HU229164B1 - Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of heart disease - Google Patents

Description

Ι A találsoássy mvérnmőstói tótegségekkal tepessdatos.. A találmány tárgya közeiabfeöl IL-lá iahihim1 mk alkahsszssa tóvbombáttefom kezelésé® és/vagy megelőzésér».,

I A sstok® mwltekia 19-st <11-1b) «mtótífeg iatefete-y (kbN-y) iatóálő fetotkósA kzák fe [Natasám

Ι és mmkatem. (1989)]. Ak IL-lá hasd jele az 1 síposé T-theíbcsss segítő sejtek (Tilt sejtek) kifejlődésére

Ι átlóst válasznak, Az 11-19 se 11- I 2 és 11-3 táktorokkah aosigéselskei, msösgénetai és valószlsöleg más egyéb fektorukkal együttesen váltja ki az lEM-y termelődését Az IL-18 feleli a QM-O és se £1-2 tenselödését és { pelswitozza a® artd-CDS été kivtatí T-s^ít szaporodást, vakmist aövelí a temémstea ölő (killer) sejtek (fes | által kösveöteb sejtpmtítő hatását

Az étet tl-IŐ s megfelelő elővegyöiefeői ksletedk az 11-lp konvertáló wém (ÍCB, kaszpáz-1) tótéira.

Az 11,-19 rkseptos legalább tó fe>mpöf«sböl áll. amelyek kőxjwőköőaek a ,iig«temk megkötésé| boa, Az 11,-19-stt kötő kb és zagy affitdtásö kötőhelyeket találtak egetek 11-12 ától stimulált T sejtesben és | ebből aoklársoti tesgzez komplex létezékótO kőveteMtek (Voshkooto ás (19^8)j. Étidig két re| segitA alegységet szoooshotM, mindkettő az 11-1 seoepter mafeátó tetőzik [Pattó és ssmkasfete (I99ö) és i Kim és mtetófeat (2öOl)j, Az 11- 1.9 jelátvitele sofeo az Mt-zB aktiválódik [DiDeuato és maatóámi {1997)1, t Az 11-1 § twpíst· kompién tót reeepfer lástebol áll, az egyik az 1!,~1ΚΕο nevű hgaorfeteksffi lánc, a másik az

11-lffiffi nevö jelálvivő lát®. Az tt-llR láfiset eléször mist a fadioskOv Izotóppal jelzett IL-i 9-hoz kötődő ssjilblófeb groíefet kBiöobstték el, A poAefet tetefetták és tstótatánzzíák amisxmtwímíájét. és Igy kideodt, hogy azssros a korábhse felit ?L-líUe tótő gwehmek {Ik-lÜsp} nevezek ''árva (otpim) ttógtemal fTongee és sosotlístársag (1999)1.

Nemrégiben emberi vizeletből elkáteitóek egy ultferó pootsfeh amely nagy affinitást matat az 11-19-fesz és ezzel embssi éa eyéss «DNS-ι valamint smtód zést klsksoatsk (feovlek és mnakatámi <1999) és WO 99109043 stómtm közzétett németed szabadaboi bejetotésj. Ezt a goetfefe 11-19 kötő pzefebmek savazték el éOL-lö biófeg protein. 11- 19BF).

Az 1L-1SBF nem egy fetwst R.-1Ő receptor sejteskívdlí doooónfe, Itass® a sztovezaíben kiválasztott, a tazefessetes körlblyoetaiokbaa fesztvavö pAksfe, amely a kiválasztott proteinek egy éj családjába tártak köfenfelzA a azffillszMnis által kódolt ps-otefeakkei együtt (Nnvíck és ostakfeársai, 1999), A vizelet és a tekotobináns tt-lSÖP Is spsxffikosao, nagy affinitással köti az lt-19-at és ezáltal módosba. az 11.,-10 biológiai alTssitáSiik

Alegáilapkobák, hegy aat it-lőBP gétt sz esőben llgi3 temestómátón helyezkedik el:: a á,3 kb getsas szskveoeiábi® sast találtak bommmfefáa demmn ezeo kóstolást. Bődig mtótfees sz IL- i 9BP négy, alternatív sffiAS agitál álstl geoseáb wkbssát vagy izefasoját (változatát) azonosították, Eaeket az IL-iOBF g„ ó, g és B tewel látták ek ffifetl a sésy szolbnosak (váhs>zstsak) azteos sz N-végesoportja. ős skáfö a C-vegesepostfe [tásvisfe és mostesiámi, {1999)), Elsőse ax IL-1Ó kötís képessegek is. A ségy szolét® hözill az «mbéri 11.-1 ÓBB

ΦΦ 56 * « és g ixoriji-míától ismert, hogy sz ΪΕ-18-aí semlegesítő kápességgsl rendelkeznek. Az emberi It-188P izoform « keresztretskeióba lép sz egérfeie II -18-cat

Szívbetegségeknek olyan -rendellenességeket neveznek, amelyek a szívizomét vagy a szív véredényeít érintik (The Merek Mannal Home Edition, www.rn.erek.com). Vaszknláris rendellenességnek a véredények resKtellenességeít nevezik, ilyen rendellenesség például. a szűkület által okozott elégtelen vérkeringés, A szívbetegségeket szívénendszeri rendellenességeknek is nevezik,

Az Iszkémiás szívbetegség a szívelégtelenség szokásos oka; ez a leggyakoribb halálok a nyugati világ országaiban. Leggyakrabban a szívkoszorúerek zsíros elfejrsfess {'atetoms) okozza. A szívizom károsodásai közé tartozik az iszkémiás begesedés és az akut inferkms. Egészséges szív esetén a szívkoszorúerekben folyó véráramlás éppen megfelel a szívizom anyagcsere igényeinek. Iszkémiás szívbetegségről akkor beszélünk, ha a vérellátás elégtelen, akár azért·, mert maga a vérellátás .kórosan elégtelen, akár azért, mert a szívizom hiperttófiája miatt nagyobb mértékű vérellátásra lenne igény. A szívkoszorúerekben lévő véráramlás az egészséges szívnél föggetlen az aortában kialakuló nyomástól, mert létezik egy hatásos önszabályozó mechanizmus a szívkoszorúerekben átfolyó véráramlás szabályozására.

Ha egy fokoszorúétben - általában ateroszkiétözís vagy aterioszkíerözis miatt - szűkület alakul ki, akkor a szívkoszorúerekben lévő véráramlás előszöris azért van akadályozva, mert a szűkület következtében a távoli pcriferiés ellenállás csökken. Ha az ér fessen (keresztmetszet) több mint ?5%-kal csökken, Iszkémia alakul ki, különösen akkor, hs a szívkoszorúér kollsferslri keringése elégtelen.

A szívizom anyagcseréje különösen aktív, az egyes szívizomtostok több mint 3ö%fet a mitokondrinm teszi ki Alapvető fontosságú az aerab anyagcsere, mivel nagyon csekély a tartalék a nagyenergiájú foszfotekhól. Szívizom halál akkor 1¼ fel, ha a szövet ndenozinírifoszfot (ATP) szm^e nagyon alacsony és ha az anaerob glikozilok látszólag elfogytak. Akárcsak más szöveteknél, a balál pontos oka ttom ismert, de a halálos kimenetelő szívizomkárosodások kapcsolatba hozhatók membránkárosodásokkal és a kalciumnak a sejt citoplazmájába történő hirtelen belépésével. Áz iszkémia rövid időszakai után a szív véráramlása hclyrcúllhítt (ezt nevezik mperfáztónak). Egy kritikus ídőlstómllum után azonban a reperfílzió lehetetlen, valószínűleg a hajszálér endotélium sejtjeinek megduzzadása miatt,

A leggyakoribb srivkoszotűér betegség az ateoszkletózis. Az iszkémiás szívbetegség oka a szívkoszorú artériákban lévő elégtelen átátamlás Is lehet Ennek gyakori oka a síroké, különösen a vérrög által okozott elzáródás.

Amint az előzőekben rámutattunk, az iszkémiás szívbetegséget & szívizomban lévő véráramlás és a szívizomban lejátszódó anyagcsere szükségletei közötti egyensúly felbomlása okozza. A véráramlást akadályozhatják az ebhez Sámdó események, például úrgörcs, trombózis és az áramlás csökkenését okozó keringési változások.

A szívkoszorúereken végbemenő vétótsmmfes függ az estis (aorta dtaszfoíés nyomás) és a koronázta szinusz (jobb pitvari nyomás) közötti nyomáskülönbségétől. A sztsrtoíés szskssz alatt a szívkoszorú artériák vérátáramlását a csökkend, a szlvkoszotóerck szándékánál kialakuló Veaturi hatás és a kamra összehúzódása alatt a szívizom «temek kompressziója. A szívkoszorúerekben lévő vérátáramlást csökkentő tényezők közé tetőzik a csökkent aortás díssztoiés nyomás, a megnövekedett kamxtó nyomás, a szívkoszorúerek szűkülete, sz aorta billentyűk szűkülete és a visszafolyás, valamint a megnövekedett jobb pitvari nyomás.

φ.φφφ φ

φ «· ΦΦ

ΦΦ φφχ φφ φ

φφ

V

Φ·φ·

Φ φφ »

φφφ φ· φφ «

ΦΦΦ

A viszonylag fess trorobusok ttlolttteo gysteso Aalmaxaak trmbolhS:os kezelést, feltett swafeekhtéxzai vagy tóvet plaafeoogáo sktiváíösrsü ÓTA). .Az tesnfestt festeáttt eredményező kezeléssel az esetek löbbségébeo víssxaéHítóó a véráramlás. Ex hozzájárni s sélyaa sttvleomkárostfeteok megelőzéséhez, hs időbea, ax eseményt követó közölhetői egy tett bellii végslk; a kezelés legalábbis elősegíti a további káwo~ áások csökkentését.

Ax angina pestem az tettésoktt sztvfeiogságokoéi fellépő ftótegySöes, melyet tómmkhan jelentke» fe, átektteo «gyesem mögötti vagy fevtájáfe mellkasi indáim jellemez, A szívizom infarktust Icgfettote has szívizom isttfefe okozza, Fellépőét hirtelen sjávfe< ttttibsto a tevroboro mám egy érán belől vagy még a ttetttt -fellépése előtt. Ex évente Ml ööö - ttXMXI «sebest érint

Ax egyéb szívbetegségek közé tartók ax alkoholos szlvlxembáotalom, ax aorta blliefeyh prolapsxnsa, ax aorta bl.lletey# feltett, a mAa'limoszavarok, a kardlogén sokk, oe öröklődő szívbetegségek, a szívizom tág»» lássa! járé betegsége, a szívroham, a tettsttgteeoseg, a szív tegsosios betegségei, a ttldöfeéfe bhfettyá szűkülete, a hlperöőfiával járő zxtvlzomfeobtem, a kllopáiitt fevizoteháttateö, ax ísttémiás .fevfetegség, a mltós {ttthegy#} billentyűnél kislakaié víssaafotyás, a tetette bllieotyá ptolapsxusa, a felles tetet kiafetelő sAtómbámalom és a s-tebil ssgloa.

Ax iszkémiás szivizömbeiegségek közé iattók. a szívizom Isfehtus is.. Bőnek kilépésében előzményként szerepet játszik a sxfekosxorőérhen lévő, elzáródást októ trrnnlm, axax a fékélyes vagy ei&joteos, .szűkületet októ plattoo lévő írombos. A tevteztefetes kialakuló elzáródást októ trombus okozza ax akut, a teljes feba kite^edö szívizom ifetrtesstt fetefe. Érgöres előxménye lehet a szivteszorfereh meszesedése és véttsnette aggregetek de ttfekoltet ezek teltei is, A szívizom bferktusban oofette is felléphet.

