CN109694910A

CN109694910A - 防御素hnp基因在治疗器官损伤中的应用

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Publication number: CN109694910A
Application number: CN201810373376.5A
Authority: CN
Inventors: 张海波; 黎毅敏; 钟南山; 亚瑟·斯勒茨基
Original assignee: Guangzhou Respiratory Health Research Institute
Current assignee: Guangzhou Respiratory Health Research Institute
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN109694910B

Abstract

本发明公开了防御素（HNP）基因在治疗器官损伤中的应用。本发明中防御素HNP基因在作为筛选药物的靶标中的应用，所述药物为预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高引起的炎症反应及器官损伤的药物；所述防御素HNP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3任一所示，防御素HNP的氨基酸序列如SEQ ID NO:4～7任一所示。白细胞所释放的防御素（HNP）导致炎症反应的机理并发现防御素通过特异性直接和间接受体诱导器官炎性损伤中的作用。本发明确定了防御素与其直接和间接的受体蛋白可以应用于预防、缓解或/和治疗由白细胞所致炎症反应及器官损伤。此外，防御素与其直接或间接受体蛋白在与炎症反应造成的器官损伤中的作用的发现将为进一步的研究提供新的方向。

Description

防御素HNP基因在治疗器官损伤中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种防御素HNP基因在治疗器官损伤中的应用。

背景技术

天然的防御素分布在从植物、低等动物到哺乳动物等几乎所有的生物类群中，是生物长期与疾病斗争中进化而来的，也是其自身防御体系的重要组成部分。防御素具有十分广泛的抗菌谱，对细菌、真菌、病毒等多种微生物都具有杀伤作用，尤其是哺乳动物防御素，除了对细菌、真菌、被膜病毒具有杀伤作用外，还能杀伤支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性肿瘤细胞。防御素能有效杀灭革兰阴性细菌和革兰性阳细菌及病毒,例如influenzaA virus (IAV)，human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)，herpes simplex virus 1(HSV-1)，respiratory syncytial virus (RSV)，human parainfluenza virus 3 (HPIV-3)，cytomegalovirus (CMV) and vesicular stomatitis virus (VSV) (Wilson S, etal. J Mol Biol. 2013 Dec 13; 425(24)。

发明内容

本发明的目的在于确定防御素HNP基因/蛋白表达与炎症反应造成的器官损伤之间的关系，提供了防御素及其受体在由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供防御素HNP基因在作为筛选药物的靶标中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种防御素HNP基因作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物和/或生物学制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种防御素HNP或防御素HNP基因的抑制剂在制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因在作为筛选药物的靶标中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤药物和/或生物学制剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种防御素HNP的直接或间接受体蛋白或防御素HNP的受体蛋白基因的抑制剂在制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的制剂，含有防御素HNP或其直接或间接受体蛋白的抑制剂的一种或几种的混合物。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

在临床脓毒症患者血浆样本中却发现，患者体内防御素的提高会引起炎症反应从而导致肺损伤，且该损伤作用大于防御素的抗病原微生物的作用。

图1表明了防御素在体内与炎症反应，器官损伤的关系。发明人研究发现器官受外界打击时（如严重感染、呼吸衰竭、呼吸机相关肺损伤等情况），白细胞（包括中性粒细胞）浸润肺内增多，从而释放大量防御素(HNP)，使得器官的防御素HNP升高，形成炎症反应进而引起器官损伤。故防御素可作为炎性损伤标记蛋白，并可应用为临床治疗炎症效果的反馈指标。

同时，防御素也有效应蛋白（本身具有保护或损伤组织）的重要作用：1）已有的研究报道，通过正-负电结合原理，防御素具有杀伤多种微生物作用，防御素由此得名；2）本研究发现，在炎症条件下(包括有菌或无菌的炎症)，大量释放的防御素可引起或加重炎症反应和，进而引起器官损伤。

进一步研究发现了防御素的直接受体BCAM蛋白和间接受体P2Y₆蛋白，抑制防御素HNP的直接受体BCAM蛋白和间接受体P2Y₆蛋白可以有效的缓解由于防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤。

即，当器官受外界打击时，白细胞侵润增多，会使得器官的防御素HNP释放升高：

1）HNP释放的水平可以作为感染和炎症反应的生物标记物；

2）在感染时，低浓度的HNP释放，通过正负电荷互相作用，破解带有负电荷的病原微生物，从而起到杀菌和病毒的作用；

3）在无菌或有菌炎症条件下，大量HNP释放可引起或加重炎性反应，并导致器官损伤；

4）进一步研究发现，防御素与组织器官的接触是通过直接结合细胞表面受体的基底粘附蛋白BCAM，并间接激活嘌呤受体P2Y₆，从而导致炎性反应和器官损伤。

故抑制防御素HNP的直接受体BCAM蛋白和间接受体P2Y₆蛋白可以有效的缓解由于防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤，而同时保持HNP的杀菌作用。

所以本发明要求防御素HNP基因在作为筛选药物的靶标中的应用，所述药物为预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物；所述防御素HNP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3任一所示，防御素HNP的氨基酸序列如SEQ ID NO：4～7任一所示。

所述防御素HNP和防御素HNP基因均为人防御素HNP和人防御素HNP基因。其中，人防御素HNP包括HNP1，HNP2，HNP3和HNP4，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4～7所示，由于人HNP2是HNP-1和HNP-3蛋白一个产物，是HNP-1和HNP-3的N-端截短型，所以，没有对应的基因。因此人防御素只有HNP1基因，HNP3基因和HNP4基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示。

本发明还要求保护，防御素HNP基因作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤药物和/或生物学制剂中的应用。

本发明还要求保护，防御素HNP或防御素HNP基因的抑制剂在制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

本发明还要求保护，防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因在作为筛选药物的靶标中的应用，所述药物为预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物。

本发明还要求保护，防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤药物和/或生物学制剂中的应用。

本发明还要求保护，防御素HNP的直接或间接受体蛋白或防御素HNP的受体蛋白基因的抑制剂在制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

优选地，所述直接受体蛋白为BCAM蛋白，编码BCAM蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示，所述BCAM的氨基酸如SEQ ID NO：9所示。

优选地，所述间接受体蛋白为P2Y₆蛋白，编码P2Y₆蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述P2Y₆的氨基酸如SEQ ID NO：11所示。

进一步，SEQ ID NO：12～15所示siRNA之一为BCAM蛋白抑制剂；SEQ ID NO:16～19所示siRNA之一为P2Y₆蛋白抑制剂。

优选地，所述器官损伤为肺损伤及动脉粥样硬化。

本发明进一步要求保护一种预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的制剂，含有防御素HNP或其直接或间接受体蛋白的抑制剂的一种或几种的混合物。

