MXPA02010895A

MXPA02010895A - Uso de inhibidores de interleucina 18 para el tratamiento y/o prevencion de aterosclerosis.

Info

Publication number: MXPA02010895A
Application number: MXPA02010895A
Authority: MX
Inventors: Yolande Chvatchko
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2003-03-27
Also published as: KR100798545B1; CN1250286C; EA200201175A1; HK1055681A1; JP2003532685A; AU2001267390B2; US20040076628A1; ME00554B; KR20070073989A; NO20025307L; HRP20020828A2; HU229375B1; RS50926B; KR20030016254A; HUP0301991A3; EA200401183A1; ES2305082T3; CZ300792B6; WO2001085201A3; SK15562002A3

Abstract

La invencion se refiere al uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de aterosclerosis.

Description

USO DE INHIBIDORES DE INTERLEUCINA-18 PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN DE ATEROSCLEROSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de enfermedades vasculares. Más específicamente, la invención se refiere al uso de inhibidores de IL-18 para tratamiento y/o prevención de aterosclerosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La aterosclerosis es la enfermedad vascular más común y más importante, pero se reconocen muchos otros trastornos vasculares. La aterosclerosis principalmente afecta a las arterias grandes y de tamaño medio, y sus lesiones comprenden ateromatosis, placas fibrosas y lesiones complicadas. La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de la pared arterial caracterizada por acumulación progresiva de lípidos, tal como colesterol, células, como macrofagos, linfocítos T o células de músculo liso, y matriz extracelular (1). Las acumulaciones mayores se llaman ateromas o placas, que pueden a menudo contener calcio. El tejido graso puede desgastar la pared de la arteria, reducir la elasticidad de la arteria e interferir con el flujo sanguíneo. Finalmente, pueden formarse coágulos alrededor de los depósitos de placas, que interfieren con el flujo sanguíneo, que pueden llevar a una obstrucción total del vaso sanguíneo. Usualmente, la aterosclerosis se asocia a niveles aumentados de LDL-colesterol, fibrinogeno Lp(a) y factor Vil, así como también niveles reducidos de HDL-colesterol. Los factores de riesgo incluyen aumento de la edad, sexo masculino, tabaquismo, diabetes, obesidad, colesterol en la sangre alto, una dieta de alto contenido de grasas, y tener una historia personal o familiar de enfermedades cardíacas. Es la principal causa de isquemia orgánica tal como, por ejemplo, infarto de miocardio. El ateroma es la lesión más común en las arterias, que puede además complicarse por trombo-embolismo. Las placas ateromatosas a menudo reducen el lumen de las arterias produciendo isquemia y algunas veces atrofia de los tejidos en el territorio hipoprofuso. Las consecuencias graves incluyen el síntoma de angina debido a la isquemia de miocardio, insuficiencia cardiaca debida a isquemia o episodios no isquémicos, e hipertensión debida a angostamiento de arteria renal e hipoperfusión de un riñon que responde fisiológicamente mediante una menor secreción de renina. Algunas veces se hace referencia a aterosclerosis y arterioesclerosis como a estados patológicos separados, y en este caso, la aterosclerosis se define de modo que implica el endurecimiento (esclerosis) o pérdida de elasticidad de las arterias debido específicamente a ateroma, mientras que la arterioesclerosis es el endurecimiento o pérdida de elasticidad de las arterias por cualquier causa.

Las complicaciones o consecuencias de la aterosclerosis incluyen enfermedad de la arteria coronaria (aterosclerosis de arterias coronarias), deficiencia de suministro sanguíneo debido a obstrucción (isquemia/angina), Ml agudo (infarto de miocardio, ataque cardíaco), ataque isquémico transiente (TÍA) o ataque cerebral, y daño a los vasos sanguíneos, músculos u órganos del cuerpo. Las aneurismas, que son dilataciones anormales permanentes de los vasos sanguíneos, son también consecuencias comunes de aterosclerosis. Las aneurismas aórticas abdominales ateroescleróticas comúnmente se desarrollan en pacientes de edad avanzada. Pueden romperse en el espacio retroperitoneal. En las aneurismas ateroescleróticas, por lo general se produce una pérdida pronunciada de tejido elástico y fibrosis de la media, principalmente debido a isquemia del músculo de la media aórtica, seguido por liberación de enzimas de macrófagos que causan fragmentación de las fibras elásticas. Las medicaciones recomendadas para tratamiento o prevención de aterosclerosis incluyen reducción de grasas/colesterol en la sangre. En particular, la terapia reductora de LDL-colesterol es ampliamente utilizada. Actualmente, las estatinas, que son inhibidores específicos de HMG CoA reductasa, son ampliamente utilizadas. Además, los agentes reductores de grasas comprenden medicaciones tal como colestiramina, colestipol, ácido nicotínico, gemfibrozil, probucol, lovastatina y otros.

Otro enfoque es reducir al mínimo el riesgo de formación de trombos sobre lesiones ateromatosas establecidas. La aspirina, que parece ser un inhibidor específico de agregación plaquetaria mediada por tromboxano A2, o anticoagulantes, pueden ser utilizados para reducir el riesgo de formación de coágulos. La "angioplastia de globo" percutánea utiliza un catéter con un extremo de globo para aplanar la placa y aumentar el flujo sanguíneo detrás de la oclusión. La técnica es similar a la utilizada para abrir las arterias del corazón, pero puede aplicarse a muchas otras arterias en el cuerpo. Las estenosis de arteria coronaria son derivadas con segmentos de vena safena unidos en la aorta próxima o diseccionando la arteria mamaria interna de la pared del pecho y anastomizando su extremo distal a una arteria sobre la superficie anterior del corazón. La remoción quirúrgica de depósitos (endarterectomía) puede ser recomendada en algunos casos (por ejemplo, endarterectomía de la carótida). Sin embargo, la principal recomendación sigue siendo tratar o controlar los factores de riesgo, como mantener una dieta baja en grasas, baja en colesterol y baja en sales y seguir las recomendaciones del profesional de la salud para el tratamiento y control de hipertensión, diabetes y otras enfermedades, reducción del peso del cuerpo y dejar de fumar, así como ejercicio regular para mejorar la condición del corazón y la circulación.

El proceso inflamatorio está comprendido en todas las diferentes etapas de aterosclerosis (1). La activación endotelial, mediante diversos factores que incluyen tensión de corte bajo, lipoproteínas modificadas y citocinas pro-inflamatorias, se considera como el primer paso en la aterosclerosis y se encuentra bajo control inflamatorio (1 ). Muchos estudios recientes han demostrado que las interacciones entre las células vasculares e inflamatorias son cruciales en la aterogenesis (1 ). Particularmente, la inhibición de pasajes pro-inflamatorios redujo el desarrollo de aterosclerosis d). La inflamación también desempeña un papel importante en la rotura de placa ateroesclerótica y trombosis (2-5), y por lo tanto influye en la ocurrencia de síndromes isquémicos agudos y la mortalidad relacionada con los mismos (6). En realidad, manifestaciones clínicas graves de aterosclerosis, incluyendo infartos cardíacos, cerebrales y de otros órganos afectados por aterosclerosis, se deben principalmente a oclusión de lumen de los vasos mediante una trombosis formada en el contacto de una placa aterosclerótica rota (3,4). Los estudios patológicos han demostrado que las placas vulnerables o inestables, es decir, placas con tendencia a la ruptura o que han sufrido ruptura, en gran medida difieren en cuanto a composición de las células y la matriz comparadas con las placas estables, sin tendencia a la ruptura (7). Las placas vulnerables son ricas en células inflamatorias (macrófagos y linfocitos T), contienen un núcleo de lípido trombogénico y se caracterizan por una fina cubierta fibrosa con una pérdida sustancial de matriz extracelular (7). La síntesis de colágeno reducida, mediada por la citocina IFNy, pro-inflamatoria, y la reducida actividad de matriz derivada de marcrófagos que degrada las metaloproteinasas son responsables del angostamiento y fragilidad de la cubierta fibrosa (7). La ruptura de la cubierta fibrosa y frágil expone al núcleo lípido altamente trombogénica a la sangre en circulación y produce la formación de trombo oclusivo (1 , 7). Por lo tanto, la densidad de células inflamatorias en una lesión ateroesclerótica dada es considerada como un buen indicador de su inestabilidad. El pronóstico clínico de un paciente con aterosclerosis depende solamente en parte del tamaño de las lesiones (19, 20) Actualmente es ampliamente reconocido que la calidad (composición de placa), más que el tamaño, de la lesión podría ser un mejor indicador de la ocurrencia de episodios isquémicos. En realidad, las manifestaciones clínicas graves de aterosclerosis (infartos de corazón y cerebro) son principalmente debidas a oclusión del lumen de los vasos por un trombo formado en el contacto de una placa ateroesclerótica rota (19). Los estudios patológicos han demostrado que las placas vulnerables o inestables, que tienden a romperse o que han sufrido ruptura, son ricas en células inflamatorias e inhiben una pérdida sustancial en contenido de células de músculo liso y de colágeno (20, 21). Además, tales placas muestran un significativo aumento en la muerte de células apoptóticas que lleva a la formación de un núcleo de lípido altamente trombogénico (13, 22).