A szívizom ín&rktns öitxy soorttégttl megjelenése többféle sebet A irasszmurálls (ez egeex fent kiterjedő} lofeteís a bei kamra teljes vastagságira kifejte. a tfevfelbttlytt)l a fevbotökig. A sznbtóofeatdűdis íatótas során több elhaláson gitt alakul ki, mely o b el kamra fefett egyharmadát ~ esettedét érinti, A testese htfekios szövődményei kőte öntözik a szivrlűnmzaw éa a vezetési zavarok, a “hirtelen halál* fetetőségével, ax Ittbrters tevábbfesjeslése, ax kdárktns Ismétlődése, a szőkűletes szívelégtelenség (tlidőődéma), a kardtogén sokk, a fevbioOkxyttiodtt, a fevfehsn fellépő trombózis, amelyet etette kísérhet, a tetei szakadása, amelyet szlvtamponád kitehet a popttáris tzom szakadása, amely elétetett bilfcotyb működéssel társulhat éa a kamrai erek toűlht testes (votektem aaeorixmos),

A tettess istekte {Ml} alsht a sxfvixm istetess efebtet ésjhk, amelyet éhtebso a tevkosxoráeeetet kifolyó vétem birteleo etekkeoése okoz.

Ax etet sxtvizom in&rfciasbaa szenvedő beieg.sk több miat Mteahl ste ostew tetei ki, amely gyakran plskk letetessl jár egyikt, ás amely eltejs a fcteotet iertetei ellátó sitteát, smelyát előzőleg egy steeosekietetes gbte ste leteikkefi, Ax éttetmesebesos platt ttsl okozott oteoteliáte vétetett tea# telteik megváhoxoít tttloosette teltette Ibtehetteg sttkéo teattjántl a ttombŐM kttttuteáhox. A tetette a betegek terbtete tttesiuttetól sgootes tetetek, így 24 órával a kitektttt ote assgte a Ütegek éttá-átti teilbte teosbtes,

A tettem bttttett bizonyos esetekben na titttetee hhlttttl etette etasxa például a shttte blltegyb vagy ax aorta tektete. festett állal etetett tevbelltttyagyolttltt vagy sorvadás kitt okozott ssf vbeb· hteyggyoliadte)· Sxívtem Iterktost letett olyas httegekoél le, ttlkoél ax egyébként egészséges tevkoseett snénáb gttoss lépett lók A kötete isttstev tetetette arlésis gitebl okoz, igy a koktttegyasttttoál a ktts0* 4 * * #00 0 X 04 * * * 000 0 000 “* “ ·«» *« tn válthat ki sttgisráf vagy szívizom ínfárkrisst Autopaziás vizsgálatokkal és sz,ívkoszoná angiográfrával kimatatták, hogy a kokain által kiváltott szívkoszorúér trombózis egészséges szivkoszssrd artériákban is kialakulhat, vagy a már lőtezó aterómára rakódhat rá.

A szívizom infarktus elsősorban a hal kantra (ventrikula) betegsége, de a károsodás kiterjedhet a jobb kamrára (RV) és a pitvarra is, A jobb kamrai infarktust általában a jobboldali koszorúér v&gy egy lő baloldali ívalaká artéria szűkülete okozza, «agy jobb kamra töllönyomás jeliestzi és gyakran súlyos, a háronthegyü {iríeuszpid} billexhyöttől kialakuló visszafolyás és a kilépő véráram csökkenése kíséri. A jobb kamrai reudellenesség valamilyen formája a betegek körülbelül felénél fellép. alsó-hátsó infarktussal együtt, ®s a betegek lö-15%'ásái okoz véráramlást rendellenességet

Az, hogy a szív képes-e továbbra ís pumpaként működni, közvetlenül a szívizom károsodásának mértékétől függ.

Az egész falat érintő fttnnszmnrális) infarktus a szlvizoax teljes vastagságára kitajed, a szívburoktól & szívbelhártyáig (epikarrlitnutól az otafokardkanig}, és általában sz EKG-» megjelenő abnormális Q hullám jellemzi. A nem tnmszmtnáiis vagy szabeadokardíálrs infarktus uem fetjsd ki. a kamra falának teljes vastagságára és csak az ST szegmensen és a T bullámban okoz eltérési, A sznbojsdokardiális infarktus általában a szívizom belső egyhanösdára terjed ki, ahnl a falta kifejlett nyomás ά legnagyobb és ahol a szívizom véráiáramlása & keringési változásokra a legérzékenyebb. Ezt tartós alacsony vérnyomás követheti. Mivel a íhl teljes vastagságára. kiterjedő szivizoaseíh&lás fnekrózisi által okozott halált kliaiksüag nem lehet pontosan meghatározni, az infarktusokat az EKG-n látható eltérés alapján Q hullám ős nem Q hullám infarktusokra osztják, A károsodott szívizom térfogatát & CR emelkedés kiterjedése és időtartama alapján lehet becsülni.

Á szív iszkémlás megbetegedései közé tartozik az íszkémiás szivizornbánialom. A betegség előzménye lehel szívizom infarktus is, & betegség oka azonban a szívkoszorúerek súlyos, valamennyi íö ágat érintő meszesedébe okozza. A következmény az elégtelen vérellátás, ami izontsejí veszteséget okoz. A ftbrőztssal együtt járó ízorasejt veszteség szövetközi kollagén lerakódással jár együtt és a teljesítmény csökkenéséhez vezet, ami a szív kísérőjelenségként fellépő tágulásával együtt a megmaradó ízomsejtek túlterhelését okozza. A folyamat tovább halad, kompenzálásként a szívizom folyamatosan megnagyobbodik. Az ízomsejtek; nagyobbodása (hípertrófia) mellett hiperplázia (a sejtek felszaporodása) ís kialakulhat, amisek következtében a szív hatalmas mérető lesz (a normál méret 2-3-szorosa). Végöl a szív már nem képes kompenzációra, és a. szívelégtelenség arírmíáf és/vagy iszkémtás rohamokat okoz, Kiímkaiiag lassan, de folyamatosan rosszabbodó szívelégtelenség alakul ki, akár volt előzőleg szívizom infarktus vagy anginás fájdalom, akár nem. Az iszkámiás szívizombántalom felelős az iszkémtás szívbetegségek által okozott halálozások 4Ö%-áért.

A szívben lejátszódó iszkémtás esemény ős reperfúzíó alatt a szervezetben sokféle endogén közvetítő (medtátot), így számos ktsmoletalájú másodlagos messzenázser termelődik, amelyek károsan befolyásolják a szívizom működését Az iszkémtás 'esemény ulán néhány percen 'belül csökken a szívizom Smehőzódásának. erőssége, és az, hogy ez visszaáll ·« & aotmál értékre, nagymértékben fogg se iszkémtás időszak hosszától (Daemen ős munkatársai (1 W9)j. Egy iszkémtás esemény alatt például a kafcínmion belső egyensúlyának Chomeoszíázisánük) zavara lep föl, oxígőrfeöl származó szabad. gyökök keletkeznek és nitrogésmsöoxíd (MO) szintézis és felszabadulás megy végbe. Emellett a eítokinate hely Heg is termelődnek, különösen a TNF« és az íL.-lh [Belli (1990)).. Az érintetlen szivhen ezek a citokinek hozzájárulnak a szívizom úrakémia állal kiváltott rendellenes működéséhez, mert gén expresszáfődást váltanak hl as indukálható MO színtáz (iNOS) [Daemen ős rf * rfrfrf rf rf X rf ·* rf rfrf rf rf rfrf ♦ rf » rfrf rf * X ♦ rfrfrf rf rfrf rfrf rfrfrf rf,* rf « _x rfrfrf muiskísiársai (1999)], a cikloosigenáz-2 (CGX-2.) és a foszfelipáz A2_X továbbá vaszkuiáris adhéziós molekulák és számos kemokia vonatkozásában. Ennek eredményeként azonnal csökken a szívizom összehúzódásának ereje, amelyet a kismolekulájú. messzendzserefc közvetítenek, ezt a cítokínek által közvetíteti neutrofll beszúróáés követi, ami tovább károshga a szívizmot. Állati szivek vér és vértermékek nélküli vizsgálata szerint TNFa [Herskowitz és munkatársai (1995)] és IL-Ιβ keletkezik az iszkésúás esemény alatt. A szívizomsejtek szintén csökkentik az Összehúzódás erejét az endogén cítokínek halasának következtében [Meldrum és munkatársai (1998)1.

A szívizom TNP«. és az 11.-1 β áltói közvetített rendellenes működésére vonatkozó kísérleti adatok többsége állatkísérletekből származik. Vizsgáltak azonban kiterjedt szlv-tödöartéria bypass műtéten átesett betegekből nyert emberi szívízomszövetet is, ellenőrzött ex vivő körülmények között (Gurevích és munkatársai (199ő), Cleveland és munkatársai, (1997)1, Ezekben a kísérleti modellekben humán pitvari trabekulál (a szív belső bordázatából származó szövetet) véon.sntes fiziológiás oxigénellátásé potíerflrdöben szoszpeodáitak, majd szim»· Iáit iszkémiás esemény hatásának tették ki. Ezalatt az idő alatt sz összehúzódás ereje ugrássz&röen csökken; amikor a szövet oxigéxicilá-ását visszaállították, az összehúzódás ereje megnőtt, de nem. érte ei az eredeti értékei ($0-70% csökkenés), és a szívizom károsodás bizonyítékaként keratin kinéz (ceratine kínase) felszabadulását lehetett kimutatni (Gureviteh és munkatársai (199(1),, Cleveland és munkatársai (199?)], Ha a TNE biológiai hatását specifikusan semlegesítjük az iszkémía/reperí&m (l/R) időszaka alatt, az összehúzódás erőssége nagyobb mértékben áll vissza, azt jelezve, hogy az endogén TNF aktivitás hozzájárul a szívizom összehúzódásnak az iszkémiás esemény által kiváltod rendellenességéhez (Cain és munkatársai (1999)].

Daemen és munkatársai (1999) vese iszkémiás egérféle modellen tanulmányozták az isz&émia és az ezt követő reperfúzió által kiváltott szővetkárosodást. Kimutatták, hogy az ÍL-1 8 mKNS télszabályozása a kaszpáz-1 aktivitással együtt lépett fel, az iszkémlát kővető első napon. Az lFN-γ és az ít-12 mKNS túlszabályozása az iszkémíát. kővető ő. napon következett be. Együttesen, de külósvküióo. nem, fellép az IFN-v áltól indukált IL-12 és ÍL-18 cítokínek semlegesítése es csökken az ÍF.Ny fllggö 1. és 2. osztályba tartozó MMC felfelé szabályozása az 1FN-y semlegesítéssel azonos mértékben.

Az IL-18 inhibitorokat és ezek betegség-környezetét leírtók a szakirodalomban.

Például a WÖ98/248Ö4 számú nemzetközi közzétételi iratba» mterleukra-ΐβ konvertáló enzim (IGE) inhibitorokat ismertettek. A dokumentumban azt is kimutatták, hogy az IGE szerepet játszhat, a programozott sejipusztíilásbsn vagy apoptózlsban, továbbá hogy az apoptózis gátlásának terápiás alkalmazása magában foglalhatja a szívizom infsrktas kezelését.

A WOÖ1/589SS számú nemzetközi közzétételi nuőrna anö-XL-lS antitesteket ismertettek. Ezen antitestek számos különböző elméletileg lehetséges terápiás alkaknszáss között megemlítik a szívelégtelenséget, a szívizom ínfarictust és a szívízomhántóimat,

A WOŐ1/85201 számú nemzetírőzi közzétételi irat 11.-18 inhibitorok áterosxklefősris esetén történő alkalmazására vonatkozik.

Séta és munkatársai [Heart, 84, ÓŐ8-ŐŐ9 (2bó9)] az 1E-18 akut szívizom, infarktusban játszott szerepet ismertetik, és akut szívizom infarktusban szenvedő betegeknél az ÍL-18-at a srivkárosodáá maskeréaek javasolják.

* * X

A WOOI/Ö37Í9 szántó «eniztók/tói közzététóli iratban oszteoprotegerint, a tumor uekrózis faktor receptor szuperesaíádjának egy tagját, valamint esnek. csontmefebolízmus szabályzásában játszott szerepét árják le. Ebben a dokumentumban számos vegyüiettel végzett kombinált terápiáról la szó van, ezek között megemlítik az H.,-18 tóbibitoroksi ás a TOF-mhibitorokat. Ebben a dokumeatumbaa szívbetegségekről nincs szó.

