CZ305653B6

CZ305653B6 - Farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ305653B6
Application number: CZ2003-2335A
Authority: CZ
Inventors: Charles Dinarello; Benjamin Pomerantz; Leonid Reznikov; Alden Harken; Yolande Chvatchko
Original assignee: Merck Serono Sa
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-28
Publication date: 2016-01-27
Also published as: SK10892003A3; HK1062810A1; EA200501549A1; JP2009102354A; ES2295332T3; DK1355668T3; EE200300328A; JP4860897B2; HU229164B1; HUP0303306A3; DE60224004D1; ZA200305439B; CN1326562C; PL213568B1; EP1355668A1; IL157024A; PL366802A1; EP1355668B1; BR0206819A; JP2004522748A

Abstract

Použití inhibitoru IL-18 k výrobě léčiva pro léčení a/nebo prevenci kardiomyopatie, kde inhibitor je zvolen z inhibitorů kaspázy-1, z protilátek vůči interleukinu 18, z protilátek vůči kterékoliv z podjednotek receptoru interleukinu 18 a z vazebných proteinů interleukinu 18 nebo z isoforem, muteinů, fúzních proteinů nebo funkčních derivátů takových látek, vyvolávajících inhibici biologické účinnosti interleukinu 18.

Description

(57) Anotace:

Použití inhibitoru IL-18 k výrobě léčiva pro léčení a/nebo prevenci kardiomyopatie, kde inhibitor je zvolen z inhibitorů kaspázy-1, z protilátek vůči interleukinu 18, z protilátek vůči kterékoliv z podjednotek receptoru interleukinu 18 a z vazebných proteinů interleukinu 18 nebo z isoforem, muteinů, fuzních proteinů nebo funkčních derivátů takových látek, vyvolávajících inhibici biologické účinnosti interleukinu 18.

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález patří do oboru kardiovaskulárních onemocnění. Konkrétněji se týká použití inhibitoru interleukinu 18 (IL-18) k léčbě a/nebo prevenci srdečního onemocnění, zejména pak ischemické choroby srdeční.

Dosavadní stav techniky

Cytokin interleukin 18 (IL-18) byl nejprve popsán jako faktor indukující interferon-γ (IFN-γ) (Nakamura se spoluautory, Infect Immun. 57, 590-595, 1989). Je to časný signál ve vývoji odpovědi T-lymfocytámích pomocných buněk typu 1 (TH1). IL-18 působí spolu s IL-12, IL-2, antigeny, mitogeny a případně s dalšími faktory tak, že indukuje produkci IFN-γ. IL-18 také zvyšuje produkci GM-CSF (faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů) a IL-2, zesiluje proliferaci buněk T, indukovaných prostřednictvím anti-CD3 a zvyšuje Fas-zprostředkované zabíjení buňkami přirozených zabíječů (natural killers) (Fas = membránový protein, fungující na buněčném povrchu jako receptor).

Zralý interleukin 18 je vytvářen ze svého prekursoru působením enzymu konvertuj ícího IL-18 (ICE, kaspáza-1).

Receptor IL—18 sestává z nejméně dvou složek, které spolupracují při vazbě ligandu. Málo afinitní a vysoce afinitní vazebná místa pro IL-18 byla nalezena na myších T buňkách, stimulovaných IL-12 (Yoshimoto se spoluautory, J. Immunol. 161, 3400-3407, 1998), což ukazuje na receptorový komplex s násobnými řetězci. Až dosud byly identifikovány dvě receptorové podjednotky, obě patřící do skupiny receptorů IL—1 (Pamet se spoluautory, J. Biol. Chem. 271, 3967-3970, 1996, Kim se spoluautory, J. Immunol. 166, 148-154, 2001). Signální transdukce IL-18 zahrnuje aktivaci nefritického faktoru NF-AB (DiDonato se spoluautory, Nature 388, 16 514-16 517, 1997). Receptorový komplex IL-18 sestává ze dvou receptorových řetězců: řetězce navazujícího ligand, označovaného jako IL-18Ra řetězec a řetězce transdukujícího, přenášejícího signál, označeného jako řetězec IL—18Rp. Řetězec IL-18R byl nejprve izolován jako protein buněčného povrchu, navazujícího se na radioaktivně označený IL-18; protein byl vyčištěn a jeho aminokyselinová sekvence odhalila shodnost s dříve popsaným sirotčím receptorem, označovaným jako IL—1 R-related protein (IL-Rrp) (Torigoe se spoluautory, J. Biol. Chem. 272. 25 737-25 742.

Nedávno byl z lidské moče izolován rozpustný protein, mající vysokou afinitu k IL-18 a klonovány byly lidská a myší cDNA, stejně jako lidský gen (Novick se spoluautory, Immunity 10, 127-136, 1999; WO 99/0906). Protein byl označen jako vazebný protein IL-18 (IL-18BP).

IL-18BP není extracelulámí, vněbuněčnou doménou jednoho ze známých receptorů IL-18, ale vylučovaný, přirozeně obíhající protein. Patří do nové skupiny vylučovaných proteinů, která dále zahrnuje několik proteinů kódujících virus neštovic (Novick se spoluautory, 1999). Močový i rekombinantní IL-18BP specificky, s vysokou afinitou váže IL-18 a moduluje biologickou afinitu IL-18.

Gen IL-18 byl lokalizován na lidském chromosomu 1 lql3 a vgenomové sekvenci o velikosti 8,3 kilobasí nebyl nalezen exon, kódující transmembránovou doménu. U lidí byly až doteď nalezeny čtyři spojené varianty nebo isoformy IL-18BP, vytvářené alternativním spojováním mRNA. Byla označena jako IL-18BP a, b, c, d, přičemž všechny sdílejí stejný N-konec a liší se Ckoncem (Novick se spoluautory, 1999). Tyto isoformy se liší svou schopností vázat IL-18. Je

-1 CZ 305653 B6 znám, že z uvedených čtyř forem mají isoformy hIL-18BP a hIL-18BP c neutralizační kapacitu vzhledem k IL-18. Lidská isoforma IL-19BP křížově reaguje s myším IL-18.

Onemocnění srdce jsou definována jako poruchy, které postihují srdeční sval nebo krevní cévy srdce (The Merck Manual Home Edition, www.merck.com). Cévní poruchou je problém krevní cévy, jako špatný oběh vyvolaný jejím ucpáním. Onemocnění srdce jsou také nazývána kardiovaskulárními poruchami.

Ischemická choroba srdeční je běžnou příčinou srdečního selhání a je nejčastější příčinou smrti v západní společnosti. Je obvykle způsobena ateromem koronární, věnčité tepny. Léze myokardu zahrnují ischemickou fibrózu a akutní infarkt. Za normálních podmínek tok krve v koronárních tepnách přesně odpovídá metabolickým požadavkům srdečního svalu. Ischemická choroba srdeční vzniká, pokud se přívod krve stane nedostatečným, neboť je poškozen buď samotný přívod krve, nebo myokard hypertrofuje (zbytní) a má vysoké požadavky na přívod krve. Koronární tok krve normálně nezávisí na tlaku v aortě. Pro kontrolu toku krve koronárním krevním řečištěm existuje účinný autoregulační mechanismus.

Pokud vznikne v hlavní koronární tepně ucpávka, obvykle způsobená atherosklerózou nebo arteriosklerózou, je koronární tok krve nejprve zachován, neboť je snížen periferní odpor distálně od ucpávky. Pokud je světelnost cévy uzavřena více než ze 75 %, vyvíjí se ischemie, zejména pokud je chabě vyvinutý koronární kolaterální oběh.

Srdeční sval je metabolicky extrémně aktivní a mitochondrie představují přes 30 % objemu jednotlivých vláken. Aerobní metabolismus je zásadní, neboť zde existují jen velmi malé rezervy vysoce energetických fosfátů. Odumření srdečního svalu nastává, pokud jsou tkáňové hladiny adenosintrifosfátu (ATP) velmi nízké a pokud fakticky zanikla anaerobní glykolýza. Tak jako u jiných tkání je přesná příčina odumření neznámá, ale letální poškození srdečního svalu jsou spojena s membránovým poškozením a s náhlým vstupem vápníku do cytoplasmy buněk. Po krátkých obdobích ischemie může být tok krve srdcem opět obnoven (reperfuze). Ovšem po kritickém časovém úseku je reperfuze nemožná, zřejmě v důsledku otoku, nabobtnání kapilárních endoteliálních buněk.

Atheroskleróza zodpovídá za velkou většinu onemocnění koronárních tepen. Ischemická choroba srdeční může také vyplývat z malého koronárního tepenného promývání. Častou příčinou tohoto jevu je mrtvice, zvláště v důsledku krvácení.

Jak bylo zdůrazněno výše, je ischemická choroba srdeční způsobena nerovnováhou mezi tokem krve v myokardu a metabolickými požadavky myokardu. Tok krve může být dále snížen násobícími se příčinami, jako křečí krevních cév, trombózou, nebo oběhovými změnami, vedoucími k hypoperfuzi (malému promývání).

Perfuze, promývání koronární tepny závisí na rozdílu tlaků mezi ústím (aortový diastolický tlak) a koronárním sinem, tj. věnčitým splavem srdce (pravý arteriální tlak). Koronární krevní tok je snížen během systoly vzhledem k Venturiho účinkům v koronárních ústích a kompresi, stlačení intramuskulámích tepen během stahu komor. Faktory, snižující koronární krevní tok, zahrnující snížený diastolický tlak v aortě, zvýšený intraventrikulámí tlak (v komorách) a stah myokardu, stenózu koronární tepny, stenózu aortové chlopně a opakovanou regurgitaci (zpětný tok krve) a zvýšený pravý arteriální tlak.

Trombolytická léčba činidly, jako jsou streptokináza nebo aktivátor tkáňového plasminogenu (TPA), se často používá k lyži nedávno vytvořeného trombu. Taková léčba, zahrnující lyži trombu, může ve většině případů obnovit krevní tok. Pokud je časná (v průběhu méně než hodiny nebo podobně), pomáhá zabránit významnému poškození myokardu a může alespoň pomoci snížit další poškození.

-2CZ 305653 B6

Angina pektoris je komplexní příznak ischemické choroby srdeční, charakterizované záchvatovitými návaly bolesti v hrudi, obvykle substemálních nebo prekordiálních bolestí. Je způsobena ischemií myokardu, která poklesne ještě před indukcí infarktu. Může nastat náhlá srdeční smrt, což je neočekávané úmrtí ze srdečních příčin, obvykle jednu hodinu po srdeční příhodě nebo bez nástupu příznaků. Ročně postihne 300 000 až 400 000 osob.

Jiné formy srdečního onemocnění zahrnují alkoholickou kardiopatii, prolaps aortální chlopně, stenózu aortální chlopně, arytmie, kardiogenní šok, vrozené srdeční onemocnění, rozšířenou kardiopatii, srdeční záchvat, srdeční selhání, srdeční nádor, pulmonální stenózu srdeční chlopně, hypertrofní kardiopatii, idiopatickou kardiomyopatii, ischemickou chorobu srdeční, ischemickou kardiomyopatii, mitrální regurgitaci, prolaps mitrální chlopně, peripartální kardiomyopathii, trvalou angínu.

Infarkt myokardu je další formou ischemické choroby srdeční. Patogeneze může zahrnovat okluzivní, tj. uzavírající intrakoronální trombus, tedy trombus, vytvářející vředovitý nebo rozpukaný stenotický plát. Uzavírací intrakoronámí trombus zapříčiňuje 90 % transmurálních (stěnu prorůstajících) akutních infarktů myokardu. Křeč cév může probíhat s koronární atherosklerózou nebo bez ní a možné je spojení s agregací destiček. Při infarktu myokardu může být přítomná také embolie.