Las citocinas pro-inflamatorias se encuentran implicadas en la inflamación. La citosina interleucina 18 (IL-18) se describió inicialmente como un interferón-? (IFN- y) que induce el factor (8). Es una señal temprana en el desarrollo de las repuestas de células auxiliares de T-linfocito tipo 1 (Th1). II-18 actúa junto con IL-12, IL-2, antígenos, mitógenos, y posiblemente otros factores, para inducir la producción de IFN-?. IL-18 también mejora la producción de GM-CSF e IL-2, potencia la proliferación de células T inducidas por anti-CD3, y aumenta la destrucción mediada por Fas de células destructoras naturales. La IL-18 madura se produce a partir de su precursor mediante la enzima de conversión de 11-1 ß (ICE, caspasa-1). El receptor de IL-18 consiste de por lo menos dos componentes, que cooperan en la unión de ligando. Los sitios de unión de alta y baja afinidad para IL-18 se encontraron en células T estimuladas por IL-12 murinas (9), que sugieren un complejo receptor de cadena múltiple. Dos subunídades de receptor se han identificado hasta ahora, ambas pertenecientes a la familia de receptor de IL-1 (10). La transducción de señal de IL-18 incluye la activación de NF-xB(11 ). Recientemente, una proteína soluble con una alta afinidad para IL-18 ha sido aislada a partir de orina humana, y ADNc humano y de ratón así como genes humanos fueron clonados (12; WO 99/09063). La proteína ha sido designada proteína de unión a IL-18 (IL-18BP). IL18BP no es el dominio extraceluiar de uno de los receptores de IL18 conocidos, sino una proteína secretada de circulación natural. Pertenece a una familia novedosa de proteína secretada, que además incluye diversas proteínas codificadas en Poxvirus (12). IL18BP se expresa constitutivamente en el bazo (12). La IL18BP en la orina así como recombinante específicamente se unen a IL-18 con una alta afinidad y modulan la afinidad biológica de IL-18. El gen IL18BP ha sido localizado en el cromosoma humano 11q13, y no se encontró codificación de exón para un dominio de transmembrana en una secuencia genómica 8.3kb. Se encontraron cuatro variantes de empalme o isoformas de IL18BP en humanos, y se designaron IL18BP a, b, c y d, todos ellos compartiendo la misma N-terminal y diferenciándose en la C-terminal (12). Cuatro isoformas humanas y dos de ratón de IL-18BP, resultantes del empalme con ARNm y encontrados en diversas genotecas de ADNc, fueron expresadas, purificadas y determinadas para unión y neutralización de las actividades biológicas de IL-18 (23). La isoforma IL-18BP humana a (IL-18Bpa) exhibió la mayor afinidad para IL-18 con una de velocidad de activación rápida, velocidad de inactivación lenta y constante de disociación (K(d)) de 399 pM. IL-18BPc comparte el dominio Ig de IL-18Bpa excepto por los 29 aminoácidos C-terminales; la K(d) de IL-18BPC es 10 veces menor (2,94 nM). No obstante, IL-18Bpa e IL-18BPc neutralizan a la IL-18 > 95% a un excedente molar de dos. Las isoformas IL-18BPb e IL-18BPd carecen de un dominio Ig completo y carecen de la capacidad de unir o neutralizar a IL-18. Las ¡soformas IL-18BPc e IL-18BPd de murino, que poseen el dominio Ig idéntico, también neutralizan la IL-18 murina a >95% en un exceso molar de dos. Sin embargo, IL-18BPd murina que comparte un motivo C-terminal común con 11-18Bpa humano, también neutraliza a IL-18 humana. La modelación molecular identificó un gran sitio de unión electrostático e hidrofóbico mixto en el dominio Ig de IL-18-BP, que podría dar cuenta de su unión de alta afinidad al ligante (23).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de que un inhibidor de IL-18 tuvo un efecto benéfico pronunciado sobre el desarrollo de placa, progresión de placa y estabilidad de placa en un modelo murina de aterosclerosis. El inhibidor de IL-18 no sólo impidió la formación de lesión en la aorta torácica, sino que también indujo un cambio hacia un fenotipo de placa estable en las placas ateroescleróticas ya establecidas. Por lo tanto, la invención se refiere al uso de un inhibidor de IL- 18 para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de aterosclerosis. La invención se refiere además a métodos de tratamiento para un enfoque terapéutico de genes para tratar y/o prevenir aterosclerosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un histograma que ilustra el porcentaje de supervivencia de células endoteliales de vena umbilical humana luego de incubación con lipoproteínas oxidadas aisladas, o incubación con una combinación de lipoproteínas oxidadas y un anticuerpo de IL-18 o IL18BP, respectivamente. La figura 2 muestra una prueba de Western Blot realizada sobre extractos de proteína de arterias ateroescleróticas en comparación con arterias de control. En la prueba de Western Blot se utilizaron los anticuerpos dirigidos contra IL-18BP (hlL18BP), subunidad a de receptor de IL-18 (hlL18Ra), IL-18 (HIL18) y Caspasa-1 (Caspasa 1 p10). La figura 3 muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra el resultado de un análisis de RT-PCR para ARNm de IL-18 e IL-18BP en células de la placa ateroesclerótica. Las figuras 4A a 4D son representativas de los resultados de RT-PCR para IL-18BP e IL-18 en placas ateroescleróticas en comparación con la expresión de h -actina (control) en placas sintomáticas y asintomáticas. La figura 5 muestra el mapa del vector de expresión utilizado para electrotransferencia intramuscular en ratones. La figura 6 muestra un histograma que ilustra el área de tinción de lípidos en arterias ateroscleróticas. Análisis de imagen cuantitativo asistido por computadora sobre la deposición de lípidos. Los datos representan los valores con s.e.m. (n= 19 para plásmido vacío, n = 14 para IL-18BP plásmido). Los asteriscos cuádruples indican P< 0.0001. La Figura 7 muestra un histograma que ilustra el área de lesión de seno aórtico luego de tratamiento con IL-18BP según se compara con control (plásmido vacío). Análisis de imagen cuantitativo asistido por computadora del área de lesión. Los datos representan los valores medios con s.e.m. (n= 19 para plásmido vacío, n= 14 para IL-18BP plásmido). Los dobles asteriscos indican P< 0.01. La figura 8 muestra el efecto del tratamiento con IL-18BP sobre el contenido de célula inflamatoria de lesión. El análisis de imagen cuantitativo asistido por computadora se utilizó para determinar el porcentaje de áreas macrofago-positivas (barras negras) y el número de linfocitos T infiltrantes por mm2 (barras grises) en lesiones de seno aórtico de control (n= 12 para tinción de macrófagos, n= 15 para tinción de linfocitos T) o ratones tratados con IL-18BP (n=13 para macrófagos, n = 12 para T-linfocitos). Los datos representan valores medios con s.e.m. Los asteriscos triples indican P < 0.005; y los asteriscos cuádruples indican P< 0.0001.- La figura 9 muestra el efecto de tratamiento con IL-18BP sobre la lesión de células de músculo liso y contenido de colágeno. El análisis cuantitativo de imagen asistido por computadora se utilizó para determinar el porcentaje de áreas positivas en células de músculo liso (barras negras) y acumulación de colágeno (barras grises) en lesiones de seno aórtico de control (n= 6 para células de músculo liso, n= 11 para colágeno) y ratones tratados con IL-18BP (n = 6 para células de músculo liso, n= 13 para colágeno). Los datos representan valores medios con s.e.m. el asterisco simple indica P < 0.05; y los asteriscos dobles indican P < 0.01.- DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de niveles aumentados de IL-18 en circulación en pacientes con síndromes coronarios agudos y producción de IL-18 aumentada en placas ateroscleróticas de carótida inestables, responsables del ataque. Además de eso, se ha demostrado que la electrotransferencia in vivo de un ADN de plásmido de expresión que codifica IL-18BP impide el desarrollo de ateroma en la aorta torácica y retarda la progresión de placas ateroscleróticas avanzadas en el seno aórtico en un modelo murino bien establecido de aterosclerosis. En forma más importante, la transfección con plásmido IL-18BP induce cambios profundos en la composición de placa (reducción de macrófagos, células T, muerte celular y contenido de lípidos y aumento en contenido de colágeno y células de músculo liso) que lleva a un fenotipo de placa estable. Estos resultados demuestran por primera vez un papel importante para los inhibidores de IL-18 en la reducción de desarrollo/progresión de placa y en la promoción de estabilidad de placa.

La invención se refiere por lo tanto al uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para tratamiento y/o prevención de aterosclerosis. El término "prevención" dentro del contexto de esta invención se refiere no solamente a una prevención completa de un cierto efecto, sino también a cualquier prevención parcial o sustancial, atenuación, reducción, mitigación o disminución del ^efecto antes o al inicio temprano de la enfermedad. El término "tratamiento" dentro del contexto de esta invención se refiere a cualquier efecto benéfico sobre la progresión de la enfermedad, incluyendo atenuación, reducción, mitigación o disminución del desarrollo patológico luego del inicio de la enfermedad. El término "inhibidor de IL-18" dentro del contexto de esta invención se refiere a cualquier molécula que modula ia producción y/o acción de IL-18 en una forma tal que la producción y/o acción de IL-18 resulta atenuada, reducida o parcial, sustancial o completamente impedida o bloqueada. Un inhibidor de producción puede ser cualquier molécula que afecte negativamente la síntesis, procesamiento o maduración de IL-18. Los inhibidores considerados de acuerdo con la invención, pueden ser, por ejemplo, supresores de expresión genética de interleucina IL-18, ARNm antisentido que reduce o impide la transcripción de ARNm de IL-18 o que lleva a la degradación de ARNm, proteínas que impiden la correcta duplicación, o que parcialmente o sustancialmente impiden la maduración o secreción de IL-18, las proteasas que degradan IL-18, una vez que ha sido sintetizado, y similar. Un inhibidor de producción podría ser un inhibidor Caspase-1 o un inhibidor de ICE, por ejemplo, que impide la maduración de IL-18. Un inhibidor de acción de IL-18 puede ser, por ejemplo, un antagonista de IL-18. Los antagonistas pueden tanto unirse a o secuestrar la molécula de 1L-18 con suficiente afinidad y especificidad para neutralizar parcial o sustancialmente el IL-18 o el sitio(s) de unión de IL-18 responsable de la unión de IL-18 con sus ligantes (tal como, por ejemplo, con sus receptores). Un antagonista también puede inhibir la vía de señalización de IL-18, activada dentro de las células con unión IL-18/receptor. Los inhibidores de acción de IL-18 también pueden ser receptores de IL-18 solubles o moléculas que imitan a los receptores, o agentes que bloquean a los receptores de IL-18, anticuerpos de IL-18, tal como anticuerpos monoclonales, por ejemplo, o cualquier otro agente o molécula que impide la unión de IL-18 con sus objetivos, disminuyendo o impidiendo así el impulso o inicio de las reacciones intracelulares o extracelulares mediadas por IL-18. La aterosclerosis también se conoce como arterioesclerosis o endurecimiento de las arterias. Dentro del contexto de la presente invención, el término aterosclerosis comprende todas las enfermedades o estados de enfermedades de las arterias generalmente descritas como aterosclerosis, en donde el material graso se deposita en la pared del vaso, y finalmente dando como resultado el angostamiento o impedimento del flujo sanguíneo así como la ruptura y/o desgaste con formación de trombo. De conformidad con la presente invención, la aterosclerosis comprende tanto esclerosis como pérdida de elasticidad de las arterias debido a ateroma (aterosclerosis), y debido a cualquier otra causa (arterioesclerosis). Las condiciones patológicas de aterosclerosis, así como las complicaciones o consecuencias de aterosclerosis, que están destinadas a incluirse en el término "aterosclerosis", tal como se utilizan en la presente, se han descrito en forma detallada anteriormente en "antecedentes de la invención".- La progresión de aterosclerosis incluye la formación de placas ateroscleróticas y el desarrollo de las mismas en formas cada vez más inestables. Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para reducir o impedir la progresión de aterosclerosis. La oclusión de vasos por un trombo formado en una placa aterosclerótica es un episodio crítico en infartos del corazón y cerebro, que se encuentran entre las consecuencias más perjudiciales de aterosclerosis. Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trombosis de una placa aterosclerótica. La estabilidad de placa influye en el desarrollo de una placa aterosclerótica en una placa dañina o vulnerable, que tiende a iniciar trombosis. Por lo tanto, la invención se refiere además al uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar la inestabilidad de placa aterosclerótica. Una placa inestable tiene predisposición a la fractura, y la fractura de una placa puede llevar a trombosis. La invención se refiere además, por lo tanto, al uso de un Inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para prevenir el desgaste o disrupción de placa aterosclerótica. La inestabilidad de placa y trombosis pueden deberse, por ejemplo, a la muerte de células apoptóticas, que confiere una alta actividad procoagulante y podría ser un evento clave que lleve a la trombosis de placas ateroscleróticas desgastadas o rotas así como a eventos o episodios embólicos (13, 14). Se ha demostrado que las lipoproteínas oxidadas (oxLDL) inducen apoptosis de células endoteliales y macrófagos en cultivo (15). Tal como se muestra en los ejemplos que se dan más adelante, se ha encontrado ahora que un inhibidor de L-18 es capaz de reducir en gran medida la muerte de células inducidas por oxLDL. De conformidad con la presente invención, se ha encontrado en forma sorprendente que los niveles de IL-18 en la sangre fueron significativamente elevados en pacientes con fallas cardíacas que sufren de episodios recurrentes, tal como, por ejemplo, muerte, isquemia recurrente, re-vascularización, progresión de aterosclerosis o re-hospitalización por insuficiencia cardiaca, según se compara con los pacientes que no volvieron al hospital. Este aumento en los niveles de IL-18 fue especialmente pronunciado en aquellos pacientes que murieron más tarde, según se compara con los que sobrevivieron. Los niveles elevados de IL-18 en la circulación de la sangre se observaron en pacientes con isquemia, así como en pacientes no isquémicos. Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de inhibidores de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de casos recurrentes de insuficiencias cardiacas. Los eventos recurrentes pueden ser cualquier evento luego de la insuficiencia cardiaca, tal como muerte, isquemia recurrente, re-vascularización, progresión de aterosclerosis o rehospitalización por insuficiencia cardiaca. En una modalidad preferida de la invención, la insuficiencia cardiaca es isquémica, es decir, debido a isquemia miocardial. En otra modalidad preferida, la insuficiencia cardiaca es no isquémica, tal como debido a hipertensión sistémica, enfermedad cardiaca valvular, o enfermedad pulmonar que lleve a insuficiencia cardiaca directa y luego congestiva. En una modalidad preferida de la invención, el inhibidor de IL-18 se selecciona entre el grupo formado por inhibidores de ICE, anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades de receptor de 1L-18, inhibidores de la vía de señalización de receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-19, y proteínas unión de IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados permutados circulares de los mismos que poseen la misma actividad.