Eddig azonban nem írták le, hogy az EL-18 szerepet játszik a szivizomhántalombasi,

As^mfeyjssgglbgliitósía

A találmány azon a felismerésen alapul, hogy sz 11.-ig inhibitorok lényegesen növelik a szív összehúzódását szuprafüzíós humán pitvari iszkémíás/repetfeiés modellben. A kaszpás-i (1CE) gátlása szintén gyengíti az iszkémia és reperfúzió «tán bekövetkező összehúzódás erősségét.

Egérééle szívizom infarktus modellben az ÍL-1 § inhibitorok javították a túlélés esélyeit és jelentősen növelték a kamrai működést.

Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy az IL-lá inhibitorok szívizom iafadttus kezelésére és megelőzésére alkalmazhatók.

A találmány tárgya 11,-18 inhibitorok alkalmazása szivizombántalom kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmazható gyógyszerek előállítására.

.A itóálítóiny tárgya továbbá az .11.-18 inhibitort kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós vektor alkalmazása szivizombántalom kezelésére és/vagy megelőzésére. így génterápia alkalmazásával juttathatjuk el az BL-1 8 inhibitort a beteg szövethez vagy sejthez.

Aytóg<?kröytójtótósa

1. ábra: az IL-1SBE hatása iszkémia áltól kiváltott rendellenes szívizom összehúzódás esetén (A) Kinetikai válasz az ixakétólás károsodásra. Az egyensúly íeq) beállását kővetően a kontroli trabefalát normái oxigénellátás biztosítása mellet szninafuzíonáltuk a kisérki slati.. A tarbekrdát iszktótós/reperfeíó hatásának tettük ki ÍL-18SP jelenlétében és anélkSl (5 ug/nb). A függőleges tengelyen az összehúzódás erejét ábrázoljuk a kezdeti erősség (0 időpillanat) százalékában kifejezve. Az adatok egyetlen beteg trabefeuíájáhóí származnak. és a módszer szempontjából reprezentatívnak tekinthetők a 90 pere alatt kialakult átlagos változások számítását tekintve.

(8) Az összehúzódás erőssége az iszkémia után, az ÍL-lb-nak 1 vagy 5 pg/mi ÍE-18SP-vei történő semlegesítését kővetően. Az adatokat a kontrolihoz viszonyított erő százalékos változásaként fejeztük ki, a reperéúzió teljes végbemenetelét (90 pere) kővetően. A zárójelben lévő számok az EL-18BP pg/ml-ben kifejezett koncentrációját jelentik. N=ő. * p<0,Öl az f/R-hez viszonyítva (iszkémia/reperéúzió}.

2. áhra: a szívizom Í.L~i8 protein tartalmát mutatja. A trabefalát, 90 perces sznprafúzió után homogenizáltuk, normái oxigénellátás mellett (kontroll) illetve 45 perecéi a 3Ü perces iszkémia után (í/R). A tarbefalát ugyanahhoz az alanyhoz viszonyítottuk. Az IL-18 szinteket a függőleges tengelyen ábrázoltuk, pg/ml-bea. NMAp<ö,ÖÍ.

3. ábra: az 1L-1.S és az ΪΕ-18ΒΕ mRNS egyensúlyi ssiotjét routóiis a kontroliban ás az iszkémiás pitvari szövetben.. Az ÍL-18 és az IE-1SBE mRNS szintjeit RT-ECR-rel határoztuk meg. Egy vagy több alanyon kapóit adatokat értékeitüak, A az etídtmnlsomid sgsréz géb mutatja, amelyben a ECR termékeket elkőlömtettSk, snlg “B’^! a EC? termék mennyiségi értékeinek a kontrolihoz viszonyított változását mutatja (GAEDH).

«44 Μ » 4

4, ábra; &ζ ICE gátlásnak az íszkéiuia után kifejtett erőre gyakorolt hatását mutatja. Az adatok az íszkétniafeeperhiziő utáni átlagos erőnek a kontrolihoz viszonyított százalékos értékeit mutatják. A zárójelben lévő számok az ICEi koncentrációját mulatják pg/ml-ben. N~?« *p<ő,01 az í/R-hez viszonyítva,

5. ábra: a szövet keratin kináz (CK) aktivitását matatja az ϊ/R-t követően. A CK-t a szövet nedves tömegének l milligrammjára vonatkoztatott hatásegységekben fejeztük ki, A kísérleti körülményeket a vízszintes tengely alatt tüntettük, fel. Ctrl és í/R, N-~6; 1L-I8.BP (.$ X,g/mí)₅ N™·.?; ÍCEi (10 és 20 pg/ml), N~5 mindegyik esetben; *p<0,05, az l/R-hez viszonyítva,

S, ábra: a 10 pg/ml-rel .15 percig inkabált trabekula által kifejtett erő átlagos változása az egyensúlyi állapot beállását követően, százalékban megadva, a TNFa (1 ng/ml) hozzáadása előtt. Mindkét fürdőhöz hozzáadtunk TNFa-t és 1L-18BP-1,

7. ábra: & hantán pitvari ttabekula 1L- I8~ra adott ideiglenes válasza normál oxigénellátás mellett. Érett 1L-18 (löO ng/ml hat adtunk a pitvari trabekaláhöz a kísérlet 90 pere időtartama alatt. A függőleges tengely a kifejted erő átlagos változását matatja a kezdeti értékhez viszonyítva. A kezdeti értéket az egyensúly beállása után határoztuk meg (nincs ábrázolva)), n^Ő. *p<Ö,Ö5, **p<0,ÖÖl, a kontrolihoz viszonyítva ugyanolyan időpontot véve figyelembe, a kísérteti időszak további részében.

8. ábra: A szívizom szövet krnatia kináz aktivitásának megmaradását ábrázolja l/R hatása Mén, TNFa ti ag/ml) és TM'Pa (1.0 og/ml)HI,-ÍSBP, A CK. aktivitást 1 milligmmm nedves szövette vonatkoztatva adtuk meg (n~ő).

A.Mtemysvrészte;e:yssn;ertetóse

A taláhnány azon a felismerésen alapul, begy az· IL-Í8 inhibitorok kedvező hatást fejtenek ki szívbetegségekben, különösen iszkémiás szívbetegségekben. Amint azt a következő példák is szemléltetik, különböző 11,-18 ínhihteokról mutattuk ki, hogy jelentős kedvező hatást fejtenek ki a szívizom íszkémía ülést kifejtett erejére.

Emellett egy íí,»í8 inisibitest I» vívó szívinfarktus modellben is vizsgáltok, és kedvezőbb tóiélési adatot és lényegesen jobb kamrai működést mutattunk ki.

A találmány tárgya ezért 1L-i8 iutóbiior alkalmazása szívízombántalom kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerek előáll kására,

Szívizomhánraíom alatt a kamrai szívizom minden szerkezesi és működési eltérésiéi érijük.

A megelőzés kifejezés alatt a jelen találmány értelmében nemcsak egy bizonyos hatás teljes megelőzését érijük, hanem a hatás minden részleges és lényeges megelőzését, enyhítését, redukcióját, csökkentesét és a mérséklését, a betegség kialakulása elöli vagy annak korai szakaszában.

A kezelés meghatározás alatt »jelen találmány értelmében a betegség előrehaladására kifejtett kedvező hatást értjük, ide értve- a betegség enyhítéséi, redukcióját, csökkentését vagy mérséklését a betegség kialakulása utáni bármilyen kóros jelenség vonatkozásban.

Az *71.-18 inhtbitef’ alatt a jelen találmány érteimébe» minden olyas molekulát ériönig amely mérsékli az li.-M termelődését és/vagy hatását oly módon, hogy az lb-18 termelődése és/vagy hatása gyengül vagy csökken, részlegesen, jelentősen vagy teljeset! gátolva van vagy hlofckoíódík.

Az ÍL-18 hatásának inhibitorai lehetnek iL-18 ;miitestek, így & poliklonális és mosoklonális antitestek.

φ *· * Φ ** X ΧΦ * κ 4Φ Φ « ·> X Φ * < 4 V χ ψ * * ♦ ΦΦΦ φ «Φ* «»* »β φ φ 4 Φ Φ κΧφΦ4φφ«

A találmány szerint t-z 11,-I8 inhibitort a kővetkező csoportból vúlaszíluk: kaszpáz-l inhibitorok (1CE), as II- · 8 elleni antitestek, az 1I.-18 receptor alegységek bármelyike elleni antitestek és ezek ÍL-18 kötő proteinjei, izoriirtsjas, mutánsai, kondenzált proteinjei, ezek fonkeíős származékai, amelyek gátolták az 11,-18 biológiai hatását.

Az ”il,-Í8-at kötő proteinek” meghatározást az ÍL-18 kötő protein* és az * IL18-BF” kifejezésekkel azonos értelemlxm használjuk, Ide tartoznak azok az ii..-I S kötő proteinek, amelyeket WO 99/09063 számon közzétett nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetnek (Nóvickés munkatársai (1999)), iáé eazve sz 11-18 kötő proteinek térbeli szerkezetben eltérő változatait és/wgy az 1L-I8 kötő protein izofermjak, amelyeket Kint és munkatársai (2000) azonosítottak, és amelyek az 1.1..-18-hoz kötődnek. Az lL-i8BP~nek különösen az emberi g és e ízotbrmjai alkalmazhatók előnyöset) a jelei) találmány szerint. A jelen találmány szerűn alkalmazható proteinek lehetnek glikozílezett vagy nem glikozilesett proteinek, származhatnak természetes forrásokból, igy vizeletből, vagy előnyösen lehetnek rekombínáns eredetűek is, A rekombínáns expresszió lehet ptokarióía expresszibe remiszer, mini az E. coli, vagy eukatióta, előnyösen emlős expresszlós rendszer.

A mutáns” meghatározást a jelen leűásbaa az Π..·· l.8BP-vel és a vírus I.L-18BF analógjaival kapesolatbán alkalmazzuk, ahol egy természetes 1L-18BF vagy vírus 1L-Í8BP egy vagy több aminosav-maradéka, különböző aminosav-matadékokksü van helyettesítve vagy törölve van, vagy az IL-188F természetes szekvenciájához egy vagy több antisosav-matadék van hozzáadva, vagy egy vírus IL-ISBP, amely nem változtatja meg jelentősen a képződő termék aktivitását a vad típusú lL-18BP-veí vagy a vírus 11-18BF-vel összehasonlítva. Ezeket a mutánsokat ismert szintézissel és/vagy hely-irányított suutagenszis technikákkal vagy bármilyen más, eme alkalmas ismert technikával állítják elő.

A jelen találmány szerinti mutánsok például mtklemsavak, például DNS vagy RNS által kódolt proteinek, amelyek Π,- I8BP-1 kódolnak, vagy vírus 1I.-I8BÍM kódolnak a jelen találmány szerinti szigoré feltételek mellett, A szigorú íéltétolek kifejezés a hibridizációra és sz azt követő mosásra vonatkozik, és azt őrijük alatta;, amit a szakember általában szigorú” feltételeknek neves (Ausubel és munkatársai fent idézett közletaénye, derest Protocols in Molecular Biology, Interscicnce, NY,, 6.3 és 6.4 (193?, 1992) ős Sambrook és munkatársai fenti idézett közleménye}, A szigorú feltételekre példaként. a korlátozás szándéka nélkül a vizsgált hibrid Tm hőmérséklete alatti hőmérsékleten, így 12-20 ’€ közötti hőmérsékleten végzett mosását értjük, például 2xSSC és 0,5% SDS 5 percig, 2zSSC ős 0,1% SDS 15 percig: Ö,íxSSC és 0,5% SDS 37 *C-on 3Ö-ŐÖ percig, majd ÖJxSSC és 0.576 SDS 68 ^eC-ou 30-60 percig, A szakember számára ez azt jelents, hogy az alkalmazandó szigorú feltétetek függenek a DNS szekvencia hosszától, az otigonukleotiti próbákról (így például 10-40 bázisra) és a vegyes oiigonukleeiid próbáktól. Ha vegyes próbákat végzőnk, előnyös a tetrametil-ammómomklorid (TMAC) alkalmazása az SSC helyett (lásd Ausubel font idézett közfeményétj.