本发明证实，防御素直接作用在内皮细胞、上皮细胞和免疫细胞后，可造成炎性反应及组织损伤。进一步发现，防御素通过刺激细胞表面受体从而诱导器官炎性损伤。同时，本发明确定了防御素与其直接和间接的受体蛋白。本发明的重大意义在于，阻断介导防御素炎症损伤作用的细胞受体，可抑制炎症反应而不影响其杀灭微生物的作用。本发明应用阻断防御素受体作为治疗靶点，以预防、缓解或/和治疗由白细胞所致炎症反应及器官损伤，同时保留防御素其杀灭微生物的作用。故防御素受体阻断剂可成为新一类内源性抗炎症反应药。

发明具有如下有益效果：

本发明首次确定了防御素HNP与炎症反应造成的器官损伤之间的关系。因此，防御素HNP基因及其直接或间接的受体蛋白基因均可以应用于炎症反应造成的器官损伤的预防、缓解或/和治疗。此外，防御素HNP及其直接或间接受体蛋白在与炎症反应造成的器官损伤中的作用的发现，将为进一步研究提供新的方向。

本发明的重大意义在于，阻断介导防御素炎症损伤作用的细胞受体，可抑制炎症反应而不影响其杀灭微生物的作用。本发明应用阻断防御素受体作为治疗靶点，以预防、缓解或/和治疗由白细胞所致炎症反应及器官损伤，同时保留防御素其杀灭微生物的作用。故防御素受体阻断剂可成为新一类内源性抗微生物药。

附图说明

图1为当器官受外界打击时，白细胞侵润增多，会使得器官的防御素HNP释放升高的模式图。

图2为对于盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症，HNP⁺转基因小鼠与野生型FVB相比体重减轻少，细菌清除能力强；A：体重和直肠温度是在假手术或CLP前和24h之后测量，并且表示为以基线为准的百分比变化；B：CLP 24h后血浆和腹腔灌洗液中HNP浓度；C：全身和局部的细菌数量；其中：C为假手术对照组，M轻度脓毒症，S为严重的脓毒症，N = 10 /组，* P<0.05（相对于FVB假手术对照组），† P <0.05（相对于FVB轻度脓毒症组），‡ p <0.05（相对于FVB严重脓毒症组），§p <0.05（与HNP⁺假手术对照组相比），¶ p <0.05（与HNP ⁺轻度脓毒症相比）。

图3为HNP⁺转基因小鼠在CLP诱导的脓毒症中炎症反应和肺损伤减轻；A：CLP 24h后检测血浆细胞因子/趋化因子；B：CLP 24h后的代表性肺组织学检查（200x，比例尺=50μm）；其中：C为假手术对照组，M为轻度脓毒症，S为严重的脓毒症，对照组N = 4/组，脓毒症组N = 8 /组，* p<0.05（与FVB假手术对照组相比），† P<0.05（相对于FVB轻度脓毒症组），‡ p<0.05（相对于FVB严重脓毒症组），§P <0.05（相对于HNP假手术对照组），¶ p<0.05（相对于HNP +轻度脓毒症组）。

图4为在急性肺损伤模型中HNP⁺转基因小鼠比野生型FVB小鼠具有更高的炎症反应和肺损伤；A：PBS或盐酸滴注2小时后行低压通气（LV）或高压通气（HV）3小时后肺组织中HNP浓度；B：在二次打击后检测血浆细胞因子和趋化因子；C：二次打击损伤后的代表性肺组织学（200x，比例尺=50μm）；其中：S为自主呼吸，LV为低压通气；HV为高压通气，PBS自主呼吸组中N = 3，在其他条件下，n = 7 /组，* p <0.05（与HNP ⁺小鼠的PBS + S相比），† p <0.05（与相同条件下的FVB相比），‡ p<0.05（与相同菌株的HCl + S相比），§ p<0.05（分别相对于FVB的S组）。

图5为HNP被人肺上皮细胞摄取并与BCAM共定位；A：HNP被BEAS-2B细胞摄取，FITC-HNP，在37℃下与BEAS-2B细胞培养2h，上图为HNP共定位与F-肌动蛋白，下图为单丹磺酰尸胺（MDC）预处理30分钟抑制HNP；B：在玻璃盖玻片HNP与BEAS-2B（顶部）和SAEC（底部）在37℃下培养1h。

图6为HNP与BCAM或P2Y₆的共定位分析以及BCAM和P2Y₆响应HNP刺激对IL-8产生和细胞粘附的作用；A：来自肺上皮细胞的HNP和BCAM或P2Y₆之间的结合分析，蛋白从人类小气道上皮细胞（SAEC）或BEAS-2B细胞的全细胞裂解物（WCL）或膜组分（MP）提取；B：GST融合蛋白pull-down测定，从SAEC和BEAS-2B细胞中提取的蛋白质与GST或GST-HNP融合蛋白固定在谷胱甘肽Sephorase 4B珠一起孵育，用所标示抗体检测被pull-down的GST-HNP受体蛋白；C：用特异性siRNA将BEAS-2B细胞中BCAM和P₂Y₆的表达敲低48小时后将细胞用HNP处理4小时以检测HNP刺激的IL-8产生（左）和细胞粘附（右）；D：BEAS-2B细胞用HNP特异性抑制剂MRS2578预处理30分钟，然后和HNP培养6小时。HNP-刺激IL-8的产生被MRS2578以剂量依赖方式被显著抑制，但HNP增强细胞粘附效应不被MRS2578所抑制；其中：N = 5，* p <0.05（相对于HNP + MRS25780μM），** p <0.05（相对于HNP + MRS25783μM），†p <0.05（分别相对于HNP ⁺ scRNA组），E：受体间相互作用/复合物的形成模型示意图，与表面BCAM结合的HNP与P₂Y₆相互作用形成受体复合物，导致细胞内信号传导激活和细胞功能应答。

图7为HNP分别与重组的人BCAM/Fc和P2Y₆/GST三种融合蛋白孵育。

图8为BEAS-2B细胞中BCAM或P2Y₆的蛋白质表达。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例 1 HNP的表达情况