Tal como se utiliza en la presente, el término "muteínas" se refiere a los análogos de un IL-18BP, o análogos de un IL-18BP viral, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos de un IL-18BP natural o IL-18BP viral son reemplazados por diferentes residuos de aminoácidos, o son eliminados, o uno o más residuos de aminoácidos son agregados a la secuencia natural de un IL-18BP, o un IL-18BP, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes, tal como se compara con el tipo salvaje de IL-18BP o IL-18BP viral. Estas muteínas se preparan mediante síntesis y/o técnicas de mutagenesis dirigidas al sitio conocidas, o por cualquier otra técnica conocida que sea adecuada para tal fin. Cualquiera de dichas muteínas preferentemente posee una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la misma de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de una IL-18BP viral, tal como para tener una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP. Una actividad de IL-18BP es su capacidad de unir la IL-18. En tanto la muteína tenga una actividad de enlace sustancial con respecto a IL-18, la misma puede utilizarse en la purificación de IL-18, tal como por medio de cromatografía de afinidad, y de ese modo puede ser considerada como que posee actividad sustancialmente similar a IL-18BP. De este modo, puede determinarse si cualquier muteína dada posee sustancialmente la misma actividad que IL-18BP por medio de experimentación de rutina que consiste en someter a dicha muteína, por ejemplo, a un ensayo de competencia de tipo emparedado para determinar si la misma se une o no a una IL-18 adecuadamente rotulada, tal como por radioinmunoensayo o ensayo de ELISA. Las muteínas de polipéptidos de IL-18BP o muteínas de IL-18BP virales, que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, o codificación de ácido nucleico para las mismas, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución, que pueden ser obtenidos por rutina por un experto en la técnica, sin experimentación indebida, con base en las enseñanzas o a la guía presentada en la presente. Los cambios preferidos para muteínas de acuerdo con la presente invención se conocen como sustituciones "conservativas". Las sustituciones de aminoácidos conservativas de polipéptidos o proteínas de IL-18BP o IL-18BP virales, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares, de modo que la sustitución entre miembros del grupo conservará la función biológica de la molécula (16). Resulta claro que las inserciones y eliminaciones de aminoácidos también pueden realizase en las secuencias antes definidas sin alterar la función de las mismas, particularmente si las inserciones o eliminaciones sólo comprenden unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferentemente menos de diez, y no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína.

Las proteínas y muteínas producidas por tales eliminaciones y/o inserciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En forma preferida, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el cuadro I. Más preferentemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el cuadro II, y en forma más preferida, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el cuadro lll.

CUADRO I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly He Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Tf, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, He, Val, Ley, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His, Gln^ Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, He, Val, Leu, Met Trp Trp CUADRO II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, He, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, He Gly Gly He He, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, He, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, Lie, Val, Leu CUADRO lll Grupos mayormente preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácidos Grupo sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, He, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly He He, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden utilizarse para obtener muteínas de polipéptidos de IL-18BP o proteínas o muteínas de IL-18BP virales, para usarse en la presente invención incluyen cualesquiera pasos de métodos conocidos, tal como los presentados en las patentes de E.U.A. 4,959,314, 4,588, 585 y 4,737,462, de Mark et al.; 5,116,943 de Koths et al., 4,965,195 de Ñamen et al.; 4,879,111 de Chong et al. y 5,017,691 de Lee et al. y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de E.U.A. No. 4,904,584 (Shaw et al.). El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende un IL-18BP, o un IL-18BP viral o una muteína del mismo, fusionada con otra proteína que, por ejemplo, tiene un tiempo de residencia prolongado en los fluidos del cuerpo. Una IL-18BP o una IL-18BP viral puede por lo tanto fusionarse con otra proteína, polipéptido o lo similar, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. "Los derivados funcionales", tal como se utilizan en la presente, cubren derivados de IL-18BP o un IL-18BP viral, y sus muteínas o proteínas fusionadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que se producen como cadenas laterales en los residuos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención mientras permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyen la actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de IL-18BP, o IL-18BP viral, y no confieren propiedades tóxicas en composiciones que los contienen. Estos derivados pueden, por ejemplo, incluir cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigénicos y extender la residencia de una IL-18BP o una IL-18BP viral en los fluidos del cuerpo. Otros derivados incluyen esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con partes de acilo (por ejemplo, grupos arolio carbocíclicos o alcanoilos) o derivados de O-acilo de grupos hidroxi libres (por ejemplo, los de residuos de serilo o treonilo) formados con partes de acilo. Como "fracciones activas" de una IL-18BP o una IL-18BP viral, muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención cubre cualquier fragmento o precursores de la cadena polipéptida de la molécula de proteína solos o junto con moléculas o asociadas o residuos unidos a las mismas, por ejemplo, azucar o residuos de fosfato, o agregados de la molécula de proteína o los residuos de azúcar en sí mismos, siempre que dicha fracción posea actividad sustancialmente similar a IL-18BP. En una modalidad preferida de la invención, el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo contra IL-18. Los anticuerpos anti-IL-18 pueden ser policlonales o monoclonales, quiméricos, humanizados o incluso totalmente humanos. Los anticuerpos recombinantes y los fragmentos de los mismos se caracterizan por la unión de elevada afinidad a IL-18 in vivo y a la baja toxicidad. Los anticuerpos que pueden utilizarse en la invención se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes durante un período suficiente para tener una regresión o alivio buenos o excelentes de la condición patogénica o de cualquier síntoma o grupo de síntomas relacionados con un estado patogénico, y una baja toxicidad. Los anticuerpos neutralizantes son fácilmente producidos en animales tales como conejos, cabras o ratones por inmunización con IL-18.

Los ratones inmunizados son particularmente útiles para proveer fuentes de células B par ala fabricación de hibridomas, que a su vez son cultivados para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales anti-ll-18. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de inmunoglobulina caracterizadas por dos o más segmentos o porciones derivadas de diferentes especies animales. En general, la región variable del anticuerpo quimérico se deriva de un anticuerpo mamífero no humano, tal como un anticuerpo monoclonal murino, y la región constante de inmunoglobulina se deriva de una molécula de inmunoglobulina humana. En forma preferida, ambas regiones y la combinación tienen baja inmunoginicidad según se determinan en forma rutinaria (24). Los anticuerpos humanizados son moléculas de inmunoglobulina creadas por técnicas de ingeniería genética en donde las regiones constantes murinas son reemplazadas por contrapartes humanas mientras retienen las regiones de unión de antígeno murinas. El anticuerpo quimérico de ratón-humano resultante preferentemente posee inmunogenicidad reducida y farmacocinética mejorada en humanos (25). De este modo, en una modalidad preferida, el anticuerpo IL-18 es un anticuerpo IL-18 humanizado. Ejemplos preferidos de anticuerpos anti- IL-18 humanizados se describen, por ejemplo en la solicitud de patente europea EP 0 974600. En otra modalidad preferida, el anticuerpo IL-18 es totalmente humano. La tecnología para producir anticuerpos humanos se describe en forma detallada, por ejemplo en WO00/76310, WO99/53049, E.U.A. 6,162,963 o AU 5336100. Los anticuerpos totalmente humanos son preferentemente anticuerpos recombinantes, producidos en animales transgénicos, por ejemplo xenoratones que comprenden la totalidad o parte de loci Ig humanos funcionales. En una modalidad altamente preferida de la presente invención, el inhibidor de IL-18 es una IL-18BP, o una isoforma, una muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o derivado permutado circularmente de los mismos. Estas isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados funcionales retienen la actividad biológica de IL-18BP, en particular la unión a IL-18, y de preferencia tienen esencialmente por lo menos una actividad similar a IL-18BP. En forma ideal, dichas proteínas tienen una actividad biológica que es incluso aumentada en comparación con IL-18BP no modificada. Las fracciones activas preferidas tienen una actividad que es mejor que la actividad de IL-18BP, o que tienen otras ventajas, tal como una mejor estabilidad o una menor toxicidad o inmunogenicidad, o son más fáciles de producir en grandes cantidades, o más fáciles de purificar.

Las secuencias de IL-18BP y sus variantes de empalme/isoformas pueden tomarse a partir de WO99/09063 o de (12), así como también de (23). Los derivados funcionales de IL-18BP pueden ser conjugados con polímeros a fin de mejorar las propiedades de la proteína, tal como estabilidad, vida media, biodisponibilidad, tolerancia por el cuerpo humano, o inmunogenícidad. Para lograr este objetivo, IL18-BP puede unirse, por ejemplo, a polietilenoglicol (PEG). La unión a PEG puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos, que se describen, por ejemplo en WO 92/13095. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la presente invención, IL-18BP es unido a PEG. En otra modalidad preferida de la invención, el Inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que comprende toda o parte de una proteína de uniórr de IL-18, que se fusiona a toda o parte de una inmunoglobulina. EL experto en la técnica entenderá que la proteína de fusión resultante retiene la actividad biológica de IL-18BP, en particular, la unión a IL-18. La fusión puede ser directa, o a través de un péptido de enlace corto que puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos de aminoácidos de longitud o más, por ejemplo 13 residuos de aminoácidos de longitud. Dicho medio de enlace puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia de unión de aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre la secuencia de IL-18BP y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante tiene propiedades mejoradas, tal como un tiempo de residencia prolongado en los fluidos del cuerpo (vida media), actividad específica aumentada, nivel de expresión aumentado, o la purificación de la proteína de fusión es facilitada. En una modalidad preferida, IL-18BP se fusiona a la región constante de una molécula de Ig. En forma preferida, se fusiona a regiones de cadena pesada, tal como, por ejemplo dominios de CH2 y CH3 de lgG1 humana. La generación de proteínas de fusión específicas que comprenden IL-18BP y una porción de una inmunoglobulina se describen, por ejemplo, en el ejemplo 11 de WP99/09063. Otras isoformas de moléculas de Ig son también adecuadas para la generación de proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención, tales como isoformas lgG2 o lgG4, u otras clases de Ig, como, por ejemplo, IgM o IgA. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, heteroméricas o homomultiméricas. Los interferónes son principalmente conocidos por los efectos inhibitorios sobre replicación viral y proliferación celular. El interferón-?, por ejemplo, desempeña un importante papel en la promoción de respuestas inmunes y respuestas inflamatorias. El interferón-ß (IFN-ß, un interferón tipo I) es considerado como con una función anti-inflamatoria. La invención también se refiere al uso de una combinación de un inhibidor de IL-18 y un interferón en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aterosclerosis.

