KR20010074925A

KR20010074925A - 인터류킨-18 결합 단백질

Info

Publication number: KR20010074925A
Application number: KR1020017002753A
Authority: KR
Inventors: 도리고에가쿠지; 다니아이마도카; 구리모토마사시
Original assignee: 도시오 미야께; 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1998-09-01
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 2001-08-09
Also published as: US20050191303A1; CA2340579A1; EP1110969A4; WO2000012555A1; BR9816013A; KR100537558B1; EP1110969A1

Abstract

본 발명은 IL-18에 결합함으로써 그 생리작용을 억제하는 물질과 그용도, 더욱이는 그 물질을 코우드하는 DNA의 제공을 과제로 하며, 특정의 아미노산 서열을 함유하는 IL-18 결합 단백질과, 그 단백질을 코우드하는 DNA와, 유효성분으로서 IL-18 결합 단백질을 함유하는 IL-18 억제제 및 항감수성 질환제를 제공함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다.

Description

인터류킨-18 결합 단백질{INTERLEUKIN 18-BINDING PROTEIN}

인터류킨-18 (이하, 간단히 "IL-18"라 함)은 면역계에 있어서의 정보전달물질인 사이토카인의 1종이다. 일본국의 특개평8-27189호 공보, 특개평8-193098호 공보 및 하루키ㆍ오카무라 등의 "네이쳐", 제378권, 제6,552호, 88 내지 91 페이지 (1995년)에 기재된 바와 같이 IL-18은 발견 당초, "인터페론-γ 유도인자 (IGIF)"로 호칭되고 있었으나, 그 후, 심페이 ㆍ우시오 등의 "더 저어널 오브 이뮤놀로지", 제156권, 4,274 내지 4,279 페이지 (1996년)에 있어서의 제안에 따라 "IL-18 (인터류킨-18)"로 호칭되게 되었다. 앙가스 더블유 톰손 편 "더 사이토카인 핸드북" 제3판, 아카데믹 프레스 발행, 465 내지 489 페이지에 기재되어 있는 바와 같이, 성숙형의 IL-18은 157개의 아미노산으로 되어 있고, 면역담당 세포에 있어서 생리활성 물질로서 유용한 인터페론-γ(이하, 간단히 "IFN-γ"라 함)의 산생을 유도하는 성질과, 킬러세포의 세포장해성을 증강한다거나 킬러세포 그 자체의 생성을 유도하는 성질을 겸비하고 있다. 이들 성질로 인하여 IL-18은 항바이러스제, 항균제, 항종양제, 항면역 질환제 등의 의약품으로서 광범한 용도가 기대되어 현재 그실용화를 목표로 하여 예의 연구가 진행되고 있다.

위에서 설명한 바와 같이 IL-18에 한정하지 않고 사이토카인은 본래 면역계에서의 정보전달을 담당하는 물질로서 산생되어 분비된다. 따라서 IL-18이 포유류의 체내에서 과잉으로 산생된다거나 외부로부터 과잉으로 투여된다거나 하면 면역계의 발란스에 치우침이 생겨 생체에서 유해한 면역반응을 야기할 가능성이 있다. 예컨대, 일본국 특개평10-96730호 공보 등에 나온 바와 같이 최근의 발견은 만성관절 류머티즘을 포함한 자기면역 질환의 환자가 IL-18의 체액 레벨에 있어서 건강한 사람 보다 유의하게 높은 것을 나타내고 있다. 이것은 IL-18이 어떤 종류의 질환의 발증에 직접 또는 간접으로 관여하고 있다는 것을 말하는 것이다. 따라서 이 분야에서는 IL-18 그 자체의 생리작용의 해명이나 실용화 외에 IL-18의 생리작용을 억제하는 물질이 한시라도 빨리 해명되어 실용화되는 것을 기대하고 있다.

본 발명은 신규한 사이토카인 결합 단백질, 특히 인터류킨-18 결합 단백질에 관한 것이다.

도 1은 인간 유래의 IL-18 결합 단백질의 펩티드 맵이다.

도 2는 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질의 펩티드 맵이다.

도 3은 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 염기서열을 가진 재조합 DNA의 구조를 나타낸 제한효소 지도이다.

도 4는 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 염기서열을 가진 재조합 DNA의 구조를 나타낸 제한효소 지도이다.

그리고 도면에서 아래의 부호는 각각 아래의 것을 나타낸다.

EFH18BPH6 cDNA: 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 염기서열을 가진 cDNA

EFM18BPH-MK2 cDNA: 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 염기서열을 가진 cDNA

EF1αP: 연장인자 1 프로모우터

Amp: 앰피실린 내성 유전자

ori: 복제 기점

이러한 상황을 감안하여 본 발명의 제1과제는 IL-18의 생리작용을 억제하는 성질을 가지며 의약품으로서 인간을 포함한 포유류에 적용가능한 물질을 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 제2과제는 이러한 물질을 코우드하는 DNA를 제공함에 있다.

더욱이 본 발명의 제3과제는 이러한 물질의 IL-18 억제제로서의 용도를 제공함에 있다.

또한 본 발명의 제4과제는 이러한 물질의 의약품으로서의 용도를 제공함에 있다.

본 발명자가 이들 과제를 해결하고자 예의연구한 결과, IL-18에 결합함으로써 생리작용을 억제하는 물질이 포유류의 체액중에 존재하는 것을 뜻밖에 발견하였다. 본 발명자가 이 물질을 분리하여 성질과 성상을 조사한 결과, 그 본질은 단백질이며, 단리된 상태에서도 IL-18에 결합하여 그 생리작용을 현저하게 억제하는 것을 발견하였다. 더욱이 이렇게하여 존재가 확인된 IL-18 결합 단백질은 인간을 비롯한 포유류에 투여하면 자기면역 질환, 염증성 질환 및 알레르기 질환을 포함한, 과잉의 면역반응에서 기인하는 여러 종류의 질환의 치료ㆍ예방에 효과를 발휘하는 것도 발견하였다.

즉, 본 발명은 상기한 제1과제를 서열표에서의 서열번호 1 및 2에 나온 어느 한가지의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 IL-18 결합 단백질을 제공함으로써 해결하는 것이다.

더욱이 본 발명은 상기 제2과제를 이러한 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA를 제공함으로써 해결하는 것이다.

그리고 본 발명은 상기 제3과제를 유효성분으로서 이러한 IL-18 결합 단백질을 함유하는 IL-18 억제제를 제공함으로써 해결하는 것이다.

더욱이 본 발명은 상기 제4과제를 유효성분으로서 이러한 IL-18 결합 단백질을 함유하는 항감수성 질환제를 제공함으로써 해결하는 것이다.

이하, 본 발명의 실시의 형태에 대해 설명하면, 본 발명의 단백질은 IL-18에 결합함으로써 그 생리작용을 억제하는 성질과, 독특한 아미노산 서열에 의해 특징이 부여된다. 즉, 본 발명의 IL-18 결합 단백질은, IL-18에 작용시키면 IL-18의 대표적인 생리작용인 면역담당 세포에 있어서 IFN-γ의 산생을 유도하는 작용을 억제한다. 그리고 이 IL-18 결합 단백질은 IL-18에 결합시키면 IL-18의 생리작용에 의한 킬러세포의 세포 장해성의 증강이나 킬러세포의 생성의 유도를 억제할 경우가 있다. 본 발명의 IL-18 결합 단백질은 서열표에서의 서열번호 1 및 2에 나온 어느하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 함유해서 되며, 예컨대 인간 유래의 IL-18 결합 단백질은 부분 아미노산 서열로서 서열표에서의 서열번호 3 내지 23에 나온 아미노산 서열의 전부 또는 일부를, 또한, 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질은 서열표에서의 서열번호 24 내지 31에 나온 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 각각 함유한다. 본 발명의 IL-18 결합 단백질은 오줌이나 혈액 등의 체액에 있어서는 통상, 가용성 당단백질로서 존재하며, 환원제 존재하의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (이하, 간단히 "SDS-PAGE"라 함)을 적용하면 분자량 약 40,000 내지 60,000 달톤에서 IL-18 결합능을 수반하는 단백질의 밴드를 나타낸다.