Úhrnné morfologické příznaky infarktu myokardu se mohou lišit. Transmurální infarkt zahrnuje úplné ztluštění levé ventrikulámí (komorové) stěny, od srdeční nitroblány (endokardu) po serózní blánu (epikard). Subendokardiální infarkt zahrnuje víceložiskové oblasti nekrózy, omezené na vnitřní část, do hloubky 1/3 až 1/2 levé stěny komory. Komplikace infarktu myokardu mohou zahrnovat arytmie a poruchy vodivosti, s možností „náhlé smrti“, rozšíření infarktu, opakovaný infarkt, městnavé poškození srdce (pulmonámí edém), kardiogenní šok, zánět osrdečníku, stěnovou trombózu s možností embolizace, protržení stěny myokardu s možností tamponády, protržení papilámího svalu s možnou chlopňovou nedostatečností, tvorbu komorové výdutě.

Infarkt myokardu (MI) je definován jako ischemická nekróza myokardu, obvykle vyplývající z nenadálého snížení koronárního toku krve do části myokardu.

U více než 90 % pacientů s akutním s akutním infarktem myokardu akutní trombus, často spojený s protržením plátu, uzavře tepnu (dříve částečně uzavřenou atherosklerotickým plátem), která vyživuje poškozenou oblast. Pozměněná funkce krevních destiček, indukovaná endoteliální změnou v atherosklerotickém plátu, pravděpodobně přispívá k trombogenezi. Spontánní trombolýza nastává přibližně u 2/3 pacientů, takže o 24 hodin později je trombotické uzavření nalezeno jen u přibližně 30 % pacientů.

Infarkt myokardu je někdy zapříčiněn embolizací tepen (například u mitrální či aortické stenózy, infekční endokarditidy (zánětu srdeční nitroblány) a marantické endokarditidy. Infarkt myokardu byl popsán u pacientů s koronárním spasmem, křečí, a jinak normálními koronárními (věnčitými) tepnami. Intenzivní křeč koronárních tepen vyvolává kokain a jeho uživatelé mohou mít kokainem indukovanou angínu nebo infarkt myokardu. Studie využívající pitvu a koronární angiografii prokázaly, že kokainem indukovaná koronární trombóza může vzniknout v normálních koronárních (věnčitých) tepnách, nebo být umístěna do oblasti již existujícího ateromu.

Infarkt myokardu je převážně onemocněním levé komory, ale poškození se může rozšířit i na pravou komoru (RV, right ventricle) nebo na předsíně. Infarkt pravé komory je obvykle důsledkem uzavření pravé věnčité tepny nebo dominantní levé ohnuté tepny a je charakterizován abnormálními Q-vlnami při EKG. Netransmurální nebo subendokardiální infarkty se nerozšiřují přes stěnu komory a vyvolávají jen abnormality ST-segmentu T-vln. Subendokardiální infarkty obvykle poškozují vnitřní 1/3 myokardu, kde je větší namáhání stěny a tok krve myokardem je oběhovými změnami nejzranitelnější. Následovat může také prodloužené trvání nízkého tlaku (hypotenze). Vzhledem k tomu, že klinicky nelze přesně stanovit transmurální hloubku nekrózy

-3CZ 305653 B6 (ve stěně komory), jsou infarkty lépe klasifikovány prostřednictvím EKG jako Q-vlny a nikolivQ vlny. Objem zničeného myokardu může být odhadnut na základě rozsahu a trvání zvýšení CK (kreatinkinázy).

Jiným onemocněním, patřícím mezi ischemické choroby srdeční, je ischemická kardiomyopatie. Při tomto stavu mohlo dojít i k dřívějšímu infarktu myokardu, ale onemocnění je důsledkem těžké koronární atherosklerózy, zahrnující všechny hlavní větve. Výsledkem je neodpovídající cévní vyživení, vedoucí k myocytámímu úbytku. Myocytámí úbytek v kombinaci s fibrózou ve formě ukládání intersticiálního kolagenu vyvolává snížení kompliance, poddajnosti, což spolu s doprovodnou srdeční dilatací zapříčiňuje zahlcení zbývajících myocytů. To udržuje celý proces v chodu, za kompenzace pokračující hypertrofií, zbytněním myocytů. Kompenzace může být stejně jako hypertrofií uskutečňována dokonce i hyperplazií, což může vysvětlovat výslednou enormní velikost (dvojnásobek až trojnásobek normální velikosti) takového srdce. Nakonec už další kompenzace není možná a následuje srdeční selhání s arytmiemi a/nebo ischemickými příhodami. Klinicky se tedy jedná o pomalé, narůstající srdeční selhání s anamnézou předchozího infarktu myokardu nebo angínové bolesti, nebo bez takové anamnézy. Ischemická kardiopatie zodpovídá až za 40 % úmrtí při ischemické chorobě srdeční.

Během ischemie, stejně jako během reperfuze srdce, jsou vytvářeny mnohé endogenní mediátory, jako malé molekuly druhých poslů (second messengers), které ovlivňují funkci myokardu. Během minutové doby trvání ischemické příhody je stahová funkce myokardu zmenšena a celkové obnovení stahové funkce je široce závislé na trvání ischemického období (Daemen se spoluautory, J. Immunol. 162. 5506-5510, 1999). Během ischemické příhody je například narušena homeostáze Ca²⁺, jsou vytvářeny volné kyslíkové radikály a dochází k syntéze a uvolňování oxidu dusnatého (NO). Kromě toho jsou místně produkovány cytokiny, zejména TNFa (faktor nekrózy tumoru) a IL—1 β (Bolli, Circulation 82, 723-738, 1990). V intaktním, neporušeném srdci tyto cytokiny přispívají k ischemií indukované dysfunkci myokardu indukováním genové exprese indukovatelné NO-syntázy (iNOS) (Demen se spoluautory, 1999), cyklooxygenázy-2 (COX-2) a fosfolipázy A2, stejně jako cévních adhesivních molekul a několika chemokinů. Výsledkem je okamžitý pokles stahové síly myokardu, zprostředkovaný posly o malé velikosti molekuly a následná infiltrace neutrofilů zprostředkovaná cytokiny, která dále poškozuje srdeční sval.

Zvířecí srdce, studovaná v nepřítomnosti krve nebo krevních produktů, vypracovávala během ischemické stimulace TNFa (Herskowitz se spoluautory, Am. J. Pathol. 146, 419-428, 1995) a IL—1 β. Kardiomyocyty také v důsledku působení těchto endogenních cytokinů ztrácejí stahovou sílu (Meldrum se spoluautory, Ann. Thorac. Surg. 65, 439-443, 1998).

Většina experimentálních údajů, týkajících se dysfunkce myokardu zprostředkované TNFa a IL1β, je získána ze studií na zvířatech. Ovšem lidské tkáně myokardu, získané od pacientů, kteří podstoupili zvolenou proceduru kardiopulmonámího bypassu (přemostění), byly studovány za řízených podmínek ex vivo (Gurevitch se spoluautory, J. Am. Coll. Cardiol. 28, 247-252, 1996, Cleveland se spoluautory, Circulation 96, 29-32, 1997). U tohoto pokusného modelu jsou lidské sinové trámce suspendovány ve fyziologicky okysličované pufrové lázni bez přítomnosti krve a poté jsou vystaveny období napodobené ischemie. Během této doby stahová síla dramaticky poklesne a pokud je tkáň opět vystavena kyslíku, stahová síla se obnoví, aleje zmenšena (60% až 70% snížení) a důkazem poškození myokardu je pozorované uvolnění kreatinkinázy (CK) (Gurevitch se spoluautory, 1996, Cleveland se spoluautory, 1997). Pokud je biologická aktivita TNF během ischemie/reperfuze (I/R) specificky neutralizována, je pozorováno větší obnovení stahové síly, což naznačuje, že endogenní myokardická aktivita TNF přispívá ke stahové dysfunkci, indukované ischemickou příhodou (Cain se spoluautory, J. Surg. Res. 76, 117-123, 1998).

Daemen a spoluautoři studovali tkáňové poškození jako důsledek ischemie, po níž následovala reperfuze, za použití myšího modelu ledvinové ischemie. Prokázali, že regulace ledvinové mRNA IL-18 směrem k nárůstu (up-regulation) se shodovala s aktivací kaspázy-1 v den 1 po is

-4CZ 305653 B6 chemii. Následně byly stejným způsobem regulovány k nárůstu IFN-γ a mRNA IL—12 v den 6 po ischemii. Spojená, ale nikoli oddělená neutralizace cytokinů IL—12 a IL-18, indukujících IFN-γ, snížila regulaci směrem k nárůstu na IFN-γ závislého MHC (hlavního histokompatibilního komplexu) třídy I a II v podobném rozsahu, jako neutralizace IFN-γ.

Do současné doby však ještě nebylo popsáno, že IL-18 hraje v roli v srdečních onemocněních.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen na zjištění, že inhibitor IL-18 podstatně zlepšuje stahovou funkci srdce u ischemického/reperfuzního modelu promývaného (suprafuzovaného) lidského síňového myokardu. Snížení stahové funkce po ischemii a reperfuzi rovněž oslabila inhibice kaspázy-1 (ICE).

Nadto bylo výsledkem podání inhibitoru IL-18 u myšího modelu infarktu myokardu zvýšení přežití a významné zlepšení ventrikulámí (komorové) funkce.

Tyto studie prokázaly, že inhibitory IL-18 jsou vhodné pro léčbu nebo prevenci dysfunkce myokardu.

Předkládaný vynález se proto týká použití inhibitoru IL-18 k výrobě léčiv pro léčbu a/nebo prevenci srdečního onemocnění, zvláště ischemické choroby srdeční a/nebo srdečního selhání.

Pro možnost genového léčebného přístupu k dodání inhibitoru IL-18 do nemocné tkáně nebo buňky se vynález dále týká i použití expresního vektoru, obsahujícího kódovací sekvencí inhibitoru IL-18, k léčbě a/nebo prevenci srdečního onemocnění.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje účinek IL-18BP na ischemii indukovanou stahovou (kontrakti lni) dysfunkci myokardu.

(A) Kinetická odpověď na ischemické poškození. Po uvedení do rovnovážného stavu (ekv., ekvilibrace) byly kontrolní trámce (ctrl) během celého pokusu promývány za normoxických podmínek (podmínek normálního obsahu kyslíku). V přítomnosti nebo v nepřítomnosti IL-18BP (5 μg/ml) byly trámce podrobeny ischemii/reperfuzi. Svislá osa ukazuje procenta vyvinuté sily ve srovnání s počátkem pokusu (dobou 0). Údaje jsou získány z trámců od jediného pacienta a jsou ztělesněním metod, použitých pro výpočet střední změny vyvolané síly během 90 minut.

(B) Post-ischemická vyvolaná síla po neutralizaci IL-18 prostřednictvím 1 nebo 5 μg/ml IL18BP. Výsledky jsou vyjádřeny jako střední procentní změny vyvinuté síly vzhledem ke kontrolám (ctrl) po ukončení reperfuze (80 minut). Údaje 1 až 5 pod dvěma posledními sloupci udávají množství IL-18BP v μg/ml. n=6, * označuje p<0,01 ve srovnání s I/R (ischemii/reperfuzi).

Obr. 2 znázorňuje obsah proteinu IL-18 v myokardu. Trámce byly homogenizovány po 90 minutách promývání za normoxických podmínek (kontroly), nebo 45 minut po třicetiminutové ischemii (I/R). Trámce byly získány od stejných subjektů. Hladiny IL-18 jsou uvedeny na svislé ose v pg/ml. n=4, * označuje p<0,01.

Obr. 3 znázorňuje rovnovážný (ustálený) stav mRNA IL-18 a IL-18BP u kontrolní a ischemické tkáně síní. Hladiny mRNA IL-18 a IL-18BP byly stanoveny prostřednictvím RT-PCR (polymerázové řetězové reakce). Údaje pocházejí od jednoho ze dvou hodnocených subjektů. Část A znázorňuje ethidiumbromidem barvený agarózový gel, v němž byly rozděleny produkty PCR a

-5CZ 305653 B6 část B znázorňuje výsledky kvantifikace množství produktů PCR jako násobek změny vůči kontrolám (GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza).

