ES2949987T3

ES2949987T3 - Composición para el tratamiento o la prevención de enfermedad inflamatoria infecciosa o composición para la mejora inmunitaria, que comprende triptofanil-ARNt sintetasa como principio activo

Info

Publication number: ES2949987T3
Application number: ES16755930T
Authority: ES
Inventors: Sunghoon Kim; Mi Rim Jin; Young Ha Ahn
Original assignee: Mirimgene Co Ltd
Current assignee: Mirimgene Co Ltd
Priority date: 2015-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2023-10-04
Anticipated expiration: 2036-02-26
Also published as: US11207389B2; US20180064790A1; US20210205423A1; EP3292872B9; EP3292872C0; EP3292872A1; KR20160104587A; KR101899591B1; EP3292872A4; EP3292872B1; WO2016137280A1

Abstract

La presente invención se refiere a una composición para el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias infecciosas, o una composición para mejorar el sistema inmunológico, que comprende una triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) como ingrediente activo y, más específicamente, a una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención. una composición alimenticia para prevención o mejora, y una composición médica veterinaria para prevención o tratamiento de enfermedades inflamatorias causadas por infección, las composiciones que comprenden triptofanil-ARNt sintetasa como ingrediente activo, y una composición para mejora inmune que comprende triptofanil-ARNt sintetasa como ingrediente como ingrediente activo. La composición de la presente invención puede ser útil para prevenir o tratar enfermedades en humanos y animales causadas por infecciones por bacterias, virus y similares, en particular, activando la respuesta inmune innata para inhibir infecciones bacterianas, virus, etc. en la etapa temprana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para el tratamiento o la prevención de enfermedad inflamatoria infecciosa o composición para la mejora inmunitaria, que comprende triptofanil-ARNt sintetasa como principio activo

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias infecciosas provocadas por al menos uno seleccionado del grupo que consiste en bacterias, virus y hongos, que comprende triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) como un principio activo, en donde la TrpRS induce la acumulación de neutrófilos en el cuerpo. Más particularmente, la composición actualmente desvelada puede ser una composición alimenticia, una composición farmacéutica o una composición veterinaria.

[Tecnología antecedente]

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente coreana N.° 10-2015-0027617 presentada el 26 de febrero de 2015.

La aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) es una enzima que media la unión específica de aminoácidos al ARNt y desempeña un papel fundamental en la producción de proteínas. Recientemente, se sabe que estas AARS están implicadas en diversos fenómenos de la vida tales como apoptosis, angiogénesis y reacción inflamatoria además de sus funciones intrínsecas. La triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) pertenece a la clase I de AARS y está presente en el citoplasma de una célula. Se sabe que mini-TrpRS, que no contiene un dominio N-terminal adicional de TrpRS, es un factor angiostático que se activa por IFN-γ. Se observa que TrpRS de longitud completa se secretó en células vasculares, pero aún no se sabe qué papel juega en el cuerpo (Guo M et al. (2013), Nat. Chem. Biol, 9 (3): 145-153). El documento WO-A-2011097031 describe la actividad terapéutica de TrpRS en el tratamiento de la inflamación. El documento WO-A-2011072265 describe la actividad terapéutica de TrpRS en el tratamiento de la inflamación.

[Descripción detallada de la invención]

[Problema técnico]

Mientras buscaban las novedosas funciones biológicas de la triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) además de sus funciones esenciales relacionadas con la síntesis de proteínas, los presentes inventores descubrieron que la triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) activa las respuestas inmunitarias innatas e inhibe la infección de bacterias, hongos, virus y similares, completando la presente invención.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1.

Preferentemente, la composición actualmente desvelada puede ser una composición alimenticia, de acuerdo con la reivindicación 2.

Preferentemente, la composición actualmente desvelada puede ser una composición veterinaria, de acuerdo con la reivindicación 3.

Se describe y no se reivindica en sí misma una composición para la mejora inmunitaria que comprende una triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

Se describe y no se reivindica en sí mismo un método para prevenir, mejorar o tratar enfermedades inflamatorias infecciosas que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

Se describe y no se reivindica en sí mismo un uso para la preparación de un agente para prevenir, mejorar o tratar enfermedades inflamatorias infecciosas que comprenden como una triptofanil-ARNt sintetasa un principio activo. Se describe y no se reivindica en sí mismo un método para la mejora inmunitaria que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

Se describe y no se reivindica en sí mismo un uso para producir un agente para la mejora inmunitaria que comprende una triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

(1) . La presente invención es para proporcionar una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1.

(2) . Preferentemente, la composición para su uso de acuerdo con (1), en donde dicha composición es una composición alimenticia.

(3) Preferentemente, la composición para su uso de acuerdo con (1), en donde dicha composición es una composición farmacéutica o una composición veterinaria.

(4) Preferentemente, la composición para su uso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), en donde la triptofanil-ARNt sintetasa está representada por una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

(5) La composición para su uso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), en donde las enfermedades inflamatorias infecciosas son al menos una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en salmonelosis, intoxicación alimentaria, fiebre tifoidea, paratifoidea, septicemia, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODs ), neumonía, tuberculosis pulmonar, tuberculosis, resfriado, gripe, infección de las vías respiratorias, rinitis, nasofaringitis, otitis media, bronquitis, linfoadenitis, paperas, adenolinfitis, queilitis, estomatitis, artritis, miositis, dermatitis, vasculitis, gingivitis, pericementitis, queratitis, conjuntivitis, infecciones de heridas, peritonitis, hepatitis, osteomielitis, celulitis, meningitis, encefalitis, abscesos cerebrales, encefalomielitis, meningitis cerebral, osteomielitis, nefritis, carditis, endocarditis, enteritis, gastritis, esofagitis, duodenitis, colitis, infección del tracto urinario, cistitis, vaginitis, cervicitis, salpingitis, eritema infeccioso, disentería bacteriana, absceso y úlcera, bacteriemia, diarrea, disentería, gastritis, gastroenteritis, absceso genitourinario, herida abierta o infección de herida, inflamación purulenta, abscesos, flemones, piodermia, impétigo, foliculitis, celulitis, infección de la herida después de la cirugía, síndrome de la piel escaldada, síndrome de quemaduras en la piel, trombocitopenia trombótica, síndrome urémico hemolítico, insuficiencia renal, pielonefritis, glomerulonefritis, absceso del sistema nervioso, otitis media, sinusitis, faringitis, amigdalitis, mastoiditis, inflamación de los tejidos blandos, infección dental, dacriocistitis, pleuresía, absceso abdominal, absceso hepático, colecistitis, absceso de bazo, pericarditis, miocarditis, placentitis, infección de líquido amniótico, mamitis, mastitis, fiebre puerperal, síndrome de choque tóxico, enfermedad de Lyme, gangrena gaseosa, ateroesclerosis, síndrome de Mycobacterium avium (MAC), infección por Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH), infección por Escherichia coli enteropatógena (EPEC), infección por Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), infecciones por Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (VRSA) y listerosis.

Se describe y no se reivindica en sí misma una composición para la mejora inmunitaria que comprende triptofanilARNt sintetasa como un principio activo.

Se describe y no se reivindica en sí mismo un uso para preparar un agente para prevenir, mejorar o tratar enfermedades inflamatorias infecciosas que comprenden triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

Se describe y no se reivindica en sí mismo un método para la mejora inmunitaria que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

Se describe y no se reivindica en sí mismo un uso para preparar un agente para la mejora inmunitaria que contiene triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle.

La presente invención proporciona una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1. La triptofanil-ARNt sintetasa puede estar representada por una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

Los inventores descubrieron y desvelaron por primera vez en este documento que la TrpRS tiene la función de inhibir infecciones tales como infecciones bacterianas, víricas y fúngicas al activar el sistema inmunitario, particularmente las respuestas inmunitarias innatas.

Específicamente, un siguiente Ejemplo muestra que la TrpRS se secretó fuera de las células desde el comienzo de la infección, cuando las células mononucleares de sangre periférica se infectan con bacterias y virus y la TrpRS secretada aumenta la producción de TNF-a, una citocina inflamatoria. Otro ejemplo muestra que cuando las células mononucleares de sangre periférica se infectan con bacterias, la TrpRS se secreta activamente en lugar de secreción debido a la piroptosis, y la TrpRS, que ya está presente en la célula, se secreta sin inducción de su expresión génica.

Otro ejemplo muestra que la TrpRS aumentó la secreción de diversas citocinas, particularmente en monocitos y macrófagos, y promueve la diferenciación de macrófagos y la activación de su función fagocítica.

En otro Ejemplo más, se muestra que la acción de TrpRS aumentó la fluidez celular de los neutrófilos y los monocitos y cuando se inyecta TrpRS en el cuerpo, induce la concentración de neutrófilos intraperitoneales, aumenta el número de neutrófilos y macrófagos y promueve su activación.

Otro Ejemplo más muestra que la secreción de TNF-a y MIP-1a disminuyó y la tasa de mortalidad aumentó cuando un anticuerpo específico de TrpRS se trató con una célula infectada con bacterias para inhibir la actividad de TrpRS.

Además, en otro Ejemplo, cuando se administró TrpRS a un organismo vivo, aumentó el número de neutrófilos en la cavidad abdominal y se confirmó que las bacterias se eliminaron del hígado y el bazo. Esto confirma que TrpRS promueve la acción de eliminar las bacterias infecciosas del cuerpo y reduce notablemente la tasa de mortalidad asociada a la infección.

Por tanto, los presentes inventores descubrieron y desvelaron en el presente documento que la triptófano ARNt sintetasa (TrpRS) de la presente invención se secreta al exterior de la célula por infecciones tales como la infección bacteriana, vírica y fúngica y la TrpRS activa las células inmunitarias y es eficaz en el tratamiento o la prevención de enfermedades inflamatorias infecciosas.

Como se usa en el presente documento, "TrpRS" o "polipéptido TrpRS" se refiere a un polipéptido conocido como triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS o WRS). El polipéptido TrpRS puede ser un polipéptido que tenga cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8. La TrpRS de la presente invención también incluye equivalentes funcionales de la misma. "Polipéptido" se usa indistintamente con "polipéptidos" o "proteína o proteínas" y se refiere a un polímero de restos de aminoácidos, como se encuentra comúnmente en las proteínas en estado natural.

El equivalente funcional mencionado anteriormente significa una homología de secuencia (es decir, identidad) de al menos el 70 % o más, preferentemente el 80 % o más y más preferentemente el 90 % o más con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, un polipéptido que tiene el 70 %, el 71 %, el 72 %, el 73 %, el 74 %, el 75 %, el 76 %, el 77 %, el 78 %, el 79 %, el 80 %, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de una homología de secuencia, que tiene una actividad fisiológica sustancialmente homogénea como un polipéptido representado por cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8. En el presente documento, la "actividad fisiológica sustancialmente homogénea" significa la activación de funciones de células inmunitarias tales como la producción y la secreción de citocinas, la fluidez celular y la fagocitosis de macrófagos, la inducción de la concentración de neutrófilos en el cuerpo y la potenciación de la acción de eliminar las bacterias infectantes.

