей мере примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз.

Как правило, биологически активные фрагменты включают домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью эталонного полипептида ААК8, и могут включать один или более (и в некоторых случаях все) из различных активных доменов и включают фрагменты, обладающие неканонической активностью. В некоторых случаях, биологически активные фрагменты полипептида ААК8 обладают биологической активностью, которая является уникальной для конкретного укороченного фрагмента, при этом полноразмерный полипептид ААК8 может не обладать указанной активностью. В конкретных случаях, биологическая активность может быть раскрыта путем отделения биологически активного фрагмента полипептида ААК8 от других последовательностей полноразмерного полипептида ААК8 или путем изменения конкретных остатков последовательности полноразмерного полипептида ААК8 дикого типа для открытия биологически активных доменов.

Биологически активный фрагмент эталонного полипептида ААК8 может представлять собой полипептидный фрагмент, который состоит, например, из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 или более заменимых или незаменимых аминокислот, включая все целые числа (например, 101, 102, 103) и диапазоны (например, 50-100, 50-150, 50-200) между ними, аминокислотных последовательностей, описанных для любого из эталонных полипептидов ААК8, описанных в настоящем изобретении, но, как правило, за исключением полноразмерной ААК8. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения биологически активный фрагмент содержит связанную с неканонической активностью последовательность, домен или мотив. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения С-концевой или Ν-концевой участок любого эталонного полипептида ААК8 может быть укорочен примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 или более аминокислот или примерно на 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650700 или более аминокислот, включая все целые числа и диапазоны между ними (например, 101, 102, 103, 104, 105), при условии, что укороченный полипептид ААК8 сохраняет неканоническую активность эталонного полипептида. Как правило, биологически активный фрагмент обладает не меньше примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 25% или примерно 50% активности (т.е. неканонической активности) биологически активного эталонного полипептида ААК8, из которого он произошел. Примеры способов оценки указанных неканонических видов активности описаны в примерах.

Как отмечено выше, полипептид ААК8 может быть изменен различными путями, включая аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки. Методы таких манипуляций в целом известны в данной области техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей эталонного полипептида ААК8 могут быть получены путем введения мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменения нуклеотидной последовательности хорошо известны в данной области техники. См., например, Кипке1 (1985, Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8с1. США. 82: 488-492), Кипке1 е! а1. (1987, МеШобк ίη Еп/уток 154: 367-382), патент И8 № 4873192, Аа1коп, ί.Ό. е! а1. (Мо1еси1аг Вю1оду оГ 1ке Оепе, Роийк ЕбШоп, Веп)ат1п/Ситтш§8, Меп1о Рагк, СаИГ., 1987) и цитированные в указанных источниках ссылки. Руководство по внесению соответствующих замен аминокислот, не влияющих на биологическую активность интересующего белка, может

- 31 030418 быть найдено в модели Дэйхоффа (ЭауНоГГ е1 а1. (1978), Αί^ оГ Рго1ет δе^иеηсе апй δΙπιαιιΐΌ (№ΐ1. Вютей. Ке8. Роипй., Аа8Ыпд£оп, О.С)).

Аналогично, специалистам в данной области техники очевидно, как устранять и/или ослаблять проблему иммуногенности при ее возникновении при использовании полипептида ΑΑΚδ, например, путем применения автоматизированных программ компьютерного распознавания для идентификации потенциальных эпитопов Т-клеток и методов направленной разработки для идентификации менее иммуногенных форм.

Способы скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, созданных с помощью точечных мутаций или усечений и скрининга библиотеки кДНК на предмет генных продуктов, имеющих выбранное свойство, известны в данной области техники. Указанные способы можно адаптировать для быстрого скрининга генной библиотеки, созданной с помощью комбинаторного мутагенеза полипептидов ΑΑΚδ. Рекурсивный множественный мутагенез (КЕМ), метод, который усиливает частоту возникновения функциональных мутантов в библиотеки, может применяться в комбинации со скрининговыми анализами для идентификации вариантов полипептида ΑΑΚδ (ΑΛω апй Уоигуап (1992), Ргос. Ν·ιΐ1. Αсай. δα. США 89: 7811-7815; Ое1дгауе еί а1. (1993), Рго1ет Епдшеегшд, 6: 327-331). Консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты на другую, имеющую сходные свойства, может являться желательным, как обсуждается более подробно ниже.

Биологически активные укороченные и/или вариантные полипептиды ΑΑΚδ могут содержать консервативные аминокислотные замены в различных положениях в их последовательности по сравнению с эталонным остатком аминокислоты ΑΑΚδ. Кроме того, природные варианты белков ΑΑΚδ были секвенированы, и как известно в данной области техники, являются, по меньшей мере, частично функционально взаимозаменяемыми. Таким образом, выбор положения аминокислот для введения консервативной или неконсервативной мутации в полипептид ΑΑΚδ на основании вариации природных последовательностей среди известных гомологов, ортологов и природных изоформ белков ΑΑΚδ человека, а также других видов белка ΑΑΚδ, является стандартной практикой.

Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области техники, и в целом могут быть разделены на подклассы следующим образом.

Кислые: остаток имеет отрицательный заряд из-за потери иона Н при физиологических значениях ρΗ, и указанный остаток притягивается водным раствором таким образом, что поверхностные положения спрятаны внутри конформации пептида, в котором он содержится, когда указанный пептид находится в водной среде при физиологических значениях ρΗ. Аминокислоты, содержащие кислые боковые цепи, включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту.

Основные: остаток имеет положительный заряд из-за ассоциации с ионом Η при физиологических значениях рН или в пределах одной или двух единиц от физиологического значения рН (например, гистидин) и остаток притягивается водным раствором таким образом, что поверхностные положения спрятаны внутри конформации пептида, в котором он содержится, когда указанный пептид находится в водной среде при физиологических значениях рН. Аминокислоты, имеющие основную боковую цепь, включают аргинин, лизин и гистидин.

Заряженные: остатки являются заряженными при физиологических значениях рН и, соответственно, включают аминокислоты, содержащие кислые или основные боковые цепи (т.е. глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аргинин, лизин и гистидин).

Гиброфобные: остатки являются незаряженными при физиологических значениях рН и остаток отталкивается водным раствором таким образом, что внутренние положения спрятаны внутри конформации пептида, в которой он находится в водной среде. Аминокислоты, имеющие гиброфобную боковую цепь, включают тирозин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин и триптофан.

Нейтральные/полярные: остатки не заряжены при физиологических значениях рН, но остаток недостаточно отталкивается водным раствором, таким образом, что внутренние положения спрятаны внутри конформации пептида, в которой он находится в водной среде. Аминокислоты, содержащие нейтральную/полярную боковую цепь включают аспарагин, глутамин, цистеин, гистидин, серин и треонин.

Настоящее описание также характеризует конкретные аминокислоты как малые, если их боковые цепи не достаточно большие, даже в отсутствие полярных групп, для обеспечения гидрофобности. За исключением пролина, малые аминокислоты представляют собой аминокислоты, содержащие четыре атома углерода, или менее, если по меньшей мере одна полярная группа находится на боковой цепи, и три атома углерода, или менее, если нет. Аминокислоты, содержащие малую боковую цепочку, включают глицин, серин, аланин и треонин. Кодируемая генами вторичная аминокислота пролин представляет собой исключение из-за ее известного влияния на вторичную конформацию пептидных цепей. Структура пролина отличается ото всех других природных аминокислот тем, что его боковая цепочка связана с атомом азота α-аминогруппы, также как и α-углеродом. Несколько матриц подобия аминокислот известно в данной области техники (см., например, матрицу РАМ120 и матрицу РАМ250, описанную, например, Дэйхоффом, ЭауНоГГ еί а1., 1978, Α тойе1 оГ еуо1ийопагу сйапде ш рго1ет8). Однако матрицы для

- 32 030418 определения отношений расстояния, описанные в источнике М. О. Бау^ГГ, (еб.), Αΐ^ οΓ рго1:ет зед^^е аηб зЦисШге, νοί. 5, р. 345-358, №^^1 Вютебюа1 КезеагсЬ Ροиηбаΐ^οη, ШазИтдЮн БС; и ΟοηηοΙ е! а1. ^щспсс, 256: 14430-1445, 1992), включают пролин в той же группе, что и глицин, серин, аланин и треонин. Соответственно, в целях настоящего изобретения, пролин классифицируют как малую аминокислоту.

Степень притяжения или отталкивания, необходимая для отнесения аминокислот к классу полярных или неполярных, является неоднозначной и, соответственно, аминокислоты, которые конкретно рассматриваются согласно изобретению, были классифицированы как полярные или неполярные. Большинство аминокислот, которые не имеют конкретного названия, могут быть классифицированы на основе известного поведения.

Аминокислотные остатки могут быть также разделены на подклассы как циклические или нециклические и ароматические или неароматические (очевидные классификации на основе групп-заместителей боковых цепей остатков) и как маленькие или большие. Остаток считается маленьким, если он содержит в общем четыре атома углерода, или менее, включая атом углерода карбоксила, при условии что присутствует дополнительный полярный заместитель; в противном случае - три, или менее. Маленькие остатки, безусловно, всегда являются неароматическими. В зависимости от их структурных свойств, аминокислотные остатки могут входить в состав двух или более классов. Для аминокислот природных белков разделение на подклассы в соответствии с указанной схемой показано в табл. В.

ТаблицаВ

Подклассы аминокислот

Подклассы	Аминокислоты
Кислые	Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота
Основные	Нециклические: аргинин, лизин; Циклические: гистидин
Заряженные	Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аргинин, лизин, гистидин
Малые	Глицин, серин, аланин, треонин, пролин
Полярные/ нейтральные	Аспарагин, гистидин, глутамин, цистеин, серин, треонин
Полярные/ большие	Аспарагин, глутамин
Гидрофобные	тирозин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан
Ароматические	Триптофан, тирозин, фенилаланин
Остатки, влияющие на ориентацию цепи	Глицин и пролин

Консервативная замена аминокислот также включает образование групп на основе боковых цепей. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, включает глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, включает серин и треонин; группа аминокислот, содержащих амидные боковые цепи, включает аспарагин и глутамин; группа аминокислот, содержащих ароматические боковые цепи, включает фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, содержащих основные боковые цепи, включает лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, содержащих боковые цепи, включающие серу, представляет собой цистеин и метионин. Например, имеются основания ожидать, что замещение лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или подобное замещение аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет оказывать значительное влияние на свойства полученного в результате варианта полипептида. Приводит ли изменение аминокислот к образованию функционально укороченного и/или вариантного полипептида ΑΑΚδ, можно с легкостью определить путем анализа его неканонической активности, как описано в настоящем изобретении. Консервативные замены показаны в табл. С под заголовком Примеры замен. Аминокислотные замены в пределах объема изобретения в целом осуществляются путем выбора замен, которые значительно не отличаются по их влиянию на поддержание (а) структуры скелета пептида в области замены, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в области-мишени, (с) объема боковой цепи или (б) биологической функции. После введения замен варианты подвергали скринингу на предмет биологической активности.

- 33 030418

Таблица С

Примеры аминокислотных замен

Исходный остаток	Примеры замен	Предпочтительные замены
А1а	Уа1, Ьеи, 11е	УаЬ
Агд	Ьуз, 61п, Азп	Ьуз
Азп	61п, НЬз, Ьуз, Агд	СЬп
Азр	СЬи	СЬи
Суз	Зег	Зег
С1п	Азп, НЬз, Ьуз,	Азп
С1и	Азр, Ьуз	Азр
61у	Рго	Рго
ΗΪ3	Азп, 61п, Ьуз, Агд	Агд
Не	Ьеи, УаЬ, МеЬ, А1а, РЬе, ЫогЬеи	Ьеи
Ьеи	ЫогЬеи, 11е, УаЬ, МеЬ, А1а, РЬе	ЬЬе
Ьуз	Агд, 61п, Азп	Агд
МеЬ	Ьеи, 11е, РЬе	Ьеи
РЬе	Ьеи, УаЬ, 11е, А1а	Ьеи
Рго	61у	61у
Зег	ТЬг	ТЬг
ТЬг	Зег	Зег
Тгр	Туг	Туг
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, Зег	РЬе
Уа1	11е, Ьеи, МеЬ, РЬе, А1а, ЫогЬеи	Ьеи

В альтернативном варианте подобные аминокислоты для создания консервативных замен могут быть разделены на три категории на основе идентичности боковых цепей. Первая группа включает глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аргинин, лизин, гистидин, все из которых имеют заряженные боковые цепи; вторая группа включает глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, глутамин, аспарагин; и третья группа включает лейцин, изолейцин, валин, аланин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, как описано в источнике 2иЬау, С., ВюсЬет1§1гу, 1Ыгб ебШоп, Ат. С. Вго^п РиЬНзЬегк (1993).

Таким образом, предсказанные заменимые аминокислотные остатки в укороченном и/или вариантном полипептиде ААК8, как правило, заменяются на другой аминокислотный остаток из того же семейства боковых цепей. В альтернативном варианте могут быть введены случайные мутации по всей или части кодирующей последовательности ААК8, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут подвергаться скринингу на предмет видов активности исходного полипептида для идентификации мутантов, которые сохраняют указанные активности. После мутагенеза кодирующей последовательности, закодированный пептид можно экспрессировать рекомбинантным путем и можно определить активности пептида. Заменимые аминокислотные остатки представляют собой остатки, которые могут быть измененными по сравнению с эталонной последовательностью полипептида согласно варианту реализации изобретения без устранения или существенного изменения одной или более видов активности. Соответствующее изменение по существу не устраняет один из указанных видов активности, например, активность по меньшей мере составляет 20, 40, 60, 70 или 80, 100, 500, 1000% или более от активности эталонной последовательности ААК8. Незаменимые аминокислотные остатки представляют собой остатки, изменение которых по сравнению с эталонной последовательностью полипептида ААК8 приводит к устранению активности исходной молекулы, например, сохраняется менее чем 20% эталонной активности. Например, указанные незаменимые аминокислотные остатки включают остатки, которые являются консервативными в полипептидах ААК8 у разных видов, включая такие последовательности, которые являются консервативными по активному сайту (сайтам) связывания или мотиву (мотивам) полипептидов ААК8 из различных источников.

В целом полипептиды и гибридные полипептиды (также как и кодирующие их полинуклеотиды) являются изолированными. Изолированный полипептид или полинуклеотид представляет собой полипептид или полинуклеотид, который был выделен из его естественного окружения. Например, природный белок является изолированным, если он отделен от некоторых или всех существующих с ним в естественной системе материалов. Предпочтительно, указанные полипептиды являются по меньшей мере примерно на 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% чистыми. Полинуклеотид считается изолированным, если, например, он был клонирован в векторе, который не является частью естественного окружения.

Конкретные варианты реализации изобретения также включают димеры полипептидов ААК8. Ди- 34 030418 меры могут включать, например, гомодимеры между двумя идентичными полипептидами ΑΑΚδ, гетеродимеры между двумя различными полипептидами ΑΑΚδ (например, полноразмерным полипептидом ΥΚδ и укороченным полипептидом ΥΚδ; укороченным полипептидом ΥΚδ и укороченным полипептидом ^Κδ), и/или гетеродимеры между полипептидом ΑΑΚδ и гетерологичным полипептидом. Конкретные гетеродимеры, такие как гетеродимеры между полипептидом ΑΑΚδ и гетерологичным полипептидом, могут являться бифункциональными, как описано в настоящем изобретении.

Также предложены мономеры полипептидов ΑΑΚδ, включая изолированные мономеры полипептидов ΑΑΚδ, которые по существу не димеризуются со вторым полипептидом ΑΑΚδ, вследствие одного или более замещения, усечения, делеции, добавления, химической модификации или комбинации указанных изменений. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения мономерные полипептиды ΑΑΚδ обладают биологическими видами активности, включая неканонические виды активности, которыми не обладают димерные или мультимерные комплексы полипептидов ΑΑΚδ.

Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения также предложено применение модифицированных полипептидов ΑΑΚδ, включая модификации, улучшающие желательные характеристики полипептида ΑΑΚδ, описанного в настоящем изобретении. Модификации полипептидов ΑΑΚδ согласно изобретению включают химическую и/или ферментативную дериватизацию одной или более составляющих их аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации скелета и модификации Ν- и С-конца, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и присоединение углеводных или липидных фрагментов, кофакторов и т.п. Типичные модификаций также включают пэгилирование полипептида ΑΑΚδ (см., например, Уегонеке апй Натк, Αάναηοοά Эгид Όβΐίνегу Ре\ае\ук 54: 453-456, 2002; и Раки! е! а1., Ехрег! Ορίηίοη. Тйег. Ра1еШк 14(6) 859-894, 2004, обе включены сюда посредством ссылки).

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой хорошо известный полимер, обладающий свойством растворимости в воде и во многих органических растворителях, отсутствием токсичности и отсутствием иммуногенности. Также он является прозрачным, бесцветным, не имеет запаха и является химически стабильным. По этим и другим причинам ПЭГ был выбран в качестве предпочтительного полимера для присоединения и использовался исключительно в целях иллюстрации, а не в качестве ограничения. Подобные продукты могут быть получены при использовании других растворимых в воде полимеров, включая, но не ограничиваются ими; поливинилспирт, другие поли(алкиленоксиды), такие как поли(пропиленгликоль) и т.п., поли(оксиэтилированные полиолы), такие как поли(оксиэтилированный глицерин) и т. п., карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, этилен/малеиновый ангидрид и полиаминокислоты. Специалисты в данной области техники смогут выбрать желательный полимер на основе желаемой дозы, времени циркуляции, устойчивости к протеолизу и других факторов.

В частности, многочисленные разнообразные производные ПЭГ являются доступными и подходящими для применения в получении ПЭГ-конъюгатов. Например, ПЭГ-реагенты компании ΝΟΡ Согр.'к, которые продаются под торговой маркой δυΝΒΚΙΟΗΤ® δе^^е5, предлагают множество ПЭГпроизводных, включая метоксиполиэтиленгликоли и активированные производные ПЭГ, такие как метокси-ПЭГ амины, малеимиды, сложные эфиры Ν-гидроксисукцинамида и карбоновые кислоты, для сочетания с помощью различных способов с Ν-концевой, С-концевой или любой внутренней аминокислотой полипептида ΑΑΚδ. Улучшенная технология пэгилирования №к!аг Тйегареийск' также предлагает различные технологии ПЭГ-присоединения для потенциального улучшения безопасности и эффективности терапевтических средств на основе полипептида ΑΑΚδ.

Поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных заявок также позволит специалистам в данной области техники рассмотреть настоящее изобретение с учетом возможных значительных технологий ПЭГ-сочетания и ПЭГ-производных. Например, патенты США № 6436386; 5932462; 5900461; 5824784 и 4904584, содержание которых полностью включено посредством ссылки, описывают указанные технологи и производные и способы для их получения.

Согласно конкретным аспектам изобретения для модификации полипептидов ΑΑΚδ согласно изобретению можно использовать метод хемоселективного лигирования, например, путем присоединения полимеров сайт-специфическим и контролируемым образом. Указанный метод в целом основан на включении хемоселективных якорных фрагментов в белковый каркас либо химическим, либо рекомбинантным образом, и последующей модификации с помощью полимера, содержащего комплементарный линкер. В результате процесс сборки и ковалентную структуру полученного конъюгата белок-полимер можно контролировать, обеспечивая целесообразную оптимизацию свойств лекарственного средства, таких как эффективность и фармакокинетические свойства (см., например, КосйепйоегГег. Сиггеп!: Ορίηίοη ίη Сйеш1са1 Вю1оду 9:555-560, 2005).

Согласно другим вариантам реализации изобретения также предложены слитые белки полипептида ΑΑΚδ с другими белками, и указанные слитые белки могут повышать биологическую активность, секрецию, направленность, время биологической жизни, способность проникать через клеточные мембраны или гематоэнцефалический барьер или фармакокинетические свойства указанного полипептида ΑΑΚδ. Примеры слитых белков, которые улучшают фармакокинетические свойства (модификаторов фармако- 35 030418 кинетических свойств (РК)), включают, но не ограничиваются перечисленными: белки слияния с человеческим альбумином (ОкЬогп е! а1.: Еиг. I. РЬагтасо1. 456(1-3): 149-158, (2002)), Рс-доменами антитела, последовательностями поли-О1и или поли-Акр и трансферрином. Кроме того, слитые белки с конформационно измененными полипептидными последовательностями состоят из аминокислот Рго, А1а и §ег (РА§у1а!юп) или гидроксиэтилкрахмала (который продается под торговой маркой ΗЕδΥ^АТIОN®) обеспечивают простой способ повышения гидродинамического объема полипептида ААВ8. Указанное дополнительное удлинение вносит объемную рандомную структуру, которая значительно увеличивает размер полученного в результате слитого белка. Указанным способом, как правило, быстрый клиренс более маленьких полипептидов ΆΛΚδ путем почечной фильтрации замедляется на несколько порядков величины. Кроме того, также было показано, что использование гибридизованных с О белков обеспечивает проницаемость некоторых слитых белков через гематоэнцефалический барьер (Ри е! а1. (2010), Вгаш Век. 1352:208-13).

Примеры слитых белков, которые улучшают проницаемость через клеточные мембраны, включают слитые белки с последовательностями транслокации через мембрану. В указанном контексте, термин последовательности транслокации через мембрану относится к природным и синтетическим аминокислотным последовательностям, которые способны транслоцироваться через клеточную мембрану. Типичные последовательности транслокации через мембрану включают последовательности на основе природных последовательностей транслокации через мембрану, которые являются производными белка Та! и белка гомеозисной транскрипции Ап!еппарей1а, также как и синтетические последовательности, транслоцирующиеся через мембрану целиком или частично, на основе остатков полиаргинина и полилизина. Типичные последовательности транслокации через мембрану включают, например, последовательности, описанные в следующих патентах США: υδ 5652122; υδ 5670617; υδ 5674980; υδ 5747641; υδ 5804604; И8 6316003; υδ 7585834; υδ 7312244; υδ 7279502; υδ 7229961; υδ 7169814; υδ 7453011; υδ 7235695; υδ 6982351; υδ 6605115; υδ 7306784; υδ 7306783; υδ 6589503; υδ 6348185; υδ 6881825; υδ 7431915; и публикациях международных заявок: XVО 0074701 А2; XVО 2007111993 А2; XVО 2007106554 А2; АО 02069930 А1; АО 03049772 А2; АО 03106491 А2 и АО 2008063113 А1.

Необходимо понимать, что гибкий молекулярный линкер (или спейсер) необязательно ковалентно соединяет и располагается между полипептидом ААВЯ и любым из слитых белков, описанных в настоящем изобретении.

Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации изобретения полипептид ААВЯ может содержать синтетические или секретированные естественным образом сигнальные последовательности, которые являются производными других хорошо описанных секретируемых белков. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанные белки могут подвергаться процессингу путем протеолитического расщепления с образованием полипептида ААВЯ ίη κίΐιι. Указанные слитые белки включают, например, гибриды полипептида ААВЯ с убиквитином с получением новых Ν-концевых аминокислот или применения секреции сигнала для обеспечения высокого уровня секреции полипептида ААВЯ во внеклеточную среду, или Ν- или С-концевыми эпитопными метками для облегчения очистки или выявления.

Полипептиды ААВЯ, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью любого подходящего способа, известного специалистам в данной области техники, такого как рекомбинантные технологии. Кроме способов рекомбинантной продукции, полипептиды согласно изобретению могут быть получены путем прямого синтеза пептида с использованием твердофазных методов (Метйе1й, ί. Ат. СЬет. Яос. 85:2149-2154 (1963)). Синтез белка можно проводить с использованием неавтоматизированных или автоматизированных способов.

Автоматизированный синтез может осуществляться, например, с использованием пептидного синтезатора АррЬей Вюкукйтк 431А (Регкш Е1тег). В альтернативном варианте различные фрагменты могут быть синтезированы химическим путем раздельно и объединены с использованием химических способов с получением желательной молекулы.

IV. Полинуклеотиды ААВЯ.

Варианты реализации настоящего изобретения включают полинуклеотиды, которые кодируют один или более новых идентифицированных белковых фрагментов аминоацил-тРНК-синтетазы (ААВЯ), а также соответствующие комплементарные последовательности, варианты и фрагменты. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полинуклеотид ААВЯ кодирует целый или часть полипептида (полипептидов) эталонной последовательности ААВЯ, приведенной в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, которые представляют собой сплайс-варианты, протеолитические фрагменты или другие типы фрагментов гистидил-тРНК-синтетазы. Конкретные варианты реализации изобретения включают полинуклеотиды, кодирующие полипептиды или белки, которые содержат последовательность одной или более границ сплайсинга указанных сплайс-вариантов, а также соответствующие комплементарные последовательности, варианты и фрагменты. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, как правило, из-за уникальной природы выбранного сплайс-варианта ААВЯ, в котором экзоны скомбинированы новым или исключительным образом, эталонные последовательности полинуклеотида ААВЯ содержат уникальную или исключительную границу сплайсинга. Конкретные варианты реализации изобретения исключают

- 36 030418 соответствующий полноразмерный полинуклеотид ААК8.

Также полинуклеотиды ААК8 согласно настоящему изобретению включают праймеры, зонды, антисмысловые олигонуклеотиды и агенты на основе интерферирующей РНК, которые содержат целиком или частично указанные эталонные полинуклеотиды, которые являются комплементарными всему или части указанного эталонного полинуклеотида или которые специфично гибридизуются с указанными эталонными полинуклеотидами, описанными в настоящем изобретении.

Термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота в настоящем изобретении обозначает мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Термин, как правило, относится к полимерной форме нуклеотидов, состоящей по меньшей мере из 10 оснований в длину, либо к рибонуклеотидам или дезоксинуклеотидам или модифицированной форме любого типа нуклеотида. Термин включает одноцепочечные и двуцепочечные формы ДНК. Термины ДНК и полинуклеотид и нуклеиновая кислота относятся к молекуле ДНК, которая была изолирована в свободной от геномной ДНК конкретного вида форме. Таким образом, изолированный сегмент ДНК, кодирующий полипептид, относится к сегменту ДНК, который содержит одну или более кодирующих последовательностей и является при этом по существу изолированным от (или очищенным в форме, свободной от) тотальной геномной ДНК того вида, из которого указанный сегмент ДНК был получен. Также включены некодирующие полинуклеотиды (например, праймеры, зонды, олигонуклеотиды), которые не кодируют полипептид ААК8. Термины сегмент ДНК и полинуклеотид включают сегменты ДНК и более маленькие фрагменты указанных сегментов, и также рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фагмиды, фаги, вирусы и т. п.

Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не должны, присутствовать в полинуклеотиде согласно настоящему изобретению, и указанный полинуклеотид может, но не обязательно, быть связан с другими молекулами и/или поддерживающими материалами. Таким образом, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, независимо от самой длины кодирующей последовательности, могут быть комбинированы с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикции ферментом, множество сайтов клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., таким образом, что их общая длина может значительно варьировать.

Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент полинуклеотида почти любой длины; при этом общая длина предпочтительно ограничивается легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК. Включены полинуклеотиды, длина которых составляет примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 или более (включая все целые числа между ними) оснований, включая любую часть или фрагмент (например, более чем примерно 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов в длину) эталонного полинуклеотида ААК8 (например, количество оснований Х-Υ, в которых X составляет примерно 1-3000 или более и Υ составляет примерно 10-3000 или более,) или ее комплемента.

Варианты реализации настоящего изобретения также включают варианты последовательности эталонного полинуклеотида ААК8. Варианты полинуклеотида могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным полинуклеотидом. В целом вариант последовательности эталонного полинуклеотида ААК8 может являться по меньшей мере примерно на 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70%, в целом по меньшей мере примерно на 75, 80, 85%, желательно примерно от 90 до 95% или более и более предпочтительно, примерно на 98% или более идентичным конкретной нуклеотидной последовательности, по результатам определения с помощью программ выравнивания последовательностей, описанных в другой части настоящего изобретения, с использованием параметров по умолчанию. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения варианты могут отличаться от эталонной последовательности на примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (включая все целые числа между ними) или более оснований. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, например, когда вариант полинуклеотида кодирует полипептид ААК8, обладающий неканонической активностью, желаемая активность кодируемого полипептида ААК8 по существу не уменьшается по сравнению с немодифицированным полипептидом. Влияние на активность закодированного полипептида в целом можно оценивать, как описано в настоящем изобретении.

Конкретные варианты реализации изобретения включают полинуклеотиды, которые гибридизуются с последовательностью эталонного полинуклеотида ААК8 или с соответствующими комплементарными последовательностями, в условиях жесткости, описанных ниже. В настоящем изобретении термин гибридизуется в условиях низкой жесткости, средней жесткости, высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости описывает условия для гибридизации и промывки. Руководство для проведения реакций гибридизации можно найти в источнике Аи8иЬе1 еΐ а1. (1998, выше), разделах 6,3,1-6,3,6. Водные и неводные способы описаны в указанной ссылке и любые из них можно применять.

- 37 030418

Ссылка в настоящем изобретении на условия низкой жесткости включает и охватывает по меньшей мере от примерно 1% (по объему) до по меньшей мере примерно 15% (по объему) формамида, и по меньшей мере от примерно 1 М, до по меньшей мере примерно 2 М соли, для гибридизации при 42°С и по меньшей мере примерно 1 М до по меньшей мере примерно 2 М соли для промывки при 42°С. Условия низкой жесткости также могут включать 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NаНРΟ₄ (рН 7,2), 7% ДСН для гибридизации при 65°С и (ί) 2х88С, 0,1% ДСН; или (ίί) 0,5% БСА, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ NаНРΟ₄ (рН 7,2), 5% ДСН для промывки при комнатной температуре. Один вариант реализации условий низкой жесткости включает гибридизацию в 6х88С (хлорид натрия/цитрат натрия) при примерно 45°С, с последующими двумя промывками в 0,2х88С, 0,1% ДСН по меньшей мере при 50°С (температура промывок может быть повышена до 55°С для условия низкой жесткости).

Условия средней жесткости включают и охватывают от по меньшей мере примерно 16% (по объему) до по меньшей мере примерно 30% (по объему) и от по меньшей мере примерно 0,5 М до по меньшей мере примерно 0,9 М раствора соли для гибридизации при 42°С и от по меньшей мере примерно 0,1 М до по меньшей мере примерно 0,2 М раствора соли для промывки при 55°С. Условия средней жесткости также могут включать 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NаНРΟ₄ (рН 7,2), 7% ДСН для гибридизации при 65°С и (ί) 2х88С, 0,1% ДСН; или (ίί) 0,5% БСА, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ NаНРΟ4 (рН 7,2), 5% ДСН для промывки при 60-65°С. Один вариант реализации условий средней жесткости включает гибридизацию в 6х88С при примерно 45°С, с последующей одной или более промывками в 0,2х88С, 0,1% ДСН при 60°С. Условия высокой жесткости включают и охватывают от по меньшей мере примерно 31% (по объему) до по меньшей мере примерно 50% (по объему) формамида и от примерно 0,01 М до примерно 0,15 М раствора соли для гибридизации при 42°С и примерно 0,01 М до примерно 0,02 М раствора соли для промывки при 55°С.

Условия высокой жесткости также могут включать 1% БСА, 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NаНРΟ₄ (рН 7,2), 7% ДСН для гибридизации при 65°С и (ί) 0,2х88С, 0,1% ДСН; или (ίί) 0,5% БСА, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ NаНРΟ₄ (рН 7,2), 1 % ДСН для промывки при температуре выше 65°С. Один вариант реализации условий высокой жесткости включает гибридизацию в 6х88С при примерно 45°С, с последующей одной или более промывкой в 0,2х88С, 0,1% ДСН при 65°С. Один вариант реализации условий очень высокой жесткости включает гибридизацию в 0,5 М растворе фосфата натрия, 7% ДСН при 65°С, с последующей одной или более промывкой в 0,2х88С, 1% ДСН при 65°С.

Другие условия жесткости хорошо известны в данной области техники, и специалисту в данной области техники ясно, что различные факторы можно регулировать для оптимизации специфичности гибридизации. Оптимизация жесткости конечных промывок может осуществляться для обеспечения высокой степени гибридизации. Подробные примеры см. в источниках АикиЬе1 е1 а1., выше, стр. 2.10.12.10.16, и ЗатЬгоок е1 а1. (1989, выше) в разделах 1.101-1.104.

Тогда как жесткие отмывки, как правило, осуществляют при температурах от примерно 42°С до 68°С, специалистам в данной области техники очевидно, что другие температуры могут являться подходящими для жестких условий. Максимальная скорость гибридизации, как правило, происходит при температуре, примерно на 20-25°С ниже Тт, для образования гибрида ДНК-ДНК. Хорошо известно в данной области техники, что Т_т представляет собой температуру плавления или температуру, при которой две комплементарные полинуклеотидные последовательности диссоциируют. Способы оценки Т_т хорошо известны в данной области техники (см. АикиЬе1 е1 а1., выше, с. 2.10.8).

В целом Т_т идеального совпадающего дуплекса ДНК можно предсказать приближенно с помощью формулы: Т_т=81,5 + 16,6 (1од_!0 М) + 0,41 (%О+С) - 0,63 (% формамид) - (600/длина), где М представляет собой концентрацию №+, предпочтительно в диапазоне от 0,01 М до 0,4 М; %О+С представляет собой процент суммы оснований гуанозина и цитозина от общего числа оснований, в диапазоне между 30% и 75% О+С;% формамид представляет собой процентную концентрацию формамида по объему; длина представляет собой число пар оснований в ДНК-дуплексе. Тт дуплекса ДНК снижается приблизительно на 1°С с каждым повышением на 1% количества случайных несовпадений пар оснований. Отмывку в целом осуществляют при Т_т 15°С для условий высокой жесткости или Т_т 30°С для условий средней жесткости.

В одном примере способа гибридизации мембрану (например, нитроцеллюлозную мембрану или нейлоновую мембрану), содержащую иммобилизованную ДНК, гибридизовали в течение ночи при 42°С в буфере для гибридизации (50% деионизированный формамид, 5х§§С, 5хРаствор Денхардта (0,1% фиколл, 0,1% поливинилпирролидон и 0,1% бычий сывороточный альбумин), 0,1% ДСН и 200 мг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых), содержащую меченый зонд. Затем мембрану подвергали двум последовательным отмывкам средней жесткости (т.е. 2х§§С, 0,1% ДСН в течение 15 мин при 45°С, с последующей 2х§§С, 0,1% ДСН в течение 15 мин при 50°С), с последующими двумя последовательными отмывками высокой жесткости (т.е. 0,2х§§С, 0,1% ДСН в течение 12 мин при 55°С с последующей 0,2х§§С и 0,1% раствора ДСН в течение 12 мин при 65-68°С).

Как отмечено выше, конкретные варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидам ААК§, которые кодируют полипептид ААК§. Среди других применений, указанные варианты реализа- 38 030418 ции изобретения можно использовать для рекомбинантной продукции желательного полипептида ΑΑΚδ или его варианта или для экспрессии полипептида ΑΑΚδ в выбранной клетке или субъекте. Специалистам в данной области техники очевидно, что из-за вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, описанный в настоящем изобретении. Некоторые из указанных полинуклеотидов могут иметь минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые различаются из-за различий в частоте использования кодонов, конкретно рассматриваются согласно настоящему изобретению, например, полинуклеотиды, которые оптимизированы для выбора кодона человека и/или примата.

Таким образом, множество полинуклеотидов может кодировать полипептиды ΑΑΚδ согласно изобретению. Более того, полинуклеотидные последовательности можно обрабатывать в различных целях. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными: встраивание предпочтительных кодонов для усиления экспрессии полинуклеотида в различных организмах (см., в целом №катига е1 а1., Кис. ΑΟ6. ^з. (2000), 28 (1): 292). Кроме того, молчащие мутации можно встраивать для введения или устранения сайтов рестрикции, снижения плотности динуклеотидных мотивов СрО (см., например, Катеба е1 а1., ВюсЬет. ВюрЬуз. Щз. Сетти. (2006), 349(4): 1269-1277) или снижения способности одноцепочечной последовательности формировать структуры типа стебель-петля: (см., например, йикег Μ., Νικ1. ΑΟ6 Щз. (2003); 31(13): 3406-3415). Кроме того, экспрессию у млекопитающих можно также оптимизировать путем включения консенсусной последовательности Козака (Κο/ак) [т.е. (а/д)сс(а/д)ссΑТΟд] в стартовый кодон. Консенсусные последовательности Козака, применимые в указанных целях, известны в данной области техники (МайуЬ е1 а1. ΡΝΑδ 92: 2662-2666 (1995); МайуЬ е1 а1., Рго1. Ехр. & РипГ. 6, 124 (1995)).

Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, независимо от длины самой кодирующей последовательности, можно комбинировать с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикции ферментами, множество сайтов клонирования, другие кодирующие сегменты и т. п., таким образом, что их общая длина может значительно варьировать. Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент полинуклеотида почти любой длины; при этом общая длина предпочтительно ограничивается легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК.

Полинуклеотиды и их гибриды можно получать, обрабатывать и/или экспрессировать с использованием любого из различных общепринятых методов, известных и доступных в данной области техники. Например, полинуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды согласно изобретению или слитые белки или их функциональные эквиваленты, можно применять в рекомбинантных молекулах ДНК для направления экспрессии полипептида ΑΑΚδ в соответствующих клетках хозяина. Из-за присущей генетическому коду вырожденности могут быть получены другие ДНК последовательности, которые кодируют по существу такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и указанные последовательности можно применять для клонирования и экспрессии конкретного полипептида.

Специалистам в данной области техники очевидно, что может быть предпочтительным в некоторых примерах получать кодирующие полипептид нуклеотидные последовательности, имеющие неприродные кодоны. Например, кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина могут быть выбраны для повышения скорости экспрессии белка или для продукции рекомбинантного РНК-транскрипта, имеющего желаемые свойства, такие как время полужизни, которое больше по сравнению с транскприптом, полученным из природной последовательности. Указанные полинуклеотиды обычно называют кодон-оптимизированные. Любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем изобретении, можно использовать в кодон-оптимизированной форме. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полинуклеотид может быть кодон-оптимизированным для использования в специфических бактериях, таких как Е.тоЬ, или дрожжах, таких как δ. сеге\аз1ае (см., например, ВигдеззВго\уп е1 а1., РЮсш Ехрг РипГ. 59:94-102, 2008; Е^тοίаеνа ΜΌ (2001), Сигг. 1зз. Μο1. Вю1. 3(4) 91-7; \Уе1сЬ с1 а1., ΙΊ.οδ ΟΝΞ 4(9): е7007 бο^:10.1371/^οитаί.рοηе.0007002).

Более того, полинуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению могут быть сконструированы с использованием способов, в целом известных в данной области техники, для изменения кодирующих полипептидных последовательностей в различных целях, включая, но не ограничиваясь перечисленными: изменения, которые приводят к модификации клонирования, процессинга, экспрессии и/или активности генного продукта.

В соответствии с другим аспектом изобретения, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды согласно изобретению можно доставлять субъекту ίη νίνο, например, с использованием методов генной терапии. Генная терапия в целом относится к переносу гетерологичных нуклеиновых кислот в конкретные клетки, клетки-мишени млекопитающего, в частности, человека, страдающего нарушением или состоянием, для лечения которого требуется указанная терапия. Нуклеиновая кислота вводится в выбранные клетки-мишени таким образом, что экспрессируется гетерологичная ДНК, и таким образом, продуцируется закодированный терапевтический продукт.

Различные вирусные векторы, которые можно применять для генной терапии, как описано в на- 39 030418 стоящем изобретении, включают аденовирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы, аденоассоциированный вирус (ΑΑν), или, предпочтительно, РНК-вирус, такой как ретровирус. Предпочтительно, ретровирусный вектор представляет собой производное ретровируса мышей или птиц или представляет собой лентивирусный вектор. Предпочтительный ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Примеры ретровирусных векторов, в которые может быть встроен один чужеродный ген, включают, но не ограничиваются ими: вирус мышиного лейкоза Молони (МоМиЬ'У), вирус саркомы мышей Харви (ΗаМиδV), вирус мышиной опухоли молочной железы (МиМТ'У), вирус иммунодефицита обезьян (δίν), бычий вирус иммунодефицита (Βίν), вирус иммунодефицита человека (НIV) и вирус саркомы Рауса (Κδν). Ряд дополнительных ретровирусных векторов может включать множество генов. Все из указанных векторов могут переносить или встраивать ген селективного маркера, таким образом, что указанные трансдуцированные клетки могут быть идентифицированы и генерированы. Мишеньспецифичный вектор может быть создан, например, путем встраивания интересующей последовательности полипептида, связывающегося с помощью цинкового пальца с ДНК, в вирусный вектор, наряду с другим геном, кодирующим лиганд рецептора специфической клетки-мишени. Могут быть созданы мишень-специфичные ретровирусные векторы путем встраивания, например, полинуклеотида, кодирующего белок (димер). В качестве примера, направленность можно осуществлять путем использования антитела для направленности на ретровирусный вектор. Специалистам в данной области техники известно, или же они могут с легкостью определить без излишней экспериментальной работы, специфические полинуклеотидные последовательности, которые могут быть встроены в ретровирусный геном для обеспечения мишень-специфической доставки ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид белка, связывающегося с нуклеотидом, имеющим цинковый палец.

Поскольку рекомбинантные ретровирусы являются дефектными, они требуют помощи для продукции инфекционных векторных частиц. Указанная помощь может быть обеспечена, например, путем использования хелперных клеточных линий, которые содержат плазмиды, кодирующие все структурные гены ретровируса под контролем регуляторных последовательностей внутри ΕΊΚ. Указанные плазмиды лишены нуклеотидной последовательности, которая обеспечивает механизм упаковки для распознавания РНК-транскрипта для инкапсулирования. Хелперные клеточные линии, которые имеют делеции сигнала упаковки, включают, но не ограничиваются перечисленными: ΡδΙ.2, РА317 и РА12, например. Указанные клеточные линии продуцируют пустые вирионы, так как никакой геном не упаковывается. Если ретровирусный вектор вводится в такую клетку, в которой сигнал упаковки является интактным, но структурные гены не замещены другими интересующими генами, вектор может быть упакован, и векторный вирион продуцируется. Векторные вирионы, продуцированные указанным способом, могут затем использоваться для инфицирования тканевой клеточной линии, такой как клетки №Н 3Т3, для продукции больших количеств гибридных ретровирусных вирионов.

Для генной терапии также можно применять методы невирусной доставки, включая, например, комплексы ДНК-лиганд, комплексы аденовирус-лиганд-ДНК, непосредственную инъекцию ДНК, преципитацию СаРО₄, методы генной пушки, электропорацию, липосомы, липофекцию и т.п. Любой из указанных способов хорошо доступен специалистам в данной области техники и является подходящим для применения согласно настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники доступны другие подходящие способы, и необходимо понимать, что настоящее изобретение можно осуществлять с использованием любого из доступных способов трансфекции. Липофекцию можно осуществлять путем инкапсулирования изолированной молекулы ДНК в липосомную частицу и приведения указанной липосомной частицы во взаимодействие с клеточной мембраной клетки-мишени. Липосомы представляют собой самособирающиеся коллоидные частицы, в которых липидный бислой, состоящий из амфифильных молекул, таких как фосфатидилсерин или фосфатидилхолин, инкапсулирует часть окружающей среды, например, липидный бислой окружает гидрофильную внутреннюю часть. Могут быть сконструированы униламеллярные и мультиламеллярные липосомы таким образом, что внутренняя часть содержит желаемое химическое соединение, лекарственное средство или, как в примере изобретения, изолированную молекулу ДНК.

Согласно другому аспекту, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды согласно изобретению, можно применять для экспрессии и доставки полипептида ΑΑΚδ в рамках клеточной терапии. Соответственно, согласно другому аспекту, настоящее изобретение включает клеточную терапию для лечения заболевания или нарушения, включающую введение хозяйских клеток, экспрессирующих или способных экспрессировать полипептид ΑΑΚδ.

Клеточная терапия включает введение клеток, которые были селектированы, размножены и фармакологически обработаны или изменены (т.е. генетически модифицированы) вне организма (ВогЛдпоп, С. еί а1., Се11 ТНегару: ΑсН^еνетеηί8 апй Рег8ресйуе8 (1999), Наетай1одюа, 84, рр.1110-1149). Указанные клетки-хозяева включают, например, первичные клетки, включая макрофаги и стволовые клетки, которые были генетически модифицированы для экспрессии полипептида ΑΑΚδ. Целью клеточной терапии является замещение, восстановление или усиление биологической функции поврежденных тканей или органов.

Применение трансплантированных клеток исследовали для лечения различных эндокринных нару- 40 030418 шений, таких как анемия и карликовость, гематологических нарушений, почечной и печеночной недостаточности, недостаточности гипофиза и ЦНС и сахарного диабета (И1ийад е! а1., Тес1ию1оду о£ Матта1ί;·ιη Се11 Εηсаρδи1а!^οη (2000), Αάνаηсеά Эгид ОеПуегу Ееу1е\У5. 42, ρ. 29-64). Трансплантированные клетки могут функционировать путем высвобождения биоактивных соединений, таких как полипептид ΑΑΚδ согласно изобретению, для замещения эндогенных полипептидов ΑΑΚδ, которые отсутствуют или продуцируются в недостаточном количестве в поврежденной системе.

Варианты реализации настоящего изобретения также включают олигонуклеотиды для детектирования, амплификации, терапии с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, или для других целей. Для указанных и связанных целей, предполагается, что термин олигонуклеотид или олиго или олигомер включает единственный олигонуклеотид, а также множество олигонуклеотидов, и относится к любому полимеру, состоящему из двух или более нуклеотидов, нуклеозидов, нуклеотидных оснований или родственных соединений, используемых в качестве реагента в способах амплификации согласно настоящему изобретению, а также последующих способах выявления.

Олигонуклеотид может представлять собой ДНК и/или РНК и/или их аналоги.

Термин олигонуклеотид не обязательно обозначает любую конкретную функцию реагента, вместо этого он используется как общий термин для всех таких реагентов, которые описаны в настоящем изобретении. Олигонуклеотид может иметь различные функции, например, он может действовать как праймер, если он способен гибридизоваться с комплементарной цепочкой и может также быть удлинен в присутствии полимеразы нуклеиновых кислот, указанный олигонуклеотид может обеспечивать промотор, если он содержит последовательность, распознающуюся РНК-полимеразой, и позволяет транскрипцию, он может функционировать для предотвращения гибридизации или препятствовать удлинению праймера, если расположен и/или модифицирован соответствующим образом. Оигонуклеотид также может действовать в качестве зонда или антисмыслового агента. Олигонуклеотид может быть фактически любой длины, которая ограничивается только его специфической функцией, например, в реакции амплификации, в выявлении продукта реакции амплификации или при применении в качестве антисмыслового агента или РНК-интерферирующего агента. Любой из олигонуклеотидов, описанных в настоящем изобретении, может использоваться в качестве праймера, зонда, антисмыслового олигомера или агента на основе интерферирующей РНК.

Термин праймер в настоящем изобретении относится к одноцепочечному олигонуклеотиду, способному действовать как точка инициации для зависимого от матрицы синтеза ДНК в подходящих условиях, определяемых, например, буфером и температурой, в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и агентов для полимеризации, таких как ДНК- или РНК-полимераза или обратная транскриптаза. Длина праймера, в любом конкретном случае, зависит, например, от предполагаемого применения праймера и в целом лежит в диапазоне от примерно 15 до 30 нуклеотидов, хотя можно применять более короткие и более длинные праймеры. Молекулы коротких праймеров в целом требуют более холодных температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Праймер не должен отображать точную последовательность матрицы, но должен быть достаточно комплементарным для гибридизаци с указанной матрицей. Сайт праймера представляет собой участок матрицы, с которым праймер гибридизуется. Пара праймеров представляет собой набор праймеров, включая расположенный выше в направлении 5' праймер, который гибридизуется с 5'-концом последовательности, которую предполагается амплифицировать, и расположенный ниже в направлении 3' праймер, который гибридизуется с комплементом 3'-концом последовательности, которую предполагается амплифицировать.

Термин зонд в настоящем изобретении включает иммобилизованную на поверхности или растворимую, но способную быть иммобилизованной, молекулу, которая может быть распознана конкретной мишенью. См., например, патент США № 6582908 для примера чипов, имеющих все возможные комбинации зондов с 10, 12 и более основаниями. Зонды и праймеры в настоящем изобретении, как правило, содержат по меньшей мере 10-15 заменимых нуклеотидов известной последовательности. Для повышения специфичности также можно применять более длинные зонды и праймеры, такие как зонды и праймеры, которые содержат по меньшей мере 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или по меньшей мере 150 нуклеотидов эталонной последовательности ΑΑΚδ или ее комплемента. Зонды и праймеры могут быть значительно длиннее, чем указанные примеры, и необходимо понимать, что может использоваться любая длина, в соответствии с уровнем техники и настоящей заявкой, включая таблицы, фигуры и перечень последовательностей.

Способы для получения и использования зондов и праймеров описаны в ссылках, например, δатЬгоок, I. е! а1. (1989), Мо1еси1аг С1оп1п§: Α ЬаЬога!огу Маша1, 2.δυρ.ηά еД., νο1. 1-3, Со1Д δρήη§ НагЬог Рге88, Р1ату1е\у Ν.Υ.; Ли8иЬе1, Р. М. е! а1. (1987), СиггеШ Рго!осо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Стене РиЬ1. Αδ8ос. & Α^1еу-Iη!е^δс^еηсеδ, №\у ΥοιΊ< Ν.Υ.; Ιηηίδ, М. е! а1. (1990), РСк Рго!осок. Α СиШе !о Ме!коЙ8 ;·ιηά Αρρ1^саΐ^οηδ, Αсаάет^с Рге88, Сан-Диего, Калифорния. Пары праймеров для ПЦР могут представлять собой пары, которые были получены из известной последовательности, например, путем использования компьютерных программ, предполагаемых для указанных целей, таких как Рптег (версия 0,5, 1991, Институт биохимических исследований Уайтхэда, Кембридж, Масачусетс).

- 41 030418

Олигонуклеотиды для использования в качестве праймеров или зондов могут быть выбраны с использованием программ, известных в данной области техники. Например, программа ОЬЮО 4,06 применима для выбора пар праймеров для ПЦР, каждый из которых содержит вплоть до 100 нуклеотидов, и для анализа олигонуклеотидов и более больших полинуклеотидов, содержащих вплоть до 5000 нуклеотидов, из вводимой полинуклеотидной последовательности, содержащей вплоть до 32 тысяч пар нуклеотидов. Подобные программы для выбора праймеров включают дополнительные признаки для расширенных возможностей. Например, программа для выбора праймеров РптОи (общедоступная из Центра изучения генома Юго-Западного Медицинского Центра Техасского Университета, Даллас, Техас) способна выбирать специфические праймеры из мегабазных последовательностей и, таким образом, применима для создания праймеров в масштабе полного генома.

Программа для выбора праймеров Рптег3 (общедоступная в Центре исследования генома Института Уайтхэда/Массачусетского технического института, Кэмбридж, Массачусетс) позволяет пользователю вводить библиотеку не связывающихся с праймером последовательностей, в которой пользователь выбирает избегаемые последовательности, такие как сайты связывания праймера. Программа Рптег3 применима, в частности, для выбора олигонуклеотидов для микрочипов (также может быть получен исходный код для последних двух программ для выбора праймеров из соответствующих источников и модифицирован для удовлетворения конкретным требованиям пользователя). Программа РптеОеп (общедоступная из Исследовательского центра Великобритании, Проект расшифровки генома человека, Кембридж, Великобритания) создает праймеры на основе множественного выравнивания последовательностей, таким образом, позволяя выбор праймеров, которые гибридизуются либо с наиболее консервативным, либо с наименее консервативными участками выровненной последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, указанная программа применима для идентификации как уникальных, так и консервативных фрагментов олигонуклеотидов и полинуклеотидов. Указанные фрагменты олигонуклеотидов и полинуклеотидов, идентифицированные с помощью любого из выше указанных способов выбора, применимы для использования в методах гибридизации, например, в качестве праймеров для ПЦР или секвенирования, элементов микрочипа или специфических зондов для идентификации полностью или частично комплементарных полинуклеотидов в образце нуклеиновых кислот. Способы выбора олигонуклеотидов не ограничиваются способами, описанными в настоящем изобретении.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотиды могут быть получены путем поэтапного твердофазного синтеза, с использованием способов, подробно описанных в ссылках, цитированных выше и далее, имеющих отношение к синтезу олигонуклеотидов, имеющих как незаряженные, так и катионные скелетные связи. В некоторых случаях, может быть желательным добавлять дополнительные химические фрагменты к олигонуклеотиду, например, для усиления фармакокинетики или для облегчения захвата или выявления соединения. Такой фрагмент может быть ковалентно связан, как правило, с концом олигомера, в соответствии со стандартными способами синтеза. Например, добавление фрагмента полиэтиленгликоля или другого гидрофильного полимера, например, полимера, содержащего 10-100 мономерных субъединиц, может применяться для повышения растворимости. Одна или более заряженных групп, например, анионных заряженных групп, таких как органические кислоты, могут усиливать клеточный захват.

Для придания олигонуклеотиду или белку способности поддаваться выявлению можно применять различные поддающиеся выявлению молекулы, такие как радиоизотопы, флуорохромы, красители, ферменты, наночастицы, хемилюминесцентные маркеры, биотин или другие мономеры, известные в данной области техники, которые могут выявляться непосредственно (например, путем облучения светом) или не непосредственно (например, путем связывания флуоресцентно меченного антитела).

Радиоизотопы представляют собой примеры поддающихся выявлению молекул, которые можно использовать согласно конкретным аспектам настоящего изобретения. Некоторые радиоизотопы можно применять в качестве поддающихся выявлению молекул для мечения нуклеотидов или белков, включая, например, ³²Р, ³³Р, ³⁵8 , ³Н и ¹²⁵1. Указанные радиоизотопы имеют различные периоды полураспада, типы распада и уровни энергии, которые могут быть оптимизированы в соответствии с требованиями конкретного протокола. Например, ³Н представляет собой низкоэнергетический излучатель, который обеспечивает низкий фоновый уровень, однако, указанное низкоэнергетическое излучение также обеспечивает длительные временные периоды для авторадиографии. Радиоактивно меченные рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды и аминокислоты являются коммерчески доступными. Доступны нуклеотиды, которые являются радиоактивно меченными по первой, или а, фосфатной группе или третьей, или γ, фосфатной группе. Например, [а-³²Р] бАТР и |',/-³²Р| бАТР являются коммерчески доступными. Кроме того, радиоактивно меченные нуклеотиды, обладающие различными специфическими видами активности, также являются коммерчески доступными и могут быть адаптированы для различных протоколовД. ругие примеры поддающихся выявлению молекул, которые можно применять для выявления олигонуклеотида, включают флуорофоры. Некоторые флуорофоры можно применять для мечения нуклеотидов, включая, например, флуоресцеин, тетраметилродамин, краситель Техак Кеб и ряд других флуорофоров (см., например, Наид1апб, НапбЬоок оГ ИиогексеШ РгоЬек - 9¹¹' Еб., 2002, Мо1ес. РгоЬек, 1пс., Еидепе

- 42 030418

0Κ; Наид1апб, ТЬе НапбЬоок: Α Ошбе !о Ииогексеп! РгоЬез апб ЬаЬеЬпд Тсскпо1од1С5-10^|Н Еб., 2005, Ιηνί!годеп, Карлсбад, Калифорния, США).

В качестве одного примера, олигонуклеотиды могут быть флуоресцентно мечены в процессе химического синтеза, так как включение аминов или тиолов во время синтеза нуклеотидов обеспечивает добавление флуорофоров. Флуоресцентно меченные нуклеотиды являются коммерчески доступными. Например, доступны уридин- и дезоксиуридинтрифосфаты, конъюгированные с десятью различными флуорофорами, которые охватывают весь цветовой спектр. Флуоресцентные красители, которые могут быть связаны непосредственно с нуклеотидами, также можно применять в качестве поддающихся выявлению молекул. Например, красители ΡΑΜ, ГОЕ, ΤΑΜΚΑ и Κ0Χ представляют собой аминные реактивные флуоресцентные красители, которые были присоединены к нуклеотидам и используются для автоматизированного секвенирования ДНК. Указанные флуоресцентно меченные нуклеотиды, например, ΚΟΧ-66ΑΤΡ, ΚΟΧ-ббСТР, ΚΟΧ-ббОТР и ΚΟΧ-ббиТР, являются коммерчески доступными.

Не радиоактивные и не флуоресцентные поддающиеся выявлению молекулы также доступны. Как отмечено выше, биотин может быть присоединен непосредственно к нуклеотидам и выявляться с помощью специфического и высоко аффинного связывания с авидином или стрепавидином, который химически связан с ферментом, катализирующим колориметрическую реакцию (таким как фосфатаза, люцифераза или пероксидаза). Меченные дигоксигенином нуклеотиды также можно применять подобным образом для не изотопного выявления нуклеиновых кислот. Биотинилированные и меченные дигоксигенином нуклеотиды являются коммерчески доступными.

Очень маленькие частицы, называемые наночастицами, также можно применять для мечения олигонуклеотидных зондов. Указанные частицы варьируют в размере от 1 до 1000 нм и включают различные химические структуры, такие как частицы золота и серебра и квантовые точки. При облучении случайным преломленным дневным светом указанные наночастицы золота и серебра, варьирующие по размеру от 40 до 120 нм, рассеивают монохроматический свет с высокой интенсивностью. Длина волны рассеянного света зависит от размера частицы. Каждая из четырех - пяти различных частиц в непосредственной близости рассеивает монохроматический свет, который при наложении дает специфический уникальный цвет. Частицы изготавливаются такими компаниями, как Оетсоп δ^ΐ'^δ (Карлсбад, Калифорния).

Дериватизированные частицы золота и серебра могут быть присоединены к широкому разнообразию молекул, включая белки, антитела, низкомолекулярные соединения, лиганды рецептора и нуклеиновые кислоты. Например, поверхность частицы может быть химически дериватизирована для обеспечения способности присоединения к нуклеотиду.

Другие типы наночастиц, которые можно применять для выявления поддающейся выявлению молекулы, включают квантовые точки. Квантовые точки представляют собой флуоресцирующие кристаллы диаметром 1-5 нм, которые возбуждаются светом в большом диапазоне длин волн. При возбуждении светом, имеющим соответствующую длину волны, указанные кристаллы испускают свет, такой как монохроматический свет, с длиной волны, зависящей от их химического состава и размера. Квантовые точки, такие как Сбδе, Б^е, 1пР или ΙπΑδ. обладают уникальными оптическими свойствами; указанные и подобные квантовые точки доступны из ряда коммерческих источников (например, NN-£^5, Фаеттевилл, Арканзас; Осеап №по!есЬ, Фаеттевилл, Арканзас; Nаηοсο ТесНпоЮфек Манчестер, Великобритания; δ^дта-Α1б^^сЬ, Сент-Луис, Миссури).

Множество классов частиц может быть создано в соответствии с несколькими классами размеров кристаллов из квантовых точек. Классы размеров кристаллов получают либо 1) путем строгого контроля параметров образования кристалла для создания частиц каждого желаемого класса размера или 2) путем создания серии кристаллов без строгого контроля параметров образования кристалла с последующим сортингом в соответствии с желаемым размером и/или длиной волны испускания. Два примера ссылок, в которых квантовые точки помещали в эпитаксиальные слои из кремния с собственной проводимостью полупроводникового испускающего свет/выявляющего устройства, представляют собой патенты США № 5293050 и 5354707, СЬарр1е 8око1, е! а1.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотидные праймеры или зонды могут быть меченными одним или более светоизлучающими или другими детектируемыми красителями. Свет, испускаемый красителями, может представлять собой видимый свет или невидимый свет, например, ультрафиолет или инфракрасный свет. Согласно типичным вариантам реализации изобретения краситель может представлять собой краситель на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (РРЕТ); ксантиновый краситель, такой как флуоресцеин и родамин; краситель, который содержит аминогруппу в альфа- или бета-положении (такой как нафтиламиновый краситель, 1-диметиламинонафтил-5сульфонат, 1-анилино-8-нафталинсульфонат и 2-п-толуидинил-6-нафталинсульфонат); краситель, который содержит 3-фенил-7-изоцианатокумарин; акридин, такой как 9-изотиоцианатоакридин и акридин оранжевый; пирен, бензоксадиазол и стилбен; краситель, который содержит 3-(е-карбоксипентил)-3'этил-5,5'-диметилоксакарбоцианин (СУД); 6-карбоксифлуоресцеин (ΡΑΜ); 5,6-карбоксиродамин-110 (Κ110); 6-карбоксиродамин-6О (Κ6Ο); ^^№,№-тетраметил-6-карбоксиродамин (ΤΑΜΚΑ); 6-карбокси- 43 030418

Х-родамин (ΚΟΧ); 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (ЛОЕ); ΑΕΕΧΑ ΡΕυΟΚ™; Су2; Техак Е.ей и родамин красный; 6-карбокси-2',4,7,7'-тетрахлорфлуоресцеин (ТЕТ); 6-карбокси-2',4,4',5',7,7'гексахлорфлуоресцеин (ΗΕΧ); 5-карбокси-2',4',5',7'-тетрахлорфлуоресцеин (ΖΟΕ); ΝΑΝ; ΝΕΌ; Су3; Су3,5; Су5; Су5,5; Су 7 и Су7,5; 1Р800С^, 1СО, Α1еxа Р1иог 350; Α1еxа Р1иог 488; Α1еxа Р1иог 532; Α1еxа Р1иог 546; Α1еxа Р1иог 568; Α1еxа Р1иог 594; Α1еxа Р1иог 647; Α1еxа Р1иог 680 или Α1еxа Р1иог 750.

Полинуклеотиды и олигонуклеотиды ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению могут применяться в любых терапевтических, диагностических, научно-исследовательских или связанных с поиском лекарственных средств композициях и способах, описанных в настоящем изобретении.

V. Антитела.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, также предложены антитела, которые проявляют специфичность связывания в отношении полипептида ΑΑΚδ или его нативного клеточного партнера по связыванию (т.е. партнера по связыванию, представляющего собой клеточной рецептор, липид, углевод, белок или нуклеиновую кислоту), или их комплексов, и способы их применения. Термин антитело включает его различные варианты, такие как ΡΑΒ, человеческие антитела, модифицированные человеческие антитела, одиночные цепи, нечеловеческие антитела и другие производные укладки иммуноглобулиновой молекулы, лежащие в основе лигандов антигенов иммунной системы, описанных в настоящем изобретении и известных в данной области техники. Антитела могут применяться в любом из терапевтических, диагностических способов, способов поиска лекарственных средств или способов экспрессии/очистки белков и в композициях, предложенных в настоящем изобретении.

Конкретные антитела согласно настоящему изобретению отличаются от конкретных ранее созданных антител, поскольку они могут распознавать белковые фрагменты ΑΑΚδ, приведенные в табл. 1-3, или 4-6, или 7-9, и их соответствующий полноразмерный ΑΑΚδ, как правило, при связывании с большей аффинностью с белковыми фрагментами ΑΑΚδ, чем с соответствующим полноразмерным ΑΑΚδ. В целом указанные антитела могут связываться с уникальными последовательностями или структурами, которые образуются или открываются в результате сплайсинга, протеолиза или другого клеточного процессинга, приводящего к образованию белкового фрагмента ΑΑΚδ согласно изобретению (например, посттрансляционного процессинга, включая, но не ограничиваясь перечисленными: фосфорилирование и другие модификации, которые изменяют структуру белка). Согласно некоторым аспектам, антитела могут связываться с последовательностями вокруг уникальной границы сплайсинга (например, с одним или более участками, состоящими по меньшей мере из 5 последовательных аминокислот, выбранных из последовательностей границы сплайсинга, перечисленных в табл. 2В, 5В или 8В, или, в альтернативном варианте с любой аминокислотной последовательностью С-конца указанного сайта сплайсинга, например, такой как перечисленные в табл. 2В, 5В или 8В. Например, указанные антитела могут иметь специфичность связывания с одной или более не открытыми для растворителя поверхностями, которые открыты в белковом фрагменте ΑΑΚδ, но не в полноразмерном ΑΑΚδ, или последовательностями, которые не обнаруживаются или являются другим образом недоступными в полноразмерном ΑΑΚδ. Антитела также могут связываться с уникальной трехмерной структурой, которая является результатом различий между укладкой белкового фрагмента ΑΑΚδ и полноразмерной ΑΑΚδ. Указанные различия в укладке могут быть локализованными (например, в специфическом домене или области) или глобальными. В качестве одного примера, укладка белковых фрагментов ΑΑΚδ может приводить к получению уникальных непрерывных или дискретных эпитопов, которые не обнаруживаются в соответствующей или исходной ΑΑΚδ. Примеры также включают антитела, которые специфично связываются с Ν- или С-концом, образованным в результате сплайсинга, протеолиза или другого клеточного процессинга; указанные концы могут являться уникальными по сравнению с полноразмерной ΑΑΚδ или могут не являться открытыми для связывания антитела в полноразмерной версии из-за того, что ее концы полностью или частично погружены в общую структуру более крупной исходной молекулы ΑΑΚδ.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения антитела, предложенные в настоящем изобретении, не образуют агрегатов, имеют желаемую растворимость и/или имеют профиль иммуногенности, который является подходящим для применения у людей, как описано в настоящем изобретении и известно в данной области техники. Также включены антитела, которые являются подходящими для способов обработки, например, для очистки белковых фрагментов ΑΑΚδ, описанных в настоящем изобретении. Предпочтительно, активные антитела могут быть концентрированы по меньшей мере до примерно 10 мг/мл, и необязательно представлены в виде лекарственной форм для биотерапевтического применения.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитела являются эффективными для модуляции одной или более из неканонических видов активности, опосредованных полипептидом ΑΑΚδ согласно изобретению. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело, например, представляет собой антитело, которое связывается с полипептидом ΑΑΚδ и/или его партнером по связыванию, ингибирует их способность взаимодействия друг с другом и/или проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело, например, связывается с клеточным партнером по связыванию полипептида ΑΑΚδ и имитирует активности полипептида ΑΑΚδ, например, путем повышения или проявления агонизма в от- 44 030418 ношении неканонической активности, опосредованной полипептидом ААК8. Соответственно, антитела можно применять для диагностики, лечения или предотвращения заболеваний, нарушений или других состояний, которые опосредуются полипептидом ААК8 согласно изобретению, например, путем проявления частичного или полного анагонизма или агонизма в отношении его активности.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, называется специфично связывающимся, иммунологически связывающимся и/или иммунологически реактивным с полипептидом согласно изобретению, если оно реагирует на детектируемом уровне (например, с помощью анализа методом твердофазного ИФА) с полипептидом и не реагирует на детектируемом статистически значимом уровне с неродственными полипептидами при таких же условиях. В конкретных примерах, связывающий агент значительно не взаимодействует с полноразмерной версией полипептида ААК8.

Иммунологическое связывание, при использовании в данном контексте, в целом относится к нековалентным взаимодействиям такого типа, которые возникают между молекулой иммуноглобулина и антигеном, к которому специфичен указанный иммуноглобулин. Сила или аффинность связывания таких взаимодействий, как иммунологическое связывание, может быть выражена с помощью константы диссоциации (К_б) взаимодействия, где меньшее значение К_б соответствует большей аффинности. Свойства иммунологического связывания выбранных полипептидов можно количественно оценить с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. См., например, Оа\аек е1 а1. (1990) Аппиа1 Кеу. ВюсНет. 59:439-473. Согласно конкретным иллюстративным вариантам реализации изобретения аффинность антитела к белковому фрагменту ААК8 составляет по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 или 50 нМ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность антитела к белковому фрагменту ААК8 сильнее, чем его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ААК8, как правило, примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз (включая все целые числа между ними). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность антитела к соответствующему полноразмерному белку ААК8 составляет по меньшей мере примерно 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мкМ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антитело слабо связывается или по существу не связывается на выявляемом уровне с полноразмерным белком ААК8.

Сайт связывания антигена или связывающий участок антитела, относится к части молекулы иммуноглобулина, которая принимает участие в связывании антигена. Сайт связывания антигена формируется аминокислотными остатками Ν-концевых вариабельных (V) участков тяжелой (Н) и легкой (Ь) цепи. Три высоко дивергентных последовательности внутри ν-участков тяжелых и легких цепей называются гипервариабельными участками, которые располагаются между более консервативными фланкирующими последовательностями, известными как каркасные участки или РК. Таким образом, термин РК относится к аминокислотным последовательностям, которые в естественных условиях находятся между и прилегают к гипервариабельным участкам в иммуноглобулинах. В молекуле антитела три гипервариабельных участка легкой цепи и три гипервариабельных участка тяжелой цепи располагаются друг относительно друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность является комплементарной трехмерной поверхности связываемого антигена, и три гипервариабельных участка каждой из тяжелых и легких цепей называются определяющими комплементарность участками или СОК.

Антитела могут быть получены с помощью любого из различных методов, известных специалистам в данной области техники. См., например, Наг1оте апб Ьапе, АпйЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаФгу, 1988. Моноклональные антитела, специфичные к интересующему полипептиду, могут быть получены, например, с использованием метода, предложенного Кохлером и Мильстейном (КоЫег апб МПк1еш, Еиг. ί. 1ттипо1. 5:511-519, 1976), и его усовершенствованных вариантов. Также включены способы, в которых используются трансгенные животные, такие как мыши, для экспрессии человеческих антител. См., например, №иЬегдег е1 а1., №-11иге Вю1есНпо1оду 14:826, 1996; ЬопЬегд е1 а1., НапбЬоок ок Е\рептеп1а1 Р1агтасо1оду 113:49-101, 1994; апб ЬопЬегд е1 а1., 1п1егпа1 Ке\ае\у ок 1ттипо1оду 13:65-93, 1995. Конкретные примеры включают технологию VЕ^ΟСIММυNЕ®, разработанную компанией КЕСЕNЕКΟN® (см., например, патент США № 6596541). Антитела также могут быть созданы или идентифицированы путем использования библиотек фагового дисплея и дрожжевого дисплея (см., например, патент США № 7244592; С1ао е1 а1., №-11иге Рго1осо1к. 1:755-768, 2006). Неограничивающие примеры доступных библиотек включают клонированные или синтетические библиотеки, такие как комбинаторная библиотека человеческих антител (НиСАЬ), в которой репертуар структурного разнообразия человеческих антител представлен генами семи вариабельных участков тяжелой цепи и семи вариабельных участков легкой цепи. Комбинация указанных генов дает начало 49 каркасам в основной библиотеке. Путем перекрывания высоко вариабельных генетических кассет (СОК = определяющие комплементарность участки = гипервариабельные участки) указанных каркасов, может быть получено большое количество разнообразных человеческих антител. Также включены человеческие библиотеки, созданные на основе

- 45 030418 фрагментов, полученных от доноров, представляющих собой людей, кодирующие вариабельный участок легкой цепи, СОК-3 тяжелой цепи, синтетическую ДНК, кодирующую разнообразие СОК-1 тяжелой цепи, и синтетическую ДНК, кодирующую разнообразие СОК-2 тяжелой цепи. Другие библиотеки, подходящие для использования, очевидны специалистам в данной области техники. Полипептиды согласно настоящему изобретению можно применять в процессе очистки, например, на этапе аффинной хроматографии.

Фрагмент Ρν может быть получен путем предпочтительного протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина 1дМ и редко встречающихся молекул иммуноглобулинов 1§С или 1дА. Ρνфрагменты однако чаще получают с использованием рекомбинантных методов, известных в данной области техники. Ρν-фрагмент включает нековалентный гетеродимер Уц::У[,. содержащий антигенсвязывающий сайт, который в значительной степени сохраняет способность нативной молекулы антитела распознавания и связывания антигена. См., например, 1нЬаг еΐ а1. (1972), Ргос. Ν;·ιΙ. Асаб. 8οί. США 69:26592662; НοсЬтаη еΐ а1. (1976), ВюсЬет 15:2706-2710; и ЕПгПсП еΐ а1. (1980), ВюсЬет 19:4091-4096.