본 발명의 IL-18 결합 단백질은 이러한 특징을 지표로 하여 포유류의 체액이나 세포로부터 얻을 수가 있다. 개개의 체액으로서는 혈액, 임파액, 복강내액, 오줌 등을 들 수 있다. 그리고 세포로서는 상피세포, 내피세포, 간질세포, 연골세포, 단구(單球), 과립구, 임파구, 신경세포 및 이들을 배양주화하여 얻어지는 세포주를 들 수 있다. 경제성을 문제로 하는 것이면 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA에 재조합 DNA 기술을 적용하는 것이 유리하다. 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA는 서열번호 1 내지 31에 나온 아미노산 서열에 근거하여 포유류의 유전자를 검색함으로써 얻을 수가 있다. 예컨대 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 인간 유래의 DNA는 통상, 서열표에서의 서열번호 32에 나온 염기서열의 전부 또는 일부를, 그리고 마우스 유래의 DNA는 통상, 서열표에서의 서열번호 33에 나온 염기서열의 전부 또는 일부를 각각 함유한다. 이러한 DNA에 의해 형질전환한 동물 및 미생물 유래의 숙주는, 통상적인 방법에 따라 배양함으로써 본발명의 IL-18 결합 단백질을 고수득량으로 산생한다. 동물 유래의 숙주의 구체예로서는, 예컨대 3T3 세포 (ATCC CCL-92), C127I 세포 (ATCC CRL-1616), CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61), CV-1 세포(ATCC CCL-70), COS-1 세포 (ATCC CRL-1650), HeLa 세포 (ATCC CCL-2), MOP 8 세포 (ATCC CRL-1709) 및 이들의 변이주를 비롯한 인간, 원숭이, 마우스 및 햄스터 유래의 상피계 세포, 간질 세포 및 조혈계 세포를 들 수 있다. 미생물 유래의 숙주의 구체예로서는, 예컨대 세균, 진균 및 효모를 들 수 있다. 이들 숙주중에서 동물 유래의 숙주나 효모는 당단백질로서의 형태의 이 IL-18 결합 단백질에 특히 유용하다.

상기한 바와 같은 공급원을 사용하여 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 제조할 때에는 체액 또는 세포 혹은 미생물의 배양물을, 필요에 따라 초음파 등으로 파쇄한 후, 생리활성 단백질을 정제하기 위한 관용의 방법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 단독 또는 조합하여 적용하면 좋다.

그런데 면역계는 본래 유해한 이물로부터 생체를 방어하기 위한 것이지만, 때로는 그 작용으로 인해 생체에 유해한 결과를 초래하는 경우가 있다. 포유류에, 예컨대 피부, 신장, 간장, 심장, 골수 등의 장기를 이식하면 동종 이계(異系) 항원에 대한 거절반응에 의해 T 세포가 활성화되어 임파구가 증가한다거나 염증이 생기는 경우가 있다. 염증의 정도는 다르겠지만 마찬가지의 현상은, 예컨대 알레르겐과같이 숙주가 고유의 것으로 간주되지 않는 동종 이계 항원이 침입했을 경우에도 관찰된다. 그리고 자기 면역질환에서는 본래 고유의 것으로 간주되는 성분이 알레르기 반응을 야기한다.

본 발명의 IL-18 결합 단백질은 면역계를 활성화하는 IL-18에 결합함으로써 그 생리작용을 억제하는 IL-18 억제제로서 기능을 하므로 인간을 비롯한 포유류에 투여하면 상기한 바와 같은 면역반응을 억제하는 것이 기대된다. 따라서 본 발명에서 말하는 감수성 질환이라 함은 거절반응 및 알레르기 반응을 면역반응 일반의 항진에서 기인하는 면역질환을 포함하며, 본 발명의 IL-18 결합 단백질이 직접 또는 간접으로 작용하여 치료 및/또는 예방할 수 있는 모든 질환이라는 것이 된다. 개개의 감수성 질환으로서는, 예컨대 상기한 바와 같은 장기이식에 따른 거절반응 외에 활동성 만성간염, 위축성 위염, 자기 면역성 용혈성 빈혈, 바세도우병, 베체트 증후군, CRST 증후군, 한랭 응집소성 용혈성 빈혈, 궤양성 대장염, 굿패스튜어 증후군, 갑상선 기능 항진증, 만성 갑상선염, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 청년성 당뇨병, 백혈구 감소증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 발작성 한랭 혈색소 뇨증,악성 빈혈, 다발성 결절성 동맥염, 다발성 근염, 원발성 담즙성 간경변, 류머티즘열, 만성 관절 류머티즘, 하시모토병, 쉐그렌 증후군, 클론병, 교환성 안염, 진행성 전신성 경화증, 웨지나 육아종증, HIV 감염증, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 화분증 및 벌독 알레르기를 비롯한 자기면역 질환, 염증성 질환 및 알레르기성 질환 일반을 들 수 있다.

그리고 본 발명의 IL-18 결합 단백질은 IFN-γ의 과잉산생이나 과잉투여 등에서 기인하는 패혈증 소크의 치료, 예방에도 유효하다. 또한, 생체내에서 IL-18이 Fas 리간드의 산생을 증강한다거나, 역으로 Fas 리간드가 IL-18의 세포로부터의 분비를 유도하는 경우가 있으므로, 본 발명의 IL-18 결합 단백질은 Fas 및 Fas 리간드가 관여하는 면역질환 일반의 치료, 예방에도 유효하다. 더욱이 본 발명의 IL-18 결합 단백질은, 예컨대 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 극증 간염, 바이러스성 간경변, 알코올성 간경변, 중독성 간경변, 담즙성 간경변, 지방간, 간장 종양 및 간혈관 장해 등의 간질환, 담관염, 담낭염, 원발성 경화성 담관염, 담낭 종양 및 담관 종양 등의 담낭, 담도질환, 금석 췌염, 만성 췌염, 췌기능 부전, 췌장 종양 및 췌낭포 등의 췌질환의 치료, 예방, 더욱이는 이들 질환에 따른, 예컨대 식욕부진, 권태감, 피로감, 복통, 배통(背痛), 황달, 발열, 간성 뇌염, 복수, 출혈경향 등의 간기능 장해 및 간기능 부전을 완화 또는 해소하는 효과도 있다. 그 경우, 예컨대 프로토포르피린, 티오푸린, 마로티레이트, 간장 가수분해물, 글리시리진, 디클로로아세트산 디이소프로필아민, 메틸메티오닌술포늄 클로라이드, 글루타티온, 타우린, 시아니다놀, 인터페론, 비타민 B₁, 비타민 B₂, 비타민 B₆, 비타민 B₁₂, 티옥트산, 소자호탕, 대자호탕, 자호계지탕, 아스파라긴산, 감초, 메티오닌, 티오푸린, 글리시리진 등의 간세포의 기능을 촉진하는 약제를 병용해도 좋다. 더욱이 본 발명의 IL-18 결합 단백질은 허혈, 허혈성 심근증, 뇌허혈, 뇌저동맥 편두통, 뇌저부 이상 혈관망증, 뇌졸중, 뇌저부 동맥류, 동맥경, 혈관내피 장해, 당뇨병, 장관막 혈관 폐색증 및 상장관막 동맥 증후군을 포함한 순환기계 질환, 파킨슨병, 척수근육 위축증, 근위축성 측색 경화증, 알쯔하이머병, 치매증, 뇌혈관성 치매증, 에이즈 치매증 및 뇌척수염을 비롯한 신경계 질환의 증상을 완화하거나 예방하는 효과도 있다. 이렇게 하여 유효성분으로서 IL-18 결합 단백질을 함유하는 본 발명의 항감수성 질환제는 인간을 비롯한 포유동물에서의 상기한 경우의 감수성 질환을 예방, 치료하기 위한 항(抗)자기면역 질환제, 항염증제, 항알레르기제, 항종양제, 면역 억제제, 증혈제, 백혈구 증다제, 혈소판 증다제, 진통제, 해열제, 간기능 개선제 등으로서 다종다양한 용도를 가지게 된다. 제형 및 감수성 질환의 종류 및 증상에도 다르지만, 본 발명의 감수성 질환제는, 통상, 액상, 현탁상, 페이스트상, 또는 고상으로 제조되며, 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 0.00001 내지 100% (w/w), 바람직하게는 0.0001 내지 20% (w/w) 함유해서 된다.