Los equivalentes funcionales pueden resultar de la adición, la sustitución o la eliminación de un aminoácido en cualquier parte de cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8. La sustitución del aminoácido es preferentemente una sustitución conservativa. Los ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos presentes en la naturaleza son como sigue: aminoácidos alifáticos (Gly, Ala, Pro), aminoácidos hidrófobos (Ile, Leu, Val), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp), aminoácidos ácidos (Asp, Glu), aminoácidos básicos (His, Lys, Arg, Gln, Asn) y aminoácidos que contienen azufre (Cys, Met). Además, los equivalentes funcionales incluyen variantes en las cuales algunos de los aminoácidos están eliminados en la secuencia de aminoácidos del polipéptido TrpRS de la presente invención. La eliminación o sustitución del aminoácido se localiza preferentemente en una región que no está directamente relacionada con la actividad fisiológica del polipéptido de la presente invención. La eliminación del aminoácido también se localiza preferentemente en un sitio que no está directamente implicado en la actividad fisiológica del polipéptido TrpRS. También se incluyen variantes en las cuales se han añadido varios aminoácidos en ambos extremos o secuencias de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TrpRS. También se incluyen dentro del alcance de los equivalentes funcionales de la presente invención los derivados de polipéptidos en los cuales algunas de las estructuras químicas de los polipéptidos se modifican manteniendo la cadena principal básica del polipéptido de acuerdo con la presente invención y su actividad fisiológica. Esto incluye, por ejemplo, modificaciones estructurales para alterar la estabilidad, la estabilidad en estantería, la volatilidad o la solubilidad de los polipéptidos de la presente invención.

En la presente memoria descriptiva, la homología y la homogeneidad de la secuencia se definen como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata a la secuencia de aminoácidos de TrpRS después de alinear la secuencia candidata con la secuencia de aminoácidos de TrpRS (cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8) e introduciendo espacios. Si fuera necesario, las sustituciones conservativas como parte de la homología de secuencia no se consideran para obtener el porcentaje máximo de homología de secuencia. Además, el tramo, la eliminación o la inserción de extremo N, extremo C o región interna en la secuencia de aminoácidos de TrpRS no se interpreta como una secuencia que afecta la homología de secuencia o la homología. Además, dicha homología puede determinarse mediante métodos convencionales usados para comparar porciones similares de secuencias de aminoácidos de dos polipéptidos. BLAST o un programa informático similar alinea dos polipéptidos de tal manera que cada aminoácido coincida de manera óptima (a lo largo de la secuencia de longitud completa de una o dos secuencias o a lo largo de la porción predicha de una o dos secuencias). El programa proporciona un PAM 250 (Standard Scoring Matrix; Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, suμl 3, 1978), que proporciona una penalización de apertura predeterminada y una penalización de brecha predeterminada y puede usarse junto con un programa de ordenador. Por ejemplo, el porcentaje de homogeneidad puede calcularse multiplicando el número total de coincidencias idénticas por 100 y después dividiendo entre la suma del número de espacios introducidos en la secuencia más larga para alinear dos secuencias con la longitud de la secuencia más larga en el intervalo emparejado.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden extraerse de forma natural o construirse mediante métodos de ingeniería genética. El ácido nucleico puede construirse mediante amplificación por PCR usando cebadores apropiados. Como alternativa, las secuencias de ADN pueden sintetizarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado (disponible en el mercado de Biosearch o Applied Biosystems). El ácido nucleico construido se inserta en un vector que comprende una o más secuencias de control de la expresión (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) unidos operativamente a la expresión del ácido nucleico, y una célula hospedadora se transforma con el vector de expresión recombinante formado a partir de ella. El transformante resultante se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico y el polipéptido sustancialmente puro expresado por el ácido nucleico se recupera del cultivo. La recuperación puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, cromatografía). Como se usa en el presente documento, "polipéptido sustancialmente puro" significa que el polipéptido de acuerdo con la invención está sustancialmente libre de cualquier otra proteína derivada de la célula hospedadora. Los métodos de ingeniería genética para la síntesis de polipéptidos de la presente invención pueden encontrarse en las siguientes referencias: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Segunda (1998) y tercera (2000) ediciones; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; y Hitzeman et al., J.Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

Además, los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse fácilmente mediante síntesis química conocida en la técnica (Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman y Co., NY, 1983). Los métodos representativos incluyen, pero no se limitan a, síntesis en fase líquida o sólida, condensación fraccionada, química F-MOC o T-BOC (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., c Rc Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1989).

La triptofanil-ARNt sintetasa de la composición de acuerdo con la presente invención puede usarse en su propia forma o en forma de una sal, preferentemente una sal farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa fisiológicamente aceptable y normalmente no provoca una reacción alérgica o similar cuando se administra a humanos y la sal es preferentemente una sal de adición de ácido formada por un ácido libre farmacéuticamente aceptable. Como el ácido libre, puede usarse un ácido orgánico y un ácido inorgánico. Los ácidos orgánicos incluyen, pero no se limitan a, cítrico, acético, láctico, tartárico, maleico, fumárico, fórmico, propiónico, oxálico, trifluoroacético, benzoico, glucónico, metosulfónico, glicólico, succínico, Ácido glutámico y ácido aspártico. El ácido inorgánico incluye, pero no se limita a, ácido clorhídrico, ácido brómico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico.

"Farmacológicamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica que es fisiológicamente aceptable y no inhibe la acción del principio activo cuando se administra a seres humanos y normalmente no provoca una reacción alérgica tal como un trastorno gastrointestinal, mareos o similares. La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse en diversas formas de acuerdo con la vía de administración mediante un método conocido en la técnica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para el efecto inmunoestimulador de la triptofanil-ARNt sintetasa. Dichos vehículos incluyen toda clase de disolventes, medios de dispersión, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, composiciones acuosas, liposomas, microperlas y microsomas.

La vía de administración puede ser oral o parenteral. Los métodos de administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intracardíaca, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o puede ser administración rectal.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía oral, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse en un polvo, un gránulo, un comprimido, una píldora, un comprimido de azúcar, una cápsula, un líquido, un gel, un jarabe, una suspensión, una oblea y similares. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen sacáridos que incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol y maltitol y almidones incluyendo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de patata, y celulosa incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica e hidroxipropilmetilcelulosa, y cargas tales como gelatina, polivinilpirrolidona y similares. Además, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o alginato sódico pueden añadirse opcionalmente como disgregante. Además, la composición farmacéutica puede comprender además un anticoagulante, un lubricante, un agente humectante, un agente saborizante, un agente emulsionante y un agente antiséptico.

Además, cuando se administra por vía parenteral, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica en forma de inyecciones, fármacos transdérmicos e inhaladores nasales junto con un vehículo parenteral adecuado. En el caso de inyecciones, deben estar esterilizadas y protegidas de la contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. Los ejemplos de vehículos adecuados para inyecciones incluyen, pero no se limitan a, disolventes o medios de dispersión que contienen agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, etc.), mezclas de los mismos y/o pueden ser aceites vegetales. Más preferentemente, los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, solución de Hank, solución de Ringer, solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene trietanolamina o pueden ser soluciones isotónicas tales como agua estéril para inyección, etanol al 10%, propilenglicol al 40% y dextrosa al 5%. Para proteger la inyección de la contaminación microbiana, diversos agentes antibacterianos y antifúngicos tales como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares pueden incluirse adicionalmente. Además, las inyecciones en la mayoría de los casos también pueden contener agentes isotónicos tales como azúcares o cloruro sódico.

Los ejemplos de formas de dosificación transdérmica incluyen pomadas, cremas, lociones, geles, soluciones para uso externo, pastas, linimentos y rodillos de aire. La "administración transdérmica" significa que una composición farmacéutica se administra localmente en la piel, por lo que se administra a la piel una cantidad eficaz del principio activo contenido en la composición farmacéutica. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede prepararse en una formulación de tipo pulverizador, que se pincha suavemente con una aguja fina de inyección de calibre 30 o se aplica directamente sobre la piel. Estas formulaciones se describen en la bibliografía (Remington's Pharmaceutical Science, 15a edición, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania), que es una prescripción comúnmente conocida en química farmacéutica.

En el caso de las formas farmacéuticas de inhalación, los compuestos usados de acuerdo con la presente invención pueden formularse en un paquete presurizado o un paquete presurizado usando un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados. Puede administrarse convenientemente en forma de pulverizador en aerosol desde un nebulizador. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse dotándolo de una válvula que suministra una cantidad medida. Por ejemplo, las cápsulas y los cartuchos de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener un compuesto y una mezcla de polvo de una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Como otros vehículos farmacéuticamente aceptables, puede hacerse referencia a aquellos descritos en las siguientes referencias (Remington's Pharmaceutical Sciences, l9a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también puede contener uno o más tampones (por ejemplo, solución salina o PBS), un carbohidrato (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextrano), un antioxidante, un bacteriostático, un agente quelante (por ejemplo, EDTA o glutatión), un adyuvante (por ejemplo, Hidróxido de aluminio), un agente de suspensión, un agente espesante y/o un conservante.

Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse usando métodos conocidos en la técnica para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del principio activo después de su administración a un mamífero.

Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse en combinación con un compuesto conocido que tiene el efecto de prevenir o tratar una enfermedad inmunitaria o una enfermedad inflamatoria infecciosa.

En las enfermedades inflamatorias provocadas por la infección bacteriana de la presente invención, la bacteria puede seleccionarse preferentemente de una o más del grupo que consiste en Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter hydrophila, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes xylosoxidans, Bacteroides distasonis, Bacteroides fragilis, Bacteroides melaninogenicus, Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Bartonella henselae, Bordetella pertussis, Branhamella catarrhalis, Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella canis, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Citrobacter diversus, Cltrobacter freundi, Citrobacter koseri, Coxiella burnetii, Edwarsiella tarda, Ehrlichia chafeenis, Eikenella corrondens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia vulneris, Flavobacterium meningosepticum, Francisella tularensis, Fusobacterium spp., Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozaenae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Pasteurella multoclda, Plesiomonas shigelloides, Porphyromonas asaccharolytica, Porphyromonas gingivalis, Prevotella bivia, Prevotella buccae, Prevotella corporis, Prevotella endodontalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella oralis, Proteus mirabilis, Proteus myxofaclens, Proteus penner, Proteus vulgaris, Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri, ProvidenCla stuarfii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Ricketsia prowozekii, Salmonella bongori, Salmonella entérica, Serratia marcescens, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulunificus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis.