Одноцепочечный полипептид Ρν (δΡν) представляет собой ковалентно связанный гетеродимер У_Н:У_Ъ, который получен из слитых генов, включающих У_н- и У_ъ-кодирующие гены, связанные пептидкодирующим линкером. ΗιΐδΙοη еΐ а1. (1988), ΡNА8 США. 85(16):5879-5883. Был описан ряд способов для определения химической структуры для превращения природных ассоциированных, но химически отдельных, легких и тяжелых полипептидных цепей из вариабельной области антитела в молекулу δΡν, которая укладывается в трехмерную структуру, по существу подобную структуре антигенсвязывающего сайта. См., например, патенты США № 5091513 и 5132405, ΗιΐδΙοη еΐ а1.; и патент США № 4946778, Ьабнег еΐ а1.

Каждая из описанных выше молекул включает набор СОК тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, расположенный между набором РК указанной тяжелой и легкой цепи, который обеспечивает поддержку СОК и определяет пространственное расположение СОК относительно друг друга. В настоящем изобретении термин набор СОК относится к трем гипервариабельным участкам вариабельной области тяжелой и легкой цепей. Начиная с Ν-конца тяжелой и легкой цепи, указанные участки обозначаются как СОК1, СОК и СОК3 соответственно. Антигенсвязывающий сайт, таким образом, включает шесть СОК, включающих группу СОК из каждой вариабельной области тяжелой и легкой цепи. Полипептид, содержащий один СОК, (например, СОК1, СОК2 или СОК3), называется в настоящем изобретении единицей молекулярного распознавания. Кристаллографический анализ ряда комплексов антиген-антитело показал, что аминокислотные остатки СОК образуют сильный контакт со связанным антигеном, где наиболее сильный контакт с антигеном обеспечивает СОК3 тяжелой цепи. Таким образом, единицы молекулярного распознавания, главным образом, отвечают за специфичность антигенсвязывающего сайта.

В настоящем изобретении термин ряд РК относится к четырем фланкирующим аминокислотным последовательностям, которые ограничивают СОК группы СОК тяжелой и легкой цепи вариабельной области. Некоторые остатки РК могут контактировать со связанным антигеном; однако, РК в первую очередь отвечают за укладку вариабельной области в антигенсвязывающем сайте, в частности, остатков РК, непосредственно прилежащих к СОК. Конкретные аминокислотные остатки в РК и конкретные структурные признаки являются очень высоко консервативными. В этом отношении, все последовательности вариабельной области содержат внутреннюю дисульфидную петлю, содержащую примерно 90 аминокислотных остатков. Когда вариабельные области укладываются в сайт связывания, СОК образует выступающие петлевые мотивы, которые образуют антигенсвязывающую поверхность. В целом считается, что именно консервативные структурные участки РК влияют на укладку петлей СОК в конктреных традиционных структурах, независимо от точной аминокислотной последовательности СОК. Более того, конкретные остатки РК, как известно, принимают участи в нековалентных междоменных контактах, которые стабилизируют взаимодействие тяжелых и легких цепей антитела.

Конкретные варианты реализации изобретения включают однодоменное антитело (кбАВ или нанотело), которое относится к фрагменту антитела, состоящему из одного мономерного вариабельного домена антитела (см., например, патенты США № 5840526; 5874541; 6005079, 6765087, 5800988; 5874541 и 6015695). Указанные кбАВ, как правило, имеют молекулярную массу примерно 12-15 кДа. Согласно конкретным аспектам изобретения, кбАВ и другие молекулы антител могут быть получены или изолированы из уникальной тяжелой цепи антител иммунизированных верблюдов и лам, которые часто называют камелидами. См., например, СстаЛ еΐ а1., ДВС. 276:7346-7350, 2001.

Был описан ряд гуманизированных молекул антител, содержащих антигенсвязывающий сайт, произошедший из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, включая гибридные антитела, содержащие вариабельные области грызунов и ассоциированный с ними СОК, слитые с человеческим константными доменами (ЛУиНег еΐ а1. (1991), №11иге 349:293-299; ШЬи^ю еΐ а1. (1989), Ргос. Ν;·ιΙ. Асаб. 8а. США 86:4220-4224; 8 Паи е1 а1. (1987), 1. Iттиηο1. 138:4534-4538; Вгоип е1 а1. (1987), Сапсег Кек. 47:3577-3583), СОК грызунов, привитые на человеческие поддерживающие РК-участки перед гибридизацией с соответствующим константным доменом человеческого антитела (К1есЬташ1 еΐ а1. (1988), №Ше 332:323-327; V ег1юе\е11 е1 а1. (1988), 8саепсе 239:1534-1536; 1ο^5 е1 а1. (1986), №Ше 321:522-525) и СОК грызунов привитые на поддерживающие рекомбинантные человеческие РК-участки грызунов (пуб- 46 030418 ликация европейского патента № 519596, опубликованная 23 декабря 1992 г.). Указанные гуманизированные молекулы были созданы для минимизации нежелательной иммунологической реакции на молекулы античеловеческих антител грызунов, ограничивающей длительность и эффективность терапевтического применения указанных фрагментов у реципиентов, представляющих собой людей. См., например, патенты США № 5530101; 5585089; 5693762; 6180370 и 7022500.

Антитела согласно настоящему изобретению можно применять в любых терапевтических, диагностических целях для поиска лекарственных средств, очистки белка и в аналитических способах и композициях, описанных в настоящем изобретении.

УГ. Альтернативы антител и другие связывающие агенты.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, также предложены альтернативы антител или другие связывающие агенты, такие как растворимые рецепторы, аднектины, пептиды, пептидомиметики, низкомолекулярные соединения, аптамеры, и т.д., которые проявляют специфичность связывания в отношении полипептида ААК§ или его клеточного партнера по связыванию, описанного в настоящем изобретении, или в отношении его части, варианта или производного, и композиции и способы их применения. Связывающие агенты могут применяться в любой из терапевтических, диагностических целей, в целях поиск лекарственных средств или экспрессии/очистки белка и в аналитических способах и композициях, описанных в настоящем изобретении. Биологические связывающие агенты, такие как аднектины, растворимые рецепторы, авимеры и тринектины, являются особо применимыми.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения указанные связывающие агенты являются эффективными для модуляции одной или более неканонических видов активности, опосредуемых полипептидом ААК§ согласно изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения связывающий агент, например, представляет собой агент, который связывается с полипептидом ААК.8 и/или его партнером по связыванию, ингибирует их способность взаимодействовать друг с другом и/или проявляет антагонизм в отношении неканонической активности полипептида ААК.8. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения связывающий агент, например, связывается с клеточным партнером по связыванию полипептида ААК§ и имитирует активность полипептида ААК8, например, путем повышения или проявления агонизма в отношении неканонической активности, опосредованной полипептидом ААК.8. Соответственно, такие связывающие агенты можно применять для диагностики, лечения или предотвращения заболеваний, нарушений или других состояний, который являются опосредованными полипептидом ААК§ согласно изобретению, например, путем проявления частичного или полного антагонизма или агонизма в отношении его активности.

Считается, что связывающий агент специфично связывается с полипептидом ААК§ согласно изобретению или его клеточным партнером по связыванию, если он реагирует на детектируемом уровне (в рамках, например, анализа методом твердофазного ИФА) с полипептидом или его клеточным партнером по связыванию и не реагирует на статистически значимом детектируемом уровне с неродственными полипептидами при таких же условиях. В конкретных примерах, связывающий агент значительно не взаимодействует с полноразмерной версией полипептида ААК.8. Согласно конкретным иллюстративным вариантам реализации изобретения аффинность связывающего агента к белковому фрагменту ААК§ или его клеточному партнеру связывания составляет по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 или 50 нМ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность связывающего агента к белковому фрагменту ААК§ сильнее, чем его аффинность к соответствующему полноразмерному полипептиду ААК8, как правило, примерно в 1,5х, 2х, 2,5х, 3х, 3,5х, 4х, 4,5х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х, 1000х или более раз (включая все целые числа между ними). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения аффинность связывающего агента к соответствующему полноразмерному белку ААК.8 составляет по меньшей мере примерно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мкМ.

Как отмечено выше, в качестве связывающих агентов включены пептиды. Термин пептид, как правило, относится к полимеру аминокислотных остатков и их вариантов и синтетических аналогов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения термин пептид относится к относительно коротким полипептидам, включая пептиды, которые состоят из примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот, включая все целые числа и диапазоны между ними (например, 5-10, 8-12, 10-15), и взаимодействуют с полипептидом ААК8, его клеточным партнером по связыванию, или обоими. Пептиды могут состоять из природных аминокислот и/или не природных аминокислот, описанных в настоящем изобретении.

Кроме пептидов, состоящих только из природных аминокислот, также предложены пептидомиметики или аналоги пептидов. Аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической индустрии как непептидные лекарственные средства, обладающие свойствами, аналогичными свойствам эталонного пептида. Указанные типы непептидных соединений называются миметиками пептидов или пептидомиметиками (ЬиШтап, е1 а1., А ТехШоок оГ Эгид Эек1дп апб ^еνе1οртеηΐ, 14:386-406, 2'¹ Ей., Наггеоой

- 47 030418

Асайетю РиЬЬкЬегк (1996); 1оасЫт Огап!е, Апдете. СЬет. Ш!. Ей. Епд1., 33:1699-1720 (1994); РаисЬеге, ί., Айу. Эгид Век., 15:29 (1986); VеЬе^ апй Рге1йшдег ΉΝδ, р. 392 (1985); Еуапк, е! а1., ί. Мей. СЬет. 30:229 (1987)). Пептидомиметик представляет собой молекулу, которая имитирует биологическую активность пептида, но не является пептидной по своей химической природе. Соединения, представляющие собой пептидомиметики, известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 6245886.

Настоящее изобретение также включает пептоиды. Пептоидные производные пептидов представляют собой другую форму модифицированных пептидов, которые сохраняют структурные детерминанты, важные для биологической активности, но не имеют пептидных связей, таким образом, приобретая устойчивость к протеолизу (Яшоп, е! а1., РNАδ США. 89:9367-9371, 1992). Пептоиды представляют собой олигомеры Ν-замещенных глицинов. Был описан ряд Ν-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты.

Пептидомиметики согласно настоящему изобретению включают соединения, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток, несколько аминокислотных остатков или все аминокислотные остатки замещены на соответствующие Ν-замещенные глицины. Пептоидные библиотеки описаны, например, в патенте США № 5811387.

Связывающий агент также может включать одну или более малых молекул. Малая молекула относится к органическому соединению, которое имеет синтетическую или биологическую природу (биомолекула), но, как правило, не является полимером. Органические соединения относятся к большому классу химических соединений, молекулы которых содержат углерод, как правило, за исключением тех молекул, которые содержат только карбонаты, простые оксиды углерода или цианиды. Термин биомолекула в целом относится к органической молекуле, которая продуцируется живым организмом, включая крупные полимерные молекулы (биополимеры), такие как пептиды, полисахариды и нуклеиновые кислоты, также как и низкомолекулярные соединения, такие как первичные и вторичные метаболиты, липиды, фосфолипиды, гликолипиды, стерины, глицеринипиды, витамины и гормоны. Термин полимер в целом относится к большой молекуле или макромолекуле, состоящей из повторяющихся структурных единиц, которые, как правило, связаны ковалентными химическими связями.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения молекулярная масса низкомолекулярного соединения составляет менее чем 1000-2000 Дальтон (Да), как правило, между примерно 300 и 700 Да, и включая примерно 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 650, 600, 750, 700, 850, 800, 950, 1000 или 2000 Да. Библиотеки малых молекул описаны в другой части настоящего изобретения.

В качестве связывающих агентов также предложены аптамеры (см., например, Е1Ьпд!оп е! а1., №!иге. 346, 818-22, 1990; и Тиегк е! а1., δ^ι^. 249, 505-10, 1990). Примеры включенных аптамеров представляют собой аптамеры нуклеиновых кислот (например, ДНК-аптамеры, РНК-аптамеры) и пептидные аптамеры. Аптамеры нуклеиновых кислот в целом относятся к видам нуклеиновых кислот, которые были сконструированы с помощью повторяющихся циклов селекции ш уЬго или эквивалентного способа, такого как ЯЕЬЕХ (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), для связывания с различными молекулярными мишенями, такими как низкомолекулярные соединения, белки, нуклеиновые кислоты и даже клетки, ткани и организмы. См., например, патенты США № 6376190 и 6387620. Таким образом, включены аптамеры нуклеиновых кислот, которые связываются с полипептидами ААВЯ, описанными в настоящем изобретении, и/или их партнерами по связыванию.

Пептидные аптамеры, как правило, включают вариабельную пептидную петлю, присоединенную с обоих концов к белковому каркасу, двойное закрепление структуры, которое, как правило, повышает аффинность связывания пептидного аптамера до уровня, сравнимого с уровнем для антитела (например, в наномолярном диапазоне). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения длина вариабельной петли может составлять примерно 10-20 аминокислот (включая все целые числа между ними), и каркас может включать любой белок, который имеет хорошие свойства растворимости и укладки. Конкретные типичные варианты реализации изобретения могут использовать бактериальный белок ТЬюгейохшА в качестве белка каркаса, при этом вариабельная петля встроена в сайты пониженной активности (Сук-О1у-Рго-Сук- петля в белке дикого типа), при этом боковые цепи двух цистеинов способны образовывать дисульфидный мостик. Способы идентификации пептидных аптамеров описаны, например, в заявке на патент США № 2003/0108532. Таким образом, включены пептидные аптамеры, которые связываются с полипептидами ААВЯ, описанными в настоящем изобретении и/или их партнерами по связыванию. Выбор пептидного аптамера может осуществляться с использованием различных систем, известных в данной области техники, включая дрожжевую двугибридную систему.

Также включены АДНЕКТИНЫ'™, АВИМЕРЫ'™, анафоны и антикалины, которые специфично связываются с белковым фрагментом ААВЯ согласно изобретению. АДНЕКТИНЫ™ относятся к классу нацеленных биологических препаратов, производных человеческого фибронектина, распространенного внеклеточного белка, который в природе связывается с другими белками. См., например, заявки на патенты США № 2007/0082365; 2008/0139791 и 2008/0220049. АДНЕКТИНЬЕ™, как правило, состоят из природного скелета фибронектина, а также нескольких направленных доменов специфической части человеческого фибронектина. Направленные домены могут быть сконструированы для обеспечения спе- 48 030418 цифического распознавания АДНЕКТИНОМ'™ терапевтической интересующей мишени, такой как белковый фрагмент ΑΑΚδ согласно изобретению.

АВИМЕРЬР™ относятся к мультимерным связывающим белкам или пептидам, сконструированным путем перестановок экзонов ш νίίΐΌ и фагового дисплея. Несколько связывающих доменов соединяют, что приводит к большей аффинности и специфичности по сравнению с иммуноглобулиновыми доменами с одним эпитопом. См., например, δί1\Όπη;·ιπ еί а1., №-11иге Вю1ес1то1оду. 23:1556-1561, 2005; патент США № 7166697; и заявки на патенты США № 2004/0175756, 2005/0048512, 2005/0053973, 2005/0089932 и 2005/0221384.

Также включены сконструированные белки с анкириновым повтором (дарпины), которые включают класс не иммуноглобулиновых белков, которые могут обеспечивать преимущество по сравнению с антителами с точки зрения связывания мишени в поиске лекарственных средств и разработке лекарственных средств. Среди других применений, дарпины наилучшим образом изучены для ш νί\Ό отображения или доставки токсинов или других терапевтических грузов из-за их благоприятных молекулярных свойств, включая маленький размер и высокую стабильность. Малозатратная продукция в бактериях и быстрое производство большого количества мишень-специфичных дарпинов делает подход с использованием дарпинов применимым для поиска лекарственных средств. Кроме того, дарпины могут быть с легкостью получены в формах, обладающих множественной специфичностью, что дает возможность направлять эффекторный дарпин на множество рецепторов конкретного органа или ткани с помощью одной молекулы, состоящей из нескольких дарпинов. См., например, δίитρρ еί а1., Сигг Орт Эгид Όΐ8^ν ϋ^1. 10:153-159, 2007; заявки на патенты США № 2009/0082274; и РСТ/ЕР2001/10454.

Конкретные варианты реализации изобретения включают монотела, которые, как правило, используют 10-й домен фибронектина III типа человека (ΡΝίΗ10) в качестве каркаса для предоставления множества петель поверхности для связывания мишени. ΡΝίΗ10 представляет собой малый (94 остатка) белок с β-сэндвич структурой, подобной укладке иммуноглобулиновой цепи. Он является высоко стабильным без дисульфидных связей или ионов металла и он может экспрессироваться в правильно уложенной форме на высоком уровне в бактериях. Каркас ΡΝίΗ10 совместим фактически с любой технологией отображения. См., например, ВаЮп еί а1., Рго1ет Епд. 15:1015-20, 2002; и Ао)сП< еί а1., Ν·ιΙ δίπια Мо1. Вю1., 2010; патент США № 6673901.

Антикалины относятся к классу миметиков антител, которые, как правило, синтезируют из человеческих липокалинов, семейства связывающих белков с гипервариабельным участком петли, поддерживаемым структурно жестким каркасным участком. См., например, заявку на патент США № 2006/0058510. Антикалины, как правило, имеют размер примерно 20 кДа. Антикалины характеризуются бочковидной структурой, образованной восьмью антипараллельными β-цепями (стабильный βбочковидный каркас), которые попарно соединены четырьмя пептидными петлями, и присоединенной аспиралью. Согласно конкретным аспектам изобретения, в гипервариабельный участок (участки) цепи внесены конформационные изменения для достижения специфического связывания. См., например, δке^^а, ΡΕΒδ I. 275:2677-83, 2008, включенный в настоящее изобретение посредством ссылки.

VII. Биологические анализы и аналитические тест-системы для анализа высвобождения лекарственного средства и исследования продукта, диагностика и реагенты.

Также предложены способы биологического анализа, которые относятся к белковым фрагментам ΑΑΚδ и родственным агентам в качестве терапевтических и диагностических реагентов. Примеры включают биологические анализы и аналитические тест-системы, которые позволяют измерить чистоту, биологическую активность, аффинность, растворимость, рН, уровень эндотоксина, и т.д., многие из которых описаны в настоящем изобретении. Также включены анализы, которые обеспечивают кривые зависимости доза-ответ и/или обеспечивают один или более параметров для сравнения между различными партиями агентов. Сравнения партий могут быть основаны на одной или более химической характеристике, биологической характеристике и клинической характеристике. Для белковых агентов также включены способы оценки активности, стабильности, фармакокинетики и иммуногенности выбранного агента. Среди других применений, указанные и другие способы можно применять для тестирования уменьшения объема партии биологических или химических агентов, включая белковые фрагменты ΑΑΚδ, антитела, связывающие агенты, полинуклеотиды, а также антисмысловые агенты и векторы и другие, описанные в настоящем изобретении.

Конкретные варианты реализации изобретения включают применение анализов биоаффинности. Такие анализы можно применять для оценки аффинности связывания, например, между белковым фрагментом ΑΑΚδ и клеточным партнером по связыванию или между белковым фрагментом ΑΑΚδ и антителом. Аффинность связывания также можно измерить между белковым фрагментом ΑΑΚδ и предполагаемым связывающим агентом, таким как соединение-кандидат или перспективное исследуемое соединение (например, низкомолекулярный модулятор ΑΑΚδ) или между клеточным партнером по связыванию ΑΑΚδ и исследуемым соединением-кандидатом или перспективным исследуемым соединением. Конкретные типичные анализы аффинности связывания могут использовать анализы на основе твердофазного ИФА, как описано в настоящем изобретении и известно в данной области техники. В конкрет- 49 030418 ных анализах используется высокоэффективная хроматография связывания с рецептором (см., например, Κο5\νη11 с1 а1., Βίοίοβίοαίδ. 24:25-39, 1996). Согласно другим типичным анализам аффинности связывания можно применять методы на основе поверхностного плазмонного резонанса (δΡΚ). Примеры включают технологии компании В1ЛСогс. некоторые из которых объединяют метод на основе δΡΚ с микрофлюидной системой для наблюдения за молекулярными взаимодействиями в реальном времени при концентрациях, варьирующих от пМ до мМ. Также включены анализы ΚΙΧΕΧΑ™, которые обеспечивают точные измерения специфичности связывания, аффинности связывания и кинетики связывания/констант скорости.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к иммунологическим анализам для оценки или оптимизации иммуногенности белковых агентов. Примеры включают клеточные анализы человека ех νίνο и иммуноферментные анализы ίη νίΐτο для получения полезной информации относительно потенциальной иммуногенности терапевтического белка. Анализы клеточного ответа ех νίνο можно применять, например, для воспроизведения клеточной кооперации между антиген-презентирующими клетками (АПК) и Т-клетками и, таким образом, измерения активации Т-клеток после контакта с интересующим белком. Конкретные ферментативные анализы ίη νίΐΓΟ могут использовать коллекцию рекомбинантных молекул ΗΤΑ-ΌΚ, охватывающих значительную часть подходящей человеческой популяции, и могут включать автоматизированные иммуноферментные анализы для оценки связывания пептидов (образованных в результате фрагментации терапевтического белка) с молекулами ΗΤΑ-ΌΚ. Также включены способы снижения иммуногенности выбранного белка, например, с использованием указанных и связанных способов для идентификации и последующего удаления или изменения одного или более Тклеточных эпитопов белкового агента.

Также предложены способы анализа биологического высвобождения (например, клеточные анализы) для измерения параметров, таких как значения специфической биологической активности, включая неканонические виды биологической активности и цитотоксичность. Конкретные специфические биологические анализы включают, например, клеточные анализы, в которых используется клеточный партнер по связыванию (например, рецептор клеточной поверхности), выбранный белковый фрагмент ΑΑΚδ, который функционально связан с индикатором, таким как флуоресцентный или люминесцентный индикатор неканонической биологической активности, описанный в настоящем изобретении.

Например, конкретные варианты реализации изобретения включают клетку, которая содержит рецептор клеточной поверхности или его внеклеточную часть, которая связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ, где указанная клетка содержит детектор или индикатор. Также включены биологические анализы ίη νίνο для характеристики фармакокинетики агента, такого как полипептид ΑΑΚδ или антитело, в которых, как правило, используются трансгенные мыши или другие млекопитающие (см., например, Ьее еΐ а1., ТЬе ίοιίΓηαΙ οΓ Рйагтасо1оду. 281:1431-1439, 1997). Примеры биологических анализов на основе цитотоксичности включают анализы высвобождения (например, анализы высвобождения хрома или европия для оценки апоптоза; см., например, νοη Ζοηδ еΐ а1., С1ш Όίηβη ЬаЬ Iттиηο1, 4:202-207, 1997), среди других анализов, позволяющих оценивать цитотоксичность белковых фрагментов ΑΑΚδ для получения кривых зависимости доза-ответ, для сравнения партий продукта или анализа других свойств, связанных с получением одобрения различных органов управления, таких как Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (ΡΌΑ).

Такие анализы можно применять, например, для получения кривой зависимости доза-ответ для выбранного белкового фрагмента ΑΑΚδ или другого агента, и/или для сравнения кривых зависимости доза-ответ различных партий белков или других агентов. Кривая зависимости доза-ответ представляет собой график зависимости X от Υ, связывающий величину стрессорного агента с ответом рецептора; где указанный ответ может представлять собой физиологический или биохимический ответ, например, неканоническую биологическую активность в клетке ίη νίΐΓΟ или в клетке или ткани ίη νίνο, терапевтически эффективное количество, измеренное ίη νίνο (например, измеренное на основе Ε^₀) или смертность, измеренную ίη νίίτο или ίη νίνο (например, клеточную гибель, гибель организма). Смертность обычно выражают как ЬО₅₀, статистически определенная дозы, которая является летальной для 50% смоделированной популяции, но также может обозначаться как ЬС₀1 (летальная доза для 1% анализируемой популяции животных), ЬСцх, (летальная доза для 100% анализируемой популяции животных) или ЬС_Ь0 (минимальная доза, вызывающая летальность). Почти все желательные эффекты или конечные точки можно охарактеризовать таким образом.

Измеренную дозу для кривой зависимости доза-ответ, как правило, наносят на ось X и ответ наносят на ось Υ. Чаще ось X наносят логарифм дозы, что наиболее часто приводит к получению сигмоидальной кривой с крутым изгибом в средней части. Уровень отсутствия наблюдаемого эффекта (ηο ο¥ 8егуаЬ1е еГГсс1 1еуе1, N0Ε^) относится к минимальной экспериментальной дозе, при которой не наблюдается поддающегося измерению эффекта, и пороговая доза относится к первой точке на графике, показывающей ответ выше нуля. Как правило, для более сильных лекарственных средств получаются более крутые кривые зависимости доза-ответ. Для многих лекарственных средств желательные эффекты наблюдаются при дозах, немного превышающих пороговую дозу, часто из-за того, что более низкие дозы являются относительно неэффективными, а более высокие дозы приводят к нежелательным побочным

- 50 030418 эффектам. Кривые зависимости доза-ответ, построенные для анализов ш У1уо, при желании могут характеризоваться такими значениями, как мкг/кг, мг/кг или г/кг массы тела.

Для сравнения партий может быть полезно рассчитывать коэффициент вариации (СУ) между различными кривыми зависимости доза-ответ для различных партий (например, между различными сериями белковых фрагментов ААК8, антител или других агентов), отчасти благодаря тому, что СУ позволяет сравнивать наборы данных с различными единицами или данных, полученных различными способами. Например, согласно конкретным типичным вариантам реализации изобретения СУ между двумя или тремя или более различными партиями белковых фрагментов ААК8 или других агентов составляет меньше примерно 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% для 4, 5, 6, 7 или 8 точек кривой дозирования. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения кривую зависимости доза-ответ оценивают для клеточного анализа, и показатель указанного анализа относится к повышению или снижению выбранной неканонической активности белкового фрагмента ААК8. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения кривую зависимости доза-ответ измеряли для анализа высвобождения из клеток или на животной модели (например, мышиной модели), и показатель указанного анализа относится к клеточной гибели или смерти животного. Другие варианты очевидны специалистам в данной области техники.

УШ. Системы экспрессии и очистки.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы и связанные композиции для экспрессии и очистки белковых фрагментов ААК8 или других агентов на основе полипептидов согласно изобретению. Такие рекомбинантные полипептиды ААК8 могут быть легко получены с использованием стандартных протоколов, описанных, например, в 8атЬгоок, е! а1. (1989, выше), в частности, разделах 16 и 17; АикиЬе1 е! а1. (1994, выше), в частности, главах 10 и 16; и СоПдап е! а1., СиггеШ Рго!осо1к ш Рго1еш 8с1епсе (1оЬп Абеу & 8опк, 1пс. 1995-1997), в частности, главах 1, 5 и 6. В качестве одного общего примера, полипептиды ААК8 могут быть получены способом, включающим один или более из этапов: (а) получения конструкции, содержащей полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ААК8 и которая функционально связана с регуляторным элементом; (Ь) введения конструкции в клетку хозяина; (с) культивирования клетки-хозяина для экспрессии полипептида ААК8; и (б) выделения полипептида ААК8 из клетки-хозяина.

Полинуклеотиды ААК8 описаны в другой части настоящего изобретения. Для экспрессии желаемого полипептида можно встраивать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид или его функциональный эквивалент, в соответствующий вектор экспрессии, т. е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, можно применять для конструирования векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие интересующий полипептид, и соответствующие элементы контроля транскрипции и трансляции. Указанные способы включают технологии получения рекомбинантной ДНК ш уйто, синтетические методы и генетическую рекомбинацию ш У1уо. Такие методы описаны в источнике 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отп§, А ЬаЬога1огу Мапиа1 (1989), и АикиЬе1 е! а1., СиггеШ РгоЮсо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (1989).

Различные системы вектор экспрессии/хозяин известны и могут применяться для включения и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Указанные системы включают, но не ограничиваются перечисленными: микроорганизмы, такие как бактерия, трансформированная рекомбинантным бактериофагом, плазмидные или космидные векторы экспрессии ДНК; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусом); системы растительных клеток, трансформированные вирусными векторами экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом табачной мозаики, ТМУ) или бактериальными векторами экспрессии (например, плазмидами Τι или рВК322); или системы клеток животных, включая системы клеток млекопитающих и, более конкретно, человека.

Контрольные элементы или регуляторные последовательности, присутствующие в векторе экспрессии, представляют собой такие нетранслируемые участки вектора (энхансеры, промоторы, 5'- и 3'нетранслируемые участки), которые взаимодействуют с белками клетки-хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут отличаться по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой векторной системы и хозяина может использоваться любое количество подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно применять индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды РВЬИЕ8СК1РТ (81га1адепе, Ла Джола, Калифорния) или плазмиды Р8РОКТ1 (ОЛсо ВКЬ, Гейтерсбург, Мэриленд) и т.п. В системах клеток млекопитающих промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих в целом являются предпочтительными. При необходимости получения клеточной линии, которая содержит множество копий последовательности, кодирующей полипептид, предпочтительно использовать векторы на основе 8У40 или ЕВУ с соответствующим селективным маркером.

В бактериальных системах количество векторов экспрессии может быть выбрано в зависимости от предполагаемого применения экспрессированного полипептида. Например, в случае необходимости

- 51 030418 больших количеств можно применять векторы, направленные на высокий уровень экспрессии слитых белков, которые с легкостью могут быть очищены. Такие векторы включают, но не ограничиваются перечисленными: мультифункциональные векторы клонирования и экспрессии Е^Н, такие как ВШЕ^СМРТ (^(гс-Падеие), в которых последовательность, кодирующая интересующий полипептид, может быть лигирована в вектор в рамке с последовательностями для амино-концевого Ме1 и последующими 7 остатками β-галактозидазы, таким образом, что продуцируется слитый белок; векторы рГЫ (Vаη Нееке & δ^η.^ΙΟΓ, ί. Είο1. СЬет. 264:5503, 5509 (1989)); и т.п. Также можно применять векторы рОЕХ (Рготеда, Мэдисон, Висконсин) для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатионы-трансферазой (ΟδΤ). В целом такие слитые белки являются растворимыми и могут с легкостью быть очищены из лизированных клеток путем абсорбции на глутатион-агарозные гранулы с последующим вымыванием в присутствии свободного глутатиона. Белки, созданные в таких системах, могут быть сконструированы для включения гепарина, тромбина или сайтов расщепления протеазой фактором ХА, таким образом, что клонированный интересующий полипептид может самопроизвольно высвобождаться из фрагмента ΟδΤ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять системы экспрессии на основе Е.тоЬ (см., например, 81гос1:ига1 Ос^тк® ΟοίΗοΠίιιιη οΐ а1., №1иге Мебюбз. 5:135-146, 2008). Указанные и связанные варианты реализации изобретения могут основываться частично или полностью на лигазно-независимом клонировании (Ь1С) для продукции подходящего вектора экспрессии. Согласно конкретному варианту реализации изобретения экспрессию белка можно контролировать с помощью РНК-полимеразы Т7 (например, серия векторов рЕТ). Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения может использоваться экспрессия в хозяйском штамме ВЬ21(ЭЕ3), содержащем лизоген /ГОЕ3 ВЬ21, который поддерживает Т7-опосредованную экспрессию и не имеет протеаз 1οη и οтрΤ, для улучшения стабильности белка-мишени. Также включена экспрессия хозяйских штаммов, содержащих плазмиды, кодирующие тРНК, которые редко используются в Е^Н, такие как штаммы ΚΟδЕΤΤΑ™ (ЭЕ3) и ^зеНа 2 (ЭЕ3). Лизис клеток и обработку образца также можно улучшить с использованием реагентов, которые продаются под торговыми марками нуклеаза ВЕNΖΟNΑδЕ® и реагент для белковой экстракции ВυΟВυδΤЕΚ®. Для клеточных культур, самоиндуцирующая среда может улучшать эффективность многих систем экспрессии, включая высокоэффективные системы экспрессии. Среда указанного типа (например, система самоиндукции ΟνΈΚΝΙΟΗΤ ЕXΡΚЕδδ™) постепенно вызывает экспрессию белка путем метаболического сдвига, без добавления искусственных индуцирующих агентов, таких как 1РТО. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения используются гексагистидиновые метки (такие как метки, которые продаются под торговой маркой гибридов ΗIδ·ΤΑΟ®), с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (ΙΜΑΟ), или связанных методов. Однако согласно конкретным аспектам изобретения, белки клинической степени чистоты могут быть изолированы из телец включения Е^Н, с использованием или без использования аффинной метки (см., например, δΙΕι^ е1 а1., Ρ^οΐе^η Ехрг РипГ. 50:58-67, 2006). В качестве другого примера, согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять индуцируемые Холодовым шоком высокоэффективные системы продукции Е^Ь, так как повышенная экспрессия белков в ЕзсЬепсЫа тоН при низкой температуре улучшает из растворимость и стабильность (см., например, Цшд οΐ а1., №Циге В^οΐесЬηοίοду. 22:877-882, 2004).

Также включены системы бактериальной ферментации с большой плотностью. Например, культивирование клеток Κаίзΐοη^а етгорНа при высокой плотности обеспечивает продукцию белка при плотности клеток больше 150 г/л и экспрессию рекомбинантных белков в титрах, превышающих 10 г/л.

В дрожжах δассЬа^οтусез сеге\аз1ае может использоваться ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как альфа-фактор, алкогольоксидаза и РОН. Обзоры см. в источниках ΑизиЬеί οΐ а1. (выше) и ОгаШ οΐ а1., ΜеΐЬοбз Еηζутοί. 153:516-544 (1987). Также включены системы экспрессии РюЫа раηбο^^з (см., например, Ы οΐ а1., №Ш.1ге В^οΐесЬηοίοду. 24, 210-215, 2006; и НатПΐοη οΐ а1., δάοικο, 301:1244, 2003). Конкретные варианты реализации изобретения включают дрожжевые системы, которые сконструированы для селективного гликозилирования белков, включая дрожжи, которые имеют гуманизированные пути Ν-гликозилирования, и другие (см., например, Ηат^ίΐοη οΐ а1., δοΐοηοο. 313:1441-1443, 2006; ^ι16ϊ οΐ а1., №Ш.1ге Κеν^еγз ΜκγοΜοΕ 3:119-28, 2005; и Оетдгозз οΐ а1., №ιΐи^е-В^οΐесЬηοίοду. 22:1409-1414, 2004; патенты США № 7629163; 7326681 и 7029872). Исключительно в качестве примера, рекомбинантные дрожжевые культуры можно растить в колбах Фернбаха или ферментерах на 15Ь, 50Ь, 100Ь и 200Ь и т.д.

В случаях, когда используются растительные векторы экспрессии, экспрессия последовательности, кодирующей полипептиды, может быть запущена любым из ряда промоторов. Например, можно применять вирусные промоторы, такие как промоторы 35δ и 19δ СаΜV, отдельно или в комбинации с омегалидерной последовательностью из вируса табачной мозаики ΤΜν (Τакатаΐзи, ЕΜВΟ ί. 6:307-311 (1987)). В альтернативном варианте можно применять растительные промоторы, такие как малая субъединица ^В^СО или промоторы теплового шока (Οοπιζζί οΐ а1., ЕΜВΟ ί. 3:1671-1680 (1984); ВгодПе οΐ а1., δοΐοηοο 224:838-843 (1984); и \νίηΙΟΓ οΐ а1., Κезиίΐз РгоЬ1. Се11 ЭГГег. 17:85-105 (1991)). Указанные кон- 52 030418 струкции могут быть введены в растительные клетки путем непосредственной трансформации ДНК или патоген-опосредованной трансфекции. Указанные методы описаны в ряде общедоступных обзоров (см., например, НоЬЬк ίη МсОгате НШ, УеагЬоок оГ δ^ι^ апй Тесйш1оду, р. 191-196 (1992)).

Для экспрессии целевого полипептида также может использоваться система на основе насекомых. Например, в одной указанной системе, вирус ядерного полиэдроза ^сКР^ ЛнЮдгарйа сайГогшса используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках δροйορ!е^а Ггид1регйа или в клетках Тпсйорйыа. Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в заменимый участок вируса, такой как ген полиэдрина, и помещать под контроль промотора полиэдрина. Успешное встраивание кодирующей полипептид последовательности приводит к инактивации гена полиэдрина и продукции рекомбинантного вируса, у которого отсутствует белок оболочки. Рекомбинантные вирусы могут затем использоваться для инфицирования, например, клеток δ. Ггид1регйа или клеток Тпсйорйыа, в которых можно экспрессировать интересующий полипептид (Енде1йагй е! а1., Ргос. №ιΐ1. Αсай. δα. υ.δ.Α. 91:3224-3227 (1994)). Также включены системы экспрессии бакуловируса, включая системы, которые используют клетки δΡ9, δΡ21 и Т. ηί (см., например, Мигрйу аий РШтса-^огтк, Сшт Рго!ос Рго!еш δα. Сйар!ег 5:υηίΐ5.4, 2001). Системы насекомых могут обеспечивать пост-трансляционные модификации, подобные системам млекопитающих.

В целом доступен ряд систем экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих на основе вирусов. Например, в случаях, когда используется аденовирус в качестве вектора экспрессии, последовательности, кодирующие интересующий полипептид, можно лигировать в комплекс транскрипции/трансляции аденовируса, состоящий из позднего промотора и тройной лидерной последовательности. Встраивание в заменимый участок Е1 или Е3 вирусного генома может использоваться для получения жизнеспособного вируса, который способен экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (Родам & δйеηк, Ргос. №·ιΐ1. Αсай. δα. υ.δ.Α. 81:3655-3659 (1984)). Кроме того, можно применять энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (Κδν), для повышения экспрессии в хозяйской клетке млекопитающего.

Примеры применимых хозяйских клеточных линий млекопитающих включают линию клеток почки обезьяны СV1, трансформированные δν40 ΡΟδ-7, ΑΤСС СРЙ 1651); линию человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Огайат е! а1., Л. Оеη νίΐΌ1. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомячка (ВНК, ΑΤСС ССЬ 10); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Ма1йег, Вю1. Рергой. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (С'У1 ΑΤСС ССЬ 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (νΕΚΟ-76, ΑΤСС СИР-1587); клетки карциномы шейки матки человека (ΗΕΡΑ, ΑΤСС ССЬ 2); клетки почки собаки (МОСК, ΑΤСС ССЬ 34); клетки печени крыс буфало (ΒΚΣ 3А, ΑΤСС СНЬ 1442); клетки легкого человека (^138, ΑΤСС ССЬ 75); клетки печени человека (Нер О2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, ΑΤСС ССЬ51); клетки ТШ (Ма!йег е! а1., Αηππ1κ Ν.Υ. Αсай. δα. 383:44-68 (1982)); клетки М^ 5; клетки Ρδ4; и клеточную линию гепатомы человека (Нер О2). Другие применимые хозяйские клеточные линии млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки Ό^^^Ο РгйшЬ е! а1., РNΑδ υδΑ 77:4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как ΝδΟ и δρ2/0. Обзор конкретных хозяйских клеточных линий млекопитающих, подходящих для продукции антител, можно найти, например, в источниках Υаζак^ апй ^и, Ме!йойк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ^1. 248 (В.К.С. Ьо, ей., Читана Ргекк, То1о\уа, ΝΡ, 2003), р. 255-268. Конкретные предпочтительные системы экспрессии на основе клеток млекопитающих включают системы экспрессии на основе клеток СНО и НЕК293. Системы экспрессии млекопитающих могут использовать адгезионные клеточные линии, выращенные, например, на Т-флаконах, роллерных флаконах или клеточных фабриках, или суспензионные культуры, выращенные, например, во вращающихся флаконах на 1 и 5 л, биореакторах с механическим перемешиванием на 5, 14, 40, 100 или 200 л или биореакторах на 20/50 л и 100/200 л ^ΑνΕ, среди прочего, известных в данной области техники.

Также включены бесклеточные системы экспрессии белков. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения как правило, используют очищенную РНК-полимеразу, рибосомы, тРНК и рибонуклеотиды; указанные реагенты могут быть получены путем экстракции из клеток или их клеточной системы экспрессии.

Специфические инициирующие сигналы также можно применять для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих интересующий полипептид. Указанные сигналы включают инициирующий кодон ΑΤО и прилежащие последовательности. В случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и вышележащие последовательности, встраиваются в соответствующий вектор экспрессии, нет необходимости в дополнительных сигналах контроля транскрипции или трансляции. Однако в случаях, когда встраиваются только кодирующая последовательность или ее части, должны быть обеспечены экзогенные сигналы контроля трансляции, включая инициирующий кодон ΑΤО. Более того, инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания для обеспечения трансляции целой встроенной последовательности. Экзогенные элементы трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, быть как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения энхансеров, которые соответствуют для конкретной используемой клеточной системы, такие как энхан- 53 030418 серы, описанные в литературе (ЬсНагГ. е! а1., Ре8и118 РгоЬ1. Се11 ΌίΠοΓ. 20:125-162 (1994)).

Кроме того, может быть выбран штамм хозяйских клеток на основе их способности модулировать экспрессию встроенной последовательности или процессировать экспрессируемый белок желаемым образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются перечисленными: посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, присоединение липидов и ацилирование. Пост-трансляционный процессинг, обеспечивающий расщепление препро формы белка, может также использоваться для облегчения правильного встраивания, укладки и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как дрожжи, СНО, НеЬа, МОСК, НЕК293 и А138, кроме бактериальных клеток, которые имеют или даже не имеют специальный клеточный аппарат и характерные механизмы для пост-трансляционной активности, могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка.

Для длительной высокоэффективной продукции рекомбинантных белков стабильная экспрессия в целом является предпочтительной. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют интересующий полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием векторов экспрессии, которые могут содержать вирусные ориджины репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и выбранный маркерный ген в том же или в отдельном векторе. После встраивания вектора клеткам можно позволить расти в течение примерно 1-2 дней в обогащенной питательной среде до их перевода на селективную среду. Целью селективного маркера является подтверждение устойчивости селекции, и его присутствие позволяет рост и репарацию клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток можно размножать с использованием методов тканевых культур, соответствующих данному типу клеток. Временная продукция, например, путем временной трансфекции или инфекции, также может использоваться. Типичные системы экспрессии млекопитающих, которые являются подходящими для временной продукции, включают системы на основе клеток НЕК293 и СНО.

Любое число систем селекции может использоваться для восстановления трансформированных или трансдуцированных клеточных линий. Указанные включают, но не ограничиваются перечисленными: гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (А1д1ег е! а1., Се11 11:223-232 (1977)) и аденинфосфорибозинтрансферазы (Ьоуу е! а1., Се11 22:817-823 (1990)), которые можно применять в !к- или аρ^ΐ-клетках соответственно. Также антиметаболическая устойчивость, устойчивость к антибиотикам или гербицидам может использоваться в качестве основы для селекции; например, ДЬГг, которая обеспечивает устойчивость к метотрексату (А1д1ег е! а1., Ргос. Αсаά. δα. υ.δ.Α. 77:3567-70 (1980)); ηρ!, который обеспечивает устойчивость к аминогликозидам, неомицину и С-418 (Сο1Ье^е-Са^аρ^η е! а1., I. Мо1. Βίο1. 150:1-14 (1981)); и а18 или ρа!, которые обеспечивают устойчивость к хлорсульфурону и фосфинотрицинацетилтрансферазе, соответственно (Мшту, выше). Были описанные другие селективные гены, например, ΙτρΒ, которые позволяют клеткам использовать индол вместо триптофана, или Й18, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (НаПтам & МиШдая Ргос. №!1. Αсаά. δθ. υ.δ.Α. 85:8047-51 (1988)). Применение видимых маркеров приобрело популярность с использованием таких маркеров, как зеленый флуоресцентный белок (дгеен Г1иоге8сеШ ρΓοαίη, СРР) и другие флуоресцентные белки (например, ИРР, ΥΒΈ), антоцианины, β-глюкуронидаза и ее субстрат Ουδ и люцифераза и ее субстрат люциферин, которые широко используются не только для идентификации трансформантов, но также для количественной оценки неустойчивой или стабильной экспрессии белка, обеспечиваемой конкретной векторной системой (см., например, Р1ю0е8 е! а1., Ме!йоЙ8 Мо1. Βίο1. 55:121-131 (1995)).

Варианты реализации настоящего изобретения также включают высокоэффективные системы продукции белка или низкоэффективные системы продукции. Согласно конкретным аспектам, можно применять, например, слитые с гексагистидином метки для экспрессии и очистки белка на модифицированных хелатом металла поверхностях скольжения или Мадг1еН18 Νί-частицах (см., например, Куоп е! а1., ВМС ВюйсЬпоГ 9:72, 2009; и Ьт е! а1., МеШоЙ8 Мо1 Βίο1. 498:129-41, 2009)). Также включены высокоэффективные бесклеточные белковые системы экспрессии (см., например, δ^!а^атаη е! а1., Ме!йоЙ8 Мо1 Βίο1. 498:229-44, 2009). Указанные и связанные варианты реализации изобретения можно применять, например, для получения микрочипов белковых фрагментов ΑΑΚδ, которые могут затем использоваться для скрининга библиотек для идентификации агентов, которые взаимодействуют с белковым фрагментом (фрагментами) ΑΑΚδ.

Различные протоколы для детектирования и измерения экспрессии кодируемых полинуклеотидом продуктов с использованием связывающих агентов или антител, таких как поликлональные или моноклональные антитела, специфические для указанного продукта, известны в данной области техники. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΜδΑ), вестерн-иммуноблотинг, радиоиммунологические анализы (ΚΙΑ) и сортировку флуоресцентно-активированных клеток (РΑСδ). Эти и другие анализы описаны, среди других источников, в Натρ!οη е! а1., δе^ο1οд^са1 МеШоЙ8, а ЬаЬога!огу Магша1 (1990) и МаДДох е! а1., I. Εχρ. МеД. 158:1211-1216 (1983).

Широкое разнообразие меток и методов конъюгации известны специалистам в данной области техники и их можно применять в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения зондов для меченной гибридизации или ПЦР для выявления последовательности, связанной с по- 54 030418 линуклеотидами, включают олигомечение, ник-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. В альтернативном варианте последовательности или любые их части можно клонировать в вектор для продукции мРНК-зонда. Указанные векторы, известные в данной области техники, являются коммерчески доступными и можно применять для синтеза РНК-зондов ίη νΐίΓΟ путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или δΡ6 и меченых нуклеотидов. Указанные процедуры можно проводить использованием различных коммерчески доступных наборов. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые можно применять, включают радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.

Клетки-хозяева, трансформированные интересующей полинуклеотидной последовательностью, могут культивироваться в условиях, подходящих для экспрессии и восстановления белка из клеточной культуры. Согласно конкретному варианту реализации изобретения используется свободная от сыворотки клеточная системы экспрессии. Примеры включают клетки ΗΕΚ293 и клетки СНО, которые можно растить в бессывороточной среде (см., например, Ро^ег с1 а1., Рго1еш Ехрг. РшгР 40:237-43, 2005; и патент США № 6210922).

Белок, продуцированный рекомбинантной клеткой, может секретироваться или содержаться внутри клетки в зависимости от используемой последовательности и/или вектора. Специалистам в данной области техники ясно, что могут быть созданы векторы экспрессии, содержащие полинуклеотиды согласно изобретению, с включением сигнальных последовательностей, которые направляют секрецию закодированного полипептида через мембрану прокариотической или эукариотической клетки. Другие рекомбинантные конструкции можно применять для соединения последовательностей, кодирующих интересующий полипептид, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей домен полипептида, который будет облегчать очистку и/или детектирование растворимых белков. Примеры указанных доменов включают расщепляемые или не расщепляемые метки аффинной очистки и эпитопные метки, такие как авидин, ΡΕΑΟ-метки, поли-гистидиновые метки (например, 6χΗίδ), сМус метки, У5-метки, глутатион-δтрансферазные (ΟδΤ) метки и другие.

Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может быть очищен и охарактеризован в соответствии с различными способами, известными в данной области техники. Типичные системы для проведения очистки белка и анализа чистоты белка, включают жидкостную экспресс-хроматографию белков (ЖЭХБ) (например, системы для ЖЭХБ АКТА и Вю-каф, жидкостную хроматографию при высоком давлении (ЖХВД) (например, прибор для ЖХВД Весктап апй \Уа1сг5). Типичные химические анализы для очистки включают ионообменную хроматографию (например, 0, δ), эксклюзионную хроматографию, солевые градиенты, аффинную очистку (например, Νΐ, Со, ΡΕΑΟ, мальтоза, глутатион, белок Л/С), гель-фильтрацию, обращенно-фазовую, керамическую ΗΎΡΕΚΌ® ионообменную хроматографию и колонки для хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (Н1С), среди прочих, известных в данной области техники. Также включены аналитические способы, такие как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН) (например, окраска Кумасси, окрашивание серебром), иммуноблоттинг, метод Брэдфорда и ΕΟδΑ, которые можно применять во время любого этапа продукции или процесса очистки, как правило, для измерения чистоты белковой композиции.

Также предложены способы концентрирования белковых фрагментов ΑΑΚδ и получения композиций, содержащих концентрированные растворимые белки. Согласно различным аспектам, такие концентрированные растворы полипептидов ΑΑΚδ могут содержать белки в концентрации, составляющей примерно 5 мг/мл или примерно 8 мг/мл или примерно 10 мг/мл; примерно 15 мг/мл или примерно 20 мг/мл.

Согласно одному аспекту указанные композиции могут являться по существу монодисперсным, что означает, что указанные композиции, содержащие полипептид ΑΑ^δ, существуют в основном (т.е. по меньшей мере примерно на 90% или более) в форме, демонстрирующей одну очевидную молекулярную массу при анализе, например, с помощью эксклюзионной хроматографии, динамического рассеяния света или аналитического ультрацентрифугирования.

Согласно другому аспекту, указанные композиции являются чистыми (на основе белка) по меньшей мере примерно на 90% или согласно некоторым аспектам по меньшей мере примерно на 95% чистыми, или согласно некоторым вариантам реализации изобретения по меньшей мере на 98% чистыми. Чистоту можно определять с помощью любого стандартного аналитического способа, известного в данной области техники.

Согласно другому аспекту, содержание высокомолекулярных агрегатов в указанных композициях составляет меньше примерно 10% от общего количества присутствующего белка, или согласно некоторым вариантам реализации изобретения содержание высокомолекулярных агрегатов в указанных композициях составляет меньше примерно 5%, или согласно некоторым аспектам, содержание высокомолекулярных агрегатов в указанных композициях составляет меньше примерно 3%, или согласно некоторым вариантам реализации изобретения содержание высокомолекулярных агрегатов составляет меньше примерно 1%. Содержание высокомолекулярных агрегатов можно определить с помощью различных аналитических методов, включая, например, эксклюзионную хроматографию, динамическое рассеяние света или аналитическое ультрацентрифугирование.

- 55 030418

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, как отмечено в настоящем изобретении, содержание эндотоксина в композициях полипептида ΑΑΚδ составляет меньше примерно 10 ЕЭ/мг полипептида ΑΑΚδ или меньше примерно 5 ЕЭ/мг полипептида ΑΑΚδ, меньше примерно 3 ЕЭ/мг полипептида ΑΑΚδ или меньше примерно 1 ЕЭ/мг полипептида ΑΑΚδ.

Примеры методов концентрирования, рассмотренных в настоящем изобретении, включают лиофилизацию, которую, как правило, используют, когда раствор содержит малорастворимые компоненты, отличные от интересующего белка. Лиофилизацию часто осуществляют после проведения ЖХВД, и с ее помощью можно удалять большую часть или все летучие компоненты из смеси. Также предусмотрены методы ультрафильтрации, которые, как правило, используют одну или более селективную проницаемую мембрану для концентрации белкового раствора. Мембрана позволяет прохождение воды и малых молекул, но не пропускает белок; раствор может пропускаться через мембрану с помощью механического насоса, давления газа или центрифугирования и других методов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения реагенты, белковые фрагменты ΑΑΚδ или родственные агенты (например, антитела) являются чистыми по меньшей мере примерно на 90%, по результатам измерения в соответствии со стандартными методами в данной области техники. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения таким как диагностические композиции или конкретные терапевтические композиции, композиции, содержащие ΑΑΚδ, согласно настоящему изобретению, являются чистыми по меньшей мере примерно на 95%. Согласно конкретному варианту реализации изобретения таким как терапевтические или фармацевтические композиции, композиции, содержащие ΑΑΚδ, согласно настоящему изобретению, являются чистыми по меньшей мере примерно на 97% или 98%, или 99%. Согласно другим вариантам реализации изобретения таким как применение в качестве эталонных реагентов или реагентов для исследований, белковые фрагменты ΑΑΚδ могут быть менее чистыми и могут являться чистыми по меньшей мере примерно на 50, 60, 70 или 80%. Можно измерять общую чистоту или чистоту на основе выбранных компонентов, таких как другие белки, например, чистоту на основе белка.

Очищенные белковые фрагменты ΑΑΚδ также могут быть охарактеризованы в соответствии с их биологическими характеристиками. Примеры включают аффинность связывания или кинетику связывания с выбранным лигандом (например, клеточным партнером по связыванию белкового фрагмента ΑΑΚδ, таким как рецептор клеточной поверхности или его внеклеточный домен) и присутствие уровня одной или более традиционной или неканонической биологической активности, описанной в настоящем изобретении. Аффинность связывания и кинетику связывания можно измерить в соответствии с различными способами, известными в данной области техники, такими как В1асоге® и связанные технологии, которые используют поверхностный плазмонный резонанс (δΡΚ), оптическое явление, которое обеспечивает детектирование немеченых интерактантов в реальном времени. Биосенсоры на основе δΡΚ могут применяться для определения активной концентрации, скрининга и исследования на предмет аффинности и кинетики. Присутствие уровня одной или более традиционных или нетрадиционных биологических видов активности можно измерить в соответствии с клеточными анализами, включая анализы, которые используют клеточный партнер по связыванию (например, рецептор клеточной поверхности), выбранный из белкового фрагмента ΑΑΚδ, который функционально сопряжен с выявляемым агентом или индикатором, таким как флуоресцентный или люминесцентный индикатор неканонической биологической активности, описанный в настоящем изобретении.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения как отмечено выше, композиции, содержащие полипептид ΑΑΚδ, являются по существу приблизительно свободными от эндотоксина, например, примерно на 95% свободными от эндотоксина, предпочтительно, примерно на 99% свободными от эндотоксина, и более предпочтительно, примерно на 99,99% свободными от эндотоксина. Присутствие эндотоксинов можно выявить в соответствии со стандартными методами, известными в данной области техники, как описано в настоящем изобретении. Согласно конкретному варианту реализации изобретения композиции, содержащие ΑΑΚδ, получены из эукариотической клетки, такой как клетка млекопитающего или клетка человека, в по существу свободной от сыворотки среде.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиции, содержащие полипептид ΑΑΚδ, содержат меньше примерно 10% (по массе) высокомолекулярных агрегатов или меньше примерно 5% (по массе) высокомолекулярных агрегатов или меньше примерно 2% (по массе) высокомолекулярных агрегатов или меньше примерно 1% (по массе) высокомолекулярных агрегатов.

Также предусмотрены способы анализа и тест-системы на основе белка, которые можно применять для оценки, например, чистоты белка, размера, растворимости и степени агрегации, а также другие характеристики. Чистоту белка можно оценить несколькими путями. Например, чистоту можно оценить на основе первичной структуры, структуры высоких порядков, размера, заряда, гидрофобности и гликозилирования. Примеры способов проведения оценки первичной структуры включают Ν- и С-концевое секвенирование и пептид-картирование (см., например, Α1Κπ е! а1., Вю1одюак. 24:255-275, 1996)). Примеры способов проведения оценки структуры высоких порядков включают круговой дихроизм (см., например, Ке11у е! а1., ВюсЫт ВюрЬук ЛсЪа. 1751:119-139, 2005), флуоресцентную спектроскопию (см., например, МеадЬег е! а1., 1. Вю1. СЬет. 273:23283-89, 1998), РТ-ΙΚ, кинетику водородно-дейтериевого обмена в

- 56 030418 амидах, дифференциальную сканирующую калориметрию, ЯМР-спектроскопию, иммунореактивность с чувствительными к конформации антителами. Структуры высоких порядков также можно оценивать как функцию различных параметров, таких как рН, температура или добавленные соли. Примеры способов осуществления оценки характеристик белка, таких как размер, включают аналитическое ультрацентрифугирование и эксклюзионную ЖХВД (ЭХ-ЖХВД), и типичные способы для измерения заряда включают ионообменную хроматографию и изоэлектрическое фокусирование. Гидрофобность можно оценить, например, с помощью обращенно-фазовой ЖХВД и хроматографии гидрофобных взаимодействий ЖХВД. Гликозилирование может влиять на фармакокинетику (например, клиренс), конформацию или стабильность, связывание с рецептором и функцию белка и может быть оценено, например, с помощью масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Как отмечено выше, конкретные варианты реализации изобретения включают применение ЭХЖХВД для оценки характеристик белка, таких как чистота, размер (например, гомогенность размера) или степень агрегации, и/или для очистки белков, и другие применения. Эксклюзионная хроматография (ЭХ), также включая гель-фильтрационную хроматографию (ГФХ) и гель-проникающую хроматографию (ГПХ), относится к хроматографическому методу, в котором молекулы в растворе разделяются в пористом материале на основе их размера, или более конкретно, их гидродинамического объема, коэффициента диффузии и/или свойств поверхности. Процесс в целом используется для разделения биологических молекул и для определения молекулярных масс и распределения молекулярных масс полимеров. Как правило, биологический образец или белковый образец (такой как белковый экстракт, полученный в соответствии со способами экспрессии белка, предложенными в настоящем изобретении и известными в данной области техники) наносится на выбранную колонку для эксклюзионной хроматографии с определенной неподвижной фазой (пористым материалом), предпочтительно фазой, которая не взаимодействует с белками в образце. Согласно конкретным аспектам изобретения, неподвижная фаза состоит из инертных частиц, упакованных в плотную трехмерную матрицу внутри стеклянной или стальной колонки. Подвижная фаза может представлять собой чистую воду, водный буфер, органический растворитель или их смесь. Частицы неподвижной фазы, как правило, имеют маленькие поры и/или каналы, которые только позволяют входить молекулам ниже конкретного размера. Большие частицы, таким образом, исключаются из указанных пор и каналов и их ограниченное взаимодействие с неподвижной фазой приводит к их вымыванию в виде полностью исключенного пика в начале эксперимента. Более мелкие молекулы, которые могут вместиться в поры, удаляются из текущей подвижной фазы, и время, которое они проводят иммобилизованными в порах неподвижной фазы, зависит отчасти от того, как далеко они проникают в поры. Их удаление из тока подвижной фазы приводит к тому, что они дольше вымываются из колонки, что приводит к разделению частиц на основе различий в их размере. Конкретная колонка для эксклюзионной хроматографии имеет диапазон молекулярных масс, которые могут разделяться. В целом молекулы, которые больше верхнего предела, не улавливаются неподвижной фазой, молекулы, которые меньше нижнего предела, полностью заходят в твердую фазу и вымываются в виде одного бэнда и молекулы, находящиеся в пределах диапазона, вымываются с разными скоростями, которые определяются их свойствами, такими как гидродинамический объем. Примеры указанных способов, используемых на практике для фармацевтических белков, можно найти в источнике Вгииег е1 а1., 1оигиа1 о£ РНагтасеи11са1 апб Вютебюа1 Αηα^δίδ. 15: 1929-1935, 1997.

Чистота белка для клинического применения также обсуждается, например, Аницетти (ЛюсеЮ е1 а1., Тгепбк ίη Вю1есЬпо1о§у. 7:342-349, 1989). Более поздние методы анализа чистоты белка включают, но не ограничиваются перечисленными: ЬаЬСЫр ΟΧΙΙ, автоматизированную платформу для быстрого анализа белков и нуклеиновых кислот, которая обеспечивает высокоэффективный анализ титра, распределение по размеру и анализ чистоты белков. Согласно конкретным неограничивающим вариантам реализации изобретения белки клинической степени чистоты, такие как белковые фрагменты и антитела, могут быть получены путем использования комбинирования хроматографических материалов по меньшей мере в двух независимых этапах, среди других способов (см., например, ТНегареийс Рго1ешк: Мебюбк апб Рго1осо1к. Уо1. 308, Ебк., δта1ек апб Отек. Нитапа Ргекк 1пс., 2005). Как правило, белковые агенты (например, белковые фрагменты ΑΑΚδ, антитела, связывающие агенты) и другие агенты (например, антисмысловые, РНКи, низкомолекулярные соединения) по существу являются свободными от эндотоксинов, как измерено в соответствии со способами, известными в данной области техники и, описанными в настоящем изобретении.

Также включены способы анализа растворимости белков. Такие анализы можно применять, например, для определения оптимальных условий для роста и очистки для рекомбинантной продукции, для оптимизации выбора буфера (буферов) и для оптимизации выбора белковых фрагментов ΑΑΚδ или их вариантов. Растворимость или агрегацию можно оценить в соответствии с различными параметрами, включая температуру, рН, соли и присутствие или отсутствие других добавок. Примеры скрининговых анализов растворимости включают, но не ограничиваются перечисленными: способ измерения растворимости белка на основе микропланшетов с использованием степени прозрачности или других измерений в качестве конечной точки, высокоэффективные анализы для анализа растворимости очищенных рекомбинантных белков (см., например, δΐеηνаΠ е1 а1., ВюсЫт ВюрНук Α^. 1752:6-10, 2005), анализы,

- 57 030418 которые используют структурную комплементарность генетического маркерного белка для отслеживания и измерения укладки белка и растворимости ίη νίνο (см., например, \У1д1еу с1 а1., Ыа1иге Вю1ес1ию1оду. 19:131-136, 2001) и электрохимический скрининг растворимости рекомбинантных белков в ΕδсНепсЫа οοΐί с использованием сканирующей электрохимической микроскопии (8сапшпд е1ес1госйетюа1 Ш1сго8сору, 8ЕСМ) (см., например, Ыадатше е1 а1., В^οΐесЬηο1οду апб Вюепдшеегтд. 96:1008-1013, 2006), среди других способов. Белковые фрагменты ΑΑΚδ, обладающие повышенной растворимостью (или пониженной агрегацией) могут быть идентифицированы или выбраны в соответствии со стандартными методами в данной области техники, включая простые анализы ίη νίνο растворимости белка (см., например, Мах^е11 е! а1., Рго1еш §ск 8:1908-11, 1999).

Растворимость и агрегацию белка можно измерить с помощью методов на основе динамического рассеяния света. Агрегация представляет собой общий термин, который включает несколько типов взаимодействий или характеристик, включая растворимость/нерастворимость, ковалентные/нековалентные взаимодействия, обратимые/необратимые взаимодействия и нативное/денатурированное состояния. Для способов терапии с использованием белков присутствие агрегатов, как правило, считается нежелательным, из-за того, что агрегаты могут вызывать иммуногенную реакцию (например, малые агрегаты) или могут вызывать неблагоприятные реакции на введение (например, частиц). Динамическое рассеяние света относится к методу, который может использоваться для определения профиля распределения по размерам малых частиц в суспензии или полимерах, таких как белки в растворе. Указанный метод, также называемый фотонно-кореляционной спектроскопией (РС8) или квазиупругим рассеянием света (ОЕЬ§), использует рассеянный свет для измерения скорости диффузии белковых частиц. Колебания интенсивности рассеивания могут наблюдаться из-за броуновского движения молекул и частиц в растворе. Указанные данные о движении могут стандартным способом обрабатываться для выведения распределения по размерам для образца, где указанный размер описывается радиусом Стокса или гидродинамическим радиусом белковой частицы. Гидродинамический размер зависит как от массы, так и от формы (конформации). Динамическое рассеивание может выявлять присутствие очень малых количеств агрегированного белка (<0,01% по массе), даже в образцах, которые содержат большой диапазон масс. Его также можно использовать для сравнения стабильности различных лекарственных форм, включая, например, способы применения, которые основаны на наблюдении изменений в реальном времени при повышенных температурах. Соответственно, конкретные варианты реализации изобретения включают применение динамического рассеяния света для анализа растворимости и/или присутствия агрегатов в образце, который содержит белковый фрагмент ΆΛΚδ, антитело или другой агент согласно изобретению.

IX. Диагностические способы и композиции.

ΑΑΚδ-агенты, такие как белковые фрагменты ΑΑΚδ, полинуклеотиды ΑΑΚδ и антитела и другие связывающие агенты, описанные в настоящем изобретении, могут применяться в диагностических анализах и диагностических композициях. Включены биохимические, гистологические и клеточные способы и композиции, среди прочего.

Указанные и связанные варианты реализации изобретения включают детектирование последовательности (последовательностей) полинуклеотида ΑΑΚδ или соответствующей последовательности (последовательностей) полипептида ΑΑΚδ или его частей, одного или более новых идентифицированных белковых фрагментов ΑΑΚδ, также называемых полипептидами ΑΑΚδ. Например, конкретные аспекты включают детектирование последовательности (последовательностей) полинуклеотида ΑΑΚδ или соответствующей последовательности (последовательностей) полипептида или его частей, одного или более новых идентифицированных сплайс-вариантов ΑΑΚδ, и/или одной или более границ сплайсинга указанных сплайс-вариантов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полинуклеотид или соответствующая последовательность (последовательности) полипептида по меньшей мере одной из границ сплайсинга является уникальной для указанного конкретного сплайс-варианта ΑΑΚδ.

Также предложено непосредственное детектирование белковых фрагментов ΑΑΚδ, включая сплайс-варианты, протеолитические фрагменты и другие. Согласно конкретным вариантам реализации изобретени, присутствие или уровень одного или более новых идентифицированных белковых фрагментов ΑΑΚδ связано или коррелирует с одним или более клеточным типом или состоянием клеток. Таким образом, присутствие или уровень полипептида или полинуклеотида ΑΑΚδ можно применять для различения разных типов клеток или разных состояний клеток.

Присутствие или уровень белковых фрагментов ΑΑΚδ или родственных им полинуклеотидов может выявляться в соответствии с основанными на полинуклеотидах и/или полипептидах диагностическими методами, описанными в настоящем изобретении и известными в данной области техники.

Согласно конкретным аспектам, белковые фрагменты ΑΑΚδ, антитела или полинуклеотиды ΑΑΚδ можно применять как часть сопутствующего диагностического способа, обычно, для предсказания благоприятного ответа у субъекта или популяции субъектов на конкретное медицинское лечение. Например, конкретный терапевтическая агент ΑΑΚδ (например, белковый фрагмент, антисмысловой агент, РНКиагент, антитело, связывающий агент) можно идентифицировать как подходящий для субъекта или конкретной популяции субъектов на основе того, будет ли субъект (субъекты) иметь один или более выбранных биомаркеров для конкретного заболевания или состояния. Примеры биомаркеров включают

- 58 030418 сывороточные/тканевые маркеры, а также маркеры, которые могут быть идентифицированы с помощью методов медицинской визуализации. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения природный белковый фрагмент ААК8 (или соответствующий полинуклеотид) может сам обеспечивать сывороточный и/или тканевой биомаркер, который можно использовать для измерения результата лекарственного средства или оценки целесообразности применения указанного лекарственного средства у конкретных субъектов или в конкретных популяциях субъектов. Согласно конкретным аспектам изобретения, идентификация эталонной последовательности полипептида или полинуклеотида ААК8 может включать характеризацию дифференциальной экспрессии указанной последовательности, как в выбранном субъекте, так и в выбранной ткани, или другим способом, описанным в настоящем изобретении и известным в данной области техники.

Конкретные способы, предложенные в настоящем изобретении, основываются на различной экспрессии полипептида или полинуклеотида ААК8 для исследования состояния или стадии клетки, ткани или субъекта, и для различения их от других клеток, тканей или субъектов. Неограничивающие примеры включают способы выявления присутствия или уровня полипептида или полинуклеотида ААК8 в биологическом образце для различения клеток или тканей разных видов, клеток разных тканей или органов, стадий клеточного развития, например, клетками новорожденного и взрослого организма, стадий дифференцировки клеток, состояний, таких как здоровое, нездоровое и требующее лечения состояние, внутриклеточных и внеклеточных фракций, а также первичных клеточных культур, таких как иммортализованные клеточные культуры.

Дифференциальная экспрессия включает статистически значимое различие уровней экспрессии одного или более генов эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК8 по сравнению с уровнем экспрессии той же последовательности в соответствующем контроле. Статистически значимое различие может относиться либо к повышению, либо к снижению уровня экспрессии, при измерении на основе уровня РНК, уровня белка, функции белка или любого другого подходящего способа измерения экспрессии гена, такого как способы измерения, описанные в настоящем изобретении. Также включено сравнение полинуклеотида или полипептида ААК8 согласно изобретению и последовательности полноразмерной цитозольной или митохондриальной ААК8 или цитозольной или митохондриальной ААК8 дикого типа, как правило, такого же или соответствующего типа. Дифференциальная экспрессия может быть выявлена с помощью различных способов, известных в данной области техники и описанных в настоящем изобретении, включая способы на основе полинуклеотидов и полипептидов, такие как ПЦР в реальном времени, вычитающая гибридизация, полинуклеотидные и полипептидные чипы, и другие.

Результат, как правило, называется статистически значимым, если он с низкой вероятностью является случайным. Уровень значимости теста или результата обычно относится к анализу частоты принятия статистической гипотезы. В простых случаях, статистическая значимость может быть определена как вероятность принятия решения отвержения нулевой гипотезы, когда указанная нулевая гипотеза является в действительности справедливой (решение, известное как ошибка I типа, ложно положительное определение). Указанное решение часто принимается на основе р-значения: если р-значение меньше уровня значимости, то нулевая гипотеза отвергается. Чем меньше р-значение, тем более значимым является результат. Коэффициенты Бейеса также можно применять для определения статистической значимости (см., например, Сообтап §., Алл 1п1егп Меб 130:1005-13, 1999).

В более сложных, но с практической точки зрения важных случаях, уровень значимости критерия или результата может относиться к анализу, в котором вероятность принятия решения о том, что нулевую гипотезу следует отвергнуть, когда указанная нулевая гипотеза является в действительности справедливой, составляет не более, чем установленное значение вероятности. Указанный тип анализа обеспечивает возможность указанных применений, в которых вероятность принятия решения отвержения может быть намного меньше уровня значимости для некоторых наборов допущений, включенных в нулевую гипотезу.

Согласно конкретным типичным вариантам реализации изобретения статистически значимая дифференциальная экспрессия может включать ситуации, когда уровень экспрессии данной последовательности ААК8 обеспечивает по меньшей мере примерно 1,2х, 1,3х, 1,4х, 1,5х, 1,6х, 1,7х, 1,8х, 1,9х, 2,0х, 2,2х, 2,4х, 2,6х, 2,8х, 3,0х, 4,0х, 5,0х, 6,0х, 7,0х, 8,0х, 9,0х, 10,0х, 15,0х, 20,0х, 50,0х, 100,0х, или больше, отличие от экспрессии (т.е. обеспечивает дифференциальную экспрессию, которая может быть выше или ниже экспрессии) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с соответствующим контролем, включая все целые числа и десятичные дроби между ними (например, 1,24х, 1,25х, 2,1х, 2,5х, 60,0х, 75,0х и т.д.). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения статистически значимая дифференциальная экспрессия может включать ситуации, когда уровень экспрессии конкретной последовательности ААК8 обеспечивает по меньшей мере примерно на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000%, или больше, различие в экспрессии (т.е. дифференциальную экспрессию, которая может быть выше или ниже) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с соответствующим контролем, включая все

- 59 030418 целые числа и десятичные дроби между ними.

В качестве дополнительного примера, дифференциальную экспрессию также можно определить путем проведения Ζ-тестирования, т.е. расчета абсолютного Ζ-показателя, как описано в настоящем изобретении и известно в данной области техники (см. пример 1). Ζ-тестирование, как правило, используется для идентификации достоверных различий между средним для образца и средним для популяции. Например, по сравнению со стандартной нормальной таблицей (например, контрольной тканью), при доверительном интервале 95% (т.е. при уровне значимости 5%), Ζ-показатель с абсолютным значением более 1,96 указывает на неслучайность. Для доверительного интервала 99%, если абсолютный Ζ-показатель больше 2,58, то это означает, что р<0,01, и различие даже более достоверно нулевая гипотеза может быть отвергнута с большим доверием. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения абсолютный Ζ-показатель, равный 1,96, 2, 2,58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более, включая все десятичные дроби между ними (например, 10,1, 10,6, 11,2 и т.д.), может обеспечивать высокое значение статистической значимости. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения абсолютный Ζ-показатель, равный более, чем 6, может обеспечить крайне высокую статистическую значимость.