Minden ilyen mutáns smiaosav-szekvenota, előnyösen IL-18BP szekvencia kellő mértékben hasonló az II-I8BP szekvencia duplikátjához vagy kellő mértékben isssonlő a vírus H.-18BF szekvencia duplikfejához, és igy az H..· ISBP-veí összehasonlítható hatása vas. Az IL-I8B? egyik hatása az, hogy képes megkötni az .11.-18-at. Ha a mutáns kellő mértékű kötődési aktivitással rendelkezik az lt.-l.8BP-re nézve, akkor alkalmazható az 1L-18 tisztítására, például affinitás kromatográfíával végezve és ezért a hatása kellően hasonló az IL-18.BF halé.sához, Azt, hogy egy adott mutáns hatása kellően hasonló-e a az IL-18BF hatásához, szokásos kísérteti elrendezéssel határozhatjuk sneg, például úgy, hogy a mutánst egyszerű szendvics versengési kísérleti elrendezésben.

<) χ φφχκ φ φφ » «χ * * * * φ φ φ ><·

Φ Φ χ ♦*'φ φφ vizsgáljuk, és meghatározzuk, hogy milyen mértékben kötődik az izotóppal fotóit ILHŐ-hoz; alkalmazhatunk például. tadiotnummessszét vagy ELISA esszét.

Egy előnyős megvalósítás szerint egy mutáns szekvenciája legalább 40%-ban azonos vagy homológ a vagy az 1.L~1SBP v&gy & vírus által kódolt IL-18BP homológ szekvenciával, amint azt a WO Ü9/Ö9ÖŐ3 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetik. A szekvenciák azonossága még előnyösebben legalább Sö%, legalább Óö%, legalább 70%, legalább 80%, legelőnyösebben legalább $0%,

Az IL-18BP polipeptid mutánsai vagy a vírus lL-18BP-k mutánsai, amelyek a jelen találmány szerint alkalmazhatók, és az ezeket kódoló nakleinsavak tartalmaznak egy lényegében megfelelő szekvencia szakaszt, és ezekkel helyettesíthetők az olyan peptidek és polinofcleotídefc, amelyeket a szakember rutinszerűen alkalmaz, de a jelen leírásban adott kiianítás és útmutatás alapján nem szükséges atkahnazásukhoz méltánytalanul nagy terhet jelentő kísérletek elvégzése.

A jelen találmány szerint előnyösek azok a maíáasok, amelyeket konzervatív helyettesítőkként Ismernek. Áz IL-18BP poiipeptidek, proteinek és vírus ÍL-18BP-k konzervatív aminosav helyettesítéses (szinonim aminosavakkal helyettesített) megfelelői hasonló fízikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek ahhoz, hogy a csoporton belüli aminosavval való helyettesítés megőrizze a molekula biológiai funkcióját (Grandiam 0974}]. Nyilvánvaló, hogy lehetséges aminosavak beékslése a fenti szekvenciákba vagy a szekvenciából való törlése is, ha ez nem okozza a funkció megváltozását; különösen ha csak néhány, például 30-nál kevesebb, előnyösen 10-nét kevesebb aminosav beékeiése vagy törlése történik, és a működés szempontjából döntő fontosságú amínosavakat, például a eíszteinesopertokat nem. töröljük vagy helyettesijük. A proteinek és az ilyen törlésekkel és/vagy beéke lése kkel kapott mutánsok a jelen találmány körébe tartoznak.

Az előnyös szinonim 'aminosavakat'az 1. táblázatban adjuk meg. A különösen előnyős szinonim anrinosavakat a 2, táblázat tartalmazza; a legelőnyösebb szinonim aminosavakat a 3. táblázatban adjuk meg.

1. táblázat

Előnyős szinoním aminosavak

Aminosav	S zínenim ami nösav&k
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Glu, Lys, Glu, Kis
Leu	Be, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Alá, Thr, Pro
l'hf	Pro, Ser, Alá, Gly, His, Gin, Thr
Áia	Gly, Thr, Pro, Alá
Val	Met, Tyr, Phe, 11«, Len, Val
Gly	Alá, Thr, Pro, Ser, Gly
Be	Met, Tyr, Phe, Val, Len, Be
Phe	Ttp, Met, Tyr, Be, Vál, l.eu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, 11«, Val, Len, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asm, íiís, Thr, Arg, Gin

2, táblázat Különösen előnyős szinoním amínosavafc
Amisosav	Szinonim aminosavak
Ser	Ser
Arg	Hb, Lys, A.rg
Len	Len, fíe, Phe, Met
Pm	Alá, Pro
Thr	Thr
Aia	Pro, Ah?
Vb	Val, Met, ife
Gly	Oly
lle	He, Meg phe, Vei Í,e«
Phe	Meg Tyr, ife. Leu, Phe
'i>·	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
G.b	Gitt, Gin, His
ÁSS.	Asp, Asm
Lys	lys, Arg
Asp	Asp, Áss
Gh:	Gb, Gh·
Mét	Meg Phe, He, Val, .Leu
Tsp	Trp
3. táblázat
.A legelőnyösebb szinonim amínosavals
Amiaosav	Szinonim asaínosavak
Ser	Ser
Arg	Arg
Lee	Len, He, Mel
Ere	Pro
Thr	Thr

X »· * «*»« *

Φ * ·χ

XX# V #

Az II..-188F polipeptidek te proíeiaék mutánsainak és a vírus IL-18BF muíánsahiak aminosav helyettesítéssel történő előállítására a találmány értelmében bármely ismert eljárás alkalmazható, igy például a 4 959 314, 4 588 585 te 4 757 462 (Mark te muslmtársm}, sz 5 116 945 (Kelte te munkatársai), a 4 965 195 (Namen és snuuluttárssi), a 4 879 111. (Chong és munkatársat) és az 5 017 691 (Lee és munkatársai).számú amerikai egyestül államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett eljárások. Lizimtei helyettesített proteineket ismertetnek a 4 904 584 széinú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban (Shaw és munkatársai).

A kondenzált protein'¹ teeuhniúro:tes alatt olyan polipeptideket ériünk, amelyek ll.-lSBF-t, vaus IL·18SIM, ezek íragmenseit vagy mutánsait tartalmazzák egy másik proteinnel kendenzáiva, ahol a másik protein példáid hosszabb ideig tartózkodik a testiolyadékban. Az 1L-18BF vagy a vírus ÍL-Í8BP egy másik proteinnel, polipeptiddel vagy hasonlóval lehet kondenzálva, ami lehet például immunglobulin vagy egy únmtrnglcbaíús fragmenss.

A funkciós származékok meghatározás alatt az IL-lSBF-k és a vírus IL-18BP olyan származékait, mutánsait és kondenzált proteinjeit érijük, amelyek a maradók eldaliáncán lévő funkciós csoportokon vagy az Nvagy C-végesoportos aíakhhatók ki a technika állásából ismeri eljárásokkal, és amelyek a találmány körébe tartoznak, amennyiben a protein halasa, ami lényegében azonos az 11.Ί8ΒΡ vagy a vírus iL-18BF-k hatásával, nem vész. el, és az ilyen származékokat tartalmazó gyógyszerkészítmény nem rendelkezik mérgező tulajdonságokkal.

Az ilyen származékok kézé tartoznak például pelietüén-glikel oldalláncút tartalmazó származékok, amelyek maszkírozzák az antigén kötő helyeket és növelik az ÍL-188F és s vírus Í1-18BF ellenállását a testfolyadékban, További származékok például a karboxíesoporton kialakított alifás észterek, a karboxíesoportoa ammóniával vagy printer vagy szekunder amittokkal való reakciókkal kialakított amídok, az amnsosavesojxsriok szabad armsoesopcrtjats acilcsoportokkal. (például altenoílcsoportokkai vagy karfcocíklusos amiicsoprotokkal) *4 * X 4 4 * Λ 44 π

való makelöval kialakított N-aeil származékok, valamint a sztfead itidorziesopímokotr (például a szarta és a öeonin maradékok hidroteesoporljam) aedesoportokkal való rttegáhatásste kialakított O-ttell-sztfeutazékok,

A találmány egy további előnyős sztegvsbósiiása szerint az IL-1 á inhibitor sz ,11-1 g vagy tusnak meeptom, az 11,.-:18R ellem zotlteot. Ax :11..-18R alegységei ekeni antitestek, amelyek eloacsxése 11.-1 bfetr és β, szódén alkaiotezhatók a jelen láiálmáoy és-te tetetem.

A íttetetnttuy szermtl antitestek lehelnek poliklonahsak vagy motioklonáilsak, knner, hmssaaizáít vagy akár teljes mértékben emberi antitestek. A tekotubiteitss antitesteket és egek ikgamaossh ez Ih-lk-hms és az ít-löikhez való négy In vivő kötess atetetels és az. alacsony teslcilás jellemzi,. A iteálnstfey szerint alkalmazható antitestek jellemzője, begy ezekkel a beteg egy pategéa állapot vagy egy pstogén állapottal kapcsolatos bármilyen tünet vagy rüoetesopon megfelelő vagy jelentős vlssmfejlódéséhez vagy enyhüléséhez. szükséges ideig kezelhető, és kevéssé toxikus.

Eemtegesitö nttetestek könnyen képezitetök áliatokhns, például aynlákban, keeskékben és egetekben, 1L-tfe-eal vagy 11,-lkfete-vsi vagy β-val való lummorztUásaal. lotenanzáb egerek a hibriöámak előállítására kitiömásén jól alkateteghaiö 8 sejt ImoÁsrtk, amelyek nsgymeanyfeégö aud-l!..-iá menokionátls antitest temtelásére alkabttedtatek,

A kimer tetemetek olyan Immoaglobalin molekulák, amelyekre jeltemzö, hogy két vegy több szzgmetssúk vagy részük kaíöshözö álfetfejokból etted. .Ákteábss & kimet antitest változó része nézte emberi emlős smtitestből, például egérfelék arditestéhöl származik, az immntrgkifedin államid része pedig erniteri immunglobulin molekulából származik. Előnyösen mindkét rész és a komblnáelő is esek kfemériékbea ttemnrnfeál, ami szokásos eljárásokkal nseghatesozöteé [Eiliod és mnnkniársal, 1994( A homuolzéh ttnbtesteh olyan Immunglobulin molekulák, amelyek géntechnológiai úton állíthatók elő és amelyekben sz egérfeléból szármnzá állandó részt annak esttel megfelelője helyettesíti, tnig az egérí'éie antitest antigén kötő helye változatlan. A kapott egértembsr köztér assthest emberiséi előnyösen kisebb mértékben Immunizál ás kedvezfeth tarmakektetedkai tolap őostzágökkái rendelkezik fefetight és oumkatársai, 1993(

Egy további előnyös megvalósítás szerbé az 11,- 19 és nz It-ISR antitestek humanizált antitestek. A humanizált aoti-il-lá asdtestékr® előnyős példaként az EFö37öéőÖ szabadalmi lesthan issnerteteö antitestek említhetők..

