KR101899591B1 - 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 면역증강용 조성물 - Google Patents

트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 면역증강용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS)를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 면역증강용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품용 조성물, 및 예방 또는 치료용 수의학적 조성물, 그리고 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 조성물은 특히 선천면역반응을 활성화시킴으로써 박테리아 및 바이러스 등의 감염을 초기 단계에 억제하여 박테리아 및 바이러스 등의 감염이 유발하는 인간과 동물의 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 면역증강용 조성물 {Compositions for treating or preventing infection-induced inflammatory diseases and for enhancing immune responses comprising tryptophanyl-tRNA synthetase}
본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS)를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 면역증강용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품용 조성물, 및 예방 또는 치료용 수의학적 조성물, 그리고 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 대한 것이다.
아미노아실 티알엔에이 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase, AARS)는 아미노산 특이적으로 티알엔에이에 결합시키는 반응을 매개하는 효소로 단백질 생성에 중추적인 역할을 담당한다. 최근 이 AARS들이 본질적인 기능 외에도 세포사멸(apoptosis), 혈관형성(angiogenesis), 염증반응 등 다양한 생명현상에 관여하고 있음이 알려지고 있다. 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS)는 클래스 I에 속하는 AARS로 세포질 속에 존재한다. TrpRS에서 아미노기 부가부분(extra N-terminal domain)이 없는 형태의 mini-TrpRS는 IFN-r에 의해 활성화되는 혈관형성저해인자(angiostatic factor)임이 알려졌다. 전체 TrpRS(full-length TrpRS)는 혈관세포에서 분비되는 것이 관찰되었지만, 체내에서 어떤 역할을 하는지에 대해서는 아직 알려진 바 없다(Guo M et al.(2013), Nat. Chem. Biol, 9(3):145-153).
본 발명자들은 단백질 합성에 연관된 본질적인 기능 외에 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 새로운 생물학적 기능을 연구하던 중, 트립토파닐 티알엔에이 합성효소가 선천면역반응을 활성화시키고, 박테리아, 곰팡이 및 바이러스 등의 감염을 억제하는 효과가 있음을 처음으로 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여,
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여,
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여,
트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명자들은 TrpRS가 면역체계, 특히 선천면역반응(innate immune responses)를 활성화시킴으로써 박테리아 및 바이러스 등의 감염을 억제하는 기능이 있음을 처음 발견하여 본 명세서에 공개하였다.
구체적으로 실시예에서는 말초혈액 단핵세포가 박테리아 및 바이러스에 감염되면, 감염 초기부터 TrpRS를 세포 외부로 분비하며, 분비된 TrpRS는 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성을 증가시키는 것을 보여준다. 또 다른 실시예에서는 말초혈액 단핵세포가 박테리아에 감염되었을 때, 세포사멸로 인한 분비가 아닌 능동적으로 TrpRS를 분비하며, 유전자 발현 유도 없이 세포 내에 존재하고 있던 TrpRS가 분비되는 것임을 알 수 있다.
다른 실시예에서는 TrpRS는 특히 단핵구(monocyte)와 대식세포(macrophage)에서 다양한 사이토카인(cytokine)의 분비를 증가시키며, 대식세포의 분화와 대식작용을 촉진하는 것을 알 수 있다.
다른 실시예에서는 TrpRS의 작용으로 인해 호중구(neutrophil)와 단핵구(monocyte)의 세포 유동성이 증가하며, TrpRS를 체내 주입하면 복강 내 호중구 집중 현상이 유도되며, 호중구 및 대식세포의 수를 증가시키고, 활성화를 촉진시키는 것을 알 수 있다.
또 다른 실시예에서는 TrpRS에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하여 박테리아에 감염된 세포에 처리하여 TrpRS의 활성을 억제하면, TNF-α와 MIP-1α의 분비가 감소하며, 감염 치사율이 증가하는 것을 알 수 있다.
나아가 다른 실시예에서는 TrpRS를 생체에 투여하였을 때, 복강 내에서 호중구의 수가 증가하였으며, 간과 비장에서 박테리아를 제거하는 것을 확인하였다. 이는 TrpRS가 생체 내에서 감염 박테리아 제거 작용을 촉진하여 감염 치사율을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 트립토판 티알엔에이 합성효소(TrpRS)는 박테리아 또는 바이러스 등의 감염에 의해 세포 외부로 분비되며, 이러한 TrpRS는 면역세포를 활성화시켜 감염성 염증 질환의 예방 및 치료에 효과가 있다는 것을 처음 발견하여 본 명세서에 공개하였다.
본 발명에서 “TrpRS” 또는 “TrpRS 폴리펩티드”는 트립토판 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS 또는 WRS)로 알려져 있는 폴리펩티드를 말한다. 상기 TrpRS 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 8 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한 본 발명의 TrpRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다. "폴리펩티드(polypeptide)"는 "폴리펩티드들(polypeptides)" 또는 "단백질(들)"과 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
상기 기능적 동등물이란 서열번호: 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호: 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 1로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서,”실질적으로 동질의 생리활성”이란 사이토카인의 생성과 분비, 세포 유동성, 대식작용 등의 면역세포의 기능을 활성화하고, 체내에서 호중구 집중 현상을 유도하며 감염 박테리아의 제거 작용을 증대시키는 것을 의미한다.
상기 기능적 동등물은 서열번호: 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 TrpRS 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 TrpRS 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 TrpRS 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 TrpRS의 아미노산 서열(서열번호: 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 TrpRS의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, TrpRS의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 이와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J.Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
본 발명에 따른 조성물의 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
“약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 면역 활성화 효과를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 면역 질환 또는 감염성 염증질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 박테리아 감염으로 유발되는 염증성 질환에서 상기 박테리아는 바람직하게는 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 악시네토박터 칼로아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 악시네토박터 해몰리티쿠스(Acinetobacter haemolyticus), 악시네토박터 하이드라필라(Acinetobacter hydrophila), 악티노바실루스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 알칼리게네스 크실록시단스(Alcaligenes xylosoxidans), 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 멜라니노게니쿠스(Bacteroides melaninogenicus), 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 브란하멜라 카타르할리스(Branhamella catarrhalis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 칸니스(Brucella canis), 부르콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 부르콜리데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르콜데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 시트로박터 디베르수스(Citrobacter diversus), 시트로박터 프룬디이(Cltrobacter freundi), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 에드와시엘라 타르다(Edwarsiella tarda), 에를리키아 카페니스(Ehrlichia chafeenis), 에이케넬라 코론덴스(Eikenella corrondens), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 불너리스(E.vulneris), 플라보박테리움 메닝고셉티쿰 (Flavobacterium meningosepticum), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테리움 아종(Fusobacterium spp.), 해모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 해모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 킨젤라 킨가에(Kingella kingae), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 오자에나에(Klebsiella ozaenae), 크렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 크렙시엘라 리노스클레로마티스(Klebsiella rhinoscleromatis), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 모락셀라 카타할리스(Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 네이세리아 고노호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 파스테렐라 물토시다(Pasteurella multoclda), 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonas shigelloides), 포르피로모나스 아사카롤리티카(Porphyromonas asaccharolytica), 포르필로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 비비아(Prevotella bivia), 프레보텔라 부카에(Prevotella buccae), 프레보텔라 코르포리스(Prevotella corporis), 프레보텔라 엔도돈탈리스(Prevotella endodontalis), 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 오랄리스(Prevotella oralis), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 믹소파시엔스(Proteus myxofaclens), 프로테우스 펜너(Proteus penner), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 프로비덴시아 스투라르피(ProvidenCla stuarfii), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 리케챠 프로우제키(Ricketsia prowozekii), 살모넬라 봉고리 (Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 세라티아 마르센스(Serratia marcescens), 시겔라 보이디(Shigella boydii), 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 파라매몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불루니피쿠스(Vibrio vulunificus), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 에르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의한 감염일 수 있다.
본 발명의 박테리아 감염으로 유발되는 염증성 질환은 포유류 및 조류에서 발생되는 박테리아 감염 및 박테리아 감염에 수반되는 질병을 포함하며, 바람직하게는 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 속에 의한 감염에 수반되는 폐렴, 중이염, 부비동염, 기관지염, 편도선염 및 유양 돌기염; 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 그룹 C 및 G 스트렙토코쿠스, 클로스트리듐 디프테리아에(Clostridium diptheriae) 또는 악티노바실루스 하에몰리티쿰(Actinobacillus haemolyticum)에 의한 감염에 수반되는 인두염, 류머티스열 및 사구체신염; 미코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 또는 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)에 의한 감염에 수반되는 기도 감염; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 코아굴라제-양성 스타필로코커스(즉, S. 에피덜미디스(S. epidermidis), S. 헤몰리티쿠스(S. hemolyticus) 등), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코코스 그룹 C-F(미세-콜로니 스트렙토코커스), 비리단스(Viridans) 스트렙토코커스, 코리네박테리움 미누티시뭄(Corynebacterium minutissimum), 클로스트리듐(Clostridium) 속 또는 바르토넬라 헨젤라에(Bartonella henselae)에 의한 감염에 수반되는 비복합형 피부 및 연조직 감염, 종기, 골수염 및 산욕열; 스타필로코커스 사프로피티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus) 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 의한 감염에 수반되는 비복합형 급성 요로감염; 요도염 및 자궁경부염; 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 하에모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 또는 네이세리아 고노레아에(Neiserria gonorrheae)에 의한 감염에 수반되는 성적으로 전이되는 질병; S. 아우레우스(S. aureus)(식중독 및 독소 쇼크 증후군), 그룹 A, B 및 C 스트렙토코커스에 의한 감염에 수반되는 독소 질병; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 의한 감염에 수반되는 궤양; 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis)에 의한 감염에 수반되는 전신 열병 증후군; 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)에 의한 감염에 수반되는 라임(Lyme)병; 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 네이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae), S. 아우레우스(S. aureus), S. 뉴모니아에(S. pneumoniae), S. 피오제네스(S. pyogenes), H. 인플루엔자에(H. influenzae) 또는 리스테리아(Listeria) 속에 의한 감염에 수반되는 결막염, 각막염 및 누낭염; 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 또는 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (Mycobacterium intracellulare)에 의한 감염에 수반되는 범발성 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC) 질병; 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에 의한 감염에 수반되는 위장염; 비리단스 스트렙토코커스에 의한 감염에 수반되는 치성 감염; 보르데텔라 페리투씨스(Bordetella pertussis)에 의한 감염에 수반되는 지속성 기침; 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 또는 박테로이데스 (Bacteroides) 속에 의한 감염에 수반되는 가스 회저; 및 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 또는 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)에 의한 감염에 수반되는 아테롬성 동맥경화증일 수 있다. 본 발명의 조성물로 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염 및 이들 감염으로 유발되는 질환은 샌포드(J. P. Sanford) 등의 문헌[" The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy" , 26판, Antimicrobial Therapy, Inc., 1996]에 인용되어 있다.