Como se usa en el presente documento, las enfermedades inflamatorias provocadas por infecciones bacterianas incluyen infecciones bacterianas que se producen en mamíferos y aves, y enfermedades acompañadas de infecciones bacterianas, Preferentemente, puede ser neumonía, otitis media, sinusitis, bronquitis, amigdalitis y mastoiditis asociadas a infección por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus o el género Peptostreptococcus; Faringitis, fiebre reumática y glomerulonefritis relacionadas con infección por Streptococcus pyogenes, estreptococos de los grupos C y G, Clostridium diptheriae o Actinobacillus haemolyticum; infecciones de las vías respiratorias asociadas a infecciones por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae o Chlamydia pneumoniae; Infecciones no complejas de piel y tejidos blandos, flemones, osteomielitis y fiebre puerperal asociadas a infección por Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa positivo (por ejemplo, ^{S .} epidermidis, S. hemolyticus, etc.), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus grupo C-F (micro-colonia de Streptococcus), Viridans streptococcus, Corynebacterium minutissimum, género Clostridium o Bartonella henselae; Infección aguda del tracto urinario no complejada; uretritis y cervicitis asociadas a infección por Staphylococcus saprophyticus o género Enterococcus; y enfermedades de transmisión sexual asociadas a la infección por Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum o Neiserria gonorrheae; enfermedades tóxicas asociadas a la infección por ^{S .} aureus (intoxicación alimentaria y síndrome de choque tóxico), estreptococos de los grupos A, B y C; úlceras asociadas a infección por Helicobacterpylori; síndrome febril sistémico asociado a infección por Borrelia recurrentis; enfermedad de Lyme asociada a infección por Borrelia burgdorferi; conjuntivitis, queratitis y dacriocistitis asociadas a infección por Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae o género Listeria; Síndrome difuso de Mycobacterium avium (MAC) asociado a infección por Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare; Gastroenteritis asociada a infección por Campylobacter jejuni; Infección dental asociada a infección por Streptococcus viridans; Tos persistente asociada a infección por Bordetella pertussis; Gangrena gaseosa asociada a infección por Clostridium perfringens o el género Bacteroides; y aterosclerosis acompañada de infección por Helicobacter pylori o Chlamydia pneumoniae. Las infecciones bacterianas que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse mediante la composición de la presente invención y las enfermedades provocadas por estas infecciones se citan en J. P. Sanford et al. ("The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy", 26°, Antimicrobial Therapy, Inc., 1996).

La enfermedad inflamatoria provocada por la infección bacteriana de la presente invención es más preferentemente una enfermedad provocada por una infección bacteriana del género Escherichia, el género Listeria, el género Salmonella o el género Staphylococcus.

Las enfermedades inflamatorias infecciosas provocadas por virus de acuerdo con la presente invención pueden incluir una enfermedad inflamatoria provocada por una infección tal como, por ejemplo, adenovirus, virus del herpes (por ejemplo, VHS-I, VHS-II, CMV o VZV), poxvirus (por ejemplo, viruela), ortopoxvirus tales como vaccinia o molusco contagioso^,picornavirus (por ejemplo, Linovirus o enterovirus), ortomicovirus (por ejemplo, virus de la gripe), paramixovirus (por ejemplo, virus 5-para-influenza, virus de las paperas), virus del sarampión y virus respiratorio sincicial (RSV), coronavirus (por ejemplo, SARS), papovavirus (por ejemplo, virus del papiloma que provocan verrugas genitales, verrugas comunes o verrugas plantares), hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B), flavivirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B o virus de la hepatitis C o virus del dengue) o retrovirus (por ejemplo, lentivirus tales como VIH)), citomegalovirus y similares. Preferentemente, puede ser una enfermedad inflamatoria provocada por la infección del virus seleccionado del grupo que consiste en rinovirus, coronavirus, virus de la gripe, virus sincicial respiratorio (VSR), adenovirus, virus paragripal, virus del herpes simple, citomegalovirus y similares, que están provocados por la infección de neumonía, gripe (influenza) o virus que se sabe que provocan infección del tracto respiratorio.

Específicamente, la enfermedad inflamatoria infecciosa de la presente invención puede ser al menos una seleccionada del grupo que consiste en salmonelosis, intoxicación alimentaria, fiebre tifoidea, paratifoidea, septicemia, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), neumonía, tuberculosis pulmonar, tuberculosis, resfriado, gripe, infección de las vías respiratorias, rinitis, nasofaringitis, otitis media, bronquitis, linfoadenitis, paperas, adenolinfitis, queilitis, estomatitis, artritis, miositis, dermatitis, vasculitis, gingivitis, pericementitis, queratitis, conjuntivitis, infecciones de heridas, peritonitis, hepatitis, osteomielitis, celulitis, meningitis, encefalitis, abscesos cerebrales, encefalomielitis, meningitis cerebral, osteomielitis, nefritis, carditis, endocarditis, enteritis, gastritis, esofagitis, duodenitis, colitis, infección del tracto urinario, cistitis, vaginitis, cervicitis, salpingitis, eritema infeccioso, disentería bacteriana, absceso y úlcera, bacteriemia, diarrea, disentería, gastritis, gastroenteritis, absceso genitourinario, herida abierta o infección de herida, inflamación purulenta, abscesos, flemones, piodermia, impétigo, foliculitis, celulitis, infección de la herida después de la cirugía, síndrome de la piel escaldada, síndrome de quemaduras en la piel, trombocitopenia trombótica, síndrome urémico hemolítico, insuficiencia renal, pielonefritis, glomerulonefritis, absceso del sistema nervioso, otitis media, sinusitis, faringitis, amigdalitis, mastoiditis, inflamación de los tejidos blandos, infección dental, dacriocistitis, pleuresía, absceso abdominal, absceso hepático, colecistitis, absceso de bazo, pericarditis, miocarditis, placentitis, infección de líquido amniótico, mamitis, mastitis, fiebre puerperal, síndrome de choque tóxico, enfermedad de Lyme, gangrena gaseosa, ateroesclerosis, síndrome de Mycobacterium avium (MAC), infección por Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH), infección por Escherichia coli enteropatógena (EPEC), infección por Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), infecciones por Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (VRSA) y listerosis.

Escherichia es un bacilo gramnegativo con ocho especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Aunque la mayoría de las bacterias del género Escherichia tienen una relación simbiótica con el hospedador y son inofensivas para los hospedadores, son una causa importante de infecciones del tracto urinario y provocan una diversidad de enfermedades gastrointestinales. E. coli es la bacteria patógena más común de Escherichia. Además, E. fergusonii infecta heridas abiertas o heridas, provocando bacteriemia e infección del tracto urinario, y E. vulneris también infecta principalmente heridas.

E. coli se divide además en 190 serotipos de acuerdo con los antígenos O, H y K. La Escherichia coli patógena se clasifica en E. coli enterotoxigénica (ETEC), que produce enterotoxina, E. coli enterohemorrágica (EEEC), que produce verotoxina, E. coli enteroinvasiva (EIEC), que invade las células epiteliales de la mucosa intestinal y provoca infección tisular y E. coli enteropatógena (EPEC), que provoca gastroenteritis aguda y E. coli enteroagregante (EAggEC). Escherichia coli hemorrágica intestinal provoca hemorragia y dolor abdominal grave, rara vez trombocitopenia trombótica o síndrome urémico hemolítico y puede provocar insuficiencia renal grave. Esta clase de infección por Escherichia coli se denomina colitis hemorrágica debido a los síntomas de diarrea hemorrágica grave. Especialmente E. coli O157: H7 es un importante organismo que provoca intoxicación alimentaria. E. coli tóxica es un organismo causante de enteritis y diarrea del viajero, provocando diarrea con deshidratación. Escherichia coli es un síntoma importante de fiebre y dolor abdominal. Infecta las células epiteliales de la mucosa del intestino grueso y provoca infección. Por tanto, las úlceras se forman por necrosis celular y provocan diarrea, que es una mezcla de sangre y moco. Escherichia coli patógena intestinal presenta síntomas de vómitos, dolor abdominal, diarrea y fiebre. Escherichia coli es una infección principalmente a través de pacientes, vehículos y excrementos de animales, pero cualquier alimento contaminado con bacterias puede ser un agente causal debido a una amplia gama de distribución tales como el ganado, las personas y el entorno natural.

Se sabe que Listeria es una bacteria grampositiva de forma uniforme y corta y existen 10 especies de Listeria. Solo L. monocytogenes y L. ivanovii son los patógenos y se sabe que solo L. monocytogenes es capaz de infectar a los seres humanos.

La listeria se transmite principalmente a través de alimentos contaminados y puede transmitirse directamente desde un animal infectado. La listeriosis a menudo se manifiesta como fiebre o sepsis, tales como fiebre alta, mialgia y puede provocar meningitis, encefalitis, abscesos cerebrales, etc. en el sistema nervioso central. La infección del tracto gastrointestinal provoca síntomas tales como fiebre, náuseas y vómitos. Rara vez se ve como una infección local tal como tejido blando, conjuntivitis, pleuritis, peritonitis, hepatitis, absceso hepático, colecistitis, absceso de bazo. Puede provocar síntomas infecciosos importantes tl.es como sepsis o meningitis y peritonitis, endocarditis y absceso cerebral en pacientes con inmunidad celular disminuida, receptores de trasplantes de órganos sometidos a tratamiento inmunosupresor, ancianos y mujeres embarazadas. Las mujeres embarazadas provocan bacteriemia similar a la de la gripe. A menos que sean tratados temprano, pueden provocar infecciones placentarias y fetales, dando lugar a un aborto espontáneo o muerte fetal. Los adultos saludables también pueden provocar gastroenteritis.

Salmonella es un bacilo gramnegativo en forma de bastoncillo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. El género Salmonella se clasifica en dos especies, Salmonella enterica (S. enterica) y Salmonella bongori (S. bongori) y S. enterica de nuevo se divide en seis subespecies. Se compone de unos 2.500 serotipos de nuevo según la combinación del antígeno bacteriano (O) y los antígenos de flagelos (H), que son lipopolisacáridos de salmonella. Muchos serotipos de Salmonella, incluyendo S. typhi, S. enteritidis, S. paratyphi, S. typhimurium y S. choleraesuis, que provocan enfermedades infecciosas en seres humanos, pertenecen a la subespecie entérica.

La Salmonella infecta a seres humanos y animales a través de varias vías incluyendo alimentos contaminados, animales infectados, agua y utensilios, y provoca enfermedades. La infección por Salmonella está provocada por diversos síntomas tales como intoxicación alimentaria, enteritis, septicemia, bacteriemia, infección crónica e infección local. Especialmente en seres humanos S. typhi provoca tifus, S. paratyphi provoca paratifus, S. typhimurium, S. enteritidis, S. Infantis, S. heidelberg, etc. provocan gastroenteritis. La salmonelosis provoca síntomas gastrointestinales tales como fiebre, cefalea, dolor abdominal, diarrea, náuseas, vómitos y deshidratación durante un período de latencia de 12 a 36 horas. Comienza con enterocolitis aguda y puede progresar a sepsis o bacteriemia, absceso, artritis, colecistitis, pericarditis, neumonía, sífilis, pielonefritis. La salmonella puede transmitirse a través de cualquier tejido del cuerpo.