1、健康对照组和脓毒症患者的HNP水平

（1）具体做法

血浆来源于DYNAMICS研究患者，为多中心、前瞻性、感染性和非脓毒血症的重症患者的观察性研究（DYNAMICS研究，ClinicalTrials临床注册号NCT01355042），本研究通过在加拿大圣米高医院的研究伦理委员会的批准。经健康伦理委员会批准后，从健康志愿者（获得书面知情同意书）采集血浆作为对照组。ICU患者标本为入院后24小时内采集血液样本。非脓毒血症组患者符合以下诊断：外伤；心源性休克；神经外科相关诊断：动脉瘤，蛛网膜下腔，颅内、硬膜下出血；或其他原因造成休克（例如，肺栓塞）。通过ELISA测定的HNP水平。

一共采集了62名脓毒血症患者，38名为非脓毒血症患者和9名为健康人将样本进行研究，检测其防御素HNP水平，所有研究需取得患者本人或家属的知情同意。非脓毒血症患者为有创伤和失血性休克等情况的危重患者。主要临床特征见表1。

表1：入选患者一般人口学和临床特征资料及HNP水平

	健康志愿者	脓毒症	非脓毒症
				例数	9	62	38
年龄（岁）	46.3 ± 2.2	67.4 ± 4.5	64.5 ±4.7
				性别（男/女）	5/4	34/28	22/16
乳酸 (mmol/L)		4.5 ± 0.5	3.9 ± 0.5
				HNP（ng/mL）	1.4 ± 0.3	4.4 ± 0.5<sup>a</sup>	7.5 ± 0.6<sup>a,b</sup>
白细胞计数（10<sup>9</sup>/L）	5.5 ± 0.3	17.6 ± 1.1<sup>a</sup>	14.7 ± 1.1<sup>a</sup>
				中性粒细胞计数（10<sup>9</sup>/L）	1.5 ± 0.6	14.8 ± 7.2<sup>a</sup>	12.8 ± 0.9<sup>a</sup>
APACHE II		26.0 ± 0.4	26.3 ± 0.4
				MODS评分		8.1 ± 3.3	7.7 ± 2.4
感染部位<sup>*</sup>
				菌血症		26 (41.9%)
肺		28 (45.2%)
				腹腔		5 (8.1%)
尿道		13 (21.0%)
				皮肤软组织		3 (4.8%)
神经系统		2 (3.2%)
				其他		1 (1.6%)
非脓毒症病因
				创伤			6
消化道			3
				脑			9
心血管			9
				呼吸系统			5
出血性休克			3
				其他			3

说明：a，p<0.05与健康志愿者相比；b，p<0.05 与脓毒症患者相比； *，有些患者感染部位不止一个。APACHE II：急性生理与慢性健康评分II ；MODS评分：多器官功能障碍综合征评分。

（2）结果

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征，临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶。虽然脓毒症是由感染引起，但从本质上讲脓毒症是机体对感染后的强烈炎性反应，并导致多器官衰竭。

本实验发现，脓毒症患者的血浆HNP水平高于健康志愿者，HNP在重症患者特别是重症感染（脓毒症）患者的血液浓度升高。说明，白细胞增多，就会使得防御素HNP升高。

实施例2小鼠脓毒症模型的建立

1、HNP在小鼠体内的表达情况

（1）具体做法

动物实验方案得到了圣米高医院动物护理委员会的批准。将10～12周龄的野生型FVB小鼠和转基因HNP⁺（过表达HNP）小鼠随机分为轻度和重度脓毒症组（n = 10 /组）进行盲肠结扎穿刺（CLP）造成脓毒症模型。

麻醉小鼠，通过结扎盲肠的一半并用18G针在盲肠壁的一侧刺穿一次而诱导的；通过结扎四分之三的盲肠并通过单次穿透穿刺来达到严重的败血症。对小鼠行外科手术但不进行盲肠穿刺结扎为假手术对照组。所有小鼠接受1mL盐水注射，并且保持在具有食物和水的培养箱中24小时，手术前后24小时测量体重和直肠温度。

（2）结果

盲肠结扎穿刺（CLP）24小时后，小鼠表现出明显的体重减轻和体温降低脓毒血症的症状（图2中A）HNP⁺转基因小鼠与野生型FVB小鼠相比HNP显著升高。症状越严重HNP的表达量越高（图2中B）。野生型FVB小鼠，轻度脓毒血的小鼠的全身性细菌负荷为6.1 ± 1.4×10²CFU/mL，重度脓毒症小鼠的全身性细菌负荷为6.1 ± 3.4×10⁵CFU/mL，HNP⁺转基因小鼠分别降低为3.1 ± 18 CFU/mL和4.0 ± 0.8×10³CFU/mL（p<0.05）。野生型FVB小鼠，轻度症状的小鼠的腹腔灌洗液中细菌量为5.2 ± 1.1×10⁴CFU/mL，重度症状的小鼠的腹腔灌洗液中细菌量为7.7 ± 4.9×10⁸CFU/mL，HNP⁺转基因小鼠分别降低为2.1 ±0.9×10²CFU/mL和1.0 ± 0.4×10⁶CFU/mL（p<0.05）。在对肺组织的细菌计数时候也观察到了相似的结果（图2中C）。

FVB和HNP⁺小鼠的白细胞数基本一致，但只有HNP⁺小鼠白细胞分泌HNP，故其HNP水平高于FVB小鼠，模型构建用以证实HNP的致炎作用。说明了在脓毒症模型中，HNP⁺小鼠体重减轻更少，体温降低的更少，局部和全身细菌的清除增加。

2、小鼠脓毒症模型中细胞因子、趋化因子和肺损伤的检测

检测上一步中处理过的HNP⁺转基因小鼠与野生型FVB小鼠的细胞因子/趋化因子（IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-12，GM-CSF，INF-γ，IL-10）和肺损伤炎性细胞因子（KC，MCP-1，RANTES）。

（1）具体做法

小鼠的细胞因子（IL-6，IL-1β，TNF-α，INF-γ，IL-12，GM-CSF，IL-10）和趋化因子是通过可组合的小鼠多细胞（KC，MCP-1，RANTES）依试剂盒Mouse polysryrene kits(Affymetrix) canalogue #PC3010说明书检测。

（2）结果

从轻度到重度脓毒症小鼠，血浆中测定的炎性细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-12，GM-CSF，INF-γ，IL-10和趋化因子（KC，MCP-1，RANTES）以剂量依赖的方式增加。对于相同严重程度的脓毒症模型，与FVB小鼠相比，HNP⁺小鼠的细胞因子和趋化因子水平较低（p <0.05，图3中A），说明HNP⁺小鼠炎症反应较弱。

同时，经过观察发现在盲肠结扎穿刺诱导的脓毒症之后的急性肺损伤的特征：中性粒细胞浸润，肺水肿，肺泡壁增厚出血，在FVB小鼠中的嗜中性粒细胞浸润，肺水肿，肺泡壁增厚和出血，在HNP⁺转基因小鼠的大大减弱（图3中B）。说明HNP ⁺小鼠在CLP诱导的脓毒症炎症反应和肺损伤减轻，同样说明HNP⁺小鼠炎症反应较弱。