본 발명의 박테리아 감염으로 유발되는 염증성 질환은 가장 바람직하게는 에스케리치아 속(Escherichia genus), 리스테리아 속(Listeria genus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus genus)의 박테리아 감염으로 유발되는 질환일 수 있다.
본 발명에서의 바이러스에 의한 감염성 염증 질환은, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어 HSV-I, HSV-II, CMV 또는 VZV), 폭스바이러스(예를 들어 천연두(variola), 백시니아 또는 물사마귀바이러스(molluscum contagiosum)와 같은 진성두창바이러스(orthopoxvirus), 피코르나바이러스(예를 들어 리노바이러스 또는 엔테로바이러스)), 오르토믹소바이러스(예를 들어 인플루엔자바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어 5-파라인플루엔자바이러스, 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스 및 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 코로나 바이러스(예를 들어 SARS), 파포바바이러스(예를 들어 성기사마귀, 보통사마귀 또는 족저 사마귀를 유발하는 파필로마 바이러스), 헤파드나바이러스(예를 들어 B형간염 바이러스), 플라비바이러스(예를 들어 B 또는 C형 간염 바이러스 또는 뎅기열 바이러스(Denguevirus)) 또는 레트로바이러스(예를 들어 HIV와 같은 렌티바이러스)), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 등의 감염에 의해 유발되는 염증성 질환일 수 있다. 바람직하게는 리노바이러스(rhinovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 아데노바이러스(adenovirus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 헤르페스바이러스(herpes simplex virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 등과 같이 폐렴, 인플루엔자(독감), 또는 상기도 감염을 일으키는 것으로 알려진 바이러스의 감염으로 유발되는 염증 질환일 수 있다.
구체적으로는 본 발명의 감염성 염증 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
에스케리치아(Escherichia)는 장내세균과의 그람음성 간균으로 8여 종이 있다. 에스케리치아 균속의 대부분의 박테리아가 숙주와 공생하고 해롭지 않지만, 요로 감염의 주요 원인이며, 다양한 위장관 질환을 일으킨다. 에스케리치아 균속의 가장 대표적인 병원성 박테리아로 대장균(E. coli)이 있고, 이외에도 E. fergusonii는 개방성 창상 또는 상처를 감염시키고, 균혈증과 요로 감염을 일으키며, 방광염을 일으킨 예도 있으며, E. vulneris도 주로 상처를 감염시킨다.
E. coli는 O 항원, H 항원, K 항원에 따라 다시 190여 종의 혈청형으로 분류되며, 병원성 대장균은 베로독소(verotoxin)을 생산하는 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli, EHEC), 장관 독소 (enterotoxin)를 생산하는 독소성 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC), 대장 점막의 상피세포를 침입하여 조직 내 감염을 일으키는 장침습성 대장균(enteroinvasive E. coli, EIEC), 그리고 급성위장염을 일으키는 장병원성 대장균(enteropathogenic E. coli, EPEC), 장관흡착성 대장균 (enteroaggregative E. coli, EAggEC) 등으로 구분된다. 장출혈성 대장균은 혈변과 심한 복통, 드물게는 혈전성 혈소판 감소증 또는 용혈성 요독 증후군 등을 일으키며, 심한 경우 신부전증을 유발하기도 한다. 이 부류의 대장균 감염증은 심한 출혈성 설사의 증상을 보이는 경우가 있어 출혈성 대장염(hemmorrhagic colitis)라고 불린다. 특히 대장균 O157:H7은 주요 식중독 원인균이다. 독소성 대장균은 장염과 여행자 설사증 (traveler’s diarrhea)의 원인균으로 탈수를 동반한 설사증을 일으킨다. 장침습성 대장균은 발열, 복통이 주요 증상이며, 대장 점막의 상피세포에 침입하여 감염을 일으키므로 세포 괴사 등에 의해 궤양이 형성되고 혈액과 점액이 섞인 설사를 일으킨다. 장병원성 대장균은 구토, 복통, 설사, 발열 증상을 나타낸다. 대장균은 주로 환자, 보균자, 동물의 배설물을 통한 감염이 문제가 되지만, 가축, 사람, 자연환경 등 분포 범위가 광범위하여 균에 오염된 식품이면 무엇이든 원인체가 될 수 있다.
리스테리아(Listeria)는 모양이 고르고 짧은 그람양성 간균으로, 10개의 종이 있으며, 리스테리아 균속 중 현재까지 L. monocytogenes와 L. ivanovii 종만이 병원균으로, 또한 이 중 L. monocytogenes만이 인간에게 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 리스테리아는 주로 오염된 식품을 통해 감염되며, 감염된 동물로부터 직접 감염될 수도 있다. 리스테리아증(listeriosis)은 흔히 고열, 근육통 등의 감기 또는 패혈증 증세로 나타나며, 중추신경계에서 뇌수막염, 뇌염, 뇌농양 등을 유발할 수 있다. 위장관 계통으로 감염되면 발열, 구역, 구토 등의 증상이 나타나며, 드물게 연조직염, 결막염, 늑막염, 복막염, 간염, 간농양, 담낭염, 비장농양 등의 국소 감염증으로 나타나기도 한다. 주로 세포성 면역이 저하된 환자, 면역억제 치료를 받고 있는 장기이식환자, 노인, 임산부 등에서 패혈증이나 뇌수막염 등의 주요 중증 감염 증상을 일으키며, 복막염, 심내막염, 뇌농양 등을 일으킬 수도 있다. 임산부에서는 인플루엔자와 비슷한 소견의 균혈증을 일으키는데, 조기에 치료하지 않으면 태반염, 양수염, 태아 감염을 일으켜서 유산이나 사산을 초래하기도 한다. 건강한 성인에게서도 위장관염 증세를 야기할 수 있다.
살모넬라(Salmonella)는 장내세균과에 속하는 막대 모양의 그람음성 간균이다. 살모넬라 균속은 Salmonella enterica(S. enterica)와 Salmonella bongori(S. bongori) 두 개의 종으로 분류되며, S. enterica는 다시 6개의 아종(subspecies)으로 나뉜다. 살모넬라 지방다당질(lipopolysaccharide)로 된 균체 항원(O)과 편모 항원(H)의 조합에 따라 다시 약 2,500여종의 혈청형으로 구성되어 있다. S. typhi, S. enteritidis, S. paratyphi, S. typhimurium, S. choleraesuis 등 사람에서 감염 질환을 일으키는 많은 살모넬라 혈청형이 S. enterica subsp. enterica 아종에 속한다.
살모넬라균은 오염된 음식, 감염된 동물, 물, 기구 등 다양한 경로를 통해 사람과 동물을 감염시키고 질병을 일으킨다. 살모넬라 감염은 식중독, 장염, 패혈증, 균혈증, 만성보균상태, 국소 감염 등 다양한 증상으로 나타나며, 특히 사람에서 S. typhi는 장티푸스, S. paratyphi는 파라티푸스를 일으키며, S. typhimurium, S. enteritidis, S. infantis, S. heidelberg 등은 위장염을 일으킨다. 살모넬라증(salmonellosis)은 12~36시간의 잠복기간을 거쳐 발열, 두통, 복통, 설사, 구역, 구토 등의 위장 증상과 탈수를 일으킨다. 급성 장염으로 시작되어 패혈증 또는 균혈증이나 농양, 관절염, 담낭염, 심낭염, 폐렴, 농피증, 신우신염 등으로 진행되기도 한다. 살모넬라는 인체의 어느 조직을 통해서도 감염될 수 있다.
스타필로코쿠스(Staphylococcus, 포도알균)는 그람양성 알균으로 단일, 쌍 또는 불규칙적 포도모양 배열을 하고 있다. 스타필로코쿠스는 40여 종으로 분류되며, 다시 16s 리보솜 알엔에이(rRNA) 염기 서열에 따라 11개의 그룹으로 나뉜다. 이 중 임상에서 주로 문제가 되는 것은 S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus 등 세 종이다.