По существу аналогичный в целом относится к отсутствию статистически значимого различия в уровне экспрессии между биологическим образцом и эталонным контролем. Примеры фактически одинакового уровня экспрессии могут включать ситуации, где уровень экспрессии данного δδί',ΊΟδ обеспечивает меньше примерно 0,05х, 0,1х, 0,2х, 0,3х, 0,4х, 0,5х, 0,6х, 0,7х, 0,8х, 0,9х, 1,0х, 1,1х, 1,2х, 1,3х или 1,4х различие в экспрессии (т.е. дифференциальную экспрессию, которая может представлять собой более высокую или более низкую экспрессию) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с эталонным образцом, включая все десятичные дроби между ними (например, 0,15х, 0,25х, 0,35х и т.д.). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения дифференциальная экспрессия может включать ситуации, где уровень экспрессии данной последовательности ААВЯ обеспечивает меньше примерно на 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50% различие в экспрессии (т.е. дифференциальную экспрессию, которая может представлять собой более высокую или более низкую экспрессию) в предполагаемом биологическом образце по сравнению с эталонным образцом, включая все десятичные дроби между ними.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, например, когда используют микрочип АГГутеЩх для измерения уровня экспрессии эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААВЯ, дифференциальная экспрессия может также быть определена с помощью среднего значения экспрессии, суммированного с помощью программы АГТутейтх Мюгоаггау διιίΚ 5 (ΛГГутеι^^x. Санта Клара, Калифорния) или других подобных программ, как правило, при определенном среднем значении экспрессии, равном 1000.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы детектирования присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААВЯ или его части для различения клеток или тканей или других биологических образцов различных организмов или видов, где присутствие или уровень указанной последовательности связан с выбранным организмом или видом. Общие примеры включают способы различения между человеком и любой комбинацией бактерий, грибов, растений и других животных, отличных от человека. Для животных включены способы проведение различия между человеком и любой комбинацией позвоночных и беспозвоночных, включая позвоночных, таких как рыбы, амфибии, рептилии, птицы и млекопитающие, отличные от человека, и беспозвоночных, таких как насекомые, моллюски, ракообразные и кораллы. Для млекопитающих, отличных от человека, включены способы проведения различия между человеком и любой комбинацией млекопитающих, отличных от человека, из АГгокопийа, МасгоксеНйеа, ТиЬиНйеп1а1а, Нугасойеа, РгоЬокийеа, δ^^еη^а, Сшди1а!а, Рйока, δсаηйеηί^а, Оегтор!ега, Рпта!ек, Койепйа, ЬадотогрЬа, ЕгтасеотогрЬа, δο^^сοтο^рЬа, СЫгор!ега, РЬоййо!а, Се!асеа, Сагтуога, Репккойас1у1а или Агйойас1у1а. В подкласс Приматов (Рпта!е) включены мартышки, обезьяны, гориллы и шимпанзе, среди прочих, известных в данной области техники. Соответственно, присутствие или уровень эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААВЯ или варианта, описанного в настоящем изобретении, может использоваться для идентификации источника конкретного биологического образца, такого как клетка, ткань или орган, путем проведения различия между любой комбинацией указанных организмов или путем проведения различия между человеком и любым одним или более из указанных организмов, например, группой организмов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения источник конкретного биологического образца может также быть определен путем сравнения присутствия или уровня последовательности ААВЯ или ее части с заранее определенным значением.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы выявления присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААВЯ или его части для проведения различия между клетками или другими биологическими образцами, которые происходят из различных тканей или органов. Неограничивающие примеры включают способы проведения различия между клеткой или другим биологическим образцом, который происходит из любой комбинации из кожи

- 60 030418 (например, дермы, эпидермиса, подкожного слоя), волосяных фолликулов, нервной системы (например, мозга, спинного мозга, периферических нервов), слуховой системы или органов равновесия (например, внутреннего уха, среднего уха, наружного уха), респираторной системы (например, носа, трахеи, легких), гастроэзофагальных тканей, желудочно-кишечной системы (например, рта, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки), сосудистой системы (например, сердца, кровеносных сосудов и артерий), печени, мочевого пузыря, лимфатической/иммунной системы (например, лимфатических узлов, лимфоидных фолликулов, селезенки, тимуса, костного мозга), мочеполовой системы (например, почек, мочеточника, мочевого пузыря, уретры, шейки матки, фаллопиевых труб, яичников, матки, вульвы, предстательной железы, бульбоуретральных желез, придатка семенника, предстательной железы, семенных пузырьков, яичек), скелетно-мышечной системы (например, скелетных мышц, гладких мышц, костей, хряща, связок, сухожилий), жировой ткани, ткани молочной железы и эндокринной системы (например, гипоталамуса, гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, надпочечников). Таким образом, на основе связи с последовательностью полинуклеотида или полипептида ААК§, описанной в настоящем изобретении, указанные способы можно применять для идентификации или исследования ткани или органа, из которого была получена клетка или другой биологический образец.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы выявления присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК§, или его части, для исследования или проведения различия между стадиями развития или дифференцировки клетки. Также включены способы проведения различия между зародышевыми клетками, стволовыми клетками и соматическими клетками. Примеры стадий развития включают стадию новорожденного и взрослого организма. Примеры стадий дифференцировки клеток включают все из отдельных и идентифицируемых состояний между тотипотентной клеткой, плюрипотентной клеткой, мультипотентной прогениторной стволовой клеткой и зрелой, полностью дифференцированной клеткой.

Тотипотентная клетка, имеющая общий потенциал, как правило возникает в результате полового и неполового размножения и включает споры и зиготы, хотя в конкретных примерах указанные клетки могут дедифференцироваться и восстанавливать тотипотентность. Плюрипотентная клетка включает стволовую клетку, которая имеет способность дифференцироваться в любой из трех зародышевых листков, включая эндодерму (внутренняя выстилка желудка, желудочно-кишечный тракт, легкие), мезодерму (мышцы, кость, кровь, мочеполовая система) и эктодерму (эпидермальные ткани и нервная система).

Мультипотентные клетки-предшественники, как правило, способны дифференцироваться в ограниченное число типов тканей. Примеры мультипотентных клеток включают, но не ограничиваются перечисленными: гематопоэтические стволовые клетки (взрослые стволовые клетки) из костного мозга, которые дают начало клеткам иммунной системы, таким как эритроциты, лейкоциты крови и тромбоциты, мезенхимальные стволовые клетки (взрослые стволовые клетки) из костного мозга, которые дают начало стромальным клеткам, жировым клеткам и различным типам клеток кости, эпителиальные стволовые клетки (клетки-предшественники), которые дают начало различным типам клеток кожи, и мышечные сателлитные клетки (клетки-предшественники), которые вносят вклад в дифференцированную мышечную ткань. Соответственно, присутствие или уровень конкретной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК§ (например, границы сплайсинга сплайс-варианта ААК§, протеолитического фрагмента ААК§), может использоваться для исследования или проведения различия между вышеуказанными стадиями дифференцировки клеток и контролем или предварительно определенным уровнем.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы выявления присутствия или уровня эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ААК.8 для исследования или диагностирования состояния или клетки, ткани, органа или субъекта, в котором указанное состояние может быть охарактеризовано как здоровое, не здоровое, подверженное риску заболевания или подверженное лечению. Для указанных диагностических целей, термин диагностический или диагностировать включает идентификацию присутствия или природы патологического состояния, определение риска развития указанного состояния и/или измерение изменения (или отсутствия изменения) патологического состояния в ответ на лечение. Диагностические способы могут отличаться по чувствительности и специфичности. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения чувствительность диагностического анализа относится к проценту больных клеток, тканей или субъектов, которые имеют положительный ответ в указанном анализе (процент истинно положительных). Больные клетки, ткани или субъекты, не выявляемые с помощью анализа, как правило, называются ложно отрицательными. Клетки, ткани или субъекты, которые не являются больными и которые имеют отрицательный ответ в анализе, могут называться истинно отрицательными. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения специфичность диагностического анализа может быть определена как один (1) минус частота встречаемости ложно позитивных, где частота встречаемости ложно позитивных определяется как отношение образцов или субъектов, не являющими больными, которые имеют положительный ответ в анализе. Поскольку конкретные диагностические способы могут не обеспечивать точного диагностирования состояния, является достаточным, если способ обеспечивает положительную индикацию, способствующую диагностированию.

В конкретных примерах, существование риска развития патологического состояния можно диагно- 61 030418 стировать путем сравнения присутствия или уровня одной или более выбранной эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида ΑΑΚδ, или его частей, который коррелирует с состоянием на основе повышенного или пониженного уровня по сравнению с подходящим контролем. Подходящий контроль или соответствующий контроль включает значение, уровень, признак, характеристику или свойство, определенное в клетке или другом биологическом образце ткани или организма, например, контрольная или нормальная клетка, ткань или организм, проявляющий, например, нормальные признаки, таких как отсутствие состояния. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения подходящий контроль или соответствующий контроль представляет собой предварительно определенное значение, уровень, признак, характеристику или свойство. Другие подходящие контроли очевидны специалистам в данной области техники. Примеры заболеваний и состояний описаны в другой части настоящего изобретения.

Варианты реализации настоящего изобретения включают способы детектирования на основе полинуклеотида или нуклеиновой кислоты ΑΑΚδ, которые обеспечивают конкретные преимущества благодаря чувствительности детектирования. Таким образом, конкретные варианты реализации изобретения относятся к применению или детектированию полинуклеотидов ΑΑΚδ как части способа диагностики или диагностической тест-системы. Присутствие и/или уровень полинуклеотидов ΑΑΚδ можно измерять с помощью любого способа, известного в данной области техники, включая гибридизационные анализы, такие как Нозерн-блоттинг, количественная или качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР), количественная или качественная ПЦР с обратной транскриптазой (^-0^), микрочип, дот- или спотблоттинг или Ш 8Йи гибридизация, такая как флуоресцентная Ш 8Йи гибридизация (РШН), среди других способов. Конкретные из указанных способов описаны более подробно ниже.

Полинуклеотиды ΑΑΚδ, такие как ДНК и РНК, могут быть собраны и/или получены из крови, биологических жидкостей, тканей, органов, клеточных линий или других подходящих образцов с использованием методов, известных в данной области техники, таких как методы, описанные в источнике (Кшд8Шп, 2002 СиггеШ РгоЮсоР Ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЫ. Α88οс. Шс. & 1оНп Айеу & δοη8, Шс., ΝΥ, ΝΥ (см., например, как описано в источнике №18оп еί а1., Ргос №ιΐ1 Αсай δ^ υδΑ, 99: 11890-11895, 2002)) и в других источниках. Более того, различные коммерчески доступные наборы для конструирования РНК применимы для создания РНК для использования согласно настоящему изобретению. РНК может быть создана из органов/тканей/клеток, полученных из нормальных здоровых субъектов; однако, настоящее изобретение также рассматривает конструирование РНК из не здоровых субъектов. Конкретные варианты реализации изобретения предполагают использование любого типа органа из любого типа субъекта или животного. Для тестируемых образцов РНК может быть получена из индивида (например, животного, включая млекопитающих), страдающего или не страдающего видимым заболеванием, и из образцов ткани, биологических жидкостей (например, цельной крови) или т. п.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения амплификация или конструирование последовательности кДНК может быть полезным для повышения детектирующей способности. Согласно настоящему изобретению, также как и в данной области техники, предложен необходимый уровень детализации для осуществления указанных задач. Согласно одному типичному варианту реализации изобретения цельная кровь используется в качестве источника РНК и, соответственно, необязательно используются РНК-стабилизирующие реагенты, такие как РАХ-пробирки, как описано, например, в источниках ТНасН е1 а1., I. ^типок МеШоЙ8. Вес 283 (1-2):269-279, 2003 и СНа1 е1 а1., I. С1Ш. ЬаЬ Α^Ε 19 (5):182-188, 2005 (оба из которых включены посредством ссылки). Библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) могут быть созданы с использованием методов, известных в данной области техники, таких как методы, описанные в источниках Αυ8υ^1 еί а1. (2001 СиггеШ РгоЮсоЕ Ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬ1. Α88οс. Шс. & ШЬп Айеу & δοη8, Шс., ΝΥ, ΝΥ); δатЬ^οοк еί а1. (1989 Мо1еси1аг С1опШд, δесοηй Ей., Со1й δρ^^ηд НагЬог ЕаНогаЮг^·, РЕнтае!!; ΝΥ); МатаШ еί а1. (1982 Мо1еси1аг С1опШд, Со1й δρ^^ηд НагЬог каЬогаЮг^·, Р1атνίον, ΝΥ), а также в других источниках. Кроме того, различные коммерчески доступные наборы для создания библиотеки кДНК являются применимыми для создания библиотеки кДНК согласно настоящему изобретению. Могут быть созданы библиотеки из органов/тканей/клеток, полученных от нормальных здоровых субъектов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять способы гибридизации для детектирования полинуклеотидных последовательностей ΑΑΚδ. Способы проведения анализов гибридизации полинуклеотидов хорошо развиты в данной области техники. Методы и условия гибридизационного анализа варьируют в зависимости от применения и выбраны в соответствии с общими известными методами связывания, включая методы, на которые ссылаются в источниках МашаЙ8 еί а1., Мо1еси1аг С1отпд: Α ЕаЬогаЮгу Мапиа1 (2^пй Ей. Со1й δρ^^ηд НагЬог, Ν.Υ., 1989); Вегдег апй К1тте1 МеШой8 т Еп/утоКду, ^1. 152, Сшйе Ш Мо1еси1аг С1отпд ТесНп1цие8 (^айепкс Рге88, Шс., δаη О1едо, СаНГ., 1987); Υοиηд апй Оау18, ΡNΑδ. 80: 1194 (1983). Способы и приборы для осуществления воспроизводимых и контролируемых реакций гибридизации были описаны в патентах США № 5871928, 5874219, 6045996 и 6386749, 6391623, каждый из которых включен в настоящее изобретение посредством ссылки.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять способы амплификации нуклеиновых кислот для детектирования полинуклеотидных последовательностей ΑΑΚδ. Термин

- 62 030418 амплификация или амплификация нуклеиновых кислот относится к продукции множества копий нуклеиновой кислоты-мишени, которая содержит по меньшей мере часть предполагаемой специфической последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Множество копий может называться ампликоном или продуктами амплификации. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения амплифицированная мишень содержит не полную последовательность гена-мишени (интроны и экзоны) или экспрессированную последовательности гена-мишени (сплайсированный транскрипт экзонов и фланкирующих нетранслируемых последовательностей). Например, специфические ампликоны могут продуцироваться путем амплификации части интересующего полинуклеотида при использовании праймеров для амплификации, которые гибридизуются и инициируют полимеризацию со внутренних сайтов интересующего полинуклеотида.

Предпочтительно, амплифицируемая часть содержит поддающуюся выявлению последовательность-мишень, которая может быть выявлена с использованием любого из различных хорошо известных способов.

Селективная амплификация или специфичная амплификация, в настоящем изобретении, относится к амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, где выявляемая амплификация последовательности-мишени по существу ограничена амплификацией последовательности-мишени, в которую вносит вклад интересующий образец нуклеиновой кислоты, подверженный тестированию, и не вносит вклад последовательность нуклеиновой кислотымишени, полученная из другого источника образца, например, загрязнения, присутствующего в реагентах, используемых во время реакций амплификации, или в окружении, в котором проводят указанные реакции амплификации.

Термин условия амплификации относится к условиям, обеспечивающим амплификацию нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. Условия амплификации, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, могут быть менее жесткими по сравнению с жесткими условиями гибридизации, описанными в настоящем изобретении. Олигонуклеотиды, используемые в реакциях амплификации согласно настоящему изобретению гибридизуются с их предполагаемыми мишенями в условиях амплификации, но могут или не могут гибридизоваться при жестких условиях гибридизации. С другой стороны, зонды для детектирования согласно настоящему изобретению, как правило, гибридизуются при жестких условиях гибридизации. Приемлемые условия для осуществления амплификации нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением могут быть с легкостью определены специалистом в данной области техники в зависимости от конкретного используемого способа амплификации.

Многие хорошо известные способы амплификации нуклеиновых кислот требуют термоциклирования для чередования циклов денатурации двуцепочечной нуклеиновой кислоты и гибридизации праймеров; однако, другие хорошо известные способы амплификации нуклеиновых кислот являются изотермическими. Полимеразная цепная реакция (патенты США № 4683195; 4683202; 4800159; 4965188), обычно называемая ПЦР, использует множество циклов денатурации, отжига пар праймеров с комплементарной цепочкой и удлинения праймеров с экспоненциальным увеличением числа копий последовательностимишени. В вариации, называемой КТ-ПЦР, обратная транскриптаза (КТ) используется для создания комплементарной ДНК (кДНК) на основе мРНК, и указанная кДНК затем амплифицируется с помощью ПЦР для продукции множества копий ДНК.

Как отмечено выше, термин ПЦР относится к множеству циклов амплификации, которые селективно амплифицируют намеченный вид нуклеиновой кислоты. Включены количественная ПЦР (кПЦР), ПЦР в реальном времени, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и количественная ПЦР с обратной траскрипцией (аРВ-ПЦР), хорошо описанные в данной области техники. Термин рПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции и термин кОТ-ПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. кПЦР и кОТ-ПЦР можно применять для амплификации и одновременной количественной оценки молекулы кДНК-мишени. Она обеспечивает и детектирование, и количественную оценку специфической последовательности в пуле кДНК, такой как выбранный ген или транскрипт.

ПЦР в реальном времени может использовать ДНК-связывающий краситель для связывания со всеми двуцепочечными (дц) ДНК в ПЦР, приводя к флуоресценции красителя. Увеличение количества продукта ДНК во время ПЦР, следовательно, приводит к повышению интенсивности флуоресценции и измеряется в каждом цикле, таким образом, позволяя количественно оценивать концентрацию ДНК. Однако красители дцДНК, такие как 8ΥВК Сгееи, связываются со всеми ПЦР-продуктами дцДНК. Флуоресценцию выявляют и измеряют в термоциклере для ПЦР в реальном времени и ее возрастание в геометрической прогрессии, соответствующее экспоненциальному росту количества продукта, используется для определения порогового цикла (С1) в каждой реакции.

Термин значение СТ' относится к значению порогового цикла, который представляет собой цикл, при котором ПЦР-амплификация превосходит пороговый уровень. Если присутствует более высокое количество мРНК для конкретного гена в образце, то она превысит порог раньше по сравнению с геном, экспрессируемым на низком уровне, из-за большего количества исходной РНК для амплификации. Таким образом, низкое значение С указывает на высокий уровень экспрессии гена в образце, и высокое

- 63 030418 значение С1 указывает на низкий уровень экспрессии гена.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения может использоваться лигазная цепная реакция (^е188, δ^ι^. 254: 1292, 1991), обычно называемая ЛЦР, которая использует два набора комплементарных олигонуклеотидов ДНК, которые гибридизуются с соседними участками нуклеиновой кислоты-мишени. Олигонуклеотиды ДНК ковалентно связываются с помощью ДНК-лигазы в повторяющихся циклах термической денатурации, гибридизации и лигирования для получения поддающегося выявлению двуцепочечного лигированного олигонуклеотидного продукта.

Другой способ представляет собой амплификацию с перемещением цепи (\Уа1кег„ С. еΐ а1., 1992, Ргос. №а1. Αсаά. δ^. υδΑ 89:392-396; патенты США № 5270184 и 5455166), обычно называемую δΌΑ, которая использует циклы отжига последовательностей пар праймеров с комплементарными цепочками последовательности-мишени, удлинения праймера в присутствии άNТΡαδ для продукции дуплекса гемифосфоротиотированного продукта удлинения праймера, опосредованное эндонуклеазами внесение одноцепочечного разрыва в гемимодифицированный сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазы и опосредованное полимеразой удлинение праймера от 3'-конца одноцепочечного разрыва с перемещением существующей цепочки и созданием цепочки для следующего цикла отжига праймеров, внесения одноцепочечного разрыва и перемещения цепочки, которая приводит к амлификации продукта в геометрической прогрессии. Термофильная δΌΑ (ΐδΌΑ) использует термофильные эндонуклеазы и полимеразы при более высоких температурах по существу таким же способом (европейский патент № 0684315).

Другие способы амплификации включают, например: амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (патент США № 5130238), обычно называемую NΑδΒΑ; амплификацию, которая использует РНК-репликазу для амплификации самой молекулы зонда (Ы/агйг Р. еΐ а1., 1988, ΒίοТесйшЕ 6: 1197-1202), обычно называемую ЦР-репликаза; способ амплификации на основе транскрипции (Κ^οΗ, Ό. еΐ а1., 1989, Ргос. №·ιΐ1. Αсаά. δά. υδΑ 86:1173-1177); самоподдерживающуюся репликацию последовательности (СиаΐеШ, 1. еΐ а1., 1990, Ргос. №и1. Αсаά. δ^.. υδΑ 87: 1874-1878); и опосредованную транскрипцией амплификацию (патент США № 5480784 и 5399491), обычно называемую ТМА. Более подробное обсуждение известных способов амплификации можно найти в источнике Регзшд, ЭаУ1Й Η., 1993, Ιη νίίτο №.1с1ею Ααά Αтρ1^Г^саί^οη ТесИшсщез ίη Όί;·ΐ8ηο8ΐΚ Мейюа1 МюгоЬю^ду: Ргтар1е8 аий Αрр1^саί^οη8 (Регетд еΐ а1., Εά8.), р. 51-87 δοс^еίу Γογ МюгоЬгоЦду, ^а8Ь^ηдΐοη, ЭС)).

Иллюстративные системы амплификации на основе транскрипции согласно настоящему изобретению включают ТМА, которая использует РНК-полимеразу для продукции множества РНК-транскриптов участка-мишени (патент США № 5480784 и 5399491). ТМА использует промотор-праймер, который гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью в присутствии обратной транскриптазы и РНКполимеразы для образования двуцепочечного промотора, из которого РНК-полимераза продуцирует РНК-транскрипты. Указанные транскрипты могут становиться матрицей для дальнейших циклов ТМА в присутствии второго праймера, способного гибридизоваться с РНК-транскриптами. В отличие от ПЦР, ЛЦР или других способов, которые требуют термической денатурации, ТМА представляет собой изотермический способ, использующий активность РНКазы Н для расщепления цепочки РНК гибрида РНК:ДНК, таким образом, создавая цепочку ДНК, доступную для гибридизации с праймером или промотором-праймером. В целом используется активность РНКазы Н вместе с обратной транскриптазой, обеспечивающей амплификацию.

В иллюстративном способе ТМА, один праймер для амплификации представляет собой олигонуклеотидный промотор-праймер, который содержит последовательность промотора, которая становится функциональной, когда является двуцепочечной, расположенную со стороны 5' по отношению к связывающейся с мишенью последовательности, которая способна гибридизоваться с сайтом связывания РНКмишени в положении 3' по отношению к последовательности, которую предполагается амплифицировать.

Промотор-праймер может называться Т7-праймер, когда он является специфичным для распознавания РНК-полимеразы Т7. При конкретных обстоятельствах 3'-конец промотора-праймера или субпопуляции указанных промоторов-праймеров, может быть модифицирован для блокировки или уменьшения удлинения праймера. Из немодифицированного промотора-праймера обратная транскриптаза создает копию кДНК РНК-мишени, тогда как активность РНКазы Н деградирует РНК-мишень. Второй праймер для амплификации затем связывается с кДНК. Указанный праймер может называться не-Т7 праймер для отличия его от Т7-праймера. Из указанного второго праймера для амплификации обратная транскриптаза создает другую цепочку ДНК, что приводит к образованию двуцепочечной ДНК, содержащей функциональный промотор на одном конце. Когда последовательность промотора является двуцепочечной, она способна связываться с РНК-полимеразой для начала транскрипции последовательностимишени, с которой был гибридизован промотор-праймер. РНК-полимераза использует указанную последовательность промотора для продукции множества РНК-транскриптов (т.е. ампликонов) в целом примерно от 100 до 1000 копий. Каждый новый синтезированный ампликон может гибридизоваться со вторым праймером для амплификации. Обратная транскриптаза затем может создавать копию ДНК, тогда как активность РНК-азыН приводит к деградации РНК указанного дуплекса РНК: ДНК. Промотор- 64 030418 праймер затем может связываться с новой синтезированной ДНК, позволяя обратной транскриптазе создавать двуцепочечную ДНК, из которой РНК-полимераза продуцирует множество ампликонов. Таким образом, изотермическая амплификация в миллиард раз может достигаться с использованием двух праймеров для амплификации.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения другие методы можно применять для оценки РНК-транскриптов из транскриптов из конкретной библиотеки кДНК, включая анализ с использованием микрочипа (Нап, М., еί а1., ΝηΙ В^есЬпо1, 19: 631-635, 2001; Вао, Р., еί а1., Αηαΐ СЬет, 74: 17921797, 2002; 8сЬепа еί а1., Ргос. №И. Αсай. δα. υδΑ 93:10614-19, 1996; и Не11ег еί а1., Ргос. №Й. Αсай. δα. υδΑ 94:2150-55, 1997) и δΑΟΕ (серийный анализ экспрессии генов). Подобно ΜΡδδ, метод δΑΟΕ является цифровым и может производить большое количество специфических последовательностей (см., например, Уе1си1е8си, V. Е., еί а1., Тгепйк Оепе1. 16: 423-425., 2000; Ти1е)а Κ. апй Ти1е)а Ν. Вюеккаук. 2004 Лид; 26(8):916-22), несмотря на то, что порядки величин для указанного анализа ниже по сравнению с методами, такими как ΜΡδδ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения термин микрочип включает микрочип нуклеиновых кислот, содержащий множество связанных с субстратом нуклеиновых кислот, где гибридизация с каждой из множества связанных нуклеиновых кислот отдельно поддается выявлению. Субстрат может быть твердым или пористым, плоским или неплоским, цельным или дискретным. Микрочипы нуклеиновых кислот включают все устройства, указанные в источниках δΟκικι (ей.), ΌΝΑ М1сгоаггаук: Α РгасПса! ДрргоасН (РгасИса! ДрргоасН δе^^е5), О\Гогй ипДегкПу Ргекк (1999); №-Ииге Сепе1. 21(1) (кирро1.): 1-60 (1999); δΟκικι (ей.), М1сгоаггау ВюсЫр: Тоо1к апй ТесЬпо1оду, ЕаЮп РиЬНкЫпд Сотрапу/ВюТесЬтдиек Воокк ОМкюп (2000). Микрочипы нуклеиновых кислот могут включать множество связанных с субстратом нуклеиновых кислот, в которых множество нуклеиновых кислот расположены на множестве гранул вместо цельного плоского субстрата, как описано, например, в источнике Вгеппег еί а1., Ргос. Νηΐ1. Αсай. δα. υδΑ 97(4): 1665-1670 (2000). Примеры микрочипов нуклеиновых кислот могут быть найдены в патентах США № 6391623, 6383754, 6383749, 6380377, 6379897, 6376191, 6372431, 6351712, 6344316, 6316193, 6312906, 6309828, 6309824, 6306643, 6300063, 6287850, 6284497, 6284465,

6280954, 6262216, 6251601, 6245518, 6263287, 6251601, 6238866, 6228575, 6214587, 6203989, 6171797,

6103474, 6083726, 6054274, 6040138, 6083726, 6004755, 6001309, 5958342, 5952180, 5936731, 5843655,

5814454, 5837196, 5436327, 5412087 и 5405783, описания которых включены посредством ссылки.

Дополнительные примеры включают чипы нуклеиновых кислот, которые являются коммерчески доступными из компании ДГГуте1п.\ (Санта-Клара, Калифорния) под брэндовым названием ΟΕΝΕΟΗΦ™. Другие типичные способы изготовления и применения чипов предложены, например, в патентах США № 7028629; 7011949; 7011945; 6936419; 6927032; 6924103; 6921642 и 6818394.

Настоящее изобретение, в отношении чипов и микрочипов, также предполагает различные способы применения полимеров, присоединенных к твердым субстратам. Способы применения включают мониторинг экспрессии генов, анализ уровня экспрессии, скрининг библиотек, генотипирование и диагностику. Способы мониторинга и анализа уровня экспрессии генов и способы, применимые для мониторинга и анализа уровня экспрессии генов описаны в патентах США № 5800992, 6013449, 6020135, 6033860, 6040138, 6177248 и 6309822. Генотипирование и способы его применения описаны в патентах США № 10/442021, 10/013598 (публикация заявки на патент США № 2003/0036069) и патентах США № 5925525, 6268141, 5856092, 6267152, 6300063, 6525185, 6632611, 5858659, 6284460, 6361947, 6368799, 6673579 и 6333179. Другие способы амплификации нуклеиновых кислот, мечения и анализа, которые можно применять в комбинации со способами, раскрытыми в настоящем изобретении, описаны в патентах США № 5871928, 5902723, 6045996, 5541061 и 6197506.

Как очевидно специалистам в данной области техники, согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять олигонуклеотиды, такие как праймеры или зонды, для амплификации или детектирования, как описано в настоящем изобретении. Олигонуклеотиды определенной последовательности и химической структуры могут быть получены с помощью методов, известных специалистам в данной области техники, таких как химический или биохимический синтез и ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό экспрессия из молекул рекомбинантных нуклеиновых кислот, например, бактериальных или вирусных векторов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотид не состоит только из хромосомной ДНК дикого типа или продуктов ее ш νί\Ό транскрипции.

Олигонуклеотиды или праймеры могут быть модифицированы любым образом, при условии, что данная модификация является совместимой с желаемой функцией конкретного олигонуклеотида. Специалист в данной области техники может с легкостью определить, является ли данная модификация подходящей или желаемой для любого конкретного олигонуклеотида согласно настоящему изобретению. Подходящие олигонуклеотиды ΑΑΚδ описаны более подробно в другой части настоящего изобретения.

В то время как структура и последовательность олигонуклеотидов зависит от их функции, описанной в настоящем изобретении, в целом учитываются некоторые параметры. Примерами наиболее подходящих параметров является длина, температура плавления (Тт), специфичность, комплементарность другим олигонуклеотидам в системе, содержание О/С, полипиримидиновые (Т, С) или полипуриновые (Α, О) участки и 3'-концевая последовательность. Контроль указанных и других параметров представляет

- 65 030418 собой стандартный и хорошо известный аспект конструкции олигонуклеотидов, и различные компьютерные программы с легкостью доступны для скрининга большого количества потенциальных олигонуклеотидов для поиска оптимальных вариантов.

Конкретные варианты реализации изобретения таким образом включают способы детектирования интересующего полинуклеотида ААК8 в образце, полинуклеотида, содержащего последовательность эталонного полинуклеотида ААК8, описанного в настоящем изобретении, включающие а) гибридизацию образца с зондом, содержащим последовательность, комплементарную полинуклеотиду-мишени в образце, где указанный зонд специфично гибридизуется с указанным полинуклеотидом-мишенью, в условиях, при которых образуется комплекс гибридизации между указанным зондом и указанным полинуклеотидом-мишенью, или его фрагментом и Ь) детектирование присутствия или отсутствия указанного комплекса гибридизации и, необязательно, при его наличии, определение его количества. Также включены способы детектирования интересующего полинуклеотида ААК8 в образце, полинуклеотида, содержащего последовательность эталонного полинуклеотида ААК8, описанного в настоящем изобретении, включающие а) амплификацию полинуклеотида-мишени или его фрагмента и Ь) детектирование присутствия или отсутствия указанного амлифицированного полинуклеотида-мишени, или его фрагмента, и, необязательно, при его наличии, определения его количества. Конкретные варианты реализации изобретения относятся к выявлению сплайс-вариантов ААК8, например, к выявлению уникальной границы сплайсинга сплайс-варианта, путем гибридизации, амплификации или других способов детектирования.

Варианты реализации настоящего изобретения включают различные методы детектирования на основе полипептидов ААК8, включая методы детектирования на основе антител. Согласно указанным вариантам реализации изобретения включено применение полипептидов ААК8 для создания антитела или других связывающих веществ, которые затем можно использовать в диагностических способах и композициях для детектирования или количественной оценки выбранных полипептидов ААК8 в клетке или другом биологическом образце, как правило, полученном от субъекта.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять стандартные методики и детекторы, такие как вестерн-блоттинг и иммунопреципитация, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), проточная цитометрия и имунофлуоресцентные анализы (1РА), в которых используется устройство визуализации. Указанные хорошо известные способы, как правило, используют одно или более моноклональных или поликлональных антител, как описано в настоящем изобретении, которые специфично связываются с выбранным полипептидом ААК8 согласно изобретению или уникальным участком указанного полипептида ААК8 и в целом значительно не связываются с другими полипептидами ААК8, такими как полноразмерный полипептид ААК8. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения уникальный участок полипептида ААК8 может представлять сбой уникальную трехмерную структуру, которую содержит новый идентифицированный белковый фрагмент ААК8.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять чипы, такие как микрочипы. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения микрочип также может относиться к пептидному микрочипу или белковому микрочипу, имеющему набор или множество связанных с субстратом полипептидов, где связывание с каждым из множества связанных полипептидов отдельно поддается выявлению. В альтернативном варианте пептидный микрочип может содержать множество связывающих веществ, включая, но не ограничиваясь перечисленными: моноклональные антитела, поликлональные антитела, связывающие вещества из фагового дисплея, связывающие вещества из дрожжевых двугидридных систем и аптамеры, которые могут специфично выявлять связывание полипептидов ААК8, описанных в настоящем изобретении. Чип может быть основан на выявлении с помощью аутоантител указанных полипептидов ААК8, как описано, например, в источнике КоЬшкоп е! а1., ΝηΙιιΐΌ Мебюше 8(3):295-301 (2002). Примеры пептидных чипов могут быть найдены в публикациях международных заявок на патент АО 02/31463, АО 02/25288, АО 01/94946, АО 01/88162, АО 01/68671, АО 01/57259, АО 00/61806, АО 00/54046, АО 00/47774, АО 99/40434, АО 99/39210 и АО 97/42507 и патентах США № 6268210, 5766960 и 5143854, каждый из которых включен посредством ссылки.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять массспектрометрические или другие способы, основанные на определении молекулярной массы, для диагностического детектирования последовательностей полипептида ААК8. Масс-спектрометрия (МС) в целом относится к аналитическому методу определения элементарного состава образца или молекулы. МС также может использоваться для определения химических структур молекул, таких как пептиды и другие химические соединения.

В целом масс-спектрометрия (МС) основана на ионизации химических соединений с образованием заряженных молекул или фрагментов молекул и последующем измерении отношения их массы к заряду. Согласно иллюстративному МС-методу, образец наносили на прибор МС и испаряли, компоненты образца ионизировали с помощью одного из различных способов (например, путем воздействия на них электронным лучом), которые приводят к формированию положительно заряженных частиц, положительные ионы затем ускоряются магнитным полем. Расчет отношения массы частиц к заряду (т/ζ) проводили на основе деталей перемещения ионов по мере их прохождения через электромагнитные поля, и детектирования ионов, которые были отсортированы на предыдущем этапе в соответствии с т/ζ.

- 66 030418

Иллюстративные МС-приборы имеют три модуля: ионный источник, который превращает газовую фазу образца молекулы в ионы (или, в случае ионизации электрораспылением, перемещает ионы, которые существуют в растворе, в газовую фазу); массовый анализатор, который сортирует ионы по их массе путем приложения электромагнитных полей; и детектор, который измеряет значение количества индикатора и, таким образом, обеспечивает данные для расчета относительно содержания избытка каждого присутствующего иона.

Метод МС имеет как качественное, так и количественное применения, включая идентификацию неизвестных соединений, определение изотопного состава элементов в молекуле и определение структуры соединения путем наблюдения его фрагментации. Другие применения включают количественную оценку соединения в образце или исследование основ химии ионов газовой фазы (химии ионов и нейтронов в вакууме). Включены газовая хроматография-масс-спектрометрия (ОС/Μδ или ОС-Μδ), жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЬС/Μδ или ЖХ/МС) и спектрометрия ионной подвижности/массспектрометрия (ΙΜδ/Μδ или ΙΜΜδ). Соответственно, МС-методы можно применять в соответствии с любым из способов, предложенных в настоящем изобретении, для измерения присутствия или уровня полипептида ΑΑΚδ согласно изобретению в биологическом образце и для сравнения указанных уровней с контрольным образцом или заранее определенным значением.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять устройства/способы сортировки клеток или визуализации клеток или отображения для детектирования или количественной оценки присутствия или уровня полинуклеотидов или полипептидов ΑΑΚδ. Примеры включают проточную цитометрию с активированной флуоресценцией или ΡΑСδ, иммунофлуоресцентный анализ (ΙΡΑ) и метод ш кПи гибридизации, такой как флуоресцентная ш кПи гибридизация (ΡΙδΗ).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять стандартные биологические способы, программы и системы для диагностических целей. Продукты компьютерного программного обеспечения согласно изобретению, как правило, включают машиночитаемый носитель, содержащий выполняемые компьютером программы для проведения логических этапов способа согласно изобретению. Подходящие машиночитаемые носители включают гибкий диск, ΟΟ-ΚΟΜ/ΌνΟ/ΌνΟ-ΚΟΜ, жесткий диск, флэш-память, ΚΟΜ/ΚΑΜ, магнитные ленты и т.д. Выполняемые компьютером программы могут быть написаны на подходящем компьютерном языке или комбинации нескольких языков. Основные методы вычислительной биологии описаны, например, в источниках δе!иЬа1 апб Μе^баη^к е! а1., 1п!гобис!юп !о Сотри!а!1опа1 Вю1оду ΜеίЬοбк ΤΧνδ РиЬНкЫпд Сотрапу, Вок!оп, 1997); δа1ζЬе^д, δеа^1ек. Как1Г, (Еб.), Сотри1аПопа1 ΜеίЬοбк ш Μο1еси1а^ Вю1оду, Ю^аег Αтк!е^бат, 1998); ИакН|б| апб ВиеЬ1ег, ВюшГогтаПск Вакюк: Αрр1^са!^οη ш Вю1одюа1 δ^ι^ апб Μеб^с^ηе (СРС Ргекк, Ьопбоп, 2000) и Οπ^ί& апб Вζеνаη^к ВюшГогтаПск: Α Ргас!юа1 Ошбе Гог Αηа1ук^к оГ Оепе апб Рго!ешк (ΧνίΡν & δοηк, 1пс., 2пб еб., 2001). См. патент США № 6420108.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения можно применять различные компьютерные программные продукты и обеспечения для различных целей, таких как создание зонда, управление данными, анализ и работа прибора. См. патенты США № 5593839, 5795716, 5733729, 5974164, 6066454, 6090555,6185561, 6188783, 6223127, 6229911 и 6308170.

Дискретный анализ полного генома (\νθδΑ) описан, например, в источниках Кеппебу е! а1., №!. Вю!есЬ. 21, 1233-1237 (2003), Μа!киζак^ е! а1., Оеп. Век. 14: 414-425, (2004), и Μа!киζак^, е! а1., №-11иге ΜеίЬοбк 1:109-111 (2004). Алгоритмы для использования в методах картирования описаны, например, в источниках Ьш е! а1., ВюшГогтаПск. 19: 2397-2403 (2003) и Όί е! а1., ВюшГогтаПск. 21:1958 (2005). Дополнительные способы, связанные с VОδΑ, и чипы, применимые для VОδΑ, и области применения VОδΑ описаны, например, в заявке на патент США № 60/676058, поданной 29 апреля 2005 г., 60/616273, поданной 5 октября 2004 г., 10/912445, 11/044831, 10/442021, 10/650332 и 10/463991. Полногеномные исследования связей генотипа с различными фенотипическими признаками (Оепоте \\абе аккоааПоп к!иб1ек) с использованием методов картирования описаны, например, в источниках Ни е! а1., Сапсег Иек.; 65(7):2542-6 (2005), ΜίΠπ е! а1., Сапсег ^к., 64(21):8116-25 (2004), Ви!сЬег е! а1., Нит Μο1 Оепе!., 14 (10):1315-25 (2005), и К1еш е! а1., δс^еηсе. 308 (5720):385-9 (2005).

Кроме того, конкретные варианты реализации изобретения могут включать способы предоставления генетической информации в сети, такой как интернет, как описано, например, в заявках на патент США № 10/197621, 10/063559 (публикация заявки на патент США № 2002/0183936), 10/065856, 10/065868, 10/328818, 10/328872, 10/423403 и 60/482389.

Χ. Антисмысловые и РНКи-агенты.

Варианты реализации настоящего изобретения также включают антисмысловые олигонуклеотиды и РНКи-агенты, которые направлены на полинуклеотидные последовательности ΑΑΚδ, и способы их применения для снижения экспрессии выбранного транскрипта и/или белкового фрагмента ΑΑΚδ. Конкретные варианты реализации изобретения относятся к одной или более границам сплайсинга (часто уникальным), которые генерируют сплайс-вариант белкового фрагмента ΑΑΚδ согласно настоящему изобретению. Также включены способы ингибирования на основе антисмысловых или РНКи агентов, которые направлены на конкретные сплайс-формы, для стимуляции или подавления сплайсинга выбранного

- 67 030418 белкового фрагмента. Согласно конкретным предпочтительным вариантам реализации изобретения границы сплайсинга, которые генерируют белковые фрагменты ΑΑΚδ, экспрессируются на повышенном уровне в конкретных тканях и являются уникальными для указанного сплайс-варианта. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения указанные сплайс-варианты не только являются источником цитозольной активности ΆΛΚδ в интересующем типе клеток. Например, конкретные сплайсварианты, которые являются предполагаемой мишенью, могут составлять примерно 10%-50% общего числа копий сплайс-вариантов РНК ΑΑΚδ в конкретной клетке или ткани, и предпочтительно примерно 1-10% общего числа копий сплайс-варинтов РНК ΑΑΚδ в конкретной клетке или ткани. Сплайс варианты, которые составляют примерно <1% общего числа копий сплайс-вариантов РНК ΑΑΚδ в конкретной клетке или ткани, также могут являться мишенью.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые или РНКи агенты не направлены на полноразмерный белок, так как полноразмерные белки отвечают за ключевые этапы синтеза белка, что, таким образом, позволяет избежать летальности, которая часто является результатом нокаута ΑΑΚδ дикого типа. Конкретные способы, описанные в настоящем изобретении, таким образом, можно применять для избежания нежелательных эффектов, таких как токсичность, как при лечении хронических, так и острых заболеваний, и для селективной модуляции неканонических видов активности белкового фрагмента ΑΑΚδ. Однако конкретные варианты реализации изобретения могут в общем быть направлены на последовательности ΑΑΚδ, включая полноразмерные последовательности ΑΑΚδ, например, на уничтожение или существенное нарушение физиологии клетки- или ткани-мишени.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения сплайс-вариант ΑΑΚδ, являющийся предполагаемой мишенью, обладает неканонической биологической активностью. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения сплайс-вариант ΑΑΚδ имеет пониженную или не поддающуюся выявлению традиционную активность ΑΑΚδ, и связанный с использованием антисмысловых или РНКиагентов способ, в частности, модулирует его неканоническую активность. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые или РНКи-агенты могут комбинироваться с подходом направленной или местной доставки для снижения системных нежелательных эффектов в отношении клеток и тканей, не являющихся мишенью. Среди прочего, как описано в настоящем изобретении, типичные клетки или ткани, на которые может быть таким образом направлено действие, включают раковые клетки и клетки или ткани, на которые может быть локально направлено действие путем местного применение, таких как опухоли или эпителий.

А. Антисмысловые агенты.

Термины антисмысловой олигомер или антисмысловое соединение или антисмысловой олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми и относятся к последовательности циклических субъединиц, каждая из которых содержит фрагменты спаривания оснований, соединенные межсубъединичными связями, которые позволяют фрагментам спаривания оснований гибридизоваться с последовательностьюмишенью в нуклеиновой кислоте (как правило, РНК) путем спаривания оснований Уотсона-Крика, с образованием гетеродуплекса нуклеиновая кислота:олигомер в последовательности-мишени и, как правило, таким образом, предотвращением трансляции указанной РНК. Также включены способы их применения для модуляции экспрессии выбранного транскрипта ΑΑΚδ, такого как сплайс-вариант или протеолитический фрагмент, и/или его соответствующего полипептида.

Антисмысловые олигонуклеотиды могут содержать между примерно 8 и 40 субъединицами, как правило, примерно 8-25 субъединиц и предпочтительно примерно от 12 до 25 субъединиц. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотиды могут иметь точную комплементарность последовательности-мишени или приблизительную комплементарность, как определено ниже. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения степень комплементарности между последовательностью-мишенью и антисмысловой направленной последовательностью является достаточной для образования стабильного дуплекса. Участок комплементарности антисмысловых олигомеров с последовательностью-мишенью РНК может быть не меньше 8-11 оснований, но предпочтительно содержит 1215 оснований или более например, 12-20 оснований или 12-25 оснований, включая все целые числа между указанными диапазонами. Атисмысловой олигомер, состоящий примерно из 14-15 оснований, в целом является достаточно длинным для того, чтобы иметь уникальную комплементарную последовательность для направленности против выбранного гена ΑΑΚδ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения минимальная длина комплементарных оснований может требоваться для достижения требуемой Тт связывания, как обсуждается в настоящем изобретении.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые олигомеры длиной в 40 оснований могут являться подходящими, где по меньшей мере минимальное число оснований, например, 10-12 оснований, являются комплементарными последовательности-мишени. В целом однако, облегченный или активный захват в клетках оптимален при длине олигомера меньше примерно 30 оснований. Для конкретных олигомеров, дополнительно описанных ниже, оптимальный баланс связывания стабильности и захвата в целом происходит при длине в 18-25 оснований. Включены антисмысловые олигомеры (например, ПНК, ΤΝΑ, 2'-ОМе, МОЕ), которые состоят примерно из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 оснований, в которых по

- 68 030418 меньшей мере примерно 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 заменимых или незаменимых оснований являются комплементарными их последовательности-мишени ААК8 или ее вариантам.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые олигомеры могут быть на 100% комплементарными последовательности-мишени нуклеиновых кислот ААК8 или могут включать несоответствия, например, для включения вариантов, при условии, что гетеродуплекс, образованный между олигомером и последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты ААК8, является достаточно стабильным, чтобы являться устойчивым к действию клеточных нуклеаз и других способов деградации, которые могут происходить ш У1уо. Термин последовательность-мишень относится к части РНКмишени, против которой направлен олигонуклеотид, т.е. последовательности, с которой олигонуклеотид будет гибридизоваться путем спаривания оснований комплементарной последовательности УотсонаКрика. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень может представлять собой заменимый участок мРНК ААК8 (например, уникальную границу сплайсинга мРНК ААК8) или может состоять из незаменимых участков мРНК.

Олигомерные каркасы, которые менее чувствительны к расщеплению нуклеазами, описаны ниже. Несоответствия, в случае их присутствия, являются менее дестабилизирующими в направлении концевых участков гибридного дуплекса по сравнению со средней частью. Количество разрешенных несоответствий будет зависеть от длины олигомера, процента пар оснований С:С в дуплексе и положения несоответствия (несоответствий) в дуплексе, в соответствии с хорошо известными правилами стабильности дуплекса. Несмотря на то что указанный антисмысловой олигомер не обязательно является на 100% комплементарным последовательности-мишени нуклеиновой кислоты ААК8, он является эффективным для того, чтобы стабильно и специфично связываться с последовательностью-мишенью, приводя, таким образом, к модулированию биологической активности нуклеиновой кислоты-мишени, например, экспрессии белка (белков) ААК8.

Стабильность дуплекса, образованного между олигомером и последовательностью-мишенью, представляет собой функцию Т_т связывания и чувствительности дуплекса к клеточному ферментативному расщеплению. Т_т антисмыслового олигонуклеотида для комплементарной последовательности РНК можно измерять с помощью общепринятых способов, таких как способы, описанные в источниках Натек е1 а1., ШсЫс Ааб НуЬпб17айоп, 1КЬ Ргекк, 1985, рр.107-108 или М1уаба С.С. апб Аа11асе К.В., 1987, Θ1ίдопис1еойбе 11уЬпб1/айоп 1есйтдиек, Ме11обк Еп/уто1. ^1. 154, р. 94-107. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловые олигомеры могут иметь Тт связывание для комплементарной последовательности РНК больше температуры тела, и предпочтительно, больше 50°С. Т_т в диапазоне 60-80°С или более является предпочтительной. В соответствии с хорошо известными принципами, Тт олигомерного соединения для основанного на комплементарности РНК-гибрида, может быть повышена путем повышения отношения пар оснований С:С в дуплексе, и/или путем повышения длины (в парах оснований) гетеродуплекса. В то же время, в целях оптимизации клеточного поглощения, может являться предпочтительным ограничивать размер антисмыслового олигомера. По указанной причине, соединения, которые имеют высокую Т_т (50°С или более) при длине 25 оснований, или менее, являются в целом предпочтительными по сравнению с теми, которые требуют более чем 25 оснований для высоких значений Тт.

Могут быть сконструированы антисмысловые олигомеры для блокировки или подавления трансляции мРНК или для подавления сплайс-процессинга природной пре-мРНК или индукции деградации мРНК-мишеней и могут называться направленными на или нацеленными против последовательности-мишени, с которой он гибридизуется. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень может включать любую кодирующую или некодирующую последовательность мРНК транскрипта ААК8 и может, таким образом, находиться внутри экзона или внутри интрона. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень является относительно уникальной или исключительной среди последовательностей ААК8 (например, полноразмерной ААК8) и являться селективной в отношении уменьшения экспрессии выбранного белкового фрагмента ААК8, такого как протеолитический фрагмент или сплайс-вариант. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения сайт-мишень включает 3' или 5'-сайт сплайсинга пре-процессированной мРНК или точку ветвления. Последовательность-мишень для сайта сплайсинга может включать мРНК последовательность, имеющую на 5'-конце от 1 до примерно 25 до примерно 50 пар оснований после акцепторного соединения сплайсинга или перед донорным соединением сплайсинга в препроцессированной мРНК. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения последовательность-мишень может включать границу сплайсинга альтернативно-сплайсированной мРНК ААК8, такую как граница сплайсинга, которая не встречается в полноразмерной ААК8 или является уникальной или исключительной для указанного транскрипта, в котором она либо не встречается, либо только редко встречается в других сплайс-вариантах ААК8. Олигомер более обобщенно называется нацеленным против биологически подходящей мишени, такой как эталонный полинуклеотид ААК8, когда он нацелен против нуклеиновой кислоты-мишени таким образом, как описано в настоящем изобретении.

Олигонуклеотид, как правило, является комплементарным последовательности-мишени, такой как

- 69 030418

ДНК- или РНК-мишень. Термины комплементарный и комплементарность относятся к полинуклеотидам (т.е. последовательностям нуклеотидов), соединенным по правилам спаривания оснований. Например, последовательность Α-О-Т является комплементарной последовательности Т-С-А. Комплементарность может быть частичной, когда только некоторые из оснований нуклеиновой кислоты не соответсвуют согласно правилам спаривания оснований. Или же указанные последовательности нуклеиновых кислот могут иметь идеальную или полную комплементарность (100%). Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительное влияние на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Тогда как идеальная комплементарность часто является желательной, некоторые варианты реализации изобретения могут включать одно или более предпочтительно 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 несоответствие в отношении последовательности-мишени. Включены вариации в любом положении олигомера. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения вариации последовательности вблизи конца олигомера в целом являются предпочтительными по сравнению с вариациями в начале последовательности и, при их наличии, как правило, составляют в пределах примерно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотида со стороны 5' и/или 3'-конца.

Термин направленная (нацеленная) последовательность, или согласно конкретным вариантам реализации изобретения антисмысловая направленная последовательность относится к последовательности в олигонуклеотиде, которая является комплементарной (что означает, кроме того, по существу комплементарной) последовательности-мишени в молекуле-мишени ДНК или РНК. Целая последовательность или только часть антисмыслового соединения может быть комплементарной последовательностимишени. Например, в олигонуклеотиде, содержащем 20-30 оснований, примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 оснований могут составлять направленные последовательности, которые являются комплементарными области-мишени. Как правило, направленная последовательность образована из заменимых оснований, но, в альтернативном варианте, может быть образована из незаменимых последовательностей, которые при объединении, например, из противоположных концов олигонуклеотида, составляют последовательность, которая захватывает последовательность-мишень.

Последовательность-мишень и направленная последовательность, описаны как комплементарные друг другу при гибридизации в антипараллельной конфигурации. Направленная последовательность может иметь приблизительную или значительную комплементарность последовательности-мишени, но все еще функционировать в целях настоящего изобретения, т.е. она может все еще являться функционально комплементарной. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения олигонуклеотид может иметь не более одного несоответствия с последовательностью-мишенью из 10 нуклеотидов, и предпочтительно, не больше одного несоответствия из 20. В альтернативном варианте олигонуклеотид может являться по меньшей мере примерно на 80, 85, 90% гомологичным последовательности, и предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичным последовательности эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ, описанного в настоящем изобретении, или его комплемента.

Олигонуклеотид специфично гибридизуется с интересующим полинуклеотидом, если олигомер гибридизуется с намеченным (например, эталонным полинуклеотидом ΑΑΚδ или его комплементом) в физиологических условиях, при этом Тт составляет по существу больше 45°С, предпочтительно по меньшей мере 50°С и как правило 60-80°С, или больше. Указанная гибридизация предпочтительно соответствует строгим условиям гибридизации. При конкретной ионной силе и рН, Тт представляет собой температуру, при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с комплементарным полинуклеотидом. Опять же, указанная гибридизация может происходить с приблизительной или значительной комплементарностью антисмыслового олигомера последовательности-мишени, также как и с точной комплементарностью.

Термины специфично связывается или специфично гибридизуется в целом относятся к олигонуклеотидному зонду или полинуклеотидной последовательности, которая не только связывается с ее предполагаемой последовательностью-мишенью гена в образце при выбранных условиях гибридизации, но и не связывается значительно с другими последовательностями-мишенями в образце и, таким образом, отличает ее предполагаемую мишень от всех других мишеней в пуле-мишени. Зонд, который специфично гибридизуется с его предполагаемой последовательностью-мишенью может также выявлять различия в концентрации при выбранных условиях гибридизации, описанных в настоящем изобретении.

Устойчивая к действию нуклеаз олигомерная молекула (олигомер) относится к молекуле, скелет которой является по существу устойчивым к расщеплению нуклеазами, в не гибридизованной или гибридизованной форме; общими внеклеточными и внутриклеточными нуклеазами в теле организма; т.е. олигомер мало поддается или не поддается расщеплению при нормальных условиях нуклеазами в теле организма, действию которых подвергается указанный олигомер.

Гетеродуплекс относится к дуплексу между олигонуклеотидом и комплементарной частью интересующего полинуклеотида, такого как ДНК- или РНК-мишень. Устойчивый к действию нуклеаз гетеродуплекс относится к гетеродуплексу, образованному путем связывания олигомера с комплементарной ему мишенью, таким образом, что указанный гетеродуплекс по существу является устойчивым к дегра- 70 030418 дации ίη νίνο внутриклеточными и внеклеточными нуклеазами, такими как РНКазаН, которая способна разрезать двуцепочечые комплексы РНК/РНК или РНК/ДНК.

Субъединица олигонуклеотида относится к одной единице нуклеотида (или аналога нуклеотида). Термин может относиться к нуклеотидной единице, содержащей или не содержащей присоединенную межсубъединичную связь, несмотря на то, что при ссылке на заряженную субъединицу, заряд, как правило, принадлежит межсубъединичной связи (например, фосфатной или фосфоротиоатной связи или катионной связи).

Циклические субъединицы олигонуклеотидов могут представлять собой группы на основе рибозы или другого пентозного сахара или, согласно конкретным вариантам реализации изобретения альтернативные или модифицированные группы. Примеры модифицированных олигонуклеотидных скелетов включают, но не ограничиваются перечисленными: фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, 2'-5'-связанные их аналоги и группы, которые имеют противоположную ориентацию, где смежные пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Также рассматриваются пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), запертые нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ), 2'-О-метилолигонуклеотиды (2'-ОМе), 2'метоксиэтоксиолигонуклеотиды (МОЕ), среди других олигонуклеотидов, известных в данной области техники.

Пуриновый или пиримидиновый фрагмент спаривания оснований, как правило, представляет собой аденин, цитозин, гуанин, урацил, тимин или инозин. Также включены основания, такие как пиридин-4он, пиридин-2-он, фенил, псевдоурацил, 2,4,6-триметилэтоксибензол, 3-метилурацил, дигидроуридин, нафтил, аминофенил, 5-алкилцитидины (например, 5-метилцитидин), 5-алкилуридины (например, риботимидин), 5-галоуридин (например, 5-бромуридин) или 6-азапиримидины или 6-алкилпиримидины (например 6-метилуридин), пропин, квеозин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, вибутозин, вибутоксозин, 4ацетилтидин, 5-(карбоксигидроксиметил)уридин, 5'-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5карбоксиметиламинометилуридин, β-Ό-галактозилквеозин, 1-метиладенозин, 1-метилинозин, 2,2диметилгуанозин, 3-метилцитидин, 2-метиладенозин, 2-метилгуанозин, Ж-метиладенозин, 7метилгуанозин, 5-метоксиаминометил-2-тиоуридин, 5-метиламинометилуридин, 5метилкарбонилметилкарбонилметилуридин, 5-метилоксиуридин, 5-метил-2-тиоуридин, 2-метилтио-Ж)изопентениладенозин, β-Ό-маннозилквеозин, уридин-5-оксиуксусную кислоту, 2-тиоцитидин, треониновые производные, и т.д. (Вигдш е1 а1., 1996, В1осЬет181гу, 35, 14090; ИЫтап & Реутап, выше). Под термином модифицированные основания в указанном аспекте подразумевается нуклеотидное основание, отличное от аденина (А), гуанина (С), цитозина (С), тимина (Т) и урацила (И), как показано выше; указанные основания можно применять в любом положении в антисмысловой молекуле. Специалистам в данной области техники очевидно, что в зависимости от применения олигомера, Τδ и Όδ являются взаимозаменяемыми. Например, в случае других антисмысловых химических соединений, таких как 2'-Ометильные антисмысловые олигонуклеотиды, которые являются более подобными РНК, Т основание может обозначаться как и.

Как отмечено выше, конкретные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, включают пептидонуклеиновые кислоты (ПНК). Пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) представляют собой аналоги ДНК, в которых скелет является структурно гомоморфным скелету дезоксирибозы, состоящие из Ж(2-аминоэтил)глициновых единиц, к которым присоединены пиримидиновые или пуриновые основания. ПНК, содержащие природные пиримидиновые и пуриновые основания, гибридизуются с комплементарными олигонуклеотидами, удовлетворяя правилам спаривания оснований Уотсона-Крика, и имитируют ДНК с точки зрения распознавания пар оснований (Едко1т, ВискагШ е1 а1. 1993). Скелет ПНК образован пептидными связями вместо фосфодиэфирных связей, что делает их походящими для применения в качестве антисмысловых агентов (см. структуру ниже). Скелет является незаряженным, что приводит к получению дуплексов ПНК/ДНК или ПНК/РНК, которые обладают большей термальной стабильностью по сравнению с нормой. ПНК не распознаются нуклеазами или протеазами.

ПНК могут быть получены синтетическим путем с использованием любого метода, известного в данной области техники. ПНК представляет собой аналог ДНК, в котором полиамидный скелет замещает традиционное фосфатно-рибозное кольцо ДНК. Несмотря на радикальные структурные изменения природной структуры, ПНК способна к последовательность-специфическому связыванию с ДНК в спиральной форме или РНК. Характеристики ПНК включают высокую аффинность связывания с комплементарными ДНК или РНК, дестабилизирующий эффект, вызванный несоответствием одного основания, устойчивость к нуклеазам и протеазам, гибридизация с ДНК или РНК, независимо от концентрации соли, и формирование триплекса с гомопуриновой ДНК. Рападепе™ разработали их собственные В1з-ПНК мономеры (βΐδ; бензотиазол-2-сульфонильная группа) и запатентованный способ олигомеризации. Олигомеризация ПНК с использованием В1з-ПНК мономеров состоит из повторяющихся циклов удаления за- 71 030418 щитной группы, сочетания и кэпирования. Патенты компании Рападепе, относящиеся к указанной технологии, включают патент США 6969766, патент США 7211668, патент США 7022851, патент США 7125994, патент США 7145006 и патент США 7179896. Примеры патентов США, в которых описаны способы получения ПНК-соединений включают, но не ограничиваются перечисленными: патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящее изобретение посредством ссылки. Дополнительное описание ПНК-соединений можно найти в источнике №е1кеп е1 а1., δοίο^ο, 1991, 254, 1497.

Также включены субъединицы запертых нуклеиновых кислот (ΕΝΑ). Структуры ΕΝΑ известны в данной области техники: например, ХУепдек ек а1., СЬетюа1 Соттитсакюпк (1998), 455; ТекгаЬебгоп (1998) 54, 3607, и Αссоиηΐк о£ СНет. ΚοκοβγοΗ (1999), 32, 301); ОЫка, ек а1., ТекгаЬебгоп Ьеккегк (1997), 38, 8735; (1998) 39, 5401, и Вюогдапю Мебюша1 СкетЫкту (2008), 16, 9230.

Олигонуклеотиды могут включать одну или более ΕΝΑ; в некоторых случаях, соединения могут быть полностью составлены из ΕΝΑ. Способы синтеза отдельных нуклеозидных субъединиц ΕΝΑ и их включения в олигонуклеотиды известны в данной области техники: патенты США 7572582; 7569575; 7084125; 7060809; 7053207; 7034133; 6794499 и 6670461. Типичные межсубъединичные линкеры включают сложные фосфодиэфирные и фосфоротиоатные фрагменты. В альтернативном варианте можно применять не содержащие фосфор линкеры. Предпочтительный вариант реализации изобретения представляет собой ΕΝΑ-содержащее соединение, где каждая субъединица ΕΝΑ отделена субъединицей ДНК (т.е. нуклеотидом дезоксирибозы). Другие предпочтительные соединения состоят из чередующихся ΕΝΑ и ДНК субъединиц, где межсубъединичный линкер представляет собой фосфоротиоат.

Конкретные олигонуклеотиды могут содержать морфолиновые субъединицы, содержащие фрагменты спаривания оснований, соединенные не заряженными или по существу не заряженными связями. Термины морфолиновый олигомер или РМО (фосфорамидат- или фосфородиамидатморфолиновый олигомер) относятся к аналогу олигонуклеотида, состоящему из структур морфолиновых субъединиц, где (ί) указанные структуры связаны вместе с помощью фосфор-содержащих связей, длиной от одного до трех атомов, предпочтительно, два атома в длину, и предпочтительно, незаряженными или катионными, соединяющими атом азота морфолиновой группы одной субъединицы с 5' экзоциклическим атомом углерода соседней субъединицы, и (ίί) каждое морфолиновое кольцо содержит пурин или пиримидин или эквивалентный фрагмент спаривания оснований, эффективный для связывания с помощью специфических для оснований водородных связей, с основаниями в полинуклеотиде.

Указанные связи могут быть модифицированы при условии, что они не препятствуют связыванию или активности. Например, кислород, присоединенный к фосфору, может содержать в качестве заместителя серу (тиофосфородиамидат). 5'-кислород может содержать в качестве заместителя амино или амино, содержащий в качестве заместителя низший алкил. Азот боковой цепи, присоединенный к фосфору, может являться незамещенным, монозамещенным или дизамещенным (необязательно замещенным) низшим алкилом. Фрагмент, спариваемый с пуриновым или пиримидиновым основанием, как правило, представляет собой аденин, цитозин, гуанин, урацил, тимин или инозин. Синтез, структуры и характеристики связывания морфолиновых олигомеров подробно описаны в патентах США № 5698685, 5217866, 5142047, 5034506, 5166315, 5521063 и 5506337 и заявке РСТ № РСТ/Щ07/11435 (катионные связи) и патенте США 08/012804 (улучшенный синтез), все из которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки.

Морфолиновые субъединицы также могут быть связаны с помощью межсубъединичных связей не на основе фосфора, как дополнительно описано ниже, где по меньшей мере одна связь является модифицированной катионной группой боковой цепи, как описано выше. Можно применять другие связи олигонуклеотидных аналогов, которые являются незаряженными в своем немодифицированном состоянии, но которые могут также содержать аминный заместитель группы боковой цепи. Например, 5'-атом азота на морфолиновом кольце может использоваться в сульфамидной связи или мочевинной связи (где фосфор замещен атомом углерода или серы соответственно) и модифицированные аналогичным 5'-атому азота в структуре (Ь3) образом, выше.

Конкретные варианты реализации изобретения включают по существу незаряженные морфолиновые олигомеры, такие как по существу незаряженный фосфородиамидат-связанный морфолиновый олигомер. По существу незаряженный, содержащий фосфор скелет в аналоге олигонуклеотида представляет собой скелет, в котором большинство субъединичных связей, например, между 50-100%, как правило по меньшей мере от 60 до 100% или 75 или 80% его связей, являются незаряженными при физиологических значениях рН и содержат один атом фосфора. Примеры морфолиновых олигонуклеотидов, имеющих фосфор-содержащие связи скелета, включают фосфороамидат- и фосфородиамидат-связанные морфолиновые олигонуклеотиды.

Конкретные варианты реализации изобретения могут включать положительно заряженные группы, предпочтительно, примерно в 10-50% связей их скелета.

Свойства субъединиц, обусловленные присутствием морфолино-, включают, например, способность быть связанными в олигомерной форме с помощью стабильных, незаряженных или положительно заряженных связей скелета, способность поддерживать нуклеотидное основание (например, аденин, ци- 72 030418 тозин, гуанин, тимидин, урацил и гипоксантин) таким образом, что образующийся полимер может гибридизоваться с комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью, включая РНК-мишень, значения Тт выше примерно 45°С в относительно коротких олигонуклеотидах (например, 10-15 оснований), способность олигонуклеотида активо или пассивно транспортироваться в клетки млекопитающих и способность гетеродуплекса антисмысловой олигонуклеотид:РНК быть устойчивым к деградации РНКазами и РНКазойН соответственно.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения по существу незаряженный олигонуклеотид может быть модифицирован для включения заряженных связей, например, вплоть до примерно 1 на каждую 2-5 незаряженных связей, например, примерно 4-5 на каждые 10 незаряженных связей. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения оптимальное улучшение антисмысловой активности может наблюдаться, когда примерно 25% связей скелета являются катионными. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения усиление может наблюдаться при малом количестве, например, 1020%, катионных связей или где число катионных связей находится в диапазоне 50-80%, например, примерно 60%. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения катионные заряды скелета могут быть дополнительно усилены путем распределения объема зарядов вблизи связей центральной области скелета антисмыслового олигонуклеотида, например, в 20-мерном олигонуклеотиде с 8 катионными связями скелета, по меньшей мере 70% указанных заряженных связей которого расположены в 10 наиболее центральных связях.

Олигонуклеотиды, которые направлены на одну или более частей полинуклеотида эталонной последовательности ΑΑΚδ или ее комплемента можно применять в любых терапевтических, диагностических способах или способах скрининга лекарственных средств, описанных в настоящем изобретении и очевидных специалистам в данной области техники.

В. Агенты РНК-интерференции.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к агентам на основе интерферирующей РНК (РНКи), которые направлены на один или более мРНК транскриптов эталонного полинуклеотида аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), включая его фрагменты и сплайс-варианты. Также включены способы их применения для модуляции уровня выбранного транскрипта ΑΑΚδ, такого как сплайс-вариант ΑΑΚδ или эндогенный протеолитический фрагмент.

Термин двуцепочечный обозначает две отдельные цепочки нуклеиновых кислот, содержащие участок, в котором по меньшей мере часть цепочек являются достаточной комплементарными для образования водородных связей и формирования дуплексной структуры. Термин дуплекс или дуплексная структура относится к участку двуцепочечной молекулы, где две отдельные цепочки являются по существу комплементарными и, таким образом, гибридизуются друг с другом. дцРНК относится к молекуле рибонуклеиновой кислоты, имеющей дуплексную структуру, содержащей две комплементарные и антипараллельные цепочки нуклеиновых кислот (т.е. смысловая и антисмысловая цепочки). Не все нуклеотиды дцРНК должны иметь пары оснований Уотсона-Крика; две цепи РНК могут являться по существу комплементарными. Цепи РНК могут иметь одинаковое или разное число нуклеотидов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения дцРНК представляет собой или включает участок, который является, по меньшей мере, частично комплементарным РНК-мишени. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения дцРНК является полностью комплементарной РНК-мишени. Нет необходимости в идеальной комплементарности между дцРНК и мишенью, но соответствие должно быть достаточным для возможности дцРНК или продукта ее расщепления, направлять специфический сайленсинг последовательности, например, РНКи-расщепление РНК-мишени. Комплементарность или степень гомологии с цепью-мишенью, как правило, является наиболее критичной в антисмысловой цепи. Тогда как идеальная комплементарность, в частности в антисмысловой цепи, часто является желательной, некоторые варианты реализации изобретения могут включать одно или более, но предпочтительно 6, 5, 4, 3, 2 или менее, несоответствий относительно РНК-мишени. Несоответствия наиболее допустимы в концевых участках и, при наличии, предпочтительно находятся в концевом участке или участках, например, в пределах 6, 5, 4 или 3 нуклеотидов 5' и/или 3' конца. Смысловая цепочка должна быть только по существу комплементарной с антисмысловой цепью для поддержания общей двуцепочечности молекулы.

В настоящем изобретении модифицированная дцРНК относится к молекуле дцРНК, которая содержит по меньшей мере одно изменение, которое делает ее более устойчивой к действию нуклеаз (например, протеинкиназ) по сравнению с идентичной молекулой дцРНК, которая распознает эту же РНКмишень. Модифицированные дцРНК могут содержать одноцепочечный нуклеотидный липкий конец и/или по меньшей мере один замещенный нуклеотид.

В настоящем изобретении нуклеотидный липкий конец относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выступают за пределы дуплексной структуры, когда 3'-конец цепи РНК выходит за пределы 5'-конца другой комплементарной цепи, или наоборот. Тупой или тупой конец означает отсутствие неспаренных нуклеотидов на указанном конце дцРНК, т. е. отсутствие нуклеотидного липкого конца. дцРНК с тупыми концами представляет собой дцРНК, которая является двуцепочечной по всей длине, т.е. не имеет нуклеотидного липкого конца ни на одном конце молекулы.

- 73 030418

Термин концевая пара оснований в настоящем изобретении относится к последней паре оснований нуклеотидов на одном конце дуплексного участка двуцепочечной молекулы. Например, если дцРНК или другая молекула представляет собой молекулу с тупыми концами (т.е. не имеет нуклеотидных липких концов), последние пары оснований нуклеотидов на обоих концах молекулы представляют собой концевые пары оснований. Когда дцРНК или другая молекула имеет нуклеотидный липкий конец на одном, или на обоих, концах дуплексной структуры, последняя пара (пары) оснований нуклеотидов, непосредственно прилегающая к нуклеотидному липкому концу (концам) представляет собой концевую пару оснований на указанном конце (концах) молекулы.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения способы, предложенные в настоящем изобретении, могут использовать двуцепочечную молекулу рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) в качестве модулирующего агента, для уменьшения экспрессии транскрипта ААК§, такого как выбранный фрагмент или сплайс-вариант. дцРНК в целом включает две отдельные цепочки. Одна цепочка дцРНК содержит нуклеотидную последовательность, которая является по существу идентичной части гена-мишени или участка-мишени (смысловая цепочка), и другая цепочка (комплементарная или антисмысловая цепочка) содержит последовательность, которая является по существу комплементарной части участкамишени. Цепочки являются достаточно комплементарными для гибридзации с образованием дуплексной структуры. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения комплементарная цепочка РНК может иметь длину менее 30 нуклеотидов, менее чем 25 нуклеотидов или даже от 19 до 24 нуклеотидов. Согласно конкретным аспектам изобретения, комплементарная нуклеотидная последовательность может иметь длину 20-23 нуклеотидов или 22 нуклеотида.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения по меньшей мере одна из цепочек РНК содержит нуклеотидный липкий конец, длина которого составляет от 1 до 4 нуклеотидов. Согласно другим вариантам реализации изобретения дцРНК также может содержать по меньшей мере один химически модифицированный нуклеотид. Согласно конкретным аспектам изобретения, дцРНК, содержащая одноцепочечный липкий конец, состоящий из 1-4 нуклеотидов, может включать молекулу, где неспаренный нуклеотид одноцепочечного липкого конца, который непосредственно прилегает к концевой нуклеотидной паре, содержит пуриновое основание. Согласно другим аспектам, последние комплементарные нуклеотидные пары на обоих концах дцРНК представляют собой пары О-С, или по меньшей мере две из последних четырех концевых пар нуклеотидов представляют собой пары О-С.