由此得到，在单纯感染时，HNP释放，通过正负电荷互相作用，破解带有负电荷的病原微生物，从而起到杀菌和病毒的作用。

实施例 3 HNP⁺转基因小鼠的肺损伤情况

对HNP⁺转基因和野生型FVB小鼠分别进行盐酸和磷酸缓冲液的灌注，2小时候低压（LV）通气或高压（HV）通气3小时。

1、具体做法

用盐酸滴注、机械通气或联合（二次打击）诱导急性肺损伤模型。FVB和HNP⁺小鼠随机分为6组，每组7只。麻醉小鼠，腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤），然后用20G血管导管（Becton Dickinson，Mississauga，ON，Canada）气管插管。HCl（0.1N，pH=1.2，2mL/kg）或等量的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）气管内滴注；随后进行机械通气（ServoI，Maquet-Dynamed Inc，Markham，ON，Canada）10分钟，吸气峰压（PIP）10 cmH₂O，呼气末正压（PEEP） 2 cmH₂O，呼吸频率（RR）120次/min，呼入氧浓度（FiO₂）0.5，使HCl在肺内分布均匀。盐酸灌注后两小时，小鼠用4%七氟醚，气管插管麻醉，通风3小时，或高压通风（HV）PIP 22cm H₂O，PEEP 0 cm H₂O和RR 70次/ min，FiO₂ 0.4；或低压力通气（LV）PIP 12 cm H₂O，PEEP2 cmH₂O和RR 120次/ min，FiO₂ 0.4。

2、结果

如图4，与自发呼吸组相比，单独HCl灌注、机械通气使用LV或HV、HCI灌注-通气二次打击模型均导致肺组织中HNP表达的显着增加，并且HNP⁺转基因小鼠中的HNP浓度在二次打击即HCl滴注后进行机械通气组中进一步增加，（图4中A）。

在野生型FVB小鼠中，细胞因子IL-1β，IL-6和趋化因子MCP-1和KC仅在二次打击组中增加，但在HNP⁺转基因小鼠中仅观察到机械通气、单独的HCl滴注和二次打击组（图4中B）细胞炎症因子均有增加。与FVB小鼠相比，组织学评估显示HNP⁺转基因小鼠中更严重的肺损伤，与其增强的肺部炎症反应一致（图4中C）。

结果说明：HNP加重急性肺损伤动物模型的炎症反应和肺损伤严重程度。

结合实施例2的结果说明了HNP有双重作用：

一方面，在单纯感染时，HNP释放，通过正负电荷互相作用，破解带有负电荷的病原微生物，从而起到杀菌和病毒的作用；

另一方面，在炎症条件下（包括有菌或无菌的），大量HNP释放可引起或加重炎症反应；

当由于HNP释放后的促炎作用大于其杀病原体的作用时，就会导致器官损伤。

即，在有感染存在的情况下，HNP可起到杀灭细菌的作用；但另一方面，在炎症条件下（包括有菌或无菌的），大量释放的HNP可引起加重炎症反应和导致器官损伤。

实施例 4 HNP受体蛋白的鉴定

1、为了检测HNP在脓毒症与原发性急性肺损伤模型中发挥不同作用的机制，检测了BEAS-2B细胞中HNP是否可以通过受体介导的内吞作用被内吞。

（1）具体做法

BEAS-2B和SAEC（1×10⁵）细胞与HNP（10μg/ml，在无FBS的DMEM中）37℃孵育1 h，然后与鼠抗人HNP单克隆抗体孵育，最后用相应的二抗进行染色。

（2）结果

观察到FITC-HNP在孵育2h后被BEAS-2B细胞内吞，并且MDC处理可抑制HNP 被内吞（图5中A），表明存在配体—受体相互作用。

2、使用HNP作为诱饵，进行质谱仪蛋白质组学分析

（1）具体做法

使用了两种细胞：正常人肺上皮细胞BEAS-2B细胞和原代培养的人小气道上皮细胞。使用HNP为诱饵，将HNP的结合蛋白进行分离，经考马斯亮蓝染色后将目的条带切下，并进行质谱分析。

（2）结果

使用HNP作为诱饵，质谱仪蛋白质组学分析与HNP结合可能的受体，发现了2种膜蛋白与HNP存在结合。结合蛋白经过鉴定与已知的人基底细胞粘附分子（BCAM/CD239）和P2Y嘌呤受体6（P2Y₆）有100%序列同源性。

编码BCAM蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述BCAM的氨基酸序列如SEQID NO：9所示；

编码P2Y₆蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述P2Y₆的氨基酸如序列SEQ IDNO：11所示；

3、免疫荧光检测

（1）具体做法

首先，BEAS-2B和SAEC（1×10⁵）细胞与HNP（10μg/ ml，在无FBS的DMEM中）37℃孵育1 h；

然后，与鼠抗人HNP单克隆抗体和兔抗人单克隆抗体P2Y₆孵育，

或与兔抗人HNP多克隆抗体和鼠抗人BCAM单克隆抗体孵育；

最后，用相应的二抗进行染色。

（2）结果：

在SAEC和BEAS-2B细胞中对HNP、BCAM和P2Y₆进行免疫荧光，证实了HNP和BCAM之间的存在直接的相互作用，但HNP与P2Y₆不存在直接相互作用（图5中B）。

4、免疫共沉淀检测

（1）具体做法为：

纯化HNP和BEAS-2B或SAEC细胞的全细胞裂解液或细胞膜蛋白提取物分别与BCAM和P2Y₆抗体在4℃过夜孵育；然后加入Protein A/G Ultra-Link Resin（Thermo Scientific，Waltham，MA）对可能存在的免疫复合物进行沉淀。

（2）结果：

结果显示：在BEAS-2B细胞膜蛋白中显示HNP和BCAM或P2Y₆之间存在相互结合（图6中A）

5、GST-HNP融合蛋白下拉（pull down）分析

（1）具体做法

将GST-HNP融合蛋白和BEAS-2B或SAEC细胞中提取的全细胞裂解物混合并在4℃下条件下孵育过夜，GST蛋白为对照组；然后用谷胱甘肽珠子（glutathione beads）下拉与GST融合蛋白结合的蛋白复合物，免疫印迹检测BCAM或P2Y₆与GST-HNP融合蛋白是否存在结合。