Los interferónes pueden también conjugarse con polímeros a fin de mejorar la estabilidad de las proteínas. Un conjugado entre Interferón-ß y polietilenoglicol (PEG) de poliol ha sido descrito, por ejemplo, en W099/55377. En otra modalidad preferida de la invención, el interferón es el interferón-ß (IFN-ß) y más preferentemente IFN-ß 1 a. El inhibidor de producción de IL-18 y/o acción de IL-18 es de preferencia utilizado en forma simultánea, secuencial o separada con el interferón. En otra modalidad de la invención, un inhibidor de IL-18 se utiliza en combinación con antagonista de FNT. Los antagonistas de FNT ejercen su actividad en diversas formas. Primero, los antagonistas pueden unirse a o secuestrar la molécula de FNT con suficiente afinidad y especificidad para parcial o sustancialmente neutralizar el epitopo o epitopos FNT responsables de la unión del receptor de FNT (en adelante "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra FNT. En forma alternativa, los antagonistas de FNT pueden inhibir la vía de señalización de FNT activado por el receptor de superficie de célula luego de la unión de FNT (en adelante "antagonista de señalización"). Ambos grupos de antagonistas son útiles, tanto en forma aislada como conjunta, en combinación con un inhibidor de IL-18, en la terapia de aterosclerosis.

Los antagonistas de FNT son fácilmente identificados y evaluados mediante clasificación de rutina de candidatos por sus efectos sobre la actividad de FNT nativo en líneas de célula susceptibles in vitro, por ejemplo, células B humanas, en donde FNT causa proliferación y secreción de inmunoglobulina. El ensayo contiene formulación de FNT en diluciones variadas de antagonista candidato, por ejemplo de 0.1 a 100 veces la cantidad molar de FNT utilizada en el ensayo, y controles sin FNT o solamente antagonista (26). Los antagonistas secuestrantes son los antagonistas de FNT preferidos para ser utilizados de acuerdo con la presente invención. Entre los antagonistas secuestrantes se prefieren los polipéptidos que unen FNT con alta afinidad y que poseen baja inmunogenicidad. Las moléculas receptoras de FNT solubles y los anticuerpos neutralizantes de FNT son particularmente preferidos. Por ejemplo, FNT-RI y FNT-RII son útiles en la presente invención. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares de los receptores o porciones funcionales de los mismos, son antagonistas más particularmente preferidos de acuerdo con la presente invención. Los receptores de FNT tipo I y tipo II solubles truncados se describen, por ejemplo en EP914431. Las formas truncadas de los receptores FNT son solubles y han sido detectados en orina y suero como proteínas de unión inhibitorias de FNT 30kDa y 40 kDa, que se llaman TBPI y TBPII, respectivamente (27). El uso simultáneo, secuencial o separado del inhibidor de IL-18 con el antagonista de FNT y/o un interferón es preferido, de acuerdo con la invención. De conformidad con la invención, TBP I y TBPII son antagonistas de FNT preferidos a ser utilizados en combinación con un inhibidor de IL-18. Los derivados, fragmentos, regiones y porciones biológicamente activas de las moléculas receptoras funcionalmente se asemeja a las moléculas de receptor que pueden también utilizarse en la presente invención. Tal equivalente o derivado biológicamente activo de la molécula receptora se refiere a la porción del polipéptido, o de la secuencia que codifica a la molécula receptora, es decir de tamaño suficiente y puede unirse a FNT con una afinidad tal que la interacción con el receptor de FNT llevado en la membrana es inhibida o bloqueada. En otra modalidad preferida, FNT-RI soluble humano (TBPI) es el antagonista de FNT a ser utilizado de acuerdo con la invención. Las moléculas de receptor de FNT soluble recombinante y natural y los métodos de producción de las mismas se han descrito en las patentes europeas EP 308 378, EP 398 327 y EP 433 900. El inhibidor de IL-18 puede utilizarse simultáneamente, secuencialmente o separadamente con el inhibidor de FNT. En forma ventajosa, se puede utilizar una combinación de un anticuerpo de IL-18 o antisuero y un receptor soluble de FNT, con actividad inhibitoria de FNT. En una modalidad preferida de la invención, el medicamento comprende además un inhibidor de COX, preferentemente un inhibidor de COX-2. Los inhibidores de COX son conocidos en la técnica. Los inhibidores de COX-2 se revelan en WO 01 00229, por ejemplo. Los inhibidores de tromboxano, en particular tromboxano A2, son en la actualidad ampliamente utilizados para el tratamiento de aterosclerosis. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, el medicamento comprende además un inhibidor de tromboxano, y en particular, un inhibidor de tromboxano A2, para uso simultáneo, secuencial o separado. La aspirina es especialmente preferida para usarse en combinación con el inhibidor de IL-18, de acuerdo con la invención. Una de las causas de aterosclerosis parece ser una alta concentración de lípidos en la sangre. Por lo tanto, en otra modalidad preferida, el medicamento comprende también un agente reductor de lípídos para uso simultáneo, secuencial o separado. Cualquier agente reductor de lípidos conocido en la técnica puede ser utilizado de acuerdo con la invención. Otros agentes reductores del nivel de grasas comprenden medicamentos tales como colestiramina, colestipol, ácido nicotínico, gemfibrozil, probucol y otros. En especial se prefieren los inhibidores de reductasa CoA HMG, en preferentemente las así llamadas estatlnas. Muchas estatinas son conocidas en la técnica, tal como simvastatina o lovastatina. A fin de impedir y/o tratar aterosclerosis aún mejor, una modalidad preferida de la invención se refiere al uso de un inhibidor de IL-18 en combinación con una dieta baja en grasas y/o bajas en colesterol y/o baja en sales. En una modalidad preferida de la presente invención, un Inhibidor de IL-18 se utiliza en una cantidad de alrededor de 0.0001 a 10 mg/kg de peso del cuerpo, o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg de peso del cuerpo 0 alrededor de 0.1 a 3 mg/kg de peso del cuerpo o alrededor de 1 a 2 mg/kg de peso del cuerpo. En otra modalidad preferida, el inhibidor de IL-18 se utiliza en una cantidad de alrededor de 0.1 a 1000 µg/kg de peso del cuerpo o 1 a 100 µg/kg de peso del cuerpo o alrededor de 10 a 50 µg/kg de peso del cuerpo. La invención se refiere además al uso de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18 en la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de aterosclerosis. Un enfoque terapéutico por genes se usa de este modo para tratar y/o prevenir la enfermedad. En forma ventajosa, la expresión de un inhibidor de IL-18 estará entonces in situ, y de ese modo bloqueará en forma eficiente al IL-18 directamente en el tejido o células afectadas por la enfermedad. Tal como se explica en detalle en los ejemplos a continuación, se ha demostrado que una expresión eficiente de IL-18BP podría demostrarse en un modelo murino de la enfermedad luego de electrotransferencia de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de IL-18BP. Por lo tanto, en una modalidad preferida, el vector de expresión es administrado por electrotransferencia, preferentemente por vía intramuscular.

El uso de un vector para inducir y/o mejorar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula normalmente silenciosa para la expresión de un inhibidor de IL-18, o que expresa cantidades del inhibidor que no son suficientes, se encuentran también contemplados de acuerdo con la invención. El vector puede comprender secuencias reguladoras funcionales en las células que se desea que expresen el inhibidor de IL-18. Tales secuencias reguladoras pueden ser, por ejemplo, promotoras o mejoradoras. Estas secuencias reguladoras pueden ser entonces introducidas en el lugar correcto del genoma por recombinación homologa, y de ese modo unir en forma operable a la secuencia reguladora con el gen, cuya expresión debe ser inducida o mejorada. La tecnología en general es denominada "activación de gen endógena" (EGA), y se describe, por ejemplo, en WO 91/09955. Un experto en la técnica entenderá que también es posible interrumpir la expresión de IL-18 utilizando la misma técnica, es decir, introduciendo un elemento de regulación negativo, tal como, por ejemplo, un elemento silenciador, en el lugar del gen de IL-18, llevando así a la reducción o prevención de la expresión de IL-18. El experto en la técnica entenderá que dicha reducción o silenciamiento de la expresión de IL-18 tiene el mismo efecto que el uso de un inhibidor de IL-18 a fin de impedir y/o tratar la enfermedad. La invención se refiere además al uso de una célula que ha sido genéticamente modificada para producir un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de aterosclerosis.

La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas particularmente útiles para la prevención y/o tratamiento de aterosclerosis, que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-18 y una cantidad terapéuticamente efectiva de un interferón. Como inhibidor de IL-18, la composición puede comprender inhibidores de caspase-1 , anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades de receptor de IL-18, inhibidores del pasaje de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, y proteínas de unión de IL-18, ¡soformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados permutados círcularmente de los mismos que poseen la misma actividad. 1L-18BP y sus ¡soformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados permutados circularmente tal como se describió anteriormente son los ingredientes activos preferidos de las composiciones farmacéuticas. El interferón comprendido en la composición farmacéutica es preferentemente IFN-ß. En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende cantidades terapéuticamente efectivas de un inhibidor de IL-18, opcionalmente un interferón, y un antagonista de FNT. Los antagonistas de FNT pueden ser anticuerpos que neutralizan la actividad de FNT, o fragmentos receptores de FNT truncados solubles, también llamados TBPI y TPBII. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede además comprender uno o más inhibidores de COX, preferentemente inhibidores COX-2. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede comprender un inhibidor de tromboxano, tal como aspirina, y/o un agente reductor de lípidos tal como estatina. La definición de "farmacéuticamente aceptable" comprende cualquier vehículo, que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico al huésped al cual es administrado. Por ejemplo, para la administración parenteral, la proteína activa puede formularse en una unidad de dosis para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringer. Los ingredientes activos de la composición farmacéutica de conformidad con la invención pueden administrarse a un individuo en una variedad de formas. Las rutas de administración incluyen rutas intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica, e intranasal. Se puede usar cualquier otra ruta eficaz de administración, por ejemplo, adsorción a través de tejidos epiteliales o endoteliales o por terapia génica, en donde la molécula de ADN que codifica el agente activo es administrada al paciente (por ejemplo, por medio de un vector) que hace que el agente activo sea expresado y secretado in vivo. Además, las proteínas de acuerdo con la invención pueden administrarse junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como agentes tensioactivos farmacéuticamente aceptables, excipientes, vehículos, diluyentes y vehículos.