Obr. 4 znázorňuje účinek inhibice ICE (kaspázy-1) na post-ischemickou vyvinutou sílu. Výsledky jsou vyjádřeny jako střední procentní změna vyvinuté síly vzhledem ke kontrolám (ctrl) po ischemii/reperfuzi (I/R). Číselné údaje u posledních dvou sloupců označují koncentraci inhibitoru ICE v mg/ml. n=7, *označuje p<0,01 vzhledem k I/R.

Obr. 5 znázorňuje tkáňovou aktivitu kreatininkinázy (CK) po I/R. CK je vyjádřena v jednotkách aktivity na mg vlhké hmotnosti tkáně. Podmínky pokusu jsou uvedeny pod vodorovnou osou. Ctrl a I/R, n=6; IL-18BP (5 gg/ml), n=5; ICEi (10 a 20 gg/ml), n=5 u každé zobou hodnot; * označuje p<0,05 ve srovnání s I/R.

Obr. 6 znázorňuje střední změnu vyvolané síly vzhledem k síle vyvolané po době ekvilibrace, stanovené na 100 % (n=5), trámců inkubovaných s 10 gg/ml IL-18BP po dobu 15 minut, před přídavkem TNFa (1 ng/ml). TNFa a IL-18BP byly přidávány při každé změně lázně.

Obr. 7 znázorňuje časovou odpověď lidských síňových trámců na IL-18 za normoxických podmínek. Zralý IL-18 (100 ng/ml byl přidán k síňovým trámcům na dobu 90 minut. Svislá osa ukazuje střední procentní změnu vyvinuté síly oproti základní hodnotě. Základní hodnota byla stanovena na konci doby ekvilibrace (není znázorněno). n=6, *označuje p<0,05, ** označují p<0,001 ve srovnání s kontrolami ve stejném časovém okamžiku a pro zbytek doby trvání pokusu.

Obr. 8 znázorňuje zachování aktivity kreatinkinázy v myocelulámí tkáni (tkáni svalových buněk) po vystavení I/R, působení TNFa (1 ng/ml) a TNFa (10 ng/ml) + IL—18BP. Aktivita kreatinkinázy je vyjádřena v jednotkách aktivity enzymu na mg hmotnosti vlhké tkáně, n=6.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález je založen na zjištění, že inhibitory IL-18 vykazují přínosný účinek při srdečních onemocněních, zejména při ischemické chorobě srdeční. Jak je uvedeno v níže uvedených příkladech, bylo prokázáno, že různé inhibitory IL-18 vykazují významný přínosný účinek na post-ischemicky vynakládanou stahovou sílu srdečního svalu.

Kromě toho byl inhibitor IL-18 testován na modelu infarktu myokardu in vivo a výsledkem bylo zvýšené přežití a významného zlepšení ventrikulámí (komorové) funkce.

Vynález se proto týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci srdečního onemocnění.

Podle tohoto vynálezu zahrnuje výraz „onemocnění srdce“ taková onemocnění, která zahrnují srdeční dysfunkci. Obecně se také nazývají kardiovaskulární poruchy.

V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je srdečním onemocněním ischemická choroba srdeční.

Výraz „ischemická choroba srdeční“, jak je zde používán, zahrnuje veškeré různé typy ischemické choroby srdeční, včetně, ne však výhradně, chorob, které byly podrobně vysvětleny v odstavci „Dosavadní stav techniky“, stejně jako kardiovaskulární onemocnění nebo poruchy, vztahující se k ischemické chorobě srdeční.

Použití podle tohoto vynálezu je dobře přizpůsobeno pro dlouhodobou léčbu a je tedy zvláště vhodné pro použití ve vztahu k chronickému srdečnímu onemocnění. Proto ischemická choroba srdeční je v upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu chronická. Angína nebo angína pecto

-6CZ 305653 B6 ris je jedním z nej běžnějších klinických příznaků u pacientů, majících dlouhodobě ischemickou chorobu srdeční. Narušená funkce levé komory, následující po jedné nebo více dřívějších příhodách infarktu myokardu, může mít za následek selhání levé komory a nakonec městnavé selhání srdce. Tento vynález se proto dále týká použití inhibitoru IL— 18 pro léčbu a/nebo prevenci angíny pectoris.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je ischemická choroba srdeční akutní a ještě výhodněji se jedná o infarkt myokardu.

Akutní srdeční onemocnění myokardu obvykle zahrnuje nekrózu srdečního svalu, běžně levé komory. Často je způsobena atheromem koronární, věnčité tepny s převrstveným trombem nebo hemorhagickým plátem Po nekróze dochází k zánětlivé infiltraci, z nekrotického svalu se do krve uvolňují fibrózní opravné enzymy a dochází k leukocytóze, což lze diagnosticky využít.

Komplikace akutní infekce myokardu zahrnují arytmie, srdeční selhání, protržení myokardu vedoucí k hemoperikardu, stěnový trombus vedoucí k embolii a srdeční výduť. Další komplikace zahrnují náhlou smrt, arytmie, přetrvávající bolest, angínu, srdeční selhání, mitrální nedostatečnost, perikarditidu (zánět osrdečníku), srdeční protržení (komorová bolest, srdeční přepážka nebo papilámí sval), stěnovou trombózu, komorovou výduť, Dresslerův syndrom (bolest v hrudi, horečka, efúze (prosáknutí)), pulmonámí embolii. Léčivo podle vynálezu může být použito také k léčbě a/nebo prevenci těchto komplikací infarktu myokardu.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění je srdečním onemocněním selhání srdce nebo srdeční selhání. Selhání srdce je chorobný stav, při němž je srdce neschopné čerpat krev rychlostí, vyžadovanou normálním metabolismem. U téměř všech forem selhání srdce je srdeční výkon snížený, to vyvolává určitý stupeň nedostatečné perfuze (zásobování krví), který je nazýván nedostatečné tepenné zaplnění (arterial underfilling). Tělo kompenzuje rostoucí objem krve zadržením tekutiny. Selhání srdce může být akutní nebo chronické. V ranných stádiích se mohou klinické příznaky jevit jako jednostranné, ale vzhledem ktomu, že mezikomorová (interventrikulámí) přepážka je sdílena pravou i levou komorou, po selhání jedné komory nevyhnutelně následuje selháním i té druhé. Selhání srdce může být způsobeno ischemickou chorobou srdeční. Může být vyvoláno i jinými příčinami, jako je systémová hypertenze, chlopňové onemocnění srdce nebo plicní onemocnění, vedoucí k městnavému srdečnímu selhání.

Srdečním selháním může být městnavé srdeční selhání, což je symptomatická dysfunkce myokardu, jejíž důsledkem je charakteristický profil hemodynamických, ledvinových a neurohormonálních odpovědí. Klinickými příznaky srdečního selhání mohou být selhání srdce nebo selhání pravé komory. Srdeční selhání se projevuje systolickou nebo diastolickou dysfunkcí, nebo oběma takovými dysfunkcemi. Obvyklé jsou kombinované systolické a diastolické abnormality.

V ještě dalším upřednostňovaném ztělesnění je onemocněním srdce kardiomyopatie. Kardiomyopatie je strukturní nebo funkční abnormalita komorového myokardu (srdeční svaloviny).

Výraz „prevence“ se v kontextu tohoto vynálezu týká nejen úplné prevence, předcházení určitému účinku, ale také jakékoliv částečné nebo podstatné prevence, oslabení, redukce, snížení nebo zmenšení účinku před nástupem nebo v počátku nástupu onemocnění.

Výraz „léčba“ se v kontextu tohoto vynálezu týká jakéhokoliv přínosného účinku vzhledem k postupu onemocnění, včetně oslabení, redukce, snížení nebo zmenšení patologického, chorobného vývoje po nástupu onemocnění.

Výraz „inhibitor IL-18“ se v kontextu tohoto vynálezu týká jakékoliv molekuly, modulující produkci IL—18 a/nebo jeho působení takovým způsobem, že produkce a/nebo působení IL-18 je oslabeno, redukováno, nebo částečně, podstatně či úplně zamezeno či blokováno.

-7 CZ 305653 B6

Inhibitorem produkce může být jakákoliv molekula, která záporně ovlivňuje syntézu, zpracování nebo zrání IL—18. Takovými inhibitory, uvažovanými podle předkládaného vynálezu, mohou být například supresory genové exprese interleukinu IL-18, negativní (antikódující) mRNA, redukující nebo zabraňující transkripci mRNA IL—18 nebo vedoucí k degradaci mRNA, proteiny poškozující správné skládání, nebo částečně či podstatně zabraňující sekreci IL-18, proteázy odbourávající 1L-18 hned, jakmile byl syntetizován, inhibitory proteáz štěpících pro-IL-18 k vytvoření zralého IL-18, jako jsou inhibitory kaspázy-1, a podobně.

Inhibitorem působení IL-18 může být například antagonista IL-18. Antagonisté se mohou vázat buď molekulu IL-18, nebojí s dostatečnou afinitou a specifičností vyčleňovat k částečnému nebo podstatnému neutralizování IL-18 samotného, nebo vazného místa či vazných míst pro IL—18, odpovědného (odpovědných) za vazbu IL-18 kjeho ligandům (jako například kjeho receptorům). Agonista může také inhibovat signální dráhu IL-18, která je v buňkách aktivována během vazby IL—18 na receptor.

Inhibitory působení 1L— 18 mohou být také rozpustné receptory IL— 18 nebo protilátky vůči IL—18, jako jsou polyklonální nebo monoklonální protilátky, nebo jakékoliv jiné činidlo či molekula, zabraňující vazbě IL-18 na cílové struktury, čímž se omezuje nebo zabraňuje spuštění intracelulámích nebo extracelulámích reakcí, zprostředkovaných IL-18.

V upřednostňovaném ztělesnění předkládaného vynálezu je inhibitor IL-18 zvolen z inhibitorů kaspázy-1 (ICE), protilátek vůči IL-18, protilátek zaměřených vůči podjednotkám receptoru IL18, inhibitorů signální dráhy IL-18, antagonistů IL-18, kompetujících s IL-18 a blokujících receptor IL—18 a vazebních proteinů IL-18, z isoforem, muteinů, fúzních proteinů, funkčních derivátů, aktivních podílů nebo oběhově obměněných (permutovaných) derivátů takových látek, inhibujících biologickou aktivitu IL-18.

Výraz „vazebné proteiny IL-18“ je zde používán synonymně s výrazem „vazebný protein IL-18“ nebo „IL-18BP“. Zahrnuje proteiny navazující IL-18, jak jsou definovány ve WO 99/09063 nebo Novickem a spoluautory, 1999, včetně spojených (spletených) variant a/nebo isoforem vazebných proteinů IL-18, jak jsou definovány Kimem a spoluautory v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1190-1195, 2000, které se vážou na IL-18. Podle předkládaného vynálezu jsou vhodné zejména lidské isoformy a forma c IL-18BP. Vhodné proteiny podle tohoto vynálezu mohou být glykosylované i neglykosylované, mohou být získány z přírodních zdrojů, jako je moč, nebo mohou být s výhodou vyráběny rekombinantně. Rekombinantní exprese může probíhat v prokaryotických expresních systémech, jako v E. coli, nebo v eukaryotických a s výhodou v savčích, expresních systémech.

Tak jak je zde použit, týká se výraz „muteiny“ analogů IL-18BP, nebo analogů virového IL18BP, u nichž došlo k nahražení jednoho nebo více z aminokyselinových zbytků přírodního IL18BP nebo virového IL-18BP jinými aminokyselinovými zbytky, nebo k jejich odstranění, nebo došlo k přidání jednoho či více aminokyselinových zbytků k přírodní sekvenci IL-18BP či virového IL-18BP, aniž by byla podstatně změněna aktivita výsledných produktů ve srovnání s divokým typem IL-18BP nebo virového IL-18BP. Tyto muteiny jsou připravovány známým syntetickým postupem a/nebo místně zaměřenými mutagenezními postupy, nebo jakoukoli jinou známou metodou, která je k tomu vhodná.