（2）结果

结果显示：使用GST-HNP融合蛋白的Pull-Down实验表明，只有BCAM与GST-HNP融合蛋白在SAEC和BEAS-2B细胞中具有清晰和一致的结合（图6中B）。

6、重组蛋白Pull-Down实验

（1）具体做法

重组蛋白BCAM-Fc （R&D Systems）或 P2Y₆-GST（Abnova，Walnut，CA）分别与纯化的HNP在4℃孵育；然后用蛋白A/G珠子（protein A/G beads）下拉Fc嵌合体蛋白或谷胱甘肽珠子（glutathione beads）下拉GST融合蛋白。珠子单独或与重组人Fc片段一起与HNP孵育作用对照组。使用SDS-PAGE电泳和HNP多克隆抗体检测目标蛋白是否与HNP之间的存在结合。

（2）结果

将HNP分别与重组的人BCAM/Fc、和P2Y₆/GST两种融合蛋白孵育，进一步证实重组HNP蛋白可以与重组人BCAM/Fc融合蛋白直接结合，而不与P2Y₆/GST融合蛋白直接结合（图7）。

实施例5 HNP受体蛋白的功能鉴定

1、通过使用特定的siRNA分别沉默BEAS-2B细胞中BCAM或P2Y₆的蛋白质表达。

用于沉默BCAM 的siRNA的序列为：

SEQ ID NO：12：GCUAAAGACAGCGGAAAUA，

SEQ ID NO：13：CGGGAACCCACGACCAUUA，

SEQ ID NO：14：GAGGUGCGCUUGUCUGUAC，

SEQ ID NO：15：CGAGGAAAGUCUGUCAUUC；

用于沉默P2Y₆的siRNA的序列为：

SEQ ID NO：16：CCACAGGCAUCCAGCGUAA，

SEQ ID NO：17：GUGUCUACCGCGAGAACUU，

SEQ ID NO：18：GCACUGUAUUGGAGGCCUU，

SEQ ID NO：19：CAACUAUGCCCAAGGUGAU。

（1）具体做法

将BEAS-2B细胞以2×10⁵个细胞/孔的浓度接种在24孔板中并培养过夜。对于基因敲低研究，分别用靶向BCAM和P2Y₆的siRNA（Dharmacon，Lafayette，CO）转染细胞。

（2）结果

结果显示：靶向BCAM和P2Y₆的siRNA可以降低BEAS-2B细胞中BCAM或P2Y₆的蛋白质表达（图8）。

2、细胞IL-8和粘附性检测

（1）具体做法

使用含HNP的无血清培养基刺激37℃培养皿中BEAS-2B，一段时间后，使用胰蛋白酶和EDTA在37℃消化细胞使用在非处理的对照组细胞与培养皿中完全分开。轻轻地冲洗脱落细胞后，仍贴壁的细胞使用甲醇固定1 min，然后使用1.2 g/mL Thiazine染色一分钟,去除培养皿中液体并在常温干燥。将脱色液（甲醇10 mL、醋酸5 mL，水37.5 mL）添加培养皿中，直到所有的细胞染色的染料溶解。在96孔板中测定了染料的光密度（OD 590 nm），为细胞粘附的一个定量结果。

（2）结果：

沉默BCAM导致HNP诱导的IL-8产生减弱和细胞粘附显着降低的趋势，而沉默P2Y₆导致IL-8产生和细胞粘附两者显着降低（图6中C）。

3、在BEAS-2B细胞中使用特异性P2Y₆抑制剂MRS2578响应HNP刺激进一步研究了P2Y₆的功能活性。

（1）具体做法

使用P2Y₆受体的特异性阻断MRS2578（Sigma）剂量分别为0、3、10nM预处理细胞，然后检测HNP诱导BEAS-2B的上清IL-8含量(Mouse ProcartaPlex Panels)和细胞粘附能力。

（2）结果

MRS2578的应用导致HNP诱导的IL-8产生的剂量依赖性衰减，但不是细胞粘附（图6中D），表明后者受P2Y₆受体以外的信号途径调控。说明BCAM负责介导HNP诱导的细胞粘附，而P2Y₆信号调节IL-8的产生。

总之，结果表明，HNP能够结合BCAM，而BCAM继而与P2Y₆受体相互作用，介导人肺上皮细胞中的HNP刺激的炎症反应（图6中E）。

序列表

<110> 广州呼吸健康研究院

<120> 防御素HNP基因在治疗器官损伤中的应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 514

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggctgctcct tgctatagaa gacctgggac agaggactgc tgtctgccct ctctggtcac 60

cctgcctagc tagaggatct gtgaccccag ccatgaggac cctcgccatc cttgctgcca 120

ttctcctggt ggccctgcag gcccaggctg agccactcca ggcaagagct gatgaggttg 180

ctgcagcccc ggagcagatt gcagcggaca tcccagaagt ggttgtttcc cttgcatggg 240

acgaaagctt ggctccaaag catccaggct caaggaaaaa catggcctgc tattgcagaa 300

taccagcgtg cattgcagga gaacgtcgct atggaacctg catctaccag ggaagactct 360

gggcattctg ctgctgagct tgcagaaaaa gaaaaatgag ctcaaaattt gctttgagag 420

ctacagggaa ttgctattac tcctgtacct tctgctcaat ttcctttcct catcccaaat 480

aaatgccttg ttacaagaaa aaaaaaaaaa aaaa 514

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ccttgctata gaagacctgg gacagaggac tgctgtctgc cctctctggt caccctgcct 60

agctagagga tctgtgaccc cagccatgag gaccctcgcc atccttgctg ccattctcct 120

ggtggccctg caggcccagg ctgagccact ccaggcaaga gctgatgagg ttgctgcagc 180

cccggagcag attgcagcgg acatcccaga agtggttgtt tcccttgcat gggacgaaag 240

cttggctcca aagcatccag gctcaaggaa aaacatggac tgctattgca gaataccagc 300

gtgcattgca ggagaacgtc gctatggaac ctgcatctac cagggaagac tctgggcatt 360

ctgctgctga gcttgcagaa aaagaaaaat gagctcaaaa tttgctttga gagctacagg 420

gaattgctat tactcctgta ccttctgctc aatttccttt cctcatctca aataaatgcc 480

ttgttacaag aaaaaaaaaa a 501

<210> 3

<211> 619

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ccttaaataa ggaagtcctc tcctctgtgt gcatggctgc tcttgctaca taagacctgg 60

aacacaggac tgctgtctgc cctctctgct cgccctgcct agcttgagga tctgtcaccc 120

cagccatgag gattatcgcc ctcctcgctg ctattctctt ggtagccctc caggtccggg 180

caggcccact ccaggcaaga ggtgatgagg ctccaggcca ggagcagcgt gggccagaag 240

accaggacat atctatttcc tttgcatggg ataaaagctc tgctcttcag gtttcaggct 300

caacaagggg catggtctgc tcttgcagat tagtattctg ccggcgaaca gaacttcgtg 360

ttgggaactg cctcattggt ggtgtgagtt tcacatactg ctgcacgcgt gtcgattaac 420

gttctgctgt ccaagagaat gtcatgctgg gaacgccatc atcggtggtg ttagcttcac 480

atgcttctgc agctgagctt gcagaataga gaaaaatgag ctcataattt gctttgagag 540

ctacaggaaa tggttgtttc tcctatactt tgtccttaac atctttcttg atcctaaata 600

tatatctcgt aacaagatg 619

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr

1 5 10 15

Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys

20 25 30

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr Gly

1 5 10 15

Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys

20 25

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Asp Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr

1 5 10 15

Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys

20 25 30

<210> 7

<211> 33

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ala Cys Ser Cys Arg Leu Val Phe Cys Arg Arg Thr Glu Leu Arg Val

1 5 10 15

Gly Asn Cys Leu Ile Gly Gly Val Ser Phe Thr Tyr Cys Cys Thr Arg

20 25 30

Val

<210> 8

<211> 2470

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctctggctcc cagccccgca gcggccgagc tgcagcccgg gctcagtctc cgccgccgcc 60

gtgaacatgg agcccccgga cgcaccggcc caggcgcgcg gggccccgcg gctgctgttg 120

ctcgcagtcc tgctggcggc gcacccagat gcccaggcgg aggtgcgctt gtctgtaccc 180

ccgctggtgg aggtgatgcg aggaaagtct gtcattctgg actgcacccc tacgggaacc 240

cacgaccatt atatgctgga atggttcctt accgaccgct cgggagctcg cccccgccta 300

gcctcggctg agatgcaggg ctctgagctc caggtcacaa tgcacgacac ccggggccgc 360

agtcccccat accagctgga ctcccagggg cgcctggtgc tggctgaggc ccaggtgggc 420

gacgagcgag actacgtgtg cgtggtgagg gcaggggcgg caggcactgc tgaggccact 480

gcgcggctca acgtgtttgc aaagccagag gccactgagg tctcccccaa caaagggaca 540

ctgtctgtga tggaggactc tgcccaggag atcgccacct gcaacagccg gaacgggaac 600

ccggccccca agatcacgtg gtatcgcaac gggcagcgcc tggaggtgcc cgtagagatg 660

aacccagagg gctacatgac cagccgcacg gtccgggagg cctcgggcct gctctccctc 720

accagcaccc tctacctgcg gctccgcaag gatgaccgag acgccagctt ccactgcgcc 780

gcccactaca gcctgcccga gggccgccac ggccgcctgg acagccccac cttccacctc 840

accctgcact atcccacgga gcacgtgcag ttctgggtgg gcagcccgtc caccccagca 900

ggctgggtac gcgagggtga cactgtccag ctgctctgcc ggggggacgg cagccccagc 960

ccggagtata cgcttttccg ccttcaggat gagcaggagg aagtgctgaa tgtgaatctc 1020

gaggggaact tgaccctgga gggagtgacc cggggccaga gcgggaccta tggctgcaga 1080

gtggaggatt acgacgcggc agatgacgtg cagctctcca agacgctgga gctgcgcgtg 1140

gcctatctgg accccctgga gctcagcgag gggaaggtgc tttccttacc tctaaacagc 1200

agtgcagtcg tgaactgctc cgtgcacggc ctgcccaccc ctgccctacg ctggaccaag 1260

gactccactc ccctgggcga tggccccatg ctgtcgctca gttctatcac cttcgattcc 1320

aatggcacct acgtatgtga ggcctccctg cccacagtcc cggtcctcag ccgcacccag 1380

aacttcacgc tgctggtcca aggctcgcca gagctaaaga cagcggaaat agagcccaag 1440

gcagatggca gctggaggga aggagacgaa gtcacactca tctgctctgc ccgcggccat 1500

ccagacccca aactcagctg gagccaattg gggggcagcc ccgcagagcc aatccccgga 1560

cggcagggtt gggtgagcag ctctctgacc ctgaaagtga ccagcgccct gagccgcgat 1620

ggcatctcct gtgaagcctc caacccccac gggaacaagc gccatgtctt ccacttcggc 1680

accgtgagcc cccagacctc ccaggctgga gtggccgtca tggccgtggc cgtcagcgtg 1740

ggcctcctgc tcctcgtcgt tgctgtcttc tactgcgtga gacgcaaagg gggcccctgc 1800

tgccgccagc ggcgggagaa gggggctccg ccgccagggg agccagggct gagccactcg 1860

gggtcggagc aaccagagca gaccggcctt ctcatgggag gtgcctccgg aggagccagg 1920

ggtggcagcg ggggcttcgg agacgagtgc tgagccaaga acctcctaga ggctgtccct 1980

ggacctggag ctgcaggcat cagagaacca gccctgctca cgccatgccc gcccccgcct 2040

tccctcttcc ctcttccctc tccctgccca gccctccctt ccttcctctg ccggcaaggc 2100

agggacccac agtggctgcc tgcctccggg agggaaggag agggagggtg ggtgggtggg 2160

agggggcctt cctccaggga atgtgactct cccaggcccc agaatagctc ctggacccaa 2220

gcccaaggcc cagcctggga caaggctccg agggtcggct ggccggagct atttttacct 2280

cccgcctccc ctgctggtcc ccccacctga cgtcttgctg cagagtctga cactggattc 2340

ccccccctca ccccgcccct ggtcccactc ctgcccccgc cctacctccg ccccacccca 2400

tcatctgtgg acactggagt ctggaataaa tgctgtttgt cacatcaaca ccaaaaaaaa 2460

aaaaaaaaaa 2470

<210> 9

<211> 628

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Met Glu Pro Pro Asp Ala Pro Ala Gln Ala Arg Gly Ala Pro Arg Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Val Leu Leu Ala Ala His Pro Asp Ala Gln Ala Glu

20 25 30

Val Arg Leu Ser Val Pro Pro Leu Val Glu Val Met Arg Gly Lys Ser

35 40 45

Val Ile Leu Asp Cys Thr Pro Thr Gly Thr His Asp His Tyr Met Leu

50 55 60

Glu Trp Phe Leu Thr Asp Arg Ser Gly Ala Arg Pro Arg Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Glu Met Gln Gly Ser Glu Leu Gln Val Thr Met His Asp Thr Arg