Para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), las proteínas activas pueden formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, solución salina, solución de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o estabilidad química (por ejemplo, conservadores y reguladores de pH). La formulación es esterilizada por técnicas comúnmente utilizadas. La biodísponibilidad de la proteína activa de acuerdo con la invención también puede ser reducida utilizando los procedimientos de conjugación que aumentan la vida media de la molécula en el cuerpo humano, pro ejemplo, uniendo la molécula a polietilenglicol, según se describe en la solicitud de patente PCT WO 92/13095. Las cantidades terapéuticamente efectivas de la proteína activa serán una función de muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, la afinidad del antagonista para IL-18, cualquier actividad citotóxica residual exhibida por los antagonistas, la vía de administración, la condición clínica del paciente (incluyendo la conveniencia de mantener un nivel no tóxico de actividad de IL-18 endógena. "Una cantidad terapéuticamente efectiva" es aquella que cuando es administrada, el inhibidor de IL-18 produce la inhibición de la actividad biológica de IL-18. La dosis administrada, como dosis única o múltiple, a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo las propiedades farmacocinéticas del inhibidor de IL-18, la vía de administración, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso del cuerpo, salud, tamaño), intensidad de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y manipulación de las dosis establecidas se encuentran dentro de la capacidad de un experto en la técnica, así como los métodos in vitro o in vivo para determinar la inhibición de IL-18 en un individuo. De acuerdo con la invención, el inhibidor de IL-18 se usa en una cantidad de alrededor de 0.0001 a 10 mg/kg o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg o peso del cuerpo, o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg de peso del cuerpo o alrededor de 0,1 a 3 mg/kg de peso del cuerpo o alrededor de 1 a 2 mg/kg de peso del cuerpo. Otras cantidades preferidas de los inhibidores de IL-18 son cantidades de alrededor de 0,1 a 1000 µg/kg de peso del cuerpo o alrededor de 1 a 100 µg/kg de peso del cuerpo o alrededor de 10 a 50 µg/kg de peso corporal. La vía de administración que se prefiere de acuerdo con la invención es la administración por vía subcutánea. La administración intramuscular es además preferida de acuerdo con la invención. En otras modalidades preferidas, el inhibidor de IL-18 se administra diariamente o un día sí y otro no. Las dosis diarias generalmente se dan en dosis divididas o en forma de liberación sostenida efectiva para obtener los resultados deseados. Las administraciones segunda y subsiguientes pueden realizarse a una dosis que es igual, menor o mayor a la dosis inicial o anterior administrada al individuo. Una administración segunda o subsiguiente puede administrarse durante o con anterioridad al inicio de la enfermedad. De acuerdo con la invención, el inhibidor de IL-18 puede administrarse profilácticamente o terapéuticamente a un individuo con anterioridad o simultáneamente o secuencialmente con otros regímenes terapéuticos o agentes terapéuticos (por ejemplo, regímenes de droga múltiples), en una cantidad terapéuticamente efectiva. Los agentes activos que son administrados simultáneamente con otros agentes terapéuticos pueden administrarse en la misma composición o diferentes composiciones. La invención se refiere además a un método de tratamiento y/o prevención de aterosclerosis que consiste en administrar a un huésped que lo necesite una cantidad inhibitoria efectiva de un inhibidor de IL-18. La invención se refiere además a un método de prevención y/o tratamiento de aterosclerosis que consiste en administrar a un huésped que lo necesite un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación e un inhibidor de IL-18. En las modalidades preferidas de la invención, el vector de expresión se administra sistémicamente, y en forma más preferida, por inyección intramuscular. La invención se refiere además al uso de IL-18 como un marcador de diagnóstico para un mal pronóstico clínico en insuficiencia cardiaca. El mal pronóstico clínico comprende cualquier empeoramiento del estado del paciente, tal como episodios recurrentes, o incluso la muerte, luego del primer infarto de miocardio. En forma preferida, IL-18 se utiliza como un marcador de diagnóstico de episodios recurrentes luego de un primer episodio de insuficiencia cardiaca. Los episodios recurrentes incluyen, sin limitarse a ello, isquemia recurrente, re-vascularización, progresión de aterosclerosis o rehospitalización por insuficiencia cardiaca. Luego de describir la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante los siguientes ejemplos que se proveen a modo de ilustración y que no están destinados a limitar la presente invención.

EJEMPLOS Material y métodos Muestras Se recolectaron cuarenta placas ateroscleróticas humanas retiradas de 36 pacientes que fueron sometidos a endarterectomía de carótida. Para los controles, se obtuvieron 2 arterias carótidas y 3 mamarias internas libres de aterosclerosis (2 con engrosamiento fibromuscular mínimo) en autopsia durante cirugía de derivación coronaria. Fueron rápidamente sumergidas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Las placas que se utilizaron para extracción de proteína y ARN fueron rápidamente lavadas, sumergidas en nitrógeno líquido antes de ser almacenadas a -80°C. Para los estudios inmunohistoquímícos, las placas se colocaron durante 2 horas en paraformaldehído al 4% fresco, luego se transfirieron a una solución de sacarosa-PBS al 30% antes de ser congeladas en medio de procesamiento de tejido a temperatura de corte óptima (O.C.T. Compound, Miles Inc. División Diagnósticos) con nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C para seccíonamiento crioestático. Las diversas secciones de 8-µm a 10-µm se obtuvieron para cada muestra para análisis histológico y estudios inmunohistoquímicos.

Clasificación de pacientes A fin de estudiar la relación potencial entre la expresión de IL-18/IL-18BP y los signos de inestabilidad de placa, recolectamos en una forma en prospectiva y a ciegas, datos clínicos de 23 pacientes consecutivos (entre 36) que fueron sometidos al procedimiento de endarterectomía entre mayo y agosto de 2000. La presencia o ausencia de una úlcera intra-placa en el examen macroscópico fue sistemáticamente informada por el cirujano que realizó el procedimiento de endarterectomía. Esto nos permitió clasificar las placas como placas ulceradas y placas no ulceradas. Además, los pacientes fueron clasificados de acuerdo a los síntomas clínicos en dos grupos separados. Los pacientes que se presentaron con síntomas clínicos de ataque isquémico cerebral relacionado con la estenosis de carótida fueron clasificados como sintomáticos. La endarterectomía se realizó 2-66 días (17,6 + 5,3 días) luego del inicio de los síntomas clínicos en estos pacientes. Los pacientes que nunca experimentaron síntomas de isquemia cerebral en el territorio de arteria carótida se clasificaron como asintomáticos. La estenosis de carótida asintomática fue detectada sobre la base de examen clínico sistemático de pacientes con enfermedad coronaria o periférica, y su severidad fue determinada utilizando ecografía de Doppler por un ecografista autorizado y con experiencia. Aunque los pacientes asintomáticos nunca tuvieron un episodio isquémico en el territorio de estenosis de carótida, la endarterectomía de carótida se ha demostrado como benéfica en estos pacientes, tal como lo muestran los Investigadores (28) del Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study (ACAS) (Estudio de aterosclerosis de carótida asintomática).- Análisis de Western Blot Se extrajeron proteínas de 12 placas ateroscleróticas y arterias normales de control. Las muestras congeladas fueron pulverizadas en nitrógeno líquido. Los polvos fueron resuspendidos en regulador de pH de lisis de hielo-frío [20 mmoles/L de Tris-HCl, pH de 7,5, 5 mmoles/L de EGTA, 150 mmoles/L de NaCI, 20 mmoles/L de glicerofosfato, 10 mmoles/L de NaF, 1 mmoles/L de ortovanadato de sodio, 1% de Tritón X-100, 0.1% de Tween 20, 1 µg/mL de aprotinina, 1 mmoles/L de PMSF, 0.5 mmoles/L de cetona de clorometilo N-tosil-L-fenilalanina (TPCK), 0.5 mmoles/L de cetona de clorometilo N(a)-p-tosil-L-lisina (TLCK) a una relación de 0.3 mL/10 mg de peso mojado. Los extractos fueron incubados en hielo durante 15 minutos y luego centrifugados (12 000 g, 15 minutos, 4°C). Las fracciones de sobrenadante solubles en detergente fueron retenidas, y las concentraciones de proteína en muestras fueron ecualizadas utilizando un ensayo de proteína Bio-Rad. A fin de realizar los ensayos de Western Blot para IL-18 y IL- 18R, los extractos de proteína se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamina al 7,5% o 15%. Para IL-18BP, rhlL-18 purificado a partir de E.Coli (Serono Pharmacuetical Research Institute, Ginebra) se acopló a Affllgel 15 (Biorad) a 1 mg/ml de resina de acuerdo con el protocolo de fabricación. El extracto de proteína (60 µg) se incubó durante toda la noche a 4°C en un rodillo con 20 µm de resina ajustada a 500 µl de PBS 0,05% Tween. A fin de retirar cualquier unión no específica, la resina fue centrifugada y lavada con 10 mM de Tris pH 8, 140 mM de NaCI, 0.5% de Triton-X-100 (Fluka), 0.5% de deoxicolato, luego con 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCI, 0.05 % de TX100, 0.05% de nonidet P40 (Fluka), 2 mM de CHAPS (Boehringer, Mannheim) seguido por un último lavado con 50 mM de Tris pH 8. La resina fue luego centrifugada, resuspendida en regulador de pH de muestra en condiciones reducidas, hervida durante 5 minutos y finalmente cargada en un gel NuPAGE de SDS-poliacrilamlda al 10% (Invitrogen). Las muestras fueron electroforéticamente transferidas a partir de geies de poliacrilamida en nitrocelulosa. Las membranas de nitrocelulosa fueron saturadas durante 2 horas a temperatura ambiente en TBST [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 250 mmol/L de NaCI, y 0.1% de Tween salina] que contenía 5% de leche seca libre de contenido graso. Las membranas fueron luego incubadas con anticuerpos policlonales de IL-18 e IL-18R (cadena a) anti-humanos de cabra (1 µg/ml) (R & D Systems), anticuerpo monoclonal de IL-18BP anti-humano de ratón (Mab 657.27 a 5 µg/ml) (Corbaz y otros, manuscrito 2000 presentado), anticuerpo policlonal de caspasa-1 anti-humano de conejo (1 µg/ml)(A-9, Santa Cruz). La especificidad de Mab 657.27 se analizó sobre membrana separada mediante competencia utilizando un exceso de 200 x molar de rhlL-18BP-6his (purificado de células ováricas de hámster chino, Serono Pharmaceutical Research Institute) co-incubado con el Mab 657.27 a 5 µg/ml durante 1 hora. Luego de la incubación con anticuefos correspondientes conjugados de HRP, se utilizaron sustratos quimioluminiscentes (ECL, Western Blotting; Amersham Corp) para revelar bandas positivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y las bandas se visualizaron luego de exposición a Hyperfilm ECL (Amersham Corp).

Inmunohistoquímica Las secciones congeladas de 6 placas ateroscleróticas fueron incubadas con 1 :10 de suero de caballo normal o 1 :10 suero de cabra normal durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron una vez en PBS, luego se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón primario contra CD68 para identificación de macrófago (DAKO-CD68, KP1), o un anticuerpo monoclonal de ratón primario contra a-actina de músculo listo humano (1A4, DAKO) para identificación de células de músculo liso. Para identificar a IL-18 y al receptor de IL-18 dentro de las placas ateroscleróticas, se utilizaron anticuerpos policlonales de cabra específicos (R & D Systems) como una dilución de 5 µg/mL. Se detectó IL-18BP mediante el uso de un anticuerpo monoclonal específico dirigido contra isoforma a de IL-18BP humano recombinante (H20) (Corbaz y otros, manuscrito 2000 presentado). Luego de lavar en PBS, las muestras se incubaron con los siguientes anticuerpos biotinilados secundarios: IgC (Vector) anti-ratón de caballo biotinilado a una dilución de 1 :200 para detección de tinciones con anticuerpos contra CD68, a-actina de músculo liso e IL-18 BP, y un IgG (Vector) anti-cabra de caballo biotinilado a una dilución de 1:200 para detección de anti-IL-18 y anticuerpos de receptor de anti-IL-18. Las inmunotiniciones fueron visualizadas con el uso de sistema de visuallzación HRP aviden-biotina (Vectastain ABC PK-6100 Vector). Para los controles negativos, se tiñeron secciones adyacentes con anticuerpos irrelevantes de isotipos correspondientes en lugar de los anticuefos primarios.

Preparación de ARN El ARN total fue extraído de 29 placas ateroscleróticas en una solución de tiocinato de guanidio ácido y se extrajo con fenol y cloroformo de acuerdo con el método de Chomczynski y Sacchi (29). El ARN purificado se disolvió en agua y la concentración se midió por absorbencia a 260 nm. La integridad de ARN se determinó por electroforesis en geles de agarosa al 1%. El ADNc fue sintetizado a partir de 1 µg de ARN total utilizando el sistema de transcripción inversa Promega de acuerdo con el protocolo del fabricante.