Muteiny podle předkládaného vynálezu zahrnují proteiny kódované nukleovými kyselinami jako DNA či RNA, hybridizující se (křížící se) s DNA nebo RNA, které kódují IL-18BP nebo virový IL-18BP, podle předkládaného vynálezu, za podmínek tísně. Výraz „podmínky tísně“ se týká hybridizace a následných podmínek promývání, které jsou osobami s běžnou znalostí oboru tradičně označovány za „tísnivé“. Viz Ausebel se spoluautory, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, NY, § 6.3 až § 6.4 (1987, 1992) a Sambrock se spoluautory, viz výše. Bez vymezování zahrnují příklady podmínek tísně podmínky promývání, prováděného 12 až 20 °C pod vypočítanou hodnotou. Tm studovaného hybridu, například promývání 2 x SSC (standard

-8CZ 305653 B6 ním citrátem sodným) a 0,5% SDS (dodecylsulfátem sodným) po dobu 5 minut, 2 x SSC a 0,1% SDS po dobu 15 minut; 0,1 x SSC a 0,5% SDS 30 až 60 minut při 37 °C a pak 0,1 x SSC a 0,5% SDS po dobu 30 až 60 minut při 68 °C. Osobám s běžnou znalostí tohoto oboru bude zřejmé, že podmínky tísně závisí také na délce sekvencí DNA, oligonukleotidových sond (jako 10 až 40 baží) nebo směsných oligonukleotidových sond. Pokud jsou použity směsné sondy, upřednostňuje se použití tetramethylamoniumchloridu (TMAC) místo SSC. Viz Ausbel, ad výše.

Aby měl aktivitu srovnatelnou s IL-18BP, vykazuje jakýkoli takový mutein s výhodou sekvencí aminokyselin, která je dostatečně duplikativní vzhledem k sekvenci IL-18BP, nebo dostatečně duplikativní vzhledem k virovému IL-18BP. Jednou aktivitou IL-18BP je schopnost vázat IL18. Pokud má mutein podstatnou aktivitu týkající se IL-18, je možné ho použít pro čištění IL-18, například za využití afmitní chromatografie a proto je možné ho považovat za mající v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP. Zda má daný mutein v podstatě stejnou aktivitu jako IL-18BP je tedy možné stanovit pomocí rutinního testování. To zahrnuje podrobení takového muteinu například jednoduchému sendvičovému kompetitivnímu testu, například radioimunitnímu stanovení nebo stanovení ELISA, pro zjištění, zda se váže na vhodně označený IL-18.

V upřednostňovaném ztělesnění vykazuje kterýkoliv takový mutein alespoň 40% identitu (shodnost) nebo homologii se sekvencí buď IL-18BP, nebo virově kódovaného IL-18BP homologu, jak je definováno ve WO 99/09063. Ještě lépe pak vykazuje alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80% a nejlépe alespoň 90% identitu nebo homologii.

Muteiny polypeptidů IL-18BP nebo muteiny virových IL-18BP, které lze použít podle předkládaného vynálezu, nebo nukleové kyseliny které je kódují, zahrnují omezenou sadu v podstatě souhlasných sekvencí jako substituované peptidy nebo polynukleotidy, která může být rutinně získána osobou s běžnou znalostí oboru bez nezbytného experimentování, na základě zde uvedených postupů a pokynů.

Upřednostňovanými změnami muteinů podle tohoto vynálezu jsou ty, známé jako „konzervativní“ substituce. Konzervativní aminokyselinové substituce polypeptidů nebo proteinů IL-18BP či virových IL-18BP mohou zahrnovat synonymní aminokyseliny v rámci skupiny, mající dostatečně podobné fyzikálně chemické vlastnosti k tomu, aby substituce mezi členy skupiny zachová biologickou funkci molekuly (Grantham, Science 185, 862-864, 1974). Je jasné, že ve výše uvedených sekvencích je bez pozměnění jejich funkce možné provádět také inserce a delece aminokyselin, zvláště pokud takové delece a inserce zahrnují pouze několik aminokyselin, například méně než 30 a lépe méně než 10 a netýkají se odstranění nebo přemístění aminokyselin, které jsou kritické pro funkční konformaci, například cystěinových zbytků. Proteiny a muteiny vytvářené takovými delecemi a/nebo insercemi spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Synonymní aminokyselinové skupiny jsou s výhodou ty, definované v Tabulce 1. Výhodněji jsou synonymními aminokyselinovými skupinami ty, definované v Tabulce 2 a nejvýhodněji jsou synonymními aminokyselinovými skupinami ty, definované v Tabulce 3.

-9CZ 305653 B6

Tabulka 1

Upřednostňované skupiny synonymních aminokyselin:

aminokyseliny	synonymní skupina
Ser	Ser,Thr, Gly, Asn
Arg Leu	Arg, Gin, Lys, Glu, His lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val
Gly lie	Ala, The, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie
Phe	Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe
Tyr Cys His	Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu,Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys ₅ Asp Glu	Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, lie, Val, Leu, Met
Trp	Trp

-10CZ 305653 B6

Tabulka 2

Upřednostňovanější skupiny synonymních aminokyselin:

	aminokyseliny	synonymní skupina
	Ser	Ser
	Arg	His, Lys, Arg
	Leu	Leu, lie, Phe, Met,
	Pro	Ala, Pro
	Thr	Thr
	Ala	Pro, Ala
	Val	Val, Met, lie
	Gly	Gly
	lie	lie, Met, Phe, Val, Leu,
	Phe	Met, Tyr, lie, Leu, Phe
	Tyr	Phe, Tyr
	Cys	Ser, Cys
	His	His, Gin, Arg,
	Gin	Glu, Gin, His
	Asn	Asp, Asn
	Lys	Lys, Arg,
	Asp	Asn, Asp
	Glu	Glu, Gin
	Met	Met, Phe, lie, Val, Leu,
5	Trp	Trp

-11 CZ 305653 B6

Tabulka 3

Nej upřednostňovanější skupiny synonymních aminokyselin:

aminokyseliny	synonymní skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, He, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lie	lie, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Ser, Cys
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, lie, Leu
Trp	Met

Příklady vytváření aminokyselinových náhrad v proteinech, které lze použít k získání muteinů polypeptidů nebo proteinů IL-18BP, či muteinů virových IL-18BP pro použití v předkládaném vynálezu, zahrnují kroky jakýchkoliv známých metod, jaké jsou například uvedeny v patentech US 4 959 314, 4 588 585 a 4 737 462 (Mark se spoluautory); 5 116 943 (Koths se spoluautory); 4 965 195 (Namen se spoluautory); 4 879 111 (Chong se spoluautory); 5 017 691 (Lee se spoluautory); a zahrnují i lysinové substituované proteiny, předložené v patentu US 4 904 584 (Shaw se spoluautory).

Výraz „fúzní protein“ se týká polypeptidů, obsahujícího IL-18BP, nebo virový IL-18BP, nebo mutein či fragment takových látek, spojený s jiným proteinem, který má například prodlouženou dobu dostupnosti (setrvání) v tělních tekutinách. IL-18BP nebo virový IL-18BP tedy mohou být připojeny na jiný protein, polypeptid nebo podobně, jako například na imunoglobulin či na jeho fragment.

-12CZ 305653 B6 „Funkční deriváty“, jak jsou zde používány, zahrnují deriváty IL-18BP nebo virových IL-18BP a jejich muteiny a fúzní proteiny, které mohou být připraveny z funkčních skupin, které se vyskytují jako vedlejší řetězce na zbytcích, nebo zN- a C-koncových skupin, takovými prostředky které jsou známé v oboru a jsou do vynálezu zahrnuty potud, pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, což znamená, že neničí aktivitu proteinu, která je v podstatě stejná jako aktivita IL-18BP nebo virových IL-18BP a nepropůjčují prostředkům, které je obsahují, toxickou aktivitu.

Takové deriváty mohou obsahovat například polyethylenglykolové vedlejší řetězce, které mohou maskovat antigenní místa a prodlužovat přetrvání IL-18BP nebo virového IL-18P v tělních tekutinách. Jiné deriváty zahrnují alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin vzniklé reakcí s amoniakem nebo s primárními či sekundárními aminy, N-acylové deriváty volných aminových skupin aminokyselinových zbytků, vytvářené s acylovými částicemi (například s alkanoylem nebo s karbocyklickými aroylovými skupinami) či O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin (například serylových nebo threonylových zbytků), vytvářené s acylovými částicemi.

Jako „aktivní podíly“ IL-18BP nebo virového IL-18BP, muteinů či fúzních proteinů zahrnuje předkládaný vynález jakékoliv fragmenty nebo prekursory polypeptidového řetězce proteinové molekuly samotné nebo dohromady s asociovanými molekulami nebo zbytky na ni navázanými, například s cukry či fosfátovými zbytky; nebo agregáty proteinové molekuly či cukerné zbytky samy o sobě, s tou podmínkou, že uvedený podíl má v podstatě stejnou aktivitu jako IL-18BP.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je inhibitor IL—18 protilátkou zaměřenou proti IL—18 nebo jeho receptoru, tedy IL-18R. Podle tohoto vynálezu mohou být použity protilátky zaměřené vůči kterékoliv z podjednotek IL-18R, označovaných IL-19Ra a IL-18RP.

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být polyklonální nebo monoklonální, chimérické, humanizované, nebo dokonce plně humánní. Rekombinantní protilátky a jejich fragmenty jsou charakterizovány vysokou vazebnou afinitou k IL—18 nebo IL-18R in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, které lze použít v tomto vynálezu, jsou charakterizovány svou schopností léčit pacienty po dobu, která je dostačující k dosažení dobré až vynikající regrese nebo zmírnění patogenního či chorobného stavu nebo jakéhokoliv příznaku či skupiny příznaků, vztahujících se k chorobnému stavu, a svou nízkou toxicitou.

Neutralizující protilátky jsou u zvířat, jako jsou králíci, kozy nebo myši, snadno zvýšeny imunizací prostřednictvím IL—18 nebo IL-18Ra či IL-18Rp. Imunizované myši jsou zvláště vhodné k zajištění zdrojů buněk B pro výrobu hybridomů, které jsou naopak kultivovány k produkci velkých množství monoklonálních protilátek vůči IL-18.

Chimérickými protilátkami jsou imunoglobulinové molekuly, charakterizované dvěma nebo více segmenty či podíly, získanými od různých zvířecích druhů. Obecně se variabilní oblast chimérické protilátky získá z nehumánní savčí protilátky, jako je myší monoklonální protilátka a konstantní oblast imunoglobulinu se získá z lidské imunoglobulinové molekuly. Obě oblasti i jejich kombinace s výhodou vykazují nízkou imunogenitu, jak se rutinně stanoví podle Elliota a spoluautorů, Lancet 344, 1125-1127, 1994. Humanizované protilátky jsou imunoglobulinové molekuly vytvořené postupy genetického inženýrství, u nichž byly myší konstantní oblasti nahraženy svými lidskými protějšky při zachování myších vazebných oblastí pro antigen. Výsledná myšílidská chimérická protilátka u lidí s výhodou vykazuje sníženou imunogenitu a zlepšenou farmakokinetiku (Knight se spoluautory, Mol. Immunol. 30(16), 1443-1453, 1993).

V dalším upřednostňovaném ztělesnění je tedy protilátkou vůči IL-18 nebo IL-18R humanizovaná protilátka. Výhodné příklady humanizovaných protilátek vůči IL-18 jsou popsány například v evropské patentové přihlášce EP 0 974 600.

- 13 CZ 305653 B6

V ještě dalším upřednostňovaném ztělesnění je protilátka plně humánní, lidská. Technika produkování lidských protilátek je podrobně popsána například ve WO 00/76 310, WO 99/53 049, US 6 162 963 nebo AU 5 336 100.