본 발명의 항감수성 질환제는 IL-18 결합 단백질 단독의 형태는 물론이고 IL-18 결합 단백질과 그 외의 생리적으로 허용되는, 예컨대 보조제, 증량제, 희석제, 부형제, 안정제, 방부제, 면역 조성제, 착색제, 착향제, 더욱이는 필요에 따라 기타의 생리활성 물질의 1종 또는 복수와의 조성물로서의 형태도 포함한다. 안정제로서는, 예컨대 혈청 알부민이나 젤라틴 등의 단백질, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 말토오스, 트레할로오스, 소르비톨, 말티톨, 만니톨, 락티톨 등의 당질 및 시트르산염, 인산염 혹은 탄산염을 주체로 하는 완충제가, 그리고 병용할 수 있는 기타의 생리활성 물질로서는, 예컨대 아스피린, 플루페남산, 메페남산, 디클로페낙, 인도메타신, 토르메틴, 이브프로펜, 케토프로펜, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 소염효소제, 금제제, 클로로킨 제제 등의 항염증제, FK 506, 시클로포스파미드, 아지티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로스포리 A, 부신피질 호르몬 등의 면역 억제제, 더욱이는 IL-18 및 IL-18 이외의 사이토카인의 수용체 앤태고니스트, 예컨대 인터류킨-1 수용체 단백질, 인터류킨-2 수용체 단백질, 인터류킨-5 수용체 단백질, 인터류킨-6 수용체 단백질, 인터류킨-8 수용체 단백질, 인터류킨-12 수용체 단백질 및 인터류킨-18 수용체 단백질에 대한 인간화 항체를 포함한 각각의 항체와, TNF-α 수용체, TNF-β 수용체, 인터류킨-1 수용체, 인터류킨-5 수용체, 인터류킨-8 수용체 및 인터류킨-18 수용체에 대한 각각의 앤태고니스트, 더욱이는 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-5, 인터류킨-8, 인터류킨-6, 인터류킨-8, 인터류킨-12 및 인터류킨-18에 대한 인간화 항체를 포함한 각각의 항체를 들 수 있다.

더욱이 본 발명의 항감수성 질환제는 투약단위 형태의 약제도 포함하며, 그 단위투약 형태의 약제라 함은 IL-18 결합 단백질을,예컨대 1회당의 용량 또는 그 정배수 (4배까지) 혹은 그 약수 (1/40까지)에 상당하는 량을 함유해서 되며, 투약에 적합한 물리적으로 일체의 제형인 약제를 의미한다. 이와 같은 투약단위 형태의 약제로서는 엑스제, 엘릭시르제, 캡슐제, 과립제, 환제, 안연고제, 현탁제, 유제, 경고제, 좌제, 산제, 주정제, 정제, 시럽제, 침제, 전제(煎劑), 주사제, 수액제, 팅크제, 점안제, 트로키제, 연고제, 파프제, 방향수제, 리니멘트제, 리모나데제, 유동 엑스제 및 로우션제를 들 수 있고, 필요에 따라 점비제(点鼻劑), 비(鼻)분무제, 하기도 흡입제, 안과용 제거제, 구강점막 첩부제 및 완장제(浣腸劑)로 해도 좋다. 본 발명의 항감수성 질환제는 경구적으로 투여해도 좋고 비경구적으로 투여해도 좋으며, 어느 경우에도 감수성 질환의 치료,예방에 효과를 발휘한다. 감수성 질환의 종류나 증상에도 따르지만, 구체적으로는 환자의 증상이나 투여후의 경과를 관찰하면서 성인당 약 1 ㎍/회 내지 1 g/회, 통상, 약 10 ㎍/회 내지 100 mg/회의 IL-18 결합 단백질을 1회 내지 4회/일 또는 1회 내지 5회/주의 용량으로 1일 내지 반년에 걸쳐 경구투여하거나, 혹은 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내에 비경구 투여하면 좋다.

그런데 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA는 소위 "유전자 요법"에도 유용하다. 즉, 통상의 유전자 요법에서는 본 발명의 DNA를, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스 등의 바이러스 유래의 벡터에 삽입하거나, 카티오닉 폴리머나 막융합형 리포좀 등의 리포좀에 포매(包埋)하고, 이 상태에서 IL-18 결합 단백질에 감수성을 가진 질환에 이환된 환자에게 직접 주입하거나, 혹은 환자로부터 임파구를 채취하여 생체외에서 도입한 후, 환자에게 자가 이식하는 것이다. 이렇게 하여 본 발명의 DNA는, 예컨대 자기면역 질환이나 알레르기 질환 등의 면역질환과, 간기능 장해 및 신경계 질환을 포함한 각종 질환의 유전자 요법, 더욱이는 장기이식에 따른 거절반응이나 과잉의 면역반응의 억제에 현저한 효과를 발휘하게 된다. 그리고 이들 유전자 요법을 실시하기 위한 일반적 순서는, 예컨대 島田隆, 齊藤泉, 小澤敏也 편집, "실험의학 별책 바이오메뉴얼 UP 시리즈 유전자 치료의 기초기술", 1966년, 일본국의 羊土사 발행에도 상세히 설명되어 있다.

이하, 실시예에 따라 본 발명의 실시의 형태를 설명하는데, 이 분야에서의 기술수준에서는 이러한 실시예는 다종다양하게 개변가능하다. 이러한 기술수준을고려하여 본 발명이 이들 실시예에만 한정되지 않는 것은 물론이다. 그리고 본 발명에 의한 단백질의 IL-18 결합능은 아래에서 설명되는 실시예에서는 다음의 결합 분석에 의해 결정되는 저해율을 지표로 하여 판정하였다.

즉, IL-18 수용체를 코우드하는 DNA를 차이니즈 햄스터 난소 유래의 CHO-K1 세포 (ATCC CRL-9618)에 도입함으로써 IL-18 수용체가 세포표면에서 과잉으로 발현한 효과세포를 조제한다. 별도로 0.1% (w/v) 아지화 나트륨, 0.1% (v/v) 소혈청 알부민 및 100 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산을 각각 함유한 RPMI-1640 배지 (pH 7.2)를 제조하고, 이것을 분석용 배지로 한다. 이어서 시험구로서 분석용 배지에 의해 적절히 희석한 피험시료를 50 ㎕ 취하고, 여기에 분석용 배지에 의해 적절히 희석한¹²⁵I 표지 IL-18을 50 ㎕ 가하고, 4℃에서 1 시간 진탕한 후 분석용 배지에 세포밀도 1 × 10⁷개/ml가 되도록 부유시킨 효과세포를 50 ㎕ 가하고, 4℃에서 다시 1 시간 진탕한다. 그 후, 1.5 ml 용량의 원심관에 디부틸프탈레이트/디옥틸프탈레이트 혼합액 (용적비 1:1)을 200 ㎕ 취하고, 그 상부에 효과세포의 부유액을 중층(重層)하고 4℃에서 5분간 원심분리하여 흡인에 의해 상청액을 제거한 후, 세포 잔류물을 원심관 마다 잘라 취하여 감마 카운터 (상품명 "ARC-300형", 아로카 주식회사 제조)에 의해 방사능 강도를 측정한다. 이와 병행하여¹²⁵I 표지 IL-18과 함께 미표지 IL-18을 5 ㎍ 가하는 계 (비특이적 결합구)와, 피험시료만 생략하는 계 (총 결합구)를 각각 만들어 이들을 시험구와 마찬가지로 처치한다. 그리고 시험구, 총 결합구 및 비특이적 흡착구에서 얻어진 방사능 강도를 아래의 식에 각각 대입하여 저해율 (%)을 계산하였다.

총 결합구 - 시험구

저해율 (%) = _________________________________ × 100

총 결합구 - 비특이적 결합구

실시예 1: 인간 유래의 IL-18 결합 단백질

실시예 1-1: IL-18 결합 단백질의 제조

사람의 오줌 3 리터를 막(膜) 농축한 후, 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 대해 4℃에서 20 시간 투석하였다. 투석내액을 채취하고, 이것을 미리 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 의해 평형화해 둔 어피니티 크로마토그래피용 겔 (상품명 "휘이트 잼 렉틴 세파로오스 6MB", 애머샴 파마시아 바이오테크 주식회사 판매) 230 ml의 칼럼에 부하하여 IL-18 결합 단백질을 흡착시키고, 칼럼을 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 의해 세정한 후, 0.5 M N-아세틸-D-글루코사민을 함유하는 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)을 통액하면서 칼럼으로부터의 용출액을 일정량씩 채취하였다.

각 용출획분의 IL-18 결합능을 상기한 결합 분석에 의해 조사한 후, IL-18 결합능이 확인된 획분을 한데 합쳐 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 대해 4℃에서 16 시간 투석하였다. 투석내액을 채취하여 적절히 농축한 후, 미리 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 의해 평형화해 둔 이온교환 크로마토그래피용 겔 (상품명 "TSK-gel DEAE-5PW", 일본국의 Tosoh 주식회사 제조) 54 ml의 칼럼에 부하하고, 염화 나트륨의 농도가 100분간에 0 M로부터 0.5 M 까지 직선적으로 상승하는 염화 나트륨의 농도 기울기하에서 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)을 2 ml/분의 유속을 통액하여 염화나트륨 농도가 0.2 M 부근에서 용출한 획분을 채취하였다.