Staphylococcus es una bacteria grampositiva que tiene una disposición de racimo individual, doble o irregular. Staphylococcus se clasifica en aproximadamente 40 especies y nuevamente se divide en 11 grupos de acuerdo con la secuencia de bases del ARN ribosómico (ARNr) 16s. Entre ellos, S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus son los principales problemas en la práctica clínica.

S. aureus es un importante agente causante de inflamación piógena y tiene diversos síntomas infecciosos que van desde intoxicación alimentaria hasta sepsis. Se ha demostrado que diversas toxinas tañes como la coagulasa y la enterotoxina, que tienen una potente toxicidad para coagular el plasma. Proteína A, un componente intracelular de S. aureus, actúa sobre la activación del complemento, hinchazón y convulsiones localizadas. Los síntomas de la infección por S. aureus incluyen la infección de la piel, tales como foliculitis, quemaduras, infecciones, impétigo, infecciones de heridas postoperatorias y síndromes de letargo de la piel, infección del torrente sanguíneo, neumonía, artritis, endocarditis aguda, miocarditis, encefalitis, meningitis, aparato genitourinario, sistema nervioso, absceso abdominal, otitis media, conjuntivitis, síndrome de choque tóxico. Adicionalmente, S. aureus, que es resistente a los antibióticos, es particularmente difícil de tratar y es un problema insignificante en infecciones oportunistas y manejo de enfermedades en hospitales, escuelas y prisiones. Son Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), que es resistente a los antibióticos betalactámicos tales como penicilina y meticilina, S. aureus intermedio vancomicina (VISA), que es resistente al antibiótico glucoproteico vancomicina, S. aureus intermedio vancomicina heterogéneo (hVISA) y S. aureus de alto nivel de resistencia a la vancomicina (VRSA) y similares. S. epidermidis, que es otro patógeno coagulasa negativo de Staphylococcus sp. provoca una enfermedad infecciosa patógena que puede infectarse por instrumentos terapéuticos y S. saprophyticus provoca infección del tracto urinario.

La presente invención también proporciona una composición alimenticia para su uso de acuerdo con la reivindicación 2. La triptofanil-ARNt sintetasa puede ser cualquiera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

La composición alimentaria de acuerdo con la presente invención incluye todas las formas de alimento funcional, suplemento nutricional, alimento natural y aditivos alimentarios. Estos tipos pueden prepararse de diversas formas de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica.

Por ejemplo, como un alimento saludable, la propia composición alimentaria de acuerdo con la presente invención puede prepararse en forma de té, zumo y bebida. También puede comerse en forma granulada, encapsulada o en polvo. Además, la composición alimentaria de acuerdo con la presente invención puede prepararse en forma de una composición mezclándola con sustancias o principios activos conocidos que se sabe que son eficaces en la mejora inmunológica o en la prevención o la mejora de enfermedades provocadas por infecciones bacterianas.

Los alimentos funcionales también pueden prepararse añadiendo la composición alimenticia de acuerdo con la presente invención a las bebidas (incluyendo bebidas alcohólicas), frutas y alimentos procesados (tales como frutas enlatadas, frutas embotelladas, confitura, mermelada), pescado, carne y sus alimentos procesados (por ejemplo, jamón, chorizo, etc.), panes y pastas (por ejemplo, udon, fideos de trigo sarraceno, fideos de ramen, espaguetis, macarrones, etc.), zumo de frutas, diversas bebidas, galletas, caramelo masticable, productos lácteos (por ejemplo, mantequilla, quesos, etc.), aceites vegetales comestibles, margarina, proteína vegetal, alimento embolsado, alimento congelado, diversas clases de condimentos (por ejemplo, pasta de soja, salsa de soja, salsa, etc.).

El contenido preferible de la composición alimenticia de acuerdo con la presente invención no se limita a esto, pero es preferentemente del 0,01 al 50 % en peso en el alimento finalmente preparado. Para usar la composición para alimentos de acuerdo con la presente invención en forma de aditivo alimentario, puede usarse en forma de polvo o concentrado.

La presente invención también proporciona una composición veterinaria para su uso de acuerdo con la reivindicación 3. La triptofanil-ARNt sintetasa puede ser cualquiera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

En los animales, E. coli provoca principalmente colibacilosis por infecciones intestinales en ganado vacuno, cerdos y pollos y provoca trastornos gastrointestinales como diarrea y atrofia de los terneros y miositis uterina del ganado, sepsis de cerdos, diarrea, enfermedades intestinales, deshidratación, síntomas neurológicos y similares.

Salmonella tiene aves de corral, cerdos, vacas, iguanas, tortugas, perros, gatos, mascotas, ganado y animales salvajes como un hospital. La salmonelosis en animales es una enfermedad infecciosa digestiva aguda o crónica del ganado, principalmente en ganado vacuno y porcino. Se produce a menudo en terneros y se caracteriza por fiebre, enteritis y sepsis. Puede provocar neumonía, encefalitis, artritis y mastitis. La salmonelosis en cerdos a menudo se denomina paratifoidea porcina porque provoca síntomas como sepsis gastroenteritis en el período de fritura. S. gallinarum, un serotipo de Salmonella, provoca fiebre tifoidea aviar en los pollos, lo que resulta en una alta mortalidad por sepsis.

En los animales, Listeria infecta una diversidad de ganado y vida silvestre, incluyendo pollos, vacas, cerdos, perros, mapaches, cabras, ovejas y ratones. La listeriosis provoca principalmente aborto, septicemia, meningitis, encefalitis, etc. en animales rumiantes y también se conoce como una enfermedad circulatoria, en la cual la bacteria invade el tejido cerebral y provoca daño a las células nerviosas, tal como movimiento circular o precipitarse en obstáculos. Staphylococcus es una de las bacterias causantes comunes de infecciones bacterianas en animales. Induce enfermedades purulentas tales como inflamación de la piel y tejidos blandos, y mastitis en rumiantes tales como ganado vacuno, ovejas y cabras.

Las composiciones veterinarias de la presente invención pueden comprender además excipientes y diluyentes adecuados de acuerdo con los métodos convencionales. Los excipientes y diluyentes que pueden incluirse en la composición veterinaria incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma arábiga, alginato, gelatina, fosfato cálcico, silicato cálcico, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio, cetanol, alcohol estearílico, parafina líquida, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, metilparabeno, propilparabeno y aceite mineral.

La composición veterinaria de la presente invención puede comprender además cargas, anticoagulantes, lubricantes, agentes humectantes, especias, emulsionantes, conservantes y similares. La composición veterinaria de acuerdo con la presente invención puede formularse usando métodos bien conocidos en la técnica para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del principio activo después de su administración al animal. Y las formulaciones pueden encontrarse en forma de polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles, cápsulas de gelatina blanda o dura, supositorios, soluciones inyectables estériles, preparaciones externas estériles y similares.

La composición veterinaria de acuerdo con la presente invención puede variar dependiendo del tipo de animal, la edad, el sexo y el peso corporal, pero puede administrarse en una cantidad de 0,1 a 100 mg/kg una o varias veces al día. La dosis también puede aumentarse o disminuirse dependiendo de la vía de administración, el grado de enfermedad, el sexo, el peso, la edad y similares. En consecuencia, la dosis no limita en modo alguno el alcance de la invención.

Se describe y no se reivindica en sí misma una composición para la mejora inmunitaria que comprende triptofanilARNt sintetasa como un principio activo. La triptofanil-ARNt sintetasa puede ser cualquiera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

Mejora inmunitaria significa aumentar la respuesta inmunitaria o la actividad del sistema inmunitario in vivo. La composición de la presente invención es eficaz para aliviar el deterioro de la función inmunitaria debido al envejecimiento, embarazo, tratamiento inmunosupresor o similares o para prevenir y mejorar enfermedades provocadas por disfunción inmunitaria. La enfermedad provocada por el deterioro de la función inmunitaria es preferentemente una seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad infecciosa vírica tal como un resfriado, una enfermedad alérgica tal como una enfermedad inflamatoria, una atopía, fatiga crónica y cáncer, pero no se limita a los mismos. Y todas las enfermedades provocadas por el deterioro de la función inmunitaria conocidas por los expertos en la materia están incluidas en la presente invención. La composición de la presente invención también puede incluirse como un adyuvante de una vacuna.

Se describe y no se reivindica en sí mismo una aplicación para preparar un agente para la mejora inmunitaria que contiene triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo.

Dicha "cantidad eficaz" del compuesto de la presente invención se refiere a una cantidad que, cuando se administra a un sujeto, indica una mejora, tratamiento y efecto profiláctico de enfermedades inflamatorias infecciosas y dicho "sujeto" puede ser un animal, preferentemente un mamífero, particularmente un ser humano, animal incluyendo ganado o puede ser una célula, un tejido, un órgano o similares derivados de un animal. El sujeto puede ser un paciente o un animal doméstico que requiera tratamiento.

[Efecto ventajoso]

En consecuencia, la presente invención proporciona una composición farmacéutica y una composición veterinaria para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, una composición alimentaria para su uso de acuerdo con la reivindicación 2. La composición de la presente invención es particularmente útil para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias infecciosas de seres humanos y animales provocadas por infecciones bacterianas, víricas o fúngicas al inhibir infecciones tales como bacterias y virus en una etapa temprana al activar respuestas inmunitarias innatas.

[Breve descripción de las figuras]

La FIG. 1 muestra (A) el resultado del análisis de transferencia Western de TrpRS (WRS) de sobrenadante (SUP) de células mononucleares de sangre periférica humana y lisado de células completas (WCL) infectado con S. typhimurium y (B) el resultado de ELISA para la cantidad representativa de TrpRS, HMGB-1 y proteína HSP70 en sobrenadante de cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana infectadas por bacterias y hongos.

La FIG. 2 muestra (A) el resultado del análisis de transferencia Western que muestra el patrón de secreción de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), HMGB-1 y HSP70 secretadas por células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con S. typhimurium a lo largo del tiempo y (B) los resultados de ELISA que muestran la medición de TNF-a y TrpRS producidos en el sobrenadante de cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con S. typhimurium con el tiempo.

La FIG. 3 muestra un resultado del ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) para determinar si se produce piroptosis en células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con S. typhimurium.

La FIG. 4 muestra resultados de PCR en tiempo real que muestran los niveles de ARNm de TNF-a y TrpRS producidos en células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con S. typhimurium con el tiempo.

La FIG. 5 muestra los resultados del tratamiento con anticuerpos TrpRS y la prueba ELISA para examinar el efecto de TrpRS en la secreción de TNF-a en células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con S. typhimurium.

La FIG. 6 muestra la cantidad de proteína TrpRS (WRS) en el sobrenadante del cultivo de (A) células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con el virus respiratorio sincicial (RSV) y (B) células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con el virus de la gripe PR8, respectivamente. Se muestran los resultados obtenidos por ELISA.