Jeden způsob přípravy plně lidských protilátek sestává z „humanizace“ myšího humorálního imunitního systému, tj. z produkování myších kmenů, schopných vytvářet lidský Ig (tzv. xeno-myši), zavedením lokusu (specifického místa genu na chromosomu) lidského imunoglobulinu (Ig) do myši, u níž byly inaktivovány endogenní Ig geny. Imunoglobulinové lokusy jsou komplexní, složité, pokud se týká jejich fyzikální struktury, opětného genového uspořádání i procesů exprese, vyžadovaných ke konečné produkci široké imunitní odpovědi. Různorodost protilátek je prvotně vytvářena kombinatomím přeskupením různých V, D a J genů, přítomných v lokusech Ig. Tyto lokusy také obsahují roztroušené řídicí (regulační) prvky, které řídí expresi protilátky, allelickou exkluzi, přesmyk tříd (class switching) a afmitní zrání. Zavedení nepřeskupených lidských Ig transgenů do myši prokázalo, že myší mechanismus rekombinace je slučitelný s lidskými geny. Nadto lze imunizací xeno-myší antigenem získat hybridomy, vylučující antigenně specifické hu-mAb (antigen navazující fragmenty Ig) o různých isotypech.

Plně humánní, lidské protilátky a způsoby jejich produkce jsou v oboru známé (Mendez se spoluautory, Nature Genetics 15, 146-156, 1997; Buggemann se spoluautory, Eur. J. Immunol. 21, 1323-1326, 1991; Tomizuka se spoluautory, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 722-727, 2000 a patent WO 98/24 893).

Ve vysoce upřednostňovaném ztělesnění předkládaného vynálezu je inhibitorem IL-18 vazebný protein IL-18, tj. IL18BP, nebo jeho isoforma, mutein, fúzní protein, funkční derivát, aktivní podíl nebo kruhovitě permutovaný derivát. Tyto isoformy, muteiny, fúzní proteiny nebo funkční deriváty si zachovávají biologickou aktivitu IL-18BP, zejména schopnost vazby na IL-18 a s výhodou mají v podstatě alespoň stejnou aktivitu jako IL-18BP. V ideálním případě mají takové proteiny ve srovnání s nemodifikovaným, nepozměněným IL-18BP zvýšenou biologickou aktivitu. Upřednostňované aktivní frakce, podíly, mají aktivitu lepší než je aktivita IL-18BP nebo aktivitu mající další výhody, jako je lepší stálost či nižší toxicita nebo imunogenita, anebo jsou snadněji produkovatelné ve velkých množstvích či se snadněji čistí.

Sekvence II-18BP a jejich spojené (spletené) varianty/isoformy mohou být převzaty z WO 99/09 063 nebo z práce Novicka a spoluautorů, 1999, stejně jako z práce Kima a spoluautorů, 2000.

Funkční deriváty IL-18BP mohou být konjugovány s polymery pro zlepšení takových vlastností proteinu, jako jsou stálost, poločas, biologická dostupnost, snášenlivost lidským tělem nebo imunogenita. K dosažení tohoto účelu může být IL-18BP navázán například na polyethylenglykol, PEG. Takové navázání může být prováděno známými postupy, popsanými například ve WO 92/13 095.

V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu jsou tedy inhibitory IL-18 a zejména IL-18BP vázány na PEG („PEGylovány).

V dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu obsahuje inhibitor IL-18 imunoglobulinovou směs, fůzi, to znamená, že inhibitor IL-18 je fuzním proteinem, obsahujícím část vazebného proteinu IL-18 nebo celý takový protein, který je spojen (fúzován) s částí imunoglobulinu nebo s celým imunoglobulinem. Způsoby výroby imunoglobulinových fúzních proteinů jsou dobře známé v oboru a patří k nim například způsoby, popsané ve WO 01/03 737. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že výsledný fúzní protein podle tohoto vynálezu vykazuje biologickou aktivitu IL-18BP, zejména pokud se týká vazby IL-18.

Fúze může být přímá nebo prostřednictvím krátkého spojovníku, spojovacího peptidu, který může být tvořen třeba jen jedním až třemi aminokyselinovými zbytky nebo může být delší, například mít délku 13 až 20 aminokyselinových zbytků. Zmíněným spojovníkem může být tripeptid o

- 14CZ 305653 B6 sekvenci E-F-M (Glu-Phe-Met) nebo sekvence, tvořená 13 aminokyselinami, kterými jsou GluPhe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, vložené mezi sekvenci IL-18BP a sekvenci imunoglobulinu. Výsledný fúzní protein má zlepšené vlastnosti, jako jsou prodloužená doba výskytu v tělních tekutinách (poločas), zvýšená specifická aktivita, zvýšená úroveň exprese, nebo se fúzní protein snáze čistí.

V upřednostňovaném ztělesnění fúzuje IL-18BP s konstantní oblastí imunoglobulinové molekuly. S výhodou je připojen do oblastí těžkých řetězců, jako jsou například domény CH2 a CH3 lidského IgGl. Vytváření specifických fúzních proteinů, obsahujících IL-18BP a imunoglobulinovou část, je například popsáno v Příkladu 11 patentu WO 99/09 063. Pro vytváření fúzních proteinů podle předkládaného vynálezu se hodí i další isoformy imunoglobulinových molekul, jako například IgG₂ nebo IgG4 nebo jiné třídy imunoglobulinů, jako je IgM nebo IgA. Fúzní proteiny mohou být monomemí nebo multimemí, hetero- nebo homomultimemí.

V ještě dalším ztělesnění předkládaného vynálezu se inhibitor IL—18 používá v kombinaci s antagonistou TNF. Antagonisté TNF uplatňují svou aktivitu různými způsoby. Jednou možností je vazba na molekulu TNF nebo její sekvestrace (odloučení) s dostatečnou afinitou a specifičností k částečnému nebo úplnému neutralizování epitopu či epitopů TNF, zodpovědných za receptorovou vazbu TNF (zde se označují jako „sekvestrační antagonisté“). Sekvestračním antagonistou může být například protilátka, zaměřená vůči TNF.

Alternativně mohou antagonisté TNF inhibovat signální dráhu TNF, aktivovanou receptory na buněčném povrchu po navázání TNF (zde se označují jako „signální antagonisté“). Obě skupiny antagonistů se hodí, ať už samostatně nebo společně, v kombinaci s inhibitorem IL-18, pro léčbu nebo prevenci onemocnění srdce.

Antagonisty TNF je možné snadno identifikovat a hodnotit rutinním testováním kandidátů, sledujícím jejich účinek na aktivitu přírodního TNF v citlivých buněčných liniích in vitro, například lidských buňkách B, v nichž TNF vyvolává proliferaci a vylučování imunoglobulinu. Takové stanovení zahrnuje prostředek s TNF při různých naředěních příslušného antagonisty, například v naředění od 0,1 do stonásobku molámího množství TNF použitého ve stanovení, a kontroly bez přítomnosti TNF nebo pouze antagonisty (Tucci se spoluautory, J. Immunol. 148, 2778-2784, 1992).

Upřednostňovanými antagonisty TNF pro použití podle předkládaného vynálezu jsou sekvestrační antagonisté. Z nich se dává přednost takovým polypeptidům, které mohou vázat TNF s vysokou afinitou a vykazují nízkou imunogenitu. Zvláště se upřednostňují rozpustné receptorové molekuly TNF (tj. TNF-R) a protilátky neutralizující TNF. V předkládaném vynálezu se používají například rozpustné TNF-RI a TNF-RII. Zkrácené formy těchto receptorů, obsahující extracelulámí domény receptorů nebo jejich funkční části, jsou zvláště upřednostňovanými antagonisty podle předkládaného vynálezu. Zkrácené rozpustné receptory TNF typu I a typu II jsou popsány například v EP 914 431.

Zkrácené formy receptorů TNF jsou rozpustné a byly delegovány v moči a séru jako vazebné proteiny inhibující TNF, mající velikost 30 000 a 40 000 a byly nazvány TBPI a TBPII (Engelmann se spoluautory, J. Biol. Chem. 265, 1531-1536,1990). Podle tohoto vynálezu se upřednostňuje souběžně, následné nebo oddělené použití inhibitoru IL-18 s antagonistou TNF.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění je antagonistou TNF, užívaným podle předkládaného vynálezu, lidský rozpustný TNF-RI (TBPI). Přírodní a rekombinantní rozpustné molekuly receptoru TNF a způsoby jejich výroby byly popsány v evropských patentech EP 308 378, EP 398 327 a EP 433 900.

Deriváty, fragmenty, oblasti a biologicky aktivní části receptorových molekul funkčně připomínají receptorové molekuly, které mohou být rovněž použity podle předkládaného vynálezu. Ta

- 15CZ 305653 B6 kový biologicky aktivní ekvivalent nebo derivát receptorové molekuly může být tvořen částí polypeptidu nebo sekvencí, kódující receptorovou molekulu a mající dostatečnou velikost a schopnost vázat TNF s takovou afinitou, že vzájemná reakce s membránově vázaným receptorem TNF je inhibována nebo blokována.

Inhibitor IL—18 může být používán souběžně nebo následně s inhibitorem TNF nebo odděleně od něho.

Podle předkládaného vynálezu může léčivo v kombinaci s inhibitorem IL—18 dále obsahovat známá činidla používaná pro léčbu onemocnění srdce, jako nitráty, například nitroglycerin, diuretika, inhibitory ACE, digitális, beta-blokátory nebo blokátory vápníku. Tyto aktivní složky mohou být použity souběžně, následně nebo odděleně.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění předkládaného vynálezu se inhibitor IL—18 používá v množství přibližně od 0,001 do 100 mg/kg nebo v množství přibližně od 1 do 10 mg/kg nebo od 2 do 5 mg/kg.

Inhibitor IL—18 podle předkládaného vynálezu se s výhodou podává systémově a přednostně podkožně nebo nitrosvalově.

Tento vynález se dále týká použití expresního vektoru, obsahujícího sekvenci kódující inhibitor IL-18, v přípravku léčiva pro prevenci/nebo léčbu onemocnění srdce. Pro dodání inhibitoru IL18 do místa, kde je vyžadován, se tedy zvažuje přístup genové léčby. Pro léčbu a/nebo prevenci onemocnění srdce může být vektor genové léčby, obsahující sekvenci inhibitoru IL—18, například injikován přímo do chorobné tkáně, čímž se odstraní problémy spojené se systémovým podáváním vektoru genové léčby, jako jsou zředění vektoru, dosažení cílových buněk nebo tkání a vedlejší účinky.

Podle tohoto vynálezu je rovněž předpokládáno použití vektoru pro indukci a/nebo zvýšení endogenní produkce inhibitoru IL—18 v buňce, normálně nečinné (mlčící), pokud se týká exprese inhibitoru IL-18, nebo v buňce, exprimující taková množství inhibitoru, která nejsou dostatečná. Vektor může obsahovat regulační sekvence, které jsou funkční v buňkách, u nichž je žádoucí exprese inhibitoru IL-18. Takovými regulačními sekvencemi mohou být například promotory nebo „enhancery“, zesilovače. Regulační sekvence pak může být zavedena do správného lokusu genomu homologní rekombinací, čímž operativně spojí regulační sekvence s genem, jehož exprese má být indukována nebo zvýšena. Tato technika se obvykle označuje jako „endogenní genová aktivace“ (EGA) a je popsána například ve WO 91/09955.

Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že expresi IL-18 je možné vypnout přímo, bez použití inhibitoru IL—18, a to stejnou technikou. K takovému účelu může být do lokusu genu IL—18 zaveden negativní regulační prvek, jako například „umlčující prvek“, což vede k zastavení nebo prevenci exprese IL-18. Odborníkovi v oboru zřejmé, že takové vypnutí nebo umlčení exprese IL-18 má k prevenci a/nebo léčbě onemocnění stejný účinek, jako použití inhibitoru IL-18.