이 획분을 막(膜) 농축한 후, 미리 20 mM 인산-식염 완충액 (이하, 간단히 "PBS"라 함)으로 평형화해 둔 겔 여과 크로마토그래피용 겔 (상품명 "HiLoad Superdex 200", 애머샴 파마시아 바이오테크 주식회사 판매) 120 ml의 칼럼에 부하하고, 칼럼에 PBS를 통액하면서 겔 여과 크로마토그래피에서의 분자량이 70,000 달톤 부근인 획분을 채취하였다. 새로 얻은 획분을 미리 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 수용액으로 평형화해 둔 역상 크로마토그래피용 겔 (상품명 "Vydac 214TP54", 사이프레스 인터내소날 주식회사 판매) 4 ml에 부하하고, 아세토니트릴 농도가 0% (v/v)로부터 90% (v/v) 까지 직선적으로 상승하는 아세토니트릴의 농도 기울기하에서 칼럼에 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 수용액을 통액하면서 칼럼으로부터의 용출액을 일정량씩 분획하였다. 각 용출획분의 IL-18 결합능을 상기한 결합 분석에 의해 조사한 후, IL-18 결합능이 확인된, 아세토니트릴 농도가 70% (v/v) 부근에서 용출한 획분을 채취하고 농축한 결과, 인간 유래의 정제 IL-18 결합 단백질이 약 3 ㎍ 얻어졌다.

그 후, 이 정제 IL-18 결합 단백질에 대해 디티오트레이톨 존재하에서의 SDS-PAGE에 의해 분자량을 측정한 결과, 약 40,000 달톤 내지 60,000 달톤에서 IL-18 결합능을 가진 단백질의 단일 밴드가 관찰되었다. 그리고 보리 배아 렉틴을 리간드로 하는 "휘이트 잼 렉틴 세파로오스 6MB"에 흡착하는 것은 본 실시예의 IL-18 결합 단백질이 당단백질인 것을 나타내고 있다.

실시예 1-2: N 말단 아미노산 서열

실시예 1-1의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질을 원심농축기에서 건고(乾固)한 후, 8 M 우레아 및 10 mM EDTA를 각각 함유하는 0.1 M 트리스 인산 완충액 (pH 8.1)에 용해하고, 질소기류하에 50℃에서 30분간 처리하였다. 이어서 디티오트레이톨을 적당량 가하고 질소기류하에 50℃에서 2 시간 환원한 후, 반응물에 모노요오도아세트산을 적당량 가하고 실온하에서 어두운 곳에서 30분간 반응시켜 IL-18 결합 단백질을 알킬화하였다.

수득한 알킬화물에 디티오트레이톨 존재하의 SDS-PAGE를 적용함으로써 분자량 약 40,000 내지 60,000 달톤에 상당하는 단백질을 분리하고, 이후, 통상의 방법에 따라, 분리한 IL-18 결합 단백질의 밴드를 PVDF막에 전사후, 그 막을 프로테인 시퀸서 (상품명 "473A형", 어플라이드 바이오시스템스사 제조)를 사용하는 아미노산 분석에 사용하여 N 말단 아미노산 서열을 결정하였다 그 결과, 실시예 1-1의 방법으로 얻은 본 발명의 IL-18 결합 단백질은 N 말단 아미노산 서열로서 서열표에서의 서열번호 3에 나온 아미노산 서열을 함유하고 있음이 판명되었다 (그리고 "Xaa"는 미확인의 아미노산인 것을 의미하고 있다.).

실시예 1-3: 펩티드 맵핑

울프 헤르만 등의 "어낼리티칼 바이오케미스트리", 제224권, 451 내지 455 페이지 (1995년)에 기재된 "인 겔 다이제스쳔법"에 의해 실시예 1-2의 방법으로 환원 알킬화한 IL-18 결합 단백질의 트립신 소화후 및 트립신/펩신 소화후의 펩티드 맵을 각각 작성함과 아울러 트립신 소화에 의해 얻어진 펩티드 단편 1 내지 8 및 트립신/펩신 소화에 의해 얻어진 펩티드 단편 9 내지 20의 아미노산 서열을 각각결정하였다. 그 결과, 펩티드 단편 1 내지 20은 각각 서열표의 서열번호 4 내지 23에 나온 아미노산 서열을 가지고 있음을 판명하였다 (그리고 "Xaa"는 미확인의 아미노산인 것을 의미하고 있다.). 이 때 얻어진 펩티드 맵을 도 1에 나타낸다.

실시예 1-4: IL-18 억제작용

면역담당 세포 및 IL-18로서 각각 건강한 사람의 임파구 및 재조합형 인간 IL-18을, 그리고 IFN-γ의 표준품으로서 미합중국 국립 위생 연구소로부터 입수한 표준 인간 IFN-γ(GgO2-901-530)을 각각 사용한 이외는 아래의 실시예 3-3에서와 마찬가지로 시험하였다.

그 결과, 본 실시예의 IL-18 결합 단백질이 공존하면 인간 IL-18에 의한 IFN-γ 산생의 유도가 유의하게 억제되었다. 이것은 본 실시예의 IL-18 결합 단백질이 IL-18의 생리작용을 억제하는 것을 나타내고 있다.

실시예 2: 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA

실시예 2-1: 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA

실시예 2-1(a): 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

폴리 (A) 부가 인간 간장 RNA (클론텍크제) 10 ng에 10 × PCR 완충액 2 ㎕, 25 mM 염화 마그네슘 2 ㎕, 0.1 M 디티오트레이톨 2 ㎕, 25 mM dNTP 믹스 1 ㎕, 200 단위/㎕ 역전사 효소 (상품명 "슈퍼스크리트 II", 라이프테크 오리엔탈 주식회사 제조) 1 ㎕ 및 2.5 μM 랜덤 헥사머 1 ㎕을 각각 가하고, 멸균 증류수로써 전체량을 20 ㎕로 하였다. 이 혼합물을 0.5 ml 용량의 반응관에 넣고 42℃에서 50분간, 70℃에서 15분간, 이 순서로 각각 인큐베이트함으로써 역전사 효소반응 시켜 제1 스트랜드 cDNA를 함유한 반응물을 얻었다.

이 반응물에 체적비 2.5배량의 에탄올과 3 M 아세트산 나트륨 2 ㎕을 각각 가하고 -20℃에서 2 시간 정치하여 cDNA를 침전시켰다. 침전을 채취하여 75% (v/v) 수성 에탄올로 세정한 후, 멸균 증류수에 용해하여 2.5 단위/㎕ DNA 폴리메라아제 (상품명 "클론 Pfu 폴리메라아제", 스트라타진 제조) 0.5 ㎕, 전용 완충액 10 ㎕ 및 25 mM dNTP 믹스 1 ㎕을 각각 가하고, 다시 센스 프라이머로서 서열표에서의 서열번호 3에 나온 아미노산 서열에 근거하여 화학합성한 5'-ACNCCNGTNWSNCA-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드와, 안티센스 프라이머로서 서열표에서의 서열번호 8에 나온 아미노산 서열에 근거하여 화학합성한 5'-TGNGCNARNACNACRTG-3'으로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 각각 10 μM 가하고 멸균 증류수로써 전체를 100 ㎕로 하였다. 이 혼합물을 94℃, 40℃ 및 72℃에서 이 순서로 각각 1분간 인큐베이트하는 사이클을 40회 반복하여 PCR 반응시켰다.

이어서 PCR 산물의 일부를 취하고 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔에서 전기영동함으로써 DNA 단편을 분획하고, 나일론막에 전사하여 0.4 N 수산화 나트륨에 의해 고정하고, 2 × SSC에 의해 세정하여 풍건(風乾)한 후, 6 ×SSPE, 5 ×덴발트액, 0.5% (w/v) SDS 및 100 ㎍/ml 변성 연어정자 DNA를 각각 함유하는 프리하이브리다이제이션액에 침지하고 65℃에서 3 시간 인큐베이트하였다. 별도로 통상의 방법에 따라 서열표의 서열번호 3에 나온 아미노산 서열에 근거하여 5'-GGRCANGGRTCYTT-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 이것을 [γ-³²P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드키나아제에 의해 동위체 표지함으로써 프로우브를 조제하였다. 상기 나일론막을 침지한 프리하이브리다이제이션액에 이 프로우브를 1 pmol 가하고, 나일론막을 40℃에서 다시 20 시간 인큐베이트하여 하이브리다이즈시켰다. 그 후, 6×SSC에 의해 나일론막을 세정하고, 통상의 방법에 따라 오토라디오그래피하였다. 그 결과, 프로우브의 특이적인 하이브리다이제이션을 나타내는 시크날이 나타나서 상기 PCR 산물이 목적으로 하는 DNA 단편을 함유하고 있는 것이 확인되었다.