Конкретные варианты реализации настоящего изобретения могут включать микро-РНК. МикроРНК представляют собой большую группу малых РНК, продуцирующихся в естественных условиях в организмах, некоторые из которых регулируют экспрессию генов-мишеней. Микро-РНК образуются из одноцепочечного транскрипта-предшественника, содержащего шпильки, состоящего примерно из 70 нуклеотидов, с помощью Оюег. (V. АтЬгок е1 а1., Сиггеп! Вю1оду 13:807, 2003). Конкретные микро-РНК могут транскрибироватья как предшественники РНК, содержащие шпильки, которые затем подвергаются процессингу с помощью фермента Эюег с образованием их зрелых форм.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения также можно применять малые интерферирующие РНК (миРНК). Согласно конкретным вариантам реализации изобретения первая цепочка двуцепочечного олигонуклеотида содержит на два больше нуклозидных остатка по сравнению со второй цепочкой. Согласно другим вариантам реализации изобретения первая цепочка и вторая цепочка имеют одинаковое количество нуклеозидов; однако, первая и вторая цепочки могут быть смещены таким образом, что два концевых нуклеозида на первой и второй цепочке не являются спаренными с остатком на комплементарной цепочке. В конкретных примерах два нуклеозида, которые не являются спаренными, представляют собой остатки тимидина.

Также включены короткие РНК, содержащие шпильки (ккРНК), и микроРНК (т1РНК). Двуцепочечная структура ккРНК образована одной самокомплементарной цепочкой РНК, и образование дуплекса РНК может инициироваться либо внутри, либо снаружи клетки. МикроРНК (пиРНК) представляют собой малые некодирующие РНК, состоящие из 20-22 нуклеотидов, как правило, вырезанных самогибридизующихся структур предшественника РНК, состоящих из ~70 нуклеотидов и известных как претШНК.

В примерах, когда модулирующий агент содержит миРНК, указанный агент должен включать участок достаточной гомологии с участком-мишенью и иметь достаточную длину в пересчете на нуклеотиды, таким образом, что миРНК-агент или его фрагмент, может опосредовать подавление РНК-мишени. Необходимо понимать, что термин рибонуклеотид или нуклеотид может также относится, в случае модифицированных РНК или имитатора нуклеотида, к модифицированному нуклеотиду или фрагменту замещения имитатором в одном или более положениях. Таким образом, миРНК-агент представляет собой или включает участок, который является, по меньшей мере, частично комплементарными РНКмишени, как описано в настоящем изобретении.

Кроме того, модулирующий миРНК-агент может быть модифицирован или включать имитаторы нуклеозидов.

Одноцепочечные участки миРНК-агента могут быть модифицированы или включать имитаторы нуклеозидов, например, неспаренный участок или участки структуры шпильки, например, участок,

- 74 030418 который связывает два комплементарных участка, может иметь модификации или содержать имитаторы нуклеозидов. Также применимы модификации для стабилизации одного или более 3'- или 5'-концов миРНК-агента, например, против действия экзонуклеаз или для облегчения входа антисмыслового миРНК-агента в ΚΙδϋ Модификации могут включать С3 (или С6, С7, С12) аминолинкеры, тиоловые линкеры, карбоксильные линкеры, не нуклеотидные спейсеры (С3, С6, С9, С12, без основания, триэтиленгликолиевые, гексаэтиленгликолиевые), специальные биотиновые или флуоресцеиновые реагенты, которые становятся фосфорамидитами и которые содержат другую ΌΜΤ-защищенную гидроксильную группу, позволяя множественные сочетания во время синтеза РНК.

миРНК агенты могут включать, например, молекулы, которые являются достаточно длинными для возбуждения ответа интерферона (которые могут расщепляться Оюег (Вегп81еш е! а1., 2001. ЫаШге, 409:363-366) и которые могут входить в Ш8С (РНКи-индуцированный комплекс сайлансинга)), кроме молекул, которые являются достаточно короткими и не возбуждают ответ интерферона (которые также могут расщепляться Эюег и/или входить в ΚΙδΟ), например, молекулы, которые имеют размер, позволяющий им входить в Ы8С, например, молекулы, которые похожи на продукты расщепления Э|сег. Модулирующие миРНК-агенты или продукты их расщепления, могут подавлять ген-мишень, например, путем индуцирования РНКи в отношении РНК-мишени, предпочтительно ΑΑΚδ-мишени, такой как выбранный сплайс-вариант.

Каждая цепочка миРНК-агента может быть равна, или составлять менее 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 или 15 нуклеотидов в длину. Длина цепочки предпочтительно составляет по меньшей мере 19 нуклеотидов. Например, длина каждой цепочки может составлять между 21 и 25 нуклеотидами. Предпочтительные миРНК-агенты имеют дуплексный участок, состоящий из 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 или 25 пар нуклеотидов и один или более липких концов, предпочтительно один или два 3'-липкий конца, состоящих из 2-3 нуклеотидов.

Помимо гомологии РНК-мишени и способности подавлять ген-мишень, миРНК-агент может обладать одним или более из следующих свойств: он может, несмотря на модификации даже очень большого числа или всех нуклеозидов, содержать антисмысловую цепочку, которая может предоставлять основания (или модифицированные основания) с подходящим трехмерным каркасом таким образом, что она способна формировать правильное спаривание оснований и образовывать дуплексную структуру с гомологичной РНК-мишенью, которая является достаточной для того, чтобы обеспечить подавление мишени, например, путем расщепления РНК-мишени; он может, несмотря на модификации даже очень большого числа или всех нуклеозидов, все еще обладать РНК-подобными свойствами, т.е. он может обладать всеми структурными, химическими и физическими свойствами, присущими молекуле РНК, несмотря на то, что он состоит не только из, или даже только частично состоит из, рибонуклеотидов. Например, миРНК-агент может содержать, например, смысловую и/или антисмысловую цепочку, в которой все сахара нуклеотидов содержат, например, 2'-фтор вместо 2'-гидроксила. Указанный дезоксирибонуклеотидсодержащий агент все еще может быть способен проявлять РНК-подобные свойства. Без ограничения конкретной теорией, электроотрицательный фтор предпочтительно имеет аксиальную ориентацию при присоединении к положению С2' рибозы. Указанное пространственное предпочтение фтора, в свою очередь, может заставлять сахар образовывать С3'-концевой излом плоскости углеводного кольца. Это такой же тип излома, который наблюдается в молекулах РНК и дает начало характерному для РНК типу спирали семейства А. Кроме того, так как фтор представляет собой хороший акцептор водородной связи, он может принимать участие в таких же взаимодействиях водородного связывания с молекулами воды, которые, как известно, стабилизируют структуры РНК. В целом является предпочтительным, что модифицированный фрагмент в положении 2' сахара является способным участвовать в Н-связывании, которое является более характерным для ОН-фрагмента рибонуклеотида, чем для Н-фрагмента дезоксирибонуклеотида.

Одноцепочечный РНКи-агент в настоящем изобретении, представляет собой РНКи-агент, который состоит из одноцепочечной молекулы. Он может включать дуплексный участок, образованный путем внутрицепоченого спаривания, например, он может представлять собой, или включать, структуру шпильки или ручки сковороды. Одноцепочечные РНКи модулирующие агенты предпочтительно являются антисмысловыми по отношению к молекуле-мишени. Одноцепочечный РНКи-агент должен быть достаточно длинным для того, чтобы он мог входить в ΚIδС и принимать участие в ΚΙδί'опосредованном расщеплении мРНК-мишени. Длина одноцепочечного РНКи агента составляет по меньшей мере 14 и более предпочтительно по меньшей мере 15, 20, 25, 29, 35, 40 или 50 нуклеотидов. Его длина предпочтительно составляет менее чем 200, 100 или 60 нуклеотидов.

Модулирующие РНКи-агенты, содержащие шпильки, могут иметь дуплексный участок, который равен или по меньшей мере составляет 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных пар. Дуплексный участок может предпочтительно быть равным или составлять менее чем 200, 100 или 50, в длину. Конкретные диапазоны длины дуплексного участка составляют от 15-30, 17 до 23, 19-23 и 19-21 нуклеотидных пар. Шпилька может иметь одноцепочечный липкий конец или концевой неспаренный участок, предпочтительно 3' и предпочтительно на антисмысловой стороне шпильки. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения липкие концы составляют 2-3 нуклеотида в длину.

- 75 030418

Конкретные модулирующие агенты, используемые в соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, могут включать РНКи-олигонуклеотиды, такие как гибридные олигонуклеотиды или химеры, которые содержат два или более химически отдельных участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Указанные олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок, модифицированный таким образом, что обеспечивает повышенную устойчивость к деградации указанного олигонуклеотида под действием нуклеаз, повышение клеточного поглощения и/или повышение аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Таким образом, сравнимые результаты часто могут быть получены при использовании более коротких олигонуклеотидов, когда используются гибридные олигонуклеотиды по сравнению с фосфоротиоатными олигодезоксинуклеотидами. Гибридные олигонуклеотиды могут быть образованы как составные структуры из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеотидов и/или миметиков олигонуклеотидов, описанных выше. Указанные олигонуклеотиды также называются в данной области техники гибридами или гапмерами. Примеры патентов США, в которых описаны способы получения таких гибридных структур, включают, но не ограничиваются перечисленными: патенты США № 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; 5700922 и 5955589, каждый из которых включен в настоящее изобретение посредством ссылки. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения гибридный олигонуклеотид представляет собой РНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-ДНК-РНК, ДНК-РНК-ДНК или РНК-ДНК-РНК-ДНК, где длина указанного олигонуклеотида составляет между 5 и 60 нуклеотидами.

Согласно одному аспекту согласно изобретению, РНКи-агенты относятся к олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере один лиганд, связанный с измененным или неприродным нуклеотидным основанием. Большое количество соединений могут функционировать как измененное основание. Структура измененного основания является важной, при условии, что измененное основание по существу не препятствует связыванию олигонуклеотида с его мишенью, например, мРНК. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения измененное основание представляет собой дифтортолил, нитропирролил, нитроимидазолил, нитроиндолил, нафталенил, антраценил, пиридинил, хинолинил, пиренил или бивалентный радикал любого из неприродных нуклеотидных оснований, описанных в настоящем изобретении. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения неприродные нуклеотидные основания представляют собой дифтортолил, нитропирролил или нитроимидазолил. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения неприродное нуклеотидное основание представляет собой дифтортолил. Широкое разнообразие лигандов известно в данной области техники и включено согласно настоящему изобретению. Например, лиганд может представлять собой стероид, желчную кислоту, липид, фолиевую кислоту, пиридоксал, В12, рибофлавин, биотин, ароматическое соединение, полициклическое соединение, краун-эфир, интеркалятор, расщепляющую молекулу, связывающийся с белком агент или углевод. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения лиганд представляет собой стероидное или ароматические соединение. В конкретных примерах лиганд представляет собой холесерил.

Согласно другим вариантам реализации изобретения РНКи-агент представляет собой олигонуклеотид, связанный с лигандом в целях улучшения клеточной направленности и захвата. Например, РНКиагент может быть связан с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В качестве дополнительного примера, РНКи-агент может быть связан со специфической лиганд-связывающей молекулой, такой как полипептид или фрагмент полипептида, который специфично связывается с конкретным рецептором клеточной поверхности.

Согласно другим вариантам реализации изобретения модулирующий агент содержит неприродное нуклеотидное основание, описанное в настоящем изобретении. В конкретных примерах, фрагмент рибозного сахара, который в природе встречается в нуклеозидах, замещен на гексозный сахар. Согласно конкретным аспектам изобретения, гексозный сахар представляет собой аллозу, альтрозу, глюкозу, маннозу, гулозу, идозу, галактозу, талозу или их производное. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения гексоза представляет собой Ό-гексозу. В конкретных примерах, рибозный сахарный фрагмент, который в природе встречается в нуклеозидах, замещен на полициклическое гетероалкильное кольцо или циклогексенильную группу. В конкретных примерах, полициклическая гетероалкильная группа представляет собой бициклическое кольцо, содержащее один атом кислорода в кольце. В конкретных примерах, полициклическая гетероалкильная группа представляет собой бицикло [2.2.1] гептан, бицикло [3.2.1] октан или бицикло[3.3.1]нонан. Примеры модифицированных РНКи-агентов также включают олигонуклеотиды, содержащие модифицированные скелеты или неприродные межнуклеозидные связи, описанные в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также включает использующие олигонуклеотиды рибозимы. Синтетические молекулы РНК и их производные, которые могут катализировать высокоспецифичные эндорибонуклеазные активности, известны как рибозимы. (см., например, патент США № 5543508, НакеШГ еΐ а1., и патент США № 5545729, 0οο63ιί16 еΐ а1.). Реакции расщепления катализируются самими молекулами РНК. В природных молекулах РНК сайты аутокатализируемого расщепления локализованы в высококонвсервативных участках вторичной структуры РНК (Виζауат еΐ а1., Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8а. И.8.А., 1986,

- 76 030418

83, 8859; Рог8!ег е! а1., Се11, 1987, 50, 9). Природные аутокаталитические молекулы РНК были модифицированы для генерации рибозимов, которые могут быть направлены на конкретную клеточную или патогенную молекулу РНК с высокой степенью специфичности. Таким образом, рибозимы служат таким же общим целям, как и антисмысловые олигонуклеотиды (т.е. модуляции экспрессии конкретного гена) и, подобно олигонуклеотидам, представляют собой нуклеиновые кислоты, значительная часть которых является одноцепочечной.

В конкретных примерах, РНКи-агенты или антисмысловые олигонуклеотиды для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, могут быть модифицированы с помощью группы, не являющейся лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, конъюгировали с олигонуклеотидами для повышения активности, клеточного распределения, клеточной направленности или клеточного поглощения указанного олигонуклеотида, и способы осуществления указанных конъюгации доступны в специальной литературе. Указанные фрагменты, не являющиеся лигандом, включают липидные фрагменты, такие как холестерин (Ье!8шдег е! а1., Ргос. ΑсаД. δα. υδΑ, 1989, 86:6553), аргинин-богатые пептиды, холевая кислота (Маηοка^аη е! а1., Βίοοι^. МеД. Скет. Ьей., 1994, 4:1053), тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол (Маηοка^аη е! а1., Αηη. Ν.Υ. ΑсаД. δοΐ., 1992, 660:306; Маηοка^аη е! а1., Βίοοι^. МеД. Скет. Ье!., 1993, 3:2765), тиохолестерин (ОЬегкаи8ег е! а1., №с1. Αс^Дδ Йе8., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (δа^δοη-Βектοа^аδ е! а1., ΕМΒО I., 1991, 10:111; КаЬаηον е! а1., ΡΕΒδ Ьей., 1990, 259:327; δν^ΓΛ^ е! а1., Β^οск^т^е, 1993, 75:49), фосфолипид, например, дигексадецил-гас-глицерин или триэтиламмония 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Н-фосфонат (Машкант е! а1., ТеТцакеДгст Ьей., 1995, 36:3651; δкеа е! а1., №с1. Αс^Дδ Ре8., 1990, 18:3777), цепь полиамина или полиэтилегликоля (Маηοка^аη е! а1., №.1с1ео81Де8 & №с1еойДе8, 1995, 14:969) или уксусная кислота адамантана (Маηοка^аη е! а1., ТеТρакеД^οη Ье!!., 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (М18кга е! а1., Β^ΐιίιη. Βίορ1ι\'8. Α^, 1995, 1264:229) или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент (Сгооке е! а1., I. Ркагтасо1. Εχρ. Ткег., 1996, 277:923). Примеры патентов США, в которых описаны способы получения указанных олигонуклеотидных конъюгатов, перечислены выше. Типичные протоколы конъюгации включают синтез олигонуклеотида, содержащего аминолинкер в одном или более положениях последовательности. Аминогруппа затем подвергается реакции с молекулой для конъюгации, с использованием соответствующих реагентов для сочетания и активации. Реакция конъюгации может осуществляться либо с олигонуклеотидом, все еще связанным с твердым носителем, или после ухода олигонуклеотида в фазу раствора. Очистка олигонуклеотидного конъюгата с помощью ЖХВД, как правило, приводит к получению чистого конъюгата.

Дополнительные примеры РНКи агентов могут быть найдены в публикациях заявок на патент США № 2007/0275465, 2007/0054279, 2006/0287260, 2006/0035254, 2006/0008822, которые включены посредством ссылки. Также включены векторные системы доставки, которые способны экспрессировать направленные на ΑΑΚδ последовательности, описанные в настоящем изобретении. Включены векторы, которые экспрессируют миРНК или другие образующие дуплексы молекулы интерферирующей РНК.

Система векторной конструкции или система конструкции на основе нуклеиновой кислоты может включать единственный вектор или плазмиду, два или более вектора или плазмиды, которые вместе содержат тотальную ДНК для введения в геном хозяйской клетки или транспозон. Выбор вектора, как правило, зависит от совместимости вектора с хозяйской клеткой, в которую предполагается вводить указанный вектор. В настоящем случае векторная конструкция или конструкция на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой конструкцию, которая является эффективно функциональной в клетке млекопитающих, такой как мышечная клетка. Вектор также может включать селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику или лекарственной устойчивости или репортерный ген (т.е. зеленый флуоресцентный белок, люцифераза), которые можно применять для селекции или идентификации подходящих трансформантов или трансфектантов. Типичные системы доставки могут включать вирусные векторные системы (т.е. опосредованная вирусом трансдукция) включая, но не ограничиваясь перечисленными: ретровирусные (например, лентивирусные) векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы и герпес-вирусные векторы, среди прочих, известных в данной области техники.

XI. Разработка лекарственных средств.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к применению полипептидов, антител или полинуклеотидов ΑΑΚδ для разработки лекарственных средств, как правило, для идентификации агентов, которые модулируют один или более неканонических видов активности эталонного полипептида ΑΑΚδ, например, белкового фрагмента ΑΑΚδ. Например, конкретные варианты реализации изобретения включают способы идентификации одного или более клеточных партнеров по связыванию эталонного полипептида ΑΑΚδ, таких как клеточный белок, липид, нуклеиновая кислота или другие молекулы хозяина, которые непосредственно или физически взаимодействуют с указанным полипептидом ΑΑΚδ. Конкретные примеры включают, например, рецепторы клеточной поверхности, такие как рецепторы, сопряженные с С-белком (СРСР), домены белок-белкового взаимодействия и их внеклеточные или внутриклеточные домены.

Также предусмотрены способы идентификации хозяйской молекулы, которая принимает участие в

- 77 030418 одном или более видов неканонической активности полипептида ΑΑΚδ, включая молекулы, которые прямо или не прямо взаимодействуют с клеточным партнером по связыванию и либо регулирует его роль в неканонической активности, либо регулируются партнером по связыванию. Такие молекулы хозяина включают компоненты как предшествующих, так и последующих этапов неканонического пути по отношению к этапу взаимодействия клеточного партнера по связыванию/белка ΑΑΚδ, как правило, связанных примерно с 1, 2, 3, 4, 5 или более определяемыми этапами пути.

Конкретные аспекты включают способы идентификации соединения (например, полипептида) или другого агента, который проявляет агонизм или антагонизм в отношении неканонической активности эталонного полипептида ΑΑΚδ или его активного варианта, например, путем взаимодействия с полипептидом ΑΑΚδ и/или одним или более из его клеточных партнеров по связыванию. Также предусмотрены способы идентификации агентов, которые модулируют экспрессию (например, сплайсинг) сплайсвариантов ΑΑΚδ или модулируют активность протеазы, которая в противном случае регулирует продукцию эндогенных белковых фрагментов ΑΑΚδ (резектинов) на уровне белка.

Конкретные варианты реализации изобретения таким образом включают способы идентификации партнера по связыванию эталонного полипептида ΑΑΚδ, включающие а) объединение полипептида ΑΑΚδ с биологическим образцом в подходящих условиях и Ь) детектирование специфического связывания полипептида ΑΑΚδ с указанным партнером по связыванию, и идентификацию на основании предшествующих этапов партнера по связыванию, который специфично связывается с эталонным полипептидом ΑΑΚδ. Также включены способы скрининга соединения, которое специфично связывается с эталонным полипептидом ΑΑΚδ или партнером по связыванию полипептида ΑΑΚδ, включающие а) объединение полипептида или партнера по связыванию с по меньшей мере одним исследуемым соединением в подходящих условиях и Ь) детектирование связывания полипептида или партнера по связыванию с исследуемым соединением, и таким образом, идентификацию соединения, которое специфично связывается с полипептидом или его партнером по связыванию. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения соединение представляет собой полипептид или пептид. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения соединение представляет собой низкомолекулярное или другое (например, небиологическое) химическое соединение. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения соединение представляет собой пептидомиметик.

Любой способ, подходящий для детектирования белок-белковых взаимодействий, может использоваться для идентификации клеточных белков, которые взаимодействуют с эталонным полипептидом ΑΑΚδ, с одним или более его клеточными партнерами по связыванию, или обоими. Примеры обычных способов, которые можно применять, включают совместную иммунопреципитацию, перекрестное связывание и совместную очистку с помощью градиентов или хроматографических колонок клеточных лизатов или белков, полученных их клеточных лизатов, главным образом для идентификации белков в лизате, которые взаимодействуют с полипептидом ΑΑΚδ.

Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения по меньшей мере часть аминокислотной последовательности белка, который взаимодействует с полипептидом ΑΑΚδ, или его партнером по связыванию, может быть выявлена с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как метод расщепления по Эдману. См., например, С^дЬЮ!'! РгоЮтз: δύΉ0ΐπΐ€8 ааб Μο1οαι1αΓ Ргтс1р1ез, ^. Η. Ρϊοοιηαη & ^., Ν.Υ., р. 34-49, 1983. Полученная аминокислотная последовательность может использоваться в качестве направляющей для генерации смесей олигонуклеотидов, которые можно применять для скрининга на предмет последовательности гена, кодирующей указанные белки. Скрининг может осуществляться, например, с помощью методов стандартной гибридизации или ПЦР, описанных в настоящем изобретении и известных в данной области техники. Методы получения олигонуклеотидных смесей и скрининга хорошо известны. См., например, ΑизиЬеί οΐ а1., СиггеШ Ргок^з ίη Μο1οαι1αΓ Вюкду Огссп РиЬПзЬтд Αззοс^аΐез аиб \УПеу ΙπΙοβαοικο, Ν.Υ., 1989; и Ιηтз οΐ а1., ебз. РС! РгоЮ^з: Α Ошбе ΐο ΜеΐЬοбз аиб Αррί^саί^οηз Лсабет^с Ргезз, 1пс., Νου ΥοιΊο 1990.

Кроме того, способы одновременно можно применять для идентификации генов, кодирующих партнеров по связыванию или других полипептидов. Указанные способы включают, например, зондирование библиотеки экспрессии, в соответствии со способом, аналогичным хорошо известному методу зондирования с помощью антител библиотеки лямбда-дЦ1, с использованием меченного белка или другого полипептида, пептида или слитого белка ΑΑΚδ, например, варианта полипептида ΑΑΚδ или домена ΑΑΚδ, слитого с маркером (например, ферментом, фтором, люминесцентным белком или красителем) или доменом 1д-Рс.

Один способ, позволяющий выявлять белковые взаимодействия ίη νίνο - двугибридная система подробно описан, исключительно в качестве иллюстрации, а не в целях ограничения. Был описан один пример указанной системы (СЫсп οΐ а1., ΡNΑδ υδΑ 88:9578-9582, 1991), который можно приобрести в компании СкШссЬ (Пало-Альто, Калифорния).

Вкратце, при использовании такой системы, могут быть сконструированы плазмиды, которые кодируют два гибридных белка: одна плазмида состоит из нуклеотидов, кодирующих ДНК-связывающий домен белка активации транскрипции, слитого с эталонной нуклеотидной последовательностью ΑΑΚδ (или, согласно конкретным вариантам реализации изобретения его партнера по связыванию) или ее вари- 78 030418 антом, и другая плазмида состоит из нуклеотидов, кодирующих домен активации белка активации транскриции, слитый с кДНК (или набором кДНК), кодирующей неизвестный белок (белки), которые были рекомбинантно встроены в плазмиду как часть библиотеки кДНК. Плазмида слияния с ДНКсвязывающим доменом и библиотека активатора кДНК могут быть трансформированы в штамм дрожжей δассЬа^οтусек сегеуЩае, который содержит репортерный ген (например, ΗΒδ или 1;κΖ), регуляторная область которого содержит сайт связывания активатора транскрипции. Каждый слитый белок отдельно не может активировать транскрипцию репортерного гена: гибрид ДНК-связывающего домена не может активировать транскрипцию репортерного гена, так как он не обеспечивает функцию активации, и гибридный домен активации не может активировать транскрипцию репортерного гена, так как он не может располагаться на сайтах связывания активатора. Взаимодействие двух слитых белков восстанавливает функциональный белок-активатор и приводит к экспрессии репортерного гена, который выявляется с помощью анализа продукта репортерного гена.

Двугибридная система или другие подобные методы можно применять для скрининга библиотеки домена активации в поисках белков, которые взаимодействуют с генным продуктом -приманкой. В качестве примера, но не в качестве ограничения, может использоваться эталонный полипептид или вариант ААВЯ в качестве генного продукта - приманки. Партнер по связыванию ААКЯ также может использоваться в качестве генного продукта -приманки. Общая геномная или кДНК-последовательность сливается с ДНК, кодирующей домен активации. Указанная билиотека и плазмида, кодирующая гибрид генного продукта приманки ААВЯ, слитой с ДНК-связывающим доменом, совместно трансформируется в дрожжевой репортерный штамм и полученные трансформанты подвергаются скринингу для поиска экспрессирующих репортерный ген.

Библиотека кДНК клеточной линии, в которой предстоит детектировать белки, которые взаимодействуют с генным продуктом - приманкой ААКЯ, может быть создана с использованием стандартных способов, используемых в данной области техники. Например, фрагменты кДНК могут быть встроены в вектор таким образом, что они трансляционно слиты с доменом активации транскрипции ОАЬ4. Указанная библиотека может быть трансформирована совместно с геном-приманкой плазмиды слияния ОАЬ4 в дрожжевой штамм, который содержит ген 1;κΖ, запускаемый промотором, который содержит последовательность активации ОАЬ4. Кодируемый кДНК белок, слитый с доменом активации транскрипции ОΆ^4, который взаимодействует с генным-продуктом-приманкой, восстанавливает активный белок ОАЬ4 и, таким образом, запускает экспрессию гена НК3. Колонии, которые экспрессируют НК3, могут быть выявлены на основании их роста на чашках Петри, содержащих полужидкую среду на основе агара в отсутствие гистидина. кДНК может затем быть очищена из указанных штаммов и использоваться для продукции и изолирования белков, взаимодействующих с генным продуктом-приманкой ААВЯ, с использованием стандартных методов, используемых в данной области техники.

Также предусмотрены тригибридные системы, которые обеспечивают детектирование взаимодействий РНК-белок в дрожжах. См., например, Ноок е! а1., КНА. 11:227-233, 2005. Соответственно, указанные и связанные способы можно применять для идентификации клеточного партнера по связыванию полипептида ААКЯ и для идентификации других белков или нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с полипептидом ААКЯ, его клеточным партнером по связыванию, или обоими.

Конкретные варианты реализации изобретения относятся к применению метода скрининга интерактома. Конкретные примеры включают скрининг на основе белковых доменов (см., например, Вохет е! а1., Се11. 134:534-545, 2008; и Υυ е! а1., δс^еηсе. 322:10-110, 2008).

Как отмечено выше, изолированные партнеры по связыванию могут быть идентифицированы и, в свою очередь, можно применять вместе со стандартными методами идентификации белков или других соединений, с которыми они взаимодействуют. Конкретные варианты реализации изобретения таким образом, относятся к способам скрининга соединений, которые специфично связываются с партнером по связыванию эталонного полипептида ААВЯ, включающим а) объединение партнера по связыванию с по меньшей мере одним исследуемым соединением в подходящих условиях и Ь) детектирование связывание партнера по связыванию с исследуемым соединением, с идентификацией но основании предшествующих этапов соединений, которые специфично связываются с партнером по связыванию. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение представляет собой полипептид. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения исследуемое соединение представляет собой химическое соединение, такое как низкомолекулярное соединение или пептидомиметик.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы скининга для поиска соединений, которые модулируют активности эталонного полипептида ААКЯ, включающие а) объединение полипептида с по меньшей мере одним исследуемым соединением в условиях, допускающих активность полипептида, Ь) осуществление оценки активности полипептида в присутствии исследуемого соединения и с) сравнение активности полипептида в присутствии исследуемого соединения с активностью полипептида в отсутствие исследуемого соединения, причем изменение активности полипептида в присутствии исследуемого соединения указывает на то, что указанное соединение модулирует активность указанного полипептида. Конкретные варианты реализации изобретения включают способы скрининга для поиска соединения, которое модулирует активность партнера по связыванию эталонного полипептида

- 79 030418

ΑΑΚδ, включающие а) объединение полипептида с по меньшей мере одним исследуемым соединением в условиях, допускающих активность партнера по связыванию, Ь) осуществление оценки активности партнера по связыванию в присутствии исследуемого соединения и с) сравнение активности партнера по связыванию в присутствии исследуемого соединения с активностью партнера по связыванию в отсутствие исследуемого соединения, где изменение активности партнера по связыванию в присутствии исследуемого соединения указывает на то, что указанное соединение модулирует активность партнера по связыванию. Как правило, указанные и связанные варианты реализации изобретения включают оценку выбранной неканонической активности, которая связана с полипептидом ΑΑΚδ или его партнером по связыванию. Включены условия ίη νίίΓΟ и ίη νίνο, такие как условия культивирования клеток.

Конкретные варианты реализации изобретения включают способы скрининга соединения на предмет его эффективности как полного или частичного агониста эталонного полипептида ΑΑΚδ или его активного фрагмента или варианта, включающий а) обработку образца, содержащего полипептид, соединением и Ь) детектирование активности на основе агонизма в образце, как правило, путем измерения повышения неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Конкретные способы включают а) обработку образца, содержащего партнер по связыванию полипептида ΑΑΚδ, соединением и Ь) детектирование активности на основе агонизма в образце, как правило, путем измерения повышения выбранной неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, которые содержат соединение, представляющее собой агонист, идентифицированное указанным способом, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Также включены способы скрининга соединения на предмет его эффективности как полного или частичного антагониста эталонного полипептида ΑΑΚδ, включающие а) обработку образца, содержащего полипептид, соединением и Ь) детектирование активности на основе антагонизма в образце, как правило, путем измерения снижения в неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Конкретные способы включают а) обработку образца, содержащего партнер по связыванию полипептида ΑΑΚδ соединением и Ь) детектирование активности на основе антагонизма в образце, как правило, путем измерения снижения выбранной неканонической активности полипептида ΑΑΚδ. Конкретные варианты реализации изобретения включают композиции, которые содержат соединение, представляющее собой антагонист, идентифицированное указанным способом, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения могут быть созданы системы ίη νίΐτο для идентификации соединений, способных взаимодействовать с или модулировать эталонные последовательности ΑΑΚδ или его партнера по связыванию. Примеры соединений, идентифицированных с использованием указанных систем, могут применяться, например, для модуляции активности пути и для разработки самих компонентов указанного пути. Их также можно применять в скрининге на соединения, которые нарушают взаимодействия между компонентами пути; или могут непосредственно нарушать такие взаимодействия. Один типичный подход включает получение реакционной смеси полипептида ΑΑΚδ и исследуемого соединения в условиях и в течение времени, достаточного для возможности их взаимодействия и связывания, таким образом, с образованием комплекса, который может быть удален и/или выявлен из реакционной смеси.

Можно осуществлять скрининговые анализы ίη νίΐτο различными путями. Например, полипептид ΑΑΚδ, клеточный партнер по связыванию или исследуемое соединение (соединения) могут быть заякорены на твердой фазе. Согласно указанным и связанным вариантам реализации изобретения полученные комплексы могут быть захвачены и детектироваться на твердой фазе в конце реакции. В одном примере указанного способа полипептид ΑΑΚδ и/или его партнер по связыванию связан с твердой поверхностью, и исследуемое соединение (соединения), которое связано с указанной поверхностью, может быть меченным, прямо или не прямо, таким образом, что его захват компонентом на твердой поверхности может быть выявлен. В других примерах, исследуемое соединение (соединения) связано с твердой поверхностью, и полипептид ΑΑΚδ и/или его партнер по связыванию, которые не связаны с поверхностью, являются меченными или детектируемыми. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения для удобства, в качестве твердой фазы можно использовать титрационные микропланшеты. Заякоренный компонент (или исследуемое соединение) может быть иммобилизован путем нековалентного или ковалентного связывания. Нековалентное связывание может быть осуществлено путем простого покрытия твердой фазы раствором белка и высушивания. В альтернативном варианте иммобилизованное антитело, предпочтительно моноклональные антитело, специфичное для белка, который предполагается иммобилизовать, может использоваться для связывания белка с твердой поверхностью. Поверхности могут быть приготовлены заранее и храниться.

Для проведения типичного анализа неиммобилизованный компонент, как правило, добавляют к покрытой поверхности, содержащей связанный компонент. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют (например, путем отмывки) в условиях, таких, что любые образовавшиеся специфические комплексы остаются иммобилизованными на твердой поверхности. Детектирование связанных комплексов на твердой поверхности можно осуществлять несколькими способами. Например, когда предварительно неиммобилизованный компонент является предварительно меченным, детектирование метки, иммобилизованной на твердой поверхности, указывает на образование комплексов.

- 80 030418

Когда предварительно неиммобилизованный компонент не является предварительно меченным, может использоваться непрямая метка для детектирования комплексов, связанных на поверхности; например, меченное антитело, специфичное к предварительно не иммобилизованному компоненту (антитело, в свою очередь, может быть прямо или не прямо меченным с помощью меченного анти-1д антитела).

В альтернативном варианте присутствие или отсутствие связывания исследуемого соединения можно определить, например, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (δРΚ), где изменение угла резонанса используется в качестве показателя, и где полипептид ΑΑΚδ или клеточный партнер по связыванию иммобилизуют на поверхности коммерчески доступного сенсорного чипа (например, изготовленного компанией ΒIΑСΟΚΕ™) в соответствии со стандартным способом. Исследуемое соединение приводят в контакт с указанным чипом, и указанный сенсорный чип освещают светом конкретной длины волны под конкретным углом. Связывание исследуемого соединения также можно измерить путем детектирования пика, соответствующего исследуемому соединению, с помощью способа, согласно которому полипептид ΑΑΚδ или клеточный партнер по связыванию иммобилизуется на поверхности белкового чипа, адаптируемого для масс-спектрометра, исследуемое соединение приводят в контакт с указанным чипом, и способ ионизации, такой как МЛ^^I-МС (МС с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы), ИЭР-МС, МС с бомбардировкой ускоренными атомами и т. п., используется вместе с масс-спектрометром (например, масс-спектрометром двойного фокусирования, квадрупольным масс-спектрометром, времяпролетным масс-спектрометром, масс-спектрометрм преобразования Фурье, ионно-циклотронным масс-спектрометром и т.п.).

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения клеточные анализы, анализы на основе мембранных везикул или анализы на основе мембранной фракции можно применять для идентификации соединений, которые модулируют взаимодействия в нетрадиционном пути выбранного полипептида ΑΑΚδ. Для указанных целей можно применять клеточные линии, которые экспрессируют полипептид ΑΑΚδ и/или партнер по связыванию или слитый белок, содержащий домен или фрагмент указанных белков (или их комбинацию), или клеточные линии (например, клетки СΟδ, клетки СΗΟ, клетки ΗΕК293, клетки Не1а и т.д.), которые были генетически трансформированы для экспрессии указанного белка (белков) или слитого белка (белков). Исследуемое соединение (соединения), которое влияет на неканоническую активность, можно идентифицировать путем наблюдения за изменением (например, статистически значимым изменением) указанной активности по сравнению с контролем или предварительно определенным уровнем.

Варианты реализации изобретения, которые относятся, например, к антисмысловым и РНКиагентам, также включают способы скрининга соединения на предмет его эффективности в изменении экспрессии эталонного полинуклеотида ΑΑΚδ, включающие а) обработку образца, содержащего эталонный полинуклеотид ΑΑΚδ соединением, таким как потенциальный антисмысловой олигонуклеотид и Ь) детектирование измененной экспрессии полинуклеотида ΑΑΚδ. В конкретных неограничивающих примерах указанные и связанные варианты реализации изобретения можно применять в клеточных анализах или в бесклеточных анализах трансляции, в соответствии со стандартными методами в данной области техники. Также включены антисмысловые и РНКи-агенты, идентифицированные с помощью указанных способов.

Антитела к белковым фрагментам ΑΑΚδ также можно применять в скрининговых анализах, например, для идентификации агента, который специфично связывается с ΑЛΚδ, подтверждения специфичности или аффинности агента, который связывается с белковым фрагментом ΑΑ^δ, или идентификации сайта взаимодействия между агентом и белковым фрагментом ΑΑΚδ. Предусмотрены анализы, в которых антитело используется в качестве конкурентного ингибитора агента. Например, антитело, которое специфично связывается с белковым фрагментом ΑΑΚδ с известной аффинностью, может действовать в качестве конкурентного ингибитора выбранного агента и использоваться для расчета аффинности агента к белковому фрагменту ΑΑΚδ. Также одно или более антител, которые специфично связываются с известными эпитопами или сайтами белкового фрагмента ΑΑ^δ, можно применять в качестве конкурентного ингибитора для подтверждения связывания указанного агента с тем же сайтом. Другие варианты очевидны специалистам в данной области техники.

Также включены любые из указанных выше способов или другие способы скрининга, известные в данной области техники, адаптированные для высокоэффективного скрининга (НГ^). ΗΤδ, как правило, используют автоматизированный скрининговый анализ библиотеки соединений-кандидатов, например, анализ, который измеряет повышение или снижение неканонической активности, описанной в настоящем изобретении.

В любом из способов скрининга, предложенных в настоящем изобретении, можно применять низкомолекулярные библиотеки или библиотеки, созданные с помощью комбинаторной химии. Библиотеки химических и/или биологических смесей, таких как грибковые, бактериальные, водорослевые экстракты, известны в данной области техники и могут подвергаться скринингу с помощью любого из способов анализа согласно изобретению. Примеры способов создания молекулярной библиотеки могут быть найдены в источниках Саге11 е! а1., 1994а; Саге11 е! а1., 1994Ь; Сйо е! а1., 1993; ЭеХУШ е! а1., 1993; Оа11ор е! а1.,

- 81 030418

1994; 2искегтапп е! а1., 1994.

Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (Ноидй!еп е! а1., 1992) или на гранулах (Ьат е! а1., 1991), на чипах (Робот е! а1., 1993), бактериях, спорах (Ьабпег е! а1., патент США № 5223409, 1993), плазмидах (Си11 е! а1., 1992) или на фагах (С^1г1а е! а1., 1990; Веуйп е! а1., 1990; Ре11е1 е! а1., 1991; Ьабпег е! а1., патент США № 5223409, 1993; δοο!! и δт^!й, 1990). Варианты реализации настоящего изобретения включают применение различных библиотек для идентификации низкомолекулярных модуляторов одного или более белковых фрагментов ΑΑΚδ, их партнеров по связыванию и/или связанных с ними неканонических видов активности. Библиотеки, которые можно применять в целях изобретения включают, но не ограничиваются перечисленными: (1) химические библиотеки, (2) библиотеки природных продуктов и (3) комбинаторные библиотеки, состоящие из случайных пептидов, олигонуклеотидов и/или органических молекул.

Химические библиотеки состоят из структурных аналогов известных соединений или соединений, которые идентифицированы как искомые или перспективные посредством скрининга природных продуктов. Библиотеки природных продуктов представляют собой библиотеки, которые получены из коллекций микроорганизмов, животных, растений или морских организмов, которые используются для создания смесей для скрининга путем: (1) культивирования и экстракции жидкой среды из почвы, растений или морских микроорганизмов или (2) экстракции растений или морских организмов. Библиотеки природных продуктов включают поликетиды, не рибосомальные пептиды и их варианты (неприродные). См., например, Сапе е! а1., δс^еηсе 282:63-68, 1998. Комбинаторные библиотеки могут состоять из большого количества пептидов, олигонуклеотидов или органических соединений в виде смеси. Их относительно легко можно получать с помощью стандартных автоматизированных способов синтеза, ПЦР, клонирования или собственных синтетических способов.

Более конкретно, библиотека на основе комбинаторной химии представляет собой коллекцию различных химических соединений, созданных либо путем химического синтеза, либо биологического синтеза, путем объединения ряда химических структурных элементов, таких как реагенты. Например, линейная комбинаторная химическая библиотека, такая как библиотека пептидов, образована путем объединения набора химических структурных элементов (аминокислот) каждым возможным образом для конкретной длины соединения (т.е. количества аминокислот в полипептидном соединении). Миллионы химических соединений можно синтезировать путем такого комбинаторного перемешивания химических структурных элементов.

Обзор способов комбинаторной химии и библиотек, созданных на их основе, можно найти, например, в источниках

Нис, I. апЬ Ыдиуеп, К. (2001) СотЬ. СЬет. Н1дЬ ТЬгоидЬриЬ

Зсгееп 4:53-74; Ьерге, С А. (2001) Огид ϋΐΞΟον. ТоЬау 6:133140; Репд, 3. X. (2000) ВьотесЬ СЬготаЬодг. 14:430-441; ВоЬт,

Н. Ь. апЬ ЗЬаЫ, М. (2000) Сигг. Ορίη. СЬет. ΒίοΙ. 4:283-286;

Вагпез, С апЬ Ва1азиЬгатап1ап, 3. (2000) Сигг. Ορίη. СЬет.

ΒίοΙ. 4:346-350; Ьерге, Епза1Ьа1, С, е£ а! . , (2000) Мазз

ЗерЬгот Ηεν. 19:139-161; На11, Ό. 6., (2000) ЫаЬ. В1оЬесЬпо1.

18:262-262; Ьаго, Ь. 3., апЬ Μίρ£, Р. (2000) Ц. РЬагтасо1. Ехр.

ТЬег. 293:705-709; НоидЬЬеп, К. А., (2000) Αηη. Ηθν. РЬагтасо1.

Τοχίοοί. 40:273-282; КоЬауазЫ, 3. (2000) Сигг. Ορίη. СЬет.

ΒίοΙ. (2000) 4:338-345; Κοργίον, А. М. апЬ 3ρίΓίάοηονη, V. А.

(2000) Μοί. ΒίοΙ. (Мозк) 34:1097-1113; ИеЬег, Ь. (2000) Сигг.

Ορίη. СЬет. ΒίοΙ. 4:295-302; ϋοΐΐθ, Η. Е. (2000) И. СотЬ. СЬет.

2:383-433; Е1оуЦ, С ϋ., е£ а!., (1999) Ргод. Меск СЬет. 36:91168; КипЬи, В., е£ а!., (1999) Ргод. Огид Нез. 53:89-156;

СаЫНу, 3. (1999) Мо1. В1оЬесЬпо1. 12:143-148; Ьоме, 6. (1999)

ЫаЬ. Ргоск Нер. 16:641-651; Оо11е, Н. Е. апЬ Ые1зоп, К. Н.

(1999) Ь. СотЬ. СЬет. 1:235-282; СгагпЬск, А. И. апЬ Кеепе, Ь. ϋ. (1998) Сигг. ΒίοΙ. 8:Н705-Н707; Оо11е, Н. Е. (1998) Мо1.

0ίνθΓ3. 4:233-256; Муегз, Р. Ь., (1997) Сигг. Ορίη. В1оЬесЬпо1.

8:701-707; и Р1искЬЬип, А. апЬ СогЬезе, К. (1997) ΒίοΙ. СЬет.

378:443.

Устройства для получения комбинаторных библиотек являются коммерчески доступными (см., например, 357 ΜΡδ, 390 ΜΡδ, Αбνаηсеб Сйет Теей, Ρουΐδνΐ1^ Ку., δутрйοηу, Натт, Уоберн, Массачусетс, 433А ЛррПеб Β^οδуδ!етδ, Фостер Сити, Калифорния, 9050 Ρ1υδ, Мййроге, Бэдфорд, Массачусетс). Кроме того, множество самих комбинаторных библиотек является коммерчески доступным (см., например, СотСепех, Ргтсе!оп, Ν.Ι., Λδΐηο'χ, Москва, Россия, Т^^рοδ, 1пс., Сент-Льюис, Миссури, Сйетδ!а^, Ь!б.,

- 82 030418

Москва, Россия, 3Ό РЬагтасеибсаН, Ех!оп, Ра., Майек Вюкаепсек, Колумбия, Мэрилэнд, и т.д.).

XII. Способы применения.

Варианты реализации настоящего изобретения включают терапевтические способы лечения. Соответственно, агенты ААК8, описанные в настоящем изобретении, включая полипептиды ААК8, полинуклеотиды ААК8, векторы на основе полинуклеотидов ААК8, экспрессирующие ААК8 клетки-хозяева, антисмысловые олигонуклеотиды, РНКи-агенты, а также связывающие агенты, такие как пептиды, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, пептидомиметики и другие низкомолекулярные соединения, можно применять для лечения различных неограничивающих заболеваний или состояний, связанных с неканоническими видами активности эталонной ААК8. Примеры указанных неканонических видов активности включают модуляцию внеклеточной передачи сигнала, модуляцию пролиферации клеток, модуляцию миграции клеток, модуляцию дифференцировки клеток (например, гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза), модуляцию апоптоза или других форм клеточной гибели, модуляцию ангиогенеза, модуляцию клеточного связывания, модуляцию клеточного метаболизма, модуляцию продукции или активности цитокинов, модуляцию активности цитокиновых рецепторов, модуляцию клеточного поглощения или секреции, иммуномодуляцию, модуляцию воспаления, модуляцию метаболических процессов, таких как контроль глюкозы и т. п.

Предусмотрены терапевтические средства на основе полинуклеотидов, такие как терапевтические средства на основе антисмысловых агентов и РНКи-агентов, которые, как правило, относятся к снижению экспрессии молекулы-мишени, такой как эндогенный фрагмент ААК8 или клеточный партнер по связыванию полипептида ААК8, который в противном случае вносит вклад в его неканоническую активность. Терапевтические средства на основе антисмысловых или РНКи-агентов, как правило, проявляют антагонизм в отношении неканонической активности, например, путем уменьшения экспрессии эталонного полипептида ААК8. Также предусмотрены терапевтические средства на основе полипептидов или пептидов, антител или антигенсвязывающего фрагмента, пептидомиметиков или других малых молекул, которые проявляют агонизм или антагонизм в отношении неканонической активности эталонного полипептида ААК8, например, путем взаимодействия непосредственно с полипептидом ААК8, его клеточным партнером по связыванию (партнерами), или обоими.

Указанные и связанные варианты реализации изобретения включают способы применения ААК8агентов или композиций согласно настоящему изобретению для лечения клетки, ткани или субъекта. Клетки или ткани, которые можно лечить или модулировать согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой клетки или ткани млекопитающих, или более предпочтительно, клетки или ткани человека. Указанные клетки или ткани могут находиться в здоровом состоянии или в нездоровом состоянии.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, например, предложены способы модуляции терапевтически релевантных видов активности клетки, включая, но не ограничиваясь перечисленными: клеточный метаболизм, дифференцировку клеток, пролиферацию клеток, поглощение клеткой, клеточную секрецию, клеточную гибель, подвижность клетки, миграцию клеток, транскрипцию генов, трансляцию мРНК, сопротивление клетки, иммунные ответы, воспалительные ответы и т.п., включающие осуществление контакта клетки с агентом или композицией ААК8, описанной в настоящем изобретении. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения клетка находится в теле субъекта. Соответственно, композиция на основе ААК8 может применяться для лечения по существу любой клетки, или ткани, или субъекта, у которого может быть получен благоприятный эффект от модуляции одного или более указанных видов активности.

Агенты и композиции ААК8 также можно применять в любом из ряда терапевтических контекстов, включая, например, случаи, связанные с лечением или предотвращением неопластических заболевания, заболеваний или состояний иммунной системы (например, аутоиммунных заболеваний и воспалений), инфекционных заболеваний, метаболических заболеваний, нервных/неврологических заболеваний, мышечных/сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний, связанных с нарушением кроветворения, заболеваний, связанных с нарушением миогенеза, заболеваний, связанных с нарушением нейрогенеза, заболеваний, связанных с нарушением адипогенеза, заболеваний, связанных с нарушением остеогенеза, заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза, заболеваний, связанных с нарушением выживаемости клеток, заболеваний, связанных с нарушением захавата липидов, заболеваний, связанных со старением (например, потери волос, периферической или вегетативной невропатии, старческой деменции, ретинопатии) и других заболеваний.

Например, согласно конкретным иллюстративным вариантам реализации изобретения композиции, содержащие ААК8, согласно изобретению можно применять для модуляции ангиогенеза, например, путем модуляции пролиферации и/или передачи сигнала клеток эндотелия. За пролиферацией и/или передачей сигнала клеток эндотелия можно наблюдать с использованием соответствующей клеточной линии (например, клеток эндотелия микрососудов легкого человека (НМУЕС-Ь) и клеток эндотелия пупочной вены человека (НИУЕС)) и с помощью соответствующего анализа (например, анализа миграции клеток эндотелия, анализа пролиферации клеток эндотелия, анализа формирования сосудов, анализа с использованием бляшек матригеля и т.д.), многие из которых известны и доступны в данной области техники.

- 83 030418

Таким образом, согласно связанным вариантам реализации изобретения композиции согласно изобретению можно применять для лечения по существу любой клетки или ткани или субъекта, который будет иметь благоприятный эффект от модуляции ангиогенеза. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения клетка или ткань или субъект, подверженный или чувствительный к ангиогенезу (например, ангиогенным состояниям) может подвергаться контактированию с подходящей композицией согласно изобретению для подавления ангиогенного состояния. Согласно другим вариантам реализации изобретения клетка или ткань, подверженная или чувствительная к недостаточному ангиогенезу (например, ангиостатическому состоянию) может подвергаться контактированию с соответствующей композицией согласно изобретению для препятствования ангиостатической активности и/или обеспечения ангиогенеза.

Также включены способы модуляции гематопоэза и связанных состояний. Примеры гематопоэтических процессов, которые могут модулироваться полипептидами ΑΑΚδ согласно изобретению, включают, но не ограничиваются перечисленными: образование миелоидных клеток (например, эритроидных клеток, тучных клеток, моноцитов/макрофагов, миелоидных дендритных клеток, гранулоцитов, таких как базофилы, нейтрофилы и эозинофилы, мегакариоцитов, тромбоцитов) и лимфоидных клеток (например, естественных киллеров, лимфоидных дендритных клеток, В-клеток и Т-клеток). Конкретные специфические гематопоэтические процессы включают эритропоэз, гранулоцитопоэз, лимфопоэз, мегакариоцитопоэз, тромбоцитопоэз и т.д. Также включены способы модуляции траффика или мобилизации гематопоэтических клеток, включая гематопоэтические стволовые клетки, клетки-предшественники, эритроциты, гранулоциты, лимфоциты, мегакариоциты и тромбоциты.

Способы модуляции гематопоэза можно осуществлять на практике ίη νΐνο, ίη νίίτο, ех νΐνο или в любой комбинации. Указанные способы могут осуществляться на практике на любом биологическом образце, клеточной культуре или ткани, которая содержит гематопоэтические стволовые клетки, гематопоэтические клетки-предшественники или другие стволовые клетки или клетки-предшественники, которые способны дифференцироваться в гематопоэтическом направлении (например, произошедшие из жировой ткани стволовые клетки). Для осуществления способов ίη νίίτο и ех νΐνο стволовые клетки и клетки-предшественники, гематопоэтического или другого происхождения, могут быть изолированы и/или идентифицированы в соответствии со способами и характеристиками, описанными в настоящем изобретении и известными в данной области техники.

Композиции согласно изобретению также могут применяться в качестве иммуномодуляторов для лечения противо-или провоспалительных симптомов путем модуляции клеток, которые опосредуют, непосредственно или опосредованно, аутоиммунные и/или воспалительные заболевания, состояния и нарушения. Применимость композиций согласно изобретению в качестве иммуномодуляторов или модуляторов воспаления можно оценивать с использованием любого из ряда известных и доступных методов в данной области техники, включая, например, анализы миграции (например, с использованием лейкоцитов или лимфоцитов) или анализы выживаемости клеток (например, с использованием В-клеток, Тклеток, моноцитов или ΝΚ-клеток).

Воспаление в целом относится к биологическому ответу тканей на вредоносные стимулы, такие как патогены, повреждение клетки (например, раны) и раздражители. Термин воспалительный ответ относится к специфическим механизмам, посредством которых достигается и регулируется воспаление, включая, исключительно в качестве примера, активацию и миграцию клеток иммунной системы, продукцию цитокинов, расширение просвета сосудов, включая высвобождение кининов, фибринолиз и коагуляцию, среди других механизмов, описанных в настоящем изобретении и известных в данной области техники.

Клинические признаки хронического воспаления зависят от продолжительности заболевания, воспалительных повреждений, причины и анатомической области повреждения, (см., например, Кишат е1 а1., Κο№ίηδ Ва81С Ραΐΐιοίοβν-Κ¹' ЕД. 2009 ЕКеу^ег. Τοηάοη; МШег, ЬМ, РаОюКду ЬесШте ΝοΚδ. ЛИапйс Уе1еппагу ^Неде, Ο^^ο^ίο^η, РЕ1, Канада). Хронические воспаления связаны с различными патологическими состояниями или заболеваниями, включая, например, аллергии, Болезнь Альцгеймера, анемию, стеноз аортального клапана, артрит, такой как ревматоидный артрит и остеоартрит, рак, застойную сердечную недостаточность, фибромиалгию, фиброз, инфаркт миокарда, почечную недостаточность, волчанку, панкреатит, инсульт, хирургические осложнения, воспалительное заболевание легких, воспалительное заболевание кишечника, атеросклероз, неврологические нарушения, диабет, метаболические нарушения, ожирение и псориаз, среди других, описанных в настоящем изобретении и известных в данной области техники. Таким образом, композиции ΆΛΚδ можно применять для лечения или контроля хронического воспаления путем модуляции любого из одного или более отдельных хронических воспалительных ответов или лечения любого одного или более заболеваний или состояний, связанных с хроническим воспалением.

Критерии для оценки признаков и симптомов воспалительных и других состояний, например, для осуществления дифференциальной диагностики, а также для мониторинга лечения, например, для определения того, является ли доза, вводимая во время лечения, терапевтически эффективной, например, путем оценки улучшения в соответствии с принятыми клиническими критериями, очевидны специалистам

- 84 030418 в данной области техники и их примеры приведены, например, в источниках

Вегком ек а1. , ебз.,

ТЬе Мегск Мапиа1, 1б^^ь ейШоп, Мегск апб Со., НаЬмау, Ν.6.,

1992; Сообтап ек а!., ебз., Сообтап апб СИтап'з ТЬе РЬагтасо1од1са1 Ваз1з о£ ТЬегареиЫсз, 1(А^Ь еб1Ыоп, Регдатоп Ргезз, 1пс., Е1тз£огб, Ν.Υ., (2001); Ανετγ'з Огид Тгеактепк:

Рг1пс1р1ез апб РгасЫсе о£ СИп1са1 РЬагтасо1оду апб ТЬегареиЫсз, Згб ебНЫоп, ΑΏΙ5 Ргезз, ЬЬб., ИИПатз апб ИПНпз, Ва1Ытоге, Μϋ. (1987) ; ЕЬаб1, РЬагтасо1оду, ЫЬЫе,

Вгомп апб Со., Возкоп, (1985); 0зо1с1 а1. , ебз., КетЫдкоп' з РЬагтасеиЫса1 ЗсЬепсез, 18^^ь ебНЫоп, Маек РиЬНзЫпд Со.,

Еазкоп, РА (1990); КаЫипд, Ваз1с апб СЫп1са1 РЬагтасо1оду,

Арр1екоп апб Ьапде, Ыогма1к, СТ (1992).

Согласно другим вариантам реализации изобретения композиции, содержащие ААК8, согласно изобретению можно применять для модуляции пролиферации и/или выживаемости клеток и, соответственно, для лечения или предотвращения заболеваний, нарушений или состояний, характеризующихся нарушениями пролиферации и/или выживаемости клеток. Например, согласно конкретным вариантам реализации изобретения композиции, содержащие ААК8, можно применять для модуляции апоптоза и/или для лечения заболеваний или состояний, связанных с нарушением апоптоза. За процессом апоптоза можно наблюдать с помощью любого из ряда доступных методов, известных и доступных в данной области техники, включая, например, анализы, которые измеряют фрагментацию ДНК, изменения мембранной асимметрии, активацию апоптотических каспаз и/или высвобождение цитохрома С и фактора индукции апоптоза (АГР).

За прогрессом указанных и других видов и средств терапии (например, видов терапии ех \Ао) можно с легкостью наблюдать с помощью стандартных способов и анализов и на основе критериев, известных врачам или другим специалистам в данной области техники.

ХГГГ. Фармацевтические лекарственные формы, введение и наборы.

Варианты реализации настоящего изобретения включают полинуклеотиды ААК8, полипептиды ААК8, клетки-хозяева, экспрессирующие полипептиды ААК8, связывающие агенты, модулирующие агенты или другие соединения, описанные в настоящем изобретении, представленные в виде фармацевтически приемлемых или физиологически-приемлемых растворов для введения в клетку или животному, отдельно или в комбинации с одним или более другими средствами терапии. Также необходимо понимать, что, при желании, композиции согласно изобретению также можно вводить в комбинации с другими агентами, такими как, например, другие белки или полипептиды или различные фармацевтически активные агенты. По существу не существует ограничений для других компонентов, которые могут быть дополнительно включены в композиции, при условии, что указанные дополнительные агенты не оказывают неблагоприятного влияния на модулирующие или другие эффекты, достижение которых является желательным.

Способы получения фармацевтически приемлемых наполнителей и носителей для растворов для фармацевтических композиций согласно изобретению хорошо известно специалистам в данной области техники, так же как и разработка подходящих режимов дозирования и схем лечения для применения конкретных композиций, описанных в настоящем изобретении, для различных способов лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное, подкожное и внутримышечное введение и получение лекарственных форм.

В конкретных приложениях, фармацевтические или терапевтические композиции согласно изобретению не стимулируют иммунную реакцию. Согласно другим вариантам реализации изобретения фармацевтические или терапевтические композиции согласно изобретению, как правило, содержащие один или более полипептидов или полинуклеотидов ААК8, стимулируют иммунную реакцию, например, действуя в качестве адъюванта в вакцине или связанной композиции, или присутствуя в композиции вместе с отдельным адъювантом или агентом, стимулирующим иммунный ответ.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения ААН8-агенты, такие как полипептиды ААК8, полинуклеотиды ААН8 и антитела, имеют растворимость, которая является желательной для конкретного способа введения, такого как внутривенное введение. Примеры желательной растворимости включают растворимость, составляющую по меньшей мере примерно 1 мг/мл, по меньшей мере примерно 10 мг/мл, по меньшей мере примерно 25 мг/мл и по меньшей мере примерно 50 мг/мл.

Для конкретных способов применения фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, могут доставляться субъекту путем перорального введения. В этом случае указанные композиции могут быть представлены вместе с инертным разбавителем или с усваиваемым съедобным носителем или могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу или спрессованы в таблетки, или же могут быть непосредственно включены в еду пищевого рациона субъекта.

В определенных обстоятельствах желательно доставлять фармацевтические композиции, описан- 85 030418 ные в настоящем изобретении, парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутриартериальным, интратекальным, интрапаренхимальным, интрацистернальным, внутрижелудочковым, интрауретральным, внутригрудинным, интракраниальным, интрасиновиальным или даже внутрибрюшинным путем, как описано, например, в патенте США № 5543158; патенте США № 5641515 и патенте США № 5399363 (каждый из который полностью и конкретно включен в настоящее изобретение посредством ссылки). Подходящие устройства для парентерального введения включают устройства для инъекций с иглой (включая микроиглу), устройства для инъекций без иглы и методы инфузии.

Могут быть получены водные растворы активных соединений, представленных в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей, перемешанных подходящим образом с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также могут быть получены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения, указанные составы содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для применения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незамедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций (патент США № 5466468, полностью и конкретно включенный в настоящее изобретение посредством ссылки). Во всех случаях форма должна являться стерильной и жидкой, при условии что существует возможность ее легкого введения с помощью шприца. Указанная форма должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищенной от заражения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено путем использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т. п. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия. Замедленная абсорбция композиций для инъекций может осуществляться путем использования в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Для парентерального введения, например, в водном растворе, указанный раствор, при необходимости, должен быть забуферен подходящим образом, и жидкий разбавитель должен исходно являться изотиничным, что достигается с помощью достаточного количества соли или глюкозы. Указанные конкретные водные растворы являются особо подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. Стерильные водные среды, которые можно применять для указанных целей, очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора №С1 и либо добавлена к 1000 мл жидкости для подкожного введения, либо инъедирована в предполагаемое место инфузии (см., например, ^ιηίηβίοηί РЬагтасеийса1 δ^η^, 15ΐ1ι Εάίίίοη, р. 1035-1038 ;·ιηά 1570-1580). В зависимости от состояния субъекта, подвергаемого лечению, могут требоваться некоторые вариации в размере дозы. В любом случае, соответствующая доза для конкретного субъекта определяется человеком, ответственный за введение указанной дозы. Более того, композиции для введения человеку должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты в соответствии с требованиями Отдела биологических стандартов Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США, ΡΌΑ.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активных соединений в требуемом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией посредством фильтрования. В целом дисперсии готовят путем включения различных стерильных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную среду для дисперсии и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше ингредиентов. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций, предпочтительные способы получения представляют собой методы вакуумной сушки и лиофилизации, которые приводят к получению порошка активного ингредиента вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом из предварительно стерилизованного посредством фильтрования раствора.

Композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть представлены в нейтральной форме, или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислота, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут представлять собой соли, произошедшие из неорганических оснований, таких как, например, гидроксид натрия, калия, аммония, кальция или железа и указанных органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После получения лекарственной формы

- 86 030418 растворы вводят путем, который является совместимым с указанной лекарственной формой дозирования, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Лекарственные формы с легкостью вводят в различных формах дозирования, таких как растворы для инъекций, капсулы для высвобождения лекарственного средства и т. п.

В настоящем изобретении термин носитель включает все растворители, среды для дисперсий, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, несущие растворы, суспензии, коллоиды и т. п. Применение указанных сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением тех случаев, когда любая обычная среда или агент является совместимым с активным ингредиентом, предполагается его применение в терапевтической композиции. Вспомогательные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции.

Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным соединениям и композициям, которые не вызывают аллергической реакции или подобной нежелательной реакции при введении человеку. Получение водной композиции, содержащей белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области техники. Как правило, указанные композиции готовят в виде растворов для инъекций или в виде жидких растворов или суспензий; также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкостях до их инъецирования. Композиция также может быть эмульгированной.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения фармацевтические композиции могут доставляться с помощью интраназальных спреев, ингаляторов и/или других носителей для доставки аэрозолей. Способы непосредственной доставки в легкие композиций генов, полинуклеотидов и пептидов через назальные аэрозольные спреи описаны например, в патенте США № 5756353 и патенте США № 5804212 (каждый из которых полностью и конкретно включен в настоящее изобретение посредством ссылки). Подобным образом, доставка лекарственных средств с использованием микрочастиц смолы для интраназального введения (Такеиада еΐ а1., 1998) и лизофосфатидилглицериновых соединений (патент США № 5725871, полностью и конкретно включенный в настоящее изобретение посредством ссылки) также хорошо известны в области фармацевтики. Подобным образом, доставка лекарственного средства через слизистые оболочки в форме матрицы на основе политетрафторэтилена описана в патенте США № 5780045 (полностью и конкретно включенном в настоящее изобретение посредством ссылки).

Фармацевтические композиции могут быть представлены в виде композиций с быстрым и/или замедленным высвобождением. Композиции с замедленным высвобождением включают композиции с отсроченным, модифицированным, импульсным, контролируемым, направленным и программируемым высвобождением. Таким образом, композиции могут быть представлены в виде суспензии или твердого вещества, полужидкого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантируемого депо, обеспечивающего замедленное высвобождение полинуклеотидов ААК8, полипептидов ААК8, связывающих агентов, модулирующих агентов и других активных агентов. Примеры указанных лекарственных форм включают, но не ограничиваются перечисленными: покрытые лекарственным средством стенты и полужидкости и суспензии, содержащие ламелярные везикулы или микрочастицы на основе поли(ЭЬ-молочной-ко-гликолевой)кислоты (РСЬА), поли(ЭЬ-лактид-ко-гликолида) (РЬС) или поли(лактида) (РЬА) с нагрузкой лекарственного средства, гидрогели А8: Алл. Ν.Υ. Асаб. 8а.

944: 62-73 (2001)), системы полиаминокислотных наночастиц, которые продаются под торговой маркой МЕЭи8А®, разработанной компанией Р1ате1 ТесЬтο1οд^еδ 1пс., неводные гелевые системы, которые продаются под торговой маркой АТКЮЕЬ®, разработанной компанией Айтх, 1пс., и лекарственные формы на основе изобутирата ацетата сахарозы пролонгированного действия, которые продаются под торговой маркой 8АВЕК®, разработанной компанией Энгес! Сο^ρο^аί^οη, и системы на основе липидов, разработанные компанией 8куеРЬагта и которые продаются под торговой маркой ОЕРОРОАМ®.

Устройства для замедленного высвобождения, способные доставлять желаемые дозы фармацевтических композиций в течение длительных периодов времени, известны в данной области техники. Например, в патентах США № 5034229; 5557318; 5110596; 5728396; 5985305; 6113938; 6156331; 6375978 и 6395292; описаны устройства на основе осмотического давления, способные доставлять лекарственную форму активного агента, такую как раствор или суспензия, с желаемой скоростью в течение длительного периода времени (т.е. периода, варьирующего от более чем одной недели вплоть до одного года или более). Другие типичные устройства замедленного высвобождения включают насосы регулируемого типа, которые обеспечивают постоянный ток, регулируемый ток или программируемый ток лекарственной формы благоприятного агента, которые доступны из компании Мебΐ^οη^с, включая интратекальные насосы, которые продаются под торговой маркой 8УЖ.’НКОМЕЭ ΙΝΤυ8ΙΟΝ 8Υ8ΊΈΜ®, системы ίοΐιπδοπ атб ίοΠηδοη, которые продаются под торговыми марками СОЭМАЖ® 6ίνίδίοη ритрк и ГЫ8ЕТ® ΐесЬтο1οфек ритрк. Дополнительные примеры устройств описаны в патентах США № 6283949; 5976109; 5836935 и 5511355.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения доставка может осуществляться с использованием липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и т.п. для вве- 87 030418 дения композиций согласно настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в инкапсулирвоанной форме для доставки в виде липидных частиц, липосом, везикул, наносфер, наночастиц и т.п. Получение и применение указанных везикул для доставки можно осуществлять с использованием известных и стандартных методов.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения агенты, предложенные в настоящем изобретении, могут быть присоединены к фармацевтически приемлемому твердому субстрату, включая биосовместимые и биодеградируемые субстраты, такие как полимеры и матрицы. Примеры указанных твердых субстратов включают, но не ограничиваются перечисленными: полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(винилспирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-Ь-глутамата, не деградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как поли(молочная-ко-гликолевая кислота) ^ΕΟΑ) и ЬиРВОН ИЕРОТ™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту, коллаген, металл, гидроксиапатит, биостекло, алюминат, биокерамические материалы и очищенные белки.

Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения твердый субстрат содержит биодеградируемые полимеры, продающиеся под торговой маркой ΑТΚIΟЕ^™ (ОЬТ, 1пс., Ванкувер, Канада). Система доставки лекарственных средств ΑΊΚΙΟΕΕ® состоит из биодеградируемых полимеров, растворенных в биосовместимых носителях. Фармацевтические препараты могут быть помещенными в указанную жидкую систему доставки во время изготовления или, в зависимости от продукта, могут позже добавляться врачом во время применения. Когда жидкий продукт инъецируют в подкожное пространство через малокалиберную иглу или помещают в доступные области ткани с помощью канюли, вода в тканевых жидкостях вызывает преципитацию полимера и фиксацию лекарственного средства в твердом импланте. Лекарственное средство, инкапсулирвоанное в имплант, затем высвобождается контролируемым образом по мере того, как полимерная матрица со временем биодеградирует.

Фармацевтические композиции для применения согласно настоящему изобретению также можно вводить местным, (внутри)кожным или трансдермальным путем на кожу или слизистые. Типичные лекарственные формы для указанной цели включают гели, гидрогели, лосьоны, растворы, крема, мази, присыпки, бинты, пены, пленки, кожные пластыри, брикеты, импланты, губки, волокна, повязки и микроэмульсии. Также можно применять липосомы. Типичные носители включают спирт, воду, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, глицерин, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль. Могут быть включены усилители проникновения, см., например, Рштп апб Могдап: ί. РЬагт. δοί. 88(10): 955958, (1999). Другие пути местного введения включают доставку путем электропорации, ионтофореза, фонофореза, сонофореза и инъекции через микроиглу или без иглы, например, с использованием систем, продаваемых под торговыми марками РОУЭЕВкЕСТ™ и ВЮкЕСТ™.

Способы получения лекарственных форм хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в источнике ВепипдЮп: ТНе δοίοικο и Ргасйсе о£ РЬагтасу, Маск РиЬЬкЫпд Сотрапу, Еаккоп, Ра., 20^кН ебШоп, КВ№ 0683306472 (2000). Композиции и агенты, предложенные в настоящем изобретении, могут вводиться в соответствии со способами настоящего изобретения в соответствии с терапевтически эффективным режимом дозирования. Количество и частота введения дозы выбираются для достижения эффективного уровня агента при отсутствии неблагоприятного эффекта. Эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению зависит от пути введения, типа теплокровного животного, подвергаемого лечению, и физических характеристик конкретного рассматриваемого теплокровного животного. Указанные факторы и их соотношение для определения указанного количества, хорошо известны квалифицированным практикам в области медицины. Указанное количество и способ введения могут быть оптимизированы для достижения оптимальной эффективности, но зависят от таких факторов, как масса тела, диета, сопутствующее лечение и другие факторы, которые очевидны специалистам в области медицины.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения количество вводимой композиции или агента в целом варьирует от примерно 0,1 до примерно 100 мг/кг/день и, как правило, от примерно 0,1 до 10 мг/кг, при пероральном или внутривенном введении. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения доза составляет 5 или 7,5 мг/кг. Согласно различным вариантам реализации изобретения доза составляет примерно 50-2500 мг в день, 100-2500 мг/день, 300-1800 мг/день или 500-1800 мг/день. Согласно одному варианту реализации изобретения доза лежит в пределах между примерно 100 и 600 мг/день. Согласно другому варианту реализации изобретения доза лежит в пределах между примерно 300 и 1200 мг/день. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в дозе 100, 240, 300, 600, 1000, 1200 или 1800 мг/день, в одной или более доз в день (т.е. когда комбинированные дозы достигают желательной суточной дозы). Согласно связанным вариантам реализации изобретения доза составляет 100 мг два раза в день, 150 мг два раза в день, 240 мг два раза в день, 300 мг два раза в день, 500 мг два раза в день или 600 мг два раза в день. Согласно различным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в виде одной или нескольких доз. Исходная доза

- 88 030418 и последующие дозы могут быть одинаковыми или разными.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в одной дозе, составляющей от 0,1 до 10 мг/кг или от 0,5 до 5 мг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в дозе от 0,1 до 50 мг/кг/день, от 0,5 до 20 мг/кг/день или от 5 до 20 мг/кг/день.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят перорально или внутривенно, например, путем инфузии в течение периода времени, составляющего, например, примерно от 10 до 90 мин. Согласно другим связанным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят путем непрерывной инфузии, например, в дозе между от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг/ч в течение периода времени. Несмотря на то что период времени может варьировать, согласно конкретным вариантам реализации изобретения период времени может составлять между примерно 10 мин и примерно 24 ч или между примерно 10 мин и примерно тремя днями.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для достижения общей концентрации композиции или агента в плазме крови субъекта при С_тах, лежащей в пределах между примерно 0,1 мкг/мл и примерно 20 мкг/мл или между примерно 0,3 мкг/мл и примерно 20 мкг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения пероральная доза представляет собой количество, достаточное для достижения концентрации в плазме крови (Ста\) между примерно 0,1 мкг/мл и примерно 5 мкг/мл или между примерно 0,3 мкг/мл и примерно 3 мкг/мл. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения внутривенная доза представляет собой количество, достаточное для достижения концентрации в плазме крови (Ста\) между примерно 1 мкг/мл и примерно 10 мкг/мл или между примерно 2 и примерно 6 мкг/мл. Согласно связанным вариантам реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации меньше примерно 20 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии меньше примерно 20 мкг/мл. Согласно другому варианту реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации менее примерно 10 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии меньше примерно 10 мкг/мл.