Předkládaný vynález se dále týká použití buněk, které byly geneticky pozměněny, k produkci inhibitoru IL-18 pro výrobu a/nebo prevenci onemocnění srdce.

Inhibitor IL-18, jež má být použit podle tohoto vynálezu, může být s výhodou podáván jako farmaceutický prostředek, volitelně v kombinaci s léčebně účinným množstvím inhibitoru TNF.

Upřednostňovanými účinnými přísadami farmaceutických prostředků jsou IL-18BP a jeho isoformy, muteiny, fúzní proteiny, funkční deriváty, aktivní podíly nebo kruhově permutované deriváty, jak byly popsány výše.

- 16CZ 305653 B6

Definice „farmaceuticky přijatelný“ zahrnuje jakákoliv nosič, který není na překážku účinnosti biologické aktivity aktivní přísady, a který není toxický vůči hostiteli, jemuž je podáván. Pro parenterální podávání mohou být aktivní proteiny například formovány do jednotkové formy dávkování pro injekce v nosných prostředích (vehikulech), jako jsou fyziologický roztok, roztok dextrózy, sérový albumin a Ringerův roztok.

Aktivní přísady farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu mohou být jedinci podávány různými způsoby. Cesty podávání zahrnují intradermální, transdermální (například u pomalu uvolňovaných prostředků), intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, orální, intrakraniální, epidurální, místní a intranasální cesty podání. Použity mohou být i kterékoliv jiné, léčebně účinné cesty podání, například absorpce přes epiteliální nebo endoteliální tkáně nebo genovou léčbou, u níž se pacientovi podává molekula DNA, kódující aktivní činidlo, (například cestou vektoru), což vyvolá expresi aktivního činidla a jeho sekreci. Nadto mohou být proteiny podle tohoto vynálezu podávány společně s dalšími složkami biologicky aktivních činidel jako jsou farmaceuticky přijatelné povrchově aktivní látky, pomocná činidla, nosiče, ředidla a nosná prostředí.

Pro parenterální (například intravenózní, subkutánní, intramuskulámí) podání mohou být aktivní proteiny formovány jako roztok, suspenze, emulze nebo lyofilizovaný prášek ve spojení s farmaceuticky přijatelným parenterálním nosným prostředím (s vodou, fyziologickým roztokem, roztokem dextrózy) a s přídavnými látkami, které udržují isotoničnost (například s mannitolem) nebo chemickou stálost (například konzervačními látkami a pufry). Prostředek se sterilizuje běžně používanými postupy.

Biologická dostupnost aktivního proteinu nebo proteinů podle tohoto vynálezu může být také zlepšena použitím konjugačních postupů, které zvyšují poločas molekuly v lidském těle, například navázáním molekuly na polyethylenglykol, jak je popsáno v PCT patentové přihlášce WO 92/13 095.

Léčebně účinná množství aktivního proteinu nebo proteinů budou funkcí mnoha proměnných, zahrnujících typ antagonisty, afinitu antagonisty k IL-18, jakoukoliv zbytkovou cytotoxickou aktivitu vykazovanou antagonisty, způsob podávání, klinický stav pacienta (včetně požadavku udržení netoxické hladiny endogenní aktivity IL-18).

„Léčebně účinné množství“ je takové množství inhibitoru IL— 18, jehož podáváním se dosáhne inhibice biologické aktivity IL-18. Dávka, podávaná jedinci, ať už ve formě jediné dávky nebo více dávek, se bude lišit v závislosti na množství faktorů, které zahrnují farmakokinetické vlastnosti inhibitoru IL-18, způsob podávání, stav a charakteristiky pacienta (pohlaví, věk, tělesná hmotnost, zdraví, tloušťka), rozsah příznaků, souběžné léčby, četnost léčení a požadovaný účinek. Úprava a vytvoření stanoveného dávkového rozmezí jsou v silách odborníka v oboru, stejně jako metody prováděné in vivo a in vitro, stanovující inhibici IL-18 daného jedince.

Podle tohoto vynálezu se inhibitor IL-18 používá v množství přibližně od 0,01 do lOOmg/kg nebo přibližně od 0,01 do 10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo v množství přibližně od 0,1 do 5 mg/kg tělesné hmotnosti nebo přibližně od 1 do 3 mg/kg tělesné hmotnosti nebo přibližně v množství 2 mg/kg tělesné hmotnosti.

Cestou podávání, která se upřednostňuje podle tohoto vynálezu, je subkutánní podání. Dále se podle tohoto vynálezu upřednostňuje také intramuskulámí podání. K podání inhibitoru IL-18 přímo do místa jeho působení se upřednostňuje také jeho místní podání.

V dále upřednostňovaných ztělesněních se inhibitor IL—18 podává denně, nebo každý druhý den.

Denní dávky jsou obvykle podávány rozdělené na části nebo ve formě s prodlouženým uvolňováním, která je účinná pro získání požadovaných výsledků. Je možné uskutečnit také druhé nebo

- 17CZ 305653 B6 následné podání v dávkách, které jsou stejné, menší nebo větší než původní či předchozí dávka, podávaná jedinci. Druhé nebo následné podání může být aplikováno před nástupem onemocnění, nebo během jeho nástupu.

Podle tohoto vynálezu může být inhibitor IL—18 jedinci podáván profylakticky nebo léčebně předem, souběžně nebo následně s ohledem na další léčebné režimy nebo činidla (například násobné léčebné režimy), v léčebně účinném množství, zejména s inhibitorem TNF a/nebo jiným kardioprotektivním činidlem. Aktivní činidla, která se podávají souběžně sjinými léčebnými činidly, mohou být podávána ve stejných nebo v odlišných prostředcích.

Tento vynález se dále týká způsobu výroby farmaceutického prostředku, který zahrnuje smísení účinného množství inhibitoru IL-18 a/nebo antagonisty TNF s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Tento vynález se dále týká způsobu léčby onemocnění srdce, který zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství inhibitoru IL-18, volitelně v kombinaci s farmaceuticky účinným množstvím antagonisty TNF pacientovi, který to potřebuje.

Poté, co byl tento vynález plně popsán, odborníci v oboru ocení, že může být prováděn v širokém rozmezí odpovídajících parametrů, koncentrací a podmínek, bez překročení rozsahu a smyslu tohoto vynálezu a bez nutnosti dalších pokusů.

I když byl tento vynález popsán ve spojitosti se specifickými ztělesněními, bude zřejmé, že je možné ho dále pozměňovat. Tento vynález je zamýšlen k zahrnutí jakýchkoliv změn, použití nebo úprav vynálezu, sledujících obecně principy tohoto vynálezu a zahrnujících takové odchylky od předkládaného objevu, jaké vycházejí ze známé nebo obvyklé praxe v oboru, do kterého vynález patří a jaké mohou být aplikovány na zásadní rysy uvedené výše, vyplývající z rozsahu připojených nároků.

Veškeré odkazy, které jsou zde citovány, zahrnující články nebo souhrny z časopisů, zveřejněné nebo nezveřejněné US nebo zahraniční patentové přihlášky, udělené US nebo zahraniční patenty nebo jakékoliv jiné odkazy, jsou zde plně začleněny jako odkaz, včetně veškerých údajů, tabulek, obrázků a textu obsažených v citovaných odkazech. Nadto jsou jako odkaz plně začleněny také úplné obsahy odkazů, uváděných ve zde citovaných odkazech.

Odkaz na známé kroky způsobu, kroky běžných metod, známé metody nebo běžné metody není žádným způsobem přiznáním toho, že jakýkoliv aspekt, popis nebo ztělesnění předkládaného vynálezu jsou uvedeny, popsány nebo navrženy v dosavadním stavu techniky.

Následující popis specifických ztělesnění bude tedy plně ukazovat obecnou povahu vynálezu, kterou mohou ostatní, za použití znalostí z oboru (včetně obsahů odkazů zde uváděných) snadno pozměnit a/nebo upravit pro různá použití takových specifických ztělesnění bez dalších pokusů, aniž by překročili obecný koncept předkládaného vynálezu. Proto takové úpravy a změny patří do smyslu a rozsahu ekvivalentu předkládaných ztělesnění na základě zde uvedených údajů a vodítek. Mělo by být zřejmé, že zde uváděná terminologie nebo výrazové prostředky jsou pro účely popisu a nikoliv jako omezení, a že taková terminologie nebo výrazové prostředky, použité v předkládaném popisu, mají být odborníkem v oboru vykládány ve světle údajů a vodítek zde uváděných, v kombinaci se znalostmi člověka s běžnou znalostí oboru.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1: Inhibice IL-18 snižuje ischemickou dysfunkci myokardu in vitro

-18CZ 305653 B6

Materiály a metody

Reakční činidla: Isoforma IL-18BPa byla exprimována s N-koncovým tágem (His)₆ (sekvencí 6 histidinových zbytků) ve vaječníkových buňkách čínského křečka a vyčištěna do homogenity (stejnorodosti). Schopnost IL-18-BPa-(His)6 neutralizovat IL-18 byla popsána Kimem a spoluautory, 2000. Inhibitor ICE (ICEi) Ac-Try-Val-Ala-Asp-chlormethylketon (YVAD) byl získán od firmy Alexis Biochemicals (San Diego) a byl rozpuštěn v DMSO (dimethylsulfoxidu) v koncentraci 10 mg/ml. Před použitím byl ICEi naředěn Tyrodovým roztokem. U lidských mononukleámích buněk z periferní krve snižoval ICEi endotoxinem indukovanou sekreci zralého IL- 1β z 92 %, což bylo změřeno za použití testu ELISA (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ).

Izolované síňové trámce: U pacientů, kteří podstupují chirurgický bypass (přemostění) zvolené věnčité tepny s okysličovacím čerpadlem, je nutné zavedení kanyly do pravé síně. V tomto okamžiku je také rutinně vyříznut a vyjmut malý kousek přívěsku pravé síně. Z této odebrané tkáně byly získány trámce. Lidská tkáň síně byla při teplotě 4 °C vložena do okysličovaného modifikovaného Tyrodova pufračního roztoku. Modifikovaný Tyrodův roztok byl připravován denně za použití deionizované destilované vody a obsahoval D-glukózu v koncentraci 5,0 mmol/1; CaC₂v koncentraci 5,0 mmol/1; NaCl v koncentraci 118,0 mmol/1; KC1 v koncentraci 4,0 mmol/1; MgSO₄.7H₂O v koncentraci 1,2 mmol/1; NaHCO₃ v koncentraci 25,0 mmol/1 a NaH₂PO₄ v koncentraci 1,2 mmol/1. Tyrodův roztok bez obsahu substrátu obsahoval k udržení osmolarity chlorid cholinu v koncentraci 7,0 mmol/L Pokud není uvedeno jinak, byly chemikálie a reakční činidla získány od firmy Sigma. Dva že čtyř trámců (4-7 mm dlouhé a <1,0 mm v průměru) byly připojeny na snímač síly a byly ponořeny do zahřívané (37 °C) lázně o objemu 30 ml tvořené modifikovaným Tyrodovým roztokem, za normoxie, tedy normálních kyslíkových podmínek; lázní probublávala směs 92,5 % O₂ a 7,5 % CO₂. Tato směs plynů poskytovala parciální tlak kyslíku větší než 350 mm sloupce Hg (Imm Hg = 133 Pa; tedy 46,55 kPa), parciální tlak CO₂ 36 až 40 mm sloupce Hg (4,78 až 5,32 kPa) a pH od 7,45 do 7,45. Každý parametr byl rutinně kontrolován automatickým analyzátorem krevních plynů. Během pokusu byla teplota orgánové lázně udržována na 37 °C. Během simulované ischemie byla plynná směs přepnuta na 92,5 % N₂ a 7,5 % CO₂. Tato směs poskytovala parciální tlak O₂ menší než 50 mm sloupce Hg, tedy <6,65 kPa. Pufrační roztok byl kromě třicetiminutového období simulované ischemie měněn každých 20 minut.