그 후, 나머지의 PCR 산물에 플라스미드 벡터 (상품명 "pCR-Script Cam SK (+)", 스트라타진사 제조)를 1 ng 가하고 DNA 라이게이션 키트 (상품명 "DNA 라이게이션 키트/버젼 2", 일본국의 寶酒造주식회사 제조)를 사용하여 플라스미드 벡터내에 PCR 산물인 DNA 단편을 삽입하였다. 반응물의 일부를 취하여 대장균주 (상품명 "XL1-Blue MRF' Kan", 스트라타진사 제조)를 형질전환한 후, 형질전환체를 클로람페니콜 30 ㎍/ml를 함유한 LB 배지 (pH 7.5)에 접종하여 37℃에서 18 시간 배양하고, 배양물로부터 균체를 채취하여 이것을 통상의 방법에 따라 처리하여 플라스미드 DNA를 채취하였다. 디데옥시법에 의해 조사한 결과, 이 플라스미드 DNA는 PCR 산물의 DNA 단편의 염기서열로서 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열을 함유하고 있었다. 이 염기서열이 코우드하는 서열표의 서열번호 34에 병기한 아미노산 서열과 서열표의 서열번호 3 내지 23에 나온, 실시예 1-2 내지 1-3에서 결정한 부분 아미노산 서열을 조합(照合)한 결과, 이들 부분 아미노산 서열은 어느것이라도 전부 또는 일부가 서열번호 34에 병기한 아미노산 서열에 함유되어 있었다. 이것은 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열이, 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 적어도 일부분을 코우드하는 것임을 시사하고 있다.

실시예 2-1(b): 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

폴리 (A) 부가 인간 간장 RNA (클론테크사제) 10 ng을 시판의 5' RACE 키트 (상품명 "5' RACE 시스템, 버젼 2.0", 기브코 비 알 엘제)를 사용하여 PCR의 한 변법인 5' RACE에 사용하였다. 즉, 먼저 상기 RNA를 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GGTCACTTCCAATGCTGGACA-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 역전사 효소 반응에 사용하고, 이어서 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트란스페라아제를 작용시켜, 생성한 제1 스트랜드 cDNA의 5' 말단에 C 테일을 부가하였다. 이 제1 스트랜드 cDNA를, 이어서 센스 프라이머로서 상기 키트에 첨부된 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGG∥GGG∥GGG∥G-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드와, 안티센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GTCCTTTGTGCTTCTAACTGA-3'을 사용하여 PCR 반응시켰다. 이상의 5' RACE에서 얻어진 반응산물을 일부 취하여 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔 전기영동 처리 한 결과, 특정의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 35에 나온 염기서열을 함유하고 있었다. 이 염기서열에서의 제160 내지 216번째의 염기로 된 서열은 실시예 2-1(a)에서 결정한, 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열에서의 제1 내지 57번째의 염기로 된 서열과 완전히 일치하였다. 이것은 서열표의 서열번호 35에 나온 염기서열이 서열번호 34에 나온 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 적어도 일부를 코우드하는 염기서열과 오버랩하고, 또한 그 5' 말단쪽 상류역에 상당하는 염기서열을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

실시예 2-1(c): 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

폴리 (A) 부가 인간 간장 RNA (클론테크사제) 10 ng을 齊藤隆 감역, "PCR 실험 매뉴얼", HBJ 출판 발행 (1991년), 25 내지 33에 기재된 방법에 따라 PCR의 한 변법인 3' RACE에 사용하였다. 즉, 먼저 상기 RNA를 5'-GACTCGAGTCGACATCGA(T)₁₇-3'로 나타내어지는 염기서열의 뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 역전사 효소 반응에 사용하고, 수득한 제1 스트랜드 cDNA를 실시예 2-1(a)에서 결정한, 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-TTCTCCTGTGTGCTCGTGGA-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 센스 프라이머로 하고, 5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 안티센스 프라이머로서 사용하여 PCR 반응시켰다. 이상의 3' RACE에서 얻어진 반응산물을 일부 취하여 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔 전기영동 처리 한 결과, 특정의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 36에 나온 염기서열을 함유하고 있었다. 이 염기서열에서의 제1 내지 60번째의 염기로 된 서열은 실시예 2-1(a)에서 결정한, 서열표의 서열번호 34에 나온 염기서열에서의 제352 내지 411번째의 염기로 된 서열과 완전히 일치하였다. 이것은 서열표의 서열번호 36에 나온 염기서열이 서열번호 34에 나온 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 적어도 일부를 코우드하는 염기서열과 오버랩하고, 또한 그 3' 말단쪽 하류역에 상당하는 염기서열을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

이상에서 나온 바와 같이 실시예 2-1(a) 내지 2-1(c)에서 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드하는, 서로 오버랩하는 염기서열로서 서열표의 서열번호 34 내지 36에 나온 염기서열을 결정하였다. 서로 오버랩하는 부분의 염기서열을 감안하면, 이들 염기서열은 서열표의 서열번호 37에 나온 일련의 염기서열에서 유래하는 부분서열이라고 생각되었다.

실시예 2-1(d): 인간 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

실시예 2-1(a)의 방법에 따라 폴리 (A) 부가 인간 간장 RNA를 역전사 효소 반응시킨 후, 센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 37에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-TGTGTGACTGGAGAAGAGGAC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를, 또한, 안티센스 프라이머로서, 서열번호 37에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-TACAGGCAGTCAGGGACTGTTCACTCCAG-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 각각 사용한 이외는 실시예 2-1(b)에서와 마찬가지로 하여 PCR 반응시켰다. 이 PCR 산물의 일부를 취하여 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔 전기영동 처리 한 결과, 특정의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 이어서 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 37에 나온 염기서열을 가지고 있었다. 이렇게 함으로써 실시예 2-1(a) 내지 2-1(c)에서 결정한, 서열표의 서열번호 34 내지 36에 나온 염기서열이 서열번호 37에 나온 일련의 염기서열의 각각 부분서열인 것이 지지되고 있다.

한편, 서열표의 서열번호 37에 나온 염기서열에 의해 코우드되는, 거기에 병기한 아미노산 서열과, 서열표의 서열번호 4 내지 23에 나온, 실시예 1-3에서 결정한 부분 아미노산 서열을 조합(照合)한 결과, 이들 부분 아미노산 서열은 모두 서열번호 37에 병기한 아미노산 서열에서의 제1 내지 164번째의 아미노산으로 된 부분에 함유되어 있었다. 그리고 서열표의 서열번호 3에 나온, 실시예 1-2에서 결정한 N 말단 아미노산 서열은 서열표의 서열번호 37에 병기한 아미노산 서열에서의 제1 내지 22번째의 아미노산으로 된 서열과 잘 일치하였다. 따라서 이상의 것은 서열표의 서열번호 37에 나온 염기서열에서의 제160 내지 651번째의 염기로 된 서열이 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드할 수 있는 것이고, 이 IL-18 결합 단백질이 전체로서는 이러한 염기서열에 병기한 제1 내지 164번째의 아미노산으로 된 서열을 가질 경우가 있다는 것을 시사하고 있다. 그리고 이상과 같이 시사된 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 아미노산 서열과 그것을 코우드하는 염기서열은 서열표의 서열번호 1 및 32에 각각 별도로 기재되어 있다.

실시예 2-2: 형질전환체에 의한 인간 유래의 IL-18 결합 단백질의 산생

실시예 2-2(a): 재조합 DNA의 조제

0.5 ml 반응관에, 실시예 2-1(d)의 방법으로 얻은 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드할 수 있는 DNA를 1 ng 취하고, 여기에 10 ㎕의 10×PCR 완충액, 1 ㎕의 25 mM dNTP 믹스 및 2.5 단위/㎕ DNA 폴리메라아제 (상품명 "클론드" Pfu 폴리메라아제", 스트라타진 제조)를 가하고, 센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 32에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-CTCGAGGCCACCATGACCATGAGACACAAC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를, 그리고 안티센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 32에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GCGGCCGCTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGACCCTGCTGCTGTGGACT-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 각각 적당량 가하고 멸균 증류수로써 전체량을 100 ㎕로 하였다. 이 혼합물을 94℃에서 1분간, 42℃에서 2분간 및 72℃에서 3분간 인큐베이트하는 사이클을 3회 반복한 후, 다시 94℃에서 1분간, 60℃에서 2분간 및 72℃에서 3분간 인큐베이트하는 사이클을 35회 반복하여 PCR 반응시켰다. 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 PCR 산물중에 목적으로 하는 DNA 단편이 존재하는 것을 확인 하는 한편, 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 이 DNA 단편을 삽입해서 된 플라스미드 벡터를 채취하였다. 이어서 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사하여 이 플라스미드 DNA가 서열표의 서열번호 32에 나온 염기서열을 함유함을 확인하였다.