S. aureus(황색포도알균)은 화농성 염증을 일으키는 주요 원인균이며, 식중독에서 패혈증까지 다양한 감염 증상을 보이는데, 혈장을 응고시키는 강력한 독성이 있는 코아굴라제(coagulase)와 엔테로톡신(enterotoxin) 등 다양한 독소를 분비하고, S. aureus의 세포 내 성분인 단백질 A(protein A)는 보체활성화작용, 국소 팽진과 발작 등의 작용을 한다. S. aureus에 감염되면 모낭염, 화상, 봉소염, 농가진, 수술후 상처 감염, 피부열상증후군 등의 피부감염과, 혈류감염, 폐렴, 관절염, 급성심내막염, 심근염, 뇌염, 수막염, 비뇨생식기, 신경계, 복부기관의 농양, 중이염, 결막염, 독소성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome) 등의 증상으로 나타난다. 더 나아가 항생제에 대한 내성을 갖게 된 S. aureus는 치료가 특히 어렵고, 병원, 학교, 교도소 등 사람이 많이 모이는 곳에서의 기회 감염과 질병 관리에 삼각한 문제가 된다. 페니실린(penicillin), 메티실린(methicillin) 등의 베타 락탐(beta-lactam) 항생제에 내성을 갖는 메티실린 내성 황색포도알균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 당단백질 항생제인 반코마이신(vancomycin)에 내성을 갖는 반코마이신 내성 황색포도알균(vancomycin-intermediate S. aureus (VISA), heterogenous vancomycin-intermediate S. aureus (hVISA), high-level vancomycin-resistant S. aureus(VRSA)) 등이 있다. 스타필로코쿠스 균속의 다른 병원균인 코아굴라제 음성 S. epidermidis는 병원내 감염균으로 치료 기구 등에 의해 감염될 수 있고, S. saprophyticus는 요로 감염을 일으킨다.
또한 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 따른 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품용 조성물은 면역기능 증진 또는 박테리아 감염으로 유발되는 질환의 예방이나 개선의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량% 이다. 본 발명의 식품용 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
동물에서 대장균은 주로 소, 돼지, 닭에서 장관 감염으로 인한 대장균증(colibacillosis)를 일으키는데, 송아지의 설사, 위축 등의 장 질환과 소의 자궁근염, 돼지의 패혈증, 설사, 장 질환, 탈수, 부종병, 신경 증상 등을 일으킨다.
살모넬라균은 가금류, 돼지, 소, 이구아나, 거북, 개, 고양이 등의 애완동물, 가축 및 야생동물을 모두 병원소로 하고 있다. 동물에서의 살모넬라증(salmonellosis)은 가축 중에서는 주로 소와 돼지에서 급성 또는 만성 소화기 전염병으로 나타난다. 송아지에서 자주 발생하여 발열, 장염 및 패혈증으로 나타나며, 폐렴, 뇌염, 관절염, 유방염을 일으킬 수 있다. 돼지의 경우 주로 비육기에 위장염 패혈증 등의 증상을 일으키며 돼지 파라타이포이드(paratyphoid)라고 불리기도 한다. 살모넬라균의 한 혈청형인 S. gallinarum는 닭에서 가금티푸스(fowl thyphoid)를 유발하며, 패혈증으로 인한 높은 폐사율을 초래한다.
동물에서 리스테리아균은 닭, 소, 돼지, 개, 너구리, 산양, 면양, 쥐 등의 다양한 가축과 야생동물을 감염시킨다. 리스테리아증(listeriosis)은 주로 반추동물에서 유산, 패혈증, 뇌막염, 뇌염 등을 일으키며, 균이 뇌조직에 침입하여 신경세포가 손상된 동물이 선회운동을 하거나 장애물에 돌진하는 등의 증상을 보여 선회병이라고도 한다.
스타필로코쿠스(포도알균)은 동물에서 세균성 감염의 일반적인 원인균 중의 하나로, 피부와 연조직의 염증 등 화농성 질환을 유발하며, 소, 양, 염소 같은 반추동물에서는 유선염을 일으킨다.
본 발명의 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 종류, 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.
상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
면역증강은 생체 내 면역시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 노화, 임신, 면역억제치료 등으로 인한 면역기능 저하의 완화, 또는 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 바이러스 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지성 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명의 조성물은 백신의 어쥬번트로 포함될 수 있다.
따라서 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 수의학적 조성물, 예방 및 개선용 식품용 조성물, 그리고 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 특히 선천면역반응을 활성화시킴으로써 박테리아 및 바이러스 등의 감염을 초기 단계에 억제하여 박테리아 및 바이러스 감염이 유발하는 인간과 동물의 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포의 배지 상층액(SUP)과 전체 세포 용해물(whole cell lysate, WCL)의 TrpRS(WRS)를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(A), 박테리아 및 곰팡이에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포의 배양 상층액에서 TrpRS, HMGB-1, HSP70의 단백질량을 ELISA로 관찰한 결과(B)를 나타낸다.
도 2는 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포에서 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(TrpRS)와 종양괴사인자 알파(TNF-α), HMGB-1, HSP70이 감염 후 시간에 따라 분비되는 양상을 보여주는 웨스턴 블랏의 결과(A) 및 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포의 배양 상층액에서 시간별로 생성되는 TNF-α와 TrpRS를 측정한 ELISA 결과(B)를 나타낸다.
도 3은 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포에서 세포사멸(pyroptosis)이 일어나는지 확인하기 위한 유산탈수소효소(LDH) 어세이 실험 결과를 나타낸다.
도 4는 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포에서 시간별로 생성되는 TNF-α와 TrpRS의 mRNA 수준을 보여주는 real time-PCR 결과를 나타낸다.
도 5는 TrpRS가 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포의 TNF-α분비에 미치는 영향을 알아보기 위한 TrpRS 항체 처리와 ELISA 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포(A)와 PR8 인플루엔자 바이러스에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포(B)의 배양 상층액에서 시간에 따라 TrpRS(WRS)의 단백질량을 ELISA로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 TrpRS 처리한 면역세포들에서 TNF-α와 MIP1-α가 분비되는 양상을 보여주는 ELISA 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 PBMC 세포에 full length-TrpRS와 mini-TrpRS를 처리한 뒤 MIP-1α, TNF-α, MIP-1β, IL-6, 및 IL-8의 분비량을 이미지 Lab 4.1 소프트웨어를 사용하여 분석한 것(A)과 PBMC 세포를 배양한 배양 상층액에서 TNF-a, MIP-1a, and MIP-1b의 발현량을 확인하는 ELISA 실험 결과(B) 및 RT-PCR의 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 9는 TrpRS 처리한 골수유래 대식세포(BMDM)의 배양 상층액이 면역세포 유동성에 미치는 영향을 보여주는 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay) 실험 결과를 나타낸다.
도 10은 PBMC 유래 대식세포, THP-1 세포, THP-1 유래 대식세포, J774A.1세포에서 MIP-1α의 양을 ELISA로 확인한 결과(A), PBMC 세포에서 TNF-α, MIP-1α, MCP-1의 단백질 양을 ELISA로 확인한 결과(B) 및 RT-PCR로 확인한 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 11은 TrpRS를 주입한 쥐 복강내 호중구 집중 현상(neutrophil recruitment)을 보여주는 유세포분석 실험 결과(A, B)와 MIP1-α 분비량을 보여주는 ELISA 실험 결과(C), 유세포 분석을 통한 호중구, 대식세포, 골수세포의 수(D)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 TrpRS 처리한 골수유래 대식세포의 CD40, CD80, CD86 단백질 발현 양상을 보여주는 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 13은 TrpRS 처리한 골수유래 대식세포의 대식작용 지수(phagocytosis index)로 도출된 형광 표지된 대장균을 이용한 대식 세포 실험 결과를 나타낸다.
도 14는 full length-TrpRS와 mini-TrpRS를 처리한 대식세포에서 TNF-α, MIP-1α의 양을 ELISA로 측정한 결과(A), PEC(peritoneal exudate cells)에서 CD11b+F4/80+세포와 Ly6G+ 호중구의 세포 수를 유세포 분석기로 측정한 결과(B)를 나타낸다.
도 15는 LysM-GFP 형질전환 쥐에 Alexa 647이 표기된 full legnth-TrpRS, mini-TrpRS(빨)을 주입한 뒤 이미지 분석 기술을 이용하여 시간별로 측정한 이미지(X 20)를 나타낸 것(A), S. typhimurium에 감염된 쥐에 full legnth-TrpRS, mini-TrpRS를 주입하여 대식세포의 지수를 측정한 것(B)을 나타낸다.
도 16은 TrpRS에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 과정을 도식도로 나타낸 것이다.
도 17은 full length-TrpRs와 TrpRS에 특이적인 항체를 THP-1 세포에 처리하였을 때, TNF-α의 양(A), 인간 PBMC 세포에서 TNF-α 생성에 대하여 항체(scFv 4G1)가 미치는 영향(B)을 ELISA로 측정한 결과와 항체를 사용한 full length-TrpRS나 mini-TrpRS와 결합하는 재조합 단백질의 발현(C)을 나타낸 것이다.
도 18은 항체를 이용한 동물실험의 개요를 도식도로 나타낸 것(A)과 항체가 TNF-α 및 MIP-1α의 발현에 미치는 영향(B), Ly6G+ 호중구의 수에 미치는 영향(C)을 나타낸 것이다.
도 19는 S.typhimurium에 감염된 쥐의 생존률에 TrpRS에 특이적인 항체가 미치는 영향을 보여주는 생존도표(survival plot)를 나타낸다.