Egy másik előnyös megvalósítás szerint az antitest egésze ernhsri amitest, Emberi tetetnetek előállítására, szolgáló eljárásokat részletesen ismertetetek például a WÖÖÖ/WIÓ, n Wö 99/53049, a OSö 162 9© és az AU Sdsölöö számú szabadalmi iratokban,

A teljes egészéhes emberi antitestek előállítására szolgáló egyék eljárás szerint az egér testnedvekkei kapcsolatos (humomhs) immttnrmnlszerét hmnamzálják”, azaz például 9iyan egér törzseket állítattak elő, amelyek képesek emberi lg termelésére (smmegér). Ax eljárás szériát otsitefe itmnmtgieitollo! (lg) Websek he olyas egérbe, amelyben az endogén lg géneket iosfeiváte. Az lg helyek hatása komplex, mbtel fizikai szerkezete géttkészletök és expremzlés feiyamate révén széles nsotmtválastd atkáik. Sokfele antitestet elsösofeau kmeblnaiortkns eiteodszáshen lehel: előállítani, kölönhözö, az lg ladyeken található V, D és I gének között. Ezek a helyek tersalmazzák a köziteiktstolt szabályozó elemeket fe, amelyek szabályozzék az antitest éxpmssgálóöást, ax alléi kizárási, az osztály kspesolást és az alhaitás érését, A nem áteenrlezeit etulseri lg inassxgéoek egérbe való bevezetésével kimutatták, hogy az egér rekentbináfeós gépezete össtefehetó (komp13 ♦ *x * X íí *

S * >'X tibilis) az emberi génekkel, A kblőnitözö izotipnsekkal hn-mAbs hniásáts specifikus hibndöma kiválásaié atstsgéneket lehet előállítani a satjoegér antigenmel való Itmnnmzálássvei,

Teljes mértékben smbsri snbtesteh és esek előállítására szolgál® eljárások ismertek a technika állásából (teste példáéi Meudoz és murtóámi (1997): Baggomasm és .tennkafersal (1991): Tomüoks és wtaM (lőttel köztessényét és a WO 93(24893 szarná szabadalmi srasotj,

A találmány egy kdlőnöse® előnyös megvslöshástt szedet sz 11-18 inhibitor egy 1L-18BF vagy ennek izölbrtma. mutánsa, kondenzált pfotefeje, fenkeiós származéka, Ezek sz izoterteok, utteáztsok, kondenzált proteinek és fenkcios szdeeutzékok megőrzik sz 1L-18BE biológiai hetessé kdldnöaen sz ll-iá-hoz veid kötődésének képességét, és előnyősön legalább egyféle hatásuk megegyezik tsz 1L-18 hatásával. ideába esteden ezek a prommsk bielöglallag hatásosabbak «sínt a ateteotelntlan Ik-13.139, .Az ib-I8BF szekvenciákat és ezek hasított szátmszéksk váltessmdfezsslbmgast a WO 99(ő9öb3 számú szabsdslete iné szerint állíthatjuk elő, vagy biovtek és mastealátsal (1999) vagy Kíax és nsnnkatársal ('3ÖÖÖ) eljárása szerint.

Az Ik-lbBF femkciés származékait polimerekkel kmpagálbapnk, és tetei proteinnek kedvezőbb ttbajdonságokst, példán! jobb stabilitást, hosszabb felezési időt, kedvezőbb biológiai bozzéférbtedséget, sz emberi szemezte által történő jobb elvlselhelöségei blzttssltbamnk és elkerülhetjük sz ümmmizálö öntési. Ennek a óéinak az elesés® éntekében az lldő-BE-t Snmzákapcsolhatluk péklésd polseíbénglikolhoz (EEG), A E&ö-bez való kapcsolást Ismert eljárásokkal sbgozbeijdk, példán! a WO 92(1 3095 számú szabadalmi lemben temertutatt eljárással.

bzéít a htlálmány egy előnyős snegvaldsdása. szedte az 1L-1.8 mblbltomk, különösen na B..-1.8BE PEGdsez van kapcsolva.

A találmány egy további eidnyds megvalósítása szerbé: az 1L-18 inhibitor kondenzálva von egy lmmmsglnbtdlmish azaa egy proteinnel. Az ilyen kondenzátorai sz. 11,-18 kdtd pestem egészét vagy annak egy részét tarbámmtes, ami vagy tmmnogteteelftms! vagy sónak egy részévei van ksmdenzálvs, A szakember számára nyilvánvaló, hogy a kapott találmány szerinti kondenzált protein megérzi az 11,-18.139 hatását, különösen sz .11.-18-at kötő képességéi. A kemtemtálás lehet közvetlen de tdrténhet egy rövid linket proteinen kereszted la, smt állhat példán! 1-3 ambtnsavbél, de lehet hosszabb, például 13-20 sntbtesavbd! állő pepiid maradék Is. A tetei linket' leltet egy írlgepiid. anuílynek s szekvenciája E-F-M (Gls-Ebe-Met). de leltet például egy 13 aminesssvböi álló bokor te, .amelynek szekvenciája öfe-EhaOly-Áte-Gly-kamVzi-Lteoöly-Gly-GhnEhe-Mes, ahol a tente latkor sz Π.-Ι8Β9 szekvencia és az inmmsgiobnlm szekvencia közé van betelve. A kapott kmntenzdb protein kedvezőbb Inlmdoaságokkal rendelkezik, Igy a testíolyadékbáo hosszabb Ideig marad meg (nagyobb a felezést Ideje), nagyobb a specifikus hatása, nagyobb az expresezálddás szintje., vagy egyszerűbb a kondenzált proleln teszikasn.

Egy előnyös magva kiáltás szerkő as IL-I8BP az lg molekula, áilandb részéhez van kondenzálva. Előnyősén a tteltez lánc sadtaszhoz van kondenzálva, akáteaak példáéi sz emberi IgGl CB2 és a CHS dstmaiojes. Az IL-lŐBP-t és egy ltototngdobolm egy részéi terialumzö specifikus kondenzált proteinek egy generációját Ismertetik például a WO 99((190§3 számú szabadalmi kai 1l, példájában, Ás lg metekalák egyéb izoibragsl szintén alkalmazhatók a találmány szerinti fezids proteinek generációinak eiöállüásám, Így példám az lgG_; és az IgG^ izofermok, vagy teás lg: osztályok, Így példáid az IgM és az IgA, .A kondettfek protehtek lehetnek nsonemer vagy mokrmer proteinek, és betéte- v&gy hotmmndmnerek.

A találmány egy további ixsegvniósdásélüoí a HL-18 inhibitort sgy TNF antíigorüstávai kombinációban (együttesen) aitsümazznk. A INF antagonista sokféle úton fejtheti ki hatását. Áz egyik át, hogy az antagonista a TNF molekulához kötődik vagyis azt szekves^tálja keltő affinitással és specifikus módon ahhoz, hogy részben vagy lényegében semlegesítse a TNF receptor kötéséért felelős TNF epitópot vagy epitőpokat (ezeket a továbbiakban “szekveszter avtegonistának'' is nevezzük), A szevkveszter antagonista lehet példáid a TNF elleni antitest.

A TNF lehet olyan antagosnsta is, amely gátolja a TNF jelátviteli ótvonaiat, amelyet a. sejtféíületi receptor aktívái a TNF kötődése után (a továbbiakban ezeket jelátviteli antagonistáknafc is nevezzük).

Az antagonisták mindkét csoportja alkalmazható szívbetegségek kezelésében vagy megelőzésében, önmagokban vagy együtt, Illetve egy ÍL-ÍS inhibitorral kombinációban.

A TNF antagonisták könnyen azonosíthatók és in vitro könnyén értékelhető a természetes TNF-re és az érzékeny sejtvonalakra, például az emberi B sejtekre való listásak, amelyekben a TNF sejtburjánzást és immunglobulin kiválasztást vált ki. A vizsgált mbták TNF készítményt tartalmaztak a vizsgálandó antagonista különböző hígításai mellett, ahol a hígítás például ö,l-2ÖÖ-szoros mólarányban történt az alkalmazott TNF mennyiségéhez viszonyítva; emellett csak TNF-et illetve csak antagonistát tartalmazó mintálmt is vizsgáltak (Tuecí és mutAatásviai, 1992),

A találmány szériát TNF aníagomstaként előnyösen szekveszter antagonistát alkalmazunk. A szekveszter antagonisták közül előnyösek azok a polipeptidek, amelyek a TNF-et nagy affinitással kötik és csekély mértékben immunizálnak, Az ohfeató TNF receptor molekulák és TNF semlegesítő antitestek különösen előnyösek, A jelen találmány szerint alkalmazható például az oldható TNF-RI és TNF-RÍÍ. Ezeknek a receptoroknak a csonkolt változatai, amelyek tartalmazzák a receptorok sejten kivált domaínjait vegy ezek funkciós részeit, különösen előnyös találmány szerinti antagonisták. Csonkolt I típusú és II típusú oldható TNF receptorokat írnak le például az EP 914431. számú európai szabadalmi iratban.

A TNF receptorok csonkolt fonnál oldhatóak, ezeket kimutatták a vizeletben és a szérumban mint 30 kDa és 40 kDa tömegű TNF inhibitor kötő proteineket, asnelyeket T8Pl-sek illetve TSPH-nek neveztek el (Engefmann és munkatársai, 1995)), Az- lt-18 inhibitornak a TNF antagonista alkalmazásával egyidejű, ezt kővető vagy önálló alkalmazása is előnyös a jelen találmány szócsőt.

Egy további előnyös megvalósítás szerint a találmány szerint alkalmazható TNF antagonista az emberi TNF-RI (T8P1), amely oldható. A természetes és rekombínáns oldható ‘INF receptor molekulákat és ezek előállítási eljárását írták le az EF 3Ö8 378, FF 398 327 és EP 433 900 számú európai szabadalmi iratokban.

A jelen találmány szerint alkalmazhatók a receptor molekuláknak a funkcionálisan hasonló származékai, ftagmensei és biológiailag hatásos részes is, A receptor molekulák biológiailag aktív ekvivalensei vagy származékai a polipeptid megfelelő szakaszára utalnak, vagy arra a szekvenciára, amely kódolja a receptor molekulát, megfelelő mérető és képes a TNF-et olyan affinitással megkötni, hogy a motöfeíánhoz kötött T.NF recqnorral való kölcsönhatás gátolva vagy blokkolva legyen.

Az II.«18 inhibitort a TNF inhibitorral egyidejűleg, .azt követben vagy elkülönítve alkaímazhayuk.

A találmány szerint a gyógyszer tartalmazhat továbbá szívbetegségek kezeléséin alkalmazható ismert szereket is, így például aurátokat, például nitrogltcermt, vizh^tóUt, ACF febtbitotoksi, digitálist bétablokkoiökat, kalcium blokkolókat, az ÍL-18 inhibitorral együttesen. A hatásos szereket alkalmazhatjuk egyidejűleg, egymás után vagy elkülönítve.

ΦΦ X * *#φφ φ * « φφ *# * XXX χ X Φ % *»♦ »* »»« ♦» ♦«« ♦♦» »♦

A találmány egy további előnyös megvalósítása szerint az lt-18 inhibitort körülbelül 0,001.-100 mg/kg, 1-10 mg/kg vagy 2-5 mg/kg mennyiségben alkalmazzuk.

A találmány szerinti Π..-1 8 isbibifort előnyösen szistíétnásan adagoljuk, még előnyösebben szubkután vagy iatremuszkulárisan.

A iaiábuásy tárgya továbbá egy IL-Í8 inhibitort kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós vektor alkalmazása szívizombántalom kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmazható gyógyszer előállítására, ahol az ÍE-18 inhibitor a kővetkezők közül van kiválasztva: lt-18 elleni antitestek, az ít-18 receptor alegységek bármelyike elleni antitestek és 11,-18 kötő proteinek, vagy esek szeformjaí, mutánsai, kondenzált preteíxyeí, amelyek gátolják az IL-18 biológiai hatását. így génterápiás módszerrel lehet az IL-1S inhibitor: & kellő helyre juttatni. A szívbetegség kezelésére és/vagy megelőzésére az lt-18 inhibitor szekvenciát tartalmazó génterápiás vektort kőzvetíenül a beteg szövetbe fejőkíáliteljök, ezzel elkerülve a génterápiás vektorok: szisztémás alkalmazásával járó gondokat, úgymint a vektor felhígulása, a célsejtek vagy szövetek megeélzása és elérése, továbbá elkerüljük s mellékhatásokat is.