통상의 방법에 따라 위에서 얻은 플라스미드 DNA에 제한효소 Xhol 및 Notl을 작용시켜 얻은 DNA 단편 100 ng에, 에스 미즈시마 등의 "뉴클레익 애시드 리서치", 제17호, 제18권, 5,332 페이지 (1990년)에 기재된 방법에 준하여 조제하고, 미리제한효소 Xhol 및 Notl로 절단해 둔 플라스미드 벡터 "pEF-BOS"를 10 ng 가하고, DNA 라이게이션 키트 (상품명 "DNA 라이게이션 키트/버젼 2", 일본국의 寶酒造주식회사 제조)를 사용하여 플라스미드 벡터내에 DNA 단편을 삽입하였다. 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 라이게이션 반응산물로써 대장균주를 형질전환하고, 수득한 형질전환체로부터 재조합 DNA를 채취하여 이 재조합 DNA를 "pEFH18BPH6"로 명명하였다. 통상의 방법에 따라 분석한 결과, 도 3에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pEFH18BPH6"에 있어서는 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드할 수 있는 서열표의 서열번호 32에 나온 염기서열을 함유하는 cDNA "EFH18BPH6 cDNA"가 연장인자 1 프로모우터 "EF1αP"의 하류에 연결되어 있었다.

실시예 2-2(b): 형질 전환체에 의한 인간 유래의 IL-18 결합 단백질의 산생

실시예 2-2(a)에서 얻은 재조합 DNA "pEFH18BPH6"를 함유한 형질전환 대장균주를, 100 ㎍/ml 앰피실린을 함유한 LB 배지 (pH 7.2)에 접종하고, 37℃에서 18 시간 통기교반 배양한 후, 배양물로부터 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 채취하여 재조합 DNA "pEFH18BPH6"를 얻었다. 이 재조합 DNA를 20 ㎍ 취하고, 미리 통상의 방법에 따라 증식시켜 둔 1×10⁷개의 아프리카 녹색 원숭이의 신장유래의 섬유 아세포주 COS-1 세포 (ATCC CRL-1650)에 일렉트로포레이션법에 의해 도입하여 본 발명의 DNA가 도입된 형질 전환체를 얻었다.

평평한 바닥의 배양병에 배지 (상품명 "ASF104", 일본국의 아지노 모토사제)를 취하고, 여기에 위에서 얻은 형질 전환체를 1×10⁵개/ml의 비율로 접종하여 5%CO₂인큐베이터중에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 배양물로부터 배양 상청액을 채취하고, 어피니티 크로마토그래피용 겔 (상품명 "Ni-NTA", 키아젠제)의 칼럼에 부하하였다. 이 칼럼에 20 mM 이미다졸을 함유한 PBS를 통액하여 비흡착 획분을 제거한 후, 250 mM 이미다졸을 함유한 PBS를 통액하여 칼럼으로부터의 용출액을 일정량씩 분획채취하였다. 각각의 획분에서의 IL-18 결합 단백질의 유무를 상기 결합 분석에 의해 조사하고, 이 단백질의 존재가 확인된 획분을 채취하여 한데 합쳐 1×10⁷개의 이 형질 전환체로부터 약 2 ml의 정제 IL-18 결합 단백질의 수용액을 얻었다. 이 수용액의 단백질 함량은 약 10 ㎍/ml이었다. 이 수용액을 실시예 1-2의 방법에 따라 처리하고 N 말단 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표의 서열번호 3과 동일한 아미노산 서열이 얻어졌다. 그리고 대조로서 재조합 DNA "pEFH18BPH6" 대신에 플라스미드 벡터 "pEF-BOS"를 사용하여 본 실시예와 마찬가지로 처치한 결과, IL-18 결합 단백질의 존재는 확인되지 않았다. 이상의 결과는 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질이 서열표의 서열번호 1에 나온 아미노산 서열을 가질 경우가 있으며, 이 단백질이 서열번호 32에 나온 염기서열에 의해 코우드될 수 있음을 지지하고 있다.

실시예 3: 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질

실시예 3-1: IL-18 결합 단백질의 조제

코리네박테리움 파르밤 (ATCC11827)을 60℃에서 1 시간 가열하여 얻은 사균체(死菌體)를 8주령의 암컷 CD-1 마우스 600 마리의 복강내에 1 mg/마리의 비율로주사투여하고, 통상의 방법으로 7일간 사육한 후, 정맥내에 대장균 유래의 정제 리포다당을 1 ㎍/마리의 비율로 주사투여하였다. 2 시간후 마우스의 심장으로부터 혈액을 채취하고, 이것을 통상의 방법에 따라 처리하여 혈청 200 ml을 얻었다. 그 후, 이 혈청을 실시예 1-1의 방법으로 정제한 결과, 마우스 유래의 정제 IL-18 결합 단백질이 약 3 ㎍ 얻어졌다.

그 후, 이 정제 IL-18 결합 단백질에 대해 디티오트레이톨 존재하의 SDS-PAGE로 분자량을 측정한 결과, 약 40,000 내지 60,000 달톤에서 IL-18 결합능을 가진 단백질의 단일 밴드가 관찰되었다. 그리고 보리 배아 렉틴을 리간드로 하는 "휘이트 잼 렉틴 세파로오스 6MB"에 흡착하는 것은 본 실시예의 IL-18 결합 단백질이 당단백질인 것을 나타내고 있다.

실시예 3-2: 펩티드 맵핑

실시예 3-1의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질에 대해 실시예 1-3에서와 마찬가지로 하여 펩티드 맵핑을 작성함과 아울러 트립신 소화에 의해 얻어진 펩티드 단편 1 내지 5 및 트립신/펩신 소화에 의해 얻어진 펩티드 단편 6 내지 8의 아미노산 배열을 조사한 결과, 펩티드 단편 1 내지 8은 각각 서열표의 서열번호 24 내지 31에 나온 아미노산 서열을 가지고 있었다 (그리고 "Xaa"는 미확인의 아미노산인 것을 의미하고 있다.). 이 때 얻어진 펩티드 맵을 도 2에 나타낸다.

실시예 3-3: IL-18 억제작용

14주령의 암컷 C3H/HeJ 마우스로부터 비장을 적출하고, 분산하여 부착세포를 제거한 후, 비(脾)세포를 10% (v/v) 소태아 혈청을 보충한 RPMI-1640 배지 (pH7.4)에 세포밀도 1×10⁷개/ml가 되도록 부유시켜 면역담당 세포로 하였다. 이어서 비세포 및 2.5 ㎍/ml 콘카나발린 A를 마이크로플레이트에 각각 0.15 ml/웰 및 0.05 ml씩 나누어 넣고, 재조합형 마우스 IL-18을 25 ng/ml와, IL-18에 대해 과잉량의, 실시예 3-1의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질을 함유한 신선한 동일 배지를 0.05 ml/웰 가한 후, 5% CO₂인큐베이터 중에서 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양후, 각 웰로부터 배양 상청액을 0.1 ml씩 채취하여 산생한 IFN-γ를 통상적인 효소 면역법으로 측정하였다. 이와 병행하여 IL-18 결합 단백질 및 마우스 IL-18의 어느 하나를 생략한 계를 각각 만들고, 이것을 상기와 마찬가지로 처치하여 대조로 하였다. 그리고 IFN-γ의 표준품으로는 미합중국 국립위생 연구소로부터 입수한 표준 마우스 IFN-γ (Gg02-901-533)를 사용하여 국제단위 (IU)로 환산하여 표시하였다.

그 결과, IL-18 결합 단백질을 생략한 대조에 있어서의 IFN-γ의 산생량이 약 600 IU/ml이고, 또한 마우스 IL-18을 생략한 대조에 있어서의 IFN-γ의 산생량이 약 0 IU/ml이었음에 대하여, IL-18 결합 단백질을 가한 계에서는 겨우 60 IU/ml 전후이었다. 이것은 본 실시예의 IL-18 결합 단백질이 IL-18의 생리작용을 억제하는 것을 나타내고 있다.

실시예 4: 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA

실시예 4-1: 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA

실시예 4-1(a): 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

코리네박테리움 파르밤 (ATCC11827)을 60℃에서 1 시간 가열하여 얻은 사균체(死菌體)를 8주령의 암컷 CD-1 마우스의 복강내에 1 mg/마리의 비율로 주사투여하였다. 7일간 사육한 후, 정맥내에 대장균 유래의 정제 리포다당을 1 ㎍/마리의 비율로 주사투여하고, 2 시간후 경추를 탈구시켜 도살하여 간장을 적출하였다. 적출한 간장을 습중량으로 3 g 취하고, 이것을 6 M 구아니딘 이소티오시아나토, 10 mM 시트르산 나트륨 및 0.5% (w/v) SDS로 된 혼합액 (pH 7.0) 20 ml에 침지하고, 호모게나이저에 의해 파쇄하였다. 이어서 35 ml 용량의 원심관에 5.7 M 염화 세슘을 함유하는 0.1 M EDTA (pH 7.5)를 25 ml씩 주입하고, 그 상부에 세포 파쇄물을 10 ml씩 중층하여 이 상태에서 20℃, 25,000 rpm에서 20 시간 초원심 분리하였다. 그 후, RNA 획분을 채취하고, 이것을 15 ml 용량의 원심관에 취하여 등량의 클로로포름/이소부탄올 혼합액 (체적비 4:1)을 가하고 5분간 진탕한 후, 4℃, 10,000 rpm에서 다시 10분간 원심분리한 다음에, 물층을 채취하였다. 채취한 물층에 2.5배 용량의 에탄올을 가하고 -20℃에서 2 시간 정치함으로써 전(全) RNA를 침전시킨 후, 이 침전을 채취하고 75% (v/v) 수성 에탄올로 세정하여 멸균 증류수 0.5 ml에 용해하였다.