도 20은 S. typhimurium에 감염된 쥐의 생존률에 TrpRS가 미치는 영향을 알아보기 위한 동물 실험 개요(도 20 상단)와, S. typhimurium가 침윤 호중구에 흡착 또는 흡수되는 정도에 미치는 TrpRS의 영향을 보여주는 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 21은 동물실험의 개요를 도식도를 나타낸 것으로 S. typhimurium(A)또는 L.monocytogene(B)을 감염시키기 1시간 전에 (1 X 107CFU)쥐에 복강주사로 PBS (Con), FL-WRS, or mini-WRS (each 20 mg/mouse)를 주입하고 간과 비장에서 IHC와 CFU를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 S.typhimurium에 감염된 쥐의 생존률에 TrpRS가 미치는 영향을 보여주는 생존도표(survival plot)를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
박테리아 감염된 말초혈액 단핵세포에서 분비되는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(TrpRS)
<실시예 1-1>
박테리아 및 곰팡이에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포에서 분비되는 아미노아실 티알엔에이 합성효소의 종류 확인
인간 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)가 박테리아에 감염된 후 분비하는 아미노아실 티알엔에이 합성효소(ARS)의 종류를 알아보기 위한 면역블롯(immunoblot) 실험을 수행하였다(도 1). 박테리아 및 곰팡이는 Salmonella typhimurium(S. typhimurium, ATCC 14028), Listeria monocytogenes(L. monocytogens, ATCC 15313), Escherichia coli(E. coli, ATCC 10798), Staphylococcus aureus(S. aureus, ATCC 25923), Candida albicans(C. albicans, ATCC 10231)를 한국 미생물 보존센터와 미생물자원센터에서 분양받아 영양 배지(nutrient broth) 또는 뇌-심장 침출배지(brain heart infusion, BD biosciences)에서 주기적으로 배양하였다. 감염 실험에 사용한 박테리아는 전날 하루 밤 배양하여 1X108 CFU의 밀도로 수득하였다. CFU는 600nm의 흡광도와 미리 준비된 검정 곡선(calibration curve)를 이용하여 추산하였다. 본 실시예와 다른 실시예의 박테리아 감염 실험에서는 수득한 박테리아를 PBS에 세척하고 무혈청(serum free) RPMI 배지나 PBS에 재분산(suspension)하여 실험하였다. 인간 PBMC는 1X106 cells/well의 밀도로 한 시간 배양하고, 1X106 CFU의 S. typhimurium(MOI=1) 또는 L. monocytogenes(MOI=1)로 감염시켰다. 감염 후 두 시간 동안 배양한 배양 상층액(supernatant)을 TCA 침전시키고 다양한 종류의 ARS에 대한 면역블롯 실험을 수행하였다.
그 결과, 분석 대상이었던 ARS(secretory ARS(TrpRS, GRS, KRS, DRS), AIMP1(a cofactor of ARS complexes), WHEP domain을 포함하는 ARS(TrpRS, MRS, HRS, GRS)) 중 유일하게 전체 트립토파닐 티알엔에이(full-length TrpRS, 53kDa)가 배양 상층액에서 감지되었다. 이는 박테리아 감염 후 분비되는 ARS는 TrpRS(WRS)임을 보여준다(도 1A). 또한 S. typhimurium과 L. monocytogenes 외에 E. coli 그리고 S. aureus, C. albicans에 의한 감염에 의해서도 인간 말초혈액 단핵세포에서 full-length WRS가 분비되는 것을 확인하였다(도 1B). 이는 TrpRS(WRS)가 특정 박테리아가 아니라 일반적으로 박테리아 감염에 반응하여 분비될 가능성이 높음을 보여준다.
<실시예 1-2>
TrpRS와 TNF-α 분비의 동역학적 분석(kinetic analysis)
S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(TrpRS)와 종양괴사인자 알파(TNF-α), HMGB1, 열 충격 단백질(HSP 70)이 감염 직후부터 시간 별로 분비되는 양상을 분석하였다(도 2). 인간 PBMC를 S. typhimurium(MOI=1)로 감염시키고, 감염 후 0, 15, 30, 60, 120분에 전체 세포 용해물(whole cell lysate, WCL)과 배양 상층액(supernatant)을 수득하여 면역블롯 실험을 수행하였다(도 2A).
그 결과, 배양 상층액에서는 감염 후 15분부터 TrpRS가 감지되었고, 감염 후 120분에 이르기까지 양이 증가하는 것을 관찰하였다. 한편 WCL에서는 감염 후 시간 경과에 따라 TrpRS의 양이 오히려 다소 감소하는 경향을 보였다. 따라서 TrpRS는 감염 후 초기부터 세포 외부로 분비되는 것을 알 수 있다. 한편, 전체 세포 용해물에서 TNF-α 전구체(precursor TNF-α)는 감염 후 30분부터 생성되어 120분에 감지되었고, TNF-α(Mature TNF-α)는 감염 후 120분에 이르러 미량 검출되었다. 배양 상층액에서는 120분에 TNF-a(Mature TNF-α)가 감지되었다. 즉 TrpRS는 감염 후 빠른 시간 내에 세포 외부로 분비되며, 시간적으로 TNF-α의 분비보다 크게 앞서는 것을 알 수 있다.
반면, 배양 상층액에서는 감염 후 시간 경과에 따라 HMGB-1과 HSP 70은 검출되지 않았으며, 전체 세포 용해물에서는 감염 후 시간 경과에 따라 HMGB-1과 HSP 70이 일정하게 검출되었다. 따라서 HMGB-1과 HSP 70은 박테리아 감염에 영향을 받지 않는 것을 알 수 있다.
추가적으로 박테리아 감염 후 배양 상층액에 분비된 TrpRS와 TNF-α의 양을 감염 후 0, 15, 30, 60, 120분에 엘라이자 실험으로 측정하였다(도 2B), Live S. typhimurium infection). 면역블롯 실험에서 관찰된 바와 같이 배양 상층액에 존재하는 TrpRS는 감염 후 15분부터 크게 증가하여 감염 후 60분까지 증가세가 이어졌으나, 배양 상층액에 존재하는 TNF-α는 감염 후 60분에 이르러서야 증가하기 시작하였다.
<실시예 1-3>
박테리아 감염과 세포사멸(pyroptosis) 여부 확인
실시예 1-2에서 관찰한 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 TrpRS를 분비하는 현상이 세포사멸(pyroptosis)에 의한 것인지 여부를 조사하였다(도 3). 세포사멸은 유산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH; a signature of cell death) 어세이를 통해 확인하였다. 구체적으로는 인간 PBMC를 S. typhimurium로 감염시키고, 감염 후 0, 5, 10, 20, 40, 60, 120분의 배양 상층액에 존재하는 LDH 수준을 유산탈수소효소 어세이 키트(LDH assay kit, Takara Bio, Inc.)를 이용하여 측정하였다. 1% TX-100 처리한 PBMC를 양성대조군으로 하였다.
그 결과, 양성대조군(1% TX-100)의 배양 상층액에서는 세포사멸의 지표(marker)인 LDH의 양이 시간에 따라 급격히 증가한 데 반하여 S. typhimurium 감염된 PBMC의 배양 상층액에서는 감염 후 120분에 이르기까지 LDH의 양에 큰 변화가 없는 것으로 보아, LDH는 이 기간 동안 발현되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 박테리아 감염 후 PBMC는 세포사멸이 아닌 능동적인 분비 작용으로 TrpRS를 세포 외부로 배출하는 것을 알 수 있다(도 3).
<실시예 1-4>
박테리아 감염과 TNF-α, TrpRS의 발현 수준 확인
S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 TNF-α와 TrpRS(WRS)의 유전자가 발현되는 양상을 각각의 RT-PCR을 이용하여 알아보았다(도 4).
인간 PBMC를 S. typhimurium로 감염시키고, 감염 후 0, 15, 30, 60, 120분에 세포를 수득하였고, TNF-α와 TrpRS의 mRNA 수준을 측정하였다. RNA는 알엔이지 키트(RNeasy kit, Qiagen, Hilden, Germany)의 실험 방법에 따라 추출하고, M-MLV 역전사효소(M-MLV reverse transcriptase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 역전사하여 하기 시발체(primer)를 이용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR)을 실시하였다. GAPDH mRNA의 수준을 내부 대조군(internal control)으로 하였다.
hTNF-α Forward: 5’-GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3’
hTNF-α Reverse: 5’-CTGCCCAGACTCGGCAA-3’
hTrpRS Forward: 5’-AAGAATTCATGCCCAACAGTGAGCCC-3’
hTrpRS Reverse: 5’-AACTCGAGCTACCCTGGAGGACAGTCAGCCTT-3’
GAPDH forward: 5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’
GAPDH reverse: 5’-TTGACTCCGACCTTCACCTTCC-3’
그 결과, TNF-a mRNA 레벨은 30분부터 120분까지 증가한 반면, TrpRS mRNA 레벨은 감염 후 120분까지 크게 변하지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 4)
이는 감염 후 분비되는 TrpRS는 감염 후 유전자 발현 유도 없이 세포 내 이미 존재하고 있던 TrpRS 단백질이 분비되는 것임을 보여준다. 또한 박테리아 감염에서 유도되는 중요한 염증전 사이토카인(proinflammatory cytokine)인 TNF-α의 mRNA는 감염 후 30분부터 12분에 이르기까지 크게 증가함을 확인하였다.
TNF-α mRNA가 감염 후 40여분이 지나 60분까지 크게 증가하고, 또한 실시예 1-2에서 관찰한 TNF-α의 분비량도 감염 후 60분에 이르러서 증가세가 관찰된 것은 시간적으로 TNF-α의 생산 이전에 이미 TrpRS의 분비가 일어나고 있음을 뒷받침한다.