PCR de tiempo real y seml-cuantitativo de IL-18 e 1L-18BP humano en placas ateroscleróticas humanas Las reacciones de PCT semi-cuantitativas se realizaron en un volumen total de 50 µl en presencia de 1 U de AmpliTaq ADN Polymerasa (Perkin Elmer, Roche, Estados Unidos de América), 2.5 mM de dNTPs (Amersham, Estados Unidos de América), y 50 pmoles de iniciadores (primers) de PCR hacia delante y de sentido inverso. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, Estados Unidos de América) en las siguientes condiciones: desnaturación 1 min a 94°C, cocción. durante 1 minutos a 55°C y extensión durante 1 minuto a 72°C. Para asegurar la comparación de la cantidad de productos de PCR durante la fase lineal de la reacción de PCR, se analizaron IL-18BP , IL-18 y ß-actina luego de los ciclos 25, 28 y 31. Se determinó el número óptimo de ciclos para IL-18BP, IL-18 y ß-actina antes de la saturación de las bandas (31 , 28 y 25, respectivamente). Los iniciadores de PCR fueron diseñados en base a las secuencias publicadas (AF110799, D49950, X00351), de la siguiente manera: IL-18, 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3' Inverso; 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3' hacia adelante; IL18BP, 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3' hacia adelante; 5'- GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3' inverso; ß-actina, 5'- GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3' inverso; 5'- GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3' hacia adelante. Para excluir la amplificación de ADN genómico potencial que contamina las muestras, se realizaron las reacciones de PCR en ausencia del patrón de ADNc. Los productos de PCT (10 µl) se analizaron en geles de agarosa al 1% sometidos a electroforesis en amortiguador 1 x TAE. El tamaño de los productos de PCR se verificó por comparación con una escalera de 1 kb (Gibco) seguida por tinción de los geles. La cuantificación relativa de bandas teñidas con etidio-bromuro se realizó bajo luz UV utilizando el software analítico de Kodak Digital Sciences, y se informó como la relación de gen determinado como objetivo (hiL-18BP, hlL-18) al gen de preparación (hß-actina). Los Iniciadores de PCR de Tiempo Real Verde SYBR para IL-18, IL-18BP y GAPDH (control de preparación) se diseñaron utilizando el software Primer Express de PE Biosystems de acuerdo con las secuencias publicadas (AF110799, D49950, NM 002046) de la manera siguiente: IL-18, 5'-CAGCCGCTTTAAGCAGCCA-3' inverso; 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC- 3' hacia adelante; IL18BP, 5'- AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3' hacia adelante; 5'-GAPDH, 5'-GATGGGAATTTCCATTGATGACA-3' en sentido inverso; 5'- CCACCCATGGCAAATTCC-3' hacia adelante; intrón-GAPDH, 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3' en sentido inverso; 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3' hacia adelante. La especificidad y la concentración de ¡niciador óptima fueron sometidas a prueba. La contaminación de ADN genómica potencia fue excluida mediante la realización de reacciones de PCR con iniciadores de intron-GAODH específicos. La ausencia de amplificación no específica se confirmó mediante análisis de los productos de PCR mediante electroforesis de gel de agarosa al 3.5%. Se realizó PCR de Tiempo Real Verde (Green Real Time) SYBR con 5 µl/receptáculo de RT-productos (0.5 ng total de ARN), 25 µl/receptáculo de mezcla maestra PCR Verde SYBR (PE Biosystem, CA, Estados Unidos de América) con AmpErase Uracil N-gl¡cosilato (UNG) (0,5 Unidad/receptáculo) y 20 ul de Iniciadores (300 mM). Se realizó PCR a 50°C durante 2 minutos (para incubación UNG AmpErase para retirar cualquier uracilo incorporado en el ADNc), 95°C durante 10 minutos (para activación AmpliTAq Gold) y luego se ensayó durante 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 minuto en el Sistema de Detección ABl PRISM 7700. Las muestras de ADNc transcritas en forma inversa fueron de ese modo amplificadas y se determinaron sus valores Ct (umbral de ciclo). Todos los valores de Ct fueron normalizados con el GAPDH de gen de preparación. Una banda de ADN específica única para IL-18, IL-18BP y GGAPDH se observó utilizando análisis de electroforesis de gel. El principio de detección de tiempo real utilizando la "mezcla maestra PCT Verde SYBR" se basa en la detección directa del producto PCR midiendo el aumento de fluorescencia causado por la unión de colorante verde SYBR al ADN de enlace doble.

Análisis estadístico Los datos fueron expresados como medio + SEM. Los niveles de IL-18 fueron comparados entre los grupos utilizando el ensayo d eMann-Whltney. Un valor de p 0.05 fue considerado estadísticamente importante.

EJEMPLO 1 Protección por inhibidores de IL-18 a partir de muerte de células endoteliales inducida por lipoproteínas oxidadas (oxLDL) Las células endoteliales de vena umbilical humana cultivadas (HUVECs) fueron expuestas durante 16 horas a oxLDL en presencia o ausencia de proteína de unión de IL-18 o anticuerpo anti-ll-18. Tai como se muestra en la Figura 1 , el 83% de HUVECs murieron luego de la exposición a oxLDL. La co-incubación con IL-18BP o anticuerpo anti-IL-18 rescató casi totalmente a las células de la muerte. No se observaron muertes utilizando IL-18BP. El 89% de las células sobrevivieron utilizando el anticuerpo anti-ll-18. Este experimento muestra claramente el efecto protectivo de dos inhibidores de IL-18 diferentes contra ja muerte de células debido a apoptosis dentro de la placa aterosclerótica EJEMPLO 2 Expresión de proteína de IL-18 y su inhibidor endógeno IL-18 BP en placas ateroscleróticas Los ensayos de Western Blott se realizaron sobre extracto de proteína a partir de 12 arterias ateroscleróticas carótidas y 5 controles normales. La proteína de IL-18, incluyendo la forma activa, fue altamente expresada en todas las placas aterpscleróticas, mientras que no se detectó expresión o a un nivel bajo en arterias normales (figura 2). Las líneas 1 a 4 contienen muestras de placas ateroscleróticas, las líneas 5 a 7 de arterias normales. En forma interesante, la detección de la forma activa de IL-18 pareció co-relacionarse con la expresión de la forma activa de caspasa-1 , que está comprendida en el procesamiento de IL-18 (figura 2, cuarta hilera). La expresión importante de la proteína de receptor de IL-18 (la cadena a) fue también detectada en todas las placas ateroscleróticas en comparación con un nivel muy bajo de expresión en arterias normales (figura 2, segunda hilera). Además, una mayoría de placas ateroscleróticas expresaron IL-18BP aunque el nivel de expresión fue heterogéneo (figura 2, primera hilera).

EJEMPLO 3 Localización celular de proteína de IL-18 y su inhibidor endógeno IL- 18BP en placas ateroscleróticas A fin de determinar la localización celular de IL-18 e IL-18BP, los estudios inmunohistoquímicos se realizaron sobre 6 placas ateroscleróticas de carótida. Tal como se muestra en la figura 2, IL-18 fue principalmente expresado en macrófagos, en donde estas células son probablemente la principal fuente de IL-18 en la placa (no se muestra). Estas áreas fueron también ricas en linfocitos CD3-positivos. Sin embargo, los linfocitos T no parecieron estar directamente comprendidos en la producción de IL-18. IL-18 también se expresó en algunas células de músculo liso internas y en células endoteliales ocasionales. En contraste, la expresión significativa de IL-18BP fue detectada en células endoteliales de microvasos de placa y en aquellas de superficie luminal, aunque la expresión no se encontró en todos los vasos. También se detectó una expresión de IL-18 BP relativamente baja y más heterogénea, principalmente de tipo extracelular, en algunas áreas ricas en macrófagos.

EJEMPLO 4 Expresión de transcritos de ARNm IL-18BP e IL-18 en placas ateroscleróticas y relación con la inestabilidad de placa A fin de determinar si se expresaron ARNm IL-18BP e IL-18 humanos en placas ateroscleróticas de carótida humanas, se realizó RT-PCR semi-cuantitativo en seis placas ateroscleróticas (figura 3). Se detectaron ARNm IL18BP e IL-18 en todas las placas ateroscleróticas aunque la cantidad de ARNm para IL-18 e IL-18BP fue heterogénea. Por lo tanto, a fin de cuantificar en forma exacta los niveles de expresión de ARNm de IL-18 e IL-18BP, se analizaron otras 23 placas ateroscleróticas con el método PCR de Tiempo Real Verde SYBR (figura 4). Las placas fueron caracterizadas por examen clínico y patológico como placas sintomáticas (inestables) y asintomáticas (estables) que contenían o no úlcera macroscópica. Las características clínicas de los pacientes se resumen en el cuadro 4. El porcentaje de reducción de diámetro de carótida (60%-95%) y los factores de riesgo, incluyendo la edad, diabetes, hipercolesterolemia, hipertensión y tabaquismo no se diferenciaron entre los dos grupos.

CUADRO 4 Características del paciente Pacientes asintomáticos Pacientes sintomáticos (n=9) (n= 14) Edad 66.9 + 4.0 70.2 + 3.9 Sexo Masculino (8) Masculino (9) Hipertensión2 8 9 Hipercloleste- 4 8 rolemia3 Diabetes 3 1 Actualmente 7 8 fumador Enfermedad 5 4 de arteria coronaria 1 Estos pacientes presentaron ataque cerebral isquémico transitorio o persistente 2-66 días antes de la endarterectomía. 2EI número de pacientes con hipertensión clínica tratado con agentes antihipertensivos. 3Número de pacientes con hipercolesterolemia tratados con drogas de reducción de lípidos. Se encontró que la cantidad de IL-18 aumentó en los sintomáticos comparada con las placas ateroscleróticas asintomáticas (2,03 ± 0.5 contra 0.67 ± 0.17, respectivamente) (figura 4A). El análisis estadístico demostró que este aumento en producción de IL-18 observado en las placas sintomáticas fue muy significativo (p< 0.0074), mientras que la cantidad aumentad de IL-18BP observada en las placas sintomáticas contra las placas asintomáticas no lo fue (4.54 ± 0.98 contra 2,5 ± 0,92, respectivamente) (figura 4B). En otros términos, aunque ambos grupos sintomáticos y asintomáticos demostraron una correlación positiva entre ARNm de IL-18 e IL-18BP, las curvas de pendientes fueron significativamente diferentes entre los 2 grupos (grupo sintomático: curva de pendiente 1.16 [0.18-2.14], r2 = 0,36 contra grupo asintomático: curva de pendiente 4.79 [2.39-7.20], r2 = 0.76; p < 0.05). Por lo tanto. Parece que el aumento relativo en expresión de IL-18BP en el grupo sintomático no es lo suficiente para compensar el aumento en expresión de IL-18. Además, como la presencia de ulceración es considerada como una característica de inestabilidad en las placas, el análisis estadístico se realizó además sobre placas sin o con úlceras intra-placa y demostró un aumento importante de 1L-18 en las placas que presentaban úlceras (p< 0.018) (figura 4C). Estos datos muestran que el aumento en expresión de IL-18 encontrado en las placas ateroscleróticas se co-relaciona con la inestabilidad de la placa.

EJEMPLO 5 IL-18BP modula el desarrollo y estabilidad de lesión aterosclerótica en un modelo in vivo de la enfermedad Métodos Características del paciente Se obtuvieron muestras de plasma de pacientes con síndromes coronarios isquémicos agudos (angina inestable e infarto de miocardio), menos de 7 días después de la iniciación de los síntomas. La angina inestable fue definida como la asociación de dolor de pecho típico con otros cambios isquémicos en el electrocardiograma o la presencia de enfermedad de arteria coronaria. El infarto de miocardio fue diagnosticado sobre la base de cambios isquémicos típicos en el electrocardiograma asociados con importantes aumentes en enzimas miocardiales (fosfocinasa de creatina y troponina I) en la sangre en circulación. Los pacientes no isquémicos fueron reclutados en el mismo departamento cardiológico y estuvieron completamente libres de signos isquémicos. Los niveles de plasma de IL-18 humano se determinó utilizando un equipo comercialmente disponible (MBL, Japón).