A találmány körébe tartozik az IL-18 inhibitor endogén termelődését kiváltó és/vagy elősegítő vektor alkalmazása. olyan sejtben, amelyben az 11,-18 inhibitor espmszálása normálisan gátolva van, vagy amely trem elegendő mennyiségben expresszáija az inhibitort, ahol az lt-18 inhibitor a következők közül van kiválasztva: .11,-18 kötő proteinek vagy özek -izoformjai, amelyek gátolják az 11.-18 biológiai hatását. A vektor tartalmazhat olyan szabályozó szekvenciát, amely funkcionális abba» a sejtben, amely .11.-18 inhibitort kívánnak exprosszáltahé, A szabályozó szekvenciát a genom jobboldali helyére vezethetők be homológ rekombinációval, igy működőképesen kötjük a -szabályozó szekvenciát ahhoz a génhez, amelynek expresszálását kiváltani vagy növelni szándékozunk. Ezt a technológiát általában endogén géaaktív;bás®-:u:k nevezik, és a WO§ 1/0995 S számú szabadalmi iratban ismertették.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy az II.-18 expresszálását közvetlenül is lezárhatjuk, ha 11,-18 inhibitort alkalmazunk ugyaaüyea technikával. Esnek, elérésem a negatív szabályozó elemet, így például, az expresszáiást gátló elemet bevezethetjük az Í.L-1.8 gén helyére, ezzel lefelé szabályozva vagy meggátolva az 11,-18 expresszióját. A szakember számára egyértelmű, hogy az 11,-:8 expresszálásánák ilyen módon történő lefelé szabályozása vagy gátlása ugyanolyan hatású a betegség megelőzése és/vagy kezelése szempontjából, mint egy 1L-18 inhibitor alkalmazása,

A találmány szerint alkalmazható IL-18 inhibitort előnyösen gyógyászati készítménybe adagoljuk, adott esetben egy TNF isfeíbkcr gyógyászatilag hatásos mennyiségével együtt.

Az ÍL-18I3P és ennek fent leírt izofomgai, mutánsai, kondenzált proteinjei, hmkoiős származékai, hatásos frakciói -és cirkulárisa» permuíált származékai a gyógyászán készítmények előnyős hatóanyagai

A gyógyászatilag alkalmazható meghatározásba beleértünk .minden olyan hordozóanyagot, amely sem befolyásolja a hatóanyag biológiai hatását és nem léit ki mérgező hatást arra a szervezetre sézve, amelybe a gyógyszert adagoljuk. Parenteráiis alkalmazást» a hatásos proteint vagy proteineket foiekciőként alkalmas dóxiscgységkém törnsázhatjuk, szálhtóanyagként fiziológiás soohfei»:, dexttözt, szérum albusunt vagy Ringer oldatot használva.

A gyógyászati készítmény hatóanyagát a találmány szerint a kezelendő egyed szervezetébe többféle úton juttathatjuk be. A kezelés történhet iatradermálisan, trauszdsmálisan (például késleltetett felszabadulás» készítmény formájában), fe.íraawxküidrisaip inirapenteneélisan, iaravénásan, szubkután, szájon át.

φφ immloardálfeas, epldozállsao, wpitólístm és orron ét, Bármely más adagolási mód is aákalsnszhatő, például az epiteiiális vagy endeieliálte szöveteken való shszorgciő vagy géntefepla, amikor a hatösmyngot kódoló DNS-t jotsahuk a beteg szervezetébe (például vektor segítségével), sms kiváltja a krdöasysg ezpresszásődásút és tóváfesztavát m vivő, A találmány szestnti proteineket a gyógyászsúllng h&tásoa szerek más szokásos komponenseivel egyelt Is adagolnasjok, például gyogyászsrifeg elfegodltetö ieiüfetekőv szerekkel, tószmtíőunyagokkal, higitózttyagokknl és szálllfeszezakksk

Psozmterslfe (példáéi intravénás, sznbkután vagy iotsnosuszkrőárás) adagolás céljaim a hatásos proteint vagy proteineket oldattá, sznsztnurziősfe, emulzióvá vagy lloltbzáls porrá tbronUhatinL győgyászatilag psreuterálisaa alkalmazható szállilóazatekkel (például vízzel, ilzloiőglás soolásPal vagy deztróz oldattal) és adalékokkal egyen, amelyek az oldat Izotordeltssár (például msünk) vagy kémia! stabilitását biztosítják (kouzetválészztnA és puDernk), A tótóiményi a szokásos módon stóhzálhasjok.

A találmány szerinti protein vagy pootelnek biológiai bozzáferbetöségét konjugálás! eljárásokkal is uövelhetjSk, amelyek az emberi szerveseiben meghosszabbítják a omiekaía felezési Idejét. Essek érdekében a molekulát például polteliiéngiikolhoz, ksposolhatjúk, amint, az le van lm a WO §2/13085 számú oesmtetközl .vzsbadahnl Imiben,

A lattóaayagkém alkalmazható pteteissfek) győgyászatilag hatásos mennyisége szánton tényezőtől lugg, gyen tényező az antegonlsta típusa, az astagooistúnak as ii,- ife-hoz való albnitásu, as arstegonista maradék sejtmétgezé hatása» a kezelési mód és a beteg klinikai állapota (ide értve azt is, begy az endogén ÍL-18 aktivitás nem mérgező szintjét kell fermlattam).

A győgyászatilag hatásos mennyiség” alatt azt a mennyiséget árijuk, amelyet a betegnek beadva az inhibitor gátolja az IL-IŐ biológiai hálásét, Az sdagolasdő dózis, akár egyetlen akér többszörös dózis» egy adott egyesinél számos tényezőtől idgg. Ide értve as It-lŐ inhibitor ihrmakokitmdkui tulajdonságait, a kezelés módját, a beteg állapotét és jellemzőit (neme, kora, testtömege, ákaiáaos egészségi állapota, mérete), a töaetek kéerjsdáségét, az egyéb kezeléseket, a kezelés gyakoriságát és az elérni kívánt halasi, A szakember képes a megfelelő dőzlatanonntny megállapítására és beállítására, valamint sz in vitro és irs vivő eljárások kivitelesésre, amelyekkel az adott egyébnél, az .11,-lé gátlása meghatározható,

A találmány szemű az 11-18 inhlbitost kősölbelöl ÖMöl-tŐO mgAesttÖnzegkg, 0,1)1-10 ntg/lesttöotegkg, 0,1 -5 mgketesőmogkg, 1-3 mgAesltörnegkg vagy 2 mg/testteatsgkg dózisban alkalmazzuk,

A tsifetetesy szerinti előnyös adagolási tnöd a szobkoiso adagolás. A találmány szerint előnyös továbbá sz Iteramsszfedázia adagolás fe, Annak érdekében, hogy az 11-IS Inhibitort közvetlenül a bsiás helyem juttassuk, előnyös a topikálts slkahnazás fe.

F^y további előnyös megvalósítás szerint uz ik-18 isfelhltert rnspoma vagy mámmpzmként másnap adjuk a betegnek,

A nap! dózist általában több részre osztva adjuk a betegnek, hogy etetjük st kívánt eredményt. Az első adagolást kővető második vagy- további détóa .tehet stzonos s kezdeti illetve a megelőző dózissal vagy lehel annál nagyobb vagy kisebb, A második vagy a további adagolás végezhető a betegség kialakulása előtt vagy alatt,

A találmány szerint az .11,-1 ő Inhibitort adhatjuk «^lŐnMóppun vagy terápiás eéllai, öomsgábso vagy egyéb gyógyászati kezelést megelőzően, azzal egyidejűség vagy azt kővetően fgékiáol több feUőuoyagani való kezelés részeként). Az .11.-10 Inlhbltort győgyászatilag hatásos snenayiaégben adagoljuk, különösen egy ** »* *s ***$ * « $

»*❖ *2 «

«$í>

*« * « A«

TNF ütlíibítotrul és/vagy más kardíoprotektiv szerrel együtt. Ha a 'hatóanyagot más győgyászatilag hatásos anyagokkal együtt adjuk, akkor ezeket adhatjuk egy gyógyszerkészítményben vagy külösáUő készítményekben.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmények előállítására. Az eljásis abban áll, hogy egy 11..-1$ inhibitort és/vagy egy THE antagonístát gyógyászatig elfogadható hordozóval elegyítünk.

A találmány tárgya továbbá eljárás szívbetegség kezelésére, amelynek során az ilyen kezelésre szemlé betegnek egy II..-! 8 inhibitor győgyászatilsg hatásos mennyiségéi adjuk adott ese&ea egy THF antagomstával együtt.

Példák

I. példa

Az II,-18 gátlása csökkenti a szívizom iszkémiás rendellenes istúkbdését: in vitte

Anyagok és eljárások

Reagensek; lL-18BPa izofonnot expresszáitattunk egy tótra? hörcsög peiesejtje (Hls)6 részének N-termínálísán és ezt. addig tisztítottuk, míg homogén leit. Ismert az FL-1 .SBPa-CHisjé azon képessége, hogy semlegesíti az l'L-18-at (Kim és munkatársai, 2öö0) . Az ICE inhibitor (ICEi) 2kc-Try-Val-zkla-A^-tóórínetilketoat (YVAD) az Alexis Biochemicals-töl szereztük be (San Bíego) 10 mg/ml koncentrációban oldottuk DMSO-fean. Az ICEi-·?: Tyrode oldatban hígítottuk a felhasználás előtt. Az ICEi emberi periferiáíis vér moaonukieáns sejten csökkenti az «rest ÍL-Ιβ az endotoxm által kiváltott kiválasztását 92%-ktd, ami az ELISA készlettel (Cistron Biotech?roíogy, Pine Brokk, NT) mutatható ki.

Elkülönített kamrai trsbekula

Kiterjedt (clektlv) stóvkoszorú artéria bypass műtét során a betegeknél szükség van ksssAtUel ellátott oxígénpumpa beültetésére a jobb pitvarba. Ekkor a jobb pitvari függelék egy kis szegmensét rutinszerűen kimetszik és eltávolítják. A habekalár ebből az eltávolítón: szövetből nyertük. Emberi szív-pitvarból származó szövetet oxigénnel módosított Tynxi puffét oldatba helyeztünk 4 X’-ou. Mindet? nap friss módosított Tyrode oldatot állítottunk elő ionmentes desztillált vízzel, ami 5,0 mmol/l'D-glükózt, 2,0 mmol/liíer kaleiumkloridot, 118,0 mmol/l aáfeíamklortdöt, 4,0 mmol/liíer káliumklöridei, 1,2 mmoPliter MgSO4x7H2O-t, 25,0 mmol/liter náiriumtódrogénkafbonátot; és 1,2 mmol/liter nátrimndihidrogénfeszfetot tartalmazott A szubsztrátmemes Tyrode oldat 7 mmol/liter koliskloridof is tartalmazott, az ozmolarítás Ibtínnsrtására. Hacsak nem adjuk meg másként, az alkalmazott vegyszerek és resgensek Sigma termékeket jelentestek. 2-4 knbeknlát (4-7 mm hosszú, <1,0 mm átmérőjű darabokat) az eröátalakítóhox Iliesztetífek és 30 ml melegített (37 ®C-os) módosított Tyrods oldalba merítettünk; a nem-tál oxigénellátást bisnosifé szakaszban 92,5%-os O/7,$% CO? keveréket bwborékolíaítunk át, Ez a gázkevetók 350 Hg:ntnx-ttsl nagyobb parciális nxígénnyomásnak felölt meg (1 Hgmnv-LLI Pa), a széndioxid parciális nyomása 3Ő-40 Hgtnm, a pH értéke 7,35-7,45 volt; Mittdegyik paramétert rutinszerűen automata vérgázelemzövel ellenőriztük. A szetvílirdő hőmérsékletét a kísérlet alatt végig 37 ^cC-on tartottuk, A stimulált iszkémia stfetf a gázkeveréket 92,5% N/7,5% Cö_:; keverékre cseréltük. Ez a keverék 50 Rgmm-nél kisebb parciális oxigénnyomásnak felelt meg, A pufferoldatot 29 percenként cseréltük, kivéve a stimulált iszkósnüt 30 perces szakaszát.