<실시예 1-5>
박테리아 감염 후 분비되는 TrpRS와 TNF-α의 관계
실시예 1-2에서 S. typhimurium에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 TrpRS와 TNF-α가 시간차를 두고 분비되는 것을 확인하였다. 또한 Heat-killed S. typhimurium 로 감염된 PBMC에서 감염 초기에 TrpRS 분비되지 않았을 때 TNF-α가 분비되지 않음을 관찰하였다. 이에 감염 후 분비된 TrpRS와 TNF-α사이에 기능적 관계가 있는지 알아보았다(도 5). PBMC를 TrpRS 기능상쇄 항체(function-neutralizing antibody, 항체 농도 10μg/mL)로 처리하고, S. typhimurium(MOI=1)으로 감염시킨 후 0, 2, 4, 8시간째 TNF-α의 분비 양상을 엘라이자 실험으로 측정하였다.
그 결과, 항체 처리하여 TrpRS의 기능을 저하시킨 PBMC(S.typhimurium + α-WRS ScFv)에서는 PBS 처리한 대조군 PBMC(S.typhimurium + PBS)과 비교하여 TNF-α의 양이 크게 감소함을 관찰하였다. 이는 TrpRS가 TNF-α의 생성과 분비에 중요하게 관여함을 보여준다. 이러한 결과는 특히 박테리아 감염시 TrpRS가 가장 처음으로 TNF-α 생산을 조절하는 인자일 가능성을 제시한다.
<실시예 1-6>
바이러스에 감염된 인간 말초혈액 단핵세포에서 분비되는 아미노아실 티알엔에이 합성효소
인간 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)가 바이러스에 감염된 후 시간에 따라 분비하는 아미노아실 티알엔에이 합성효소(ARS)의 양을 알아보기 위한 ELISA 실험을 수행하였다(도 6). 바이러스는 호흡기 세포융합 바이러스 A2(respiratory syncytial virus A2, RSV A2)와 PR8 인플루엔자 바이러스(Influenza A/Puerto Rico/8/1934 virus)를 표준 플라크 분석에 의해 적정하였다. 인간 PBMC에 각 바이러스를 2시간 동안 PBMC에 감염시킨 다음 24시간동안 배양하였다. 감염 후 시간마다 배양 상층액(supernatant)을 수확하였고, ELISA 실험을 통해 TrpRS(WRS)의 레벨을 측정하였다.
그 결과, RSV가 감염된 세포에서 시간이 지날수록 TrpRS의 농도가 증가하는 것으로 나타났고(도 6A), PR8이 감염된 세포에서는 감염 후 120분까지 TrpRS의 농도가 증가하였으나, 120분 이후로는 감소하는 것으로 나타났다(도 6B). 이는 TrpRS가 바이러스 감염에도 반응하여 분비된다는 것을 보여준다.
<실시예 2>
TrpRS에 의한 단핵구/대식세포 특이적 TNF-α와 MIP1-α의 분비 증가 효과
분비된 TrpRS에 반응하는 면역세포의 종류를 알아보기 위하여, 다양한 면역세포를 TrpRS 처리하고, TNF-α와 MIP1-α 등 사이토카인을 분비하는 세포를 알아보았다(도 7). 맥스 마이크로비드 분리 키트(Macs microbead isolation kits, Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 쥐(mouse)의 프라이머리(primary) B, T 세포, 호중구(neutrophil), 자연살 세포(natural killer cell, NK), 단핵구(monocyte)를 채취하였다. 수득한 세포들은 유세포분석(flow cytometry)했을 때 세포 종류별로 95% 이상의 순도를 보였다. 골수유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage, BMDM)는 M-CSF(20ng/mL) 존재 하에 6 내지 7일간 분화하여 준비하였다. 골수유래 수지상세포(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)는 GM-CSF(20ng/mL)과 IL-4(20ng/ml) 존재 하에 6 내지 7일간 분화하여 준비하였다. 면역세포들은 실험 조건에 따라 각각 배양액(control), full-length TrpRS(TrpRS-full, 100nM), mini-TrpRS(TrpRS-mini, 100nM), 또는 LPS(100ng/ml) 처리한 뒤 18시간 동안 배양하고, 배양 상층액에 존재하는 TNF-α와 MIP1-α 단백질의 양을 ELISA 키트(BD Sciences, San Jose, CA, USA and R&D systems)로 측정하였다. TrpRS는 모두 인간 TrpRS(human TrpRS)의 아미노산 서열을 가진 단백질을 실험에 사용하였다.
그 결과, LPS는 대부분의 면역세포에서 TNF-α 분비를 급격하게 유도한 데 비해, full-length TrpRS는 단핵구(monocyte)와 BMDM에서 가장 큰 효과를 보였다(표 1, 도 7 상단). 열 또는 트립신 처리한 full-length TrpRS는 TNF-α 분비에 아무 효과가 없었다(데이터 미도시). 또한 mini-TrpRS도 TNF-α 분비에 아무런 영향을 미치지 않았다. MIP1-α에 대해서도 full-length TrpRS로 처리한 단핵구(monocyte)와 쥐의 BMDM에서만 TrpRS에 의한 증가 효과를 확인할 수 있었다(표 2, 도 7 하단). 이같은 실험 결과는 TrpRS가 단핵구와 대식세포를 특이적으로 활성화시키고, 활성화 결과로 단핵구와 대식세포는 TNF-α와 MIP1-α의 분비함을 보여준다.
Figure 112016019317507-pat00001
Figure 112016019317507-pat00002
<실시예 3>
TrpRS에 의한 선천면역반응의 활성화
<실시예 3-1>
TrpRS로 자극한 골수유래 대식세포가 분비하는 키모카인
BMDM이 TrpRS에 반응하여 분비하는 키모카인(chemokine)의 종류와 양을 조사하였다(표 3). BMDM을 full-length TrpRS(30, 100nM) 또는 mini-TrpRS(100nM) 처리하여 18시간 배양하고, 배양 상층액에 존재하는 키모카인을 ELISA 실험을 이용하여 측정하였다.
또한 인간 PBMC 세포에 인간 full length-TrpRS(FL-WRS)와 mini-TrpRS(mini-WRS)를 처리하여 18시간 배양하고, 배양 상층액에 존재하는 사이토카인을 ELISA 실험을 이용하여 측정하였고, RT-PCR 실험을 이용하여 사이토카인 및 키모카인의 발현량을 측정하였다.
hTNF-α Forward: 5’-GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3’
hTNF-α Reverse: 5’-CTGCCCAGACTCGGCAA-3’
hTrpRS Forward: 5’-AAGAATTCATGCCCAACAGTGAGCCC-3’
hTrpRS Reverse: 5’-AACTCGAGCTACCCTGGAGGACAGTCAGCCTT-3’
hMIP-1α Forward: 5’-ACCATGGCTCTCTGCAACCA-3
hMIP-1α Reverse: 5’-TTAAGAAGAGTCCCACAGTG-3’
hMIP-1β Forward: 5’-AGCCTCACCTCTGAGAAAACC-3’
hMIP-1β Reverse: 5’-GCAACAGCAGAGAAACAGTGAC-3’
GAPDH forward: 5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’
GAPDH reverse: 5’-TTGACTCCGACCTTCACCTTCC-3’
그 결과, full-length TrpRS는 농도의존적으로 MIP1-α, MCP-1, IP-10등 다양한 키모카인 및 TNF-α와 IL-1β등 사이토카인의 분비를 유도하였으나, mini-TrpRS는 사이토카인 및 키모카인 분비에 아무런 효과가 없었다(표 3). 또한, full-length TrpRS는 TNFα, MIP-1α, MIP-1β, IL-6 및 IL-8과 같은 키모카인 및 사이토카인의 분비를 유도하였으나, mini-TrpRS는 사이토카인 및 키모카인 분비에 아무런 효과가 없었다(도 8A). 또한, full length-TrpRS를 처리한 PBMC 세포에서 TNFα, MIP-1α, MIP-1β, IL-6 및 IL-8의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 8B, C).
이를 통해, Full length-TrpRS는 mini-TrpRS과 대조적으로 사이토카인의 발현이나 분비를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112016019317507-pat00003
<실시예 3-2>
면역세포 유동성에 대한 TrpRS의 영향
TrpRS가 면역세포의 유동성에 미치는 영향을 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 이용하여 알아보았다(도 9). 골수유래 대식세포(BMDM)를 full-length TrpRS(FL-WRS, 100nM) 또는 mini-TrpRS(mini-WRS, 100nM)로 처리하고 18시간 동안 배양한 배양액을 24-well plate에 옮겼다. Primary 면역세포와 BMDM을 이동 체임버(migration chamber) 윗부분에 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.
그 결과, full-length TrpRS 처리한 BMDM의 배양 상층액(TrpRS-F)이 단핵구(monocyte)와 호중구(neutrophil)의 침윤(infiltration) 현상을 크게 증가시키는 것을 관찰하였다. 이에 비해 TrpRS 단백질 자체(데이터 미도시) 또는 mini-TrpRS 처리한 배양 상층액(TrpRS-M)은 세포이동에 아무런 효과가 없었다.
<실시예 3-3>
TrpRS가 다양한 면역세포에서 MIP-1과 TNF-α의 분비에 미치는 영향
TrpRS가 PBMC 유래 대식세포, THP-1 세포, THP-1 유래 대식세포 및 J774A.1세포를 포함하는 다양한 면역세포에서 MIP-1과 TNF-α의 분비에 미치는 영향 ELISA 실험과 RT-PCR을 이용하여 확인하였다.