Uspořádání pokusu: Trámce byly ekvilibrovány 90 minut ke zvýšení základní stahové síly na 1 000 mg a k umožnění stabilizace vyvinuté síly. Trámce, které byly neúspěšné při vyvinutí více než 250 mg vyvolané síly, byly z této studie vyloučeny. Během 90 minut ekvilibrace bylo provedeno nastavení tempa stahů, frekvence (pacing) za použití platinových elektrod (Radnoti Glass, Monrovia, CA) pro stimulaci pole. Elektrody byly umístěny na každé straně trámce, byly stimulovány (Grass SD9 stimulátor, Warwick, Rl) impulsy v trvání 6 milisekund napětím, 20% nad prahovým napětím a tempo bylo určováno při 1Hz během normoxie a při 3Hz během ischemie. Stahy byly monitorovány snímači síly (Grass FT03) a zaznamenávány počítačovým předzesilovačem a digitalizátorem (MacLab QuadBridge, MacLab/8e, AD Instruments, Milford, MA). Nepřetržitě byly monitorovány počítačem Macintosh.

Po ekvilibraci byly trámce od jednoho pacienta studovány za trojích pokusných podmínek: kontrolní podmínky sestávaly z 90 minutového normoxického promývání, období I/R sestávalo z 30 minut simulované ischemie a následné reperfuze v trvání 45 minut a třetí podmínky zahrnovaly anticytokinový zásah. V posledním případě byl anticytokin přidán do promývací lázně právě před nástupem ischemie a byl přítomný i během reperfuze v délce 45 minut.

Zachovaná trámcová aktivita CK (kreatinkinázy): Aktivita CK v tkáni po skončení reperfuze (90 minut) byla stanovena tak, jak popisuje Kaplan se spoluautory v J. Surg. Res. 54, 331-315, 1993. Tkáně byly homogenizovány ve 100 objemech ledově studeného isotonického extrakčního pufru (Cleveland se spoluautory, 1997 a Kaplan se spoluautory, 1993). Stanovení bylo provedeno za

- 19CZ 305653 B6 použití sady pro CK (Sigma) a automatického spektrofotometru. Výsledky jsou udávány jako jednotky aktivity CK na mg (vlhké hmotnosti tkáně).

Isolace RNA a s reverzní transkripcí spřažená PCR: Čerstvé trámce byly homogenizovány v přípravku Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati) a celková RNA byla izolována extrakcí chloroformem a vysrážením z isopropanolu. RNA byla rozpuštěna ve diethylpyrokarbonátem upravené vodě, ovlivněné DNázou a poté byla kvantifikována za použití GeneQuant (Amersham Pharmacia Biotech). Metody pro cDNA byly popsány Reznikovem se spoluautory v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2174-2179, 2000. Pro každou PCR byly použity následující posloupnosti: předehřátí po dobu 15 minut při 95 °C, poté cykly 40 sekund při 94 °C, 45 sekund při 55 °C a I minutu při 72 °C, s konečnou prodlouženou fází 10 minut při 72 °C. Optimální počet cyklů byl stanoven na 35. Primery pro glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (GAPDH), lidský IL-18 (Reznikov se spoluautory, 2000) a pro lidský IL-18BPa (Kim se spoluautory, 2000) již byly popsány. Produkty PCR byly odděleny v 1,5% agarózovém gelu, obsahujícím 0,5 x TBE (tj. 50 mmol. 1 ¹ Tris/45 mmol. 1 ¹ kyselina boritá/0,5 mmol.f¹ EDTA; pH 8,3) s ethidiumbromidem v koncentraci 0,5 mg/ml, vizualizovány ozářením UV světlem a vyfotografovány. Denzitometrie byla aplikována na negativní obraz (IMAGEQUANT software, Molecular Dynamics) a poměrná absorbance IL—18 a IL-18BP PCR produktů byla upravena (korigována) proti absorbanci, získané pro GAPDH.

Stanovení IL—18: Čerstvé trámce byly homogenizovány tak, jak bylo popsáno výše pro měření CK (kreatinkinázy). IL-18 byl analyzován elektrochemiluminiscencí v kapalné fázi (ECL, Igen, Gaithersburg, MD). Myší anti-lidský IL-18mAb (R & D Systems) byl označen rutheniem (od firmy Igen). Kromě toho byla afinitně vyčištěná kozí protilátka proti lidskému IL— 18 (R & D) označena biotinem (od firmy Igen). Biotinylovaná protilátka byla naředěna na konečnou koncentraci 1 pg/ml ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku, PBS (pH 7,4), obsahujícím 0,25 % hovězí sérový albumin, BSA, 0,5% Tween 20 a 0,01 % azid (pufr ECL). Při teplotě místnosti bylo po dobu 30 minut za důkladného protřepávání předem inkubováno 25 μΐ biotinylované protilátky na pokusnou zkumavku s 25 μΐ streptavidinem potažených paramagnetických perliček (Dynal, Great Neck, NY) v množství 1 pg/μΐ. Do zkumavek pak byly přidány vzorky pro testování (25 pl) nebo standardy a následně 25 μΐ ruthenylované protilátky (konečná koncentrace 1 pg/μΐ, naředěno v pufru ECL). Poté byly zkumavky protřepávány 24 hodin. Reakce byla ukončena přídavkem PBS v množství 200 μΐ na zkumavku a úroveň chemiluminiscence byla měřena analyzátorem Origen Analyzer (od firmy Igen). Detekční mez pro IL— 18 je 16 pg/ml.

Konfokální mikroskopie:

Lidská trámcová tkáň, získaná během zavedení kanyly okysličovacího čerpadla, byla umístěna do plastového držáku o velikosti 1 cm (Meldrum se spoluautory, 1998) upevněna a zmrazená v médiu pro mrazení tkání (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) na isopentanu chlazeném suchým ledem. Na kryostatu Leica CM 1850 (Leica, Deerfield, II) byly nakrájeny zmrazené řezy (5 pm). Řezy byly 10 minut fixovány v 4% paraformaldehydu, vysušeny vzduchem a inkubovány 20 minut v PBS, doplněném 10% normálním kozím sérem. Řezy byly inkubovány vnaředění 1:100 králičí protilátky proti lidskému IL-18 (Reprotech, Rocky Hill, NJ) nebo v neimunitním králičím IgG o koncentraci 1 pg/ml jako negativní kontrole. Protilátky byly naředěny v PBS, obsahujícím 1% BSA. Po inkubaci přes noc při teplotě 4 °C byly řezy trojnásobně promyty 0,5% BSA v PBS. Následně byly 60 minut ve tmě a při teplotě místnosti inkubovány se sekundárními kozí protikráličí protilátkou, konjugovanou s Alexa488 (Molecular Probes). Jádra byla modře barvena účinkem bisbenzimidu (Sigma) v koncentraci 1 pg/100 ml. Po barvení byly řezy promyty a testovány za použití Leica DM RXA (Lecia) konfokálního laserového zobrazovacího systému a analyzovány softwarem SLIDEBOOK pro Macintosh (Intelligent Imaging Innovations, Denver).

-20CZ 305653 B6

Statistická analýza:

Údaje byly vyjádřeny jako průměr ± střední chyba průměru. Průměrné změny vynakládané síly byly počítány vzhledem ke kontrolní hodnotě v 90. minutě pro tkáň každého pacienta. Statistická významnost rozdílů mezi skupinami byla stanovena prostřednictvím faktoriálu ANOVA s Bonferroniho-Dunnovou post hoc analýzou. Statistické analýzy byly provedeny za použití software STAT-VieW 4.51 (Abacus Concepts, Calabasas, CA).

Výsledky

Účinek neutralizace endogenního IL-18 prostřednictvím IL-18BP na postischemickou vyvinutou sílu

Obrázek 1A znázorňuje kinetickou odpověď trámců na I/R poškození. Znázorněna je konečná patnáctiminutová ekvilibrace a je normalizována na 100 % na počátku pokusného období. Kontrolní trámce jsou promývány za normoxických podmínek v průběhu celého pokusu. Jak je zřejmé, dochází v kontrolních trámcích ke snížení (10%) vyvinuté síly. Trámce podrobené ischemickým podmínkám vykazují rychlý pokles stahové funkce; při reperfuzi se stahová síla vrací na přibližně 25 % kontrolní vyvinuté síly. Oproti tomu trámce vystavené ischemickým podmínkám, avšak v přítomnosti IL-18BP, se vrátily na 55 % kontrolní vyvinuté síly. K hodnocení I/R odpovědi srdeční tkáně získané od různých pacientů byla úroveň vyvinuté síly v kontrolních trámcích během 90 minut stanovena na 100 % u vzorku každého pacienta a počítána byla poměrná procentní změna vyvinuté síly v pokusné skupině.

Jak je znázorněno na Obr. 1B, postischemická vyvinutá síla v neovlivňovaných trámcích (I/R) byla snížena na průměrně 35 % kontrolní hodnoty. Ovšem v přítomnosti IL-18BP byla toto snížení zeslabeno na průměrně 66,2 % kontrolní hodnoty při koncentraci 1 pg/ml a na 76 % kontrolní hodnoty při koncentraci 5 pg/ml IL-18BP. Tyto výsledky naznačují, že I/R vede k uvolnění biologicky aktivního IL-18 po zpracování endogenního prekursoru IL-18 prostřednictvím ICE. IL-18 byl tedy naměřen v čerstvě získané tkáni síní. Jak je znázorněno na Obr. 2, základní IL-18 byl přítomný v trámcích získaných před zavedením kanyly kyslíkového čerpadla do pravé síně. Po 90 minutách ekvilibrace, 30 minutách ischemických podmínek a 45 minutách opětného okysličení byly trámce homogenizovány a byla měřena hladina IL— 18. V tkáni po I/R bylo zjištěno 4,5 násobné zvýšení hladiny IL-18 (Obr. 2).

V těchto tkáních byly také stanoveny klidové hodnoty mRNA pro IL-18 a IL-18BP. Autoři pozorovali základní genovou expresi IL-18 a 1L-18BP v čerstvě získaných preischemických homogenátech síní (Obr. 3A, 3B). Podobně jako při zvýšení hladiny proteinu IL-18, indukovala I/R další zvýšení hladin mRNA pro IL—18 v klidovém stavu (4,7 násobné zvýšení). V čerstvě získané tkáni síní byla pozorována také genová exprese IL-18BP, která byla pouze mírně zvýšena (1,3 násobně) pro I/R.

Umístění IL-18 v lidském myokardu

Vzhledem k tomu, že protein IL-18, měřený prostřednictvím ECL, i mRNA IL-18 jsou přítomné v čerstvě získaných homogenátech myokardu, bylo k určení umístění IL—18 použito histochemické barvení. Tkáně síní byly získány těsně před zavedením kanyly okysličovacího čerpadla a byly okamžitě zmraženy (není znázorněno). IL-18 byl pozorován v usídlených makrofázích myokardu a v cévních endoteliálních buňkách. IL-18 je v makrofázích a endoteliálních buňkách přítomný už před ischemii vyvolanou operací a je přítomný i pokud nedošlo ke styku sjakýmikoliv cizími povrchy.

Umístění IL-18 v usídlených makrofázích a v endoteliálních buňkách je v souhlasu s dřívějšími studiemi konstitutivního přeformovaného prekursoru IL-18 v čerstvě získaných lidských periferních monocytech od zdravých subjektů (Puren se spoluautory Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,

-21 CZ 305653 B6

2256-2261, 1999). Je tedy možné uzavřít, že přeformovaný prekursor IL-18 existuje v myokardu pacientů určených pro by-pass (přemostění) věnčité tepny z důvodu ischemické choroby srdeční.