Согласно другому варианту реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации в диапазоне между примерно 1 нг/мл и примерно 10 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии между примерно 1 нг/мл и примерно 10 мкг/мл. Согласно одному варианту реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови субъекта соответствует средней минимальной концентрации в диапазоне между примерно 0,3 мкг/мл и примерно 3 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии между примерно 0,3 мкг/мл и примерно 3 мкг/мл.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения композицию или агент вводят в количестве, достаточном для достижения у млекопитающего концентрации в плазме крови, соответствующей средней минимальной концентрации в диапазоне между примерно 1 нг/мл и примерно 10 мкг/мл, и/или концентрации в равновесном состоянии между примерно 1 нг/мл и примерно 10 мкг/мл. Согласно связанным вариантам реализации изобретения общая концентрация агента в плазме крови млекопитающего соответствует средней минимальной концентрации в диапазоне между примерно 0,3 мкг/мл и примерно 3 мкг/мл и/или концентрации в равновесном состоянии между примерно 0,3 мкг/мл и примерно 3 мкг/мл.

Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения, эффективное количество композиции или агента или концентрация в плазме крови указанной композиции или агента достигается или поддерживается, например, в течение по меньшей мере 15 мин, по меньшей мере 30 мин, по меньшей мере 45 мин, по меньшей мере 60 мин, по меньшей мере 90 мин, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 3 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 8 ч, по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере 3 дней, по меньшей мере 4 дней, по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере 6 дней, по меньшей мере одной недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере одного года, по меньшей мере 2 лет или более чем 2 лет.

Согласно конкретным основанным на полипептидах вариантам реализации изобретения количество вводимого полипептида, как правило, лежит в диапазоне от примерно 0,1 мкг/кг до примерно 0,1 мг/кг до примерно 50 мг/кг массы тела пациента. В зависимости от типа и тяжести заболевания, примерно 0,1 мкг/кг до примерно 0,1 мг/кг до примерно 50 мг/кг массы тела (например, примерно 0,1-15 мг/кг/доза) полипептида может являться начальной предполагаемой дозой для введения пациенту, как путем, например, одного или более отдельных введений, так и путем непрерывной инфузии. Например, режим дозирования может включать введение начальной нагрузочной дозы, составляющей примерно 4 мг/кг, с последующим поддержанием в течение недели дозы, составляющей примерно 2 мг/кг полипептида, или примерно половины нагрузочной дозы. Однако можно применять другие режимы дозирования. Типичная суточная доза может варьировать от примерно 0,1 мкг/кг до примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от факторов, перечисленных выше. В случае повторных введений в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния, лечение продолжают до достижения желаемого

- 89 030418 подавления симптомов заболевания.

Согласно конкретным вариантам реализации изобретения в плазме крови достигается уровень эффективной дозы или средняя минимальная концентрация композиции или агента, описанного в настоящем изобретении. Указанный уровень с легкостью можно определить с использованием стандартных методов.

Согласно другим аспектам вариантов реализации настоящего изобретения, предложены наборы, содержащие один или более контейнеров, наполненных одним или более из полипептидов, полинуклеотидов, антител, многокомпонентных комплексов, их композиций, и т.д., согласно изобретению, как описано в настоящем изобретении. Наборы могут включать письменные инструкции по применению указанных композиций (например, для модуляции клеточной передачи сигнала, ангиогенеза, рака, воспалительных состояний, диагностирования и т.д.).

Наборы в настоящем изобретении также могут содержать один или более дополнительных терапевтических агентов или других компонентов, подходящих или желательных для подвергаемого лечению симптома или для желаемого диагностического применения. Дополнительный терапевтический агент может при желании содержаться во втором контейнере. Примеры дополнительных терапевтических агентов включают, но не ограничиваются перечисленными: антинеопластические агенты, противовоспалительные агенты, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, ангиогенные агенты, и т.д.

Наборы в настоящем изобретении могут также включать один или более шприцов или других компонентов, необходимых или желательных для облегчения предполагаемого способа доставки (например, стентов, имплантируемых депо, и т.д.).

Все публикации, патентные заявки и выданные патенты, цитированные в настоящем изобретении, включены в настоящее изобретение посредством ссылки, как если бы было конкретно указано, что каждая указанная публикация, патентная заявка или выданный патент отдельно включена посредством ссылки.

Хотя раскрытое выше изобретение для его лучшего понимания было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров, специалистам в данной области техники очевидно, что в свете идеи настоящего изобретения возможны конкретные изменения и модификации в пределах сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры приведены исключительно в качестве иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение. Специалисты в данной области техники с легкостью определят различные не критичные параметры, которые могут быть изменены или модифицированы для получения по существу таких же результатов.

XIV. Примеры.

Общие методы, если иное не указано в приведенных ниже примерах, следующие общие методы оптимизации генов, низкопроизводительной или более масштабной экспрессии белков, очистки белков, анализа транскрипционной активности и скрининга использовали для создания и описания полипептидов ΑΑΚδ, описанных в приведенных ниже примерах.

Синтез генов и клонирование в векторах экспрессии

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие содержащие эпитопные метки варианты полипептидов ΑΑΚδ, были кодон-оптимизированы и клонированы в бактериальных векторах экспрессии с использованием способов, перечисленных ниже.

Согласно способу (1), кодон-оптимизированную ДНК Е.соН (^е1сН еί а1., Ρ^οδ ΟΝΕ 4(9): е7007 йок10,1371/]оигпа1.ропе,0007002), кодирующую каждый полипептид ΑΑΚδ, синтезировали с помощью ДНК 2,0 (Менло-Парк, СА) и синтезировали два варианта каждого полипептида ΑΑΚδ, содержащие Νконцевую или С-концевую комбинированную эпитопную метку, содержащую как гистидиновый маркер, так и эпитопную метку ν5.

ДНК, кодирующая меченные по Ν-концу полипептиды ΑΑΚδ, синтезировали с 5' удлинением, кодирующим в направлении 5'-3' сайт связывания рибосом (гЬ8 (подчеркнутый ниже)), сайт рестрикции КйеН метку, содержащую шесть гистидинов, и эпитопную метку ν5, (АССАССТААААСАТАТССАТСАТСАТСАТСАТСАСССТААСССТАТСССТ/кАСССТТТССТСССТСТССАТТСТАСС) (ЗЕО Ю ΝΟ: 1), оторый слит в рамке с предсказанной открытой рамкой считывания полипептида ΑΑΚδ. В случаях, когда полипептид ΑΑΚδ содержит предсказанный нативный инициирующий остаток метионина ЛТС) или первый аминокислотный остаток предсказанного полипептида ΑΑΚδ представляет собой МеЕ указанный остаток удаляли. На конец предсказанной открытой рамки считывания полипептида ΑΑΚδ добавляли два стоп-кодона и сайт ΧΗοΐ (таатсастссас) (зео ю N0: 2). ДНК, кодирующую меченые по Сконцу полипептиды ΑΑΚδ, синтезировали с 5'-удлинением, кодирующим гЬ8 (подчеркнутый ниже) и сайт рестрикции Кйе! который либо повторяет предсказанный нативный старт-кодон для полипептида ΑΑΚδ, либо встраивает Α^ в рамке с открытой рамкой считывания предсказанного полипептида ААКЗ, (АССАСАТААААСАТАТС) (ЗЕО ΙΌ N0: 3) .

Согласно различным вариантам реализации изобретения сайт связывания рибосом может содержать последовательности ⁵) ^или саассасататасат (зео ю νο: б) .

На 3'-конце открытой рамки считывания предсказанного полипептида ΑΑΚδ синтезировали 3'- 90 030418 удлинение, кодирующее в направлении 5'-3' эпитопную метку ν5, маркер, содержащий шесть гистидинов два стоп-кодона И сайт ^ХЬо1/ (ССТААСССТАТСССТААСССТСТССТСССТСТССАТТСТАСССАССАССАТСАТ сассаттаатсастссас) (3Εζ) ю N0: 7) , _КОТОр_Ый с лит в рамке с предсказанной открытой рамкой считывания полипептида ААК8. Если полипептид ААК8 включал предсказанный нативный стоп-кодон, указанный кодон удаляли.

Синтезированные последовательности ДНК, кодирующие полипептиды ААК8, субклонировали в векторе рГЕ\рге55411 (ДНК 2,0). После секвенирования для подтверждения синтеза правильного продукта, векторы экспрессии трансформировали в бактерии для экспрессии белка, как описано более подробно ниже.

В способе (2), кодон-оптимизированную ДНК Е.сой (Егто1аеуа МИ (2001) Сигг. Ιδδ. Мо1. Вю1. 3(4)91-7), кодирующую каждый полипептид ААК8, синтезировали с помощью ΟΗΝΗΑΙ/ (СаусПлейнфилд, Нью Джерси). Каждую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ААК8, синтезировали с короткими 5'- и 3'-удлинениями, содержащими уникальные сайты рестрикции для последующего клонирования.

В частности, на 5'-конце предсказанной открытой рамки считывания встраивали сайт рестрикции ВатН1. В случаях, когда полипептид ААК8 содержал предсказанный нативный инициирующий остаток метионина (АТС) или первый аминокислотный остаток предсказанного полипептида ААК8 представлял собой Ме1, указанный остаток удаляли. Кроме того, на 3' конце предсказанной открытой рамки считывания встраивали сайт рестрикции Х1о1. В случаях, когда полипептид ААК8 содержал предсказанный нативный стоп-кодон, указанный стоп-кодон удаляли.

После расщепления рестриктазами полученные последовательности ДНК субклонировали в модифицированных векторах рЕТ-24Ь (ЕМЭ, С1ЬЬ81о^п, N1), содержащих либо Ν-концевую (рЕТ24Ь_№ 6X1 Ιίδ... ν5), либо С-концевую (рЕТ24Ь_СА5/6\Н1к) комбинированную эпитопную метку, содержащую как шесть гистидинов, так и эпитопную метку ν5 (вектор, модифицированный с помощью ΟΗΝΗΑΙ/, (Саус-Плейнфилд, Нью Джерси).

После расщепления рестриктазами и клонирования ДНК, кодирующую Ν-меченный полипептид ААК8, клонировали в Ν-меченном векторе (рЕТ24Ь ^6^18^5), который содержит 5' последовательность ДНК, кодирующую шесть гистидинов и эпитопную метку ν5, (САТАТССАТСАТСАТСАТСАТСАСССТААСССТАТСССТААСССТСТССТСС СТСТССАТТСТАССССАТСС) (ЗЕО Ю ΝΟ: 8 в рамке с инициирующим кодоном (АТС), встроенным в сайт рестрикции Ыбе1. Указанное 5'-удлинение слито с открытой рамкой считывания предсказанного полипептида ААК8 с помощью короткого линкера, состоящего из 2 аминокислот, (С8).

На 3'-конце предсказанной открытой рамки считывания ДНК, кодирующая Ν-меченный полипептид ААК8, содержит последовательность ДНК, кодирующую участкок из 2 аминокислот (ЙЕ), за которым следуют два терминирующих кодона (СТССАСТААТСА) (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 9).

После рескрикционного расщепления и клонирования ДНК, кодирующую С-меченный полипептид ААК8, клонировали в С-меченном векторе (рЕТ24Ь С-У5/6хН18), содержащем 5' последовательность, кодирующую инициирующий кодон (АТС), встроенный в сайт рестрикции Ыбе1, который слит с открытой рамкой считывания предсказанного полипептида ААК8 с помощью короткого линкера, состоящего из 2 аминокислот, (С8), (САТАТСССАТСС) (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 10).

На 3'-конце предсказанной открытой рамки считывания кодирующая С-меченный полипептид ААК8 ДНК содержит 3'-последовательность ДНК, кодирующую короткий линкер, состоящий из 2 аминокислот (ЙЕ), за которым следует эпитопная метка ν5, за которой следуют шесть гистидинов и два стоп-кодона,

СТССАСССТААСССТАТСССТААСССТСТССТСССТСТССАТТСТАСССАССАСС АС С АС С АС С АС Т ААТ СА (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 11).

Экспрессия, очистка и биофизические характеристики полипептида ААК8.

6\Н18-меченные полипептиды ААК8 экспрессируют в бактериях в среднепроизводительном формате и/или в культуре большего масштаба во флаконах в зависимости от требуемого количества белка. Полипептиды ААК8 очищают с помощью аффинной и ионообменной хроматографии, как описано ниже и как специально указано для конкретных экспериментов.

Бактериальные культуры: 100 нг вектора экспрессии, содержащего кодон-оптимизированную ДНК, кодирующую каждый полипептид ААК8 (как описано выше), трансформировали в компетентные клетки бактерии Е.сой ВЙ21(ЭЕ3) (ИМЭ сйетюай, кат. № 69450) при 42°С в течение 30 с в планшетах для ПЦР. Также оценивали штаммы С41(ЭЕ3) (Йис1деп, кат. № 60442), НМ8174(ЭЕ3) (ИМЭ сйетюай, кат. № 69453) и Опдат12(ЭЕ3) (ИМЭ сйетюай, кат. № 71345). Планшеты помещали на лед на 2 мин и добавляли 100 мкл среды 8ОС, с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37°С. В каждую лунку 24луночного термоблока (С1адеп, кат. № 19583) добавляли 5 мл автоиндукционной среды (ИМЭ сйетюай, кат. № 71491) с добавлением канамицина (100 мкг/мл). Реагенты для трансформации добавляли в отдельные лунки, термоблок запечатывали с помощью клейкой пленки (УАК, кат. по 60941-078) и инкубировали в течение ночи при 250 об/мин на шейкере при 37°С. При использовании низкотемпературных условий (25°С) инкубацию осуществляли в течение 48 ч.

- 91 030418

Для более масштабной экспрессии, 200 мл автоиндукционной среды с добавлением канамицина (100 мкг/мл) добавляли во флаконы на 500 мл Ег1ептеуег с вентиляционными крышками ^οΓηί^, № по катологу 431401). Реагенты для трансформации добавляли в отдельные флаконы и инкубировали в течение 30 ч при 250 об/мин на шейкере при 37°С. Для объема 1 л, использовали среду ТВ (ВИ Вюкаепсек, кат. № 243820) вместо автоиндукционной среды и инициировали 4-часовую индукцию (0,5 мМ ΙΡΤΟ) при достижении культурой 0,6-1 ΟΌ₆₀₀.

Изолирование белка. После того, как культура достигала стационарной фазы (как правило, ΟΌ₆₀₀ 36), термоблоки центрифугировали при 3600хд в течение 10 мин. Среду осторожно отбирали и термоблоки замораживали при -80°С или -20°С в течение 10 мин. Затем указанным термоблокам позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую лунку добавляли 1 мл лизирующего буфера (100 мл ВидЬи81ег, с добавлением 200 мкл лизоназы (ΕΜΌ сНеписаН кат. по 71370) и полную смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА тотрШе тип ΕΌΤΑ-Ггее (Κο^, кат. № 11836170001)). Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, и переносили в пробирки Эппендорфа, с последующей инкубацией в течение 10-20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 16000 д в течение 10 мин при 4°С, лизаты наносили на 96луночный планшет ΤιιΦοΡί1ΗΓ 96, включенный в набор Νί-ΝΤΑ δире^Лο\γ 96 Β^οΚοЬοΐ Оадеп, кат. № 969261), и центрифугировали при 500 д в течение 5-10 мин.

Для более масштабной экспрессии, культуру в фазе стационарного роста переносили в колбы на 500 мл и центрифугировали при 6000 д в течение 10 мин. Среду сливали и осадок хранили при -80°С или -20°С до дальнейшей обработки. Затем осадку позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую колбу добавляли 20 мл лизирующего буфера. Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, с последующей инкубацией в течение 20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 10000 д в течение 30 мин при 4°С, лизаты переносили в чистые пробирки или колбы. Если следовые количества обломков клеток оставались после переноса, образец центрифугировали повторно или пропускали через целлюлозноацетатную мембрану, 0,45 мкм (Оэгитд, кат. № 430314), для дополнительной очистки. Для объема 1 л, использовали микрофлюидизацию при 14000 фунтов/кв. дюйм (МюгоЯшбюк, кат. № 110Ь) вместо лизирующего буфера.

Аффинная очистка: 96-луночный планшет О1ЛРШег покрывали 200 мкл суспензии Νί-ΝΤΑ δире^ΠολΥ, включенной в набор Νί-ΝΤΑ δире^Лο\γ 96 Β^οΚοЬοΐ и ионообменную смолу уравновешивали путем добавления 600 мкл связывающего буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия и 10 мМ имидазол, рН 7,5). Вакуумировали (-15 дюймов рт. ст.) до тех пор, пока весь буфер не проходил через смолу. Очищенные клеточные лизаты из предварительного этапа затем наносили на 96-луночный планшет ΟΙΛΡ^1ΐе^® и позволяли связываться в течение 5 мин. Вакуумировали (-3 дюймов рт. ст.) в течение приблизительно 5 мин до тех пор, пока все образцы не проходили через смолу. Указанную смолу затем промывали 1 мл связывающего буфера с последующими двумя промывками 1 мл связывающего буфера, содержащего 0,1% Тритон Х-100. Смолу затем промывали 10 раз 1 мл связывающего буфера без Тритона Х-100. Связанные 6хН18-меченные полипептиды ΑΑΚδ вымывали 450 мкл элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия и 500 мМ имидазол, рН 7,5) и хранили при 4°С.

Для более масштабной экспрессии, на пустую одноразовую колонку ΡοΚ-ΡΐΌρ (Вю-Иаб, кат. № 731-1550) наносили 1 мл суспензии Νί-ΝΤΑ δире^Лο\γ Оаден кат. № 30450) и 0,5 мл ионообменной смолы уравновешивали путем добавления 5 мл связывающего буфера. Затем на колонку наносили очищенный клеточный лизат с предыдущего этапа и пропускали под действием силы тяжести. Смолу сначала промывали 50 мл связывающего буфера вместе с 0,1% Тритоном Х-100, затем промывали 50 мл связывающего буфера без Тритона Х-100. Связавшиеся 6хН18-меченные полипептиды ΑΑΚδ вымывали с помощью 2 мл элюирующего буфера и хранили при 4°С.

Этапы обессоливания и доочистки: Для полипептидов ΑΑΚδ с молекулярной массой >10 кДа, мембрану Отеда 10К 96-луночного фильтрационного планшета Α^οΡίΌρ (Ра11, кат. № 5034) промывали 20 мкл 1Х ФСБ и планшет помещали на вакуумный коллектор (>10 дюймов рт. ст.) до полного прохождения жидкости. Элюаты из предыдущего этапа (Νί-ΝΤΑ) распределяли в каждую лунку и вакуумировали до полного прохождения жидкости. Указанные этапы повторяли до тех пор, пока весь объем элюата (450 мкл) не был обработан. Полипептиды ΑΑΚδ восстанавливали путем добавления в каждую лунку 180 мкл 1Х ФСБ, рН 7,4, осторожно пипетируя 10 раз, и затем переносили в чистый термоблок. Указанный этап повторяли для получения общего объема 360 мкл на лунку и термоблок хранили при 4°С. Для полипептидов ΑΑΚδ с молекулярной массой <10 кДа, элюаты из Νί-ΝΤΑ наносили на центрифужный фильтр Λт^сοη иИга-15 с мембраной иИгасе1-3 (Μ^11^рο^е, кат. № ИРС900308), с последующим добавлением 10 мл 1Х ФСБ и центрифугированием при 3600 д в течение 10-30 мин до получения объема менее чем 360 мкл. Образцы восстанавливали и добавляли 1Х ФСБ с получением конечного объема 360 мкл.

Для удаления эндотоксинов фильтровальный планшет Α^οΡι^ Αάνаηсе с мембраной Ми81апд О (Ра11, кат. № 8171) промывали 300 мкл 1Х ФСБ и центрифугировали при 1000 д в течение 5 мин для удаления буфера. В указанный фильтровальный планшет добавляли обессоленные полипептиды ΑΑΚδ (360

- 92 030418 мкл/лунку) и инкубировали на шейкере в течение 5-10 мин. Планшет затем центрифугировали при 1000 д в течение 5-10 мин и прошедшие через фильтр фракции, содержащие полипептиды ΑΑΚδ, собирали и хранили при 4°С.

Для более масштабной экспрессии элюаты из Νί-ΝΤΑ наносили на центрифужный фильтр Лт^соη ИНга-15 с мембраной иНгасе1-3 или иНгасе1-10 (МПНроге, кат. № ИРС900308 или ИРС901008), в зависимости от молекулярной массы полипептида ΑΑΚδ, и затем центрифугировали при 3600 д в течение 10-30 мин до уменьшения объема до 250 мкл. Образцы перемешивали в 10 мл 1Х ФСБ, рН 7,4, и снова центрифугировали при 3600 д в течение 10-30 мин до получения объема примерно 250 мкл. Указанный этап повторяли еще один раз, супернатанты восстанавливали и добавляли 1Х ФСБ до получения конечного объема 1,5 мл. Для объема 1 л, элюат Νί-ΝΤΑ диализовали против 1Х ФСБ в течение ночи вместо использования фильтрования.

Для удаления эндотоксинов сильную анионообменную мембрану δηΓ^Ού О 5 (δа^ιо^^иδ. кат. № О5Р) промывали 1 мл 1Х ФСБ и через указанную мембрану медленно пропускали полипептиды ΑΑΚδ с использованием пластикового шприца. Прошедшую через мембрану фракцию, содержащую полипептиды ΑΑΚ^δ, собирали в 96-луночный термоблок с глубокими лунками, который запечатывали и хранили при 4°С.

6xΗ^δ-меченные полипептиды ΑΑΚδ, экспрессируемые в бактериях и обнаруженные в тельцах включения, очищали с использованием аффинной хроматографии и ряда этапов повторной укладки, как описано ниже.

Бактериальные культуры: 100 нг плазмид, кодирующих каждый полипептид ΑΑΚδ, трансформировали в компетентные клетки бактерии Е.соН ВЬ21(ИЕ3) (ΕΜΌ сНетюаИ, кат. № 69450) или ί'.’41(ΌΕ3) (Ьиадеп, кат. № 60442) при 42°С в течение 30 с в ПЦР-планшетах. Указанные планшеты помещали на лед на 2 мин и добавляли 100 мкл среды δОС с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37°С. В каждую лунку 24-луночного термоблока Ладен кат. № 19583) добавляли 5 мл автоиндукционной среды (ΕΜΌ сНе1тисаШ„ кат. № 71491) с добавлением канамицина (100 мкг/мл). В отдельные лунки добавляли реагенты для трансформации, термоблок запечатывали с помощью клейкой пленки (УАД кат. по 60941078) и инкубировали в течение ночи при 250 об/мин на шейкере при 37°С.

Для более масштабной экспрессии, добавляли 200 мл автоиндукционной среды с добавлением канамицина (100 мкг/мл) во флаконы Ег1ептеуег на 500 мл с вентиляционными крышками (Согтпд, кат. № 431401). Реагенты для трансформации добавляли в отдельные флаконы и инкубировали в течение 30 ч при 250 об/мин на шейкере при 37°С. Для объема 1 л, использовали среду ТВ (ВО Ε^^ι^δ, кат. № 243820) вместо автоиндукционной среды и инициировали 4-часовую индукцию (0,5 мМ ΙΡΤ^, при достижении культурой 0,6-1 ОИ₆₀₀.

Изолирование: после достижения культурами фазы стационарного роста (как правило, ОИ₆₀₀ 3-6), термоблоки центрифугировали при 3600хд в течение 10 мин. Среду осторожно отбирали и термоблоки замораживали при -80°С или -20°С в течение 10 мин. Затем указанным термоблокам позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую лунку добавляли 1 мл лизирующего буфера (100 мл ВидЬш1ег, с добавлением 200 мкл лизоназы (ΕΜΌ сНеткаИ, кат. по 71370) и полную смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА сотр1е1е т1т ΕΌΤΑ-Ргее (ИосНе, кат. № 11836170001)). Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, и переносили в пробирки Эппендорфа, с последующей инкубацией в течение 10-20 на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 16000хд в течение 10 мин при 4°С, растворимые лизаты удаляли и тельца включения тщательно ресуспендировали в денатурирующем связывающем буфере (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 6 М гидрохлорид гуанидина, 10 мМ имидазол, рН 7,5). Образцы центрифугировали при 16000 д в течение 10 мин и супернатанты наносили на 96-луночный планшет Τи^ЬоР^1ΐе^, включенный в набор Νί-ΝΤΑ δире^Ло\γ 96 ВюВоЬо! Ладен кат. № 969261), с последующим центрифугированием при 500 д в течение 5-10 мин. Фильтраты собирали в чистый 96-луночный термоблок (Сгетег, кат. № 780286).

Для более масштабной экспрессии культуру в фазе стационарного роста переносили в колбы на 500 мл и центрифугировали при 6000 д в течение 10 мин. Среду сливали и осадок хранили при -80°С или 20°С до дальнейшей обработки. Затем осадку позволяли оттаивать при комнатной температуре и в каждую колбу добавляли 20 мл лизирующего буфера. Осадки ресуспендировали путем многократного пипетирования до тех пор, пока не оставалось видимых агрегатов, с последующей инкубацией в течение 20 мин на шейкере при комнатной температуре. После центрифугирования при 10000 д в течение 30 мин при 4°С растворимые лизаты удаляли и нерастворимые тельца включения тщательно ресуспендировали в денатурирующем связывающем буфере. Для объема 1 л, использовали микрофлюидизацию при 14000 фунтов/кв. дюйм (М1сгойшйЛ кат. № 110Ь) вместо использования лизирующего буфера. После ресуспендирования телец включения проводили этап центрифугирования при 10000 д в течение 30 мин с последующим фильтрованием через 0,45 мкм мембрану ΡΕδ (УАИ, са. № 87006).

Аффинная очистка. На 96-луночный планшет ΟΙΑΡίΗ^ наносили 200 мкл суспензии Νί-ΝΤΑ διψο Лои, включенной в набор Νί-ΝΤΑ δире^Ло\γ 96 ВюИоЬор и ионообменную смолу уравновешивали путем

- 93 030418 добавления 600 мкл денатурирующего связывающего буфера (см. выше). Вакуумировали (-15 дюймов рт. ст.) до тех пор, пока весь буфер не проходил через смолу. Очищенные денатурированные образцы из предыдущего этапа затем наносили на 96-луночный планшет ΟΙΑΡίΙΙΟΓ® и позволяли связываться в течение 5 мин. Вакуумировали (приблизительно 3 дюйма рт. ст.) в течение приблизительно 5 мин до тех пор, пока все образцы не проходили через смолу. Указанную смолу затем промывали 1 мл денатурирующего связывающего буфера с последующими пятью промывками 1 мл денатурирующего связывающего буфера, содержащим 0,1% Тритон Х-100. Затем смолу промывали 15 раз 1 мл денатурирующего связывающего буфера без Тритона Х-100. Связавшиеся 6хН18-меченные полипептиды ΑΑΚδ затем вымывали с помощью 450 мкл денатурирующего элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 6 М гидрохлорид гуанидина и 500 мМ имидазол, рН 7,5) и хранили при 4°С.

Для более масштабной экспрессии на пустую одноразовую колонку Ро1у-Ргер (Βίο-Раб. кат. № 731-1550) наносили 1 мл суспензии Νί-ΝΤΑ δире^Лο\γ ^адеи кат. № 30450) и 0,5 мл смолы уравновешивали путем добавления 5 мл денатурирующего связывающего буфера (см. выше). Затем на колонку наносили денатурированные тельца включения из предыдущего этапа и позволяли проходить под действием силы тяжести. Смолу сначала промывали 50 мл денатурирующего связывающего буфера с 0,1% Тритона Х-100, затем промывали 50 мл денатурирующего связывающего буфера без Тритона Х-100. Связавшиеся 6хН18-меченные полипептиды ΑΑΚδ вымывали с помощью 2 мл денатурирующего элюирующего буфера и хранили при 4°С.

Повторная укладка (рефолдинг). Для полипептидов ΑΑΚδ >10 кДа, мембрану Отеда 10К 96луночных фильтрационных планшетов ΑογοΡιόρ (Ра11, кат. № 5034) промывали 20 мкл 1Х ФСБ, и планшет помещали на вакуумный коллектор (>10 дюймов рт. ст.) до полного прохождения жидкости. Элюаты из предыдущего этапа (Νί-ΝΤΑ) распределяли в каждую лунку и вакуумировали до полного прохождения жидкости. Указанные этапы повторяли до тех пор, пока общий объем элюата (450 мкл) не был обработан. Полипептиды ΑΑΚδ восстанавливали путем добавления в каждую лунку 200 мкл буфера для повторной укладки, содержащего 50 мМ Τήδ, 250 мМ хлорид натрия, 10 мМ хлорид калия, 2 мМ хлорид магния, 2 мМ хлорид кальция, 400 мМ сахарозы, 500 мМ аргинина, 1 мМ ΌΤΤ и 0,01% полисорбата 80, рН 7,4, осторожно пипетируя 10 раз, и затем переносили в чистый термоблок. Указанный этап повторяли для получения общего объема 400 мкл на лунку, и термоблок помещали на шейкер на ночь при 4°С. Для полипептидов ΑΑΚδ <10 кДа, элюаты из Νί-ΝΤΑ наносили на центрифужный фильтр Αιηίαοη и11га-15 с мембраной ийгасе1-3 (Μίΐΐίροΐΐ, кат. № ИРС900308), с последующим добавлением 10 мл буфера для повторной укладки и центрифугированием при 3600 д в течение 10-30 мин до получения объема менее чем 400 мкл. Образцы восстанавливали и дополнительную порцию буфера для повторной укладки добавляли до получения конечного объема 400 мкл. Образцы переносили в 96-луночный термоблок, запечатывали пленкой и помещали на шейкер на ночь при 4°С.

Для более масштабных культур элюаты из Νί-ΝΤΑ наносили на центрифужный фильтр ΑιηΚοη υΐ1га-15 с мембраной иИгасе1-3 или и11гасе1-10 (ΜΠ^οη;, кат. № ОТС900308 или иРС901008, в зависимости от молекулярной массы полипептида ΑΑΚδ) и затем центрифугировали при 3600 д в течение 10-30 мин до уменьшения объема до примерно 500 мкл. Для олигопептидов ΑΑΚδ с ρΙ>7, образцы разбавляли в 20 раз в следующем буфере: 50 мМ ацетат натрия, 10 мМ хлорид натрия, 0,4 мМ хлорид калия, 1 мМ ЭДТА, 400 мМ сахароза, 500 мМ аргинин, 1 мМ ΌΤΤ и 0,01% полисорбат 80, рН 6,0. Для полипептидов ΑΑΚδ с ρΙ<7, образцы разбавляли в 20 раз в следующем буфере: 50 мМ Τήδ, 250 мМ хлорид натрия, 10 мМ хлорид калия, 2 мМ хлорид магния, 2 мМ хлорид кальция, 400 мМ сахароза, 500 мМ аргинин, 1 мМ ΌΤΤ и 0,01% полисорбат 80, рН 8,0. Образцы инкубировали на шейкере при 4°С в течение ночи.

Этапы обессоливания и доочистки. После инкубации в течение ночи 96-луночный термоблок центрифугировали при 3600 д для удаления любых возможных агрегатов. Для супернатантов затем проводили смену буфера на 1Х ФСБ (^^годей кат. № 10010). Для полипептидов ΑΑΚδ>10 кДа мембрану Отеда 10К 96-луночного фильтрационного планшета Α^οΡιό]3 промывали 20 мкл 1Х ФСБ и указанный планшет помещали на вакуумный коллектор (>10 дюймов рт. ст.) до полного прохождения жидкости. Образцы в буфере для повторной укладки распределяли в каждую лунку и вакуумировали до полного прохождения жидкости. Указанные этапы повторяли до тех пор, пока весь объем образца (400 мкл) не был обработан. Полипептиды ΑΑΚδ восстанавливали путем добавления 180 мкл 1Х ФСБ, рН 7,4, в каждую лунку, осторожно пипетируя 10 раз, и затем переносили в чистый термоблок. Указанный этап повторяли для получения общего объема 360 мкл на лунку и термоблок хранили при 4°С. Для полипептидов ΑΑΚδ<10 кДа образцы, подвергнутые повторной укладке, наносили на центрифужный фильтр Αίτηση и11га-15 с мембраной и11гасе1-3 (ΜΠ^οι^, кат. № ОТС900308) с последующим добавлением 10 мл 1Х ФСБ и центрифугированием при 3600 д в течение 10-30 мин до получения объема менее чем 360 мкл. Образцы восстанавливали и добавляли 1Х ФСБ до получения конечного объема 360 мкл.

Для удаления эндотоксинов фильтрационный планшет ЛсгоРгер Αбνаηсе с мембраной Μиδΐаηд О (Ра11, кат. № 8171) промывали 300 мкл 1Х ФСБ и центрифугировали при 1000 д в течение 5 мин для удаления буфера. В фильтрационный планшет добавляли полипептиды ΑΑΚδ (360 мкл/лунку) и инкубировали на шейкере в течение 5-10 мин. Планшет затем центрифугировали при 1000 д в течение 5-10 мин и фракции, прошедшие через фильтр, содержащие полипептиды ΑΑΚδ, собирали и хранили при 4°С.

- 94 030418

Для более масштабных культур, после инкубации в течение ночи образцы, подвергнутые повторной укладке, центрифугировали при 10000 д в течение 10 мин для удаления любых нерастворимых агрегатов. Супернатант наносили на центрифужный фильтр Лт^сοη υ1ΐΓη-15 и центрифугировали при 3600 д до снижения объема до 250 мкл. Образцы перемешивали в 10 мл 1Χ ФСБ и снова центрифугировали 3600 д в течение 10-30 мин до получения объема примерно 250 мкл. Необходимо отметить, что рН 1Χ ФСБ подводили для его соответствия значению рН буфера для повторной укладки (рН 6,0 или рН 8,0). Указанный этап повторяли еще раз, супернатанты восстанавливали и добавляли 1Χ ФСБ до получения конечного объема 1,5 мл. Для объема 1 л образцы, подвергнутые повторной укладке, диализовали против 1Χ ФСБ в течение ночи, вместо использования фильтрации.

Для удаления эндотоксинов сильную анионообменную мембрану δаЦοЬ^ηά О 5 (δа^ιο^^ик. кат. № Ц5Р) промывали 1 мл 1Χ ФСБ и полипептиды ΑΑΚδ медленно пропускали через указанную мембрану с использованием пластикового шприца. Прошедшую через мембрану фракцию, содержащую полипептиды ΑЛΚδ, собирали в 96-луночный термоблок с глубокими лунками, который запечатывали и хранили при 4°С.

Биофизическая характеристика. Все очищенные полипептиды ΑΑΚδ исследовали с помощью ДСНПААГ, их концентрацию определяли на основе Α280 и рассчитывали коэффициент экстинкции (программа Рго!Рагат на сервере ΕxРΑδу). Уровень эндотоксина измеряли с помощью хромогенного анализа ΡΑΣ ЦСЬ-1000 (Ьота, кат. № 50-648υ) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Динамическое рассеяние света: Прибор ^уай Тес1то1оду ОуваРго 99 и датчик температуры (20°С) нагревали в течение 15 мин до начала эксперимента с последующим присоединением программного обеспечения к прибору Ο\ΊΚΐιηΦκ. Время экспозиции устанавливали на 10 с для множественной экспозиции и мощность лазера устанавливали на 100%. Кварцевые кюветы тщательно промывали деионизированной водой и метанолом до добавления белкового образца (15 мкл в концентрации приблизительно 1 мг/мл в ФСБ). Пузырьки воздуха удаляли путем простукивания кюветы до ее помещения в держатель непрозрачной стороной налево. Если интенсивность была слишком высокой (предупреждающее сообщение, показанное на экране), образец дополнительно разбавляли в ФСБ до снижения интенсивности до нормального диапазона. Полученные данные включали гидродинамический радиус, полидисперность, предсказанную среднюю молекулярную массу, процентную интенсивность и процентную массу.

Эксклюзионная хроматография. Образец белка разбавляли до концентрации примерно 5-10 мг/мл в ФСБ до нанесения на пробоотборную петлю на 100 мкл на хроматограф для ЖЭХБ АКТА, Оеаега1 ΕΦα 1пс. Для разделения использовали колонку для эксклюзионной хроматографии δиρе^άеx 200 10/300 ОЬ (Оеиега1 ΕΦαπα кат. № 17-5175-01). Колонку сначала уравновешивали с помощью 1,5 объемов колонки (Ον) 1Χ буфера ФСБ, с последующим вводом образца. Колонку промывали 1 СХ 1х буфера ФСБ (изократический ток) с мониторингом абсорбции при 280 нм. Площадь пика интегрировали и рассчитывали процент с помощью программы Рисот. Элюирующий объем использовали для оценки молекулярной массы на основе сравнения с калибровочными наборами для гель-фильтрации (Оспсг^ ΕΦΡγΦ, кат. № 28-4038-41 и 28-4038-42).

Восстановление белка после хранения в высокой концентрации: 10 мкл полипептидов ΑΑΚδ, концентрированных до >10 мг/мл с использованием устройства для фильтрации Αт^сοη υ1ΐΓη-15 (МППроге, кат. № ОТС901024 или υΡС900324, в зависимости от молекулярной массы), переносили в чистую микроцентрифужную пробирку. Образец хранили при комнатной температуре в течение одной недели с последующим центрифугированием при 16000 д в течение 10 мин для осаждения любых преципитатов. Концентрацию супернатанта определяли с помощью анализа белка по Брэдфорду и сравнивали с концентрацией, измеренной до воздействия комнатной температуры в течение недели. Восстановление выражали в виде процента от исходной концентрации.

Характеристика полипептидов ΑΑΚδ с помощью ЖХ/МС: Очищенные полипептиды ΑΑΚδ (1 мг/мл) разбавляли в отношении 1:10 в 0,1% муравьиной кислоте и 0,6 мкг белка наносили с помощью автоматического дозатора Фюнех на капиллярную колонку С4. Указанную капиллярную колонку готовили путем вырезания 150 мм из трубки из кварцевого стекла (внешний диаметр, ΟΌ, -0,36 мм, внутренний диаметр, ГО, -0,1 мм, Ро1утФго ТесйюФдФк, кат. № 2000023). Один конец капилляра вытягивали с помощью прибора для вытягивания διι^Γ ФкйитеШ Ьакег ИЬег и отрезали с помощью резца из кварцевого стекла с получением наконечника диаметром 5 мкм. Капилляр наполняли на длину 75 мм смолой С4 (5 мкм, 300А, МФйгот, кат. № РМ5/64300/00) с использованием баллона высокого давления. ЖХ/МСанализ проводили на масс-спектрометре типа ионной ловушки ТерМоИкйег ЬТЦ, сопряженного с системой для ЖХВД ΌΦ^χ С111та1е3000. Анализируемое вещество вымывали из колонки с использованием 35-минутного градиента 5-70% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте при скорости потока 0,9 мкл/мин. Масс-спектрометр ЬТЦ работал в режиме полного МС-сканирования (300-2,000 т/ζ) с напряжением при распылении 2,5 кВ.

Сбор данных и анализ. Необработанные масс-спектрометрические данные хранили в файлах ΚΑ^, полученных с помощью программы ΧΟ1Φιιγ на масс-спектрометре ЬТЦ ΧΡ МС-спектры основных пиков, полученных с помощью хроматографа, далее анализировали с помощью деконволюционного алго- 95 030418 ритма РгоМакк, ТерМоИкЬег с получением молекулярных масс полипептидов ΑΑΚδ.

Функциональный анализ полипептидов ΑΑΚδ. Анализ транскрипции.

Уровень техники и терапевтическое значение. Кроме традиционной направленной идентификации мишеней, недавно появившиеся геномные технологии обеспечивают важный подход к объяснению механизма действия полипептидов ΑΑΚδ и могут обеспечить непосредственное понимание терапевтического значения на начальных этапах поиска лекарственных средств. Для лучшего понимания возможной терапевтической применимости, первичные клетки человека культивировали в присутствии полипептидов ΑΑΚδ и проводили оценку транскрипционной активности в два отдельных момента времени после инкубации с полипептидами ΑΑΚδ.

Выбор типов клеток для анализа транскрипционной активности основан на плюрипотентных способностях представляющих интерес клеток и потенциальной возможности идентификации полипептидов ΑΑΚδ прямого терапевтического значения. Например, мезенхимальные стволовые клетки (МδС) могут дифференцироваться в остеогенном, адипогенном, хондрогенном, миокардиальном или нейтрональном направлении при подвержении воздействию специфических стимулов, что делает их привлекательным объектом для исследования потенциальной значимости полипептидов ΑΑΚδ для широкого диапазона типов клеток и заболеваний.

Кроме поддержания гематопоэтических клеток, клетки костного мозга также могут быть стимулированы к дифференцировке в стромальные клетки костного мозга в различные линии клеток соединительной ткани, такие как кость, хрящ и жир. Потенциальная способность мезенхимальных стволовых клеток человека (ЬМδС) сохранять мультипотентность и интенсивно пролиферировать ίη νίίΓΟ, обеспечивает новые пути для клеточной терапии в восстановлении поврежденных или больных тканей. Недавние сообщения также указывают на то, что ΗМδС способны становиться клетками, пересекающими границы зародышевого листка. Кроме способности дифференцироваться во многие линии мезодермального происхождения, указанные клетки также могут дифференцироваться в нейроны эктодермального происхождения и гепатоцит-подобные клетки эндодермального происхождения. Во время процесса дифференцировки, указанные клетки могут модифицировать паттерны экспрессии специфических транскриптов конкретных линий.

Соответственно, способность конкретных полипептидов ΑΑΚδ модулировать активность конкретных генов в клетках НМ8С зависимым от времени образом демонстрирует, что указанные белки играют потенциально важные роли в широком круге путей дифференцировки, а также в заболеваниях и нарушениях, вызванных дисфункцией или нарушением указанных процессов или соответствующего типа клеток. Более того, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать транскрипцию генов в клетках Μδί'.'. имеют высокий потенциал терапевтического применения для обеспечения ίη νίίτο или ίη νίνο модуляции гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза, также как и в широком диапазоне нарушения и заболевания, включая например воспалительные ответы, аутоиммунные заболевания, рак, нейрональную дегенерацию, мышечную дистрофию, остеопороз и липодистрофию.

Человеческие клетки скелетной мускулатуры (ΗδΚΜί'.') могут дифференцироваться с появлением актомиозиновых миофиламентов, указанные клетки использовались в исследовании генетических мышечных заболеваний, таких как злокачественная гипертермия 1. Клетки ЖкМС также потенциально возможно использовать в качестве сердечного трансплантата, обеспечивающего восстановление поврежденной ткани сердца. В недавних экспериментах культивируемые человеческие клетки скелетной мускулатуры использовались в исследовании микрогравитации для изучения эффектов условий низкой гравитации на скелетные мышцы человека.

Соответственно, способность конкретных полипептидов ΑΑΚδ модулировать активность конкретных генов в клетках ЖкМС зависимым от времени образом демонстрирует, что указанные белки играют потенциально важные роли в процессах миогенеза, также как и заболеваниях и нарушениях, вызванных дисфункцией или нарушением указанных процессов, а также развития или метаболизма мышечных клеток. Соответственно, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать транскрипцию генов в мышечных клетках, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение метаболических заболеваний, кахексии, различных состояний мышечной атрофии, также как и скелетно-мышечного заболеваний.

Методы. Способность полипептидов ΑΑΚδ модулировать экспрессию генов оценивали с использованием высокоэффективного микроструйного метода количественной ПЦР в реальном времени (РТ-с|ПЦР) (ИшФдт Согрога1юп)(См. Рейту е1 а1. (2010) ΡΝΑδ (йо1/10.1073/рпа8.1009320107) в стромальных клетках костного мозга человека (НМδС) и человеческих скелетно-мышечных клетках (ЖкМС). В экспериментах, описанных в настоящем изобретении, человеческие ЖкМС (Кат. № 150-05Г) и НМδС (Кат. № 492-05 Г) получали из Се11 ЛррПса1юп5. Клетки НМδС замораживали на втором пассаже, и их можно культивировать и размножать до 10 удвоений популяции. В настоящем эксперименте использовали НМδС на 6 пассаже. Человеческие клетки скелетной мускулатуры (ЖкМС) замораживали на втором пассаже, и их можно культивировать и размножать в течение по меньшей мере 15 удвоений популяции. В описанных в настоящем изобретении экспериментах использовали клетки ЖкМС на 6 пассаже после забора от здорового донора, представляющего собой человека.

- 96 030418

В обоих случаях, клетки высевали в концентрации 50000 клеток/мл в объеме 100 мкл ростовой среды и подвергали воздействию полипептидов ААВЯ в концентрации 250 нМ или, как специально указано ниже, в течение 24 ч и 72 ч. Контроли включали среды для дифференцировки со стандартной смесью для обеспечения (1) адипогенеза, (2) остеогенеза, (3) хондрогенеза и (4) образования миотрубочек скелетной мускулатуры. Дополнительные контроли включали необработанные лунки, содержащие только ростовую среду. Для каждого контроля дифференцировки анализировали по две лунки. Контроли: все среды готовили с использованием среды БМЕМ в качестве основной среды. Эксперименты проводили в соответствии со стандартными литературными данными, среды для дифференцировки получали из Се11 АррНсаНопк. В зависимости от поставщика, среды для дифференцировки содержали следующие добавки: смесь для скелетно-мышечной дифференцировки: эмбриональная бычья сыворотка, инсулин, глутамин, РОР, ЕОР; смесь для адипогенеза: инсулин, дексаметазон и ГВМХ; смесь для остеогенеза: эмбриональная бычья сыворотка, дексаметазон, аскорбат-2-фосфат, бета-глицерофосфат; смесь для хондрогенеза: инсулин, аскорбат-2-фосфат и ТОР-βΡ

Стандартные протоколы для использования набора для экспрессии генов ТАЦМАИ® Се11§-1о-СТ™ ΆΒI (АррНей Вю§у§1ет8, № АМ1728) использовали для лизиса клеток и сбора генетического материала. Смесь ΆΒI Рге-Атр М1х (АррНей Вю§у§1ет8, Нет# 4391128) использовали для инициации преамплификации. Ген-специфичные праймеры создавали с использованием программы Рптег 3 и получали из ГОТ 1есЬпо1о§1е§. Чипы для анализа Р1шй1§т (Нет # ВМК-М-96,96) использовали для действительной количественной ПЦР с использованием стандартных нагрузочных реагентов Р1шй1§т и пипетирующих устройств. В приведенной ниже табл. Е1 перечислены проанализированные гены.

Таблица Е1

Список генов, которые оценивали в анализе транскрипции

Составленный уникальный перчень	геРзеч пб	Полное название	Синонимы
АВСА1	ΝΜ_005502	АТФ-связывающая кассета, подсемейство А (АВС1), член 1	АВС-1 | АВС1 | СЕВР | ЕЪЛ4958 | НОЪОТ1 М6С164 8 64 М6С165011| ΤΌϋ
АСТВ	ΝΜ_001101	актин, бета	Р31ТР5ВР1
АСТ61	ΝΜ 001614	актин, гамма 1	АСТ|АСТ6|ΏΕΝΑ2 0|ΏΕΝΑ2 6
АС\/К2В	ΝΜ 001106	рецептор активина А, тип ΙΙΒ	АСТК11В АсЛК-ΙΙΒ МСС116908
АРОА1	ΝΜ 000039	аполипопротеин Α-Ι	М6С117399
ΑΗΝΤ	ΝΜ 178427	ядерный транслокатор арил- гидрокарбонового рецептора	Н1Е-1Ьеба|ΗΙΕ1Β|Н1Е1БЕТА ΤΑΝ60 |ЬНЬНе2
ΒΑϋ	ΝΜ 032989	ВСЪ2-ассоциированный агонист клеточной гибели	ВВС2|ВСЬ2Ь8
ВСЬ2	ΝΜ 000657	В-клеточная хронический лимфоидный лейкоз/лимфома 2	Вс1-2
ВМР2	ΝΜ_001200	костный морфогенетический белок 2	ВМР2А
ВМР4	ΝΜ_130851	костный морфогенетический белок 4	ВМР2В|ВМР2В1|МСОР36|ОЕС11| ΖΥΜΕ

- 97 030418

СЗАН1	ΝΜ_004054	рецептор компонента комплемента За 1	ΑΖ3Β СЗАН ΗΝΕΑ609
САЗРЗ	ΝΜ_032991	каспаза 3, связанная с апоптозом цистеиновая пептидаза	СРР32|СРР32В|ЗСА-1
САУ1	ΝΜ 001753	кавеолин 1,белок кавеол, 22 кДа	ВЗСЬЗ | ССЬЗ МЗТР085 У1Р21
ΟϋΗ5	ΝΜ 001795	кадгерин 5, тип 2 (эндотелий сосудов)	7В4|СО144|ЕЬД17376
СЕЬАН	ΝΜ_003879	САЗР8 и ΕΑΟϋ-подобный регулятор апоптоза	САЗН|САЗР8АР1|СЬАНР|Сазрег| ЕЬАМЕ | Ε1ΑΜΕ-1 | Е1АМЕ1 | ЕЫР | 1-ЕЫСЕ |МН1Т | с-ЕЫР | с-ЕЫРЬ | с-ЕЫРН| с-ЕЫРЗ
СОМР	ΝΜ 000095	олигомерный матриксный белок хряща	ΕΏΜ1|ΕΡϋΙ ΜΕϋ М6С131819 М6С149768| РЗАСН|ТНВ35
СЗЕ1	ΝΜ_172212	колониестимулирующий фактор 1 (макрофаги)	МСЗЕ М6С31930
СТСЕ	ΝΜ 001901	фактор роста соединительной ткани	ССИ2 НС324 | Ι6ΕΒΡ8 М6С102839 Νθν2
ΟΤΝΝΒ1	ΝΜ 001904	катенин (кадгерин-ассоциированный белок), бета 1, 88 кДа	(3ΤΝΝΒ | ϋΚΕΖρ68 6Ώ02253 | ЕЬЬ25606| ЕЬЬ37923
ΏΑΑΜ1	ΝΜ_014992	ϋί зДече 11 еб.-ассоциированный активатор морфогенеза 1	ЕЬЬ41657|ΚΙΑΑ0666
ЕЪЫ	ΝΜ 0010817 55	эластин	ЕЬЬ38671|ЕЬЬ43523|ЗУАЗ| ИВЗИЗ
ΕΝΟ1	ΝΜ 001428	енолаза 1, (альфа)	ΕΝΟΙΙΑ |МРВ1|ΝΝΕ|РРН
ЕАВРЗ	ΝΜ_004102	белок, связывающий жирные кислоты, 3, мышцы и сердце (ингибитор роста, произошедший из молочной железы)	ЕАВР11|Ь-ЕАВР ΜΏ6Ι|О-ЕАВР
ЕАК	ΝΜ_0011996 49	киназа фокальной адгезии	£ак1
ЕСЕ4	ΝΜ 002007	фактор роста фибробластов 4	НВ6Е-4|НЗТ|НЗТ-1|НЗТЕ1|К-ЕСЕ | КЕСЕ
ΕΙ6Ε	ΝΜ_004469	с-£оз-индуцированный фатор роста (сосудистый фактор роста эндотелия ϋ)	УЕСЕ-ϋ|УЕСЕО
ЕЬТ1	ΝΜ_002019	£шз-связанная тирозинкиназа 1 (сосудистый фактор роста эндотелия/рецептор фактора проницаемости сосудов)	ЕЬТ|УЕ6ЕН1
ЕОХА1	ΝΜ_004496	ЕогкДеаб-бокс А1	ΗΝΕ3Α М6С33105|ТСЕЗА
ΟΑΡϋΗ	ΝΜ 002046	глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа	63Ρϋ 6ΑΡΌ М6С88685
С ΕΑΡ	ΝΜ 002055	глиальный фибриллярный кислый белок	ЕЫ45472

- 98 030418

ЗЪС2А4	ΝΜ_001042	Семейство переносчиков растворенных веществ 2 (ускоряющий переносчик глюкозы), член 4	съит4
ΗΑΝϋΙ	ΝΜ 004821	экспрессируемый производными сердца и нервного гребня 1	Нхб | ТЫпд1 | ЬНЪНа27 | еНапб
ΗΙΕ1Α	ΝΜ 181054	индуцируемый гипоксией фактор 1, альфа субъединица (основной ЬеПх- 1оор-ЬеИх-транскрипционный фактор)	Н1В-1а1£а|ΗΙΕ1|ΗΙΕ1- АЪЕА|МОР1|ΡΑ3Ώ8|ЬНЪНе78
НК2	ΝΜ 000189	гексокиназа 2	ϋΚΕΖρ686М1669|ΗΚΙΙ|НХК2
НМ6В1	ΝΜ 002128	бокс группы белков с высокой подвижностью 1	ϋΚΕΖρδδ6А04236 НМ61|НМСЗ| ЗВР-1
ΗΝΕ4Α	ΝΜ 178850	ядерный фактор гепатоцитов 4, альфа	РЪД39654|ΗΝΡ4|НМЕ4а7|НМЕ4а8| НМЕ4а9| НМР4а1£а|ΜΟϋΥΙΜΟϋΥΙ|ΝΗ2Α1| ΝΗ2Α21|ТСЕ ТСЕ14
НРНТ1	ΝΜ_000194	гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1	НСРКТ|НРКТ
НЗРВ1	ΝΜ_001540	белок теплового шока 1, 27 кДа	СМТ2Р ϋΚΡΖρ586Р1322|ΗΜΝ2Β| НЗ,76067| НЗР27|НЗР28|Нзр25|ЗКР27
1САМ1	ΝΜ 000201	молекула межклеточной адгезии 1	ВВ2|СО54|РЗ,58
ΙΕΝ6	ΝΜ_000619	интерферон, гамма	ΙΡ6|ΙΡΙ
1СЕ1	ΝΜ 0011112 85	инсулин-подобный фактор роста 1 (соматомедин С)	1СР-1|Ι6Ρ1Α 1СР1
1СЕ2	ΝΜ 0011275 98	инсулин-подобный фактор роста 2 (соматомедин А)	С11ог£43|РЪД22066|РЪД44734|ΙΝ3Ι6Ρ |рр9974
Ι6ΕΒΡ3	ΝΜ 0010133 98	связывающий инсулин-подобный фактор роста белок 3	ВР-53|ΙΒΡ3
Ι6ΕΒΡ5	ΝΜ_000599	связывающий инсулин-подобный фактор роста белок 5	ΙΒΡ5
ΙΚΒΚΒ	ΝΜ 001556	ингибитор энхансера гена легкой цепи каппа в В-клетках, киназа бета	РЪД33771|РЪД36218|РЪД38368 |РЪД40509| ΙΚΚ-Ьеба|ΙΚΚ2|ΙΚΚΒ М6С131801 ΝΡΚΒΙΚΒ
1Ъ10	ΝΜ_000572	интерлейкин 10	С31Р| 1Ъ-10 | 1Ы0А М6С126450 | М6С126451|Τ6ΙΡ
1Ъ1В	ΝΜ 000576	интерлейкин 1, бета	1Ъ-1 | 1Ы-БЕТА 1ЫР2
1ЪЗ	ΝΜ 000588	интерлейкин 3 (колониестимулирующий фактор, множественное распространение)	1Ъ-3 МС6Е М6С79398|МСС79399| миът1-сзв
1Ъ4	ΝΜ 172348	интерлейкин 4	ВССР-1|ВС6Р1|ВЗР1|1Ъ-4 М6С79402
ТЪ5	ΝΜ 000879	интерлейкин 5 (колониестимулирующий фактор, эозинофил)	ΕΏΕ 1Ъ-5|ТНЕ

- 99 030418

1Ь6Н	ΝΜ 181359	рецептор интерлейкина 6	СР126|Ю-6Н-1|1Ь-6Н-а1£а|1Ь6НА| МСС104991
Ю8	ΝΜ 000584	интерлейкин 8	СХСЬ8|ССР-1|ССР1|ЬЕСТ| ьист| ΣΥΝΑΡ |ΜϋΝΟΕ|ΜΟΝΑΡ|ΝΑΕ|ΝΑΡ-1|ΝΑΡ1
1ТСА5	ΝΜ_002205	интегрин, альфа 5 (рецептор фибронектина, альфа полипептид)	СЬ4 9е|ΕΝΚΑ У1А.5А
ΚϋΚ	ΝΜ_002253	рецептор, содержащий киназный домен (рецепторная тирозинкиназа III типа)	СОЗ 0 9|ЕЬК1|УЕСЕН|УЕСЕН2
ЬЕР	ΝΜ_000230	лептин	ЕЬ394114|ΟΒ|ОВЗ
ЬРЬ	ΝΜ 000237	липопротеиновая липаза	НОЬС<211 | ΤΜΡϋ
МАРКИ	ΝΜ 002751	митоген-активируемая протеинкиназа 11	Р38В|Р38ВЕТА2|РНКМ11|ЗАРК2| ЗАРК2В|р38-2|р38Веба
ММР1	ΝΜ_002421	матриксная металлопептидаза 1 (интерстициальная коллагеназа)	СЬС|СЬСМ
ММРЗ	ΝΜ_002422	матриксная металлопептидаза 3 (стромелизин 1, прожелатиназа)	СНО36 МСС126102|МСС126103| МСС126104| ММР-3|30-1|3ΤΜΥ|3ΤΜΥ1|ЗТН1
ΜΥΗ1	ΝΜ_005963	миозин, тяжелая цепь 1, скелетномышечный, взрослый	МСС133384 ΜΥΗ3Α1|МУНа| МуНС-2Х/О| МуНС-2х
МУНИ	ΝΜ 022844	миозин, тяжелая цепь 11, гладкомышечный	ААТ4|ϋΚΕΖρ68601012 6 | ϋΚΕΖρ686ϋ19237| ΕΑΑ4|ЕЬЙ35232|МСС126726|МСС32963| ЗМНС|ЗММНС
МУН 7	ΝΜ_000257	миозин, тяжелая цепь 7, сердечномышечный, бета	СМО13|СМН1|ϋΚΕΖρ451Ε047| МСС138376| МСС138378|ΜΡϋ1|МУНСВ|3ΡΜϋ| 5ΡΜΜ
ΜΥΟΏ1	ΝΜ_002478	фактор миогенной дифференцировки 1	ΜΥΕ3|ΜΥΟϋ|Рим|ЬНЬНс1
ΝΕΑΤΟ1	ΝΜ 172390	ядерный фактор активированных Τ'- клеток, цитоплазматический, кальцинейрин-зависимый 1	МСС138448ΙΝΕ-АТСΙΝΕΑΤ2|ΝΕΑΤο
ΝΕΑΤΟ2	ΝΜ_173091	ядерный фактор активированных Т- клеток, цитоплазматический, кальцинейрин-зависимый 2	ΝΕΑΤ1 ΝΕΑΤΡ
ΝΕΚΒ1	ΝΜ 003998	энхансер гена ядерного фактора легкой цепи каппа полипептида в В- клетках 1	ϋΚΕΖρ686С01211|ΕΒΡ-1|ΚΒΕ1| МСС54151| ΝΕ-карра-ВΙΝΕ-карраВ|ΝΕΚΒ-ρ105| ΝΕΚΒ-ρ50|ρΐ05|ρ50
N032	ΝΜ 000625	синтаза оксида азота 2, индуцибельная	ΗΕΡ-ΝΟ3|ΙΝΟ3|N03|ΝΟ32Α
ΝΟΤΟΗ1	ΝΜ_017617	побей 1	ΤΑΝ1|ΚΝ1

- 100 030418

ЫНЗС1	ΝΜ_0010240 94	ядерный рецептор подсемейства 3, группа С, член 1 (глюкокортикоидный рецептор)	СССЕ|ССЕ|СЕ|СЕЬ
ΝΕΡ2	ΝΜ 201279	нейропилин 2	М6С126574 ΝΡ2 ΝΡΝ2|РЕО2714| УЕ6Е165Е2
РАХ7	ΝΜ_013945	спаренный бокс 7	ЕЬЛ7460|НиР1|РАХ7В|ЕМ32
РОСЕВ	ΝΜ_033016	бета-полипептид фактора роста тромбоцитов (гомолог онкогена вируса саркомы обезьян (ν-515))	ЕЬЛ2858 | Ρϋ6Ε2 | 313 | ЗЗУ| с-313
ΡΏΚ4	ΝΜ 002612	киназа пируватдегидрогеназы, изозим 4	ЕЬД40832
РЬА2С1В	ΝΜ_000928	фосфолипаза А2, группа ΙΒ (поджелудочная железа)	М6С119834 М6С119835|РЬА2|РЬА2А| РРЬА2
РЫЛ	ΝΜ_002666	белок, ассоциированный с липидными каплями	перилипин
РРАЕС	ΝΜ_138712	активируемый пролифератором пероксисом рецептор гамма	С1МТ1|СЬМ1|ΝΕ1Ο3|РРАЕС1|РРАЕС2| РРАЕдатта
<2АЕЗ	ΝΜ 005051	глут аминил-т РНК-синт е таза	СЬБЕЗ|РЕО2195
ЕНОА	ΝΜ 001664	семейство генов гомологии газ, член А	АЕН12|АЕНА ЕНО12|ЕНОН12
ετονχι	ΝΜ_001754	гипЬ-связанный фактор транскрипции 1	АМЫ АМЫ-ЕУ1-1 АМЬСЕ1 | СВЕА2 | ЕУ1-1|РЕВР2аВ
ЕХЕА	ΝΜ_002957	ретиноидный рецептор X, альфа	ЕЫГ00280 | ЕЫГ00318 | ЕЫГ16020 | ЕЫГ167 33 М6С102720 ΝΕ2Β1
3ΕΕΡΙΝΕ1	ΝΜ_0011654 13	ингибитор серпиновой пептидазы, ветвь Е (нексин, ингибитор активатора плазминогена 1 типа), член 1	ΡΑΙ|ΡΑΙ-1|РАН|РЬАЛП
3ΜΑΏ2	ΝΜ_005901	семество 3ΜΑΏ, член 2	Л18|ДУ18-1ΙΜΑΏΗ2|ΜΑΏΕ2| М6С22139| М6С34440|ΗΜΑϋ-2|Η3ΜΑϋ2
3ΜΑΏ4	ΝΜ_005359	семейство 3ΜΑΏ, член 4	ОРС4 | ЛР |ΜΑϋΗ4
ТЕНТ	ΝΜ 198255	теломераза-обратная транскриптаза	ЕЗТ2|ТС31|ТР2|ТЕТ|НЕЗТ2
Т6ЕВ1	ΝΜ 000660	трансформирующий фактор роста, бета 1	ΟΕϋ|ΏΡΏΙ|ЬАР|ТСЕВ|ТСЕЬеЬа
ТСЕВЗ	ΝΜ 003239	трансформирующий фактор роста, бета 3	АЕУО | ЕЬЛ 6571 | ТСЕ-ЬеЬаЗ
ТНВ34	ΝΜ_003248	тромбоспондин 4	ТЗР4
ΤΝΕ	ΝΜ 000594	фактор некроза опухоли	ϋΙΕ| ΤΝΕ-аЫа | ΤΝΕΑ ΤΝΕ3Ε2
тивв	ΝΜ 178014	тубулин, бета	М40 М6С117247|МСС16435|ОК/ЗИ- с1,56|тивв1|тивв5
тивв1	ΝΜ_030773	тубулин, бета 1	бета-изоформа тубулина (1)
тивс1	ΝΜ 001070	тубулин, гамма 1	сср-1|тивс|тивссР1
УСАМ1	ΝΜ_080682	сосудистая молекула клеточной адгезии 1	СО106|ОКЕЬр779С2333|ЛСАМ- 100 МСС99561
УЕСЕА	ΝΜ 003376	сосудистый фактор роста эндотелия А	МСС70609 МУСО1|УЕСЕ|УРЕ
У1М	ΝΜ_003380	виментин	ЕЬЛ 6605
И13Р1	ΝΜ_080838	белок ΜΝΤΙ-индуцибельного сигнального пути 1	ССЛ|И13Р1с1И13РЫ|И13Р1Ьс
ΜΝΤ1	ΝΜ 005430	семейство сайтов встраивания ММТУ м1пд1езз-типа, член 1	ΙΝΤ1

Биоинформатический анализ. Данные, полученные в формате.сδν с прибора Вютагк (Б1шй1§т), преобразовывали в табличный формат, включающий информацию для образца, мРНК и репликации, наряду с необработанным значением флуоресценции. Реакции ПЦР, которые не проходили, отмечали как отсутствующие. Несколько экспериментов объединяли после нормировки по отношению к общей экспрессии видов мРНК. Все изменения экспрессии мРНК отфильтровывали на основе требований детектирования по меньшей мере в 2 из всех тестируемых биологических повторов. Авторы оценивали среднее

- 101 030418 отклонение для технического, биологического и отклонения по набору в целом наборе данных.

Для анализа данных значения С для всех интересующих генов сначала нормировали по отношению к средним значениям С для генов домашнего хозяйства из соответствующего образца для получения значений Лс1 (ΔΟ=Ο для гена - С для среднего гена домашнего хозяйства). Гены из каждого образца затем нормировали к такому же гену в необработанном контроле для получения значений ΔΔΟ (ЛЛС.’1=Лс1 контрольный образец - ΔΛ обработанный образец).

Для получения значений кратности изменения активируемые гены (т.е. ΔΔΟ более 0) подвергали следующему расчету: кратность изменения = 2^ΛΔΔΟ. Для подавляемых генов (т.е. ΔΔΟ8 менее 0): кратность изменения = -(2Λ|ΔΔΟ|).

Анализы пролиферации клеток (анализы А1-А11 в таблицах, данных ниже)

Уровень техники и терапевтическое значение.

Способность модулировать скорость пролиферации клеток и апоптоз различных типов клеток является фундаментальным свойством многих терапевтических соединений и имеет прямое значение для лечения и предотвращения широкого диапазона заболеваний и нарушений.

Соответственно, полипептиды ΑΑ^δ, обладающие способностью модулировать скорость пролиферации клеток и/или апоптоза, имеют значительный потенциал терапевтического применения в широком диапазоне заболеваний, включая использование в качестве факторов роста и факторов дифференцировки для стволовых клеток и в схемах лечения для усиления или подавления пролиферации конкретных представляющих интерес типов клеток ίη νίνο или ίη νίΐΓΟ, включая, например, гемопоэтические клетки, иммуномодулирующие клетки, раковые клетки, и для лечения и предотвращения заболеваний, связанных с возрастом, включая, например, нейродегенерацию, периферическую нейропатию и потерю мышечного тонуса и тонуса мягких тканей.

Методы. Влияние полипептидов ΑΑΚδ на пролиферацию клеток оценивали с использованием одного или более методов, перечисленных ниже и более конкретно описанных в приведенных ниже методах.

№ес^ 33432. Стандартные методы подсчета клеток для оценки пролиферации осуществляли с использованием красителя №ес!О 33432, который представляет собой проникающий в клетки ядерный контрастный краситель, который испускает синюю флуоресценцию при связывании с дцДНК. Он доступен в виде раствора (ΙηνίΐΓΟ^η Кат. № Н-3570), который используется в конечной концентрации 1 мкг/мл в среде или ФСБ. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в присутствии полипептидов ΑΑΚδ в течение стандартного времени роста, составляющего 48 ч или более в зависимости от типа клеток, как описано в приведенных ниже примерах.

ΑТΡ-1^ΐе. Клеточный уровень АТФ коррелирует с состоянием здоровья клетки и может быть с легкостью определен с использованием различных коммерчески доступных наборов. Смесь ΑТΡ-1^ΐе (РегкшΕΠικί', Кат. №6016947 Βο8ΐοη, ΜΑ 02481), которая представляет собой гомогенную смесь лизирующего раствора и реагента, детектирующего АТФ, предварительно перемешивали перед применением и использовали в отношении 1:1 (по объему) с культивируемыми клетками. Планшеты инкубировали в течение 5 мин для обеспечения лизиса и планшеты анализировали с использованием люминесцентного спектрофотометра для прочтения планшетов. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в присутствии полипептидов ΑΑΚδ в течение стандартного времени роста, составляющего 48 ч или более в зависимости от типа клеток, как описано в приведенных ниже примерах.

ΑΣΑΜΑ^ΕυΕ® (Резазурин) представляет собой индикатор выживаемости клеток, который основан на оксилительно-восстановительном состоянии клеток. Резазурин, активный ингредиент, представляет собой нетоксичное, способное проникать в клетки соединение, которое имеет синий цвет и по существу не флуоресцирует при существовании в окисленной форме. Однако при проникновении в нормальные жизнеспособные клетки резазурин быстро восстанавливается до резоруфина, который продуцирует красный флуоресцентный сигнал. Жизнеспособные клетки непрерывно превращают резазурин в резоруфин, таким образом, обеспечивая количественную меру выживаемости и цитотоксичности. Отсутствие токсичности обеспечивает возможность длительной обработки клеток резазурином без негативного влияния; было обнаружено, что клетки, которые выращивали в присутствии резазурина, производили такое же количество жизнеспособных клеток, что и контрольные клетки, при определении с помощью проточного цитометрического анализа.

Измерения проводили путем добавления раствора резазурин/Л^ЛΜΑΚΒ^υΕ® к клеткам, инкубирования их в течение 1-4 ч и считывания флуоресценции или поглощения. Значение флуоресценции или поглощения пропорционально количеству живых клеток и соответствует метаболической активности клеток. Поврежденные и нежизнеспособные клетки имеют более низкую собственную метаболическую активность и, соответственно, генерируют пропорционально более низкий сигнал по сравнению со здоровыми клетками. После инкубации в присутствии Л^ЛΜЛΚΒ^υΕ® образцы можно с легкостью анализировать с помощью приборов измерения флуоресценции и абсорбции. Для прочтения флуоресценции использовали следующие параметры для фильтров: возбуждение при 530 нм и испускание при 590 нм.

Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в присутствии полипептидов ΑΑΚδ в течение стан- 102 030418 дартного времени роста, составляющего 48 ч или более в зависимости от типа клеток, и как описано в примерах ниже.

Захват ацетилированных ЛПНП в гепатоцитах человека НерС2С3а (анализ В1 в приведенных ниже таблицах данных)

Уровень техники и терапевтическое значение:

Липопротеины низкой плотности, ЛПНП, являются основным переносчиком холестерина в крови и отвечают более чем за 60% холестерина плазмы крови. У людей рецептор ЛПНП в печени отвечает за клиренс примерно 70% плазматического ЛПНП из циркулирующей крови. Интернализированные ЛПНП разрушаются до свободного холестерина и аминокислот в лизосоме. Печень является основным органом катаболизма ЛПНП и активности рецептора ЛПНП у людей. ЛПНП, которые не интернализируется и остаются в циркулирующей крови, могут транспортироваться эндотелиальными клетками в стенку сосуда, приводя к формированию атеросклеротических бляшек. Циркулирующие ЛПНП также могут захватываться макрофагами, что также может вносить вклад в формирование бляшек. Повышение захвата ЛПНП в ткани печени считается благоприятным для здоровья человека, и разработка безопасных и эффективных способов терапии, которые могут положительно регулировать указанный процесс, может обеспечить новые способы лечения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний. Для исследования того, могут ли уникальные свойства полипептидов ΑΑΚδ регулировать захват ацетилированного ЛПНП, использовали стандартный анализ для измерения захвата ацетилированного ЛПНП в клетках НеρС2С3а.

Таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать захват ЛПНП, могут иметь высокий потенциал терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 1 и 2 типа, метаболического синдрома и сосудистых заболеваний, включая атеросклероз.

Методы. Клетки НЕРС2С3а (ΑΪΤΌ# СНЬ-10741) поддерживали в минимальной питательной среде Игла (Еад1е8 Миита1 Е88ег1Ца1 теДшт, ЕМЕМ), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (НуС1ог1е Са^Н30910,03), 50 мкг/мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина, (1шйгодец) в 15 мл среды во флаконах на 75 мл. Клетки выращивали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха, соответствующих второму классу биологической защиты ΒδΕ2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. НЕРС2С3а экспрессируют рецептор ЛПНП и могут захватывать ацетилированный ЛПНП при их культивировании на покрытых коллагеном планшетах с прозрачным дном. Клетки в объеме 100 мкл высевали на покрытые коллагеном планшеты (Iην^!^οдеη Са!#Α11428) на ночь в полной среде (выше) при плотности посева 50,000 клеток/мл. Клетки промывали один раз ФСБ (11'1уПгоде1'1 Са!# 10010) и в каждую лунку добавляли 80 мкл свободной от сыворотки среды ЕМЕМ. В каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ в конечной концентрации 250 нМ на лунку в одинаковом объеме в стерильном ФСБ. В каждую лунку наносили уникальный полипептид ΑΑΚδ. Клетки инкубировали без сыворотки и подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в течение 16 ч. Через 16 ч инкубации собирали супернатант и растворимые молекулы IСΛМ измеряли с использованием стандартного набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ΞυδΑ) фирмы ΚΝΏ δуδ!етδ (Кат. № ΌΥ643) и в каждую лунку добавляли бессывороточную среду с добавлением 5 мкг/мл ас-ЛПНП ^еха Р1иог 488-меченных Кат. № Ь23380, 1шйгодец). Через 2 ч инкубации при 37°С 5% СО₂, клетки промывали дважды стерильным ФСБ перед добавлением 100 мкл ФСБ в каждую лунку для количественной оценки. Планшеты анализировали на предмет общей интенсивности флуоресценции с помощью прочтения дна на флуоресцентном спектрофотометре для прочтения планшетов У1с!ог Х5 (Регкт Е1тег) при длине волны возбуждения примерно 485 нм и длине волны испускания примерно 535 нм. Клетки окрашивали красителем Ноеск8! и анализировали интенсивность флуоресценции при возбуждении при 405 нм/испускании при 450 нм для подтверждения стабильности количества клеток по всему планшету. Регуляция кислородного взрыва нейтрофилов и продукции эластазы у человека (анализы С1-С3 в таблицах, данных ниже)

Кислородный взрыв нейтрофилов

Уровень техники и терапевтическое значение.

Фагоцитоз полиморфоядерными нейтрофилами и моноцитами представляет собой важную составляющую иммунной защиты организма от инфекций, вызванных микроорганизмами, включая бактерии и грибы. Процесс фагоцитоза может быть разделен на несколько основных этапов: хемотаксис (миграция фагоцитов к сайтам воспаления), присоединение частиц к клеточной поверхности фагоцитов, поглощение (фагоцитоз) и внутриклеточное уничтожение по кислород-зависимым (окислительный взрыв) и кислород-независимым механизмам. Снижение или отсутствие активности кислородного взрыва наблюдается при врожденных дефектах, таких как хронические грануломатозные заболевания (ССО). ССО представляют собой гетерогенную группу наследуемых нарушений, которые обычно проявляются во время первых двух лет жизни. Заболевание характеризуется повторяющимися и угрожающими жизни инфекциями, вызванными бактериальными и грибковыми организмами. Указанные инфекции, как правило, включают пневмонию, лимфаденит или абсцесс, который поражает лимфатические узлы, легкие и пе- 103 030418 чень. ΝΑΟΡΗ-оксидаза представляет собой ферментативную систему, отвечающую за продукцию супероксид-аниона, который быстро превращается в перекись водорода и гидроксильные радикалы. Нарушения пептидов, входящих в состав феремнтативной системы ΝΑΟΡΗ-оксидазы, приводит к дисфункциям, характерным для ССО. Нейтрофилы, полученные от пациентов, страдающих ССО, не могут обеспечивать значительные реакции окислительного взрыва после стимуляции. Описаны различные формы ССО (классический Х-связанный ССО и аутосомные рецессивные варианты). Реакции окислительного взрыва гранулоцитов нарушены при трансплантаци, на поздних стадиях ВИЧ-инфекции и у пожилых людей, что делает указанные популяции более чувствительными ко вторичной инфекции и обострениям воспалительного заболевания. Различные иммуномодуляторы (например, цитокины (СМ-С8Р, С-С8Р, ΤΝΡ) или лекарственные средства) также оказывают эффекты на окислительный взрыв. Существуют белки, обладающие потенциальной способностью активировать или подавлять окислительный взрыв на терапевтическом уровне, применимые для различных стадий заболеваний.

Способы. Лиганд протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) может использоваться в указанном анализе в качестве агониста процесса окислительного взрыва. Гепаринизированную цельную кровь перемешивали со стерильным декстраном (конечная концентрация 0,6%) в течение 1 ч и позволяли разделяться на слои. Нижний слой содержал нейтрофилы, моноциты и эритроциты. Для удаления всех эритроцитов проводили этап лизиса с использованием хлорида аммония, и после указанного этапа лизиса оставалась на 97% чистая популяция нейтрофилов, загрязненная моноцитами примерно на 3%. При стимуляции гранулоциты и моноциты продуцируют реактивные метаболиты кислорода (супероксиданион, перекись водорода, гипохлорную кислоту), которые разрушают бактерии внутри фагосомы. За образованием реактивных оксидантов во время окислительного взрыва можно наблюдать путем добавления и окисления Атр1ех КеД Затем анализировали процент клеток, которые продуцировали реактивные кислородные радикалы, а также их среднюю интенсивность флуоресценции с использованием флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов. Как правило, время указанной реакции составляло 10 мин, при этом очевидный кислородный взрыв наблюдали в течение 2 мин, а уменьшение сигнала наблюдали в течение 20 мин. Указанный анализ можно проводить по принципу агонизма в отсутствие РМА или по принципу антагонизма, с сопутствующим введением полипептидов ΑΑΚδ и РМА в концентрации, которая является ниже ЕС₅₀ для указанного соединения.

Регуляция продукции эластазы нейтрофилами человека

Уровень техники и терапевтическое значение.

Эластаза нейтрофилов представляет собой сериновую протеазу, которая, как считается, играет специфическую роль в развитии широкого диапазона заболеваний человека, включая воспалительные нарушения легких и сердечно-сосудистой системы. Несмотря на ее ключевую физиологическую роль во врожденной иммунной защите организма, она также может принимать участие в ремоделировании тканей и обладает стимулирующим влиянием на секрецию, которые сейчас считаются важными сигналами для локального воспаления. В течение нескольких десятилетий считается, что активность эластазы нейтрофилов вовлечена в развитие эмфиземы, однако только относительно недавно была признана патогенная функция указанной сериновой протеазы в ситуациях, когда происходит избыточное отложение внеклеточного матрикса. Благодаря применению моделей генетически модифицированных животных начинают объясняться возможные пути влияния ее действия на фиброзную репарацию легких. Появляющиеся доказательства дают основания полагать, что вовлечение клеточных путей, имеющих более прямое действие на продукцию фиброгенного медиатора и синтез коллагена содействует обеспечению накопления легочного матрикса под действием эластазы нейтрофилов. Эластаза нейтрофилов человека также присутствует в атеросклеротических бляшках, где она вносит вклад в разрушение матрикса и ослабление стенки сосуда, ассоциированное с осложнениями образования аневризмы и разрывом атеросклеротической бляшки. Эластаза связана с другими внеклеточными протеазами в указанных процессах, но широкий диапазон субстратов и ее активность, сопряженная с дегрануляцией нейтрофилов, позволяет выделять указанную деструктивную протеазу как терапевтическую мишень при атеросклеротическом заболевании.

Методы. В указанном анализе использовали набор ΕΝΖΡΉΕΚ® (Iην^ί^οдеη Кат. № Е-12056) для анализа эластазы. Нейтрофилы получали из свежей крови человека с использованием 6% раствора декстрана и эритроциты лизировали до помещения клеток в среду КРМ1 (среда должна быть без добавления сыворотки и антибиотиков). Исходный раствор субстрата эластина ОС (1,0 мг/мл) готовили путем добавления 1,0 мл деионизированной воды (ДИ₂О) непосредственно к одной из трех пробирок, содержащих лиофилизированный субстрат, и перемешивания для достижения растворения. Однократный реакционный буфер готовили путем разбавления 6 мл 10Х реакционного буфера в 54 мл ДН₂О. 100 мкг/мл рабочего раствора субстрата эластина ОС готовили путем разбавления исходного раствора эластина ОС в десять раз 1Х реакционным буфером. Исходный раствор свиной панкреатической эластазы готовили путем приготовления исходного раствора 100 Ед/мл в ДИ₂О. Для анализа на предмет эластазной активности, 50 мкл 1Х реакционного буфера наносили в каждую аналитическую лунку, содержащую 500000 нейтрофилов/мл в объеме 30 мкл. Добавляли 8 мкл каждого полипептида ΑΑΚδ на лунку и образец инкубировали в течение 20 мин при 37°С. В каждую лунку добавляли 50 мкл рабочего раствора (100 мкг/мл) эластина

- 104 030418

ЭР и перемешивали. Образцы инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 30 мин. Интенсивность флуоресценции можно измерять на флуоресцентном спектрофотометре для считывания планшетов, снабженном стандартными флуоресцеиновыми фильтрами (возб. 485/исп.535), для нескольких временных точек.

Связывание с То11-подобными рецепторами и активация ΝΓκΒ (анализы ϋ1-ϋ4 в таблицах данных, ниже)

Уровень техники и терапевтическое значение. Макрофаги играют основную роль во врожденном иммунитете и экспрессируют большой набор различных классов рецепторов распознавания структур (РВВ), включая семейство То11-подобных рецепторов (ТЬВ), которые являются мощными регуляторами и контролерами иммунного ответа.

Стимуляция ТЕВ микробными патогенами и эндогенными лигандами инициирует сигнальные каскады, которые вызывают секрецию провоспалительных цитокинов и эффекторных цитокинов, которые направляют последующие реакции приобретенного иммунитета. Эндогенные лиганды, также как и микробные компоненты, распознаются ТБР и могут активировать ТЕР, что дает возможность предполагать, что указанные рецепторы могут представлять собой ключевую мишень для разработки новых терапий для множества заболеваний.

Таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, которые модулируют активность рецепторов ТЕР, обладают потенциалом терапевтического применения для широкого круга заболеваний и нарушений, включая, например, воспалительные заболевания и нарушения, аутоиммунные заболевания, отторжение тканевого трансплантата/отторжение органа, предотвращение или лечение рака, модуляцию гематопоэза и инфекцию.

Измерение активации ТЬК в клетках КА^-ВЬиЕ

Мышиные макрофаги, продающиеся под торговой маркой ΚΑ^-βΕυΕ™ (1пу1уодеп, Сака1од собе: га^-кр), экспрессируют все ТЬВ за исключением ТЕР5, и включают ген секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (δΕЛΡ), который индуцируется транскрипционными факторами ΝΕκΒ и АР-1. При стимуляции ТЕР, клетки ΚΑ^-ΕΕυΕ™ активируют ΝΕκΒ и/или АР-1, приводя к секреции δΕЛΡ, который поддается измерению с помощью среды для детектирования δΕЛΡ.

Методы. Клетки ΚΑ^-ΕΕυΕ™ промывали дважды ФСБ, трипсинизировали и ресуспендировали в свежей ростовой среде (ростовая среда: ИМЕМ, 4,5 г/л глюкоза, 10% термоинактивированная эмбриональная бычья сыворотка (30 мин при 56°С), 100 мг/мл 2ЕОС1К™, 2 мМ Ь-глутамин). Клетки высевали в концентрации 50000 клеток/лунку в 96-луночных планшетах в общем объеме 100 мкл и в каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ, контроли или полипептиды ΑΑΚδ (+^Ρδ) в концентрациях, показанных в экспериментах, изложенных ниже. Клетки инкубировали при 37°С в инкубаторе при 5% СО₂ в течение 18 ч. На 2 день эксперимента готовили среду для детектирования δΕЛΡ (^υΑНΊМ-В^υΕ™) (1пу1уодеп Сака1од собе: гер-цЬ 1) в соответствии с инструкциями и добавляли в 96-луночный планшет с плоским прозрачным дном в объеме 120 мкл на лунку, затем добавляли супернатант клеток (20 мкл). Образцы инкубировали при 37°С в течение от примерно 30 мин до 2 ч. Уровень δΕЛΡ определяли с использованием спектрофотометра и путем считывания абсорбции при 650 нм.

Для детектирования полипептидов ΑΑΚδ, которые специфично блокируют активацию ТЕР, указанный анализ можно модифицировать для идентификации потенциальных антагонистов ТЕК В указанном случае полипептиды ΑΑΚδ добавляли к клеткам в конечной концентрации примерно 250 нМ на лунку, (или как специально указано в приведенных ниже примерах) за 1 ч до добавления 50 нг/мл ^Ρδ. Клетки инкубировали и выявляли δΕЛΡ, как описано выше. Контрольные лунки, содержащие ФСБ в отсутствие ^Ρδ или только добавленный полипептид ΑΑΚδ, использовали для оценки фонового уровня стимуляции ТЬИ во время измерения. Контрольные лунки предварительно обрабатывали ФСБ и известными агонистами и анатагонистами ТЬР. Отношение вычитаемого фона [сигнал ФСБ плюс ^Ρδ] к [сигналу полипептида ΑΑΚδ плюс ^Ρδ] использовали для определения процентного антагонизма.

Скрининг ТЬК человека в клетках Нек293

Клетки человека НЕК293 представляют собой генетически модифицированные клетки и продаются под торговой маркой клетки НЕК-В1ие™ ТЬР (1пу1уодеп). Варианты ТЬР2 и ТЬР4 указанного типа клеток селективно экспрессируют все ТЬР2 или ТЬР4 и содержат репортерный ген секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (δΕЛΡ) под контролем минимального промотора ΙΡΝ-бета, слитого с пятью сайтами связывания транскрипционных факторов ΝΕκΒ и АР-1. При использовании специфических агонистов ТБР 2 или 4 (соответственно), клетки НЕК-ВЕЕЕ'¹™ ТЕР2 и НЕК-ВЕЕЕ'¹™ ТЕР4 активируют ΝΕκΕ и/или АР-1, приводя к секреции δΕЛΡ, который поддается измерению при использовании реагента для детектирования δΕЛΡ. Клетки НЕК-ВБЕЕ'™ ТБР2 являются ко-трансфицированными ^Ρδ-корецепторным белком СЭ14 для усиления чувствительности ТЬР2 и улучшения качества сигнала. Исходная клетка экспрессирует эндогенный уровень ТШ, 3, 5, 6, а также ЕОЭ1.

Методы. Клетки НЕ1<-ВЕЕЕ^т™-ТЕР2 или НЕК-ВЕЕЕ'™-ТЕР4 промывали дважды ФСБ, трипсинизировали и ресуспендировали в свежей ростовой среде (ростовая среда: ЭМЕМ, 4,5 г/л глюкоза, 10% термоинактивированная эмбриональная бычья сыворотка (30 мин при 56°С), 100 мг/мл 2ЕОС1К^^М, 2 мМ

- 105 030418

Ь-глутамин). Клетки высевали в концентрации 50000 клеток/лунку в 96-луночный планшет в общем объеме 100 мкл и в каждую лунку добавляли полипептиды ААК8, контроли или полипептиды ААК8 (+ЬР8) в концентрациях, показанных в экспериментах, изложенных ниже. Клетки инкубировали при 37°С в инкубаторе при 5% СО₂ в течение 18 ч. На 2 день эксперимента готовили среду для детектирования 8ЕАР (ЦиАОТЬВЬиЕ™) (Iтν^νοдет Саίа1οд тобе: гер-с]Ь1) в соответствии с инструкциями и добавляли в 96луночный планшет с плоским прозрачным дном по 120 мкл на лунку, затем добавляли клеточный супернатант (20 мкл). Образцы инкубировали при 37°С в течение примерно 30 мин вплоть до 2 ч. Уровень 8ЕАР определяли с использованием спектрофотометра и путем считывания абсорбции при 650 нм. Контрольные лунки предварительно обрабатывали ФСБ и известными агонистами ТЬК, такими как иЬгаРиге ЬР8 (ТЬК-4) или РАМ3С8К4 (ТЬК-2). Отношение вычитаемого фона [сигнал ФСБ плюс ЬР8] к [сигналу полипептида ААК8 плюс ЬР8] использовали для определения процентного агонизма.

Высвобождение цитокинов (Анализы Е1-Е17 в таблицах, данных ниже)

Уровень техники и терапевтическое значение. Цитокины представляют собой набор разнообразных низкомолекулярных белковых молекул клеточной передачи сигнала, которые широко используются для межклеточного взаимодействия и играют важные роли в поддержании нормального гомеостаза тела, включая иммуномодуляцию и регуляцию. Таким образом, полипептиды ААК8, которые модулируют высвобождение или биологическую активность цитокинов, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний и нарушений, включая, например, воспалительные заболевания и нарушения, аутоиммунные заболевания, отторжение тканевого трансплантата/отторжение органа, предотвращение или лечение рака, модуляцию гематопоэза и инфекции.

Высвобождение цитокинов из клеток в культуре Методы. Анализируемые клетки высевали в 24-луночный планшет при плотности примерно 1 миллион клеток на лунку в 1 мл ростовой среды. Клетки обрабатывали либо полипептидом ААК8 (в концентрациях, показанных в приведенных ниже примерах), либо равным объемом ФСБ, и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. После обработки клеток образцы центрифугировали при 4°С на центрифуге с бакет-ротором при 2000хд в течение 5 мин. Среду осторожно собирали таким образом, чтобы не разрушить клеточный осадок, и переносили в новую пробирку. Образцы сразу исследовали или быстро замораживали в жидком азоте для последующего анализа. Высвобождение цитокинов (включая цитокины М1Р, 1Ь-8, 1Ь-10, серпин Е1, СМ-С8Р, СКО, 1Ь-1 альфа, 1Ь-1бета, 1Ь-1га, 1Ь-6, МСР-1, М1Р-1, КАОТЕ8 и ТЯР-альфа) оценивали с использованием коммерчески доступных наборов (К&Э 8уδΐетδ, 1нс, МЩ США) или на основании контракта при помощью исследовательской организации (МЭ Вюкаеасек (Сент-Пол, Минесота).

Высвобождение цитокинов из цельной крови человека Методы. Цельную кровь человека получали от здоровых доноров, представляющих собой людей, и собирали в стандартные пробирки с гепарином для сбора образцов. Кровь использовали в день ее получения, чтобы гарантировать адекватное состояние здоровья клеток. Кровь осторожно перемешивали и помещали в объеме 100 мкл в 96-луночные поликарбонатные планшеты с У-образным дном. Добавляли полипептиды ААК8 и медленно перемешивали их с кровью 2 раза с использованием многоканальной пипетки, установленной на 50 мкл. Для всех экспериментальных работ использовали наконечники с фильтром и полный комплект средств индивидуальной защиты (РРЕ). Вся экспериментальные работа проводилась в вытяжном шкафу соответствующего класса биозащиты, который являлся подходящим для проведения экспериментальной работы с кровью человека. Кровь инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО2. После обработки клеток образцы центрифугировали на центрифуге с бакет-ротором при 2000хд в течение 5 мин. Супернатант собирали для проведения иммуноферментных анализов (ЕЫ8А) цитокинов. ЕЫ8А проводили, как описано ранее.

Высвобождения цитокинов из клеток ТНР-1 и НЬ60 Методы. Клетки ТНР1 и НЬ60 выращивали в среде КРМ1-1640+10% эмбриональной бычьей сыворотки и высевали в концентрации 1х10⁶ клеток/мл в 96-луночные планшеты. Клетки обрабатывали в течение 48 ч полипептидами ААК8 в концентрации 250 нМ, если иное не указано. Указанные два типа клеток, как правило, считаются моноцитоподобными или макрофагподобными и имеют много маркеров, которые дают основания считать их клетками миелоидного ряда. Таким образом, указанные клетки производят многочисленные различные цитокины в ответ на различные биологические стимулы и часто используются для исследования воспалительных и противовоспалительных ответов ίη νίΐτο. Высвобождение цитокинов (включая цитокины М1Р, 1Ь-8, 1Ь-10, Серпин Е1, СМ-С8Р, СКО, 1Ь-1 альфа, 1Ь-1 бета, 1Ь1га, 1Ь-6, МСР-1, М1Р-1, КАNТЕ8 и ТЯР-альфа) определяли с использованием коммерчески доступных наборов (К&Э 8уδΐетδ, 1нс, Минесота, США) или на основании контракта при помощи исследовательской организации (МЭ Вюкаеасек (Сент-Пол, Минесота).

Высвобождение цитокинов из мононуклеаров периферической крови Методы. Для изолирования мононуклеаров периферической крови свежеполученную человеческую цельную кровь медленно наносили на Н18ТОРАЦиЕ®-1077 (81дта) в отношении 1:1 в конические пробирки на 50 мл при комнатной температуре. Нанесенные образцы центрифугировали при 400хд в клини- 106 030418 ческой центрифуге, снабженной бакет-ротором, в течение 30 мин при комнатной температуре без торможения. Затем слой лейкоцитов на границе раздела между плазмой и градиентом плотности удаляли с помощью пипетки. Указанные клетки, представляющие собой мононуклеары периферической крови, промывали дважды средой ΚΡΜΙ-1640 ОпуПгсщеп #22400-105) посредством разбавления и центрифугирования в течение 10 мин при 250хд. Промытые РВМС ресуспендировали в среде ΚΡΜΙ-1640+10% эмбриональной бычьей сыворотки и высевали в концентрации 1х10⁶ клеток/мл.

Высвобождение цитокинов из синовиоцитов человека

Уровень техники и терапевтическое значение.

Большое количество исследований показало, что 1Ь-6 и 1Ь-8 продуцируются на повышенном уровне при некоторых заболеваниях и, таким образом, могут играть фундаментальную роль в патогенезе воспалительного заболевания. 1Ь-6 активирует продукцию клеток эндотелия, приводя к высвобождению 1Ь-8 и белков-хемоаттрактанов моноцитов, экспрессии молекул адгезии и привлечения лейкоцитов в места воспаления. Указанные цитокины экспрессируются в типах клеток, ассоциированных с воспалительными заболеваниями, включая клетки, вовлеченные в патогенез системного ювенильного артрита, системной красной волчанки, болезни Крона и ревматоидного артрита. Одним из наиболее важных системных эффектов продукции цитокинов является индукция ответа острой фазы. Белки острой фазы в основном продуцируются печенью и включают белки, которые обеспечивают иммунный ответ путем активации компонентов комплемента, индукции провоспалительных цитокинов и стимуляции хемотаксиса нейтрофилов. В альтернативном варианте ответ острой фазы может иметь полезное действие, и белки острой фазы, такие как антагонисты протеиназы, опсонины и прокоагулянты, помогают ограничивать разрушение ткани путем разрешения воспаления. В частности, 1Ь-6 может стимулировать пролиферацию синовиоцитов и активацию остеокластов, приводя к образованию синовиального паннуса и репарации. 1Ь-6 действует вместе с 1Ь-1 для повышения продукции матриксных металлопротеиназ, которые могут вносить вклад в разрушение суставов и хряща. Однако 1Ь-6 также может оказывать защитное действие в суставах, что было предположено на основании открытия, что указанный цитокин вызывает экспрессию тканевого ингибитора металлопротеиназ и стимулирует синтез протеогликанов при инъекции в суставы мышей, страдающих антиген-индуцированным артритом. Фибробласто-подобные синовиоциты ревматоидного артрита человека (ΗΡΡδ-ΚΑ) выделяли из синовиальных тканей, полученных от пациентов, страдающих ревматоидным артритом (ΚΑ). Они были заморожены на втором пассаже и их можно культивировать и размножать по меньшей мере в течение 5 удвоений популяции. Давно известна роль ΗΡΡδ в разрушении суставов путем продукции цитокинов и металлопротеиназ, которые вносят вклад в деградацию хряща.

Соответственно, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать рост, дифференцировку или профиль высвобождения цитокинов фибробластоподобных синовиоцитов ревматоидного артрита (ΗΡΈδ-ΚΑ) обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение воспалительных заболеваний и нарушений, включая системный ювенильный артрит, системную красную волчанку, болезнь Крона и ревматоидный артрит.

Методы. Взрослые клетки ΗΡΡδ-ΚΑ (Се11 Αрр1^саΐ^οη8 Кат. № 408ΚΑ-05а) поддерживали в ростовой среде для синовиоцитов (Се11 Αрр1^саΐ^οη8 Кат. №415-50) в 15 мл среды во флаконах на 125 мл в течение 1 пассажа до использования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты ΒδΡ2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл высевали на ночь в ростовой среде при плотности клеток примерно 50000 клеток/мл. После прикрепления в течение ночи в каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ в стерильном ФСБ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах). Контрольные лунки содержали необработанные клетки и инкубировались с эквивалентным объемом ФСБ. Клетки подвергали воздействию белков или ФСБ в основной среде (Се11 Αрр1^саΐ^οη8 Кат. №310-470) в течение 24 ч. Супернатант удаляли и проводили ΕΡΙδΑ-анализ 1Ь-8, 1Ь-6 и ΤΝΡα в соответствии с инструкциями производителя (ΚΝΏ δу8ΐет8, Кат. № ΌΥ206 и с наборами Эно-ке! ΌΥ-208, ΌΥ-210). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение трех часов при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΑΑΚδ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценции лунок, обработанных только ФСБ.

Пролиферация и продукция воспалительных цитокинов астроцитами человека

Уровень техники и терапевтическое значение. Астроциты человека (НА) представляют собой астроциты, которые являются производными коры головного мозга человека. Их замораживают на втором пассаже и их можно культивировать и размножать до 10 удвоений популяции. ΗΑ являются наиболее многочисленными клетками в центральной нервной системе и выполняют много функций, таких как обеспечение механической поддержки и доставка питательных веществ нейронам и удаление продуктов

- 107 030418 жизнедеятельности из нейронов. Помимо того, что астроциты играют важную поддерживающую роль для оптимального функционирования нейронов, они также обеспечивают снабжение биохимическими веществами клеток эндотелия, которые формируют гематоэнцефалический барьер. Недавние исследования показали, что астроциты способны регулировать нейрогенез путем запуска нейрогенной дифференцировки стволовых клеток и контроля функции одиночных синапсов, принимать активное участие в передаче и хранении информации в мозге. Осознание важной роль астроцитов в функционировании нервной системы повышается. НА могут служить полезной моделью для исследования разнообразия функций астроцитов ίη νίίΐΌ. Было показано, что астроциты пролиферируют в ответ на ГЬ6 и ΊΝΡ-α. Кроме того, указанные клетки способны создавать свой собственный ГЬ6 и ТОТЫ. Таким образом, полипептиды ААК8, которые модулируют пролиферацию и продукцию цитокинов в клетках НА, обладают потенциалом терапевтического применения для различных нейрологических заболеваний, включая нейровоспаление, нейродегенерацию, образование опухоли мозга и ишемию и регенерацию мозга.

Методы. Астроциты человека (НА) из Се11 АррНса11опк (Кат. № 882К-05Г) поддерживали в ростовой среде для клеток НА (Се11 АррНсаЕопк, Кат. № 821-500) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты В8Ь2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл высевали на покрытые коллагеном планшеты на ночь в полной среде (выше) при плотности клеток 50000 клеток/мл. Клетки промывали один раз ФСБ и в каждую лунку добавляли 80 мкл бессыворотчной ростовой среды. В каждую лунку добавляли полипептиды ААК.8 в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально описано в приведенных ниже примерах) в постоянном объеме в стерильном ФСБ. Клетки подвергали воздействию полипептидов ААК.8 в течение 48 ч и отработанную среду удаляли для анализа цитокинов (как описано ранее). Клетки подвергали воздействию белков или ФСБ в основной среде (Се11 АррНса11опк Кат. №310-470) в течение 48 ч. Супернатант удаляли и проводили анализы на ГЬ-8 и ГЬ-6 методом твердофазного ИФА в соответствии с инструкциями производителя (ΚΝΏ 8ук1етк, Кат. № ΌΥ206 и наборы Эно-ке! ΌΥ-208, ΌΥ-210). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение трех часов при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ААК8 лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только ФСБ.

Пролиферация и продукция воспалительных цитокинов клетками эндотелия микрососудов легкого человек (НЬМУЕС)

Уровень техники и терапевтическое значение. Легочная сосудистая система имеет огромное физиологическое/патологическое значение. Сейчас считается, что она представляет собой ткань, которая состоит из метаболически активных, функционально эффективных клеток, которые взаимодействуют с циркулирующими субстратами и форменными элементами крови таким образом, что регулируют состав системной артериальной крови, влияют на функции органа-мишени и вносят вклад в тромбоз, гемостаз и иммунные реакции, в также опухолевый метастаз. Эндотелиальные клетки микрососудов легкого человека (НЬМУЕС) обладают повышенной экспрессией хемоатрактантных цитокинов и молекул клеточной адгезии, которые обеспечивают ключевой сигнал для направления миграции лейкоцитов в легкое во время острого повреждения легких. Эти первичные клетки могут быть полезным инструментом для изучения различных аспектов патологии и биологии легочной микроваскуляризации ш уйго. Изменение в структуре и функции микроваскуляризации в ответ на воспалительные стимулы считается ключевым фактором в повреждении органов и при соответствующих условиях может обеспечивать стимул для репарации. Важной причиной указанных сосудистых изменений является индукция воспалительной реакции, вовлекающей инфильтрацию лейкоцитов. С помощью различных исследований, сфокусированных на адгезии гранулоцитов к эндотелию, было выявлено, что в привлечение и эмиграцию лейкоцитов вовлечен хорошо организованный адгезионный каскад. Указанный адгезионный каскад инициируется, когда гранулоцит прикрепляется к эндотелию и начинает катиться в направлении тока жидкости с низкой скоростью. По мере качения гранулоцита он активируется, затем плотно адгезирует к эндотелию и мигрирует через эндотелий во внесосудистое пространство. Указанные адгезионные события опосредуются, отчасти, молекулярными взаимодействиями, которые происходят между САМ на поверхности гранулоцитов и соответствующими гликопротеинами, присутствующими на эндотелии. Различные исследования показали, что молекула клеточной адгезии эндотелия Е-селектин может взаимодействовать с лигандами гранулоцитов, презентирующих гликан типа 8Ьех для опросредования этапов прикрепления и качения в адгезионном каскаде. Последующие этапы каскада вовлекают взаимодействие экспрессируемых эндотелием молекул межклеточной адгезии с экспрессируемыми гранулоцитами интегринами СГО18.

Таким образом, полипептиды ААК8, которые модулируют пролиферацию и/или продукцию цитокинов в клетках эндотелия микрососудов легкого человека обладают потенциалом терапевтического применения при различных сосудистых и легочных заболеваниях, включая воспалительные и обструк- 108 030418 тивные заболевания легких, включая, например, легочную гипертензию, хроническое обструктивное заболевание легких, идиопатический фиброз легких и астму.

Методы. Клетки НЬМУЕС (Се11 Αρρ1^саΐ^οη8, Кат. № 540-05) поддерживали в ростовой среде для клеток эндотелия микрососудов Се11 Αρρ1^саΐ^οη8 (Кат. № 111-500). Для приемлемого роста клеток использовали раствор фактора для прикрепления клеток, содержащий коллаген (Се11 Αρρ1^саΐ^οη8, Кат. № 123-100), для покрытия планшетов и флаконов до помещения на них клеток. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО2, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты ΒδΡ2 с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл помещали на покрытые коллагеном планшеты на ночь в полной среде (выше) при плотности клеток 50000 клеток/мл. Клетки промывали одни раз ФСБ и в каждую лунку добавляли 80 мкл бессывороточной ростовой среды. В каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ в стерильном ФСБ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально описано в приведенных ниже примерах) в постоянном объеме. Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в течение 48 ч и отработанную среду удаляли для анализа методом твердофазного ИФА для оценки молекул клеточной адгезии и цитокинов (как описано ранее). Молекулы клеточной адгезии, включая растворимые VСΑΜ и/или ΚΆΜ, измеряли с использованием стандартного набора для ΕΟδΑ, полученного из ΚΝΏ δу8ΐет8 (Кат. № ΌΥ643 и ΌΥ720 соответственно). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение трех часов при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΑΑΚδ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценции лунок, обработанных только ФСБ.

Адгезия клеток (анализы Г1-Г7 в таблицах, данных ниже)

Уровень техники и терапевтическое значение. Молекулы клеточной адгезии (САМ) представляют собой белки, расположенные на поверхности клетки, которые вовлечены в связывание с другими клетками или с внеклеточным матриксом (ВКМ) в процесс, называемый клеточной адгезией. Указанные белки, как правило, представляют собой трансмембранные рецепторы и состоят из трех доменов: внутриклеточного домена, который взаимодействует с цитоскелетом, трансмембранного домена и внеклеточного домена, который взаимодействует либо с другими молекулами САМ того же типа (гомофильное связывание), либо с другими САМ или внеклеточным матриксом (гетерофильное связывание). Большинство САМ принадлежит четырем семействам белков: суперсемейство 1д (иммуноглобулинов) (^δΡ СΑΜ), интегринов, кадгеринов и селектинов. Молекулы клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов (^δΡ) представляют собой кальций-независимые трансмембранные гликопротеины, включая: нейрональные молекулы клеточной адгезии (ΝίΆΜ), межклеточные молекулы клеточной адгезии (КАМ), сосудистые молекулы клеточной адгезии (VСΑΜ), молекулы клеточной адгезии тромбоцитов/клеток эндотелия (РЕСАМ-1), селективные для клеток эндотелия молекулы адгезии (ΕδΑΜ), молекулы адгезии контактов (ίΑΜ), нектины и другие молекулы клеточной адгезии.

Молекулы клеточной адгезии представляют собой гликопротеины клеточной поверхности, которые являются критичными для адгезии лейкоцитов к эндотелию синусоидов и трансмиграции и цитотоксичности при различных воспалительных заболеваниях печени. Ιί'.ΆΜ-1 играет важную роль в воспалении, и повышенная экспрессия Ιί'.ΆΜ-1 на эндотелиальных клетках отражает активацию клеток эндотелия. Ιί'.ΆΜ-1 имеет особое значение, так как они опосредуют прочную адгезию к эндотелию и облегчают трансмиграцию лейкоцитов. Исследования показали, что существует положительная регуляция Ιί'.ΆΜ-1 как на синусоидальных клетках, так и на гепатоцитах, при воспалительных состояниях печени, таких как вирусная инфекция гепатитом В, аутоиммунные нарушения печени, алкогольный гепатит и отторжение трансплантата печени.

Таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, которые модулируют продукцию молекул клеточной адгезии и клеточную адгезию к эндотелиальным клеткам, обладают потенциалом терапевтического применения при различных воспалительных заболеваниях, включая, например, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, аутоиммунные заболевания и легочную гипертензию.

Методы. Клетки пуповинной вены человека (АТСС, Кат. № СИЬ-2873) (НиУЕС) высевали в концентрации примерно 1,2х10⁵ клеток/на лунку в 12-луночные планшеты, покрытые раствором человеческого фибронектина для прикрепления клеток в предложенной АТСС среде с добавками и выращивали в соответствии с инструкциями производителя. Клетки стимулировали полипептидами ΑΑΚδ в указанных концентрациях или только ФСБ и инкубировали в течение ночи в ростовой среде. Клетки острого моноцитарного лейкоза человека (ТНР-1 (ΤΙΒ-202)) ресуспендировали в 0,1% БСА/ бессывороточной среде ΚΡΜΙ с кальцеином ΑΜ (6 мкл/мл; Iην^ΐ^οдеη Кат. № С1430) и инкубировали в течение 30 мин. Меченые клетки собирали и ресуспендировали в среде ΚΡΜΙ, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и плотность доводили до 2х10⁶ клеток/мл.

100 мкл (2х10⁵) меченных ТНР-1 клеток помещали в каждую лунку монослоя НиУЕС в 1 мл росто- 109 030418 вой среды и инкубировали в течение 15 мин. Лунки промывали дважды ФСБ для удаления несвязанных клеток и затем клетки анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 530 нм.

Дифференцировка клеток (Анализы С1-С4 в таблицах, данных ниже)

Дифференцировка и пролиферация адипоцитов в первичных пре-адипоцитах человека.

Уровень техники и терапевтическое значение:

Ожирение и липодистрофия обычно связаны с патологиями, включающими диабет и сердечнососудистые заболевания. На сегодняшний день признано, что жировая ткань представляет собой эндокринный орган, который секретирует множество различных факторов, и нарушенная регуляция секреции влияет на адипогенез, а также на гомеостаз глюкоза/инсулин во всем организме. Избыток жировой ткани, ведущий к ожирению, стал серьезной угрозой общественному здоровью. На развитие жировой ткани может влиять генетический фон, гормональный баланс, диета и физическая активность. Масса жировой ткани повышается, когда жировые клетки увеличиваются в размере из-за повышенного накопления триацилглицеринов. Кроме того, повышение количества жировых клеток, возникающих путем дифференцировки клеток-предшественников в адипоциты, также может происходить даже у взрослых организмов, что наблюдается при тяжелом ожирении человека и у крыс, которых содержат на рационе с высоким содержанием углеводов или жиров. Считается, в частности, что адипоциты возникают из мезенхимальных клеток, которые претерпевают процесс коммитирования и дифференцировки, адипогенеза. Клеточные линии пре-адипоцитов могут дифференцироваться в адипоциты при обработке адипогенными агентами, состоящими из синтетического глюкокортикоида, дексаметазона (ΌΕΧ), изобутилметилксантина (ГВМХ) и инсулина, которые оценивались в указанных исследованиях. Было доказано, что активируемый пролифератором пероксисом рецептор γ (ΡΡЛΚγ) и связывающийся с энхансером ССААТ белок (С/ЕВР) семейства факторов транскрипции играет основную роль в дифференцировке адипоцитов. На ранних этапах дифференцировки адипоцитов С/ЕВРβ и С/ЕВР5 индуцируются ΌΕΧ и ШМХ, соответственно, которые затем вместе индуцируют ΡΡЛΚγ и С/ЕВРа для активации различных маркеров адипоцитов, которые требуются для их функционирования.

Также было описано, что другие факторы транскрипции отрицательно или положительно регулируют адипогенез, и различные факторы роста и гормоны могут влиять на дифференцировку адипоцитов путем регулирования экспрессии адипогенными транскрипционными факторами. Таким образом, помимо того, что жировая ткань является основным депо энергии у млекопитающих благодаря запасанию триацилглицеринов и высвобождению жирных кислот в необходимое время, жировая ткань секретирует широкий набор молекул, которые вовлечены в различные физиологические процессы, включая иммунный ответ, функцию сосудов и энергетический гомеостаз. Цитокины, такие как ФНО-а и ГЬ-6, секретируются из адипоцитов. Некоторые из указанных факторов также могут влиять на рост и развитие жировой ткани путем аутокринного/паракринного действия.

Таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать дифференцировку и/или пролиферацию нормальных пре-адипоцитов человека, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение и предотвращение метаболических заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения и липодистрофии, также как и длительных осложнений диабета.

Методы. Клетки ΗΡΑй (пре-адипоциты человека) (Се11 Αρρ1^саί^οη Кат. № 8038Ό) содержали в соответствии с рекомендациями поставщика. Для культивирования клетки быстро размораживали и сразу переносили в 15 мл ростовой среды для адипоцитов (Се11 Αρρ1^саί^οη Кат. № 811М-250) и высевали в стандартный стерильный флакон с обработанной для тканевых культур поверхностью. Среду заменяли на свежую ростовую среду для адипоцитов каждые вторые сутки до достижения клетками >60% монослоя. Клетки выращивали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты ΒδΕ2 с использованием стерильных методов и соответствующими средствами индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки высевали для дифференцировки на 96-луночные аналитические планшеты с прозрачным дном и черными стенками, обработанными для оптимального прикрепления тканевых культур, в концентрации примерно 50000 клеток/мл. Полипептиды ΑΑΚδ в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах) добавляли в каждую аналитическую лунку. Все клетки поддерживали в ростовой среде в течение 2 дней, за исключением положительных контролей, которые стимулировали средой для адипогенной дифференцировки (Се11 Αρρ1^саί^οη8 Кат. № 811Ό-250). Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в течение 48 ч. Молекулы клеточной адгезии, включая растворимые VСЛМ и/или IСΑМ, измеряли с использованием стандартного набора ΕΟδΑ из ΚΝΏ δу8ίет8 (Кат. № ΌΥ643 и ΌΥ720 соответственно). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение трех часов при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΑΑΚδ лунок, де- 110 030418 ленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только ФСБ. Добавляли свежую среду и дифференцировку поддерживали в течение 16 дней после изначальной смены среды, при этом смену среды проводили каждые вторые сутки для поддержания клеток в здоровом состоянии. На 15 день клетки помещали в свободную от сыворотки среду. На 16 день, дифференцировку в зрелые адипоциты оценивали с помощью окраски №1е Кей (Iην^ί^οдеη, конечная концентрация 3 мкМ) и подсчитывали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов при соответствующих длинах волн. Для проведения указанного анализа клетки фиксировали 10% параформальдегидом, промывали в ФСБ и пермеабилизировали с помощью ФСБ, содержащим 0,5% БСА и 0,1% Тритон Х-100. Пролиферацию клеток оценивали с помощью измерения интенсивности на флуоресцентном спектрофотометре при использовании красителя №ес^ 33432 в конечной концентрации 1 мкг/мл, как описано ранее. Адипогенез выражали как интенсивность сигнала №1е Кей. Сигнал красителя №ес^ использовали для оценки количества клеток.

Дифференцировка и пролиферация клеток скелетной мускулатуры человека

Уровень техники и терапевтическое значение. Развитие скелетной мускулатуры представляет собой многоэтапный процесс, который вовлекает детерминирование плюрипотентных мезодермальных клеток, дающих начало миобластам, выведение миобластов из клеточного цикла и дифференцировку в мышечные клетки и, в конечном итоге, рост и созревание скелетно-мышечных волокон. Скелетно-мышечная дифференцировка включает выравнивание миобластов, удлинение и слияние в многоядерные мышечные трубочки, вместе с индукцией регуляторных и структурных специфичных генов мышц. На молекулярном уровне миогенное коммитирование и уровень экспрессии специфичных мышечных генов вовлекает специфичные скелетно-мышечные белки семейства МулО, содержащие домен спираль-петля-спираль (Μίχ-Ιοορ-Μίχ, ϋΗΕΗ), которые включают МулЭ, миогенин, туГ-5 и МКР4 и фактор связывания энхансера миоцитов 2 (МЕР2). Активность связывания ДНК белками семейства МулЭ ослабляется 1й, который формирует комплексы с продуктами гена Е2а в пролиферирующих клетках и подавляется при индукции их дифференцировки. На запуск дифференцировки в мышечные трубочки отрицательно влияют некоторые факторы. Обработки миобластов эмбриональной бычьей сывороткой, основными факторами роста фибробластов 2 или трансформирующим фактором роста β1, как известно, подавляют дифференцировку миобластов. Миогенез также отрицательно регулируется онкогенами, такими как с-тус, с-дт, с-ίοδ, Ηтаз и Е1а. Существует очень мало информации относительно сигнальных путей, которые запускаются в миобласте при удалении сыворотки, что приводит к индукции экспрессии гена семейства МулЭ и мышечной дифференцировке. Оказывается, что миогенная дифференцировка зависит от активации интегринов, присутствующих на плазматической мембране миобластов, что указывает на функционирование биохимического пути снаружи внутрь, в котором интегрин представляет собой более раннюю молекулярную частицу. Взаимодействия инсулиноподобных факторов роста (1СР)-1 и -II с их рецепторами также являются положительными регуляторами скелетно-мышечной дифференцировки.

Соответственно, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать развитие мышц, обладают потенциалом терапевтического применения при широком диапазоне заболеваний, включая, например, лечение метаболических заболеваний, кахексии, различных состояний, связанных с мышечной атрофией, также как и заболеваний скелетной мускулатуры, где мышечная атрофия играет ключевую роль в патогенезе и симптомологии. Человеческие клетки скелетной мускулатуры (ЖкМС) могут дифференцироваться с появлением актомиозиновых миофиламентов. ЖкМС использовались в исследовании генетических мышечных заболеваний, таких как злокачественная гипертермия. ЩкМС также возможно использовать в качестве сердечного трансплантата, обеспечивающего восстановление поврежденной ткани сердца и, таким образом, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать развитие мышц, также применимы в качестве ίη νίίτο и ίη νΐνο регуляторов миогенеза.

Методы. Для оценки возможной роли полипептидов ΑΑΚδ в указанном процессе, использовали стандартный анализ дифференцировки клеток скелетной мускулатуры. Для указанного анализа клетки скелетной мускулатуры взрослого человека (ЖкМС, Се11 Αρρ1^саί^οη Кат. № 150-05 Г) изолировали из скелетных мышц конечностей здоровых доноров, представляющих собой людей. Клетки поддерживали в ростовой среде для ЖкМС (Се11 Αρρ1^саί^οη8, Кат. № 151-500). Указанные клетки можно культивировать и размножать в течение по меньшей мере 15 удвоений популяций. Для дифференцировки клетки поддерживали в ростовой среде в течение одного пассажа и затем высевали в концентрации 50000 клеток на мл среды в 96-луночные обработанные (ТС) планшеты с прозрачным дном и черными стенками, обработанные коллагеном в концентрации 100 мкл на лунку. Клеткам позволяли прикрепляться в течение ночи. Полипептиды ΑΑΚδ в ФСБ или только ФСБ добавляли в каждую лунку в конечной концентрации 250 нМ белка (или как специально указано в примерах ниже). В контрольные лунки наносили такой же объем среды для дифференцировки (Се11 Αρρ1^саί^οη8 Кат. № 151Ό-250) в это же время. Клетки инкубировали с белком или средой для дифференцировки в течение 48 ч. Через 48 ч супернатант клеточной культуры собирали изо всех лунок и добавляли среду для дифференцировки в объеме 150 мкл на весь планшет, за исключением контрольных лунок, которые оставляли только в ростовой среде. Супернатант использовали для оценки продукции цитокинов, включая 1Ь6 и 1Ь8, как описано ранее. Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в

- 111 030418 планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение трех часов при 37°С. За клетками наблюдали под микроскопом и смену среды на свежую среду для дифференцировки проводили каждые вторые сутки. На 10 день среду удаляли и клетки фиксировали 10% парафармальдегидом в течение 30 мин. Клетки пермеабилизировали 0,1% Тритоном Х-100 в ФСБ в течение 15 мин и окрашивали ΤΚмеченным фаллоидином и красителем №ес^ 33432 (как описано ранее) для детектирования актина и ядер соответственно. Интенсивность окраски ядер использовали для определения пролиферации клеток в каждой лунке, и интенсивность окраски фаллоидином использовали для определения общего содержания актина. Клетки также окрашивали с помощью антител против скелетно-мышечного альфа-актина (СемТех Кат. № СТХ101362). Получали цифровые фотографии с использованием флуоресцентного микроскопа, а также проводили зрительное наблюдение и оценку всех лунок.

Дифференцировка и пролиферация мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека

Уровень техники и терапевтическое значение. Мезенхимальные стволовые клетки (ΜδС) являются мультипотентными стволовыми клетками, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая остеобласты, хондроциты, миоциты, адипоциты, бета-клетки островков поджелудочной железы и, возможно, нервные клетки. Многие различные события вносят вклад в коммитирование ΜδС в направлении других линий дифференцировки, включая координацию сложной сети транскрипционных факторов, кофакторов и сигнальных посредников многочисленных путей. ΜδС привлекают повышенный интерес с точки зрения терапевтического значения, так как они представляют собой популяцию клеток, имеющих потенциальную способность лечения широкого диапазона острых и дегенеративных заболеваний. Более того, полипептиды ΑΑΚδ, обладающие способностью модулировать дифференцировку ΜδС в различных направлениях развития, имеют высокий потенциал терапевтического применения для обеспечения ίη νίΐΓΟ или ίη νίνο модуляции гематопоэза, нейрогенеза, миогенеза, остеогенеза и адипогенеза, также как и в широком диапазоне нарушений и заболеваний, включая, например, воспалительные ответы, аутоиммунные заболевания, рак, нейрональную дегенерацию, мышечную дистрофию, остеопороз и липодистрофию. Человеческие ΜδС являются иммунологически привилегированными и представляют собой предпочтительный тип клеток для аллогенной трансплантации, обеспечивающих снижение риска отторжения и осложнений после трансплантации. Недавно также были получены значительные достижения в применении аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для регенерации тканей человека, включая хрящ и мениск, связки и переломанную кость. Многие исследователи также изучали применение ΜδС для генной терапии, включая трансплантацию ΜδΟ трансфицированых фактором роста сосудов эндотелия для улучшения функции сердца после инфаркта миокарда у крыс, использование ΜδС как носители для доставки интерферона-β в опухоли у мышей и генную терапию с помощью ΜδΟ экспрессирующих ВМР для обеспечения формирования кости. Соответственно, в связи с повышенным интересом к ΜδС как к прямым и модифицированным терапевтическим агентам, а также потенциальной способностью полипептидов ΑΑΚδ действовать в качестве терапевтических агентов для регуляции дифференцировки ΜδС ίη νίνο, полипептиды ΑΑΚδ тестировали как потенциальные индукторы пролиферации и дифференцировки ΜδΟ

Методы. ЬΜδС (стромальные клетки костного мозга человека) (Се11 Αрр1^саΐ^οη Кат. № 492-05Г) поддерживали в соответствии рекомендациями поставщика. Для культивирования клетки быстро размораживали и сразу переносили в 15 мл ростовой среды для стромальных клеток костного мозга (Се11 Αρриса!^ Кат. № 419-500) и высевали в стандартный стерильный флакон с обработанной для тканевых культур поверхностью. Среду заменяли на свежую ростовую среду для стромальных клеток костного мозга каждые вторые сутки до достижения клетками >60% монослоя. Клетки выращивали при 37°С, 5% С02, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты, ΒδΕ2, с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки высевали в 96-луночные аналитические планшеты с прозрачным дном и черными стенками, обработанные для оптимального прикрепления тканевых культур, для дифференцировки в концентрации 50000 клеток/мл. Произошедшие из тРНК-синтетазы белки в конечной концентрации 250 нМ на лунку (или как специально указано в приведенных ниже примерах) добавляли в каждую аналитическую лунку. Все клетки поддерживали в ростовой среде в течение 2 дней, за исключением положительных контролей, которые стимулировали средой для остеогенной или хондрогенной дифференцировки ^етРго, ΙηνίίΓΟ^η, Кат. № А10072-01 и А1007101 соответственно). Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ в течение 48 ч. Растворимые молекулы VСЛΜ измеряли с использованием стандартного набора для твердофазного ИФА фирмы ΚάΩ δу8ΐет8 (Кат. № ΌΥ643). Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение трех часов при 37°С. Планшеты анализировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов и выживаемость/пролиферацию выражали как функцию связанной с резоруфином флуоресценции обработанных полипептидом ΑΑΚδ лунок, деленную на связанную с резоруфином флуоресценцию лунок, обработанных только ФСБ. После оценки клеточной выживаемости, резазурин удаляли с двумя сменами среды и добавляли 0,5Х среды для дифференцировки во все лунки. За дифференцировкой следили путем зрительного наблюдения всех лунок в течение 10 дней после смены

- 112 030418 среды, при смене на свежую среду каждые вторые сутки для поддержания клеток в здоровом состоянии. Дифференцировку оценивали с помощью окраски на щелочную фосфатазу с использованием окраски ΕΦΡ-97 (Iην^!^οдеη Са!# Ε6601) на 10 день после первой смены среды для дифференцировки. Ра^ е! а1., №!иге Рго!осо1к (6) 187-213 (2011) йо1:10,1038/прго!, 2010, 189).

Пролиферация и дифференцировка гладкомышечных клеток легочной артерии человека (ЬРА8МС)

Уровень техники и терапевтическое значение. Гладкомышечные клетки легочной артерии (РΑδМС) в нормальных кровеносных сосудах легкого взрослого человека являются наиболее неподвижными, не мигрирующими и они сильно коммитированы в направлении выполнения их сократительной функции в легких. Однако РΑδМС являются не окончательно дифференцированными клетками и обладают способностью модулировать свой фенотип и выходить из состояния покоя в ответ на изменение локальных сигналов из окружающей среды. Указанное состояние дифференцировки может возникать в ходе развития, при повреждении ткани и ремоделировании сосудов в ответ на изменения в потребностях ткани. Легочная гипертензия (РН) связана с различными первичными состояниями, включая повышение легочного сопротивления периферических сосудов как результат повышения сосудистого тонуса и сократимости РΑδМС и ремоделирования сосудов. Ремоделирование сосудов включает рост РΑδМС, синтез материала матрикса и изменения во взаимодействиях клетка-клетка и клетка-матрикс в стенках малых легочных артерий (РА), что приводит к повышенной толщине гладкомышечного компонента стенки сосудов и нарушенной мускуляризации в норме не мускуляризованных дистальных РА. Указанный процесс вносит вклад в снижение диаметра просвета и повышение сопротивления периферических сосудов. Несмотря на то что конкретное участие РΑδМС в изначальной индукции заболевания является неоднозначным, происходящие изменения играют ключевую роль в клинических последствиях заболевания. Решающим этапом в изучении дифференцировки клеток является идентификация набора специфичных для клеток или селективных для клеток генов, которые вносят вклад в функцию (функции) дифференцировки клеток. Были идентифицированы различные гены гладкомышечных клеток РМС), которые служат в качестве применимых маркеров относительного состояния дифференцировки или созревания сосудистых δМС, такие как гены гладкомышечного альфа-актина, δМ МНС, й1-кальпонина, δМ22-альфа, десмина, метавинкулина, смутелина, и другие. Наиболее широко используемый маркер представляет собой гладкомышечный альфа-актин, частично из-за коммерческой доступности ряда очень высоко аффинных и высоко селективных антител для указанного белка. Вопрос, являются ли изменения в РΑδМС результатом их собственных характеристик или диерегуляции молекулярных событий, которые управляют ростом РΑδМС, остается открытым. Однако понимание регуляторных сигналов и механизмов нарушения регуляции их возможностей имеет важное терапевтическое значение для лечения различных сосудистых и легочных заболеваний, включая легочную гипертензию, сосудистые заболевания.

Таким образом, полипептиды ΑΑ^δ, которые способны модулировать дифференцировку и/или пролиферацию нормальных человеческих клеток РΑδМС, полученных от взрослого человека, обладают потенциалом терапевтического применения при различных сосудистых и легочных заболеваниях, включая воспалительные и обструктивные заболевания легких, включая, например, легочную гипертензию, хроническое обструктивное заболевание легких, идиопатический легочный фиброз и астму.

Методы. Клетки ΗРΑδМС (Се11 Αρρ1^са!^οηк Кат. № 352-05а) поддерживали в ростовой среде ΗРΑδМС (Се11 Αρρ1^саί^οηк Кат. № 352-05а) в 15 мл среды во флаконах на 125 мл в течение 1 пассажа до использования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СО₂, в увлажненной среде и работали с ними в вытяжных шкафах с ламинарным потоком воздуха 2 класса биозащиты, ΒδΡ2, с использованием стерильных методов и соответствующих средств индивидуальной защиты, включая очки, перчатки и лабораторные халаты. Клетки в объеме 80 мкл помещали на покрытые коллагеном планшеты на ночь в ростовой среде при плотности клеток 50000 клеток/мл. В каждую лунку добавляли полипептиды ΑΑΚδ в стерильном ФСБ в конечной концентрации 250 нМ (или как специально указано в приведенных ниже примерах). Контрольные лунки содержали только эквивалентный объем ФСБ. Образцы положительного контроля инкубировали в среде для дифференцировки ΗРΑδМС, полученной от поставщика (Се11 Αρρ1^саί^οηк Кат. № 311Ό-250). Клетки подвергали воздействию полипептидов ΑΑΚδ или ФСБ в основной среде (Се11 ΑρрНсайош! Кат. № 310-470) в течение 48 ч с последующей сменой среды на среду для дифференцировки во всем планшете. Супернатант собирали и использовали для оценки продукции цитокинов, включая 1Ь6 и 1Ь8, как описано ранее. Пролиферацию оценивали с помощью резазурина, как описано ранее, путем добавления свежей среды, содержащей резазурин, в планшеты после удаления супернатанта и инкубирования в течение 3 ч при 37°С. За клетками наблюдали в течение 10 дней при смене среды каждые вторые сутки. Дифференцировку оценивали после фиксации, как описано выше, и пермеабилизации с помощью 0,1% Тритона Х-100, путем количественной оценки окраски на гладкомышечный альфа-актин с использованием анти-δМΑ-альфа антител (ОеаеТех Кат. № ОΤX101362) и ΑΡχη 405-конъюгированных вторых антител. Пролиферацию оценивали с помощью окрашивания красителем Ноесйк! после фиксации клеток в 10% формальдегиде в течение 30 мин. Краситель Ноесйк! выявляли с использованием флуоресцентного спектрофотометра для прочтения дна планшетов при длине волны возбуждения (Εχ) 405 нм и длине волны испускания рт) 450 нм. Общую окраску на актин оценивали путем использования окрашивания Α1- 113 030418 еха-488-меченным фаллоидином (1пуйгодеп Са1# А12379).

Анализ связывания полипептидов АЛК8 с клетками (анализы Н1-Н10 в таблицах, данных ниже)

Уровень техники и терапевтическое значение.

Связывание полипептидов ΑΑΚδ с конкретными типами клеток демонстрирует, что рассматриваемый тип клеток экспрессирует специфические рецепторы для рассматриваемого полипептида ΑΑΚδ. В зависимости от рассматриваемого типа клеток, клеточное связывание подразумевает потенциальную роль для полипептида ΑΑΚδ в регуляции активности или поведения клетки или подобных типов клеток, ш у|уо. Конкретные примеры указанных регуляторных ролей включают, например, связывание и модуляцию В-клеток и Т-клеток (иммуномодуляцию/хемотаксис/аутоиммунные заболевания/воспаления); клеток НерС2 (контроль метаболизма, захвата холестерина или метаболизма); клеток ТНР-1, Никак Дад (иммуномодуляцию/хемотаксис/аутоиммунные заболевания/воспаления), тромбоцитов (тромбоцитопоэз), адипоцитов 3Τ3Ε1 (липогенез/метаболизм) и мышиных миобластов С2С12 (миогенез, остеогенез).

Связывание с клетками крови

Методы. Кровь от здоровых доноров собирали в пробирки, содержащие ЭДТА. 2 мл цельной крови помещали в пробирку ΡΑСδ на 5 мл (Ра1соп). Добавляли 2 мл буфера для окрашивания (ФСБ+2% эмбриональной бычьей сыворотки), перемешивали на вортексе в течение 3-5 секунд, центрифугировали в течение 5 мин при 300хд. Супернатант удаляли, повторяли промывку и осадок ресуспендировали в 2 мл буфера для окрашивания.

100 мкл отмытой крови переносили в чистые пробирки для образцов ΡΑδС на 5 мл. В пробирки добавляли Βίδ6- или V5-Η^δ6-меченные полипептиды ΑΑΚδ в концентрациях, указанных в конкретных экспериментах, описанных ниже, и инкубировали на льду в течение 45 мин. После инкубации в пробирки добавляли антитела к поверхностным маркерам различных типов клеток (ВЭ РНапшдеп Са1 560910, 555398, 555415, 340953, 560361) и РГГС-меченные анти-У5-антитела (У5-РГГС, 1п\Нгодеп Кат. № Κ96325) или РГТС-меченные анти-Η^δ6-антитела ЛЬСат Кат. № аЬ1206), инкубировали в темноте на льду в течение 30 мин. После инкубации в пробирки добавляли 2 мл лизирующего раствора ВО ΡΑСδ (кат. №349202). Образцы перемешивали на вортексе и помещали на лед на 15 мин. Образцы промывали 1х2 мл ФСБ и ресуспендировали в 2 мл 2% формальдегида в ФСБ до проведения ΡΑСδ-анализа. Полипептиды ΑΑΚδ, которые связывались более чем с 25% клеточной популяции, где антитело отдельно не имело значительного сигнала, считали искомыми.

Анализы связывания тромбоцитов: 50 мкл отмытой крови переносили в чистые пробирки для образцов ΡΑСδ на 5 мл, в пробирки добавляли Βίδ6- или У5-Η^δ6-меченные полипептиды ΑΑΚδ в концентрациях, указанных в конкретных экспериментах, описанных ниже, и пробирки помещали на лед на 45 мин. В каждую пробирку добавляли 20 мкл СЭ61-пан-антител к тромбоцитам (ВО РЬагт1деп, Кат. № 555754) и 0,5 мкл анти-У5-ΡIΤС-меченных антител (1п\'йгодеи Κ96325) или меченных РГГС анти-Η^δ6антител ЛЬСат Кат. № аЬ1206). Пробирки помещали на лед в защищенном от света месте на 30 мин. Образцы доводили до общего объема 2 мл 1% формальдегидом в ФСБ и анализировали с помощью проточной цитометрии в течение 24 ч. Полипептиды ΑΑΚδ, которые связывались более чем с 25% клеточной популяции, где антитело отдельно не имело значительного сигнала, считали целевыми.

Связывание с клетками в культуре. Приблизительно 1х10⁶ клеток в 100 мкл полной среды ΚΡΜΙ помещали в пробирки ΡΑСδ на 5 мл. Βίδ6- или У5-Η^δ6-меченные полипептиды ΑΑΚδ добавляли в пробирки в концентрациях, указанных в конкретных экспериментах, приведенных ниже, и указанные пробирки помещали на лед на 45 мин. Образцы клеток промывали дважды 1 мл буфера для окрашивания (ФСБ+2% эмбриональной бычьей сыворотки) и затем добавляли 0,5 мкл анти-У5-ΡIΤС антител (ΙπνίΙΐΌдеп Κ96325) или меченных РГГС анти-Η^δ6-антител ЛЬСат Кат. № аЬ1206) в буфере для окрашивания с 200 мкг/мл человеческого 1дС и образцы инкубировали на льду в защищенном от света месте в течение 30 мин. Образцы промывали дважды 1 мл буфера для окрашивания и затем доводили до общего объема 2 мл 1% формальдегида в ФСБ и анализировали с помощью проточной цитометрии в пределах 24 ч. Полипептиды ΑΑΚδ, которые связывались более чем с 25% клеточной популяции, где антитело отдельно не имело значительного сигнала, считали искомыми.

Исследования на животных: модуляция гематопоэза и циркулирующих цитокинов

Уровень техники и терапевтическое значение. Гематопоэз (В альтернативном варианте кроветворение или гемопоэз) представляет собой формирование клеточных компонентов крови. Все клеточные компоненты крови происходят из гематопоэтических стволовых клеток №С), которые находятся в срединной части кости (костном мозге) и имеют уникальную способность давать начало всем различным зрелым типам клеток крови. ЖС являются самообновляюющимися клетками: когда они пролиферируют по меньшей мере некоторые из их дочерних клеток сохраняются как ЖС, таким образом, пул стволовых клеток не истощается. Каждая из других дочерних клеток ЖС (миелоидные и лимфоидные клеткипредшественники), однако, может быть коммитирована в направлении любого из альтернативных путей дифференцировки, что приводит к появлению одного или более специфических типов клеток крови, но не может самообновляться. Изменение компонентов крови в ответ на воздействие полипептида ΑΑΚδ, таким образом, предполагает, что полипептид ΑΑΚδ способен модулировать гематопоэз и регулировать

- 114 030418 развитие стволовых клеток гематопоэза.

Все клетки крови можно разделить на три линии: эритроидные клетки, лимфоциты и миелоциты.

Эритроидные клетки представляют собой переносящие кислород эритроциты. Как ретикулоциты, так и эритроциты являются функциональными и высвобождаются в кровь. Соответственно, содержание ретикулоцитов оценивает скорость эритропоэза и изменение содержания эритроцитов предполагает, что полипептид ΑΑΚδ модулирует эритропоэз.

Лимфоциты являются основой приобретенной иммунной системы. Они происходят из общих лимфоидных предшественников.

Лимфоидный ряд в основном состоит из Т-клеток и В-клеток (типы лейкоцитов крови). Соответственно, изменения количества или состава лейкоцитов в ответ на подвержение воздействию полипептида ΑΑΚδ предполагает, что указанный полипептид ΑΑΚδ модулирует лимфопоэз.

Миелоциты, которые включают гранулоциты, мегакариоциты и макрофаги и происходят из общего миелоидных предшественников, вовлечены в различные процессы, включая врожденный иммунитет, приобретенный иммунитет и свертывание крови. Соответственно, изменения содержания или состава миелоидных клеток в ответ на воздействие полипептида ΑΑΚδ предполагает, что указанный полипептид ΑΑΚδ модулирует миелопоэз. Такое же обоснование может использоваться для определения того, модулируют ли полипептиды ΑΑΚδ гранулопоэз, путем измерения изменений количества гранулоцитов в ответ на воздействие полипептидов ΑΑΚδ. Роль полипептида ΑΑΚδ в модулировании мегакариоцитопоэза можно прогнозировать на основании изменения состава или количества мегакариоцитов или тромбоцитов в крови.

Высвобождение цитокинов у мышей либо дикого типа, либо в различных системах животных моделей воспаления, обеспечивает изначальную оценку потенциальной способности полипептидов ΑΑΚδ модулировать воспалительные ответы. Роль полипептидов ΑΑΚδ в модулировании острых хронических воспалительных процессов, например, можно с легкостью оценить с использованием мышиной модели алиментарного ожирения (ΌΙΟ). Модель ΌΙΟ основана на переводе грызунов на рацион с высоким содержанием жиров в течение нескольких месяцев, что приводит к повышенному ожирению, устойчивости к инсулину и дисфункции иммунной системы. Конкретное последствие указанной дисрегуляции иммунной системы приводит к повышенной продукции провоспалительных цитокинов у животных, страдающих ΌΙΟ, приводя к состоянию хронического системного воспаления. Увеличивается количество доказательств, указывающих на то, что слабо выраженное воспаление вносит вклад в развитие и поддержание ожирения и диабетического фенотипа, который подобным образом наблюдается при состоянии человека, называемом метаболическим синдромом. Таким образом, способность полипептидов ΑΑΚδ модулировать иммунную систему и восстанавливать гомеостатический баланс в сторону нормализации указанного хронического воспалительного состояния, может являться особо благоприятной при многих заболеваниях и нарушениях, включая, но не ограничиваясь перечисленными: лечение и предотвращение симптомов и побочных эффектов метаболических заболеваний, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, ожирения, а также различных аутоиммунных заболеваний и нарушений, включая, например, рассеянный склероз, сосудистые и аллергические нарушения.

Методы. Самцов контрольных мышей дикого типа (С57ВЬ/6) или мышей с алиментарным ожирением (С57ВЬ/6ИН стд. откл.) получали из лаборатории Наг1ап (Индианаполис, Индиана) и держали по отдельности. Мышей ΌΙΟ содержали на рационе с повышенным содержанием жиров (Са!. #ΤΌ, 0641460% ккал из жира) и контрольных мышей содержали на нормальном рационе (Са!. #2018δ-18% ккал из жира). Мышей ΌΙΟ переводили на рацион с высоким содержанием жиров, начиная с 6-недельного возраста на период в общей сложности 10 недель. Мыши ΌΙΟ и контрольные мыши имели неограниченный доступ к пище и воде. На 16-недельном возрасте мышей сортировали и случайным образом делили в группы по 5 животных на основе массы тела. На 2 день мышей взвешивали и собирали кровь из хвостовой вены (100 мкл) для предварительной обработки общего анализа крови (СВС). На 1 день мышей взвешивали и внутривенно инъецировали через хвостовую вену носитель (ФСБ) или отдельные полипептиды ΑΑΚδ в концентрации 10 мг/кг. Через 4 ч после инъекции у мышей собирали кровь из лицевой вены (150-200 мкл) для последующего анализа цитокинов. На 2, 3 и 4 день мышей внутривенно дозировали так же, как на 1 день. На 5 день мышей взвешивали, умерщвляли и собирали кровь посредством пункции сердца для общего анализа крови (СВС анализ) (плазма-ЭДТА) и оценки цитокинов (сыворотка).

Клинический анализ крови (общий анализ крови, СВС) и анализ цитокинов. Клинический анализ крови проводили на образцах крови, полученных до инъекций (день -2) и через 24 часа после последней инъекции (день 5). С помощью СВС оценивали общее содержание лейкоцитов крови и общую морфологию эритроцитов крови. Лейкоциты крови дополнительно охарактеризовывали по общему и относительному процентному содержанию нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов. Анализ эритроцитов включал измерение гемоглобина (бЬ), гематокрита (%), средний объем эритроцитов (ГР), среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (%) и общее количество тромбоцитов (10³/мкл). Анализ СВС проводили с помощью ΑπΙ^οΗ □(адгюхИсх (ИкЬегк, ΙΝ).

Уровень циркулирующих цитокинов оценивали через 4 ч после инъекции (1 день) и через 24 ч по- 115 030418 сле последней инъекции (5 день). Сыворотку выделяли, мгновенно замораживали и отправляли в центр Ри1е8 ΒаδеД МеДкше (Остин, Техас) для проведения множественного анализа. Образцы сыворотки анализировали с использованием панели ^ДеОМ^, включающей 59 уникальных биомаркеров, включая Аро А-1, СЭ40, СО40-Ь, СРР, ЕТ-1, эотаксин, ЕСР, Фактор VII, фибриноген, РСР-9, РСР-основный, С8Т-«, ССР-2, СМ-С8Р, КС/ЖОи, гаптоглобин, ^Α, №Νγ, №-10, №-1а, №-1β, №-10, Ш-11, №-12ρ70, Η-17Α, №-18, №-2, №-3, №-4, №-5, №-6, №-7, ЫР, лимфотактин, М-С8Р-1, М№-1а, М№-Щ, М№-1у, МГР-2, М№^, МОС, ММР-9, МСР-1, МСР-3, МСР-5, МРО, миоглобин, δΑΓ, 8СОТ, δСР, ΚΑΝΊΈδ, ТРО, тканевой фактор, ИМР-1, ЮТ-а, VСΑМ-1, VΕСР-Α и νΑΕ. Изменение уровня цитокинов считали искомым, если цитокин повышался по меньшей мере в 2 раза или понижался по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем носителя.

Пример 1.

Идентификация протеолитических фрагментов и продуктов альтернативного сплайсинга ΑΑΚδ с использованием платформ анализа топографии и миграции белка.

Для идентификации фрагментов ΑΑΚδ из клеточных линий, кондиционированной среды и тканей, образцы готовили следующим образом.

Мышиные макрофаги (ΚΑΑ 264,7), цитозоль и кондиционированные среды: клетки обрабатывали бессывороточной средой ЭМЕМ в плотности 15х10⁶ клеток/флакон. Через 48 ч кондиционированную среду и клеточные осадки собирали и обрабатывали. 200 мкг белка из секретированной и цитозольной протеомной фракции разделяли с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии ДСН и готовили кусочки геля для анализа с помощью масс-спектрометрии.

Ткань поджелудочной железы мыши. Поджелудочную железу от трех мышей разрезали, гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и обрабатывали ультразвуком в ФСБ с ингибиторами протеаз. Белки цитозоля выделяли путем центрифугирования и 200 мкг белка разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и готовили кусочки геля для анализа с помощью масс-спектрометрии.

Ткань печени мыши: печени трех мышей вырезали, гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и обрабатывали ультразвуком в ФСБ с протеазными ингибиторами. Белки цитозоля выделяли посредством центрифугирования и 200 мкг белка разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и готовили кусочки геля для анализа с помощью массспектрометрии.