Electrotransferencia intramuscular in vivo de plásmido de expresión IL-18BP murina Catorce ratones C57BL/6 apoE KO machos, de 14 semanas de edad, recibieron 3 inyecciones a un intervalo de 3 semanas con el plásmido de expresión IL-18BP, pADNc3-IL18BP. A los ratones de control (n= 19) se ¡nytectó el plásmido vacío de control. ADN de isoforma d de IL-18BP murina aislado, tal como se describe (número de acceso Q9ZOM9) (23) fue subclonado en los sitios EcoR1/Not1 de pADNc3 de vector de expresión de célula de mamífero bajo el control del promotor citomegalovirus (Invitrogen). La construcción, denominada 334.yh, se muestra en la figura 5. El plásmído de control fue una construcción similar sin el ADNc terapéutico. El IL-18BP o plásmido de expresión de control (60 µg) fue inyectado en ambos músculos craneales tibiales de ratón anestesiado, tal como se describió anteriormente (13). En breve, los pulsos eléctricos transcutáneos (8 pulsos eléctricos de onda cuadrada de 200 V/cm, 20 msec de duración a 2 Hz) fueron suministrados por un electropulsador PS-15 (Genetronics, Francia), utilizando dos electrodos de placa de acero inoxidable colocadas 4.2 a 5.3 mm de separación, en cada lado de la pierna. mlL-18-BP. ELISA Las placas fueron revestidas durante toda la noche con anticuerpo policlonal de conejo purificado de afinidad r-mll-18BPd (5 µg/receptáculo). Se detectó mlL-18BP soluble utilizando un anticuefo policlonal de conejo biotinilado (0.3 µg/ml) llevado contra E.coli ML-18BP (Peprotec) seguido por peroxidasa de extravidina (1/1000) (Sigma). El anticuefo policlonal de conecto de captura se sometió a análisis de Western Blott a fin de confirmar la especificidad de mlL-18BP. El mlL-18BPd recombinante producido por células HEK 293 se utilizó como patrón. La sensibilidad de ELISA fue de 5 ng/ml.

Análisis de ratones Se obtuvieron secciones de criostato (8 µm) del seno aórtico y se utilizaron para detección de deposición de lípídos utilizando rojo aceite, la detección de colágeno utilizando rojo Sirius y para análisis inmunohistoquímico según se describió anteriormente (13) Las secciones fueron teñidas con anticuerpos primarios específicos: macrófago anti-ratón, MOMA2 de clon (BioSource) anti-alfa-actina alcalina-conjugada de fosfatasa para células de músculo liso y anti-CD3 para linfocitos T (Dako) tal como se describió anteriormente (13). La detección de muerte celular se realizó utilizando la técnica TÚNEL (13). Las células positivas CD3 fueron contadas microscópicamente a ciegas. Las placas ateroscleróticas en el seno aórtico y áreas aórticas que se tiñeron como positivos para macrófagos, células de músculo liso, colágeno o TÚNEL, se midieron utilizando cuantificación de imagen asistida por computadora (NS 15000, Microvision), tal como se describió anteriormente (13). La tinción con inmunoglobulinas compatibles con isotipo no inmune determinó la especificidad de la inmunotinción. La especificidad de TNEL se determinó por omisión de la enzima deoxinucleotidilo transferasa terminal. Las aortas torácicas, que se expanden desde la arteria subclavia izquierda hasta las arterias renales, se fijaron con formalina regulada en su pH al 10% y se tiñeron para deposición de lípidos con rojo Aceite. Después se abrieron en forma longitudinal y el porcentaje de deposición de lípidos se calculó utilizando cuantificación por imagen asistida por computadora (NS 15000, Microvision).

Resultados En el presente estudio, se puso a prueba la hipótesis de que la regulación de IL-18/IL-18BP desempeña un papel crítico en aterogenesis y la estabilidad de placas. Se midieron los niveles de plasma de IL-18 en pacientes con síndromes coronarios agudos (30 paceintes de sexo masculino, 18 pacientes de sexo femenino, edad media 66.2 ± 1.6 años de edad, de los cuales 14 tenían angina inestable y 34 tenían infarto miocardial) y en pacientes de control no isquémico reclutados en el mismo departamento cardiológico (10 pacientes de sexo masculino, 3 pacientes de sexo femenino, edad media 60.0 ± 5.2 años). Los niveles de plasma de IL-18 fueron significativamente elevados en pacientes coronarios agudos comparados con los controles (148.9 ± 17.1 contra 73.0 ± 12.2 pg/ml, respectivamente, p< 0.06) en contraste con los niveles circulantes de IL-18BP que fueron levemente aumentados (20.1 ± 2.7 contra 7.5 ± 2.5 ng/ml, respectivamente, p = 0.06). Además, los niveles de IL-18 correlacionados con la severidad de la enfermedad a los niveles más altos se observaron en los pacientes con disfunción cardíaca isquémica severa y signos clínicos de edema pulmonar (224.03 ± 39.1 pg/ml, p < 0.001 comparado con los controles). Estos resultados obtenidos de pacientes con enfermedad coronaria aguda, junto con las observaciones anteriores de que IL-18 es elevado en placas ateroscleróticas de pacientes con ataques (Mallat, 2001), sugieren una función potencialmente importante de la regulación de IL-18/IL-18BP en el proceso ateroesclerótico. Por lo tanto, los inventores de la presente probaron esta hipótesis utilizando ratones apoE Knockout (KO) que espontáneamente desarrollan lesiones ateroscleróticas similares a las de los humanos. Catorce ratones de 14 semanas de edad y machos recibieron complementación de IL-18BP a través de electrotransferencia intramuscular in vivo o ADN de plásmido de expresión que codifica IL-18BPd murina, mientras que 19 controles de edad correspondiente recibieron el plásmido vacío. La electrotransferencia de plásmido fue repetida cada 3 semanas y los ratones fueron sacrificados a las 23 semanas de edad luego de 9 semanas de tratamiento. Los niveles de IL-18BP murina en el plasma fueron inferiores a los límites de detección (5 ng/ml) en ratones apoE KO inyectados con el plásmido vacío. Sin embargo, una inyección única de plásmido de IL-18BP produjo altos niveles de IL-18BP en la sangre con un aumento máximo 2 días después de la inyección (323.5 ± 100.9 ng/ml) y 127.4 ± ng/ml medido luego de 2 semanas. Luego de 9 semanas de tratamiento con IL-18BP o plásmido vacío, el colesterol total (489.4 ± 34.6 contra 480.8 ± 36.3mg/dl, respectivamente) y los niveles de suero de lipoproteina de alta densidad (52.3 ± 9.4 contra 48.8 ± 5.1 mg/dl, respectivamente) no fueron diferentes entre los 2 grupos Un aumento modesto pero importante en el peso del animal se observó en el grupo tratado con IL-18BP en comparación con el grupo de control (31.8 ± 0.9 contra 28.5 ± 0.8 g, respectivamente, p< 0.05). El resultado de la complementación de IL-18BP en aterosclerosis fue examinado en 2 diferentes lugares: la aorta torácica descendente y el seno aórtico. La aorta torácica fue seleccionada para determinar el rol de IL-18BP en el desarrollo de ateromatosis (aterogenesis) ya que las lesiones ateroscleróticas torácicas se encuentran casi ausentes a la edad de 14 semanas (no se muestran los datos), en donde se inició la transfección de IL-18BP. El seno aórtico, en donde las lesiones ateroscleróticas ya se encuentran presentes a las 14 semanas de edad (no se muestran datos), se examinó con respecto a progresión y composición de placas avanzadas, un determinante importante de la estabilidad de placa. El tratamiento por IL-18BP de ratones apoE KO afectó significativamente el desarrollo y la progresión de la lesión aterosclerótica. El examen de la aorta torácica demostró una marcada reducción en la deposición de lípidos en ratones tratados con el plásmido IL-18BP comparado con el plásmido vacío (figura 6). El análisis cuantitativo de imagen asistido por computadora mostró el 69% de reducción en la extensión de lesiones ateroscleróticas (p < 0.0001) (figura 6), indicando una función permisiva crítica para IL-18 en aterogenesis. Además, el tratamiento con plásmido IL-18BP para solamente 9 semanas significativamente limitó la progresión de placas ateroscleróticas avanzadas en el seno aórtico (24% de reducción en tamaño de placa, p= 0.01) comparado con tratamiento con el plásmido vacío (figura 7). En forma más importante, la composición de lesiones avanzadas, un principal determinante de inestabilidad de placa, fue profundamente afectada por el tratamiento con IL-18BP. Las lesiones ateroscleróticas de ratones tratados con el plásmido de IL-18BP exhibieron una muy importante reducción del 50% en infiltración de macrófagos (p< 0.0001) (figura 8), contenían 67% menos de linfocitos T (p < 0,005) (figura 8), y demostraron un aumento de dos veces en acumulación de célula de músculo liso (p < 0.05) (figura 9). Además, estos importantes cambios en la composición celular de la lesión se asociaron con un importante aumento del 85% en contenido de colágeno (p < 0.0005) según se determina por tinción con rojo Sirius, y una reducción en el contenido total de lípidos. Por lo tanto, el tratamiento con IL-18BP atenuó considerablemente el proceso inflamatorio dentro de las lesiones ateroscleróticas e indujo a un proceso de curación característico de las placas ateroscleróticas estables. Además, la reducción marcada en el componente inflamatorio de las lesiones en ratones tratados con IL-18BP se asoció con una reducción sustancial en la ocurrencia de muerte celular dentro de las placas (2.9 ± 0.9% en ratones tratados con IL-18BP contra 10.5 ± 3.6 % en controles, p < 0.05), y por lo tanto se limita la expansión y la trombogenicidad del núcleo lípído acelular [Mallat, 1999].- Conclusiones Utilizando un modelo de ratón bien validado de aterosclerosis de tipo humana, los resultados informados anteriormente claramente establecen un papel insospechado y crucial para la regulación de 1L-18 e IL-18BP en el desarrollo, progresión y estabilidad de placa aterosclerótica. Aunque evitó la formación de la lesión temprana en la aorta torácica, la inhibición de la actividad de IL-18 por complementación de IL-18BP también afectó profundamente la composición de la lesión avanzada en el seno aórtico, induciendo a un cambio hacia un fenotipo de placa estable. El pronóstico clínico de un paciente con aterosclerosis depende solamente en parte del tamaño de las lesiones. En la actualidad, es ampliamente reconocido que la calidad (composición de placa), más que el tamaño, de ia lesión podría ser un indicio aún mejor de la ocurrencia de eventos isquémicos. En realidad, las manifestaciones clínicas severas de aterosclerosis (infartos de corazón y cerebro) se deben principalmente a la oclusión de lumen de vaso por un trombo formado en el contacto de una placa aterosclerótica rota (19). Los estudios patológicos han demostrado que las placas vulnerables o Inestables, que tienden a la ruptura o que se han roto, son ricas en células inflamatorias y exhiben una pérdida sustancial en contenido de célula de músculo liso y colágeno (20, 21). Además, tales placas muestran un aumento importante en muerte celular apoptótica que lleva a la formación de un núcleo de lípido altamente trombogénico (113, 22). Debe notarse que estos signos de inestabilidad de placa aumentada fueron marcadamente atenuados en ratones tratados con IL-18 BP, indicando que la señalización de IL-18 es un principal determinante de inestabilidad de placa. La relevancia de los resultados obtenidos en ratones apoE KO con respecto a la enfermedad humana se fortalece con nuestro descubrimiento de los niveles aumentados de IL-18 en circulación en pacientes con síndromes coronarios agudos y la producción aumentada de IL-18 en placas ateroscleróticas carótidas inestables responsables del ataque. Estos descubrimientos, tomados en forma conjunta, identifican a los inhibidores la actividad de IL-18 como herramientas terapéuticas importantes novedosas para impedir y tratar el desarrollo de placa aterosclerótica y para limitar las complicaciones de las placas.