각 세포에 full length-TrpRS(FL-WRS, 100nM) 또는 mini-TrpRS(mini-WRS, 100nM)를 처리하고 18시간 동안 배양한 위 배양액을 96-well plate에 옮겨 ELISA 실험을 실시하였다. 이 중 BMDM 세포에 full-length TrpRS 또는 mini-TrpRS를 처리한 뒤 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 실시하였다.
그 결과, PBMC 유래 대식세포, THP-1, THP-1 유래 대식세포 및 J774A.1에서 full length-TrpRS가 MIP-1α의 분비를 유도하는 것을 확인하였다(도 10A). BMDM 세포에서 mini-TrpRS가 아닌 full length-TrpRS는 TNF-α, MIP-1α, MCP-1의 단백질의 생성을 유도하고(도 10B), mRNA의 발현을 유도하는 것을 확인하였다(도 10C).
<실시예 3-4>
TrpRS로 유발되는 체내 호중구 집중 현상
TrpRS가 체내 선천면역반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여, TrpRS 주입에 따른 복강 내 호중구 집중 현상(neutrophil recruitment)을 관찰하였다(도 11). 쥐의 복강에 PBS, full-length(3, 10, 30μg), 또는 mini-TrpRS(30μg)를 주입하고(각 군당 6~10 마리) 4시간 뒤 복강 삼출액을 뽑아 유세포분석 실험으로 Ly6C+Ly6G+ 세포군의 비율을 측정하고(도 11A, B), 복강 삼출액에 존재하는 MIP1-α를 ELISA 실험으로 측정하였다(도 11C). PBS 처리한 음성 대조군과 각 실험 조건의 결과의 비교에 대한 통계적 유의성은 GraphPad(ver. 4.0) 소프트웨어를 이용하여 one-way Anova test로 검증하였다. *** p<0.001, ** p<0.01
유세포분석 실험 결과, full-length TrpRS 주사한 쥐(TrpRS-F3, TrpRS-F10, TrpRS-F30)에서만 농도의존적 경향의 호중구(Ly6C+Ly6G+ 세포) 집중 현상이 현저하게 나타났으며, mini-TrpRS(TrpRS-M30)로는 이러한 효과를 내지 못하였다(도 11B). 즉 full-length TrpRS는 생체 내에서 호중구 집중 현상을 유발하는 선천면역반응을 유도할 수 있음을 보여준다. 마찬가지로 복강 삼출액에서 측정한 MIP1-α도 full-length를 주사한 쥐(TrpRS-F3, TrpRS-F10, TrpRS-F30)에서만 농도의존적로 증가하는 것이 관찰되었으며, mini-TrpRS(TrpRS-M30)는 효과가 없었다.
또한, mini-TrpRS와 PBS로 감염된 대조군과 비교하여 full length-TrpRS(FL-WRS)가 감염된 복막에서 Ly6G+ 호중구, CD11b+ 골수성 세포 및 CD11b+F4/80+ 대식세포의 수가 증가하는 것으로 나타났다(도 11D).
<실시예 3-5>
골수유래 대식세포의 활성화에 대한 TrpRS의 영향
TrpRS가 골수유래 대식세포(BMDM)의 활성화에 미치는 영향을 활성화된 대식세포의 표지(marker) 발현과 유세포분석을 통해 분석하였다(도 12). 도 11A의 Cd11b와 F4/80를 이용한 유세포분석은 골수세포가 대식세포 활성화 표지 분석을 위한 BMDM으로 잘 분화되었음을 나타낸다. 분화된 BMDM을 full-length TrpRS(30, 100 nM) 또는 mini-TprRS(100nM)로 처리하여 18시간 배양하고, CD40, CD80 그리고 CD86 단백질 발현 수준을 유세포 분석을 통해 측정하였다.
그 결과, full-length TrpRS를 처리한 BMDM(TrpRS-F)에서만 대식세포 활성화 지표인 CD40, CD80과 CD86의 세포 표면 발현(surface expression)이 급격히 증가하였음을 확인하였다(도 12B). Mini-TrpRS 처리한 BMDM(TrpRS-M)은 대조군과 크게 다르지 않았다. 즉 full-length TrpRS는 대식세포로의 활성화를 촉진함을 보여준다.
<실시예 3-6>
골수유래 대식세포의 대식작용에 대한 TrpRS의 영향
TrpRS가 골수유래 대식세포(BMDM)의 대식작용(phagocytosis)에 미치는 영향을 알아보았다(도 13). BMDM는 96웰 배양접시에서 하루 밤 배양한 후 M-CSF를 첨가하지 않은 RPMI 배양액으로 교체하고, full-length TrpRS(30nM) 또는 mini-TprRS(30nM) 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 세포를 세척한 후 100μL의 형광표지된 대장균 생체입자(fluorescein-labeled E. coli bioparticles(Vybrant phagocytosis assay kit, Invitrogen)를 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 100μL의 트립판 블루(trypan blue)로 1분간 처리하여 자가형광(autofluorescence)를 억제한 뒤, 대식작용에 의한 형광 신호를 485(excitation) 및 520nm(emission) 파장에서 측정하고 대식작용 정도는 형도를 측정하여 표시하였다 (BMG Labtech, FLUOstar OPTIMA, Ortenberg, Germany). 통계적 유의성은 GraphPad(ver. 4.0) 소프트웨어를 이용하여 t-test로 검증하였다. *** p<0.0001.
그 결과, full-length TrpRS 처리한 BMDM(TrpRS Full)의 대식작용 지수는 대조군에 비교하여 3배 이상 증가한 것을 확인하였다. Mini-TrpRS(TrpRS Mini)는 아무 효과가 없었다. 실시예 3-1 내지 3-4의 실험 결과들은 full-length TrpRS가 대식 세포 활성화를 통해 선천면역 염증 반응(innate inflammatory responses)을 유발하는 것임을 나타낸다.
<실시예 3-7>
TrpRS가 대식세포에 미치는 영향
Full length-TrpRS로 유래된 선천성 면역반응에서 대식세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 대식세포가 제거된 쥐를 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
정상쥐의 비장과 대식세포가 제거된 쥐의 비장으로부터 비장세포를 분리하여 대식세포가 제거된 것은 유세포분석법을 이용하여 확인하였다. 분리된 비장세포를 준비하여 24웰 배양접시에서 하루 밤 배양한 뒤 full length-TrpRS를 각각 처리하고, ELISA를 이용하여 TNF-α 및 MIP-1α의 분비를 측정하였다.
그 결과, 대식세포의 감소에 따라, TNF-α와 MIP-1α의 분비량이 감소하는 것을 확인하였다(도 14A). 체내에서 대식세포의 감소는 복막에서 침윤된 호중구의 수가 감소하여, 대식세포가 full length-TrpRS의 면역 자극 활성에서 기능적인 역할을 한다는 것을 나타낸다(도 14B).
이를 통해 full length-TrpRS는 선천적 면역 반응을 활성화하기 위해 대식세포를 표적으로 하는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 3-8>
TrpRS가 대식세포 활성에 미치는 영향
TrpRS가 골수유래 대식세포의 활성에 미치는 영향을 알아보았다.
Alexa647 표기된 full length-TrpRS(FL-WRS)나 mini-TrpRS(mini-WRS)를 쥐의 귀에 접종하여 체내 이미지 기술을 사용하여 감염 후 1시간과 4시간을 촬영하였다. 또한, Full length-TrpRS나 mini-TrpRS와 결합된 Alexa 647로 표기된 S. typhimurium을 GFP 발현에 의해 호중구와 대식세포를 관찰할 수 있는 GFP-LysM Tg 마우스의 귀에 접종하였다. 쥐에서 대식세포를 관찰하기 위해, 체내 이미지 기술(imaging technology)를 사용하여 대식세포를 촬영하고, 개수를 세었다.
이전에 설계된 시스템에서 수정된 custom-built video-rate laser-scanning confocal microscope imaging system(Choe et al., 2013; Seo et al., 2015)을 사용하여 면역 세포 역학(immuno-cellular dynamics)을 시각화하였다. 연속적인 3개의 레이저를 형광 자극 원으로 사용하였다. 쥐의 생체 내로부터 방출되는 세 가지 형광 색상은 488 nm (MLD, Cobolt), 561 nm (Jive, Cobolt) and 640 nm (MLD, Cobolt)의 파장에서 고감도 광전자층 튜브로 검출되었고, 8비트 3채널 프레임 그레버에 의해 디지털화되었다.
그 결과, mini-TrpRS가 아닌 full-length TrpRS를 접종한 부위에서 호중구와 대식세포의 침윤이 나타나는 것을 확인하였다. 접종 후 1시간에 침윤이 시작하였고, 접종 후 4시간에 침윤의 양이 가장 많은 것을 확인하였다(도 15A). 또한, mini-TrpRS(mini-WRS)나 PBS(Con)를 처리한 쥐와 비교하여, full length-TrpRS(FL-WRS)를 처리한 쥐에서 대식세포의 지수(phagocytic index)가 증가하는 것을 확인하였다(도 15B).
<실시예 4>
TrpRS 저해에 따른 효과
<실시예 4-1>
TrpRS에 특이적으로 결합하는 항체의 제조
감염에 대한 TrpRS의 보호역할을 더 유효하게 하기 위하여, TrpRS-특이적 항체로 TrpRS를 적정하였다. 먼저 파지 디스플레이 인간 단일 사슬 가변 단편(human single chain variable fragments, scFV)의 라이브러리를 패닝(panning)함으로, 인간 TrpRS의 N154 펩타이드를 특이적으로 결합하는 항체를 준비하였다(도 16).