이 후, 이 전(全) RNA를 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 역전사 효소반응시키고, 수득한 제1 스트랜드 cDNA를 함유한 반응물을, 센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 27에 나온 아미노산 서열에 근거하여 화학합성한 5'-GCNGTNCCNACNAA-3'으로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를, 그리고 안티센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 30에 나온 아미노산 서열에 근거하여 화학합성한 5'-GTYTTNARNCCRTC-3'으로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 각각 사용한 이외는 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 PCR 반응시켰다. 그 후, 프로우브의 조제시에 서열표의 서열번호 24에 나온 아미노산 서열에 근거하여 화학합성한 5'-SWNGTRTGNCCYTCYTT-3'으로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 사용한 이외는 실시예 2에서와 마찬가지로 하여 PCR 산물중에서 목적으로 하는 DNA 단편이 존재함을 확인하는 한편, 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 이 DNA 단편의 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열을 가지고 있었다. 서열표의 서열번호 38에 병기한 아미노산 서열과 서열표의 서열번호 24 내지 31에 나온, 실시예 3-2에서 결정한 부분 아미노산 서열을 조합(照合)한 결과, 이들 부분 아미노산 서열은 어느것이라도 그 전부 또는 일부가 서열번호 38에 병기한 아미노산 서열에 함유되어 있었다. 이것은 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열이 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질의 적어도 일부를 코우드하는 것임을 시사하고 있다.

실시예 4-1(b): 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

실시예 4-1(a)의 방법에 따라 코리네박테리움 파르밤의 사균체(死菌體)와 리포다당으로 처리한 암컷 CD-1 마우스로부터 채취한 전(全) RNA 1 ㎍을, 5' RACE 키트 (상품명 "5' RACE 시스템, 버젼 2.0", 기브코 비 알 엘제)를 사용하여, PCR의 한가지 변법인 5' RACE에 사용하였다. 즉, 먼저 상기 전(全) RNA를 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-TGCAGGCAGTACAGGACAAGG-3'로나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 역전사 효소 반응에 사용하고, 이어서 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트란스페라아제를 작용시켜 생성한 제1 스트랜드 cDNA의 5' 말단에 C 테일을 부가하였다. 이 제1 스트랜드 cDNA를, 이어서 센스 프라이머로서 상기 키트에 첨부된 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGG∥GGG∥GGG∥G-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드와, 안티센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GTGCTGGGTACTGCTTAGTTG-3'을 사용하여 PCR 반응시켰다. 이상의 5' RACE에서 얻어진 반응산물을 일부 취하여 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔 전기영동 처리 한 결과, 특정의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 39에 나온 염기서열을 함유하고 있었다. 이 염기서열에서의 제307 내지 336번째의 염기로 된 서열은 실시예 4-1(a)에서 결정한, 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열에서의 제1 내지 30번째의 염기로 된 서열과 완전히 일치하였다. 이것은 서열표의 서열번호 39에 나온 염기서열이 서열번호 38에 나온 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 적어도 일부를 코우드하는 염기서열과 오버랩하고, 또한 그 5' 말단쪽 상류역에 상당하는 염기서열을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

실시예 4-1(c): 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

실시예 4-1(a)의 방법에 따라 코리네박테리움 파르밤의 사균체(死菌體)와 리포다당으로 처리한 암컷 CD-1 마우스로부터 채취한 전(全) RNA 1 ㎍을, 齊藤隆 감역, "PCR 실험 매뉴얼", HBJ 출판 발행 (1991년), 25 내지 33에 기재된 방법에 따라 PCR의 한 변법인 3' RACE에 사용하였다. 즉, 먼저 상기 RNA를 5'-GACTCGAGTCGACATCGA(T)₁₇-3'로 나타내어지는 염기서열의 뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 역전사 효소 반응에 사용하고, 수득한 제1 스트랜드 cDNA를 실시예 4-1(a)에서 결정한, 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GATCCTGGACAAGTGGCC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 센스 프라이머로 하고, 5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 안티센스 프라이머로서 사용하여 PCR 반응시켰다. 이상의 3' RACE에서 얻어진 반응산물을 일부 취하여 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔 전기영동 처리 한 결과, 특이적인 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 40에 나온 염기서열을 함유하고 있었다. 이 염기서열에서의 제1 내지 63번째의 염기로 된 서열은 실시예 4-1(a)에서 결정한, 서열표의 서열번호 38에 나온 염기서열에서의 제289 내지 351번째의 염기로 된 서열과 완전히 일치하였다. 이것은 서열표의 서열번호 40에 나온 염기서열이 서열번호 38에 나온 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 적어도 일부를 코우드하는 염기서열과 오버랩하고, 또한 그 3' 말단쪽 하류역에 상당하는 염기서열을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

이상에서 나온 바와 같이 실시예 4-1(a) 내지 4-1(c)에서 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드하는, 서로 오버랩하는 염기서열로서 서열표의 서열번호 38 내지 40에 나온 염기서열을 결정하였다. 서로 오버랩하는 부분의 염기서열을 감안하면, 이들 염기서열은 서열표의 서열번호 41에 나온 일련의 염기서열에서 유래하는 부분서열이라고 생각되었다.

실시예 4-1(d): 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA의 염기서열

실시예 4-1(a)의 방법에 따라 코리네박테리움 파르밤의 사균체(死菌體)와 리포다당으로 처리한 암컷 CD-1 마우스로부터 채취한 전(全) RNA를 역전사 효소 반응시킨 후, 센스 프라이머로서 서열표의 서열번호 41에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-CTGAGCCTTAGAGCTCCAAG-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를, 또한, 안티센스 프라이머로서, 서열번호 41에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GTGAAGCTTGAGTTTGAGGTTC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 각각 사용한 이외는 실시예 4-1(c)에서와 마찬가지로 하여 PCR 반응시켰다. 이 PCR 산물의 일부를 취하여 통상의 방법에 따라 1% (w/v) 아가로오스 겔 전기영동 처리 한 결과, 특이적인 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 이어서 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사한 결과, 이 DNA 단편은 서열표의 서열번호 41에 나온 염기서열을 가지고 있었다. 이렇게 함으로써 실시예 4-1(a) 내지 4-1(c)에서 결정한, 서열표의 서열번호 38 내지 40에 나온 염기서열이 서열번호 41에 나온 일련의 염기서열의 각각 부분서열인 것이 지지되고 있다.

한편, 서열표의 서열번호 41에 나온 염기서열에 의해 코우드되는, 거기에 병기한 아미노산 서열과, 서열표의 서열번호 24 내지 31에 나온, 실시예 3-2에서 결정한 부분 아미노산 서열을 조합(照合)한 결과, 이들 부분 아미노산 서열은 모두 서열번호 41에 병기한 아미노산 서열에서의 제1 내지 165번째의 아미노산으로 된 부분에 함유되어 있었다. 그리고 서열표의 서열번호 1에 나온, 인간 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 아미노산 서열은, 서열표의 서열번호 41에 병기한 아미노산 서열에서의 제1 내지 165번째의 아미노산으로 된 서열과 약 61%의 상동성을 나타내었다. 따라서 이상의 것은 서열표의 서열번호 41에 나온 염기서열에서의 제235 내지 729번째의 염기로 된 서열이 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드할 수 있는 것이고, 이 IL-18 결합 단백질이 전체로서는 이러한 염기서열에 병기한 제1 내지 165번째의 아미노산으로 된 서열을 가질 경우가 있다는 것을 시사하고 있다. 그리고 이상과 같이 시사된 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질의 아미노산 서열과 그것을 코우드하는 염기서열은 서열표의 서열번호 2 및 33에 각각 별도로 기재되어 있다.