La FIG. 7 muestra los resultados de ELISA que muestran el patrón de secreción de TNF-a y MIP-1a en células inmunitarias tratadas con TrpRS.

La FIG. 8 muestra (A) que las cantidades de secreción de MIP-1a, TNF-a, MIP-1p, IL-6 e IL-8 se analizaron con el software image Lab 4.1 después de tratar células PBMC con TrpRS de longitud completa y mini-TrpRS y (B) resultados de ELISA y (C) RT-PCR para confirmar los niveles de expresión de TNF-a, MIP-1a y MIP-1p en sobrenadante cultivado en PBMC.

La FIG. 9 muestra los resultados de un ensayo de migración transpocillo que muestra el efecto del sobrenadante de cultivo de macrófagos derivados de médula ósea tratados con TrpRS (BMDM) sobre la fluidez de las células inmunitarias.

La FIG. 10 muestra los resultados de (A) ELISA para la cantidad de MIP-1a en macrófagos derivados de PBMC, células THP-1, Macrófagos derivados de THP-1 y células J774A.1, y la cantidad de TNF-a, proteína MIP-1a MCP-1 determinada por (B) ELISA y (C) RT-PCR, respectivamente.

La FIG. 11 muestra (A, B) el resultado del análisis de citometría de flujo que muestra el reclutamiento de neutrófilos en la cavidad peritoneal del ratón inyectado con TrpRS, (C) el resultado de ELISA que muestra la cantidad de secreción de MIP1-a y (D) los resultados del análisis de citometría de flujo que muestra el número de neutrófilos, macrófagos y células de la médula ósea.

La FIG. 12 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo que muestran patrones de expresión de proteínas CD40, CD80 y CD86 de macrófagos derivados de médula ósea tratados con TrpRS.

La FIG. 13 muestra los resultados de los experimentos con macrófagos usando Escherichia coli marcadas fluorescentemente derivadas del índice de fagocitosis de macrófagos derivados de médula ósea tratados con TrpRS.

La FIG. 14 muestra (A) los resultados de la medición de la cantidad de TNF-a y MIP-1a en los macrófagos tratados con TrpRS de longitud completa y mini-TrpRS por ELISA y (B) los resultados de la medición del número de células CD11b+ F4/80+ en PEC (células de exudado peritoneal) y neutrófilos Ly6G+ por citometría de flujo.

La FIG. 15 muestra (A) las imágenes (X20) obtenidas mediante la inyección de TrpRS de longitud completa y mini-TrpRS (rojo) marcadas con Alexa 647 en los ratones transgénicos LysM-GFP y (B) el índice de macrófagos en los ratones infectados con S. typhimurium, que se inyectaron con TrpRS de longitud completa y mini-TrpRS.

La FIG. 16 muestra esquemáticamente un proceso para producir un anticuerpo que se une específicamente a TrpRS.

La FIG. 17 muestra (A) la cantidad de TNF-a en células THP-1 tratadas con TrpR de longitud completa y anticuerpos específicos para TrpRS, (B) los resultados de ELISA que muestran el efecto del anticuerpo (scFv 4G1) sobre la producción de TNF-a en células PBMC humanas y (C) la expresión de la unión de proteínas recombinantes a TrpRS de longitud completa o mini-TrpRS usando anticuerpos.

La FIG. 18 muestra (A) un diagrama esquemático de un experimento animal usando un anticuerpo y (B) el efecto del anticuerpo sobre la expresión de TNF-a y MIP-1a y (C) el efecto sobre el número de neutrófilos Ly6G+.

La FIG. 19 muestra un gráfico de supervivencia que muestra el efecto de los anticuerpos específicos de TrpRS en la tasa de supervivencia de ratones infectados con S. typhimurium.

La FIG. 20 muestra los resúmenes de los experimentos con animales para investigar el efecto de TrpRS en la tasa de supervivencia de ratones infectados con S. typhimurium (arriba en la FIG. 20) y los resultados de la citometría de flujo que muestran el efecto de TrpRS en el grado de adsorción o de absorción de S. typhimurium en neutrófilos infiltrantes.

La FIG. 21 muestra un diagrama esquemático de experimentos con animales y muestra los resultados de medir IHC y UFC en el hígado y el bazo de ratones, que se administraron por vía intraperitoneal con PBS(Con), FL-WRS o mini-WRS (cada imp 20 mg/ratón) 1 hora antes de la infección con S. typhimurium (A) o L. monocytogenes (B). La FIG. 22 muestra un gráfico de supervivencia que muestra el efecto de TrpRS en la tasa de supervivencia de ratones infectados con S. typhimurium.

[Descripción detallada de la invención]

Sin embargo, los siguientes ejemplos son ilustrativos de la presente invención y el alcance de la presente invención no se limita a los siguientes ejemplos.

La triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) secretada por células mononucleares de sangre periférica infectadas por bacterias

Identificación de aminoacil-ARNt sintetasa secretada por células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con bacterias y hongos

Se realizaron experimentos de inmunotransferencia para determinar el tipo de aminoacil-ARNt sintetasa (ARS) secretada por células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) infectadas con bacterias (FIG. 1). Las bacterias y los hongos, Salmonella typhimurium (S. typhimurium, ATCC 14028), Listeria monocytogenes (L. monocytogenes, ATCC 15313), Escherichia coli (E. coli, ATCC 10798), Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923), Candida albicans (C. albicans, ATCC 10231), se obtuvieron del Centro de Conservación Microbiana de Corea y del Centro de Recursos Microbiológicos y se cultivaron periódicamente en caldo nutritivo o infusión de cerebro y corazón (BD biosciences). Las bacterias usadas para el experimento de infección se cultivaron durante la noche y se obtuvieron a una densidad de 1 * 108 UFC. Las UFC se estimaron usando una absorbancia a 600 nm y una curva de calibración preparada previamente. En el experimento de infección bacteriana de este ejemplo y otro ejemplo, las bacterias obtenidas se lavaron en PBS y se resuspendieron en medio RPMI sin suero o PBS. Se cultivaron PBMC humanas a una densidad de 1 * 106 células/pocillo durante una hora y se infectaron con 1 * 106 UFC de S. typhimurium (MOI = 1) o L. monocytogenes (MOI = 1). Los sobrenadantes cultivados durante dos horas después de la infección se precipitaron mediante TCA y se realizaron experimentos de inmunotransferencia en varias clases de ARS.

Como resultado, la única TrpRS de longitud completa, 53 kDa, se detectó en el sobrenadante del cultivo entre las ARS incluyendo ARS secretora (TrpRS, GRS, KRS, DRS), AIMP1 (un cofactor de complejos ARS) y ARS (TrpRS, MRS, HRS, GRS) que contiene el dominio WHEP. Esto muestra que la ARS secretada después de la infección bacteriana es TrpRS (WRS) (FIG. 1A). También se confirmó que la WRS completa se secretaba a partir de células mononucleares de sangre periférica humana por infección con S. typhimurium y L. monocytogenes así como por E. coli, S. aureus y C. albicans (FIG. 1B). Esto indica que es más probable que se secrete TrpRS (WRS) en respuesta a infecciones bacterianas y fúngicas generales que a determinadas bacterias.

Análisis cinético de la secreción de TrpRS y TNF-a

Los patrones de secreción de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), HMGB1 y la proteína de choque térmico (HSP70) se analizaron en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) infectadas con S. typhimurium de vez en cuando justo después de la infección (FIG. 2). Se infectaron PBMC humanas con S. typhimurium (MOI = 1), y se obtuvieron lisado celular completo (WCL) y sobrenadante de cultivo a los 0, 15, 30, 60 y 120 min, y se realizaron experimentos de inmunotransferencia (FIG. 2A).

Como resultado, TrpRS en sobrenadantes cultivados se detectó a partir de los 15 minutos después de la infección y aumentó hasta 120 minutos después de la infección. También, la cantidad de TrpRS en ^wC^ltendió a disminuir ligeramente con el tiempo después de la infección. Por tanto, TrpRS se secreta al exterior de la célula desde el principio después de la infección. Además, en el lisado celular completo, el precursor de TNF-a (precursor TNF-a) se generó a partir de los 30 minutos posteriores a la infección y se detectó a los 120 minutos, Se detectó TNF-a (TNF-a maduro) en cantidades mínimas hasta 120 minutos después de la infección. Se detectó TNF-a (TNF-a maduro) en el sobrenadante del cultivo a los 120 min. En otras palabras, TrpRS se secreta al exterior de la célula dentro de un corto tiempo después de la infección, y se encuentra que precede significativamente a la secreción de TNF-a en el tiempo. Por otra parte, HMGB-1 y HSP70 no se detectaron en el sobrenadante del cultivo a lo largo del tiempo después de la infección, mientras que HMGB-1 y HSP 70 en todos los lisados celulares se detectaron constantemente con el tiempo después de la infección. Por lo tanto, HMGB-1 y HSP70 no se ven afectados por infecciones bacterianas.

Además, las cantidades de TrpRS y TNF-a secretadas en el sobrenadante del cultivo después de la infección bacteriana se midieron por ELISA a los 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la infección (FIG. 2B). Como se observó en el experimento de inmunotransferencia, la TrpRS presente en el sobrenadante del cultivo aumentó significativamente desde 15 minutos después de la infección hasta 60 minutos después de la infección, pero el TNF-a presente en el sobrenadante del cultivo comenzó a aumentar a partir de los 60 minutos después de la infección. <Ejemplo 1-3>

Determinación de infección bacteriana y piroptosis

Se investigó si la secreción de TrpRS en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) infectadas con S. typhimurium observada en el Ejemplo 1-2 estuvo provocada por piroptosis (FIG. 3). La piroptosis se confirmó mediante ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH; una firma de muerte celular). En detalle, las PBMC humanas se infectaron con S. typhimurium y después se midieron los niveles de LDH en los sobrenadantes de cultivo a los 0, 5, 10, 20, 40, 60 y 120 min después de la infección usando el kit de ensayo de LDH (Takara Bio, Inc.). Se usaron PBMC tratadas con TX-100 al 1 % como un control positivo.