Kísérleti adatok;

A trabekulát 90 pere alatt kiegyenlítettük, és így s kezdet? húzóerőt 1,000 st?,g-itt emeltük és hagytuk, hogy kialakuljon a kifejlett erő. Az olyan trabekulát, amelyben mm jóit lébe 25Ő ?ng-cál nagyobb kifejten erő.

f; száriak a kísérletből. A 90 perces kiegyenlítődési szakasz alatt a területet stimuláló léptetést platina elektródákkal végeztük (Radnóti Glass, Mosrovia, Kalifornia). Az elektródákat a írahekula egyik oldalára helyeztük, Grass SD9 stimuiáíotT&l (W&rwíek, Rí) stimuláltuk, 6 másodperces impulzusokkal a küszöbnél 20%-kaí nagyobb feszültséggel, a normái oxignettátást biztosító szakasz alair 1 Hz frekvenciával, az iszkémiás szakasz alatt 3 Hz frekvenciával léptettük. Az összehúzódásokat eröátaíakító eszközzel (Grass FRÖ3) moniíoroztuk, az adatokat számítógéppel vezérelt elösokszorozőval és digiíslizálóval (Mactab Quad örídge, MaeLab/8e, AD Instruments, Milford, MA) rögzítettük és Macintosh számítógéppel folyamatosan regisztráltok.

Az egyensúly beállása utón egy beteg trabekuláiál tanulmányoztuk három különböző kísérleti elrendezésben, a kontroli kísérletben 90 percen át normál oxigénellátást biztosító szuprafoziót alkalmaztunk: az Í/R vizsgálatban 30 perces stimulált iszkémiát és ezt kővető 45 perces reprefáztót alkalmaztunk, a harmadik vizsgálatban aaticitokííst alkalmaztunk. Az utóbbi esett»» az antieüokint hozzáadtuk a szuprafóziós fürdőhöz az iszkémia kialakulása előtt és ezt alkalmaztuk a 45 perces reperfúziős szakasz alatt is.

Megőrzőit trabekuláris CK akíivilás

A végső (91) perces) reperfúziős szövet CK. aktivitását K&plan és munkatársai (1993) módszerével határoztok meg. A vizsgálatot CK kittel (Sigma), automata spektrofotométerrel hajtottuk végre. A kapott eredményeket CK aktivitási egység/mg·-bán fejeztük, ki (a szövet nedves tömegére vonatkoztatva).

RNS izolálás és reverz transzkripcióhoz kapcsolódó PCR

Friss trabekulát homogenizált Tri-reagensben (Molecular Research Center, Cincintö) és teljes RNS-ben kíoroformos extrakcióval és izopropanolos kicsapássaí izoláltunk. Az RNS-t dietil-pirokarhonáttól kezelt vízben oldottuk, DNS-sel kezeltük mtyd metmyiségéi GeneQuant készülékké 1 (Amersham Pharmacia Siotech) határoztok meg. A cDNS eljárásokat Reznikov és munkatársai (zööös ismertetik. A következő szekvenciát alkalmaztok mindegyik PCR-nék 15 perces elöfütés 95 “'C-on, 1 perces ciklus 94 *C-on 49 másodpercig, 55 *€-on 45 másodpercig és 72 *C-on 1 percig, a végső extenziós fázis egy lö perces szakasz volt 72 '’C-on, A ciklusok optimális száma 35 volt. ismertek a glicerinaldehid-3-fosziáf dehidrogesázhoz (GADPH) és az emberi IL-18-hoz való primerek (Reznikov és munkatársai, 20ÖÖ) és az emberi i'L-18BPa-hoz való primerek (Kim és munkatársai, 2000). A PCR termékeket 1,5%-os agaröz gélen választottuk el, ami ö,5xTBE-t (50 mM irisz/45 mM bómav/0,5 mM EDTA, pH 8,3) és 0,5 mg/ml etídmm-bromidot tartalmazott, UV megvilágítással láthatóvá tettok és lefényképeztük. A negatívon denzhometriát végeztünk (ÍMAGEQUANT szoftver, Molecular Dynamics) és az IL-I8 és az IL-Í8BPPCR termékek relatív abszorbanciáját a GAPDH-ra kapott abszostbanciával korrigáltok.

11..-1.8 meghatározás

Friss trabekulát a CK méréseknél leírt módon homogenizáltunk. Az !L-18-»t folyadékfáztsü elekirokemiltoníneszcenciával (ECL, Igen, Gauthersburg, MD) határoztok meg. Egér anti-humán Η,-18 mAb-t (R&D Systems) ntténiam izotóppal (Igét·) jdöilöíik. Affinitás! eltérés alapján tisztított kecske anti-humán IL-18 antitestet (R&D) biotítmal jelöltünk (igen). A bíoiinnai jelöli antitestet PBS-hen (pH 7,4) 1 pg/ml végkoncentrációra togttoítok, amely 0,25% BSA-t, 0,5% Tvveen-20-at és 0,0135 azidot (ECL puffer) tartóimazott. Kísérleti csövenként 25 pl biothtozett antitestet szobahőmérsékleten előinkubáltunk 25 pl szíreptavidinnel fedett paramágneses gyöngyökön (Dynal, Grcat Neck, NY) í pg/ml koncentrációban 30 percen át erőteljes rázatós mellett. A vizsgálandó mintákat (25 pl) kísérleti csövekbe vittük és hozzáadtunk 25 pl ruténiummai jelölt antitestet (végső koncentráció 1 pg/ml, ECL pufeerrei hígítva). A csöveket 24 órán át tózattok. A reakciót csöven19 * X * * * * φ ·> V* φ * * ♦ φ ΐ <. « * « * * 'kést 2Ö0 μΐ PBS hozzáadásával feáliiloferk, és raeglratározsnk a kemilnmmeszcencks. mértékét Örígea Anaíyzor készülékkel (Igen). A11,-1.8 kirnuiaíhatósági határa lő pg/ml,

Áz oaigenszívatiyú kanüljének behelyezésével kapott műben konfokáiia mikroszkópiái; szövete) 1 cm-es műanyag tartóba helyeztűak (Meldrum és munkatársai, 1998),. beágyaztuk, szővetfegyasztó közegben fagyasztottuk (Triangei Biomedical Sciences, Durham, N'C) izopeotánnal hűtött szárazjégen. A fagyasztod részeket (5 μι») Leiea CM 1850 készülékkel szeleteltük (Leica, Deerfield, IL), A szeleteket lö percet? át 4%-os parafosmaldehidben fmáitok, levegőn szárítottuk, 20 percen át 10% normál kecske szérummal kiegészített PBS-ben inkubáltok, A szeleteket, Llö hígítást? nyúl aoti-huroát? Π.-18 antitesttel (Peprotecb, feocky Hiil, NJ) slletve kontrollként 1 pg/ml nem-immun nyál IgG-ben inkubáltuk. Az. antitesteket l%BSA-t tartalmazó FBS-bsn hígítottuk. A szeleteket egy éjjelen át 4 ®C-on tartottuk, majd háromszor mostak 0,5%-os BSA.-t tartalmazó PBS-sel. Ezután a szeleteket Alexa 488-hoz (Molecular Probes) konjugált másodlagos kecske anti-nyól antitesttel mfcubáltok 60 percen át, sötétben, szobahőmérsékleten. A sejtmagokat 1 pg/ml biszbenzimiddei (Simon) kékre festettük, A festés után a szeleteket mostak és Leiea DM SXÁ (Leica) konfokáhs lézer szkennelö készülékkel vizságltuk mad Slidebook-szoftvetrel (Macintosh) elemeztük (Intelhgesi ímagtog ínnovatiotm, Denvsr).

Statisztikai elemzés

Az adatokból számítottuk a kőzépérték±SBM (szórás) értékeket. Meghatároztuk a 90 perc után mért kifejted ető átlagos változását a kontrolihoz viszonyítva nösílcn egyes beteg szövetnél, Az egyes csoportok közötti különbség statisztikai szígmSkanciáját laktoriális ANOVA-val határoztok. meg, Bonfenroni-Du»» post hős elemzéssel. Á statisztikai elemzést Síat-view 4.51 szoftverrel végeztük (Abacus Concepts, C&lábasas, CA).

Eredmények

Áz endogén Π.,-18 Π..-18BP-vel való semlegesítésének hatása az iszkémiás állapot után kifejtett erőre

Az IÁ ábtátr a trabehulának az 1/R károsodásra adod kinetikai válaszát szemlélteti. Az ábra az egyensúly utolsó 15 percét mutatja, a kísérlet kezdetére vonatkoztatod ÍŐÖ%-ra normaiizálva, A kontroll ttsbekulát a kísértet alatt normál Oxigénellátás mellett sz^tafiizionálmk. Amint látható, a kifejtett erő 10%-ra csökken a kontrol trábekulábaa.. As iszkémiának kitett trnbeknláhan az összehúzódás ereje gyorsan csökkent; a reperfnziö során az összehúzó erő a kontroll összehúzó erejének körülbelül 2S%-át érte el, Ezzel szemben az iszkémiás hatásnak az 1L-1SBP jelenlétében kitett trabekuia összehúzó ereje elérte a kontroll őmehúzóerejének 55%-át, A különböző betegek szívszövetében kialakuló 1/R válasz becslésére a kontroll. trabekulábao 90 perc után fellépő erőt tekintettük 100%-oak az egyes betegektől vett mintánál, és számítottak a kifejten erő százalékos változását az egyes kísérleti csoportoknál.

Amist az IS ábrán látható, a kezeletlen trabekulábao az íszkémia után Í.1/R) kifejtet? erő átlagosan a kontroll 35%-ára csökkent, 1 pg/ml 1L-18B.P jelenlétében azonban csak a kontroll 06,2%-ára csökkent ez az erő, n?ig 5 pg/ml XL-18BP jelenlétében csak a kontrol! ?ő%-ára csökkent Ezek a?, eredmények arra mutatnak, hogy az 1/R a biológiailag aktív 1L-I8 felszabadulását-Okozza, miután ÍCE hatására felszabadul az 11.-18 endogén prekurzorábót Meghatároztuk az T.L-1.8 szintet hfesen kinyert pitvari szövetben. Amist? a 2, ábrán látható, a bazálís IL-18 jelen volt az olyan irabefculáfcan, amelyet azelőtt nyertünk ki, mielőtt behelyeztük az oxígénszávsttyű testeidét a jobboldali pitvarba. 90 perces egyensúlyi időszak, 30 perces iszkémiás időszak és 45 perces ájruoxigénezési időszak után homogenizáltuk a trabekulát, és meghatároztok az Π.Ί 8 szintet, A szövet 11,-18 tartalma LR után 4,5~szőröséfe növekedett a vizsgált szövetben (2. ábra).

β

Az ILI 8 és az 1L-18BP áikutdősnit m'RNS szintjét is meghatároztuk ezekben a szövetekben, Á frissen kinyert iszkémia előtti pitvari hosrogönizátuntokban az 1L-Í8 és az 1L-18BP bazáíts gén expresszíóját figyeltük meg (3, ábra, A és Β). Az 11,-18 protein növekedéséhez hasonlóan az l/R az állandósult mKN'S szint további (4,7-sze-vs) növekedését váltotta ki. -Az 11,4 8SR gén exprosszsója szintén kimutatható volt a frissen kinyeri pitvari szövetben de csak kismértékben (13-szorosára) növekedett az 1K szakasz után.