85 90 95

Gly Arg Ser Pro Pro Tyr Gln Leu Asp Ser Gln Gly Arg Leu Val Leu

100 105 110

Ala Glu Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Asp Tyr Val Cys Val Val Arg

115 120 125

Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Glu Ala Thr Ala Arg Leu Asn Val Phe

130 135 140

Ala Lys Pro Glu Ala Thr Glu Val Ser Pro Asn Lys Gly Thr Leu Ser

145 150 155 160

Val Met Glu Asp Ser Ala Gln Glu Ile Ala Thr Cys Asn Ser Arg Asn

165 170 175

Gly Asn Pro Ala Pro Lys Ile Thr Trp Tyr Arg Asn Gly Gln Arg Leu

180 185 190

Glu Val Pro Val Glu Met Asn Pro Glu Gly Tyr Met Thr Ser Arg Thr

195 200 205

Val Arg Glu Ala Ser Gly Leu Leu Ser Leu Thr Ser Thr Leu Tyr Leu

210 215 220

Arg Leu Arg Lys Asp Asp Arg Asp Ala Ser Phe His Cys Ala Ala His

225 230 235 240

Tyr Ser Leu Pro Glu Gly Arg His Gly Arg Leu Asp Ser Pro Thr Phe

245 250 255

His Leu Thr Leu His Tyr Pro Thr Glu His Val Gln Phe Trp Val Gly

260 265 270

Ser Pro Ser Thr Pro Ala Gly Trp Val Arg Glu Gly Asp Thr Val Gln

275 280 285

Leu Leu Cys Arg Gly Asp Gly Ser Pro Ser Pro Glu Tyr Thr Leu Phe

290 295 300

Arg Leu Gln Asp Glu Gln Glu Glu Val Leu Asn Val Asn Leu Glu Gly

305 310 315 320

Asn Leu Thr Leu Glu Gly Val Thr Arg Gly Gln Ser Gly Thr Tyr Gly

325 330 335

Cys Arg Val Glu Asp Tyr Asp Ala Ala Asp Asp Val Gln Leu Ser Lys

340 345 350

Thr Leu Glu Leu Arg Val Ala Tyr Leu Asp Pro Leu Glu Leu Ser Glu

355 360 365

Gly Lys Val Leu Ser Leu Pro Leu Asn Ser Ser Ala Val Val Asn Cys

370 375 380

Ser Val His Gly Leu Pro Thr Pro Ala Leu Arg Trp Thr Lys Asp Ser

385 390 395 400

Thr Pro Leu Gly Asp Gly Pro Met Leu Ser Leu Ser Ser Ile Thr Phe

405 410 415

Asp Ser Asn Gly Thr Tyr Val Cys Glu Ala Ser Leu Pro Thr Val Pro

420 425 430

Val Leu Ser Arg Thr Gln Asn Phe Thr Leu Leu Val Gln Gly Ser Pro

435 440 445

Glu Leu Lys Thr Ala Glu Ile Glu Pro Lys Ala Asp Gly Ser Trp Arg

450 455 460

Glu Gly Asp Glu Val Thr Leu Ile Cys Ser Ala Arg Gly His Pro Asp

465 470 475 480

Pro Lys Leu Ser Trp Ser Gln Leu Gly Gly Ser Pro Ala Glu Pro Ile

485 490 495

Pro Gly Arg Gln Gly Trp Val Ser Ser Ser Leu Thr Leu Lys Val Thr

500 505 510

Ser Ala Leu Ser Arg Asp Gly Ile Ser Cys Glu Ala Ser Asn Pro His

515 520 525

Gly Asn Lys Arg His Val Phe His Phe Gly Thr Val Ser Pro Gln Thr

530 535 540

Ser Gln Ala Gly Val Ala Val Met Ala Val Ala Val Ser Val Gly Leu

545 550 555 560

Leu Leu Leu Val Val Ala Val Phe Tyr Cys Val Arg Arg Lys Gly Gly

565 570 575

Pro Cys Cys Arg Gln Arg Arg Glu Lys Gly Ala Pro Pro Pro Gly Glu

580 585 590

Pro Gly Leu Ser His Ser Gly Ser Glu Gln Pro Glu Gln Thr Gly Leu

595 600 605

Leu Met Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Phe

610 615 620

Gly Asp Glu Cys

625

<210> 10

<211> 2372

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

tgctctggct cctctgggtt ccagggacgc tggggccgga gctgctgccg ccgtctacac 60

ggtcccctca tttgacgggt tcgcctccta gcagcgcctg ggcgagtgac atctgggccg 120

gaccagctgg tgctgcgcgg cgcagataac aagacctctg ccagaagaac catggctttg 180

gaaggcggag ttcaggctga ggagatgggt gcggtcctca gtgagcccct gcctccctga 240

acataggaaa cccacctggg cagccatgga atgggacaat ggcacaggcc aggctctggg 300

cttgccaccc accacctgtg tctaccgcga gaacttcaag caactgctgc tgccacctgt 360

gtattcggcg gtgctggcgg ctggcctgcc gctgaacatc tgtgtcatta cccagatctg 420

cacgtcccgc cgggccctga cccgcacggc cgtgtacacc ctaaaccttg ctctggctga 480

cctgctatat gcctgctccc tgcccctgct catctacaac tatgcccaag gtgatcactg 540

gccctttggc gacttcgcct gccgcctggt ccgcttcctc ttctatgcca acctgcacgg 600

cagcatcctc ttcctcacct gcatcagctt ccagcgctac ctgggcatct gccacccgct 660

ggccccctgg cacaaacgtg ggggccgccg ggctgcctgg ctagtgtgtg tagccgtgtg 720

gctggccgtg acaacccagt gcctgcccac agccatcttc gctgccacag gcatccagcg 780

taaccgcact gtctgctatg acctcagccc gcctgccctg gccacccact atatgcccta 840

tggcatggct ctcactgtca tcggcttcct gctgcccttt gctgccctgc tggcctgcta 900

ctgtctcctg gcctgccgcc tgtgccgcca ggatggcccg gcagagcctg tggcccagga 960

gcggcgtggc aaggcggccc gcatggccgt ggtggtggct gctgcctttg ccatcagctt 1020

cctgcctttt cacatcacca agacagccta cctggcagtg cgctcgacgc cgggcgtccc 1080

ctgcactgta ttggaggcct ttgcagcggc ctacaaaggc acgcggccgt ttgccagtgc 1140

caacagcgtg ctggacccca tcctcttcta cttcacccag aagaagttcc gccggcgacc 1200

acatgagctc ctacagaaac tcacagccaa atggcagagg cagggtcgct gagtcctcca 1260

ggtcctgggc agccttcata tttgccattg tgtccggggc accaggagcc ccaccaaccc 1320

caaaccatgc ggagaattag agttcagctc agctgggcat ggagttaaga tccctcacag 1380

gacccagaag ctcaccaaaa actatttctt cagccccttc tctggcccag accctgtggg 1440

catggagatg gacagacctg ggcctggctc ttgagaggtc ccagtcagcc atggagagct 1500

ggggaaacca cattaaggtg ctcacaaaaa tacagtgtga cgtgtactgt catcaagggg 1560