Como resultado, en el sobrenadante del cultivo del control positivo (1 % TX-100), la cantidad de LDH, un marcador de piroptosis, aumentó rápidamente con el tiempo, mientras que el sobrenadante del cultivo de PCMC infectadas con S. typhimurium alcanzaron 120 minutos después de la infección sin cambios significativos en la cantidad de LDH, lo que indica que la LDH no se expresó durante este período. Por tanto, estos resultados verifican que las PBMC después de la infección bacteriana excretan TrpRS fuera de la célula mediante secreción activa en lugar de piroptosis (FIG. 3). <Ejemplo 1-4>

Evaluación de la infección bacteriana y los niveles de expresión de TNF-a y TrpRS

Los patrones de expresión de los genes TNF-a y TrpRS (WRS) en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) infectadas con S. typhimurium se examinaron por RT-PCR y ELISA (FIG. 4). Se infectaron PBMC humanas con S. typhimurium, y las células se obtuvieron a los 0, 15, 30, 60, 120 minutos después de la infección, y se midieron los niveles de ARNm de TNF-a y TrpRS. El ARN se extrajo de acuerdo con el método experimental del kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transcribió inversamente con transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.)), después se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR cuantitativa) con los siguientes cebadores. El nivel de ARNm de GAPDH se determinó como un control interno.

hTNF-a Directo: 5'-GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3'

hTNF-a Inverso: 5'-CTGCCCAGACTCGGCAA-3'

hTrpRS Directo: 5'-AAGAATTCATGCCCAACAGTGAGCCC-3'

hTrpRS Inverso: 5'-AACTCGAGCTACCCTGGAGGACAGTCAGCCTT-3'

GAPDH directo: 5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'

GAPDH inverso: 5'-TTGACTCCGACCTTCACCTTCC-3'

Como resultado, se confirmó que el nivel de ARNm de TNF-a aumentó de 30 minutos a 120 minutos, mientras que el nivel de ARNm de TrpRS no cambió significativamente hasta 120 minutos después de la infección (FIG. 4). Esto sugiere que la TrpRS secretada después de la infección es una, que ya está presente en la célula sin que se haya inducido su expresión génica tras la infección. También se confirmó que el ARNm de TNF-a, una importante citocina proinflamatoria inducida por una infección bacteriana, aumentó considerablemente de 30 minutos a 12 minutos después de la infección. El ARNm de TNF-a aumentó significativamente hasta 60 minutos después de 40 minutos de infección y el aumento en la cantidad de secreción de TNF-a observado en el ejemplo 1-2 se detectó a partir de los 60 minutos después de la infección, lo que indica que la secreción de TrpRS ya se está produciendo antes de la producción de TNF-a.

Relación entre TrpRS y TNF-a secretado después de una infección bacteriana

En el Ejemplo 1-2, se confirmó que TrpRS y TNF-a se secretaron con diferencia de tiempo en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) infectadas por S. typhimurium. Además, se observó que el TNF-a no se secretaba en ausencia de secreción de TrpRS en la etapa temprana de la infección en las PBMC infectadas con S. typhimurium muerta por calor. Por lo tanto, se examinó la relación funcional entre TrpRS secretada después de la infección y TNF-a (FIG. 5). Las PBMC se trataron con anticuerpos neutralizantes de la función TrpRS (concentración de anticuerpos de 10 |jg/ml) y se infectaron con S. typhimurium (MOI = 1). Después se midió el patrón de secreción de TNF-a a las 0, 2, 4 y 8 h, mediante ELISA.

Como resultado, en PBMC (S. typhimurium + a-WRS ScFv), que había reducido la función de TrpRS por tratamiento con anticuerpos, se observó que la cantidad de TNF-a disminuyó significativamente en comparación con las PBMC de control tratadas con PBS (S. typhimurium + PBS). Esto sugiere que TrpRS juega un papel importante en la producción y la secreción de TNF-a. Estos resultados sugieren que TrpRS puede ser el primer factor para controlar la producción de TNF-a, especialmente en infecciones bacterianas.

Aminoacil ARNt sintetasa secretada por células mononucleares de sangre periférica humana infectadas por virus

Se realizaron experimentos ELISA para determinar la cantidad de aminoacil ARNt sintetasa (ARS) secretada por células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a lo largo del tiempo después de la infección vírica (FIG.

6). El virus se tituló por virus sincicial respiratorio A2 (RSV A2) y virus de la gripe PR8 (virus de la gripe NPuerto Rico/8/1934) mediante análisis en placa convencional. Cada una de las PBMC humanas se infectó con la PBMC humana durante 2 horas y se incubó durante 24 horas. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron cada hora después de la infección y los niveles de TrpRS (WRS) se midieron mediante ELISA.

Como resultado, la concentración de TrpRS aumentó con el tiempo en las células infectadas con RSV (FIG. 6A), mientras que en las células infectadas con PR8, la concentración de TrpRS aumentó hasta 120 minutos después de la infección pero disminuyó después de 120 minutos (Fig. 6B). Esto muestra que TrpRS se secreta en respuesta a una infección vírica.

Aumento de la secreción de TNF-a específico de monocitos/macrófagos y MIP1-a por TrpRS

Para investigar los tipos de células inmunitarias que responden a la TrpRS secretada, diversas células inmunitarias se trataron con TrpRS y se examinaron células que secretan citocinas tales como TNF-a y MIP1-a (FIG. 7). Las células B primarias, las células T, los neutrófilos, los linfocitos citolíticos naturales (NK) y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y monocitos de ratones usando un kit de aislamiento de microesferas de ratón (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania). Las células obtenidas mostraron más del 95 % de pureza cuando se analizaron por citometría de flujo. Se prepararon macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) diferenciando durante 6 a 7 días en presencia de M-CSF (20 ng/ml). Se prepararon células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) diferenciando durante 6 a 7 días en presencia de GM-CSF (20 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml). Los inmunocitos se cultivaron durante 18 horas en presencia del control, TrpRS de longitud completa (TrpRS-completo, 100 nM), mini-TrpRS (TrpRS-mini, 100 nM) y LPS (100 ng/ml), respectivamente, y la cantidad de proteína TNF-a y MIP1-a presente en el sobrenadante del cultivo se midió mediante el kit ELISA (BD Sciences, San José, CA, EE.UU. y R & D systems). Todas las TrpRS usaron una proteína que tenía la secuencia de aminoácidos de la TrpRS humana (TrpRS humana) en el experimento.

Como resultado, LPS indujo significativamente la secreción de TNF-a en la mayoría de las células inmunitarias, mientras que la TrpRS de longitud completa mostró el mayor efecto en monocitos y BMDM (Tabla 1, parte superior de la FIG. 7). La TrpRS de longitud completa tratada con calor o tripsina no tuvo efecto sobre la secreción de TNF-a (datos no mostrados). Además, mini-TrpRS no tuvo efecto sobre la secreción de TNF-a. Para MIP1-a, el efecto de aumento de TrpRS se confirmó solo en monocitos y BMDM de ratones tratados con TrpRS de longitud completa (Tabla 2, FIG. 7 inferior). Estos resultados indican que TrpRS activa específicamente monocitos y macrófagos, y los monocitos y macrófagos secretan TNF-a y MIP1-a como resultado de la activación.

[Tabla 11 Efecto de TrpRS en la secreción de TNF-a en células inmunitarias

[Tabla 21 Efecto de TrpRS en la secreción de MIP1-a en células inmunitarias

Activación de la respuesta inmunitaria innata por TrpRS

Quimiocinas secretadas por macrófagos derivados de la médula ósea estimulados por TrpRS

Se examinaron los tipos y las cantidades de quimiocinas secretadas por BMDM en respuesta a TrpRS (Tabla 3). BMDM se trató con TrpRS de longitud completa (30, 100 nM) o mini-TrpRS (100 nM) durante 18 horas y se midió mediante ELISA la presencia de quimiocinas en el sobrenadante del cultivo.

Además, se trataron células PBMC humanas con TrpRS de longitud completa humana (FL-WRS) y mini-TrpRS (mini-WRS) durante 18 horas y se midieron las citocinas presentes en el sobrenadante del cultivo usando ELISA. Se usaron experimentos de RT-PCR para medir los niveles de expresión de citocinas y quimiocinas.

hTNF-a Directo: 5-GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3'

hTNF-a Inverso: 5'-CTGCCCAGACTCGGCAA-3'

hTrpRS Directo: 5'-AAGAATTCATGCCCAACAGTGAGCCC-3'

hTrpRS Inverso: 5'-AACTCGAGCTACCCTGGAGGACAGTCAGCCTT-3'

hMIP-1a Directo: 5'-ACCATGGCTCTCTGCAACCA-3'

hMIP-1a Inverso: 5-TTAAGAAGAGTCCCACAGTG-3'

hMIP-1p Directo: 5'-AGCCTCACCTCTGAGAAAACC-3'

hMIP-1p Inverso: 5'-GCAACAGCAGAGAAACAGTGAC-3'

GAPDH directo: 5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'

GAPDH inverso: 5'-TTGACTCCGACCTTCACCTTCC-3'

Como resultado, TrpRS de longitud completa indujo quimiocinas tales como MIP-1a, MCP-1 e IP-10 y citocinas tales como TNF-a e IL-1p de forma dependiente de la concentración. Por el contrario, mini-TrpRS no tuvo efecto sobre la secreción de citocinas y la secreción de quimiocinas (Tabla 3). Además, TrpRS de longitud completa indujo la secreción de quimiocinas y citocinas tales como TNFα, MIP-1a, MIP-1p, IL-6 y IL-8, pero mini-TrpRS no tuvo efecto sobre la secreción de citocinas y quimiocinas (FIG. 8A). Además, se confirmó que los niveles de expresión de TNFa, MIP-1a, MIP-1p, IL-6 e IL-8 aumentaron en células PBMC tratadas con TrpRS de longitud completa (FIG. 8B y 8C)

Por lo tanto, se confirmó que TrpRS de longitud completa induce la expresión y secreción de citocinas, en contraste con mini-TrpRS.

[Tabla 3] Las citocinas y quimiocinas secretadas por macrófagos derivados de médula ósea estimulados por TrpRS

(BMDM)

Efecto de TrpRS en la fluidez de las células inmunitarias

El efecto de TrpRS sobre la fluidez de las células inmunitarias se examinó usando un ensayo de migración transpocillo (FIG. 9). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) se trataron con TrpRS de longitud completa (FL-WRS, 100 nM) o mini-TrpRS (mini-WRS, 100 nM) y se cultivaron durante 18 horas, después se transfirieron a una placa de 24 pocillos. Las células inmunitarias primarias y BMDM se colocaron en la parte superior de la cámara de migración y se incubaron a 37 °C durante 4 horas.

Como resultado, se observó que el sobrenadante de cultivo de BMDM tratado con TrpRS de longitud completa (TrpRS-F) aumentó en gran medida la infiltración de monocitos y neutrófilos. Por el contrario, la propia proteína TrpRS (datos no mostrados) o el sobrenadante del cultivo tratado con mini-TrpRS (TrpRS-M) no tuvo efecto sobre la migración celular.

Efecto de TrpRS en la secreción de MIP-1 y TNF-a en diversas células inmunitarias

Los efectos de TrpRS en la secreción de MIP-1 y TNF-a en diversas células inmunitarias incluyendo macrófagos derivados de PBMC, células THP-1, macrófagos derivados de THP-1 y células J774A.1 se investigaron mediante experimentos ELISA y RT-PCR, respectivamente. Cada célula inmunitaria se trató con TrpRS de longitud completa (FL-WRS, 100 nM) o mini-TrpRS (mini-WRS, 100 nM) y se cultivó durante 18 horas. El cultivo se transfirió a una placa de 96 pocillos y se sometió a ELISA. Las células BMDM se trataron con TrpRS de longitud completa o mini-TrpRS y se extrajo el ARNm y se realizó RT-PCR.