EJEMPLO 6 Niveles elevados de IL-18 se correlacionan con los eventos recurrentes en pacientes con fallas cardíacas Los niveles de IL-18 se miden el suero sanguíneo de pacientes por ELISA con un anticuerpo específico de IL-18. Conjuntamente, se trataron 56 pacientes isquémicos y no isquémicos, con o sin insuficiencia cardiaca. En pacientes que murieron más tarde, los niveles de IL-18 fueron 216.0 ± 41.5 pg/ml contra 112.2 ± 12.2 pg/ml en pacientes sin resultado mortal (p = 0.0018). En pacientes con eventos recurrentes, tales como la muerte, isquemia recurrente, revascularización, progresión de aterosclerosis o re-hospitalización por fallas cardíacas, se midieron los siguientes niveles de IL- 18: 165.8 ± 23.8 contra 107.7 ± 14.6 en pacientes sin evento recurrente (p= 0.03). Estos resultados demuestran que los niveles de IL-18 son significativamente elevados en pacientes que poseen un mal pronóstico clínico, tal como eventos recurrentes o aún la muerte. Las muestras de sangre en 16 pacientes isquémicos, con o sin insuficiencia cardiaca, se midieron con respecto a sus niveles de IL-18. En estos pacientes que murieron más tarde, los niveles fueron 199.0 ± 34.8 pg/ml versus 95.3 ± 20.4 pg/ml en aquellos pacientes que sobrevivieron (p = 0.09). Pacientes con cualquier evento recurrente: 146.6 ± 34.4 pg/ml IL- 18 contra 95.4 ± 23.9 pg/ml en pacientes sin evento recurrente (p= 0.03). Aunque las diferencias en los niveles de IL-18 no alcanzaron una importancia estadística, debido al pequeño número de pacientes, pudo observarse una clara tendencia hacia niveles elevados e IL-18. En los pacientes isquémicos, los niveles de IL-18 fueron 214.2 ± 45.9 pg/ml en los pacientes que murieron contra 118.4 ± 12.8 pg/ml en aquellos que sobrevivieron (p= 0.007). Se midió 162.8 ± 24.7 pg/ml de IL-18 en aquellos pacientes que tuvieron un evento recurrente, contra 116.2 ± 16.0 en aquellos sin eventos recurrentes.

REFERENCIAS 1. Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease. (Aterosclerosis - una enfermedad inflamatoria) N Engl J Med 1999;340:115-126. 2. van der Wal AC, Becker AE, van der Loos CM, Das PK. El sitio de íntima ruptura o erosión de placas ateroscleróticas coronarias en trombosis se caracteriza por un proceso inflamatorio independiente de la morfología de placa dominante. Circulation 1994; 89:36-44. 3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. Patogénesis de la enfermedad de arteria coronaria y los síndromes coronarios agudos. (1). N Engl J Med 1992;326:242-250. 4. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. Patogénesis de la enfermedad de arteria coronaria y los síndromes coronarios agudos (2). N Engl J Med 1992; 326:310-318. 5. Lee RT, Libby P. El ateroma inestable. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:1859-1867. 6. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflamación, aspirina y el riesgo de enfermedad cardiovascular en hombres aparentemente saludables. N Engl J Med 1997; 336:973-979. 7. Libby P. Base molecular de los síndromes coronarios agudos. Circulation 1995;91 :2844-2850. 8. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K y Tamura, T. (1989).

Infecí. Immun. 57, 590-595. 9. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S y Nakanishi, K (1998). J. Imr?unol. 161 , 3400-3407. 10. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, y Sims, J E. (1996). J. Biol. Chem. 271 , 3967-3970. 11. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E y Karin, M. (1997). Nature 388, 16514-16517. 12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, y Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136. 13. Mallat Z, Hugel B, Ohan J, Leséche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Micropartículas de membrana shed con potencial procoagulante en placas ateroscleróticas humanas. Un rol para apoptosis en trombogenicidad de placa. Circulation 1999;99:348-353. 14. Tricot O, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Leséche G, Tedgui A. Relación entre apoptosis de célula endotellal y dirección de flujo sanguíneo en placa aterosclerótica humana.. Circulation 2000; en prensa. 15. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zelher AM. La lipoproteina de baja densidad oxidada induce a apoptosis de células endoteliales humanas por activación de proteasas tipo CPP32O. Una pista mecanística a la hipótesis de "respuesta a daño". Circulation 1997;95:1760-3. 16. Grantham, Science, ,y V_ ol. 185, pp. 862-864 (1974). 17. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zelher AM. La lipoproteina de baja densidad oxidada induce a apoptosis de células endoteliales humanas por activación de proteasas tipo CPP32O. Una pista mecanística a la hipótesis de "respuesta a daño". Circulation 1997; 95:1760-3. 18. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Transferencia de genes de alta eflcacia en músculo esquelético mediada por pulsos eléctricos. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7. 19. Lee, R.T. y Libby, P. El ateroma inestable. Arterioscler Thromb Vasc Biol 17, 1859-1867 (1997). 20. Davies, M.J. La composición de placas de arteria coronaria. [editorial; comentario]. N Engl J Med 336, 1312-1314 (1997). 21. Virmani, R., Kolodgie, F.D., Burke, A.P., Farb, A. y Schwartz, S.M. Lecciones de la muerte coronaria súbita: un esquema de clasificación morfológica completo para lesiones ateroscleróticas. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20, 1262-1275. (2000). 22. Kolodgie, F.D. et al. Localización de macrófagos apoptóticos en el lugar de ruptura de placa en muerte coronaria súbita, [referencia en proceso]. Am J Pathol 157, 1259-1268 (2000). 23. Kim, S.H. et al. Requisitos estructurales de sies isoformas de ocurrrencia natural de la proteína de unión a IL-18 para inhibir al IL-18.. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 1190-1195 (2000). 24. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., y Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127. 25. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construcciión y caracterización inicial de un anticuerpo anti-FNT quimérico de ratón-humano.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53 26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., y Zubler, R.H., 1992, J.lmmunol. 148, 2778-2784. 27. Engelmann, H., D. Novlck, y D. Wallach. 1990. Dos proteínas de unión al factor de necrosis tumoral purificadas de orina humana. Evidencia de reactividad cruzada inmunológica con receptores de factor de necrosis tumoral de la superficie celular. J. Biol. Chem. 265:1531-1536. 28. Moore WS, Barnett HJ, Beebe HG, et al. Directivas para endarterectomía de carótida. Una declaración de consenso multidisciplinario del Comité Ad Hoc de la Asociación Cardíaca Americana (American Heart Association). Circulation 1995; 91 :566-79. 29. Chomczynski P, Sacchi N. Método de paso único de aislamiento de ARN mediante extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidio ácido. Anal Biochem 1987;162:156-9.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de aterosclerosis.

2.- El uso de un inhibidor para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trombosis de una placa aterosclerótica.

3.- El uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de úlcera de placa aterosclerótica.

4.- El uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de desestabilización de placa aterosclerótica.

5.- El uso de un inhibidor de IL-19 para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de síndromes isquémicos debidos a la desestabilización de placa.

6.- El uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de fractura de placa aterosclerótica.

7.- El uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de episodios recurrentes de insuficiencia cardiaca.

8.- El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde la insuficiencia cardiaca es isquémica.

9.- El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde la insuficiencia cardiaca es no isquémica.

10.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el inhibidor de IL-18 es seleccionado entre el grupo formado por ICE-inhibidores, anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunldades de receptor de IL-18, inhibidores del pasaje de señalización de receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, y proteínas que se unen a IL-18, ¡soformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados circularmente permutados de los mismos.

11.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inhibidor de IL-18 es un anticuefo dirigido contra IL-18.

12.- El uso de conformidad con la reivindicación 11 , en donde el anticuefo es un anticuerpo humanizado.

13.- El uso de conformidad con la reivindicación 11 , en donde el anticuefo es un anticuerpo humano.

14.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inhibidor de acción de IL-18 es un IL-18BP, o una isoforma, una muteína, derivado o fragmento del mismo.

15.- El uso de conformidad co? cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde la proteína de unión a IL-18 es PEGilado.

16.- Ei uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde el inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que comprende toda o parte de una proteína de unión con IL-18 fusionada a toda o parte de una ¡nmunoglobulina, y en donde la proteína fusionada se une a IL-18.

17.- El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la proteína fusionada comprende toda o parte de una región constante de una inmunoglobulina.

18.- El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la ¡nmunoglobulina es del isotipo lgG1 o lgG2.

19.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un interferón para uso simultáneo, secuencial o separado.

20.- El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el interferón es interferón-ß.

21.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un antagonista de Factor de Necrosis Tumoral (FNT) para uso simultáneo, secuencial o separado.

22.- El uso de conformidad con la reivindicación 21 , en donde el antagonista de FNT es TBI y/o TBPII.

23.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un inhibidor de COX para uso simultáneo, secuencial o separado.

24.- El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el COX-inhibidor es un inhibidro de COOX-2.

25.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un inhibidor de tromboxano, para uso simultáneo, secuencial o separado.

26.- El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el inhibidor de tromboxano es aspirina.

27.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un agente de reducción de lípídos, para uso simultáneo, secuencial o separado.

28.- El uso de conformidad con la reivindicación 27, en donde el agente de reducción de lípidos es un inhibidor de HMG CoA.

29.- El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el inhibidor de HMG CoA es una estatina.

30.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento se utiliza en combinación con una dieta baja en grasas y/o baja en colesterol y/o baja en sales.

31.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el inhibidor de IL-18 se utiliza en una cantidad de alrededor de 0.0001 a 10 mg/kg de peso del cuefo, o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg de peso corporal o alrededor de 0.1 a 3 mg/kg de peso coforal o alrededor de 1 a 2 mg/kg de peso coforal.

32.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el inhibidor de IL-18 se utiliza en una cantidad de alrededor de 0.1 a 1000 µg/kg de peso corporal o 1 a 100 µg/kg de peso corporal o alrededor de 10 a 50 µg/kg de peso corporal.

33.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el inhibidor de 1L-18 es administrable en forma subcutánea.

34.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el inhibidor de IL-18 es administrable intramuscularmente.

35.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el inhibidor de IL-18 es administrable diariamente.

36.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el inhibidor de IL-18 es administrable día por medio.

37.- El uso de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación para un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de aterosclerosis.

38.- El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde el vector de expresión es administrable por electrotransferencia.

39.- El uso de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, en donde el vector de expresión es administrable sistémicamente.

40.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector de expresión es administrable intramuscularmente.

41.- El uso de un vector para inducir y/o mejorar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de aterosclerosis.

42.- El uso de una célula que ha sido genéticamente modificada para producir un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de aterosclerosis.

43.- El uso de IL-18 como un marcador diagnóstico para prevenir un mal pronóstico clínico en insuficiencia cardiaca.

44.- El uso de un marcador diagnóstico de IL-18 de episodios recurrentes luego de un primer episodio de insuficiencia cardiaca.