Гелевые гидролизаты анализировали с помощью масс-спектрометра с ионной ловушкой БТО ХЬ (ТкегтоР18кег), снабженного собранной системой 3000 цЬС (Όίοικχ). Образцы сначала наносили на РеρТга1Э (тккгот) в течение 10 мин с 5% ацетонитрилом в 0,1% муравьиной кислоте с использованием автоматического дозатора Όίοικχ. Затем образцы анализировали с использованием капиллярной колонки из кварцевого стекла, 100 мкм (внутренний диаметр), содержащей 10 см смолы С18 (тккгот). Пептиды вымывали из колонки в масс-спектрометре при скорости тока 0,45 мкл/мин с использованием линейного градиента 5-33,5% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте в пределах 110 мин.

БТО работает в зависимом от данных режиме сканирования таким образом, что за одним полным МС сканом следует семь МС/МС сканов семи наиболее распространенных ионов. Динамическое исключение обеспечивается при числе повторов, равном 1, длительности повтора, равном 20 с, размер эксклюзионного списка составляет 300 и длительность эксклюзии составляет 60 с.

После анализа ЖХ/МС/МС, необработанные данные обрабатывали с помощью ΒίοΑο№83.3.1 (8ЕС)ЕЕ8Т) с использованием составленного варианта базы данных реальных/ложных мышиных №Е Данные 8ЕОЕЕ8Т фильтровали и сортировали с помощью программы ^ТΑδе1ес!. В табл. 1, 4 и 7 показаны последовательности, идентифицированные указанным способом.

Пример 2.

Идентификация сплайс-вариантов с использованием глубокого секвенирования.

Сплайс-варианты аминоацил-тРНК-синтетазы идентифицировали с использованием высокоэффективного секвенирования библиотеки кДНК для транскриптов аминоацил-тРНК-синтетазы. Матрицы кДНК готовили из общих экстрактов РНК тканей, таких как мозг взрослого человека и эмбриона, и обогащенных аминоацил-тРНК-синтетазой транскриптов с использованием последовательностей праймеров, специфичных для всех отмеченных экзонов всех указанных человеческих аминоацил-тРНК-синтетаз и ассоциированных с ними белков.

Тотальную РНК человека получали из СккесЬ. Для образцов клеточной линии и ткани мыши, тотальную РНК экстрагировали с использованием набора для экстракции ΚΝΑ Ех!гас! II (МЛ). Геномную ДНК расщепляли в образцах тотальной РНК с помощью ДНКазы I. Для получения зрелой матричной РНК (мРНК) образцы РНК обогащали дважды путем связывания полиА+ РНК и расщепления РНК без 5'кэпа с помощью 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазы. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из зрелой РНК с использованием праймеров, которые гибридизуются с последовательностями экзонов генов аминоацил-тРНК-синтетазы. Транскрипты, обогащенные генами аминоацил тРНК-синтетазы, амплифицировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием специфичной к экзону аминоацил- 116 030418 тРНК-синтетазы кДНК и различных комбинаций праймеров экзонов аминоацил-тРНК-синтетазы.

Двухцепочечные транскриптомные продукты ПЦР, обогащенные аминоацил-тРНК-синтетазой, ферментативно восстанавливали по обоим концам перед добавлением А-липкого конца к 3'-концам восстановленных фрагментов. Затем добавляли адаптеры секвенирования и индексированные последовательности к транскриптомным продуктам ПЦР, обогащенным аминоацил-тРНК-синтетазой для получения библиотеки кДНК для глубокого секвенирования с использованием набора для мультиплексного секвенирования Шитта. Вкратце, транскриптомные продукты ПЦР, обогащенные аминоацил-тРНКсинтетазой с 3'-А липкими концами лигировали с адаптерными нуклеотидами 1пРЕ, предложенными в наборах. Индексированные последовательности добавляли к продуктам ПЦР с адаптерами 1пРЕ. Для получения достаточного количества фрагментов ДНК для глубокого секвенирования продукты ПЦР с индексированной последовательностью далее амплифицировали с помощью ПЦР. Обогащенную аминоацил-тРНК-синтетазой библиотеку кДНК с различными индексами объединяли и секвенировали с использованием ДНК-секвенатора Шитта для получения концевых считываний, содержащих 50 пар оснований. Считывния (гелк), полученные в результате секвенирования, картировали для генома человека или мыши для идентификации событий альтернативного сплайсинга. Программное обеспечение 'ЪрПсетар (общедоступное для скачивания на 1Шр://\у\у\у^1а1з1апГогб.еби/~ктГа1/ δр1^сеΜар/) используется для идентификации границ сплайсинга.

Глубокое секвенирование указанной кДНК проводили для получения примерно 1 миллиона считываний секвенирования, состоящих примерно из 50 нуклеотидов в длину.

Последовательности, специфичные для экзонов аминоацил-тРНК-синтетазы, сравнивали с аннотированными экзонами соединений, и новые границы экзонов идентифицировали как варианты альтернативного сплайсинга.

Колонки в табл. 2, 5 и 8, обозначенные 5'-экзон и 3'-экзон указывают, какие экзоны (при их наличии) сливаются в последовательности кДНК. В табл. 2, 5 и 8 показаны последовательности, которые были идентифицированы как варианты альтернативного сплайсинга, транскрипты, содержащие указанные варианты сплайсинга, и полипептиды, экспрессированные указанными транскриптами. Варианты альтернативного сплайсинга, идентифицированные методом глубокого секвенирования, обозначены в табл. 2, 5 и 8, как варианты, для которых в колонках считывний секвенирования соответствует значение больше нуля, для мозга взрослого и эмбриона человека.

Пример 3.

Идентификация полипептидов ΑΑΚδ с использованием биоинформатики.

Белковые фрагменты ΑΑΚδ (резектины или аппендакрины) идентифицировали с использованием биоинформатических подходов. Аминокислотные последовательности полноразмерной человеческой аминоацил-тРНК-синтетазы выравнивали с полноразмерной аминокислотной последовательностью ее ортолога из бактерии ΕδΗκηΜύη сой с использованием таких программ, как ΡΑδΤΑ (доступна на сайте в интернете 1Шр://ки1а.Ъюс11.У1Г8пиа.еби/ки1а_\у\у\у2/ки1а_\у\у\у.с80 или программы ΒΕΑδΤΡ из ΝΕ’ΒΙ (доступна на сайте в интернете Ь!ιр://№№№.ηсЪ^.η1т.ηШ.дον/Ъ1аδί/Β1аδ!.сд^?ΡΚΟΟΚΑΜ=Ъ1аδ!р&Β^Αδ Τ_ΡΚΟСΚΑΜδ=Ыаδ!р&ΡΑСЕ_ΤΥΡЕ=Β1аδ!δеа^сЬ&δΗΟ^_^ЕРΑυ^Τδ=οη&^INК_^ ОС ЪНыНот). Последовательности резектина из человеческих белков идентифицировали как покрывающие участки последовательности при наличии при выравнивании пропусков в бактериальной последовательности или области с низкой гомологией между двумя видами. Указанные пептиды и соответствующие последовательности ДНК в табл. 3, 6 и 9 включают примеры, идентифицированные таким образом.

Пример 4.

Дифференциальная экспрессия полипептидов ΑΑΚδ, идентифицированных с помощью массспектрометрии.

Для сравнения дифференциальной экспрессии гистидил-тРНК-синтетазы в различных тканях/клеточных типах (последовательности и сравнения в табл. 1, 4 и 7) использовали технологию ΡΚΟΤΟΜΑΡ, как описано в примере 1: экспрессию резектина аминоацил-тРНК-синтетазы сравнивали между тканью мышиной печени и тканью мышиной поджелудочной железы. Экспрессию резектина аминоацилтРНК-синтетазы сравнивали между цитозолем клеток ΡΑΑ264.7 и кондиционированной средой от клеток ΚΑ^264,7, собранной через 48 ч после инкубации в бессывороточной среде.

Пример 5.

Дифференциальная экспрессия полипептидов ΑΑ^δ, идентифицированных путем глубокого секвенирования.

Для анализа дифференциальной экспрессии сплайс-вариантов проводили глубокое секвенирование для кДНК, полученных из различных тканей.

Экспрессия конкретных вариантов альтернативного сплайсинга аминоацил-тРНК-синтетазы является не ожидаемым явлением и указывает на биологическую важность. Различие относительного числа считываний, наблюдаемых при глубоком секвенировании различных образцов транскриптома, указывает на то, что события альтернативного сплайсинга аминоацил-тРНК-синтетазы дифференциально регулируются и не являются просто артефактами, связанными с обработкой образца.

- 117 030418

Пример 6.

Скрининг антител.

Для облегчения поиска антител, проявляющих предпочтительные связывания со специфическими фрагментами аминоацил-тРНК-синтетазы (например, повышенная в >10 раз аффинность по сравнению с исходным полноразмерным ферментом), проводили скрининг библиотеки фагового дисплея человеческих антител с помощью ΑΙτΙ) δοϊΌΐΌΟ (подразделение МОΚΡНОδΥδ™, Магйпкпеб/Р1ап姧, Германия) с использованием методов аффинного обогащения (пэннинга). Антитела, после множества циклов скрининга обогащенные фрагментами аминоацил-тРНК-синтетазы, затем исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа на предмет реактивности с фрагментами и с исходным, полноразмерным ферментом. Клоны, демонстрирующие предпочтительное связывание (например, в >10 раз повышенную аффинность) с фрагментами аминоацил-тРНК-синтетазы, дополнительно охарактеризовывали.

Если необходимая специфичность не достигалась в конце процесса, использовали стратегии вычитания, такие как этапы предварительной абсорбции с полноразмерным ферментом и/или контрскрининга, для устранения перекрестно реагирующих антител, и запускали процесс селекции в отношении уникального эпитопа (эпитопов) на фрагментах аминоацил-тРНК-синтетазы.

Пример 7.

Идентификация сплайс-вариантов с использованием системной ПЦР.

Матрицы кДНК для реакций ПЦР были обратно транскрибированы из экстрактов тотальной РНК тканей или клеток (например, мозга человека, 1МЕ-32 и НЕК293Т). Реакции ПЦР проводили с использованием специфических праймеров аминоацил-тРНК-синтетазы, с прямым праймером (ЕР1), сконструированным для гибридизации с 5'-нетранслируемым участком или экзонами в 5'-половине гена, и с обратным праймером (НР1), сконструированным для гибридизации с экзонами в 3'-половине гена или 3'υΕΚ. Амплифицированные продукты ДНК анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле для идентификации продуктов ПЦР, которые отличаются по размеру от фрагментов, амплифицированных из традиционных транскриптов. Указанные различные продукты ПЦР вырезали и очищали из геля и лигировали в стандартный вектор клонирования для анализа последовательности ДНК. Варианты альтернативного сплайсинга идентифицировали как разные последовательности из традиционных транскриптов. Сплайс-варианты, идентифицированные с помощью указанного метода системной ПЦР, показаны в табл. 2, 5 и 8.

Пример 8.

Кодон-оптимизация выбранных полинуклеотидов ΑΑΚδ. Типичные полипептиды ΑΑΚδ (суммированные в табл. Е2) выбраны для дальнейшего биохимического, биофизического и функционального анализа на основе одного или более из следующих критериев, ΐ) идентификация протеолитических фрагментов полипептида ΑΑΚδ, ΐΐ) идентификация сплайс-вариантов полипептида ΑΑΚδ, ΐΐΐ) идентификация полипептидов ΑΑΚδ путем биоинформатического анализа, ίν) доказательство дифференциальной экспрессии конкретных полипептидов ΑΑΚδ, ν) доменная структура белка ΑΑΚδ, νί) размер полипептида ΑΑΚδ и νΐΐ) минимизация одинаковых дублирующихся последовательностей.

Таблица Е2

Полипептиды ΑΑΚδ, выбранные для кодон-оптимизации и бактериальной экспрессии

Название полипептида ААНЗ	ЗЕ<2 Ю N0: для эпитопно меченных полипептидов ААНЗ	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: для поли- нуклеотидов ААНЗ	Остатки белка ААНЗ	Положение эпитопной метки	Используемый способ клонирования/ синтеза
Ηΐ5Η31Ν1	5Е0 Ιϋ ΝΟ: 36	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 44	1-141	Ν-концевое	2
Ηί3Η31Ν1	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 37	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 44	1-141	С-концевое	2
Ηί5Η31Ν2	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 38	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 45	1-408	Ν-концевое	2
Ηί5Η31Ν2	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 39	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 45	1-408	С-концевое	2
Ηί5Η31Ν3	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 40	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 46	1-113	Ν-концевое	2
Ηί5Η31Ν3	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 41	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 46	1-113	С-концевое	2
ΗΪ3Κ31Ν3	3ΕΟ ΙΟ ΝΟ: 42	3ΕΟ ΙΟ ΝΟ: 47	1-243+27аа	Ν-концевое	2
Ηί5Η31Ν3	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 43	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 47	1-243+27аа	С-концевое	2
Ηί5Η31ε1	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 85	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 101	405-509	Ν-концевое	2
Н1зН31с1	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 86	3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 101	405-509	С-концевое	2
Н15Н31С2	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 87	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 102	1-60+175-509	Ν-концевое	2
Н15Н31С2	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 88	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 102	1-60+175-509	С-концевое	2
Н15Н31СЗ	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 89	3Εζ) Ιϋ ΝΟ: 103	1-60+211-509	Ν-концевое	2

- 118 030418

Н1зК31сз	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	90	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	103	1-60+211-509	С-концевое	2
НЬзК31с4	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	91	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	104	1-100+211-509	Ν-концевое	2
НЬзК31с4	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	92	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	104	1-100+211-509	С-концевое	2
НЬзК31сь	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	93	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	105	1-174+211-509	Ν-концевое	2
НЬзК31сь	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	94	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	105	1-174+211-509	С-концевое	2
Н1зК31с6	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	95	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	106	1-60+101-509	Ν-концевое	2
Н1зК31с6	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	96	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	106	1-60+101-509	С-концевое	2
НЬзК31с/	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	97	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	107	1-100+175-509	Ν-концевое	2
НЬзК31с/	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	98	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	107	1-100+175-509	С-концевое	2
Н1зК31с1°	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	99	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	108	369-509	Ν-концевое	2
Н1зК31с1°	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	100	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	108	369-509	С-концевое	2
ΗΪ3Κ3111	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	111	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	113	191-333	Ν-концевое	2
НЬзКЗ!11	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	112	3Ε0	Ιϋ	ΝΟ:	113	191-333	С-концевое	2

Полинуклеотиды, кодирующие выбранные полипептиды ААК8, перечисленные в табл. Е2, наряду с соответствующей Ν-или С-концевой эпитопной меткой, синтезировали и клонировали, как описано в разделе Общих материалов и способов, с использованием метода синтеза генов, указанного в табл. Е2.

Пример 9.

Низкопроизводительная бактериальная экспрессия и очистка. Полипептиды ААК8, перечисленные в табл. Е2, экспрессируются в Е.сой, как описано в разделе общих материалов и способов. Относительная экспрессия растворимых и локализованных в тельцах включения полипептидов ААК8 суммирована в табл. Е3.

Таблица Е3

Суммарные характеристики бактериальной экспрессии полипептида ААК8

Полипептид ААК5	Положение эпитопной метки	Количество белка, восстановленного из растворимой фракции	Количество белка, восстановленного из телец включения
Ηί3Κ31Ν1	Ν-концевое	+	+++
Ηί3Η31Ν1	С-концевое	+	+
Η13Κ31Ν2	Ν-концевое	+	+ +++
Ηί3Κ31Ν2	С-концевое	+	+
Ηί3Η31Ν3	Ν-концевое	+	+++
Н1зК31ыз	С-концевое	+	+
Ηί3Κ31Ν5	Ν-концевое	+	+ +
Ηί3Κ51Ν3	С-концевое	+	+
Н1зК31С1	Ν-концевое	+	+++
Н1зН31с1	С-концевое	+ +	+ ++++
Н1зК31с2	Ν-концевое	+	+++
Н1зК51с2	С-концевое	+	+
Н1зК31сз	Ν-концевое	+	+
Н1зК31сз	С-концевое	+	+

- 119 030418

Н1зН31с4	Ν-концевое	+	+ + +
Н13К51С4	С-концевое	+	+
Н1зК51сь	Ν-концевое	+	+
Н1зК51сь	С-концевое	+	+
Н1зК51с6	Ν-концевое	+	+ + +
Н1зК51с6	С-концевое	+	+
Н1зК51с/	Ν-концевое	+	+ + +
Н1зК51с/	С-концевое	+	+
Н13К51С1°	Ν-концевое	+	+ + +
Н1зК51с1°	С-концевое	+	+
ΗΪ3Κ5111	Ν-концевое	+	+ +
НгзНЗ!11	С-концевое	+	+

+ обозначает экспрессию 0-1 мг/л полипептида ААК8;

++ обозначает экспрессию 1-5 мг/л полипептида ААК8;

+++ обозначает экспрессию 5-10 мг/л полипептида ААК8;

++++ обозначает экспрессию 10-15 мг/л полипептида ААК8;

+++++ обозначат экспрессию >15 мг/л полипептида ААК8;

ΝΏ: не определено.

Неожиданным образом данные по экспрессии белка показали существование по меньшей мере одного семейства белковых доменов, для которых наблюдается высокий уровень экспрессии растворимого белка при экспрессии в Е.^Н. В частности, указанные данные демонстрируют, что Н1кК81^С1, (аминокислоты 405-509) полипептидов ААК8 определяют границу первого нового белкового домена, который на высоком уровне экспрессируется в Е.^Н. Кроме того, большинство остальных белков может с легкостью экспрессироваться в тельцах включения для последующего повторной укладки.

Пример 10.

Крупномасштабная продукция полипептидов ААК8.

Типичные полипептиды ААК8 получали в большем количестве для проведения дальнейшего функционального и биофизического исследования. Полипептиды ААК8, перечисленные в табл. Е4, экспрессировали в более масштабной культуре Е.^Н, как описано в разделе Общих материалов и способов. Выход и конкретные биофизические характеристики для каждого экспрессируемого растворимого белка суммированы ниже в табл. Е4.

Таблица Е4

Суммарные данные выхода и биофизической характеристики типичных полипептидов ААК8

ААКЗ поли- пептид	Положение эпитопной метки	Выход [мг/л] (1)	Чистота [%]	Эндотоксин [ЕЭ/мг]	Молекулярная масса	Рабочая исходная концентрация [мг/мл]	Стабильность [процентное восстановление] (2)	Агрегация [ОЪЗ]
Ηί3Κ51Ν1	Ν-концевое	9, 3	80	1,0	С: 18743 М: 18746	17,36	43	+ + + + +
ΗΪ3Κ51ν3	Ν-концевое	10,7	80	0, 8	С: 15499 М: 15501	19,48	80	+ + + + +
ΗΪ3Κ5111	Ν-концевое	б, 2	90	2,1	Νϋ	3, 68	Νϋ	Νϋ
Н1зН31с1	С-концевое	32,2	95	0,3	Νϋ	7,21	Νϋ	Νϋ
Н1зК31с1	Ν-концевое	8,2	95	0, 9	С: 14732 М: 29460	11,26	65	+ + + + +

⁽¹⁾ Выход, определенный путем измерения восстановления белка после последнего этапа очистки.

⁽²⁾ Определена как процентное восстановление не агрегированного материла через 1 неделю при 25°С. ⁽⁴⁾ Вероятно, представляет собой М^ без Ν-концевого метионина.

С: Рассчитано.

М: Определенная молекулярная масса (массы).

Обозначения:

+ обозначает менее 1% высокомолекулярных белковых агрегатов;

++ обозначает менее 2% высокомолекулярных белковых агрегатов;

+++ обозначает менее 5% высокомолекулярных белковых агрегатов;

++++ обозначает менее 10% высокомолекулярных белковых агрегатов;

+++++ обозначает более 10% высокомолекулярных белковых агрегатов;

ΝΏ: не определено.

Результаты указанных исследований показали, что типичные белки ААК8 из семейств белков

- 120 030418

ΑΑΚδ Ηΐ8Κδ1^Ν1, I Ιΐ8Κδ1^Ν Ηί8Κδ1^π и I Ιΐ8Κδ1^<'¹ имеют приемлемый изначальный уровень белковой экспрессии и характеристики растворимости.

Пример 11.

Анализ транскрипции типичных полипептидов ΑΑΚδ. Для тестирования способности полипептидов ΑΑΚδ модулировать экспрессию генов, выбранные полипептиды ΑΑΚδ инкубировали с мезенхимальными стволовыми клетками или человеческими клетками скелетной мускулатуры в течение времени и в концентрации, показанными в табл. Е5.

Таблица Е5

Анализ уровня транскрипции типичных полипептидов ΑΑΚδ в мезенхимальных стволовых клетках ^δ^ или человеческих скелетно-мышечных клетках (I Ы<МС)

Описание исследуемого	Тип клеток и время воздействия
	образца
Полипе- птиды ААКЗ	Положение эпитопной метки	Концентрация, нМ	МЗС 24 часа	МЗС 72 часа	НЗкМС 24 часа	НЗкМС 72 часа
Ηί5Κ31Ν1	Ν-концевое	250	4	2	7	4
ΗΪ5Κ31ν2	Ν-концевое	250	>20	1	5	7
Ηί5Κ31Ν3	Ν-концевое	250	б	6	5	5
ΗΪ5Κ31ν4	С-концевое	250	>20	5	11	2
НтзКЗ!145	Ν-концевое	250	>20	3	4	2
Н1зК31С1	Ν-концевое	250	0	1	5	7
Н1зК31с1	С-концевое	250	0	1	18	5
Н1зК31с2	Ν-концевое	250	16	0	5	6
Н1зК31с4	Ν-концевое	250	12	1	10	4
Н1зК31с6	Ν-концевое	250	>20	0	3	4
Н1зК31с/	Ν-концевое	250	15	4	5	4
Н1зК31с8	С-концевое	250	18	0	7	5
Н1зК31с9	С-концевое	250	19	0	1	3
Н1зК31с1°	Ν-концевое	250	13	3	12	2
НгзКЗ!11	Ν-концевое	250	0	0	5	4
Контроли
Среднее для всех подверженных скринингу полипептидов ААКЗ	б	2	5	4
Смесь для остеогенеза	16	18	ΝΑ	ΝΑ
Смесь для хондрогенеза	11	16	ΝΑ	ΝΑ
Смесь для адипогенеза	11	11	ΝΑ	ΝΑ
ЗКМС, положительный контроль	ΝΑ	ΝΑ	32	20
Необработанные	0	0	8	3

В табл. Е5 значения в каждой колонке обозначают число генов, активность которых была модулирована, положительно или отрицательно по меньшей мере в 4 раза по сравнению с контрольными образцами, как описано в разделе общих способов. Данные показывают, что конкретные формы исследуемых полипептидов ΑΑΚδ имеют непредвиденную способность регулировать транскрипцию и, таким образом, потенциально могут модулировать направление развития или состояние дифференцировки при их добавлении к мезенхимальным стволовым клеткам ^δ^ и/или человеческим скелетно-мышечным клеткам (I Ы<МС). Закрашенные ячейки с изолированными жирным шрифтом номерами в таблице представляют собой примеры, где полипептид ΑΑΚδ оказывает значительное влияние на регуляцию транскрипции генов в клеточных линиях, с такой кратностью, как указано в таблице.

Был сделан вывод, что Ηί8Κδ1^Ν', Πί8Κδ1^Ν?, Ηΐ8Κδ1^Ν3, ΙΙΐ8Κδ1'', Ηΐ3Κδ1^Ν5, Ηΐ3Κδ1^π, ΙΠΙΚΜ' Η^8Κδ1^С2, Ηΐ8Κδ1^Γ'⁴, Н18^1^С6, I Ιί8Κδ1^ί'⁷, Н1з^1^С8, Ηί3Κδ1^Γ' и Ηί8Κδ1^Γ'^ιη, являются важными регуляторами экспрессии генов мезенхимальных стволовых клеток и/или человеческих клеток скелетной мускулатуры.

- 121 030418

Пример 12.

Функциональный анализ полипептидов ΑΑΚδ.

Для анализа способности полипептидов ΑΑΚδ модулировать ряд фенотипических процессов, выбранные полипептиды ΑΑΚδ инкубировали с клеточными типами и при условиях, представленных в разделе общих способов и табл. Е5 и Е6.

Таблица Е6

Принципы анализов и критерии для детектирования искомого соединения

Анализы пролиферации
Источник и тип клеток	Номер анализа
Клетки мегакариоцитарного лейкоза человека/Мо7е	А1
Клетки острого промиелоцитарного лейкоза человека/НЬбО	А2
Клетки лимфобласта человека (раковая клеточная линия)/КРМ18226	АЗ
Мезенхимальные стволовые клетки человека/ПМЗС	А4
Астроциты человека	А5
Клетки острого моноцитарного лейкоза человека/ТНР1	Аб
Клетки аспирата костного мозга человека/клетки костного мозга (долговременная культура)	А7
Синовиоциты человека/НКЪ5-5упНА	А8
Пре-адипоциты человека/ЬРАР	А9
Гладкомышечные клетки легочной артерии человека/ПРАЗМС	А10
Клетки скелетной мускулатуры человека/ПЗКМС	АН
Анализ данных анализов пролиферации проводили путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААКЗ считали стимуляторами пролиферации, если измеренное значение более чем на 3 3ϋ отличалось от значения для ФСБ в положительном направлении. Произошедший из тРНК-синтетазы полипептид ААКЗ считали цитотоксичным, если наблюдали отличие более чем на 3 3ϋ от значения для ФСБ в отрицательном направлении. Цитотоксические соединения использовали в качестве отрицательного контроля и среднее значение для указанного соединения всегда больше чем на 3 3ϋ отличалось от среднего значения для ФСБ.
Анализы дифференцировки клеток и фенотипа
Описание анализа	Номер анализа
Захват ацетилированного ЛПНП гепатоцитами человека (клетками Нер62СЗа)	В1
Анализ данных анализа захвата Ас-ЛПНП осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААНЗ считали модуляторами захвата Ас-ЛПНП, если измеренное значение более чем на 2 3ϋ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении. Визуальный контроль для подтверждения результатов, полученных с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов, осуществляли с использованием флуоресцентного микроскопа.
Анализы нейтрофилов человека
Описание анализа	Номер анализа
«Кислородный взрыв» нейтрофилов (агонист)	С1
«Кислородный взрыв» нейтрофилов (антагонист)	С2
Эластаза нейтрофилов	СЗ
Анализ данных анализа нейтрофилов осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААНЗ считали модуляторами продукции эластазы нейтрофилами или биологии окислительного взрыва, если измеренное значение более чем на 2 3ϋ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении.
Модуляцию То11-подобных рецепторов (ТЬЕ)
Описание анализа	Номер анализа
Активация ТИК в клетках КАИ ВШЕ	Н
Антагонизм в отношении ТЬК в клетках КАИ ВШЕ	Ό2
Активация ПТЬК2	Ώ3

- 122 030418

Активация ПТЬЕ4 | В4
Анализ данных для анализов модуляции ТЬЕ осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААЕЗ считали модуляторами специфической биологии ТИН, если измеренное значения более чем на 3 ЗБ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении. Положительные контроли, включая ЬРЗ и выявляющий реагент, всегда имели значительное отличие и на >3 ЗБ отличались от среднего значения для ФСБ.
Высвобождение цитокинов
Описание анализа	Номер анализа
Продукция цитокинов синовиоцитами человека (высвобождение 1Ь6)	Е1
Продукция цитокинов гладкомышечными клетками легочной артерии человека (ПРАЗМС) (высвобождение ТПб)	Е2
Продукция цитокинов клетками скелетной мускулатуры человека (ПЗКМС) (высвобождение 1Ь6)	ЕЗ
Продукция цитокинов астроцитами человека (высвобождение 1Ь6)	Е4
Общее высвобождение 1Ь6 из крови	Е5
Продукция цитокинов (высвободение 1Ь8) гладкомышечными клетками легочной артерии человека (ПРАЗМС), инкубация в течение 72 часов	Еб
Продукция 1Ь8
Описание анализа	Номер анализа
Продукция цитокинов синовиоцитами человека (высвобождение 1Ь8)	Е7
Продукция цитокинов гладкомышечными клетками легочной артерии человека/ПРАЗМС (высвобождение 1Ь8)	Е8

Продукция цитокинов клетками скелетной мускулатуры человека (ПЗКМС) (высвобождение 1Ь8)	Е9
Продукция цитокинов астроцитами человека (высвобождение 1Ь8)	ЕЮ
Гепатоциты (НерО2СЗа) (НерО2СЗа) (высвобождение 1Ь8)	Е11
Клетки острого промиелоцитарного лейкоза человека/НЬбО (высвобождение 1Б8)	Е12
Лимфобластные клетки человека/ЕРМ18226 (высвобождение 1Ь8)	Е13
Продукция ΤΝΕ-альфа
Гепатоциты человека/клетки НерО2СЗа (высвобождение ΤΝΕ-альфа)	Е14
Клетки острого моноцитарного лейкоза человека (раковая клеточная линия)/ТНР1 (высвобождение ΤΝΕ-альфа)	Е15
Высвобождение 1Ь10
Высвобождение ШО из клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека/НЬбО	Е16
Первичные мононуклеары крови человека (высвобождение ШО)	Е17
Анализ данных анализов высвобождения цитокинов осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААЕЗ считали модуляторами продукции цитокинов или связанной с цитокинами биологии, если измеренное значение больше, чем 2 ЗБ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении. Проводили анализ белкового стандарта (конкретного для каждого набора анализа) на каждом планшете для подтверждения хорошего качества анализа. Только анализы, кривые белковых стандартов для которых имели значение Е2 >0,9, были выбраны для анализа данных.
Адгезия клеток и хемотаксис
Описание анализа	Номер анализа
Адгезия клеток моноцитов ТНР 1/эндотелиальных клеток пупочной вены человека (НиУЕС)	Е1

- 123 030418

Гепатоциты человека (Нер62СЗа клеток) (высвобождение 1САМ)	Е2
Регуляция клеточной адгезии клеток эндотелия микрососудов легкого человека (НЬМУЕС) (высвобождение 1САМ)	ЕЗ
Регуляция клеточной адгезии клеток эндотелия пупочной вены человека (НТЗУЕС) (высвобождение УСАМ)	Е4
Регуляция клеточной адгезии мезенхимальных стволовых клеток человека (ПМЗС) (высвобождение 1САМ)	Е5
Регуляция клеточной адгезии клеток скелетной мускулатуры (НТЗУЕС) (высвобождение 1САМ)	Еб
Регуляция клеточной адгезии гладкомышечных клеток легочной артерии человека (ПЗКМС) (высвобождение УСАМ)	Е7
Анализ данных анализа регуляции клеточной адгезии осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Полипептиды ААНЗ считали модуляторами клеточной адгезии или регуляторами биологии, связанной с клеточной адгезией, если получали значение, более чем на 2 3ϋ отличное от значения для ФСБ, в положительном или отрицательном направлении. В случае ЕЫЗА-анализов, проводили анализ белкового стандарта (конкретного для каждого набора анализа) на каждом планшете для подтверждения хорошего качества анализа. Только анализы кривые белковых стандартов для которых имели значение К2 > чем 0,9, были выбраны для анализа данных.
Дифференцировка клеток
Описание анализа	Номер анализа
Дифференцировка клеток пре-адипоцитов человека (ΠΡΑϋ)	С1
Дифференцировка клеток клеток скелетной мускулатуры человека (ПЗКМС)	02
Дифференцировка клеток мезенхимальных стволовых клеток человека (ПМЗС)	СЗ
Дифференцировка гладкомышечных клеток легочной артерии человека (ПРАЗМС)	04
Анализ данных анализа дифференцировки клеток осуществляли путем деления числового значения для аналитической лунки на среднее значение для лунок, содержащих ФСБ, для аналитического планшета. Анализы дифференцировки оценивали на основе флуоресцентной или колориметрической интенсивности конкретных антител, описанных в разделе способов. Полипептиды ААНЗ считали модуляторами дифференцировки клеток, если значение интенсивности для специфического маркера дифференцировки более чем на 2 3ϋ отличалось от значения для ФСБ в положительном или отрицательном направлении в конкретной обработанной лунке.
Клеточное связывание
Описание анализа	Номер анализа
РВМС	Н1
Первичные Т-клетки	Н2
Первичные В-клетки	НЗ
Первичные моноциты	Н4
Нер62	Н5
ЗТЗЫ	Нб
С2С12	Н7
ТНР1	Н8
ДигкаЬ	Н9
Паз ί	НЮ
Полипептиды ААНЗ считали связанными с конкретным типом клеток, если средняя связанная с клетками интенсивность флуоресценции более, чем на 2 3ϋ отличалась от контрольных значений для реагента для указанного типа клеток.

- 124 030418

Таблица Е7

Результаты функционального анализа полипептидов ΑΑΚδ

Полипептиды ААК5	Положение эпитопной метки	Концентрация [нМ]	Критерии анализа
Ηί3Κ31Ν1 Ηί3Κ31Ν2 Ηί3Κ31Ν3 Ηί3Κ31Ν4 Ηί3Κ31Ν5	Ν-концевое Ν-концевое Ν-концевое С-концевое Ν-концевое	250 250 250 250 250	ϋΐ (Биология То11-подобного рецептора) Е12, Е14 (Высвобождение цитокинов) 61 (Клеточная дифференцировка) С2 (Нейтрофильный «кислородный взрыв») Е1, Е7, Е13 (Высвобождение цитокинов) Е2 (Клеточная адгезия и хемотаксис) А7 (Пролиферация) Е1, Е7 (Высвобождение цитокинов) Е5. Еб (Клеточная адгезия и хемотаксис) 63 (Клеточная дифференцировка) А7 (Пролиферация) Ώ1 (Биология То11-подобного рецептора) С2 (Нейтрофильный «кислородный взрыв») Ό2 (Биология То11-подобного рецептора) Е7, ЕЮ, Е11, Е12 (Высвобождение цитокинов) Е2, Еб (Клеточная адгезия и хемотаксис) 61 (Клеточная дифференцировка)
Н1зК31с1	Ν-концевое	250	Е2 (Клеточная адгезия и хемотаксис) 61 (Клеточная дифференцировка)
Н1зК31с1	С-концевое	250	Е1, Е9, Е11 (Высвобождение цитокинов) 61, 63 (Клеточная дифференцировка)
Н1зК31с2	Ν-концевое	250	Ώ1 (Биология ТЬН-подобного рецептора) Е11, Е12, Е14 (Высвобождение цитокинов)
Н1зН31с4	Ν-концевое	250	Аб (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЬОЬ) Ό1 (Биология То11-подобного рецептора) Е11, Е12, Е14 (Высвобождение цитокинов) 61, 62 (Клеточная дифференцировка)
Н1зК31с6	Ν-концевое	250	АЗ (Пролиферация) С2 (Нейтрофильный «кислородный взрыв») ϋΐ, Ό2 (Биология ТЬН-подобного рецептора) Е2 (Клеточная адгезия и хемотаксис)
Н1зК31с7	Ν-концевое	250	С2 (Нейтрофильный «кислородный взрыв») 01, 02 (Биологгья ТОН-подобного рецептора) Е2, Еб (Клеточная адгезия и хемотаксис)
Н1зК31с8 Н1зК31с9 Н1зК31с1°	С-концевое С-концевое Ν-концевое	250 250 250	А4, А7 (Пролиферация) Е11 (Высвобождение цитокинов) А4 (Пролиферация) В1 (Захват Ас-ЬОЬ) 01 (Биология ТЬН-подобного рецептора) Е1, Е8, Е11, Е12, Е13 (Высвобождение цитокинов) ЕЗ, Еб (Клеточная адгезия и хемотаксис) 63 (Клеточная дифференцировка) Е1 (Высвобождение цитокинов)
НгзНЗ!11	Ν-концевое	250	ϋΐ (Биология ТЬН-подобного рецептора) Е12, Е14 (Высвобождение цитокинов) 61 (Клеточная дифференцировка)

Был сделан вывод, что ШзЯЗ^¹ (аминоксилоты 1-141), ШзЯЗ^² (аминоксилоты 1-408), ШзЯЗ^³ (аминоксилоты 1-113), ШзЯЗ^⁴ (аминоксилоты 1-60), ШзЯЗ^⁵ (аминоксилоты 1-244 + 26 аа), ШзЯЗ^¹ (аминоксилоты 191-333), №^81^С1 (аминоксилоты 405-509), ^ΚδΡ² (аминоксилоты 1-60 + 175-509), ^ΚδΡ⁴ (аминоксилоты 1-100+211-509), №^31⁰⁶ (аминоксилоты 1-60+101-509), ШзЯЗ^⁷ (аминокси- 125 030418 лоты 1-100+175-509), Шк^Е⁸ (аминоксилоты 1-60+399-509), Шк^Е⁹ (аминоксилоты 1-100+399-509) и ΙΙικΚδΓ (аминоксилоты 369-509) являются важными регуляторами пролиферации, дифференцировки, высвобождения цитокинов, активации нейтрофилов, клеточной адгезии и хемотаксиса. Следует отметить, что во многих случаях слитые по Ν- и С-концу белки имеют разные паттерны активности, как в экспериментах по анализу уровня транскрипции, так и в экспериментах фенотипического скрининга. Указанные данные соответствуют гипотезе, что новая биологическая активность полипептидов ΑΑΚδ подавляется, когда указанный полипептид ΑΑΚδ является частью интактной тРНК-синтетазы или в процессе трансляции сливается по любому концу с другим белком, но что указанная биологическая активность восстанавливается, когда полипептиды ΑΑΚδ имеют свободный амино- или карбокси-конец.

Соответственно, был сделан вывод, что полипептиды ΑΑΚδ, содержащие любые из аминокислотных последовательностей, перечисленных выше, определяют приблизительные границы (т.е. в пределах примерно ±5 аминокислот) ряда новых высокоактивных доменов полипептида ΑΑΚδ, которые являются ί) высокофункциональноактивным, ίί) могут быть с легкостью сконструированы и продуцированы в Е.^П и ίίί) проявляют благоприятные характеристики стабильности и агрегации белка.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> аТуг РНагта 1пс.

Рапди БЧорИагта ЬдтРВеД Огеепе, БезИе Апп СЫапд, Ку1е Р.

Нопд, РеЧ

УаззегоВ, А1аЧп Р.

Бо, ИЧпд-Зле ИаВкЧпз, ЛеВВгу Б.

МепШеЧп, ПоПп Б. фиЧпп, СИегу1 Б.

<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, ПОЛИПЕПТИД АМИНОАЦИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ (ААКЗ) <130> 120161.450РС <140> РСТ <141> 2011-07-12 <150> ИЗ 61/363,581 <151> 2010-07-12 <150> из 61/363,585 <151> 2010-07-12 <150> из 61/363,587 <151> 2010-07-12 <160> 113 <170> РазВЗЕф для МЧпДоиз версии 4.0 <210> 1 <211> 77 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 1 аддаддВааа асаВаВдсаВ саВсаВсаВс аВсасддВаа дссВаВсссВ аасссВВВдс 60 ВсддВсВсда ВВсВасд 77

- 126 030418 <210> 2 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 2

ЕааЕдасЕсд ад 12 <210> 3 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 3 аддадаЕааа асаЕаЕд 17 <210> 4 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 4 аддаддЕааа асаЕ 14 <210> 5 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 5 аддадаЕааа асаЕ 14 <210> 6 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 6 дааддадаЕа ЕасаЕ 15 <210> 7 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид

- 127 030418 <400> 7 ддЕаадссЕа ЕсссЕаассс ЕсЕссЕсддЕ сЕсдаЕЕсЕа сдсассасса ЕсаЕсассаЕ 60 ЕааЕдасЕсд ад 72 <210> 8 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 8 саЕаЕдсаЕс аЕсаЕсаЕса ЕсасддЕаад ссЕаЕсссЕа асссЕсЕссЕ сддЕсЕсдаЕ 60 ЕсЕасдддаЕ сс 72 <210> 9 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 9 сЕсдадЕааЕ да 12 <210> 10 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 10 саЕаЕдддаЕ сс 12 <210> 11 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 11 сЕсдадддЕа адссЕаЕссс ЕаасссЕсЕс сЕсддЕсЕсд аЕЕсЕасдса ссассассас 60 сассасЕааЕ да 72 <210> 12 <211> 141 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 12

МеЕ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

- 128

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

85

90

95

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

100

105

110

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

115

120

125

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЕ

130 135 140 <210> 13 <211> 423 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 13 аЕддсададс дЕдсддсдсЕ ддаддадсЕд дЕдааасЕЕс адддададсд сдЕдсдаддс 60 сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа 120 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад 180 ддсасаадад асЕаЕадЕсс ссддсадаЕд дсадЕЕсдсд адааддЕдЕЕ ЕдасдЕааЕс 240 аЕссдЕЕдсЕ Есаадсдсса сддЕдсадаа дЕсаЕЕдаЕа сассЕдЕаЕЕ ЕдаасЕааад 300 дааасасЕда ЕдддааадЕа Еддддаадас ЕссаадсЕЕа ЕсЕаЕдассЕ дааддассад 360 ддсддддадс ЕссЕдЕсссЕ ЕсдсЕаЕдас сЕсасЕдЕЕс сЕЕЕЕдсЕсд дЕаЕЕЕддса 420 аЕд 423 <210> 14 <211> 408 <212> Белок <213> Ното зартепз <400> 14

МеЕ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

85

90

95

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

100

105

110

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

115

120

125

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЕ

Азп

Ьуз

Ьеи

130

135

140

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

Н1з

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

145

150

155

160

Рго

А1а

МеЕ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

165

170

175

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

180

185

190

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

195

200

205

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

210

215

220

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

- 129

225

230

235

240

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

245

250

255

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

260

265

270

О1п

Няз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

275

280

285

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

290

295

300

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

305

310

315

320

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

325

330

335

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

340

345

350

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

355

360

365

МеЕ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

370

375

380

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

385

390

395

400

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

405

<210> 15 <211> 1224 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 15 аЕддсададс сЕсаадсадс сЕдааддсас ддсасаадад аЕссдЕЕдсЕ дааасасЕда ддсддддадс аЕдааЕааас ссадссаЕда аасЕЕЕдаЕс

ЕсасЕЕсада

ЕЕЕдсЕаЕсЕ сЕддасаадд ссЕдаддЕдд даасадсЕдс дассЕдаадЕ дассЕдадсс сЕасадассс ддасдсЕаЕд дддсЕсадса даддадаада дЕдсддсдсЕ адааддссад адсЕдддЕсс асЕаЕадЕсс

Есаадсдсса

ЕдддааадЕа

ЕссЕдЕсссЕ

ЕдассаасаЕ сссдЕддссд ссаЕдаЕссс

ЕаддсдасЕЕ дЕддЕдЕЕЕс

ЕдЕссЕддда сЕдассдсаЕ

ЕссаддаЕсс

ЕдсЕсЕЕЕда

ЕЕдсЕсдадд садсссаддс аЕдддсЕадЕ

ЕЕддддЕдда

Еасддассас ддаддадсЕд сдссдадсЕд

ЕдаЕдааадс ссддсадаЕд сддЕдсадаа

Еддддаадас

ЕсдсЕаЕдас

ЕааасдсЕас аЕассдддаа

ЕдаЕдсадад ссЕддЕсаад

Едасадсаад ададдЕдаад

ЕддддасЕаЕ

ЕааасЕаЕсс дЕассЕдасс дсЕддаЕЕас аддддаадад дддсаЕдЕЕс дсддаЕЕЕЕс ддад дЕдааасЕЕс аЕсдаддадд ааасадаааЕ дсадЕЕсдсд дЕсаЕЕдаЕа

ЕссаадсЕЕа сЕсасЕдЕЕс сасаЕадсаа

ЕЕсЕассадЕ

ЕдссЕдаада дЕааасдаЕс

ЕЕссдЕасса ааЕдадаЕдд дЕссадсаас саааасаадс сЕаЕЕЕддса

ЕасасЕдддд ссссЕдддЕд дассссааад

ЕссаЕсдЕдд адддададсд аддЕддсдаа

ЕЕдЕдсЕсаа адааддЕдЕЕ сассЕдЕаЕЕ

ЕсЕаЕдассЕ сЕЕЕЕдсЕсд аддЕаЕаЕсд дЕдаЕЕЕЕда

ЕсаЕдЕдсда дасдсаЕЕсЕ

ЕсЕдсЕссЕс

Едддададаа аЕддЕддддЕ аддссЕЕдда

ЕЕдаЕдасаа

ЕдаЕсЕаЕда

ЕдддсадЕдЕ ддсдсааддЕ аасададасЕ сдЕдсдаддс асЕссЕдааа аасссссаад

ЕдасдЕааЕс

ЕдаасЕааад дааддассад дЕаЕЕЕддса дсдддаЕаас саЕЕдсЕддд даЕссЕдадЕ адаЕдддаЕд адЕадасаад дддссЕЕдса аЕсссЕддЕд дддссЕддда ааЕсЕссЕЕЕ ддсадЕдсЕд ддсЕдсЕдда дссаЕдЕдЕд ададдсЕЕЕд

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1224 <210> 16 <211> 12 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 16

А1а Бег А1а О1и О1п 11е О1и О1и О1и Уа1 ТНг Ьуз 1 5 10

- 130 030418 <210> 17 <211> 49 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 17

Беи

Беи

Буз

Беи

Буз

А1а

О1п

Беи

О1у

О1п

Азр

О1и

О1у

Буз

О1п

Буз

1

5

10

15

РЬе

Уа1

Беи

Буз

ТЬг

Рго

Буз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

20

25

30

МеБ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Буз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Буз

35

40

45

Агд <210> 18 <211> 14 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 18

Ηΐ3 О1у А1а О1и Уа1 11е Азр ТЬг Рго Уа1 РЬе О1и Беи Буз 1 5 10 <210> 19 <211> 18 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 19

О1и	ТЬг Беи ТЬг О1у Буз	Туг О1у О1и Азр Бег Буз	Беи 11е Туг Азр
1	5	10	15

Беи Буз <210> 20 <211> 10 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 20

Азр О1п О1у О1у О1и Беи Беи Бег Беи Агд

5 10 <210> 21 <211> 103 <212> Белок <213> Миз тизси1из

<400> 21
А1а 1	Бег	А1а	О1и
Буз	А1а	О1п	Беи 20
ТЬг	Рго	Буз 35	О1у
О1и	Буз 50	Уа1	РЬе
О1и	Уа1	11е	Азр

О1п	11е	О1и	О1и
5 О1у	О1п	Азр	О1и
ТЬг	Агд	Азр	Туг
Азр	Уа1	11е	40 11е
ТЬг	Рго	55 Уа1	РЬе

О1и	Уа1 10	ТЬг	Буз
О1у 25	Буз	О1п	Буз
Бег	Рго	Агд	О1п
Агд	Суз	РЬе	Буз 60
О1и	Беи	Буз	О1и

Беи	Беи	Буз 15	Беи
РЬе	Уа1 30	Беи	Буз
МеБ 45	А1а	Уа1	Агд
Агд	Н1з	О1у	А1а
ТЬг	Беи	ТЬг	О1у

- 131

65					70			75		80
Ьуз	Туг	О1у	О1и	Азр	Бег	Ьуз Ьеи	11е Туг	Азр	Ьеи Ьуз Азр О1п	О1у
				85			90		95
О1у	О1и	Ьеи	Ьеи	Бег	Ьеи	Агд

100 <210> 22 <211> 14 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 22

Ηΐ3 О1у А1а О1и Уа1 11е Азр ТЪг Рго Уа1 РЪе О1и Ьеи Ьуз 1 5 10 <210> 23 <211> 166 <212> Белок <213> Миз тизси1из

О1и

ТЪг

Ьеи

ТЪг

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

1

5

10

15

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЪг

20

25

30

Уа1

Рго

РЪе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Азп

11е

Ьуз

35

40

45

Агд

Туг

Н1з

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЬ

ТЪг

50

55

60

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЪе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЪе

Азр

11е

А1а

О1у

65

70

75

80

О1п

РЪе

Азр

Рго

МеЬ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЬ

Суз

85

90

95

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азп

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

100

105

110

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЪе

А1а

Уа1

Суз

О1у

Уа1

Рго

Азр

115

120

125

Бег

Ьуз

РЪе

Агд

ТЪг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

130

135

140

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

145

150

155

160

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

165

<210> 24 <211> 22 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 24

11е О1у Азр Туг Уа1 О1п О1п Н1з О1у О1у Уа1 Бег Ьеи Уа1 О1и О1п

5 10 15

Ьеи Ьеи О1п Азр Рго Ьуз <210> 25 <211> 202 <212> Белок <213> Миз тизси1из

- 132 <400> 25

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Беи

Буз

О1и

ТЬг

1

5

10

15

Беи

ТЬг

О1у

Буз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Буз

Беи

11е

Туг

Азр

Беи

Буз

20

25

30

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Беи

Беи

Бег

Беи

Агд

Туг

Азр

Беи

ТЬг

Уа1

Рго

35

40

45

РНе

А1а

Агд

Туг

Беи

А1а

МеБ

Азп

Буз

Беи

ТЬг

Азп

11е

Буз

Агд

Туг

50

55

60

Н1з

11е

А1а

Буз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеБ

ТЬг

Агд

О1у

65

70

75

80

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

О1п

РЬе

85

90

95

Азр

Рго

МеБ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Беи

Буз

11е

МеБ

Суз

О1и

11е

100

105

110

Беи

Бег

Бег

Беи

О1п

11е

О1у

Азп

РЬе

Беи

Уа1

Буз

Уа1

Азп

Азр

Агд

115

120

125

Агд

11е

Беи

Азр

О1у

МеБ

РЬе

А1а

Уа1

Суз

О1у

Уа1

Рго

Азр

Бег

Буз

130

135

140

РНе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Буз

Беи

Азр

Буз

Уа1

Бег

Тгр

145

150

155

160

О1и

О1и

Уа1

Буз

Азп

О1и

МеБ

Уа1

О1у

О1и

Буз

О1у

Беи

А1а

Рго

О1и

165

170

175

ναι

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Нгз

О1у

О1у

Уа1

Бег

180

185

190

Беи

Уа1

О1и

О1п

Беи

Беи

О1п

Азр

Рго

Буз

195 200 <210> 26 <211> 60 <212> Белок <213> Ното зардепз <400> 26

МеБ 1

А1а О1и

Агд А1а 5

А1а

Беи О1и О1и

Беи Уа1 10

Буз

Беи О1п

О1у 15

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Беи

Буз

О1п

О1п

Буз

А1а

Бег

А1а

О1и

Беи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Буз

Беи

Беи

Буз

Беи

Буз

А1а

О1п

Беи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Буз

О1п

Буз

РЬе

Уа1

Беи

Буз

ТЬг

Рго

Буз

50

55

60

<210> <211> <212> <213>	27 180 ДНК Ното	заргепз
<400>	27
аБддсададс	дБдсддсдсБ	ддаддадсБд	дБдааасББс	адддададсд	сдБдсдаддс	60
сБсаадсадс	адааддссад	сдссдадсБд	аБсдаддадд	аддБддсдаа	асБссБдааа	120
сБдааддсас	адсБдддБсс	БдаБдааадс	ааасадаааБ	ББдБдсБсаа	аасссссаад	180

<210>	28
<211>	270
<212>	Белок
<213>	Ното заргепз

- 133 030418 <400> 28

МеЬ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

С1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Зег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Зег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Зег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

85

90

95

РНе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Зег

Ьуз

100

105

110

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

115

120

125

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

Ьуз

Ьеи

130

135

140

ТНг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

Н1з

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

145

150

155

160

Рго

А1а

МеЬ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

165

170

175

Азр

11е

А1а

С1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЬ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

180

185

190

Ьуз

11е

МеЬ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

195

200

205

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

11е

Суз

210

215

220

О1у

Уа1

Зег

Азр

Зег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Зег

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

225

230

235

240

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

О1у

Туг

Рго

Тгр

Тгр

Азп

Зег

Суз

Зег

Агд

11е

Ьеи

245

250

255

Азп

Туг

Рго

Ьуз

ТЬг

Зег

Агд

Рго

Тгр

Агд

А1а

Тгр

О1и

ТЬг

260

265

270

<210> 29 <211> 813 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 29 аЬддсададс дЬдсддсдсЬ ддаддадсЬд дЬдааасЬЬс адддададсд сдЬдсдаддс 60 сЬсаадсадс адааддссад сдссдадсЬд аЬсдаддадд аддЬддсдаа асЬссЬдааа 120 сЬдааддсас адсЬдддЬсс ЬдаЬдааадс ааасадаааЬ ЬЬдЬдсЬсаа аасссссаад 180 ддсасаадад асЬаЬадЬсс ссддсадаЬд дсадЬЬсдсд адааддЬдЬЬ ЬдасдЬааЬс 240 аЬссдЬЬдсЬ Ьсаадсдсса сддЬдсадаа дЬсаЬЬдаЬа сассЬдЬаЬЬ ЬдаасЬааад 300 дааасасЬда ЬдддааадЬа Ьддддаадас ЬссаадсЬЬа ЬсЬаЬдассЬ дааддассад 360 ддсддддадс ЬссЬдЬсссЬ ЬсдсЬаЬдас сЬсасЬдЬЬс сЬЬЬЬдсЬсд дЬаЬЬЬддса 420 аЬдааЬааас ЬдассаасаЬ ЬааасдсЬас сасаЬадсаа аддЬаЬаЬсд дсдддаЬаас 480 ссадссаЬда сссдЬддссд аЬассдддаа ЬЬсЬассадЬ дЬдаЬЬЬЬда саЬЬдсЬддд 540 аасЬЬЬдаЬс ссаЬдаЬссс ЬдаЬдсадад ЬдссЬдаада ЬсаЬдЬдсда даЬссЬдадЬ 600

ЬсасЬЬсада ЬаддсдасЬЬ ссЬддЬсаад дЬааасдаЬс дасдсаЬЬсЬ адаЬдддаЬд 660

ЬЬЬдсЬаЬсЬ дЬддЬдЬЬЬс Ьдасадсаад ЬЬссдЬасса ЬсЬдсЬссЬс адЬадасаад 720 сЬддасаадд ЬддддЬаЬсс сЬддЬддаас адсЬдсЬсса ддаЬссЬааа сЬаЬсссааа 780 асаадсаддс сЬЬддадддс сЬдддадасс Ьда 813 <210> 30 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното заргепз

- 134 030418 <400> 30 даааЕЕЕдЕд сЕсаааассс ссаадЕадад асдаддЕЕЕс ассаЕдЕЕдд <210> 31 <211> 8 <212> Белок <213> Ното заръепз <400> 31

Ьуз РНе Уа1 Ьеи Ьуз ТЪг Рго Ьуз 1 5 <210> 32 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното заръепз <400> 32 сЕссЕсадЕа дасаадсЕдд асааддЕддд дЕаЕсссЕдд ЕддаасадсЕ <210> 33 <211> 16 <212> Белок <213> Ното заръепз <400> 33

Бег Бег Уа1 Азр Ьуз Ьеи Азр Ьуз Уа1 О1у Туг Рго Тгр Тгр Азп Бег 1 5 10 15 <210> 34 <211> 113 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 34

МеЕ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЪе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЪг

Рго

Ьуз

О1у

ТЪг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЪе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЪг

Рго

Уа1

85

90

95

РЪе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЪг

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

100

105

110

Ьеи

<210> 35 <211> 339 <212> ДНК <213> Ното заръепз <400> 35 аЕддсададс дЕдсддсдсЕ ддаддадсЕд дЕдааасЕЕс адддададсд сдЕдсдаддс сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа

120

- 135 030418 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад ддсасаадад асЕаЕадЕсс ссддсадаЕд дсадЕЕсдсд адааддЕдЕЕ ЕдасдЕааЕс аЕссдЕЕдсЕ Есаадсдсса сддЕдсадаа дЕсаЕЕдаЕа сассЕдЕаЕЕ ЕдаасЕааад дааасасЕда ЕдддааадЕа Еддддаадас ЕссаадсЕЕ <210> 36 <211> 165 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

180

240

300

339 <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНтз

<400> 36

МеЕ

Н1з

Н1з

НФз

НФз

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

85

90

95

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

100

105

110

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

115

120

125

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

130

135

140

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

145

150

155

160

Ьеи

А1а

МеЕ

Ьеи

О1и

165 <210> 37 <211> 165 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНтз <400> 37

МеЕ

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

50

55

60

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

65

70

75

80

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

100

105

110

- 136

Зег

Ьуз

Ьеи 115

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз 120

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и 125

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеВ

Ьеи

130

135

140

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Зег

ТЬг

НЧз

145

150

155

160

НЧз

НЧз

НЧз

НЧз

НЧз

165 <210> 38 <211> 432 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНЧз <400> 38

МеВ

НЧз

НЧз

НЧз

НЧз

НЧз

НЧз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Зег

ТЬг

О1у

Зег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Зег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Зег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Зег

Рго

Агд

О1п

МеВ

А1а

Уа1

Агд

О1и

85

90

95

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НЧз

О1у

А1а

О1и

100

105

110

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеВ

О1у

Ьуз

115

120

125

Туг

О1у

О1и

Азр

Зег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

130

135

140

О1и

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

145

150

155

160

Ьеи

А1а

МеВ

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

НЧз

11е

А1а

Ьуз

165

170

175

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеВ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

180

185

190

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеВ

11е

195

200

205

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеВ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

210

215

220

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

225

230

235

240

О1у

МеВ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Зег

Азр

Зег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

245

250

255

Суз

Зег

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Зег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

260

265

270

Азп

О1и

МеВ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

275

280

285

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НЧз

О1у

О1у

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

290

295

300

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Зег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

305

310

315

320

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

325

330

335

Азр

Азр

Ьуз

11е

Зег

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

- 137

340

345

350

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

355

3б0

3б5

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

С1у

С1у

370

375

380

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЬ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

С1у

Агд

Ьуз

Уа1

385

390

395

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

405

410

415

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

Ьеи

420

425

430

О1п

Агд

Рго

400

О1и

О1и <210> 39 <211> 432 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку бхНФз

<400> 39

МеЬ

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

С1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

50

55

б0

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

б5

70

75

80

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

100

105

110

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

115

120

125

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

130

135

140

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

НФз

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

145

150

155

1б0

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЬ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

1б5

170

175

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЬ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

180

185

190

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЬ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

195

200

205

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

210

215

220

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

225

230

235

240

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

245

250

255

С1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

2б0

2б5

270

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

275

280

285

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

290

295

300

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

305

310

315

320

- 138

Бег

РИе

Азр

Ьеи

Бег Ьеи А1а Агд О1у Ьеи Азр

Туг Туг ТЬг О1у 335

Уа1

325

330

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

340

345

350

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

355

3б0

3б5

Уа1

О1у

МеЬ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

370

375

380

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

385

390

395

400

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

405

410

415

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

Н1з

НФз

НФз

Нтз

Нтз

Нтз

420

425

430

<210> 40 <211> 137 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий
Ν-концевую аффинную метку бхНтз
<400> 40
МеЬ Н1з Н1з Н1з Н1з	НФз НФз О1у Ьуз Рго 11е Рго Азп Рго Ьеи Ьеи
1 5	10 15
О1у Ьеи Азр Бег ТЬг	О1у Бег А1а О1и Агд А1а А1а Ьеи О1и О1и Ьеи
20	25 30
Уа1 Ьуз Ьеи О1п О1у	О1и Агд Уа1 Агд О1у Ьеи Ьуз О1п О1п Ьуз А1а
35	40 45
Бег А1а О1и Ьеи 11е	О1и О1и О1и Уа1 А1а Ьуз Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьуз
50	55 60
А1а О1п Ьеи О1у Рго	Азр О1и Бег Ьуз О1п Ьуз РЬе Уа1 Ьеи Ьуз ТЬг
б5	70 75 80
Рго Ьуз О1у ТЬг Агд	Азр Туг Бег Рго Агд О1п МеЬ А1а Уа1 Агд О1и
85	90 95
Ьуз Уа1 РЬе Азр Уа1	11е 11е Агд Суз РЬе Ьуз Агд Н1з О1у А1а О1и
100	105 110
Уа1 11е Азр ТЬг Рго	Уа1 РЬе О1и Ьеи Ьуз О1и ТЬг Ьеи МеЬ О1у Ьуз
115	120 125
Туг О1у О1и Азр Бег	Ьуз Ьеи Ьеи О1и
130	135

<210> 41 <211> 137 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку бхНтз <400> 41

МеЬ

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

- 139

55 60

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

65

70

75

80

ναι

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

100

105

110

Бег

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

115

120

125

Азр

Бег

ТЬг

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

130 135 <210> 42 <211> 294 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНтз <400> 42

МеЬ

Н1з

Н1з

Н1з

Н1з

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

85

90

95

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

100

105

110

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

115

120

125

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

130

135

140

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

145

150

155

160

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

НФз

11е

А1а

Ьуз

165

170

175

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЬ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

180

185

190

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЬ

11е

195

200

205

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЬ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

210

215

220

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

225

230

235

240

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

245

250

255

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

О1у

Туг

Рго

Тгр

Тгр

Азп

260

265

270

Бег

Суз

Бег

Агд

11е

Ьеи

Азп

Туг

Рго

Ьуз

ТЬг

Бег

Агд

Рго

Тгр

Агд

275

280

285

А1а

Тгр

О1и

ТЬг

Ьеи

О1и

290

- 140 <210> 43 <211> 294 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку бхНФз <400> 43

МеЕ

О1у Бег

А1а

О1и

Агд А1а А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

50

55

60

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

65

70

75

80

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

100

105

110

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

115

120

125

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЕ

Азп

130

135

140

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

НФз

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

145

150

155

160

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЕ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

165

170

175

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

180

185

190

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

195

200

205

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

210

215

220

11е

Суз

С1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

225

230

235

240

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

О1у

Туг

Рго

Тгр

Тгр

Азп

Бег

Суз

Бег

Агд

245

250

255

11е

Ьеи

Азп

Туг

Рго

Ьуз

ТЬг

Бег

Агд

Рго

Тгр

Агд

А1а

Тгр

О1и

ТЬг

260

265

270

Ьеи

О1и

С1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

275

280

285

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

290

<210> 44 <211> 432 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 44 ддаЕссдсад аасдЕдссдс ссЕддаадад сЕддЕаааас Едсааддсда дсдЕдЕЕсдЕ 60 ддЕсЕдааас адсадааадс аадсдсЕдаа сЕдаЕсдаад аадаадЕддс дааасЕдсЕд 120 ааасЕдааад сасадсЕддд ЕссЕдаЕдаа Есаааасааа ааЕЕсдЕссЕ даааасЕссд 180 аааддаассс дЕдасЕаЕЕс ЕссЕсдЕсаа аЕддссдЕсс дЕдааааадЕ дЕЕсдасдЕд 240

- 141 030418 а5са55сдс5 дс555ааасд ссаРддБдсс даадБдаББд аБассссддБ дБББдадсБд 300 ааададасас БдаБдддсаа аБаБддБдад дасадсааас БдаБББаБда ссБдааадаБ 360 садддБддБд аасБдсБдад БсБдсдсБаБ даБсБдасад 55ссд555дс ссдББаБсБд 420 дсааРдсБсд ад 432 <210> 45 <211> 1233 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 45 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад с5дд5аааас Бдсааддсда дсд5д55сд5 60 дд5с5дааас адсадааадс аадсдсБдаа с5да5сдаад аадаадБддс дааас5дс5д 120 ааасБдааад сасадсБддд 5сс5да5даа Бсаааасааа аа55сд5сс5 даааасБссд 180 аааддаассс д5дас5а55с 5сс5сд5саа аРддссдБсс дБдааааадБ д55сдасд5д 240 а5са55сдс5 дс555ааасд ссаРддБдсс даад5да55д аБассссддБ д555дадс5д 300 ааададасас БдаБдддсаа а5а5дд5дад дасадсааас 5да555а5да ссБдааадаБ 360 садддРддБд аасРдсБдад 5с5дсдс5а5 даРсБдасад 55ссд555дс ссд55а5с5д 420 дсааРдааБа аасБдассаа саШааасдс 5а5саса55д с5ааад5с5а БсдссдБдас 480 аа5сс5дс5а БдасссдБдд 5сд55а5сд5 дад55с5а5с ад5д5дас55 сда5а55дсс 540 ддсаас555д а5ссда5да5 сссддаБдсБ даа5дсс5да ааа5са5д5д 5дада5сс5д 600 адсадРсБдс адаДДддсда 555сс5дд5д ааадБсаасд а5сдссд5а5 5с5дда5ддс 660 аДдДДсдсса 5с5д5дд5д5 БадсдасБсс ааа55ссд5а сса5с5д5ад 5ад5д5ддас 720 ааасРддаБа аадРдадсБд ддаддаддБд ааааасдааа БддБдддсда дааадд5с5д 780 дсРссБдаад БддсБдассд 5а55дд5да5 5а5д5ссадс адсасддБдд ад5а5сас5д 840 дДДдадсаас БдсБдсаада ссс5ааас5д ад5садаа5а аасаддсссБ ддадддасБд 900 ддадаРсБда аас5дс5д55 сдад5а5с5д асссДдДДсд д5а5сда5да саааа5с5сс 960

555дасс5д5 сасРддсБсд БддасБддас 5а55а5ассд дсд5да5с5а 5даадс5д5а 1020 сРдсБдсааа сБссадсаса адсаддБдаа дадссРсБдд д5д5ддд5ад 5д5адссдс5 1080 дддддасдШ а5да5ддас5 дд5дддда5д 55сдассс5а ааддссдБаа ад55ссд5д5 1140 д5ддд5с5да д5а5сдд5д5 5дадсд5а5с 5555сса5сд Бсдадсаасд БсБддаадса 1200 сБддаддааа ааа5ссд5ас дассдаасБс дад 1233 <210> 46 <211> 348 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 46 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад с5дд5аааас Бдсааддсда дсд5д55сд5 60 ддРсБдааас адсадааадс аадсдсБдаа с5да5сдаад аадаадБддс дааас5дс5д 120 ааасБдааад сасадсБддд 5сс5да5даа Бсаааасааа аа55сд5сс5 даааасБссд 180 аааддаассс д5дас5а55с 5сс5сд5саа аРддссдБсс дБдааааадБ д55сдасд5д 240 а5са55сдс5 дс555ааасд ссаРддБдсс даад5да55д аБассссддБ д555дадс5д 300 ааададасас БдаБдддсаа а5а5дд5дад дасадсааас БдсБсдад 348 <210> 47 <211> 819 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 47 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад с5дд5аааас Бдсааддсда дсд5д55сд5 60 ддРсБдааас адсадааадс аадсдсБдаа с5да5сдаад аадаадБддс дааас5дс5д 120

- 142 030418 ааасЕдааад сасадсЕддд ЕссЕдаЕдаа Есаааасааа ааЕЕсдЕссЕ даааасЕссд 180 аааддаассс дЕдасЕаЕЕс ЕссЕсдЕсаа аЕддссдЕсс дЕдааааадЕ дЕЕсдасдЕд 240 аЕсаЕЕсдсЕ дсЕЕЕааасд ссаЕддЕдсс даадЕдаЕЕд аЕассссддЕ дЕЕЕдадсЕд 300 ааададасас ЕдаЕдддсаа аЕаЕддЕдад дасадсааас ЕдаЕсЕаЕда ссЕдааадас 360 сааддсддЕд аасЕдсЕдЕс ссЕдсдЕЕаЕ даЕсЕдасЕд ЕдссдЕЕЕдс ссдЕЕаЕсЕд 420 дссаЕдааЕа аасЕдасдаа саЕЕааасдс ЕаЕсасаЕЕд ссааадЕдЕа ЕсдссдЕдас 480 ааЕссЕдсЕа ЕдасЕсдЕдд асдЕЕаЕсдЕ дааЕЕсЕаЕс адЕдЕдасЕЕ сдаЕаЕЕдсс 540 ддсаасЕЕсд асссЕаЕдаЕ ЕссддаЕдсЕ дааЕдссЕда аааЕсаЕдЕд ЕдадаЕссЕд 600 адсадссЕдс аааЕЕддЕда сЕЕссЕддЕд ааадЕдааЕд ассдЕсдЕаЕ ссЕддаЕддс 660 аЕдЕЕЕдсса ЕЕЕдЕддЕдЕ дадсдаЕЕсс аааЕЕссдЕа ссаЕсЕдЕад ЕадЕдЕддас 720 ааасЕддаЕа аадЕдддсЕа ЕссдЕддЕдд аасЕсЕЕдЕа дссдЕаЕЕсЕ даасЕаЕссЕ 780 аааассадсс дсссдЕддсд ЕдсЕЕдддаа асЕсЕсдад 819 <210> 48 <211> 395 <212> Белок <213> Ното зартепз

<400> 48

МеЕ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

Азр

РЬе

Азр

11е

50

55

60

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

85

90

95

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

100

105

110

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

115

120

125

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

130

135

140

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Н1з

145

150

155

160

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

165

170

175

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

180

185

190

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

195

200

205

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

210

215

220

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

225

230

235

240

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЕ

РЬе

245

250

255

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

260

265

270

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

275

280

285

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

290

295

300

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

305

310

315

320

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

325

330

335

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

- 143

340

345

350

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТНг

355

360

365

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

370

375

380

Ьуз

Агд

Агд

ТНг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

385

390

395

<210> 49 <211> 1188 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 49 аЕддсададс дЕдсддсдсЕ ддаддадсЕд дЕдааасЕЕс адддададсд сдЕдсдаддс 60 сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа 120 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад 180 даЕЕЕЕдаса ЕЕдсЕдддаа сЕЕЕдаЕссс аЕдаЕсссЕд аЕдсададЕд ссЕдаадаЕс 240 аЕдЕдсдада ЕссЕдадЕЕс асЕЕсадаЕа ддсдасЕЕсс ЕддЕсааддЕ ааасдаЕсда 300 сдсаЕЕсЕад аЕдддаЕдЕЕ ЕдсЕаЕсЕдЕ ддЕдЕЕЕсЕд асадсаадЕЕ ссдЕассаЕс 360

ЕдсЕссЕсад ЕадасаадсЕ ддасааддЕд ЕссЕдддаад аддЕдаадаа ЕдадаЕддЕд 420 ддададаадд дссЕЕдсасс ЕдаддЕддсЕ дассдсаЕЕд дддасЕаЕдЕ ссадсаасаЕ 480 ддЕддддЕаЕ сссЕддЕдда асадсЕдсЕс саддаЕссЕа аасЕаЕссса ааасаадсад 540 дссЕЕддадд дссЕдддада ссЕдаадЕЕд сЕсЕЕЕдадЕ ассЕдасссЕ аЕЕЕддсаЕЕ 600 даЕдасаааа ЕсЕссЕЕЕда ссЕдадссЕЕ дсЕсдадддс ЕддаЕЕасЕа сасЕддддЕд 660 аЕсЕаЕдадд садЕдсЕдсЕ асадасссса дсссаддсад дддаададсс ссЕдддЕдЕд 720 ддсадЕдЕдд сЕдсЕддадд асдсЕаЕдаЕ дддсЕадЕдд дсаЕдЕЕсда ссссаааддд 780 сдсааддЕдс саЕдЕдЕддд дсЕсадсаЕЕ ддддЕддадс ддаЕЕЕЕсЕс саЕсдЕддаа 840 сададасЕад аддсЕЕЕдда ддадаадаЕа сддассасдд адасасаддЕ дсЕЕдЕддса 900

ЕсЕдсасада адаадсЕдсЕ ададдааада сЕааадсЕЕд ЕсЕсадаасЕ дЕдддаЕдсЕ 960 дддаЕсаадд сЕдадсЕдсЕ дЕасаадаад аасссааадс ЕасЕдаасса дЕЕасадЕас 1020

ЕдЕдаддадд саддсаЕссс асЕддЕддсЕ аЕсаЕсддсд адсаддаасЕ сааддаЕддд 1080 дЕсаЕсаадс ЕссдЕЕсадЕ дасдадсадд даададдЕдд аЕдЕссдаад адаадассЕЕ 1140 дЕддаддааа Есааааддад аасаддссад ссссЕсЕдса ЕсЕдсЕда 1188 <210> 50 <211> 359 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 50