면역 튜브에 TrpRS 10으로 코팅한 뒤 MPBS(PBS with 3% nonfat dried milk)로 블로킹하였다. mPBST 1ml에 Phage-displayed scFv library (1 X 1013CFU)를 넣어 면역 튜브에 첨가하였다. 2시간 동안 인큐베이션 후 PBST로 3-5번 세척하였고, 결합된 파지를 100mM 트리메틸아민 1mL로 용출한 뒤, 1M Tris-HCl(pH 7.0) 0.5ml로 중화하였다. 중간 로그기에서 E.coli ER257을 용출 된 파지고 감염시키고, 2% 글루코스와 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 하루 동안 배양한 뒤 박테리아를 수집하였다. 그 후 박테리아를 OD600 값이 0.5가 되도록 암피실린을 첨가한 20mL SB(3% Tryptone, 2% yeast extract, 1% MOPS, pH 7.0) 배지에서 배양하였다. VCSM13 helper phage (1 X 1011 PFU) 를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 감염시킨 뒤 카나마이신(kananycin, 70 μg/ml)을 첨가하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 파지 침전 용액(4% PEG8000 및 3% NaCl, 최종농도)을 첨가하여 혼합한 후 30분 동안 얼음에서 배양한 후 원심분리하여 침전된 파지를 수집하였다. 라이브러리를 4번 패닝한 후, TrpRS에 결합할 수 있는 개별적인 scFv 클론을 선별하였다. 이 과정을 도 16에 그림으로 나타냈다.
이와 같이, 제조한 TrpRS에 특이적으로 결합한 항체가 감염에 대한 TrpRS의 효과가 유효한지 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
PBMC에 제조한 항체(10μg/mL)를 처리하고, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, S. typhimurium(MOI=1)으로 감염시켰다. 이 후 세포 배양액에서 TNF-α의 분비 양상을 ELISA 실험으로 측정하였다. 또한, 이 중 4G1 클론을 선택하여 scFv 4G1이 full length-TrpRS(FL-WRS)에 결합하는지 확인하기 위하여, PBMC 세포 용해물을 추출하여 면역 블롯을 실시하였다.
그 결과, 몇몇 클론 중에서 F9, E11, 4G1 클론이 인간 PBMC 세포에서 full length-TrpRS의 TNF-α의 분비량이 감소하는 것을 확인하였고(도 17A), 4G1만 처리한 것과 full length-TrpRS와 4G1을 처리한 것에서 TNF-α의 분비량이 감소하는 것을 확인하였다(도 17B). 이 중 또한 면역블롯을 통하여 full length-TrpRS에 scFV 4G1이 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 17C).
<실시예 4-2>
TrpRS 특이적 항체에 의한 TNF-α와 MIP1-α의 분비 감소 효과
상기 실시예 5-1에서 제조한 scFV 4G1이 체내 선천면역반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 도 18A의 실험개요에 따라서 쥐를 이용한 동물실험을 진행하였다.
쥐에 S. typhimurium를 복강에 주입하여 감염시키거나 감염시키지 않은 군에 PBS 또는 sc Fv 4G1을 주사하였다. 감염 후 4시간 뒤 복강 삼출액을 뽑아 유세포분석 실험으로 Ly6G+ 세포의 수를 측정하고, ELISA 실험으로 MIP-1α와 TNF-α의 양을 분석하였다. PBS 처리한 음성 대조군과 각 실험 조건의 결과의 비교에 대한 통계적 유의성은 GraphPad(ver. 4.0) 소프트웨어를 이용하여 one-way Anova test로 검증하였다. *** p<0.001, ** p<0.01
ELISA 분석 결과, scFv 4G1을 처리한 쥐에서 MIP-1α와 TNF-α의 양이 감소하는 것을 확인하였다(도 18B). 또한, 유세포 분석실험 결과, scFv 4G1을 처리한 쥐에서 Ly6G+ 대식세포가 감소하는 것을 확인하였다(도 18C).
<실시예 4-3>
TrpRS 특이적 항체가 박테리아 감염된 쥐의 생존율에 미치는 영향
상기 실시예 5-1에서 제조한 scFv 4G1이 쥐의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 도 18A의 실험개요에 따라 쥐를 이용한 동물실험을 진행하여 생존 분석을 실시하였다. 상기에 기재된 바와 같이, 쥐에 S. typhimurium 를 복강에 주입하여 감염시키거나 감염시키지 않은 군에 PBS 또는 scFv 4G1을 주사하였다. 감염 후 12, 24, 36, 48시간의 쥐의 생존율을 나타냈다.
그 결과, 대조군인 ST+PBS(S. typhimurium 감염 후 PBS 주사)는 24시간에서 생존율이 50%였고, 48시간에는 25%였으나, ST+4G1(S. typhimurium 감염 후 scFv 4G1 주사)은 24시간에서 생존율이 25%이하였고, 36시간에서는 0%로 나타났다. 따라서 scFv 4G1을 주사한 군에서 쥐의 생존율이 감소하는 것을 확인하였다(도 19).
<실시예 5>
TrpRS의 생체 내 감염 억제 및 감염 후 생존율 증가 효과
<실시예 5-1>
TrpRS가 침윤 호중구에 의한 감염 박테리아 흡수에 미치는 영향
TrpRS가 S. typhimurium에 감염된 쥐의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 도 20의 실험 개요(도 20 상단)에 따라 쥐를 이용한 동물실험을 진행하고, 감염 후 한 시간 동안 S. typhimurium이 침윤 호중구(infiltrated neutrophil)에 흡수, 흡착되는 정도를 확인하였다(도 20 하단).
쥐(C57BL/6 mouse, 9 내지 12주령 암컷)의 복강에 PBS 또는 TrpRS(10μg, 0.5mg/kg)를 주사하고 1시간 뒤 형광표지된 S. typhimurium을 복강에 주사하였다(FITC-labeled S. typhimurium, 1X107 CFU/mouse, 각 군당 5~6마리). 감염 1시간 후 쥐를 희생하고 복강 내 세포들을 분리하여 Ly6G, Ly6C 항체로 염색하고 유세포분석하였다. 통계적 유의성은 t-test로 검증하였다. *** p< 0.001
그 결과, full-length TrpRS 처리한 군(TrpRS-Full)에서는 PBS 처리한 대조군(PBS)에 비하여 침윤 호중구의 수(Ly6G+ Neutrophils)도 크게 증가하였으며, 호중구에 흡착, 흡수된 S. typhimurium(FITC-S.typhimurium +/ Ly6G+ neutrophil)이 현저하게 증가했음을 확인하였다.
<실시예 5-2>
TrpRS가 비장 및 간의 감염 박테리아 제거 작용에 미치는 영향
도 21의 실험 개요에 따라 쥐(mouse)를 이용한 동물실험을 진행하여 감염 4시간 후 비장의 박테리아 제거 정도를 관찰하였다(도 21). S. typhimurim(도 21A) 또는 L. monocytogenes(도 21B)감염 4시간 후 쥐들을 희생하여 비장 및 간 균질액(spleen homogenate)를 만들고 10배 단계 희석(serial dilution)하여 NB agar 배지에서 배양하였다(각 군당 쥐 4 내지 8마리). 37℃에서 24시간 배양한 후 박테리아 집락형성단위(bacterial CFU)를 산출하여 분석하였다. 이후 통계적 유의성은 GraphPad(ver. 4.0) 소프트웨어를 이용하여 t-test로 검증하였다. ** p<0.01.
그 결과, S. typhimurim 감염시킨 쥐에서 mini-TrpRS(mini-WRS)나 PBS를 처리한 군보다 full-length TrpRS 처리한 군의 비장 및 간에서의 박테리아 CFU가 현저하게 감소했음을 확인하였다(도 21A). 또한 L. monocytogenes 감염시킨 쥐에서는 mini-TrpRS(mini-WRS)나 PBS를 처리한 군보다 full length-TrpRS(FL-WRS)를 처리한 군의 비장과 간에서의 박테리아 CFU가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 21B). 이는 TrpRS 처리한 쥐의 비장 및 간에서는 박테리아가 세포 감염을 일으키기 전에 제거되었음을 보여준다.
<실시예 5-3>
TrpRS가 박테리아 감염된 쥐의 생존률에 미치는 영향
TrpRS가 S. typhimurim(도 22A) 또는 L. monocytogenes(도 22B)에 감염된 쥐(mouse)의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 도 21의 실험 개요에 따라 쥐를 이용한 동물실험을 진행하고 생존 분석을 실시하였다(도 22). 쥐에 PBS, full-length TrpRS(FL-WRS) 또는 mini TrpRS(mini-WRS)를 주사한 후 1X107 CFU S. typhimurium 또는 L. monocytogenes를 복강에 주입하여 감염시켰다. 이후 감염 후 12, 24, 36, 48시간의 쥐의 생존률을 처리 조건에 따라 생존 도표(survival plot)로 나타내었다.
그 결과, S. typhimurim에 감염된 쥐에 full length-TrpRS를 투여한 쥐는 감염 후 36시간까지 100% 생존했고, 감염 후 48시간까지 75% 생존한 반면, PBS나 mini-TrpRS를 투여한 쥐는 감염 후 48시간에 80%이상이 사망한 것을 확인하였다(도 22A) L. monocytogenes에 감염된 쥐에 full length-TrpRS를 투여한 쥐도 감염 후 48시간 전까지 100% 생존했고, 감염 후 48시간에 약 75%가 생존한 반면, PBS나 mini-TrpRS를 투여한 쥐는 감염 후 24시간에 75%가 사망한 것을 확인하였다(도 22B). 이는 TrpRS 일회 주사만으로도 TrpRS 주사한 군의 생존기간이 대조군이나 mini-TrpRS 처리군의 생존기간보다 현저하게 연장되었음을 알 수 있다.