실시예 4-2: 형질전환체에 의한 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질의 산생

실시예 4-2(a): 재조합 DNA의 조제

0.5 ml 반응관에, 실시예 4-1(d)의 방법으로 얻은 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드할 수 있는 DNA를 1 ng 취하고, 여기에 서열표의 서열번호 33에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-CTCGACGCCACCATGACCATGAGACACTGC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 센스 프라이머로서 사용하고, 그리고 서열표의 서열번호 33에 나온 염기서열에 근거하여 화학합성한 5'-GCGGCCGCTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCAACCCCTGGGCCTGC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 안티센스 프라이머로 사용한 이외는 실시예 2-2(a)에서와 마찬가지로 처치하여 PCR 반응시켰다. 실시예 4-1(a)에서와 마찬가지로 하여 PCR 산물중에 목적으로 하는 DNA 단편이 존재하는 것을 확인 하는 한편, 이 DNA 단편을 삽입해서 된 플라스미드 벡터를 채취하였다. 이어서 실시예 2-1(a)에서와 마찬가지로 하여 염기서열을 조사하여 이 플라스미드 DNA가 서열표의 서열번호 33에 나온 염기서열을 함유함을 확인하였다.

위에서 얻은 플라스미드 DNA를 실시예 2-2(a)에서와 마찬가지로 하여 플라스미드 벡터 "pEF-BOS"에 삽입하여 재조합 DNA로 하고, 수득한 재조합 DNA를 "pEFM18BPH-MK2"로 명명하였다. 통상의 방법에 따라 분석한 결과, 도 4에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pEFM18BPH-MK2"에 있어서는 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질을 코우드할 수 있는, 서열표의 서열번호 33에 나온 염기서열을 함유하는 cDNA "EFM18BPH-MK2 cDNA"가 연장인자 1 프로모우터 "EF1αP"의 하류에 연결되어 있었다.

실시예 4-2(b): 형질 전환체에 의한 마우스 유래의 IL-18 결합 단백질의 산생

실시예 4-2(a)에서 얻은 재조합 DNA "pEFM18BPH-MK2"를 함유한 형질전환 대장균주의 배양물로부터 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 채취하여 재조합 DNA "pEFM18BPH-MK2"를 얻었다. 이 재조합 DNA를 20 ㎍ 취하고, 실시예 2-2(b)에서와 마찬가지로 하여 COS-1 세포 (ATCC CRL-1650)에 도입하여 본 발명의 DNA가 도입된 형질 전환체를 얻었다.

이어서 실시예 2-2(b)에서와 마찬가지로 하여 위에서 얻은 형질 전환체를 배양하여 배양물로부터 배양 상청액을 채취하고, 어피니티 크로마토그래피용 겔 (상품명 "Ni-NTA", 키아젠제)의 칼럼을 사용하여 이 배양 상청액을 분획하고, IL-18 결합 단백질의 존재가 확인된 획분을 채취하여 한데 합쳐 1×10⁷개의 상기 형질 전환체로부터 약 2 ml의 정제 IL-18 결합 단백질을 함유한 수용액을 얻었다. 이 수용액의 단백질 함량은 약 1 ㎍/ml이었다. 이 수용액을 실시예 1-2의 방법에 따라 처리하고 N 말단 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표의 서열번호 2에서의 N 말단부분의 것과 동일한 아미노산 서열이 얻어졌다. 그리고 대조로서 재조합 DNA "pEFH18BPH6" 대신에 플라스미드 벡터 "pEF-BOS"를 사용하여 본 실시예와 마찬가지로 처치한 결과, IL-18 결합 단백질의 존재는 확인되지 않았다. 이상의 결과는 마우스 유래의 이 IL-18 결합 단백질이 서열표의 서열번호 2에 나온 아미노산 서열을 가질 경우가 있으며, 이 단백질이 서열번호 33에 나온 염기서열에 의해 코우드될 수 있음을 지지하고 있다.

이하, 본 발명의 IL-18 결합 단백질을 유효성분으로 함유하는 감수성 질환제의 실시예를 구체적으로 설명한다.

실시예 5: 액제

안정제로서 파이로젠 제거한 결정성 트레할로오스 분말 (상품명 "트레하오스", 일본국의 주식회사 林原상사 판매)을 1% (w/v) 함유한 생리 식염수에 실시예 1-1 또는 실시예 2-2의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질을 1 mg/ml가 되도록용해한 후, 통상의 방법에 따라 제균하여 2종류의 액제를 얻었다.

안정성이 우수한 이 제품은, 어느것이라도 자기면역 질환, 염증성 질환 및 알레르기성 질환을 포함한 감수성 질환을 치료, 예방하기 위한 주사제, 점안제, 점비제 등으로서 유용하다.

실시예 6: 건조 주사제

안정제로서 파이로젠 제거한 슈크로오스를 1% (w/v) 함유한 생리 식염수 100 ml에 실시예 1-1 또는 실시예 2-2의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질을 100 mg이 되도록 용해하고, 각각 통상의 방법에 따라 제균한 후, 바이알병에 1 ml씩 나누어 넣고 동결건조하여 마개로 막았다.

안정성이 우수한 이 제품은, 어느것이라도 자기면역 질환, 염증성 질환 및 알레르기성 질환을 포함한 감수성 질환을 치료, 예방하기 위한 건조 주사제로서 유용하다.

실시예 7: 연고제

멸균 증류수에 카르복시비닐 폴리머 (상품명 "하이비즈와코", 일본국의 和光純藥공업주식회사 제조) 및 파이로젠을 제거한 결정성 트레할로오스 분말 (상품명 "트레하오스", 일본국의 주식회사 林原상사 판매)을 각각 농도 1.4% (w/w) 및 2.0% (w/w)가 되도록 용해하고, 실시예 1-1 또는 실시예 2-2의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질을 균일히 혼합한 후, pH 7.2로 조정하여 1 g당 IL-18 결합 단백질을 약 1 mg 함유한 2종류의 페이스트상물을 얻었다.

연전성(延展性)과 안정성이 우수한 이 제품은, 어느것이라도 자기면역 질환,염증성 질환 및 알레르기성 질환을 포함한 감수성 질환을 치료, 예방하기 위한 연고제로서 유용하다.

실시예 8: 정제(錠劑)

파이로젠을 제거한 무수결정 α-말토오스 분말 (상품명 "화인토오스", 일본국의 주식회사 林原상사 판매)에 실시예 1-1 또는 실시예 2-2의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질 및 세포 부활제로서의 루민을 균일히 혼합하고, 수득한 혼합물을 통상의 방법에 따라 타정하여 제품 1정 (약 200 mg)당 IL-18 결합 단백질 및 루민 (일본국의 日本感光色素주식회사제)을 각각 약 1 mg 함유한 2종류의 정제를 얻었다.

섭취성과 안정성이 우수하고 세포부활 작용도 겸비하는 이 제품은, 어느것이라도 자기면역 질환, 염증성 질환 및 알레르기성 질환을 포함한 감수성 질환을 치료, 예방하기 위한 정제로서 유용하다.

실험: 급성독성 시험

통상의 방법에 따라 5주령의 ddy 마우스 (체중 20 내지 25 g)에 대해 실험 1-1, 2-2, 3-1 및 4-2의 방법으로 얻은 정제 IL-18 결합 단백질을 경구투여하거나, 복강내 또는 정맥내에 주사투여하였다. 그 결과, 이들 정제 IL-18 결합 단백질의 LD50은 어떠한 경로에 의해서도 약 1 mg/마우스 1 마리 체중 이상이었다. 이것은 본 발명의 IL-18 결합 단백질이 인간을 포함한 포유류에 투여하는 의약품에 배합하여도 안전하다는 것을 말하고 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 IL-18에 결합하는 신규한 단백질의 발견에 근거한 것이다. 본 발명의 단백질은 인간을 포함한 포유류에 있어서 면역계를 활성화하는 IL-18의 생리작용을 가지므로 장기이식에 따른 거절반응의 완화나 과잉의 면역반응에서 기인하는 여러가지의 질환의 치료,예방에 현저한 효과를 발휘한다.

Claims

서열표의 서열번호 1 및 2에 나온 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 인터류킨-18 결합 단백질.
제1항에 있어서, 부분 아미노산 서열로서 서열표의 서열번호 3 내지 31에 나온 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 인터류킨-18 결합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정하면, 약 40,000 내지 60,000 달톤의 분자량을 나타내는 인터류킨-18 결합 단백질.
제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 포유류의 체액으로부터 얻을 수 있는 인터류킨-18 결합 단백질.
제1항 내지 제4항에 기재된 인터류킨-18 결합 단백질을 코우드하는 DNA.
제5항에 있어서, 서열표의 서열번호 32 또는 33에 나온 어느 하나의 염기서열 혹은 그 염기서열에 상동적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 함유하는 DNA.
유효성분으로서 제1항 내지 제4항에 기재된 인터류킨-18 결합 단백질을 함유하는 인터류킨-18 억제제.
유효성분으로서 제1항 내지 제4항에 기재된 인터류킨-18 결합 단백질을 함유하는 항감수성 질환제.
제8항에 있어서, 항면역 질환제로서의 항감수성 질환제.