МеЕ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

50

55

60

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

65

70

75

80

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

85

90

95

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

100

105

110

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Н1з

О1у

О1у

Уа1

Бег

115

120

125

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

130

135

140

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

145

150

155

160

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

- 144

165

170

175

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

180

185

190

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

195

200

205

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

Меб

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

210

215

220

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

225

230

235

240

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

245

250

255

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

260

265

270

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

275

280

285

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

290

295

300

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

305

310

315

320

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

325

330

335

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

340

345

350

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

355

<210> 51 <211> 1080 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 51 абддсададс сбсаадсадс сбдааддсас дбааасдабс ббссдбасса аабдадабдд дбссадсаас саааасаадс сбабббддса басасбдддд ссссбдддбд дассссааад бссабсдбдд дбдсббдбдд сбдбдддабд садббасадб сбсааддабд ададаадасс дбдсддсдсб адааддссад адсбдддбсс дасдсаббсб бсбдсбссбс бдддададаа абддбддддб аддссббдда ббдабдасаа бдабсбабда бдддсадбдб ддсдсааддб аасададасб сабсбдсаса сбдддабсаа асбдбдадда дддбсабсаа ббдбддадда ддаддадсбд сдссдадсбд бдабдааадс адабдддабд адбадасаад дддссббдса абсссбддбд дддссбддда аабсбссббб ддсадбдсбд ддсбдсбдда дссабдбдбд ададдсбббд даадаадсбд ддсбдадсбд ддсаддсабс дсбссдббса аабсаааадд дбдааасббс абсдаддадд ааасадаааб бббдсбабсб сбддасаадд ссбдаддбдд даасадсбдс дассбдаадб дассбдадсс сбасадассс ддасдсбабд дддсбсадса даддадаада сбададдааа сбдбасаада ссасбддбдд дбдасдадса адаасаддсс адддададсд аддбддсдаа ббдбдсбсаа дбддбдбббс бдбссбддда сбдассдсаб бссаддабсс бдсбсбббда ббдсбсдадд садсссаддс абдддсбадб ббддддбдда басддассас дасбааадсб адаасссааа сбабсабсдд дддаададдб адссссбсбд сдбдсдаддс асбссбдааа аасссссаад бдасадсаад ададдбдаад бддддасбаб бааасбабсс дбассбдасс дсбддаббас аддддаадад дддсабдббс дсддаббббс ддадасасад бдбсбсадаа дсбасбдаас сдадсаддаа ддабдбссда сабсбдсбда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080 <210> 52 <211> 399 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 52

Меб А1а О1и Агд А1а А1а Ьеи О1и О1и Ьеи Уа1 Ьуз Ьеи О1п О1у О1и 1 5 10 15

Агд Уа1 Агд О1у Ьеи Ьуз О1п О1п Ьуз А1а Бег А1а О1и Ьеи 11е О1и

- 145 030418

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЪе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЪг

Рго

Ьуз

О1у

ТЪг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЪе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЪг

Рго

Уа1

85

90

95

РЪе

О1и

Ьеи

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЪе

А1а

100

105

110

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЪе

Агд

ТЪг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

115

120

125

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

130

135

140

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

145

150

155

160

Уа1

О1п

О1п

Н1з

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

165

170

175

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

180

185

190

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЪе

О1и

Туг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

РЪе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

195

200

205

Бег

РЪе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЪг

О1у

Уа1

210

215

220

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЪг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

225

230

235

240

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

245

250

255

Уа1

О1у

МеЕ

РЪе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

260

265

270

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЪе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

275

280

285

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЪг

ТЪг

О1и

ТЪг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

290

295

300

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

305

310

315

320

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

325

330

335

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

340

345

350

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

355

360

365

Агд

Бег

Уа1

ТЪг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

370

375

380

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЪг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

385 390 395 <210> 53 <211> 1200 <212> ДНК <213> Ното заръепз <400> 53 аЕддсададс дЕдсддсдсЕ ддаддадсЕд дЕдааасЕЕс адддададсд сдЕдсдаддс 60 сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа 120 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад 180 ддсасаадад асЕаЕадЕсс ссддсадаЕд дсадЕЕсдсд адааддЕдЕЕ ЕдасдЕааЕс 240 аЕссдЕЕдсЕ Есаадсдсса сддЕдсадаа дЕсаЕЕдаЕа сассЕдЕаЕЕ ЕдаасЕааад 300 дЕааасдаЕс дасдсаЕЕсЕ адаЕдддаЕд ЕЕЕдсЕаЕсЕ дЕддЕдЕЕЕс Едасадсаад 360

ЕЕссдЕасса ЕсЕдсЕссЕс адЕадасаад сЕддасаадд ЕдЕссЕддда ададдЕдаад 420 ааЕдадаЕдд Едддададаа дддссЕЕдса ссЕдаддЕдд сЕдассдсаЕ ЕддддасЕаЕ 480

- 146 030418 дБссадсаас аБддБддддБ аБсссБддБд даасадсБдс БссаддаБсс БааасБаБсс 540 саааасаадс аддссББдда дддссБддда дассБдаадБ БдсБсБББда дБассБдасс 600 сБаБББддса ББдаБдасаа ааБсБссБББ дассБдадсс ББдсБсдадд дсБддаББас 660

БасасБдддд БдаБсБаБда ддсадБдсБд сБасадассс садсссаддс аддддаадад 720 ссссБдддБд БдддсадБдБ ддсБдсБдда ддасдсБаБд аБдддсБадБ дддсаБдББс 780 дассссааад ддсдсааддБ дссаБдБдБд дддсБсадса ББддддБдда дсддаББББс 840

БссаБсдБдд аасададасБ ададдсБББд даддадаада Басддассас ддадасасад 900 дБдсББдБдд саБсБдсаса даадаадсБд сБададдааа дасБааадсБ БдБсБсадаа 960 сБдБдддаБд сБдддаБсаа ддсБдадсБд сБдБасаада адаасссааа дсБасБдаас 1020 садББасадБ асБдБдадда ддсаддсаБс ссасБддБдд сБаБсаБсдд сдадсаддаа 1080 сБсааддаБд дддБсаБсаа дсБссдББса дБдасдадса дддаададдБ ддаБдБссда 1140 ададаадасс ББдБддадда ааБсаааадд адаасаддсс адссссБсБд саБсБдсБда 1200 <210> 54 <211> 473 <212> Белок <213> Ното зартепз <400> 54

МеБ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Буз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Беи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Буз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеБ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Буз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

85

90

95

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеБ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Буз

100

105

110

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Беи

Бег

Беи

Агд

115

120

125

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеБ

Азп

Буз

Беи

130

135

140

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

Н1з

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

145

150

155

160

Рго

А1а

МеБ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

Уа1

Азп

165

170

175

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеБ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

180

185

190

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

195

200

205

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеБ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

210

215

220

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Н1з

О1у

О1у

225

230

235

240

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Буз

Беи

Бег

О1п

Азп

245

250

255

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Беи

Беи

РЬе

О1и

Туг

260

265

270

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Буз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

275

280

285

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

290

295

300

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

305

310

315

320

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеБ

РЬе

Азр

Рго

325

330

335

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Беи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

- 147

340

345

350

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

355

360

365

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

370

375

380

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

385

390

395

400

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

405

410

415

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

420

425

430

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

435

440

445

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

450

455

460

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

465

470

<210> 55 <211> 1422 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 55 а+ддсададс д+дсддсдс+ ддаддадс+д д+дааас++с адддададсд сд+дсдаддс 60 с+саадсадс адааддссад сдссдадс+д а+сдаддадд адд+ддсдаа ас+сс+дааа 120 с+дааддсас адс+ддд+сс +да+дааадс ааасадааа+ ++д+дс+саа аасссссаад 180 ддсасаадад ас+а+ад+сс ссддсада+д дсад++сдсд адаадд+д++ +дасд+аа+с 240 а+ссд++дс+ +саадсдсса сдд+дсадаа д+са++да+а сасс+д+а++ +даас+ааад 300 дааасас+да +дддааад+а +ддддаадас +ссаадс++а +с+а+дасс+ дааддассад 360 ддсддддадс +сс+д+ссс+ +сдс+а+дас с+сас+д++с с++++дс+сд д+а+++ддса 420 а+даа+ааас +дассааса+ +ааасдс+ас саса+адсаа адд+а+а+сд дсддда+аас 480 ссадсса+да сссд+ддссд а+ассдддаа ++с+ассад+ д+д+ааасда +сдасдса++ 540 с+ада+ддда +д+++дс+а+ с+д+дд+д++ +с+дасадса ад++ссд+ас са+с+дс+сс 600 +сад+адаса адс+ддасаа дд+д+сс+дд даададд+да адаа+дада+ дд+дддадад 660 аадддсс++д сасс+дадд+ ддс+дассдс а++ддддас+ а+д+ссадса аса+дд+ддд 720 д+а+ссс+дд +ддаасадс+ дс+ссадда+ сс+ааас+а+ сссаааасаа дсаддсс++д 780 дадддсс+дд дадасс+даа д++дс+с+++ дад+асс+да ссс+а+++дд са++да+дас 840 аааа+с+сс+ ++дасс+дад сс++дс+сда дддс+дда++ ас+асас+дд дд+да+с+а+ 900 даддсад+дс +дс+асадас сссадсссад дсаддддаад адсссс+ддд +д+дддсад+ 960 д+ддс+дс+д даддасдс+а +да+дддс+а д+дддса+д+ +сдассссаа адддсдсаад 1020 д+дсса+д+д +ддддс+сад са++дддд+д дадсдда+++ +с+сса+сд+ ддаасадада 1080 с+ададдс++ +ддаддадаа да+асддасс асддадасас адд+дс++д+ ддса+с+дса 1140 садаадаадс +дс+ададда аадас+ааад с++д+с+сад аас+д+ддда +дс+ддда+с 1200 ааддс+дадс +дс+д+асаа даадаассса аадс+ас+да ассад++аса д+ас+д+дад 1260 даддсаддса +сссас+дд+ ддс+а+са+с ддсдадсадд аас+саадда +дддд+са+с 1320 аадс+ссд++ сад+дасдад садддаадад д+дда+д+сс даададаада сс++д+ддад 1380 дааа+саааа ддадаасадд ссадсссс+с +дса+с+дс+ да 1422 <210> 56 <211> 469 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 56

Ме+ 1

А1а О1и

Агд А1а А1а 5

Ьеи О1и О1и

Ьеи Уа1 10

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у 15

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

- 148

О1и

Зег 50

Ьуз

О1п

Ьуз

РНе Уа1 55

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз 60

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Зег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

65

70

75

80

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

85

90

95

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

Н1з

11е

100

105

110

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЬ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

115

120

125

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

130

135

140

МеЬ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЬ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Зег

145

150

155

160

Зег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

165

170

175

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Зег

Азр

Зег

Ьуз

РЬе

Агд

180

185

190

ТЬг

11е

Суз

Зег

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Зег

Тгр

О1и

О1и

195

200

205

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

210

215

220

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Н1з

О1у

О1у

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

225

230

235

240

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Зег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

245

250

255

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

260

265

270

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Зег

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

275

280

285

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

290

295

300

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Зег

Уа1

А1а

А1а

О1у

305

310

315

320

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЬ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

325

330

335

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Зег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Зег

11е

340

345

350

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

355

360

365

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

370

375

380

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Зег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

385

390

395

400

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

405

410

415

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

420

425

430

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

Уа1

ТЬг

Зег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

435

440

445

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

450

455

460

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

465

<210> 57 <211> 1410 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 57 аЬддсададс дЬдсддсдсЬ ддаддадсЬд дЬдааасЬЬс адддададсд сдЬдсдаддс 60

- 149 030418 сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа 120 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад 180 дааасасЕда ЕдддааадЕа Еддддаадас ЕссаадсЕЕа ЕсЕаЕдассЕ дааддассад 240 ддсддддадс ЕссЕдЕсссЕ ЕсдсЕаЕдас сЕсасЕдЕЕс сЕЕЕЕдсЕсд дЕаЕЕЕддса 300 аЕдааЕааас ЕдассаасаЕ ЕааасдсЕас сасаЕадсаа аддЕаЕаЕсд дсдддаЕаас 360 ссадссаЕда сссдЕддссд аЕассдддаа ЕЕсЕассадЕ дЕдаЕЕЕЕда саЕЕдсЕддд 420 аасЕЕЕдаЕс ссаЕдаЕссс ЕдаЕдсадад ЕдссЕдаада ЕсаЕдЕдсда даЕссЕдадЕ 480

ЕсасЕЕсада ЕаддсдасЕЕ ссЕддЕсаад дЕааасдаЕс дасдсаЕЕсЕ адаЕдддаЕд 540

ЕЕЕдсЕаЕсЕ дЕддЕдЕЕЕс Едасадсаад ЕЕссдЕасса ЕсЕдсЕссЕс адЕадасаад 600 сЕддасаадд ЕдЕссЕддда ададдЕдаад ааЕдадаЕдд Едддададаа дддссЕЕдса 660 ссЕдаддЕдд сЕдассдсаЕ ЕддддасЕаЕ дЕссадсаас аЕддЕддддЕ аЕсссЕддЕд 720 даасадсЕдс ЕссаддаЕсс ЕааасЕаЕсс саааасаадс аддссЕЕдда дддссЕддда 780 дассЕдаадЕ ЕдсЕсЕЕЕда дЕассЕдасс сЕаЕЕЕддса ЕЕдаЕдасаа ааЕсЕссЕЕЕ 840 дассЕдадсс ЕЕдсЕсдадд дсЕддаЕЕас ЕасасЕдддд ЕдаЕсЕаЕда ддсадЕдсЕд 900 сЕасадассс садсссаддс аддддаадад ссссЕдддЕд ЕдддсадЕдЕ ддсЕдсЕдда 960 ддасдсЕаЕд аЕдддсЕадЕ дддсаЕдЕЕс дассссааад ддсдсааддЕ дссаЕдЕдЕд 1020 дддсЕсадса ЕЕддддЕдда дсддаЕЕЕЕс ЕссаЕсдЕдд аасададасЕ ададдсЕЕЕд 1080 даддадаада Еасддассас ддадасасад дЕдсЕЕдЕдд саЕсЕдсаса даадаадсЕд 1140 сЕададдааа дасЕааадсЕ ЕдЕсЕсадаа сЕдЕдддаЕд сЕдддаЕсаа ддсЕдадсЕд 1200 сЕдЕасаада адаасссааа дсЕасЕдаас садЕЕасадЕ асЕдЕдадда ддсаддсаЕс 1260 ссасЕддЕдд сЕаЕсаЕсдд сдадсаддаа сЕсааддаЕд дддЕсаЕсаа дсЕссдЕЕса 1320 дЕдасдадса дддаададдЕ ддаЕдЕссда ададаадасс ЕЕдЕддадда ааЕсаааадд 1380 адаасаддсс адссссЕсЕд саЕсЕдсЕда 1410 <210> 58 <211> 435 <212> Белок <213> Ното заряепз <400> 58

МеЕ

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

1

5

10

15

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

Няз

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

85

90

95

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

100

105

110

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

115

120

125

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

130

135

140

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

145

150

155

160

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

165

170

175

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

180

185

190

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Няз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

195

200

205

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

210

215

220

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

225

230

235

240

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

245

250

255

- 150

Туг ТЬг

О1у

Уа1 260

11е

Туг О1и А1а Уа1 265

Ьеи

Ьеи О1п ТЬг

Рго 270

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

275

280

285

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЕ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

290

295

300

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

305

310

315

320

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

325

330

335

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

340

345

350

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

355

360

365

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

370

375

380

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

385

390

395

400

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

405

410

415

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

420

425

430

Суз

11е

Суз

435

<210> 59 <211> 1308 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 59 аЕддсададс дЕдсддсдсЕ ддаддадсЕд дЕдааасЕЕс адддададсд сдЕдсдаддс 60 сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа 120 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад 180 ддсасаадад асЕаЕадЕсс ссддсадаЕд дсадЕЕсдсд адааддЕдЕЕ ЕдасдЕааЕс 240 аЕссдЕЕдсЕ Есаадсдсса сддЕдсадаа дЕсаЕЕдаЕа сассЕдЕаЕЕ ЕдаасЕааад 300 даЕЕЕЕдаса ЕЕдсЕдддаа сЕЕЕдаЕссс аЕдаЕсссЕд аЕдсададЕд ссЕдаадаЕс 360 аЕдЕдсдада ЕссЕдадЕЕс асЕЕсадаЕа ддсдасЕЕсс ЕддЕсааддЕ ааасдаЕсда 420 сдсаЕЕсЕад аЕдддаЕдЕЕ ЕдсЕаЕсЕдЕ ддЕдЕЕЕсЕд асадсаадЕЕ ссдЕассаЕс 480

ЕдсЕссЕсад ЕадасаадсЕ ддасааддЕд ЕссЕдддаад аддЕдаадаа ЕдадаЕддЕд 540 ддададаадд дссЕЕдсасс ЕдаддЕддсЕ дассдсаЕЕд дддасЕаЕдЕ ссадсаасаЕ 600 ддЕддддЕаЕ сссЕддЕдда асадсЕдсЕс саддаЕссЕа аасЕаЕссса ааасаадсад 660 дссЕЕддадд дссЕдддада ссЕдаадЕЕд сЕсЕЕЕдадЕ ассЕдасссЕ аЕЕЕддсаЕЕ 720 даЕдасаааа ЕсЕссЕЕЕда ссЕдадссЕЕ дсЕсдадддс ЕддаЕЕасЕа сасЕддддЕд 780 аЕсЕаЕдадд садЕдсЕдсЕ асадасссса дсссаддсад дддаададсс ссЕдддЕдЕд 840 ддсадЕдЕдд сЕдсЕддадд асдсЕаЕдаЕ дддсЕадЕдд дсаЕдЕЕсда ссссаааддд 900 сдсааддЕдс саЕдЕдЕддд дсЕсадсаЕЕ ддддЕддадс ддаЕЕЕЕсЕс саЕсдЕддаа 960 сададасЕад аддсЕЕЕдда ддадаадаЕа сддассасдд адасасаддЕ дсЕЕдЕддса 1020

ЕсЕдсасада адаадсЕдсЕ ададдааада сЕааадсЕЕд ЕсЕсадаасЕ дЕдддаЕдсЕ 1080 дддаЕсаадд сЕдадсЕдсЕ дЕасаадаад аасссааадс ЕасЕдаасса дЕЕасадЕас 1140

ЕдЕдаддадд саддсаЕссс асЕддЕддсЕ аЕсаЕсддсд адсаддаасЕ сааддаЕддд 1200 дЕсаЕсаадс ЕссдЕЕсадЕ дасдадсадд даададдЕдд аЕдЕссдаад адаадассЕЕ 1260 дЕддаддааа Есааааддад аасаддссад ссссЕсЕдса ЕсЕдсЕда 1308 <210> 60 <211> 171 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 60

МеЕ А1а О1и Агд А1а А1а Ьеи О1и О1и Ьеи Уа1 Ьуз Ьеи О1п О1у О1и 1 5 10 15

- 151 030418

Агд Уа1

Агд

О1у 20

Ьеи

Ьуз

О1п О1п Ьуз 25

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи 30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЪе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЪг

Рго

Ьуз

А1а

Ьеи

О1и

О1и

50

55

60

Ьуз

11е

Агд

ТЪг

ТЪг

О1и

ТЪг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

65

70

75

80

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

85

90

95

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

100

105

110

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

115

120

125

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЪг

130

135

140

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

145

150

155

160

Ьуз

Агд

Агд

ТЪг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

165 170 <210> 61 <211> 516 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 61 аЕддсададс дЕдсддсдсЕ ддаддадсЕд дЕдааасЕЕс адддададсд сдЕдсдаддс 60 сЕсаадсадс адааддссад сдссдадсЕд аЕсдаддадд аддЕддсдаа асЕссЕдааа 120 сЕдааддсас адсЕдддЕсс ЕдаЕдааадс ааасадаааЕ ЕЕдЕдсЕсаа аасссссаад 180 дсЕЕЕддадд адаадаЕасд дассасддад асасаддЕдс ЕЕдЕддсаЕс Едсасадаад 240 аадсЕдсЕад аддааадасЕ ааадсЕЕдЕс ЕсадаасЕдЕ дддаЕдсЕдд даЕсааддсЕ 300 дадсЕдсЕдЕ асаадаадаа сссааадсЕа сЕдаассадЕ ЕасадЕасЕд Едаддаддса 360 ддсаЕсссас ЕддЕддсЕаЕ саЕсддсдад саддаасЕса аддаЕддддЕ саЕсаадсЕс 420 сдЕЕсадЕда сдадсаддда ададдЕддаЕ дЕссдаадад аадассЕЕдЕ ддаддаааЕс 480 ааааддадаа саддссадсс ссЕсЕдсаЕс ЕдсЕда 516 <210> 62 <211> 211 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 62

МеЕ 1

А1а

О1и

Агд А1а А1а 5

Ьеи

О1и О1и

Ьеи 10

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у 15

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

20

25

30

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

35

40

45

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЪе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЪг

Рго

Ьуз

О1у

ТЪг

Агд

Азр

50

55

60

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЪе

Азр

Уа1

11е

65

70

75

80

11е

Агд

Суз

РЪе

Ьуз

Агд

Н1з

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЪг

Рго

Уа1

85

90

95

РЪе

О1и

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЪг

ТЪг

О1и

ТЪг

О1п

100

105

110

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

115

120

125

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

130

135

140

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

- 152

145

150

155

160

О1у

11е

Рго

Ьей

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьей

Ьуз

Азр

О1у

165

170

175

Уа1

11е

Ьуз

Ьей

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

180

185

190

Агд

О1и

Азр

Ьей

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьей

195

200

205

Суз 11е Суз 210 <210> 63 <211> 636 <212> ДНК <213> Ното зардепз <400> 63 аБддсададс дБдсддсдсБ ддаддадсБд дБдааасББс адддададсд сдБдсдаддс 60 сБсаадсадс адааддссад сдссдадсБд аБсдаддадд аддБддсдаа асБссБдааа 120 сБдааддсас адсБдддБсс БдаБдааадс ааасадаааБ ББдБдсБсаа аасссссаад 180 ддсасаадад асБаБадБсс ссддсадаБд дсадББсдсд адааддБдББ БдасдБааБс 240 аБссдББдсБ Бсаадсдсса сддБдсадаа дБсаББдаБа сассБдБаББ БдаасБааад 300 дсБББддадд адаадаБасд дассасддад асасаддБдс ББдБддсаБс Бдсасадаад 360 аадсБдсБад аддааадасБ ааадсББдБс БсадаасБдБ дддаБдсБдд даБсааддсБ 420 дадсБдсБдБ асаадаадаа сссааадсБа сБдаассадБ БасадБасБд Бдаддаддса 480 ддсаБсссас БддБддсБаБ саБсддсдад саддаасБса аддаБддддБ саБсаадсБс 540 сдББсадБда сдадсаддда ададдБддаБ дБссдаадад аадассББдБ ддаддаааБс 600 ааааддадаа саддссадсс ссБсБдсаБс БдсБда 636 <210> 64 <211> 141 <212> Белок <213> Ното зардепз <400> 64

МеБ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьей

Бег

11е

1

5

10

15

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьей

О1и

А1а

Ьей

20

25

30

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьей

Уа1

А1а

Бег

А1а

35

40

45

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьей

Ьей

О1и

О1и

Агд

Ьей

Ьуз

Ьей

Уа1

Бег

О1и

Ьей

Тгр

50

55

60

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьей

Ьей

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьей

65

70

75

80

Ьей

Азп

О1п

Ьей

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьей

Уа1

А1а

85

90

95

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьей

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьей

Агд

Бег

100

105

110

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьей

Уа1

О1и

115

120

125

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьей

Суз

11е

Суз

130

135

140

<210> 65 <211> 426 <212> ДНК <213> Ното зардепз <400> 65 аБдББсдасс ссааадддсд сааддБдсса БдБдБддддс БсадсаББдд ддБддадсдд 60

- 153 030418

аЬЬЬЬсЬсса	ЬсдЬддааса	дадасЬадад	дсЬЬЬддадд	адаадаЬасд	дассасддад	120
асасаддЬдс	ЬЬдЬддсаЬс	Ьдсасадаад	аадсЬдсЬад	аддааадасЬ	ааадсЬЬдЬс	180
ЬсадаасЬдЬ	дддаЬдсЬдд	даЬсааддсЬ	дадсЬдсЬдЬ	асаадаадаа	сссааадсЬа	240
сЬдаассадЬ	ЬасадЬасЬд	Ьдаддаддса	ддсаЬсссас	ЬддЬддсЬаЬ	саЬсддсдад	300
саддаасЬса	аддаЬддддЬ	саЬсаадсЬс	сдЬЬсадЬда	сдадсаддда	ададдЬддаЬ	3б0
дЬссдаадад	аадассЬЬдЬ	ддаддаааЬс	ааааддадаа	саддссадсс	ссЬсЬдсаЬс	420
ЬдсЬда						42б
<210> бб
<211> 50
<212> ДНК
<213> Ното	зарФепз
<400> бб
даааЬЬЬдЬд	сЬсаааассс	ссааддаЬЬЬ	ЬдасаЬЬдсЬ	дддаасЬЬЬд		50

<210> б7 <211> 1б <212> Белок

<213> Ното	зарФепз
<400> б7
Ьуз РЬе Уа1	Ьеи Ьуз	ТЬг Рго Ьуз Азр РЬе Азр	11е А1а О1у Азп РЬе
1	5	10	15

<210>	б8
<211>	50
<212>	ДНК
<213>	Ното зарФепз
<400>	б8
даааЬЬЬдЬд сЬсаааассс ссааддЬааа сдаЬсдасдс	аЬЬсЬадаЬд		50
<210>	б9
<211>	1б
<212>	Белок
<213>	Ното зарФепз
<400>	б9
Ьуз РЬе Уа1 Ьеи Ьуз	ТЬг Рго Ьуз Уа1 Азп Азр	Агд Агд 11е	Ьеи Азр
1	5	10		15

<210>	70
<211>	50
<212>	ДНК
<213>	Ното	зарФепз
<400>	70
ЬдаЬасассЬ	дЬаЬЬЬдаас ЬаааддЬааа	сдаЬсдасдс	аЬЬсЬадаЬд		50
<210>	71
<211>	1б
<212>	Белок
<213>	Ното	зарФепз
<400>	71
Азр ТЬг Рго	Уа1 РЬе О1и Ьеи Ьуз	Ча1 Азп Азр	Агд Агд 11е	Ьеи Азр
1		5	10		15

<210> 72

- 154 030418 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 72 ссдаЬассдд дааЬЬсЬасс адЬдЬдЬааа сдаЬсдасдс аЬЬсЬадаЬд <210> 73 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зарФепз <400> 73

Агд Туг Агд О1и РЬе Туг О1п Суз Уа1 Азп Азр Агд Агд 11е Ьеи Азр 1 5 10 15 <210> 74 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 74 даааЬЬЬдЬд сЬсаааассс ссааддааас асЬдаЬддда аадЬаЬдддд <210> 75 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зарФепз <400> 75

Ьуз РЬе Уа1 Ьеи Ьуз ТЬг Рго Ьуз О1и ТЬг Ьеи МеЬ О1у Ьуз Туг О1у 1 5 10 15 <210> 76 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 76

ЬдаЬасассЬ дЬаЬЬЬдаас ЬаааддаЬЬЬ ЬдасаЬЬдсЬ дддаасЬЬЬд <210> 77 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зарФепз <400> 77

Азр ТЬг Рго Уа1 РЬе О1и Ьеи Ьуз Азр РЬе Азр 11е А1а О1у Азп РЬе 1 5 10 15 <210> 78 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 78 даааЬЬЬдЬд сЬсаааассс ссааддсЬЬЬ ддаддадаад аЬасддасса <210> 79 <211> 16

- 155 030418 <212> Белок <213> Ното зарЧепз <400> 79

Ьуз РЬе Уа1 Ьеи Ьуз ТЬг Рго Ьуз А1а Ьеи О1и О1и Ьуз 11е Агд ТЬг

5 10 15 <210> 80 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарЧепз <400> 80

ВдаВасассВ дВаВВВдаас ВаааддсВВВ ддаддадаад аВасддасса <210> 81 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зарЧепз <400> 81

Азр ТЬг Рго Уа1 РЬе О1и Ьеи Ьуз А1а Ьеи О1и О1и Ьуз 11е Агд ТЬг

5 10 15 <210> 82 <211> 50 <212> ДНК <213> Ното зарЧепз <400> 82 сВссВсадВа дасаадсВдд асааддВддд дВаВсссВдд ВддаасадсВ <210> 83 <211> 105 <212> Белок <213> Ното зарЧепз <400> 83

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

1

5

10

15

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Зег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

20

25

30

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

35

40

45

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

50

55

60

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

Уа1

ТЬг

Зег

Агд

65

70

75

80

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

85

90

95

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

100

105

<210>	84
<211>	318
<212>	ДНК
<213>	Ното зарЧепз
<400>	84

- 156 сддассасдд адасасаддЕ дсЕЕдЕддса ЕсЕдсасада адаадсЕдсЕ ададдааада 60 сЕааадсЕЕд ЕсЕсадаасЕ дЕдддаЕдсЕ дддаЕсаадд сЕдадсЕдсЕ дЕасаадаад 120 аасссааадс ЕасЕдаасса дЕЕасадЕас ЕдЕдаддадд саддсаЕссс асЕддЕддсЕ 180 аЕсаЕсддсд адсаддаасЕ сааддаЕддд дЕсаЕсаадс ЕссдЕЕсадЕ дасдадсадд 240 даададдЕдд аЕдЕссдаад адаадассЕЕ дЕддаддааа Есааааддад аасаддссад 300 ссссЕсЕдса ЕсЕдсЕда 318 <210> 85 <211> 130 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 85

МеЕ 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

20

25

30

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

35

40

45

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

50

55

60

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

85

90

95

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

100

105

110

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

115

120

125

Ьеи

О1и

130

<210> 86 <211> 130 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку 6хНФз

<400> 86

МеЕ

О1у

Бег

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

1

5

10

15

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

20

25

30

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

35

40

45

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

50

55

60

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

65

70

75

80

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

85

90

95

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

100

105

110

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

НФз

НФз

НФз

НФз

115

120

125

- 157

Нтз Нтз 130 <210> 87 <211> 419 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНтз <400> 87

Ме+

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

Ме+

11е

Рго

Азр

85

90

95

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

Ме+

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

100

105

110

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

Ме+

115

120

125

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

130

135

140

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

145

150

155

160

Ме+

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

165

170

175

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Нтз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

180

185

190

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

195

200

205

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

210

215

220

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

225

230

235

240

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

245

250

255

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

260

265

270

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

Ме+

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

275

280

285

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

290

295

300

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

305

310

315

320

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

325

330

335

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

340

345

350

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

355

360

365

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

370

375

380

- 158

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

385

390

395

400

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

405

410

415

Суз

Ьеи

О1и

<210> 88 <211> 419 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную

метку

бхНФз

<400> 88

МеЕ

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

Азр

РЬе

50

55

60

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

85

90

95

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

100

105

110

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

115

120

125

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

130

135

140

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

145

150

155

160

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

165

170

175

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

180

185

190

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

195

200

205

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

210

215

220

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

225

230

235

240

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

245

250

255

МеЕ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

260

265

270

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

275

280

285

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

290

295

300

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

305

310

315

320

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

325

330

335

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

340

345

350

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

- 159

355

360

365

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

370

375

380

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

О1у

385

390

395

400

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

Нгз

Нгз

Нгз

405

410

415

Нгз Нгз Нгз <210> 89 <211> 383 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНгз

<400> 89

МеЕ

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

85

90

95

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

100

105

110

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

115

120

125

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

130

135

140

О1п

Нгз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

145

150

155

160

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

165

170

175

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

180

185

190

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

195

200

205

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

210

215

220

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

225

230

235

240

МеЕ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

245

250

255

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

260

265

270

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

275

280

285

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

290

295

300

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

305

310

315

320

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

325

330

335

- 160

11е

11е

О1у О1и 340

О1п О1и

Ьеи

Ьуз

Азр 345

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи 350

Агд

Зег

Уа1

ТЬг

Зег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

355

360

365

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

370

375

380

<210> 90 <211> 383 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную

метку

6хНФз

<400> 90

МеЬ

О1у

Зег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Зег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Зег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

Уа1

Азп

50

55

60

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Зег

Азр

65

70

75

80

Зег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Зег

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

85

90

95

Зег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

100

105

110

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

115

120

125

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Зег

О1п

Азп

130

135

140

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

145

150

155

160

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Зег

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

165

170

175

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

180

185

190

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Зег

195

200

205

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЬ

РЬе

Азр

Рго

210

215

220

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Зег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

225

230

235

240

11е

РЬе

Зег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

245

250

255

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

260

265

270

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Зег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

275

280

285

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

290

295

300

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

305

310

315

320

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

Уа1

ТЬг

Зег

Агд

325

330

335

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

340

345

350

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

- 161

355 360 365

Азп Рго Ьеи Ьеи О1у Ьеи Азр Бег ТЬг НФз НФз НФз НФз НФз НФз

370 375 380 <210> 91 <211> 423 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНтз

<400> 91

МеЬ

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

85

90

95

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

100

105

110

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

115

120

125

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

130

135

140

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

145

150

155

160

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

165

170

175

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

180

185

190

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

195

200

205

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

210

215

220

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

225

230

235

240

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

245

250

255

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

260

265

270

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЬ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

275

280

285

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

290

295

300

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

305

310

315

320

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

325

330

335

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

340

345

350

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

355

360

365

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

370

375

380

- 162

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег Агд О1и О1и Уа1

Азр

385

390

395

400

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

405

410

415

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

420

<210> 92 <211> 423 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную

метку

6хНФз

<400> 92

МеЕ

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

50

55

60

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

65

70

75

80

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

100

105

110

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

115

120

125

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

130

135

140

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

145

150

155

160

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

165

170

175

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

180

185

190

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

195

200

205

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

210

215

220

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

225

230

235

240

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

245

250

255

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЕ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

260

265

270

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

275

280

285

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

290

295

300

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

305

310

315

320

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

325

330

335

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

340

345

350

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

- 163

355

3б0

3б5

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

370

375

380

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

385

390

395

400

Суз

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

405

410

415

ТЬг

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

420 <210> 93 <211> 497 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку бхНФз <400> 93

МеЬ

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

б0

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

б5

70

75

80

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

85

90

95

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

100

105

110

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

115

120

125

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

130

135

140

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

145

150

155

1б0

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

НФз

11е

А1а

Ьуз

1б5

170

175

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЬ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

180

185

190

РЬе

Туг

О1п

Суз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

195

200

205

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

210

215

220

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

225

230

235

240

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

245

250

255

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

2б0

2б5

270

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

275

280

285

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

290

295

300

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

305

310

315

320

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

325

330

335

- 164

Рго

Ьеи О1у Уа1 340

О1у

Бег

Уа1

А1а А1а 345

О1у О1у Агд Туг Азр 350

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЬ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

355

360

365

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

370

375

380

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

385

390

395

400

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

405

410

415

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

420

425

430

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

435

440

445

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

450

455

460

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

465

470

475

480

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

485

490

495

О1и

<210> 94 <211> 497 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную

метку

6хНФз

<400> 94

МеЬ

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

50

55

60

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЬ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

65

70

75

80

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

100

105

110

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

115

120

125

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЬ

Азп

130

135

140

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

НФз

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

145

150

155

160

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЬ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

165

170

175

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЬ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

180

185

190

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

195

200

205

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЬ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

210

215

220

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

- 165

225

230

235

240

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

245

250

255

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

260

265

270

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

275

280

285

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

290

295

300

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

305

310

315

320

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

Меб

РЬе

325

330

335

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

340

345

350

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

355

360

365

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

370

375

380

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

385

390

395

400

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

405

410

415

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

420

425

430

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

435

440

445

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

450

455

460

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

465

470

475

480

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

Нтз

Нтз

Нтз

НФз

Нтз

485

490

495

Нтз

<210> 95 <211> 493 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз

<400> 95

Меб

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьеи

Меб

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

85

90

95

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

100

105

110

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

Меб

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Азп

115

120

125

- 166

11е

Ьуз 130

Агд

Туг НФз

11е

А1а 135

Ьуз

Уа1

Туг Агд Агд Азр Азп 140

Рго

А1а

МеЕ

ТЬг

Агд

О1у

Агд

Туг

Агд

О1и

РЬе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЬе

Азр

11е

145

150

155

160

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

165

170

175

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

180

185

190

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

195

200

205

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

210

215

220

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

225

230

235

240

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

245

250

255

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

260

265

270

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

275

280

285

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

290

295

300

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

305

310

315

320

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

325

330

335

О1у

Бег

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЕ

РЬе

340

345

350

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

355

360

365

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

370

375

380

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

385

390

395

400

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

405

410

415

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

420

425

430

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

435

440

445

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

450

455

460

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

465

470

475

480

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

485

490

<210> 96 <211> 493 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку 6хНФз

<400> 96

МеЕ

О1у Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Бег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

- 167

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЪе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЪг

Рго

Ьуз

О1и

ТЪг

50

55

60

Ьеи

МеЕ

О1у

Ьуз

Туг

О1у

О1и

Азр

Бег

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

65

70

75

80

Азр

О1п

О1у

О1у

О1и

Ьеи

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Ьеи

ТЪг

Уа1

Рго

85

90

95

РЪе

А1а

Агд

Туг

Ьеи

А1а

МеЕ

Азп

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Азп

11е

Ьуз

Агд

Туг

100

105

110

Нгз

11е

А1а

Ьуз

Уа1

Туг

Агд

Агд

Азр

Азп

Рго

А1а

МеЕ

ТЪг

Агд

О1у

115

120

125

Агд

Туг

Агд

О1и

РЪе

Туг

О1п

Суз

Азр

РЪе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЪе

130

135

140

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

145

150

155

160

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

165

170

175

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЪе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

180

185

190

РЪе

Агд

ТЪг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

195

200

205

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

210

215

220

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

Нгз

О1у

О1у

Уа1

Бег

225

230

235

240

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

245

250

255

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЪе

О1и

Туг

Ьеи

ТЪг

260

265

270

Ьеи

РЪе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЪе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

275

280

285

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЪг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

290

295

300

ТЪг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

Уа1

А1а

305

310

315

320

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЕ

РЪе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

325

330

335

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЪе

340

345

350

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЪг

355

360

365

ТЪг

О1и

ТЪг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

370

375

380

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

385

390

395

400

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

405

410

415

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

420

425

430

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЪг

Бег

Агд

О1и

О1и

435

440

445

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЪг

450

455

460

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

465

470

475

480

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

485

490

<210> 97 <211> 459 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 168 <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 97

МеЕ

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1и

Ьеи

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

50

55

60

А1а

О1п

Ьеи

О1у

Рго

Азр

О1и

Бег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

65

70

75

80

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

Агд

Азр

Туг

Бег

Рго

Агд

О1п

МеЕ

А1а

Уа1

Агд

О1и

85

90

95

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НФз

О1у

А1а

О1и

100

105

110

Уа1

11е

Азр

ТЬг

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

115

120

125

Азп

РЬе

Азр

Рго

МеЕ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

130

135

140

О1и

11е

Ьеи

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

145

150

155

160

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

165

170

175

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

180

185

190

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

195

200

205

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

210

215

220

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

225

230

235

240

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

245

250

255

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЬе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

260

265

270

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

275

280

285

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Бег

290

295

300

Уа1

А1а

А1а

О1у

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеЕ

РЬе

Азр

Рго

305

310

315

320

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

325

330

335

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

340

345

350

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

355

360

365

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

370

375

380

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

385

390

395

400

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

405

410

415

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

420

425

430

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

435

440

445

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

- 169

450 455 <210> 98 <211> 459 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную метку 6хНЧз

<400> 98

МеВ

О1у

Зег

А1а

О1и

Агд

А1а

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1п

1

5

10

15

О1у

О1и

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Ьуз

О1п

О1п

Ьуз

А1а

Зег

А1а

О1и

Ьеи

20

25

30

11е

О1и

О1и

О1и

Уа1

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

О1п

Ьеи

О1у

35

40

45

Рго

Азр

О1и

Зег

Ьуз

О1п

Ьуз

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

ТЬг

50

55

60

Агд

Азр

Туг

Зег

Рго

Агд

О1п

МеВ

А1а

Уа1

Агд

О1и

Ьуз

Уа1

РЬе

Азр

65

70

75

80

Уа1

11е

11е

Агд

Суз

РЬе

Ьуз

Агд

НЧз

О1у

А1а

О1и

Уа1

11е

Азр

ТЬг

85

90

95

Рго

Уа1

РЬе

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Азр

11е

А1а

О1у

Азп

РЬе

Азр

Рго

100

105

110

МеВ

11е

Рго

Азр

А1а

О1и

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеВ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Зег

115

120

125

Зег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

130

135

140

Ьеи

Азр

О1у

МеВ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Зег

Азр

Зег

Ьуз

РЬе

Агд

145

150

155

160

ТЬг

11е

Суз

Зег

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Зег

Тгр

О1и

О1и

165

170

175

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеВ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

180

185

190

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НЧз

О1у

О1у

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

195

200

205

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Зег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

210

215

220

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

225

230

235

240

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Зег

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

245

250

255

Азр

Туг

Туг

ТЬг

О1у

Уа1

11е

Туг

О1и

А1а

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

260

265

270

А1а

О1п

А1а

О1у

О1и

О1и

Рго

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Зег

Уа1

А1а

А1а

О1у

275

280

285

О1у

Агд

Туг

Азр

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

МеВ

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

290

295

300

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Зег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Зег

11е

305

310

315

320

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

325

330

335

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

340

345

350

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Зег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

355

360

365

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

370

375

380

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

385

390

395

400

- 170

Азр О1у

Уа1

11е

Ьуз 405

Ьеи Агд

Бег Уа1

ТЬг 410

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1 415

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

420

425

430

Рго

Ьеи

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

435

440

445

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

450

455

<210> 99 <211> 1б5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку бхНФз <400> 99

МеЬ 1

НФз

НФз

НФз

НФз 5

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго 10

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи 15

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЬг

О1у

Бег

РЬе

Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

20

25

30

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

Бег

11е

О1у

Уа1

О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

35

40

45

О1п

Агд

Ьеи

О1и

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

50

55

б0

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Бег

А1а

О1п

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

б5

70

75

80

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

Ьеи

Тгр

Азр

А1а

О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

85

90

95

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

100

105

110

О1у

11е

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Ьеи

Ьуз

Азр

О1у

115

120

125

Уа1

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

130

135

140

Агд

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Ьеи

145

150

155

1б0

Суз

11е

Суз

Ьеи

О1и

1б5

<210> 100 <211> 1б5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий С-концевую аффинную

метку

бхНФз

<400> 100

МеЬ

О1у

Бег

РЬе Азр

Рго

Ьуз

О1у

Агд

Ьуз

Уа1

Рго

Суз

Уа1

О1у

Ьеи

1

5

10

15

Бег

11е

О1у

Уа1 О1и

Агд

11е

РЬе

Бег

11е

Уа1

О1и

О1п

Агд

Ьеи

О1и

20

25

30

А1а

Ьеи

О1и

О1и Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

О1и

ТЬг

О1п

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

35

40

45

Бег

А1а

О1п

Ьуз Ьуз

Ьеи

Ьеи

О1и

О1и

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Уа1

Бег

О1и

50

55

б0

Ьеи

Тгр

Азр

А1а О1у

11е

Ьуз

А1а

О1и

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

- 171

65

70

75

80

Ьуз

Беи

Беи

Азп

О1п

Ьеи

О1п

Туг

Суз

О1и

О1и

А1а

О1у

11е

Рго

Ьеи

85

90

95

Уа1

А1а

11е

11е

О1у

О1и

О1п

О1и

Беи

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

11е

Ьуз

Беи

100

105

110

Агд

Бег

Уа1

ТЬг

Бег

Агд

О1и

О1и

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

О1и

Азр

Беи

115

120

125

Уа1

О1и

О1и

11е

Ьуз

Агд

Агд

ТЬг

О1у

О1п

Рго

Беи

Суз

11е

Суз

Ьеи

130

135

140

О1и

О1у

Буз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Беи

Ьеи

О1у

Беи

Азр

Бег

ТЬг

Няз

145

150

155

160

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

Нтз

165 <210> 101 <211> 327 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 101 ддаБсссдБа ссассдааас ссаадББсБд дББдссБсад сБсадааааа асБдсБддаа 60 даасдссБда аасБддББад сдаасБдБдд даБдсБддса ББааадссда асБдсБдБаБ 120 аааааааасс сдааасБдсБ дааБсадсБд садБаББдБд аддаадсддд БаББссБсБд 180 дБддссаББа Бсддадааса ддаасБдааа дасддсдББа ББааасБдсд БадсдБдасс 240

БсБсдБдаад аадББдасдБ БсдссдБдаа даБсБддБсд аддаааБсаа асдБсдБасс 300 ддБсаассБс БдБдБаБББд ссБсдад 327 <210> 102 <211> 1194 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 102 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад сБддБаааас Бдсааддсда дсдБдББсдБ 60 ддБсБдааас адсадааадс аадсдсБдаа сБдаБсдаад аадаадБддс дааасБдсБд 120 ааасБдааад сасадсБддд БссБдаБдаа Бсаааасааа ааББсдБссБ даааасБссд 180 ааадасББсд аБаББдссдд дааББББдас ссБаБдаБсс сБдаБдссда аБдБсБдааа 240 аБсаБдБдБд адаБссБдад садБсБдсад аББддБдасБ БссБддБдаа адБдаасдаБ 300 сдссдБаББс БддаБддааБ дБББдссаББ БдБддсдБдБ сБдасадсаа аБББсдБасд 360 аБсБдБадса дсдБддаБаа асБддаБааа дБдадсБддд аддаддБдаа аааБдадаБд 420 дБдддсдааа ааддБсБддс ассБдаадБд дсБдассдБа БсддБдаББа БдББсадсаа 480 саБддсддБд БББсБсБддБ сдаасадсБд сБдсаадасс саааасБдад ссадаасааа 540 саддсасБдд ааддасБддд БдаБсБдааа сБдсБдБББд адБаБсБдас дсБдБББддс 600 аБсдаБдаса аааБсБсдББ БдассБдадс сБддсасдБд дБсБддаББа ББаБассддс 660 дБдаБсБаБд аадссдБссБ дсБдсааасБ ссадсасаад саддБдаада ассБсБдддБ 720 дББддБадБд Бадсддсадд сддасдББаБ даБддасБдд БддддаБдББ БдаБссдааа 780 ддссдБааад ББссдБдБдБ сддБсБдадБ аБсддддББд адсдБаБсББ БадсаББдБд 840 дадсаасдБс БддаадсБсБ ддаддааааа аБссдБасса ссдааассса адББсБддББ 900 дссБсадсБс адаааааасБ дсБддаадаа сдссБдааас БддББадсда асБдБдддаБ 960 дсБддсаББа аадссдаасБ дсБдБаБааа ааааасссда аасБдсБдаа БсадсБдсад 1020

БаББдБдадд аадсдддБаБ БссБсБддБд дссаББаБсд дадаасадда асБдааадас 1080 ддсдББаББа аасБдсдБад сдБдассБсБ сдБдаадаад ББдасдББсд ссдБдаадаБ 1140 сБддБсдадд аааБсааасд БсдБассддБ саассБсБдБ дБаБББдссБ сдад 1194 <210> 103 <211> 1086

- 172 030418 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 103 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад сБддБаааас Бдсааддсда дсдБдББсдБ 60 ддБсБдааас адсадааадс аадсдсБдаа сБдаБсдаад аадаадБддс дааасБдсБд 120 ааасБдааад сасадсБддд БссБдаБдаа Бсаааасааа ааББсдБссБ даааасБссд 180 ааадБдааБд аБсдссдБаБ ссБддаБддс аБдБББдсса БББдБддБдБ дадсдасБсд 240 аааББссдБа сдаБББдсБс БадсдБсдаБ ааасБддаса аадБдБссБд ддаададдБд 300 ааааасдада БддБдддБда даааддБсБд дсБссБдаад ББдссдассд БаББддБдаБ 360

БаБдББсадс адсаБддсдд БдБББсасБд дББдаасаас БдсБдсаада сссдааасБд 420

БсБсадааБа аасаддсдсБ ддааддасБд ддадаБсБда аасБдсБдББ БдадБаБсБд 480 асссБдББсд дсаББдаБда сааааБсадс ББсдассБда дссБддсасд БддБсБддаБ 540

БаББаБассд дсдБдаБсБа БдаадссдББ сБдсБдсада сассадсаса адсаддсдаа 600 даассБсБдд дБдББддББс БдБддсадсс ддБддБсдББ аБдаБддасБ ддБаддсаБд 660

ББсдаБссда ааддссдБаа адББссдБдБ дБдддасБда дБаБсддБдБ БдадсдБаБс 720

БББадсаБсд Бддаасаасд БсБддаадсд сБддаддада аааББсдБас сассдааасс 780 саадББсБдд ББдссБсадс Бсадаааааа сБдсБддаад аасдссБдаа асБддББадс 840 даасБдБддд аБдсБддсаБ Бааадссдаа сБдсБдБаБа ааааааассс дааасБдсБд 900 ааБсадсБдс адБаББдБда ддаадсдддБ аББссБсБдд БддссаББаБ сддадаасад 960 даасБдааад асддсдББаБ БааасБдсдБ адсдБдассБ сБсдБдаада адББдасдББ 1020 сдссдБдаад аБсБддБсда ддаааБсааа сдБсдБассд дБсаассБсБ дБдБаБББдс 1080 сБсдад 1086 <210> 104 <211> 1206 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 104 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад сБддБаааас Бдсааддсда дсдБдББсдБ 60 ддБсБдааас адсадааадс аадсдсБдаа сБдаБсдаад аадаадБддс дааасБдсБд 120 ааасБдааад сасадсБддд БссБдаБдаа Бсаааасааа ааББсдБссБ даааасБссд 180 аааддаасБс дБдаББаБад сссБсдссад аБддсБдБсс дБдааааадБ дББсдаБдБд 240 аБсаББсдсБ дсББсааасд БсаБддБдсс даадБсаББд аБассссддБ дББсдадсБд 300 ааадБдаасд аБсдссдБаБ БсБддаБддс аБдББсдсса БББдБддБдБ БадсдаБадс 360 аааББссдБа сааБсБдсБс БадсдБддас ааасБддаса аадБдадсБд ддаададдБд 420 ааааасдада БддБдддБда даааддссБд дсБссБдаад ББдссдассд БаБсддадаБ 480

БаБдББсадс адсаБддсдд адБББсасБд дББдаасаас БдсБдсаада сссдааасБд 540

БсБсадааса аасаддсасБ ддааддБсБд ддадаБсБда аасБдсБдББ сдадБаБсБд 600 асдсБдББсд дБаББдасда сааааБББсс ББсдассБдБ сдсБддсасд БддБсБддаБ 660

БаББаБасад дсдБдаБсБа БдаддсБдБа сБдсБдсада сассадсаса адсаддБдаа 720 дадссБсБдд дБдББддББс адББдсБдсс ддБддасдББ аБдасддасБ ддБадддаБд 780

БББдасссаа ааддссдБаа адБсссдБдБ дБаддасБдБ сБаББддсдБ БдадсдБаБс 840

БББадсаБсд Бддадсаасд БсБддаадсБ сБддаддада аааБссдБас сассдааасс 900 саадББсБдд ББдссБсадс Бсадаааааа сБдсБддаад аасдссБдаа асБддББадс 960 даасБдБддд аБдсБддсаБ Бааадссдаа сБдсБдБаБа ааааааассс дааасБдсБд 1020 ааБсадсБдс адБаББдБда ддаадсдддБ аББссБсБдд БддссаББаБ сддадаасад 1080 даасБдааад асддсдББаБ БааасБдсдБ адсдБдассБ сБсдБдаада адББдасдББ 1140 сдссдБдаад аБсБддБсда ддаааБсааа сдБсдБассд дБсаассБсБ дБдБаБББдс 1200 сБсдад 1206 <210> 105 <211> 1428 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 173 030418 <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 105 ддаЕссдсад аасдЕдссдс ссЕддаадад сЕддЕаааас Едсааддсда дсдЕдЕЕсдЕ 60 ддЕсЕдааас адсадааадс аадсдсЕдаа сЕдаЕсдаад аадаадЕддс дааасЕдсЕд 120 ааасЕдааад сасадсЕддд ЕссЕдаЕдаа Есаааасааа ааЕЕсдЕссЕ даааасЕссд 180 аааддаасЕс дЕдаЕЕаЕад сссЕсдссад аЕддсЕдЕсс дЕдааааадЕ дЕЕсдаЕдЕд 240 аЕсаЕЕсдсЕ дсЕЕсааасд ЕсаЕддЕдсс даадЕсаЕЕд аЕассссддЕ дЕЕсдадсЕд 300 ааадааассс ЕдаЕдддсаа аЕаЕддддаа даЕЕссааас ЕдаЕсЕаЕда ссЕдааадас 360 садддаддЕд аасЕдсЕдЕс ЕсЕдсдсЕаЕ дассЕдасЕд ЕЕссЕЕЕЕдс ЕсдсЕаЕсЕд 420 дссаЕдааЕа аасЕдассаа саЕсааасдс ЕаЕсаЕаЕсд ссааадЕдЕа ЕсдссдЕдас 480 ааЕссадсаа ЕдасссдЕдд ЕсдЕЕаЕсдЕ дааЕЕЕЕаЕс адЕдЕдЕдаа сдаЕсдссдЕ 540 аЕЕсЕддасд дсаЕдЕЕсдс саЕЕЕдЕддЕ дЕдЕсЕдасЕ ссаааЕЕЕсд ЕасдаЕсЕдс 600

ЕсаадсдЕдд асааасЕдда сааадЕдадс Едддаададд Едааааасда даЕддЕдддЕ 660 дадаааддсс ЕддсЕссЕда адЕЕдссдас сдЕаЕсддад аЕЕаЕдЕЕса дсадсаЕддс 720 ддадЕЕЕсас ЕддЕЕдааса асЕдсЕдсаа дасссдааас ЕдЕсасадаа сааасаддса 780 сЕддааддЕс ЕдддддаЕсЕ дааасЕдсЕд ЕЕсдадЕаЕс ЕдасдсЕдЕЕ сддЕаЕЕдас 840 дасааааЕса дсЕЕсдаЕсЕ дадссЕддса сдЕддЕсЕдд асЕаЕЕаЕас сддсдЕдаЕЕ 900

ЕаЕдаадссд ЕЕсЕдсЕдса дасЕссадса саадсаддЕд аададссЕсЕ дддЕдЕЕдда 960 адЕдЕддсад ссддЕддссд ЕЕаЕдаЕддЕ сЕддЕЕддса ЕдЕЕЕдассс даааддссдЕ 1020 ааадЕсссдЕ дЕдЕаддасЕ дЕсЕаЕсддс дЕддадсдЕа ЕЕЕЕЕадсаЕ сдЕддаасаа 1080 сдссЕддаад сЕсЕддаада дааааЕссдЕ ассассдааа сссаадЕЕсЕ ддЕЕдссЕса 1140 дсЕсадаааа аасЕдсЕдда адаасдссЕд ааасЕддЕЕа дсдаасЕдЕд ддаЕдсЕддс 1200 аЕЕааадссд аасЕдсЕдЕа Еаааааааас ссдааасЕдс ЕдааЕсадсЕ дсадЕаЕЕдЕ 1260 даддаадсдд дЕаЕЕссЕсЕ ддЕддссаЕЕ аЕсддадаас аддаасЕдаа адасддсдЕЕ 1320 аЕЕааасЕдс дЕадсдЕдас сЕсЕсдЕдаа даадЕЕдасд ЕЕсдссдЕда адаЕсЕддЕс 1380 даддаааЕса аасдЕсдЕас сддЕсаассЕ сЕдЕдЕаЕЕЕ дссЕсдад 1428 <210> 106 <211> 1416 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 106 ддаЕссдсад аасдЕдссдс ссЕддаадад сЕддЕаааас Едсааддсда дсдЕдЕЕсдЕ 60 ддЕсЕдааас адсадааадс аадсдсЕдаа сЕдаЕсдаад аадаадЕддс дааасЕдсЕд 120 ааасЕдааад сасадсЕддд ЕссЕдаЕдаа Есаааасааа ааЕЕсдЕссЕ даааасЕссд 180 ааадааассс ЕдаЕдддсаа аЕаЕддсдаа даЕЕссааас ЕдаЕсЕаЕда ссЕдааадас 240 сааддсддЕд аасЕдсЕдЕс ссЕдсдЕЕаЕ дассЕдасЕд ЕЕссдЕЕЕдс ЕсдЕЕаЕсЕд 300 дссаЕдааЕа аасЕдассаа саЕЕааасдс ЕаЕсасаЕЕд ссааадЕдЕа ЕсдссдЕдас 360 ааЕссЕдсЕа ЕдасЕсдЕдд асдЕЕаЕсдЕ дааЕЕсЕаЕс адЕдЕдасЕЕ сдаЕаЕЕдсс 420 ддсаасЕЕсд асссЕаЕдаЕ ЕссддаЕдсЕ дааЕдссЕда аааЕсаЕдЕд ЕдадаЕссЕд 480 адсадссЕдс аааЕЕддЕда сЕЕссЕддЕд ааадЕдааЕд ассдЕсдЕаЕ ссЕддаЕддс 540 аЕдЕЕсдсса ЕЕЕдЕддЕдЕ ЕадсдаЕЕсс аааЕЕссдЕа ссаЕсЕдЕад ЕадЕдЕддас 600 ааасЕддаЕа аадЕдадсЕд ддаададдЕд ааааасдааа ЕддЕдддсда ааааддЕсЕд 660 дсассЕдадд ЕЕдсЕдаЕсд ЕаЕсддЕдас ЕаЕдЕссадс адсаЕддадд ЕдЕЕЕсасЕд 720 дЕЕдадсаас ЕдсЕдсаада ЕссдааасЕд ЕсЕсадааса аасаддсссЕ ддааддасЕд 780 ддЕдаЕсЕда аасЕдсЕдЕЕ сдадЕаЕсЕд асдсЕдЕЕсд дЕаЕЕдаЕда сааааЕсЕсд 840 ЕЕсдассЕдЕ сЕсЕддсЕсд ЕддасЕддаЕ ЕаЕЕаЕасдд дсдЕааЕсЕа ЕдаадсЕдЕс 900 сЕдсЕдсада сассадсаса адсаддЕдаа дадссЕсЕдд дЕдЕЕддаад ЕдЕЕдсЕдсс 960 ддЕддЕсдсЕ аЕдасддасЕ ддЕЕддсаЕд ЕЕсдаЕссда ааддссдЕаа адЕЕссдЕдЕ 1020 дЕаддасЕда дсаЕЕддсдЕ ЕдадсдЕаЕс ЕЕЕЕссаЕсд ЕЕдадсаасд ЕсЕддаадса 1080 сЕддаадада аааЕссдЕас сассдааасс саадЕЕсЕдд ЕЕдссЕсадс Есадаааааа 1140 сЕдсЕддаад аасдссЕдаа асЕддЕЕадс даасЕдЕддд аЕдсЕддсаЕ Еааадссдаа 1200 сЕдсЕдЕаЕа ааааааассс дааасЕдсЕд ааЕсадсЕдс адЕаЕЕдЕда ддаадсдддЕ 1260 аЕЕссЕсЕдд ЕддссаЕЕаЕ сддадаасад даасЕдааад асддсдЕЕаЕ ЕааасЕдсдЕ 1320 адсдЕдассЕ сЕсдЕдаада адЕЕдасдЕЕ сдссдЕдаад аЕсЕддЕсда ддаааЕсааа 1380 сдЕсдЕассд дЕсаассЕсЕ дЕдЕаЕЕЕдс сЕсдад 1416

- 174 030418 <210> 107 <211> 1314 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 107 ддаБссдсад аасдБдссдс ссБддаадад сБддБаааас Бдсааддсда дсдБдББсдБ 60 ддБсБдааас адсадааадс аадсдсБдаа сБдаБсдаад аадаадБддс дааасБдсБд 120 ааасБдааад сасадсБддд БссБдаБдаа Бсаааасааа ааББсдБссБ даааасБссд 180 аааддаасБс дБдаББаБад сссБсдссад аБддсБдБсс дБдааааадБ дББсдаБдБд 240 аБсаББсдсБ дсББсааасд БсаБддБдсс даадБсаББд аБассссддБ дББсдадсБд 300 ааадаБББсд аБаББдссдд саасБББдаБ ссдаБдаББс сддаБдсБда дБдБсБдааа 360 аБсаБдБдБд адаБссБдад БадБсБдсад аББддддаББ БссБддБдаа адБдаасдаБ 420 сдссдБаББс БддасддсаБ дБББдссаББ БдБддсдББа дсдаБадсаа аББссдБасд 480 аБсБдБадса дБдБддасаа асБддаБааа дБсБсББддд аададдБсаа ааасдадаБд 540 дББддБдада ааддссБддс БссБдаадБд дсБдассдБа ББддБдаББа БдБссадсад 600 саБддБддБд БББсасБддБ БдаасаасБд сБдсаадасс сдааасБдБс Бсадаасааа 660 саддсасБдд ааддБсБддд БдаБсБдааа сБдсБдББсд адБаБсБдас дсБдББсддБ 720 аББдасдаса аааБББссББ сдассБдБса сБддсасдБд дБсБддаББа ББаБасаддс 780 дБааБсБаБд аддсБдБасБ дсБдсааасБ ссадсасаад саддБдаада ассБсБддда 840 дББддБадБд Бадсддсадд дддБсдББаБ даБдддсБдд БсдддаБдББ сдаБссаааа 900 ддссдБааад БсссдБдБдБ БддБсБдБсБ аББддсдББд адсдБаБсББ сБссаБсдБд 960 дадсаасдБс БддаадсБсБ ддаадааааа аБссдБасса ссдааассса адББсБддББ 1020 дссБсадсБс адаааааасБ дсБддаадаа сдссБдааас БддББадсда асБдБдддаБ 1080 дсБддсаББа аадссдаасБ дсБдБаБааа ааааасссда аасБдсБдаа БсадсБдсад 1140

БаББдБдадд аадсдддБаБ БссБсБддБд дссаББаБсд дадаасадда асБдааадас 1200 ддсдББаББа аасБдсдБад сдБдассБсБ сдБдаадаад ББдасдББсд ссдБдаадаБ 1260 сБддБсдадд аааБсааасд БсдБассддБ саассБсБдБ дБаБББдссБ сдад 1314 <210> 108 <211> 432 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 108 ддаБссББсд асссаааадд ссдБааадББ ссдБдБдБад ддсБдБсБаБ сддБдББдад 60 сдБаБсББсБ ссаБсдББда дсадсдБсБд даадсасБдд аддааааааБ ссдБасдасс 120 дадасБсаад БссБддББдс БадБдсссад аааааасБдс Бддаададсд ссБдааасБд 180 дББадБдадс БдБдддаБдс сддБаББааа дссдаасБдс БдБаБааааа ааасссдааа 240 сБдсБдааБс адсБдсадБа ББдБдаадаа дсдддсаББс сдсБддБадс даББаБсддд 300 даасаадаас БдааадаБдд сдБдаБсааа сБдсдБадсд ББасаадссд БдаддаадБд 360 дасдБссдсс дБдаддаБсБ ддББдаадад аББааасдсс дБасаддБса дссБсБдБдБ 420 аБББдссБсд ад 432 <210> 109 <211> 143 <212> Белок <213> Ното зартепз <400> 109

Суз

Ьей

Ьуз

11е

МеБ

Суз

О1и

11е

Ьей

Бег

Бег

Ьей

О1п

11е

О1у

Азр

1

5

10

15

РЬе

Ьей

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьей

Азр

О1у

МеБ

РЬе

А1а

20

25

30

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

35

40

45

Азр

Ьуз

Ьей

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеБ

Уа1

- 175 030418

50

55

60

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

65

70

75

80

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

85

90

95

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

100

105

110

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЪе

О1и

Туг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

РЪе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

115

120

125

Бег

РЪе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЪг

О1у

130

135

140

<210> 110 <211> 429 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 110

ЕдссЕдаада ЕсаЕдЕдсда даЕссЕдадЕ ЕсасЕЕсада ЕаддсдасЕЕ ссЕддЕсаад 60 дЕааасдаЕс дасдсаЕЕсЕ адаЕдддаЕд ЕЕЕдсЕаЕсЕ дЕддЕдЕЕЕс Едасадсаад 120

ЕЕссдЕасса ЕсЕдсЕссЕс адЕадасаад сЕддасаадд ЕдЕссЕддда ададдЕдаад 180 ааЕдадаЕдд Едддададаа дддссЕЕдса ссЕдаддЕдд сЕдассдсаЕ ЕддддасЕаЕ 240 дЕссадсаас аЕддЕддддЕ аЕсссЕддЕд даасадсЕдс ЕссаддаЕсс ЕааасЕаЕсс 300 саааасаадс аддссЕЕдда дддссЕддда дассЕдаадЕ ЕдсЕсЕЕЕда дЕассЕдасс 360 сЕаЕЕЕддса ЕЕдаЕдасаа ааЕсЕссЕЕЕ дассЕдадсс ЕЕдсЕсдадд дсЕддаЕЕас 420

ЕасасЕддд 429 <210> 111 <211> 168 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз <400> 111

МеЕ

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

НФз

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

О1у

Ьеи

Азр

Бег

ТЪг

О1у

Бег

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

20

25

30

Бег

Бег

Ьеи

О1п

11е

О1у

Азр

РЪе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

35

40

45

11е

Ьеи

Азр

О1у

МеЕ

РЪе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Бег

Азр

Бег

Ьуз

РЪе

50

55

60

Агд

ТЪг

11е

Суз

Бег

Бег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Бег

Тгр

О1и

65

70

75

80

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

85

90

95

А1а

Азр

Агд

11е

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Бег

Ьеи

100

105

110

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Бег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

115

120

125

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЪе

О1и

Туг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

130

135

140

РЪе

О1у

11е

Азр

Азр

Ьуз

11е

Бег

РЪе

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

145

150

155

160

Ьеи

Азр

Туг

Туг

ТЪг

О1у

Ьеи

О1и

165

<210> 112

- 176 <211> 168 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, содержащий Ν-концевую аффинную метку 6хНФз

<400> 112

МеЕ

О1у

Зег

Суз

Ьеи

Ьуз

11е

МеЕ

Суз

О1и

11е

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

О1п

1

5

10

15

11е

О1у

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Азр

Агд

Агд

11е

Ьеи

Азр

О1у

20

25

30

МеЕ

РЬе

А1а

11е

Суз

О1у

Уа1

Зег

Азр

Зег

Ьуз

РЬе

Агд

ТЬг

11е

Суз

35

40

45

Зег

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Зег

Тгр

О1и

О1и

Уа1

Ьуз

Азп

50

55

60

О1и

МеЕ

Уа1

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Рго

О1и

Уа1

А1а

Азр

Агд

11е

65

70

75

80

О1у

Азр

Туг

Уа1

О1п

О1п

НФз

О1у

О1у

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

85

90

95

Ьеи

О1п

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Зег

О1п

Азп

Ьуз

О1п

А1а

Ьеи

О1и

О1у

Ьеи

100

105

110

О1у

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

РЬе

О1и

Туг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

РЬе

О1у

11е

Азр

115

120

125

Азр

Ьуз

11е

Зег

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Азр

Туг

Туг

130

135

140

ТЬг

О1у

Ьеи

О1и

О1у

Ьуз

Рго

11е

Рго

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

Азр

145

150

155

160

Зег

ТЬг

Нтз

Нтз

НФз

Нтз

Нтз

Нтз

165

<210> 113 <211> 441 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> кодон-оптимизированный полинуклеотид гистидил-тРНК-синтетазы <400> 113 ддаЕссЕдсс ЕдааааЕсаЕ дЕдЕдадаЕс сЕдадЕадЕс ЕдсаааЕЕдд сдасЕЕЕсЕд 60 дЕсааадЕда асдаЕсдссд ЕаЕЕсЕддаЕ ддсаЕдЕЕсд ссаЕсЕдЕдд ЕдЕЕадсдас 120

ЕссаааЕЕсс дЕасааЕсЕд ЕадсадсдЕд дасааасЕдд аЕааадЕдЕс сЕдддаадад 180 дЕдааааасд аааЕддЕддд ЕдаааааддЕ сЕддсЕссдд аддЕЕдсЕда ссдЕаЕсддЕ 240 даЕЕаЕдЕЕс адсадсасдд сддЕдЕЕадЕ сЕддЕЕдаас аасЕдсЕдса адасссдааа 300 сЕдЕсЕсада асааасаддс ссЕддаадда сЕдддадаЕс ЕдааасЕдсЕ дЕЕсдадЕаЕ 360 сЕдасдсЕдЕ ЕсддсаЕЕда ЕдасааааЕЕ ЕсЕЕЕсдасс ЕдЕсасЕддс асдЕддасЕд 420 дасЕаЕЕаЕа ссддЕсЕсда д 441

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и изолированный полипептид аминоацил-тРНК-синтетазы (ΑΑΚδ), который по меньшей мере на 95, 98 или 100% идентичен последовательности δΕφ ГО N0: 64 или 83 или ее фрагменту, который представляет собой 100 или более смежных аминокислот последовательности δΕφ ГО N0: 64 или 83, причем указанный полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала, выбранную из модуляции высвобождения цитокинов, модуляции клеточной адгезии.
2. 2. Терапевтическая композиция по п.1, где ΑΑΚδ полипептид слит с гетерологичным полипептидом, выбранным из группы, состоящей из меток аффинной очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и мо- 177 030418 дификаторов фармакокинетических свойств (РК).
3. 3. Терапевтическая композиция по п.1, где аминокислотная последовательность ААВЯ полипептида имеет по меньшей мере 98 или 100% идентичность последовательности ЯЕС ГО ΝΟ: 64 или 83.
4. 4. Изолированный полипептид ААКЯ, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 95, 98 или 100% идентичность последовательности ЯЕС ГО ΝΟ: 64 или 83 или ее фрагменту, который представляет собой 100 или более смежных аминокислот последовательности ЯЕС ГО ΝΟ: 64 или 83, причем полипептид имеет активность внеклеточной передачи сигнала, выбранную из модуляции высвобождения цитокинов, модуляции клеточной адгезии.
5. 5. Изолированный полипептид ААКЯ по п.4, где ААВЯ полипептид слит с гетерологичным полипептидом, выбранным из группы, состоящей из меток аффинной очистки, эпитопных меток, нацеливающих последовательностей, сигнальных пептидов, последовательностей транслокации через мембрану и модификаторов фармакокинетических свойств (РК).
6. 6. Изолированный полипептид ААВЯ по п.4, где аминокислотная последовательность ААВЯ полипептида имеет по меньшей мере 98 или 100% идентичность последовательности ЯЕС ГО ΝΟ: 64 или 83.
7. 7. Изолированный полипептид ААВЯ по п.4, где к указанному полипептиду ковалентно или нековалентно присоединен по меньшей мере один фрагмент, где по меньшей мере один фрагмент представляет собой детектируемую метку или растворимый в воде полимер и где детектируемую метку выбирают из радиоизотопов, флуорохромов, красителей, ферментов, наночастиц, хемилюминесцентных маркеров.
8. 8. Клеточная культура для рекомбинантной продукции полипептида ААВЯ по любому из пп.4-6, содержащая популяцию клеток, в которой по меньшей мере одна клетка содержит и экспрессирует полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид ААВЯ, и бессывороточную среду, причем указанные клетки способны расти в бессывороточной среде.
9. 9. Вектор экспрессии, содержащий (ί) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ААВЯ по любому из пп.4-6.
10. 10. Способ идентификации соединения, которое специфично связывается с полипептидом ААВЯ по любому из пп.4-6, включающий:

    a) объединение полипептида ААКЯ по меньшей мере с одним исследуемым соединением в подходящих условиях связывания и

    b) детектирование связывания полипептида ААВЯ с исследуемым соединением, с идентификацией соединения, которое специфично связывается с полипептидом ААВЯ.
11. 11. Способ лечения воспалительного заболевания путем введения полипептида ААВЯ по любому из пп.4-6.
12. 12. Способ по п.11, где воспалительным заболеванием является системный ювенильный артрит, системная красная волчанка, болезнь Крона и ревматоидный артрит.

    - 178 030418