Como resultado, se confirmó que la TrpRS de longitud completa en macrófagos derivados de PBMC, THP-1, macrófagos derivados de THP-1 y J774A.1 inducen la secreción de MIP-1a (FIG. 10A). En células BMDM, se confirmó que TrpRS de longitud completa, que no es mini-TrpRS, induce la producción de TNF-a, proteínas MIP-1a y MCP-1 (FIG. 10B) e induce la expresión de ARNm (FIG. 10C).

Acumulación de neutrófilos inducida por TrpRS en el cuerpo

Para investigar el efecto de TrpRS en la respuesta inmunitaria innata en el cuerpo, se observó el reclutamiento de neutrófilos intraperitoneales después de la inyección de TrpRS (FIG. 11). PBS, TrpRS de longitud completa (3, 10, 30 |jg) o mini-TrpRS (30 |jg) se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones (6 a 10 por grupo) y la cavidad peritoneal se drenó después de 4 horas. Se extrajo la efusión peritoneal y se midió la proporción del grupo celular Ly6C+ Ly6G+ mediante citometría de flujo (FIG. 11A y 11B), y se midió MIP1-a presente en la efusión peritoneal mediante ELISA (FIG. 11C). La significación estadística de la comparación entre el control negativo tratado con PBS y los resultados de cada condición experimental se verificó mediante la prueba Anova unidireccional usando el software GraphPad (ver. 4,0). *** p<0,001, ** p<0,01

Como resultado de la citometría de flujo, la tendencia dependiente de la concentración se observó dramáticamente solo en los ratones inyectados con TrpRS de longitud completa (TrpRS-F3, TrpRS-F10 y TrpRS-F30), mientras que mini-TrpRS (TrpRS-M30) no logró este efecto (FIG. 11B). Esto es, este resultado muestra que la TrpRS de longitud completa puede inducir respuestas inmunitarias innatas que provocan la concentración de neutrófilos in vivo. De forma similar, MIP1-a, que se midió en la efusión peritoneal, aumentó de una manera dependiente de la concentración solo en los ratones inyectados con TrpRS de longitud completa (TrpRS-F3, TrpRS-F10 y TrpRS-F30) y no aumentó en ratones inyectados con mini-TrpRS (TrpRS-M30).

Además, el número de neutrófilos Ly6G+, células mieloides CD11b+ y macrófagos CD11b+F4/80+ aumentaron en el peritoneo tratado con TrpRS de longitud completa (FL-WRS) en comparación con los controles infectados con mini-TrpRS y PBS (FIG. 11D).

Efecto de TrpRS en la activación de macrófagos derivados de la médula ósea

El efecto de TrpRS sobre la activación de macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) se analizó a través de la expresión de marcadores de macrófagos activados y análisis de citometría de flujo (FIG. 12). Análisis de citometría de flujo usando Cdllb y F4/80 de la FIG. 11A indica que las células de la médula ósea se diferenciaron bien en BMDM para el análisis del marcador de activación de macrófagos. Los BMDM diferenciados se trataron con TrpRS de longitud completa (30, 100 nM) o mini-TprRS (100 nM) y se cultivaron durante 18 h y los niveles de CD40, CD80 y CD86 se midieron mediante citometría de flujo.

Como resultado, se confirmó que la expresión en la superficie celular de CD40, CD80 y CD86, que son indicadores de activación de macrófagos, aumentó abruptamente solo en los BMDM tratados con TrpRS de longitud completa (TrpRS-F) (FIG. 12B). Los BMDM tratados con Mini-TrpRS (TrpRS-M) no fueron significativamente diferentes del grupo control. Esto es, este resultado verifica que TrpRS de longitud completa promueve la activación de macrófagos. <Ejemplo 3-6>

Efecto de TrpRS en la fagocitosis de macrófagos derivados de médula ósea (BMDM)

Se investigó el efecto de TrpRS sobre la fagocitosis de macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) (FIG. 13). BMDM se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos durante la noche, después se reemplazó con medio RPMI sin M-CSF y se cultivó durante 18 horas con TrpRS de longitud completa (30 nM) o mini-TrpRS (30 nM). Después de lavar las células, se añadieron 100 μl de biopartículas de E. coli marcadas fluorescentemente (kit de ensayo de fagocitosis Vybrant, Invitrogen) y se cultivaron durante 2 horas. Una vez retirado el medio de cultivo, las células se trataron con azul de tripano (100 μl) durante 1 minuto para inhibir la autofluorescencia. Las señales de fluorescencia debidas a los macrófagos se midieron a 485 nm (excitación) y 520 nm (emisión) para mostrar el grado de acción fagocítica (BMG Labtech, FLUOstar OPTIMA, Ortenberg, Alemania). La significación estadística se verificó mediante la prueba t usando el software GraphPad (ver. 4.0). *** p<0,0001

Como resultado, se encontró que el índice fagocítico de BMDM tratado con TrpRS de longitud completa (TrpRS Full) era 3 veces mayor que el del grupo control. El Mini-TrpRS (TrpRS Mini) no tuvo ningún efecto. Los resultados experimentales de los Ejemplos 3-1 a 3-4 muestran que la TrpRS de longitud completa induce respuestas inflamatorias innatas a través de la activación de macrófagos.

Efectos de TrpRS en macrófagos

Para investigar el efecto de la respuesta inmunitaria congénita derivada de TrpRS de longitud completa en los macrófagos, el siguiente experimento se llevó a cabo usando ratones sin macrófagos.

Los esplenocitos se extrajeron del bazo de ratones normales y de ratones sin macrófagos y la eliminación de macrófagos se confirmó mediante citometría de flujo. Se prepararon esplenocitos separados, se cultivaron durante la noche en una placa de cultivo de 24 pocillos y se trataron con TrpRS de longitud completa, y se midió la secreción de TNF-a y MIP-1a mediante ELISA.

Como resultado, se confirmó que la cantidad de secreción de TNF-a y MIP-1a disminuyó con la disminución de macrófagos (FIG. 14A). La disminución de macrófagos en el cuerpo indica que los macrófagos juegan un papel funcional en la actividad inmunoestimuladora de la TrpRS de longitud completa, a medida que disminuye el número de neutrófilos infiltrados en el peritoneo (FIG. 14B). Esto confirma que la TrpRS de longitud completa se dirige a los macrófagos para activar la respuesta inmunitaria innata.

Efecto de TrpRS en la actividad de los macrófagos

Se investigó el efecto de TrpRS sobre la actividad de los macrófagos derivados de la médula ósea. Se inocularon TrpRS (FL-WRS) o mini-TrpRS (mini-WRS) etiquetados con Alexa 647 en la oreja de los ratones y se fotografiaron 1 y 4 horas después de la infección usando técnicas de formación de imágenes in vivo. Además, S. typhimurium marcado con Alexa 647 combinado con TrpRS de longitud completa o mini-TrpRS se inoculó en la oreja de ratones GFP-LysM Tg capaces de observar neutrófilos y macrófagos mediante la expresión de GFP. Para observar macrófagos en ratones, los macrófagos fueron fotografiados usando tecnología de formación de imágenes in vivo y se contaron. La dinámica inmunocelular se visualizó usando un sistema de imágenes de microscopio confocal de escaneo láser de velocidad de video hecho a la medida (Choe et al., 2013; Seo et al., 2015). Se usaron tres láseres consecutivos como la fuente de estímulo fluorescente. Se detectaron tres colores de fluorescencia emitidos por los ratones como tubos de capa optoelectrónica altamente sensibles a 488 nm (MLD, Cobolt), 561 nm (Jive, Cobolt) y 640 nm (MLD, Cobolt). Y se digitalizó por el capturador de fotogramas de 3 canales de 8 bits.

Como resultado, se confirmó que la infiltración de neutrófilos y macrófagos apareció en el sitio de inoculación de TrpRS de longitud completa en lugar de mini-TrpRS. Tal infiltración comenzó 1 hora después de la inoculación, y la cantidad de infiltración a las 4 horas después de la inoculación fue la más alta (FIG. 15A). Además, se confirmó que el índice fagocítico de macrófagos aumentó en ratones tratados con TrpRS de longitud completa (FL-WRS) en comparación con ratones tratados con mini-TrpRS (mini-WRS) o PBS (Con) (FIG. 15B).

Inhibición de TrpRS: efecto ideado

Preparación de anticuerpos que se unen específicamente a TrpRS

TrpRS se tituló con anticuerpos específicos de TrpRS para validar aún más el papel protector de TrpRS contra la infección. En primer lugar, se preparó un anticuerpo que se une específicamente al péptido N154 de la TrpRS humana seleccionando una biblioteca de fragmentos variables monocatenarios humanos (scFV) de visualización en fagos (FIG.

16). Los inmunotubos se recubrieron con TrpRS 10 y se bloquearon con MPBS (PBS con leche en polvo sin grasa 30). La biblioteca de scFv de visualización en fagos (1 * 1013UFC) se añadió a 1 ml de mPBST, se añadió al inmunotubo, se incubó durante 2 horas y después se lavó de 3 a 5 veces con PBST. El fago unido se eluyó con 1 ml de trimetilamina 100 mM y se neutralizó con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,0). E. coli ER257 se infectó con el fago eluido y se cultivó en medio LB que contenía glucosa al 2 % y ampicilina durante un día y las bacterias se recogieron del medio logaritmo. Las bacterias se cultivaron después en 20 ml de SB (triptona al 3 %, extracto de levadura al 2 %, MOPS al 1 %, pH 7,0) suplementado con ampicilina a una DO600 de 0,5. Se añadió el fago auxiliar VCSM13 (1 * 1011 UFP) y se incubó a 37 °C durante 1 hora, seguido de kanamicina (70 ug/ml) y se incubó durante la noche a 30 °C. El sobrenadante se eliminó mediante centrifugación y se añadió y mezcló solución de precipitación de fagos (4 % de PEG 8000 y 3 % de NaCl, concentración final). Después de 30 minutos de incubación en hielo, los fagos precipitados se recogieron por centrifugación. Después de recorrer la biblioteca cuatro veces, se cribaron clones de scFv individuales capaces de unirse a TrpRS. Este proceso se ilustra en la FIG. 16.

Para confirmar si los anticuerpos preparados unidos específicamente a TrpRS afectan al efecto de TrpRS sobre la infección, se realizó el siguiente experimento.

Las PBMC se trataron con el anticuerpo preparado (10 μg/ml) y se infectaron con S. typhimurium (MOI = 1) como se describe en el Ejemplo 1 anterior. El patrón de secreción de TNF-a en cultivo celular se midió por ELISA. Para confirmar si scFv 4G1 se une a TrpRS de longitud completa (FL-WRS) seleccionando clones 4G1, los lisados de células PBMC se extrajeron y se sometieron a inmunotransferencia.