Účinek inhibice ICE na postischemickou vyvinutou sílu

Vzhledem ktomu, že IL-18BP účinně oslaboval ischemií indukovanou dysfunkcí myokardu, autoři tohoto vynálezu předpokládali, že inhibování přeměny přeformovaného prekursoru IL-18 na zralý IL-18 by měl rovněž oslabit ischemií indukovanou dysfunkci myokardu. Proto byl do promývací lázně před nástupem ischemických podmínek přidán YVAD, specifický inhibitor ICE. Inhibování ICE přídavkem YVAD pokračovalo v průběhu ischemických podmínek i během reperfuze. Inhibování ICE zprostředkované YVAD mělo za následek oslabení dysfunkce myokardu indukované ischemií, jak je znázorněno zlepšením stahové funkce z 35 % u kontrol při I/R na 60 % za použití 10 pg/ml a na 75,8 % za použití 20 pg/ml YVAD (Obr. 4). Tyto výsledky potvrzují, že biologicky aktivní IL-18 v lidském myokardu je výsledkem štěpení přeformovaného prekursoru IL-18 účinkem ICE. Kromě toho tyto výsledky ukazují, že ischemie myokardu může aktivovat latentní ICE.

Zachování životnosti buněk

Intracelulámí (nitrobuněčné) hladiny CK (kreatinkynázy) byly použity k určení stupně životnosti buněk po I/R. V tomto stanovení platí, že čím vyšší je hodnota CK, tím větší je počet živoucích buněk. Každý ze zásahu anticytokinů vyvolává ochranu životnosti buněk. Jak je znázorněno na Obr. 5, zvyšovaly IL-18BP a inhibice ICE (10 a 20 pg/ml) intracelulámí hladiny CK po I/R z 1,399 jednotek aktivity CK na miligram vlhké tkáně na hodnoty 5,921; 5,675; 6,624 a 4,662 jednotek aktivity CK na miligram vlhké tkáně. Toto pozorování naznačuje, že v tomto modelu ex vivo inhibování aktivace IL-18, indukované prostřednictvím I/R, chránilo životnost buněk myokardu.

Účinek neutralizace stahové funkce myokardu, indukované prostřednictvím TNFa

Jak je znázorněno na Obr. 6, vyvinutá síla trámců byla snížena po 90 minutách vystavení exogennímu TNFa o 18 %. Neutralizace působení endogenního IL—18 na stahovou funkci lidského myokardu, vystaveného exogennímu TNFa, inkubací s IL-18BP po dobu 10 minut před přídavkem TNFa, velikost poklesu vyvinuté síly snížila, viz Obr. 6. Po 90 minutách byla vyvinutá síla u kontrolní skupiny snížena o 18 %, zatímco u trámců vystavených TNFa poklesla o 58 % ve srovnání s kontrolami. Ovšem u trámců vystavených působení TNFa spolu s IL-18BP vyvinutá síla poklesla pouze o 30 % ve srovnání s kontrolami. Tyto údaje naznačují, že přímý účinek TNFa na stahový pokles v myokardu je zprostředkován, alespoň částečně, biologicky aktivním endogenním IL—18.

Účinek exogenního IL-18 na vyvinutou sílu

Dále byl stanoven přímý účinek exogenního IL-18 na stahovou funkci myokardu. IL-18 byl přidán k promývaným trámcům po 90 minutách ekvilibrace a při každé výměně lázně. Jak je znázorněno na Obr. 7, IL-18 vyvolal v průběhu doby pokusu pomalé, ale rostoucí snížení vyvinuté síly. Po 90 minutách nepřetržitého vystavení účinku IL-18 byla vyvinutá síla snížena na 42 %. Tyto údaje ukazují, že exogenní IL-18, podobně jako TNFa, účinkuje jako depresivum myokardu. Je zajímavé, že IL—18 není jako depresivum myokardu tak účinný jako TNFa.

Uchování životnosti buněk

Srdeční onemocnění se často pojí s apoptózou (odumřením buněk). Ke stanovení životnosti buněk v trámcích, vystavených účinku TNFa, byla měřena tkáňová intracelulámí kreatinkináza (CK). Při tomto stanovení označují vysoké hladiny CK živoucí buňky. Jak je znázorněno na Obr.

-22CZ 305653 B6

8, kontrolní trámce, které podstoupily 90 minutové promývání při normoxických podmínkách, obsahovaly 6 801 ± 276jednotek aktivity CK na miligram vlhké tkáně. Oproti tomu trámce vystavené 30/45 minutám I/R narušení, nebo 90 minutám účinku TNFa, vykazovaly snížené hladiny zachované aktivity CK v hodinách 1 774 ± 181, respektive 3 246 ± 217 jednotek aktivity na miligram. Trámce vystavené TNFa v přítomnosti IL-18BP obsahovaly 5 605 ± 212 jednotek aktivity na miligram tkáně. Je zajímavé, že trámce ovlivnění TNFa vykazovaly větší zachované hladiny CK ve srovnání s trámci po I/R. To bylo neočekávané zjištění, neboť velikost vyvinuté síly na konci pokusného období byla podobná po ovlivnění I/R i TNFa.

Příklad 3: IL-18BP chrání vůči infarktu myokardu in vivo

Metoda

Intramuskulámí elektrotransfer in vivo myšího expresního plasmidu IL-18BP

Myši kmene C57BL/6 dostaly v intervalu 3 týdnů tři injekce s expresním plasmidem, obsahujícím cDNA pro IL-18BP (označován jako pcDNA3-IL-18BP, popsaný v WO 01/85 201). Kontrolní myši byly injikováni kontrolním prázdným plasmidem. Myší isoforma d cDNA pro IL18BP, izolovaná tak, jak bylo popsáno (o průvodním čísle Q9ZOM9) (Kim se spoluautory, 2000), byla subklonována do míst EcoRl/Notl expresního vektoru pcDNA3 savčích buněk pod kontrolou cytomegalovirového promotoru (Invitrogen). Kontrolní plasmy byl podobným konstruktem, postrádajícím léčebnou cDNA. Kontrolní skupina zahrnovala 31 myší, pokusná skupina, která obdržela IL— 18BP, zahrnovala 27 myší.

Expresní plasmid IL-18BP nebo kontrolní expresní plazmid (60 gg) byl injikován jak do holenního svalstva, tak do léčebného svalstva myší po anestezi tak, jak bylo dříve popsáno (Mallat se spoluautory, 1999). Stručně uvedeno, za použití dvou plochých elektrod z nerezové oceli, umístěných 4,2 až 5,3 mm od sebe na každé straně nohy, byly udělovány transkutánní elektrické pulzy (8 elektrických pulzů s pravoúhlou vlnou, 200 V/cm, v trvání 20 msec při 2 Hz) za použití elektropulzačního zařízení PS-15 (Genetronics, Francie).

Indukce infarktu v levé komoře hodin po podání plazmidu IL-18BP nebo prázdného plazmidu byla u myší provedena anesteze intraperitoneální injikací xylazinu a ketaminu, ventilace a poté byl proveden řez hrudní stěnou. Levá hlavní koronární, věnčitá tepna byla poté trvale podvázána za použití prolenové sutury 8-0 k indukování infarktu myokardu, následně byl hrudník uzavřen a zvířata byla ponechána probrat se z anesteze. Úmrtnost při operaci byla menší než 20 %. Pooperační úmrtnost činila 48 % v kontrolní skupině a 25 % v pokusné skupině, přičemž k ní docházelo téměř výlučně 4 až 5 dní po podvázání.

Sedm dní po podvázání byly myši opět podrobeny anestézii a rozměry levé komory (LV) byly stanoveny echokardiograficky při uzavřeném hrudníku za použití echokardiografu ATL HDI 5 000. Frakční zkrácení LV bylo vypočítáno z měřených konečných diastolických a systolických průměrů. Na konci echokardiografického měření bylo srdce vyjmuto, fixováno a později nakrájeno na řezy. Histologické řezy byly barveny siriovou červení k určení velikosti rozsahu infarktu.

Výsledky

Diastolický průměr levé komory 7 dní po podvázání byl u přeživších myší následující:

0,53 ± 0,1 mm (n = 20) u myší léčených IL-18BP oproti 0,59 ± 0,1 mm u kontrolních myší (n = 16), p < 0,01.

-23CZ 305653 B6

Systolický průměr levé komory 7 dní po podvázání byl u přeživších myší následující:

0,45 ± 0,2 u myší léčených IL-18BP oproti 0,52 ± 0,02 u kontrolních myší, p < 0,01.

Frakční zkrácení levé komory: 15 ± 1 % u myší léčených IL- 18BP oproti 11 ± 1 % u kontrolních myší, p <0,01.

Závěr: IL-18BP snižuje úmrtnost myší po infarktu myokardu, indukovaném celkovým podvázáním věnčité tepny levé komory na 50 %. Kromě toho je významně zlepšení funkce levé komory, jak je prokázáno snížením systolickým a diastolickým průměrem levé komory.

Claims

1. Použití inhibitoru IL-18 k výrobě léčiva pro léčení a/nebo prevenci kardiomyopatie, kde inhibitor je zvolen z inhibitorů kaspázy-1 ICE, z protilátek vůči interleukinu 18, z protilátek vůči kterékoliv zpodjednotek receptoru interleukinu 18 a z vazebných proteinů interleukinu 18 nebo z isoforem, muteinů, fúzních proteinů nebo funkčních derivátů takových látek, vyvolávajících inhibici biologické účinnosti interleukinu 18.

2. Použití podle nároku 1, při němž inhibitorem je protilátka zaměřená proti IL—18.

3. Použití podle nároku 1, při němž inhibitorem je protilátka zaměřená proti receptoru a interleukinu 18.

4. Použití podle nároku 1, při němž inhibitorem je protilátka zaměřená proti receptoru β interleukinu 18.

5. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, při němž protilátkou je humanizovaná nebo lidská protilátka.

6. Použití podle nároku 1, při němž inhibitorem ICE je Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chlormethylketon, tzn. YVAD.

7. Použití podle nároku 1, při němž inhibitorem IL-18 je vazebný protein IL-18 nebo jeho isoforma, mutein, fúzní protein nebo funkční derivát, vyvolávající inhibici biologické účinnosti IL18.

8. Použití podle nároku 6, při němž je inhibitor IL-18 na jednom nebo na více místech glykosylován.

9. Použití podle nároku 6 nebo 7, při němž fúzní protein obsahuje imunoglobulinovou Ig fúzi.

10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8, při němž funkční derivát obsahuje alespoň jeden zbytek, připojený na jednu nebo větší počet funkčních skupin, které se vyskytují jako jeden nebo větší počet vedlejších řetězců na zbytcích aminokyselin.

11. Použití podle nároku 9, při němž je uvedeným zbytkem polyethylenová skupina.

12. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, při němž léčivo dále obsahuje antagonistu faktoru nádorové nekrózy tzn. TNF.

-24CZ 305653 B6

13. Použití podle nároku 11, při němž se inhibitor IL-18 použije současně, postupně nebo odděleně od antagonisty TNF.

14. Použití podle nároku 11 nebo 12, při němž antagonistou TNF je TBPI a/nebo TPBII.

15. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, při němž se inhibitor IL—18 používá v koncentraci v rozmezí přibližně 0,001 až 100 mg/kg, nebo přibližně 1 až 10 mg/kg nebo 2 až 5 mg/kg.

16. Použití expresního vektoru, obsahujícího kódovou sekvenci pro inhibitor IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci kardiomyopatie, kde inhibitor IL-18 se volí z protilátek vůči interleukinu 18, z protilátek vůči kterékoliv zpodjednotek receptoru interleukinu 18 a z vazebných proteinů interleukinu 18 nebo z isoforem, muteinů nebo fúzních proteinů takových látek, vyvolávajících inhibici biologické účinnosti interleukinu 18.

17. Použití expresního vektoru pro indukci a/nebo zvýšení endogenní produkce inhibitoru IL— 18 v buňce pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci kardiomyopatie, kde inhibitor IL-18 se volí z vazebných proteinů interleukinu 18 nebo z isoforem, vyvolávajících inhibici biologické účinnosti interleukinu 18.