실시예의 결과들은 full-length TrpRS는 선천면역반응을 활성화시킴으로써 박테리아 감염된 쥐들의 치사율을 낮춘다는 것을 보여준다.
이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 조성물은 특히 선천면역반응을 활성화시킴으로써 박테리아 감염을 초기 단계에 억제하여 박테리아 감염이 유발하는 인간과 동물의 질환을 예방 또는 하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 면역증강 목적으로도 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center DAEJEON UNIVERSITY Industry-University Cooperation Foundation <120> Compositions for treating or preventing infection-induced inflammatory diseases and for enhancing immune responses comprising tryptophanyl-tRNA synthetase <130> NP16-0020 <150> KR 10-2015-0027617 <151> 2015-02-26 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens (Accession No. NP_004175.2) <400> 1 Met Pro Asn Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Glu Leu Phe Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ala Thr Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys Ala Gly Asn Ala Ser 20 25 30 Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu Val Ser Leu Lys Met 35 40 45 Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys 85 90 95 Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile 100 105 110 Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro 115 120 125 His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn 130 135 140 Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro 165 170 175 Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val 180 185 190 Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu 195 200 205 Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala 210 215 220 Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr 225 230 235 240 Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys 245 250 255 His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser 260 265 270 Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser 275 280 285 Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln 290 295 300 Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr 305 310 315 320 Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His 325 330 335 Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala 340 345 350 Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile 355 360 365 Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile 370 375 380 Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe 385 390 395 400 Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile 405 410 415 Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys 420 425 430 Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg 435 440 445 Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg 450 455 460 Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln 465 470 <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rattus norvegicus (Accession No. Q6P7B0.2) <400> 2 Met Ala Asp Met Pro Ser Gly Glu Ser Cys Thr Ser Pro Leu Glu Leu 1 5 10 15 Phe Asn Ser Ile Ala Ala Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Ala Pro Lys 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Lys Ser Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly 370 375 380 Arg Asp Thr Val Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Glu Val 385 390 395 400 Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Arg 405 410 415 Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly 420 425 430 Glu Leu Lys Lys Thr Leu Ile Asp Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu 435 440 445 His Gln Ala Arg Arg Lys Ala Val Thr Glu Glu Thr Val Lys Glu Phe 450 455 460 Met Thr Pro Arg Gln Leu Ser Phe His Phe Gln Cys Phe Cys Phe Asp 465 470 475 480 Thr <210> 4 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bos taurus (Accession No. P17248.3) <400> 4 Met Ala Asp Met Ser Asn Gly Glu Gln Gly Cys Gly Ser Pro Leu Glu 1 5 10 15 Leu Phe His Ser Ile Ala Ala Gln Gly Glu Leu Val Arg Asp Leu Lys 20 25 30 Ala Arg Asn Ala Ala Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Thr Ser Tyr Lys Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Lys 50 55 60 Val Asp Cys Pro Pro Gly Asp Pro Ala Pro Glu Ser Gly Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asp Ala Thr Glu Ala Asp Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln 85 90 95 Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Val Asn Arg Ile Glu Arg Ala 115 120 125 Thr Gly Gln Arg Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser 130 135 140 His Arg Asp Met His Gln Ile Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val 165 170 175 Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe 180 185 190 Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp 195 200 205 Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Tyr Ala Val Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe 225 230 235 240 Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Pro Gly Phe Tyr Lys Asn Val 245 250 255 Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe 260 265 270 Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp 290 295 300 Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro 305 310 315 320 Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys 325 330 335 Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln 340 345 350 Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp 355 360 365 Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly 370 375 380 Gly Arg Asp Thr Val Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp 385 390 395 400 Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp 405 410 415 Lys Leu Glu Gln Ile Arg Arg Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr 420 425 430 Gly Glu Leu Lys Lys Glu Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala 435 440 445 Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu 450 455 460 Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Tyr Asp Phe Gln 465 470 475 <210> 5 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sus scrofa (Accession No. JAA53775.1) <400> 5 Met Ala Asp Val Pro Asn Gly Glu Gln Gly Cys Ser Ser Pro Leu Glu 1 5 10 15 Leu Phe Asn Ser Ile Ala Ala Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys 20 25 30 Ala Arg His Ala Ala Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Met Ser Tyr Lys Ala Ala Met Gly Glu Asp Tyr Lys 50 55 60 Ala Asp Cys Pro Pro Gly Asn Arg Ala Pro Gly Ile Asp Ser Gly Leu 65 70 75 80 Asp Ala Thr Glu Ala Gly Asp Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln 85 90 95 Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asp Arg Ile Glu Arg Ala 115 120 125 Thr Gly Gln Arg Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser 130 135 140 His Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val 165 170 175 Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe 180 185 190 Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp 195 200 205 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Thr Gly Gln Arg Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser 130 135 140 His Arg Asp Met His Gln Ile Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val 165 170 175 Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe 180 185 190 Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp 195 200 205 Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Tyr Ala Val Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe 225 230 235 240 Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Pro Gly Phe Tyr Lys Asn Val 245 250 255 Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe 260 265 270 Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp 290 295 300 Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro 305 310 315 320 Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys 325 330 335 Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln 340 345 350 Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp 355 360 365 Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly 370 375 380 Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Leu Gly Gly Asn Cys Asp 385 390 395 400 Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp 405 410 415 Arg Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr 420 425 430 Gly Glu Leu Lys Lys Glu Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala 435 440 445 Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu 450 455 460 Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Tyr Asp Phe Gln 465 470 475 <210> 7 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Canis lupus (Accession No. XP_537554.1) <400> 7 Met Ala Asp Met Pro Asn Gly Glu Gln Gly Phe Ala Ser Pro Leu Glu 1 5 10 15 Leu Phe Asn Ser Ile Ala Ala Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys 20 25 30 Ala Gly Lys Ala Ser Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Leu Leu 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Met Ser Tyr Lys Ala Thr Val Gly Glu Glu Tyr Lys 50 55 60 Ala Asp Cys Pro Pro Ala Arg Pro Ala Pro Glu Asn Ser Arg Gly Leu 65 70 75 80 Asn Ala Ala Glu Ala Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln 85 90 95 Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Val Asn Arg Ile Glu Arg Ala 115 120 125 Thr Gly Gln Lys Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser 130 135 140 His Arg Asp Met Asn Gln Ile Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val 165 170 175 Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe 180 185 190 Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp 195 200 205 Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Tyr Ala Val Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Lys Lys Thr Phe Ile Phe 225 230 235 240 Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Pro Gly Phe Tyr Lys Asn Val 245 250 255 Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe 260 265 270 Gly Phe Thr Asp Ser Asp Ser Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp 290 295 300 Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro 305 310 315 320 Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys 325 330 335 Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln 340 345 350 Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp 355 360 365 Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly 370 375 380 Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp 385 390 395 400 Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp 405 410 415 Lys Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Asp Met Leu Thr 420 425 430 Gly Glu Leu Lys Lys Thr Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala 435 440 445 Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu 450 455 460 Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Tyr Asp Phe Gln 465 470 475 <210> 8 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felis catus (Accession No. XP_003988038.1) <400> 8 Met Ala Asp Val Pro Asn Gly Glu Gln Gly Cys Ala Ser Pro Leu Glu 1 5 10 15 Leu Phe Asn Arg Ile Ala Ala Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys 20 25 30 Ala Gly Lys Ala Pro Gln Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Gln Met Leu 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Met Ser Tyr Lys Ala Ala Met Gly Glu Asp Tyr Lys 50 55 60 Ala Asp Cys Pro Pro Gly Asn Pro Ala Pro Gly Asn Asn Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gly Ala Thr Glu Ala Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln 85 90 95 Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Val Asn Arg Ile Glu Arg Ala 115 120 125 Ile Gly Gln Lys Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser 130 135 140 His Arg Asp Met Asn Gln Ile Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val 165 170 175 Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe 180 185 190 Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp 195 200 205 Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Tyr Ala Val Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe 225 230 235 240 Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Ala Ser Pro Gly Phe Tyr Lys Asn Val 245 250 255 Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe 260 265 270 Gly Phe Thr Asp Ser Asp Ser Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Gly Asp 290 295 300 Lys Thr Asp Val Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro 305 310 315 320 Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys 325 330 335 Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln 340 345 350 Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp 355 360 365 Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly 370 375 380 Gly Arg Asp Thr Val Glu Glu His Arg Glu Phe Gly Gly Asn Cys Asp 385 390 395 400 Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp 405 410 415 Arg Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr 420 425 430 Gly Glu Leu Lys Lys Ile Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala 435 440 445 Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu 450 455 460 Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Tyr Asp Phe Gln 465 470 475 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTNF-alpha Forward <400> 9 ggagaagggt gaccgactca 20 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTNF-alpha Reverse <400> 10 ctgcccagac tcggcaa 17 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTrpRS Forward <400> 11 aagaattcat gcccaacagt gagccc 26 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTrpRS Reverse <400> 12 aactcgagct accctggagg acagtcagcc tt 32 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 13 cgctctctgc tcctcctgtt c 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 14 ttgactccga ccttcacctt cc 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMIP-1 alpha Forward <400> 15 accatggctc tctgcaacca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMIP-1 alpha Reverse <400> 16 ttaagaagag tcccacagtg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMIP-1 beta Forward <400> 17 agcctcacct ctgagaaaac c 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMIP-1 beta Reverse <400> 18 gcaacagcag agaaacagtg ac 22

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 박테리아에 의한 감염성 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 박테리아에 의한 감염성 염증질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물.
  3. 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 박테리아에 의한 감염성 염증질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 감염성 염증 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 감염성 염증 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제3항에 있어서, 상기 감염성 염증 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
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