tatgctccat gctttgagtc accaatgaag cgggtgaggg aagatgagag ggggaggtga 1620

gagcttctgg gaaggggcat ttgagctggg ttttgaggga tgattatgag ctctctggag 1680

aggagtgata ttccatttat ttagaaagcc tttactgaca ccttgtgctc aggcctgtgt 1740

tggttctggg gccctagaag aaccagtcct agccctggtc catacgggct cccaactgct 1800

ggaagtacag actggcacag caacatcagg gttgtgacag agggaagcat ggctgggggg 1860

agggggtaca cagacagtgc ccatgaccca gtccaaggag tcaggaaaga gctctctgag 1920

gagggagcat ctgagccaga tgttgagggc tgagtgggaa cttggcaagc agaagtgggg 1980

agcactttaa tgcaacccag gtatgctcca tgcatatcca gctgggccag cctcgtgctg 2040

ggctctgccc tgggcagaca ggcagagggc cagagcagag gacacatggc cttgcgtgtg 2100

tgaaagctga gaaaatggga gctgtgcttc agctaccctc cagacaaggg caagagttag 2160

ccagatgctc caggcagtgg gaagccaatg gagggattaa gcggcggaag cttcttagaa 2220

gaggcagggg gcgaagtgca gtggctcatg cctgtaatct cagcaatttg ggaggccaag 2280

gaaggaggaa tgcttgagcc caagagtttt agaccagcct gggcaacaca gtaagaccct 2340

gtttctacaa aaaaatataa aaaatagcct gg 2372

<210> 11

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Glu Trp Asp Asn Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Pro Pro Thr

1 5 10 15

Thr Cys Val Tyr Arg Glu Asn Phe Lys Gln Leu Leu Leu Pro Pro Val

20 25 30

Tyr Ser Ala Val Leu Ala Ala Gly Leu Pro Leu Asn Ile Cys Val Ile

35 40 45

Thr Gln Ile Cys Thr Ser Arg Arg Ala Leu Thr Arg Thr Ala Val Tyr

50 55 60

Thr Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Tyr Ala Cys Ser Leu Pro

65 70 75 80

Leu Leu Ile Tyr Asn Tyr Ala Gln Gly Asp His Trp Pro Phe Gly Asp

85 90 95

Phe Ala Cys Arg Leu Val Arg Phe Leu Phe Tyr Ala Asn Leu His Gly

100 105 110

Ser Ile Leu Phe Leu Thr Cys Ile Ser Phe Gln Arg Tyr Leu Gly Ile

115 120 125

Cys His Pro Leu Ala Pro Trp His Lys Arg Gly Gly Arg Arg Ala Ala

130 135 140

Trp Leu Val Cys Val Ala Val Trp Leu Ala Val Thr Thr Gln Cys Leu

145 150 155 160

Pro Thr Ala Ile Phe Ala Ala Thr Gly Ile Gln Arg Asn Arg Thr Val

165 170 175

Cys Tyr Asp Leu Ser Pro Pro Ala Leu Ala Thr His Tyr Met Pro Tyr

180 185 190

Gly Met Ala Leu Thr Val Ile Gly Phe Leu Leu Pro Phe Ala Ala Leu

195 200 205

Leu Ala Cys Tyr Cys Leu Leu Ala Cys Arg Leu Cys Arg Gln Asp Gly

210 215 220

Pro Ala Glu Pro Val Ala Gln Glu Arg Arg Gly Lys Ala Ala Arg Met

225 230 235 240

Ala Val Val Val Ala Ala Ala Phe Ala Ile Ser Phe Leu Pro Phe His

245 250 255

Ile Thr Lys Thr Ala Tyr Leu Ala Val Arg Ser Thr Pro Gly Val Pro

260 265 270

Cys Thr Val Leu Glu Ala Phe Ala Ala Ala Tyr Lys Gly Thr Arg Pro

275 280 285

Phe Ala Ser Ala Asn Ser Val Leu Asp Pro Ile Leu Phe Tyr Phe Thr

290 295 300

Gln Lys Lys Phe Arg Arg Arg Pro His Glu Leu Leu Gln Lys Leu Thr

305 310 315 320

Ala Lys Trp Gln Arg Gln Gly

325

<210> 12

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

gcuaaagaca gcggaaaua 19

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

cgggaaccca cgaccauua 19

<210> 14

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

gaggugcgcu ugucuguac 19

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

cgaggaaagu cugucauuc 19

<210> 16

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

ccacaggcau ccagcguaa 19

<210> 17

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

gugucuaccg cgagaacuu 19

<210> 18

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

gcacuguauu ggaggccuu 19

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

caacuaugcc caaggugau 19

Claims

1.防御素HNP基因在作为筛选药物的靶标中的应用，其特征在于，所述药物为预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应及引起器官损伤的药物；所述防御素HNP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3任一所示，防御素HNP的氨基酸序列如SEQ ID NO：4～7任一所示。

2.防御素HNP基因在作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物和/或生物学制剂中的应用。

3.防御素HNP基因或防御素HNP的抑制剂在制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

4.防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因在作为筛选药物的靶标中的应用，其特征在于，所述药物为预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物。

5.防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤药物和/或生物学制剂中的应用。

6.防御素HNP的直接或间接受体蛋白或防御素HNP的直接或间接受体蛋白基因的抑制剂在制备预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的药物中的应用。

7.根据权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述直接受体蛋白为BCAM蛋白，编码BCAM蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述BCAM的氨基酸序列如SEQ ID NO：9:所示。

8.根据权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述间接受体蛋白为P2Y₆蛋白，编码P2Y₆蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述P2Y₆的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

9.根据权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于，所述器官损伤为肺及心血管。

10.一种预防、缓解或/和治疗由防御素HNP升高造成的炎症反应和器官损伤的制剂，其特征在于，含有防御素HNP、防御素HNP直接受体蛋白或防御素HNP间接受体蛋白的抑制剂的一种或几种。