Como resultado, se confirmó que los clones F9, E11 y 4G1 entre algunos clones mostraron una disminución en la cantidad de secreción de TNF-a de TrpRS de longitud completa en células PBMC humanas (FIG. 17A), mientras que tanto el tratamiento con 4G1 como el tratamiento con TrpRS de longitud completa y 4G1 (FIG. 17B) disminuyó la cantidad de TNF-a secretado. Además, se confirmó mediante inmunotransferencia que scFV 4G1 se une específicamente a TrpRS de longitud completa (FIG. 17C).

Disminución de la secreción de TNF-a y MIP1-a por anticuerpos específicos de TrpRS

Para examinar el efecto del scFV 4G1 preparado en el Ejemplo 5-1 en la respuesta inmunitaria innata en el cuerpo, se llevó a cabo un experimento con animales usando ratones de acuerdo con el esquema experimental de la Fig. 18a .

A los ratones se les inyectó PBS o scFv 4G1 en grupos infectados o no infectados mediante inyección intraperitoneal de S. typhimurium. Cuatro horas después de la infección, se extrajo el líquido peritoneal y el número de células Ly6G+ se midió por citometría de flujo. La cantidad de MIP-1a y TNF-a se analizó por ELISA. La significación estadística de la comparación entre el control negativo tratado con PBS y los resultados de cada condición experimental se verificó mediante la prueba Anova unidireccional usando el software GraphPad (ver. 4,0). *** p<0,001, ** p<0,01

El análisis ELISA mostró que la cantidad de MIP-1 alfa y TNF-a disminuyó en ratones tratados con scFv 4G1 (FIG.

18B). Además, el análisis de citometría de flujo mostró que Ly6G+ los macrófagos disminuyeron en ratones tratados con scFv 4G1 (FIG. 18C).

Efecto de los anticuerpos específicos de TrpRS en la supervivencia de ratones infectados con bacterias

Para confirmar el efecto del scFv 4G1 preparado en el Ejemplo 5-1 en la tasa de supervivencia de los ratones, se llevó a cabo un experimento con animales usando un ratón de acuerdo con el esquema experimental de la FIG. 18A y se realizó un análisis de supervivencia. Como se ha descrito anteriormente, a los ratones se les inyectó PBS o scFv 4G1 en grupos infectados o no infectados inyectando S. typhimurium en la cavidad abdominal. La tasa de supervivencia de los ratones fue de 12, 24, 36 y 48 horas después de la infección.

Como resultado, en el control, la tasa de supervivencia ST PBS (inyección de PBS después de la infección con S. typhimurium) la tasa de supervivencia fue del 50 % a las 24 horas y del 25 % a las 48 horas, pero en ST 4G1 (inyección de scFv 4G1 después S. typhimurium infección) la tasa de supervivencia fue inferior al 25 % y el 0 % a las 36 horas. Por lo tanto, se confirmó que la tasa de supervivencia de los ratones disminuyó en el grupo inyectado con scFv 4G1 (FIG. 19).

Efecto de la inhibición de la infección in vivo de TrpRS y la tasa de supervivencia aumentada después de la infección

Efecto de TrpRS en la absorción de bacterias infectantes por neutrófilos invasivos

Para investigar el efecto de TrpRS en la tasa de supervivencia de ratones infectados con S. typhimurium, se llevó a cabo un experimento con animales usando ratones de acuerdo con el esquema del experimento de la FIG. 20 (FIG.

20, arriba), y la cantidad de S. typhimurium absorbida por y adsorbida sobre neutrófilos infiltrados se confirmó durante una hora después de la infección (FIG. 20, parte inferior).

Se inyectó PBS o TrpRS (10 μg, 0,5 mg/kg) por vía intraperitoneal en ratones (ratón C57BL/6, hembra de 9 12 semanas de edad) y se inyectó S. typhimurium marcada fluorescentemente (S. Typhimurium marcada con FITC, 1*107 UFC/ratón, 5 ~ 6 por grupo) en la cavidad abdominal 1 hora después. Una hora después de la infección, los ratones se sacrificaron y las células peritoneales se separaron y se tiñeron con Ly6G, anticuerpo Ly6C y se analizaron por citometría de flujo. La significación estadística se verificó mediante la prueba t. *** p< 0,001

Como resultado, se confirmó que el número de neutrófilos infiltrantes (Neutrófilos Ly6G+) también aumentó significativamente en el grupo tratado con TrpRS de longitud completa (TrpRS-Full) en comparación con el grupo de control tratado con PBS (PBS), y que S. typhimurium (FITC-S. typhimurium+/neutrófilo Ly6G+) adsorbida sobre y absorbida por los neutrófilos aumentó significativamente.

Efectos de TrpRS sobre la eliminación bacteriana en el bazo y el hígado

Se realizó un experimento con animales usando un ratón de acuerdo con el esquema de la FIG. 15, y se observó el grado de aclaramiento bacteriano del bazo después de 4 horas de infección (FIG. 21). Después de 4 horas de infección con S. typhimurim (FIG. 21A) o L. monocytogenes (FIG. 21B), se sacrificaron los ratones. Se prepararon homogeneizados de bazo e hígado y se cultivaron en medio de agar NB (proporciones en serie de 4 a 8 ratones por grupo) por dilución en serie 10X. Después de cultivar a 37 °C durante 24 horas, se calcularon y se analizaron las UFC bacterianas. La significación estadística se verificó después mediante la prueba t usando el software GraphPad (ver.

4.0). ** p<0,01

Como resultado, se confirmó que, en ratones infectados por S. typhimurium, las UFC bacterianas en el bazo y el hígado del grupo tratado con TrpRS de longitud completa se redujeron significativamente, en comparación con el grupo tratado con mini-TrpRS (mini-WRS) o PBS (FIG. 21A). En ratones infectados con L. monocytogenes, las UFC bacterianas en el bazo y el hígado del grupo tratado con TrpRS de longitud completa (FL-WRS) fueron significativamente menores que las del grupo tratado con mini-TrpRS (mini-WRS) (FIG. 21B). Esto muestra que en el bazo y el hígado de ratones tratados con TrpRS, las bacterias se eliminaron antes de que provocaran infecciones celulares.

Efecto de TrpRS en la tasa de supervivencia de ratones infectados con bacterias

Para investigar el efecto de TrpRS en la tasa de supervivencia de ratones infectados con S. typhimurim (FIG. 22A) o L. monocytogenes (FIG. 22B), los experimentos con animales con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con el esquema experimental de la FIG. 21 (FIG. 22). A los ratones se les inyectó PBS, TrpRS de longitud completa (FL-WRS) o mini-TrpRS (mini-WRS), seguido de infusión de 1 * 107 UFC de S. typhimurium o L. monocytogenes en la cavidad peritoneal. La tasa de supervivencia de los ratones a las 12, 24, 36 y 48 horas después de la infección se expresó como un gráfico de supervivencia de acuerdo con las condiciones de tratamiento.

Como resultado, los ratones infectados por S. typhimurim que recibieron TrpRS de longitud completa fueron 100 % viables hasta 36 horas después de la infección y el 75 % sobrevivieron hasta 48 horas después de la infección, mientras que se encontró que los ratones que recibieron PBS o mini-TrpRS tenían más del 80 % de mortalidad a las 48 horas después de la infección (FIG. 22A). Los ratones infectados con L. monocytogenes que recibieron TrpRS de longitud completa también sobrevivieron un 100 % hasta 48 h antes de la infección y un 75 % sobrevivieron 48 h después de la infección, mientras que el 75 % de los ratones que recibieron PBS o mini-TrpRS murieron en 24 horas (FIG. 22B). Esto indica que el tiempo de supervivencia del grupo al que se inyectó TrpRS fue significativamente más largo que el del grupo de control o el grupo tratado con mini-TrpRS mediante la inyección única de TrpRS sola. Los resultados de los Ejemplos anteriores muestran que la TrpRS de longitud completa reduce la mortalidad de los ratones infectados con bacterias activando las respuestas inmunitarias innatas.

[Disponibilidad industrial]

Como se ha descrito anteriormente, la composición de la presente invención puede usarse eficazmente para prevenir enfermedades inflamatorias infecciosas de seres humanos y animales provocadas por infecciones bacterianas, víricas o fúngicas mediante la inhibición de la infección bacteriana, vírica o fúngica en una etapa temprana, particularmente a través de la activación de la respuesta inmunitaria innata.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedad inflamatoria infecciosa provocada por al menos uno seleccionado del grupo que consiste en bacterias, virus y hongos, que comprende triptofanil-ARNt sintetasa como un principio activo, en donde la triptofanil-ARNt sintetasa induce la acumulación de neutrófilos en el cuerpo.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha composición es una composición alimentaria.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha composición es una composición farmacéutica o una composición veterinaria.

4. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la triptofanil-ARNt sintetasa está representada por una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las enfermedades inflamatorias infecciosas son al menos una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en salmonelosis, intoxicación alimentaria, fiebre tifoidea, paratifoidea, septicemia, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), neumonía, tuberculosis pulmonar, tuberculosis, resfriado, gripe, infección de las vías respiratorias, rinitis, nasofaringitis, otitis media, bronquitis, linfoadenitis, paperas, adenolinfitis, queilitis, estomatitis, artritis, miositis, dermatitis, vasculitis, gingivitis, pericementitis, queratitis, conjuntivitis, infecciones de heridas, peritonitis, hepatitis, osteomielitis, celulitis, meningitis, encefalitis, abscesos cerebrales, encefalomielitis, meningitis cerebral, osteomielitis, nefritis, carditis, endocarditis, enteritis, gastritis, esofagitis, duodenitis, colitis, infección del tracto urinario, cistitis, vaginitis, cervicitis, salpingitis, eritema infeccioso, disentería bacteriana, absceso y úlcera, bacteriemia, diarrea, disentería, gastritis, gastroenteritis, absceso genitourinario, herida abierta o infección de herida, inflamación purulenta, abscesos, flemones, piodermia, impétigo, foliculitis, celulitis, infección de la herida después de la cirugía, síndrome de la piel escaldada, síndrome de quemaduras en la piel, trombocitopenia trombótica, síndrome urémico hemolítico, insuficiencia renal, pielonefritis, glomerulonefritis, absceso del sistema nervioso, otitis media, sinusitis, faringitis, amigdalitis, mastoiditis, inflamación de los tejidos blandos, infección dental, dacriocistitis, pleuresía, absceso abdominal, absceso hepático, colecistitis, absceso de bazo, pericarditis, miocarditis, placentitis, infección de líquido amniótico, mamitis, mastitis, fiebre puerperal, síndrome de choque tóxico, enfermedad de Lyme, gangrena gaseosa, ateroesclerosis, síndrome de Mycobacterium avium (MAC), infección por Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH), infección por Escherichia coli enteropatógena (EPEC), infección por Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), infecciones por Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (VRSA) y listerosis.