Az 11,-18 elhelyezkedésének meghatározása az emberi szívizomban

Tekintettel anu, hogy az ECL vizsgálatok szerint sz 11,48 proíelo és az 11,48 RNS jelest vna a frissen kinyert szívizom homogenízátumokbsn, az 11,-18 helyzetének meghatározására hisztokémiai festést alknlmattunk. A pitvari szövetet közvetlenül az oxigéneíiátö szivattyú kanüliének behelyezése előd nyertük ki és azonnal hirtelen fagyasztottuk (nincs ábrázolva). Az ÍL-18-aí ki lehetett mutatni a szívizom rezidens njakrofágjaiban és a vaazkuláris endoteliális sejtekben. Az IL-18 jelen van a makto&gokbaa és az endoteíiálís sejtekben & műtéttel kapcsolatos iszkémia előtt is és jelen van a bármilyen idegen felülettel való érintkezés előtt is. Az, hogy az 11,-18 jelenlétéi a rezidens m&krofágokban és sz enáotelíális sejtekben mutatók ki, egybevág az előzetesen képződött konstitutív IL-18 prekurzotokra vonatkozó korábbi vizsgálatok eredményeivel az egészséges egyéviektől frisseit kinyert emberi perifériás monodtákfean (Porén és munkatársai, 1999). Ebből arra következtethetünk, hogy az előzetesen képződött Π..48 prokunsor jeles van olyan betegek szívizmában, akik iszkémiás szívbetegség miatt elő vannakjegyezve szívkoszorúér bypass műtétté.

Az 1CE gátlás hatása az iszkéntia otán kifejtett erőre

Mivel sz 1L48BP hatásosan enyhíti a szívizom iszkétnia által kiváltott rendellenes működését, felié· telettük, hogy sz előzetesen képződött ii.,-18 prekursor IE48~eé vaió átalakulásának gátlása szintén enyhíti a szívizom sszkémfr állni kiváltott rendellenes működését Ezért specifikus 1CE Inhibitor YVÁD-ot adtunk a szuprafűzíós fürdőhöz az iszkémia kiváltása előtt. Az 1CE gátlása YVÁD hozzáadásával folytatódott az iszkémiás szakasz alatt és a repertfrzlé alatt Is, Az YVÁD által közvetített IGE gátlás enyhítette a szívizom iszkémia állni kiváltott rendellenes működését, mivel az összehozó erő az 1/R után a kontroll 3S%~árőí őÖ%-ára nőtt 10 pg/nxi koncentrációnál és 75,8%-áfa 20 gg/m! koneenfeáe lónál (4, ábra). Ezek az eredmények att igazolják, hogy az emberi szívizomba» & biológiailag aktív il.-18 az előzetesen képződött 11,48 prekurzotból keletkezik. Az eredmények arra mutálnák továbbá, hogy a szívizom iszkémia aktiv;ilbat|a a lappangó ICE-t.

A sejt életképességének megőrzése

A CN sejtett belüli steliéttek: meghatározását használtuk fel a sejt ER utáni életképességének becslésére. Eszerint a vizsgálat szerint minél nagyobb a CK érték, annál nagyobb az életképes sejtek száma. Minden anticitokin hatású beavatkozás a sejt éleiképességének megőrzése irányába hatott, Amint az 5. ábra mutatja, 1L4SSP és 1C.E gátlás (Ili és 20 g/ml) az ER szakasz utáni sejtes bellid CK szintet az 1,399 értékről a kővetkező értékekre növeli; 5,921,5,075, 6,624 és 4,602 CK aktivitás egység milligrammonként (a nedves szövetre vonatkoztatva), Ezek a usegEgyelések arra mutatnak, hogy az .11.48 ER által kiváltott aktiválása segít megőrizni az izomsejtek életképességét a fenti ex vivő modellben.

A semlegesítés hsááse a TMFse· által kiváltott szivtaojstnökődéste

Amist att a 6. ábra mutatja, a trofcektsiák áldd kifejtett érő (DE) 18H-ra csökkent 90 perccel azután, hogy egzogén TNFa hatásának tettük ki. Vizsgáltuk az endogén .11-18 semlegesítésének hatását, az egzogén TNFo. hatásának kitett, emberi szívizom összehúzódására, oly módon, hogy 11,-18BP-eal inkubáltuk a szövetet 10 perecéi n TNEo hozzáadása előtt; így azt tupeszfeltttk, hogy kifejtett erő (DF) kisebb mértékben csökkent, * φφ φ φ amint art a ö. ábra matatja. 90 perc elteltével & kontroll csoportnál mért erő (DF) 18%-kal csökkent, rnig a TNFa hatásának kitett ttnhekülában a 58%-kaI csökkent a kontrolihoz viszonyítva. Azonban a TNF« hatásának kifest. IL-18BF-vel inkubált trabekula által kifejtett erű a kontrolihoz képest csak dö%-kol csökkent. Ezek az adatok arra mutatnak, hogy a TNFet-nak a szívizom összehúzódás gyengülésére vonatkozó közvetlen hatását legalábbis részben a biológiailag aktív endogén 11.-18 köavetiü.

Az egzogén IL-18 hatása a kifejtett erőre

A kővetkező vizsgálatba;? az egzogén IL-18-nak a szívizom összehúzódására vonatkozó közvetlen hatását határoztuk meg. Az ÍL-lb-at a szoperfáziós trahekuláhez adtak 90 perccel az egyensúlyi állapot beállása után, és cseréltük mindegyik fürdőt .Amint a 7. ábrán látható, az ÍL-18 lassan de egyre nagyobb mértékben csökkentette a .kifejtett erőt a kísérlet időszaka alatt Az 1L-I§ 90 percen át tartó folyamatos hatására a kifejteti erő 42%-ra csökkent. Ezek az adatok azt mutatják, hegy az egzogén IL-13, a TNFtx-hoz hasonlóan szívizom elernyesztő hatással rendelkezik.

Figyelemre méltó, hogy az 11,-18 szívizom elernyesztő hatása nem olyan mértékű, mint a TNFct ilyen h

A sejt életképességének megőrzése

Áz esetek egy része gyakran programozott sejthalállal (apoptezisszl) idősül. A TNFct hatásának kitett irabeknia sejtjei, életképességének becslésére mértük a szövet sejten belüli lereatitt kináz (CK.) tartalmát. Ebben a vizsgálatban a magas CK szintek mutatják a sejtek dtelkdpmégét. Amint a 8. ábrán látható, a 90 perees normál oxigénellátást biztosító szuperfúziöt kapott kontroll trabekuláaál a mért CK aktivitás §8öl±2?ő egység volt a nedves szövet egy milligrammjára vonatkoztatva. Ezzel szemben a 3Ö/4S perces l'ZR hatásnak illetve 90 perces TN'fő. hatásnak kitett ttsbekulában kisebb, 1774-1181 illetve 3246*21? egységóng CK szintet mértünk. A TNFtx hatásának ÍL-18UP jelenlétében kitctl trahekulábsn 5005*212 egység /mg szövet CK. szintet mértünk, Érdekes módon a INFct-val kezelt trabekula nagyobb mértékben őrizte meg a CK szintet mint az Í/R hatásnak kitelt trabekula. Ez· előre nem várt hatás, mivel a kísérleti időszak végén a kifejtett erő csökkenése hasonló mértékű volt az I/R hatásnak kitett szövetben, mint a TNF« hatásnak kitett szövetben.

3, példa

Az 1L-18BF szívizom infarktus elleni védőhatása In vivő

Eljárás

Egérféie 1L-18BF expresszíós plazmid ör vivő intmmuszkaláris elcktrotranszferje

C57BV6 egerek háromhetes Időközönként bárom olyan injekciót kaptak, amely az 1L-18BF oDNS-ének expresszíós plazmidját tartalmazta, amelynek elnevezése peDNS3~.iL 18BP, éa amelyet a WO Ö1/8S2Ő1. számú szabadalmi iratban Ismertettek, A kontroll egereknek plazmid nélkül adtuk be az injekciót. Az egérfole 1L-18BF izoform d cDNS-t (hozzáférési szám Q9ZÖM9) ismert módon Kim ás munkatársai (2000) eljárásával izoláltuk majd peDNSd emlős sejt expresszíós vektor BcoRl/Nöít helyéré szubklőnoztuk, ehomegalevírus promoter (litvitrogen) szabályozó hatása mellett. A. kontroll piazmidot hasonlóan állítottuk elő, de gyógyászati hiísárii cDNS-íól mentesen. A kontroll csoport 31 egérből állt, a kísérleti csoport, amely lL-18BF~t kapott, 27 egérből állt.

Az 1L-18BF-Í és a kontroll expresszíós piazmidot (őő pg) injekcióval beadtuk «teltetett egerek mindkét slpsonti kraniálís testeid;;, s Mailat. és munkatársai által leírt módon (1999). A transzkatán elektromos impnfzusckat (8 négyzethuilám SOOV/em elektromos impulzus, 20 ms ideig, 2. Hz frekvenciával) PS-15 elekttopulzátor készüléktó (Genetronics, Franciaország) váltottuk ki, két rozsdamentes acél lemez elektródát alkalmazva, egymástól 4,2-53 tata távolságra, a láb mindkét oldalán.

Infarktus kiváltása a baloldali kamrában

2.4 órával az 1L-1 8BP-vel való kezelés utas a plazmáddal liléivé üres piazmiddal való kezelés után az egereket IP altein és ketamin injekcióval elaltattuk, levegőztettük és a mellkast megnyitottuk, A baloldali fő koszorú artériát folyamatosam lekötöttük, 8-0 proién varratot alkalmazva, a szívizom infarktus kiváltására, ezután a mellkast lezártuk és sz állatokat hagytak az altatásból felébredni. A műtét előtti halálozás 20%-aál kevesebb volt A fsadét utáni halálozás a kontrol! csoportban 48% vad, míg a kísérleti csoportban 26%, és szinte kivétel nélkül a lekötés utáni 4-5. napon történt.

A lekötés után ? nappal az egereket istáét altattuk és a bal kamra (T..V) méretét szív ultrahang (ecfaokardiográfiás) vizsgálattal mértük zárt mellkas mellett, .ATI,. HDÍ 5000 szív ultrahang készüléket alkalmazva, Az EV szakasz rövidülését a mért végső szisztolés és diasztolés paraméterekből számítottuk. A szív ultrahangos vizsgálata «fást. a szivet kivettük, fixáltuk majd részesre vágtuk. A Insztotógiai részeket szinusz vörössel festettük az infarktus méretének meghatározására.

Eredmények

A bal kamra diasztolés átmérőjét a lekötés után 7 nappal mértük a túlélő egereknél a következő eljárás szerint:

0,53X601 mm (a~2Ö) az ÍL~18BP-vel kezek egereknél, a kontroll egereknél («--16) kapod 0,59+0,01. mm értékkel szemben, p«0,Öl

A bal kamra szisztolés átmérőjét a lekötés mán 7 nappal mérőik a túlélő egeteknél a következő eljárás szerint:

0,45*0,02 az IL-lSSP-vel kezeit egeteknél a kontroll egereknél kapott 0.05+0,02 értékkel szemben, »<0,0 i

A bal kamra szakasz rövidülése: 15+1 % az Í.E-18BP-vel kezelt egereknél, a kontroll egereknél kapott 11+-1¾ értékkel szemben, ρΟ,ΟΕ

Az eredmények összefoglalása: az IL-18BP 50%-kal csökkenti az egerek, infarktus utam halálozását, amikor az infarktust a bal kamra teljes szívkoszorúér lekötésével váltottak ki. A bal kamra működése lényegesen javait, amint azt a bal kamra csökkent szisztolés és diasztolés átmérője matatja.

1. Bőid, R. CbxWfttdm §2,723-38 (1990)

2. Buggemams és munkatársai, £«r. J, ímmnno/. 2.1, 1323-1326 (1991)

3. Cain, B.S., Meldrum, D.R., Dinarello, C,A,, Méng, X., Banetjee, A. és Harken, A.H. J, j?es. 76, 117-125 (19911)

4. Cleveland, Í.C.1, Mekirum, D.R., Caist, B.S., Barserjee, A. és Hsrk.es, A.H. Cimderioa 96,29-32 (1997)

5. Daemen MA, vsad Veer C, Wolfs TG és munkatársai, Ischsndtereperfsstos-inífoced IFN-gamma up~ -reguktlon: invoívement of IL-12 and 11.-18:7. Znomm»/. 162,5596-5510 (1999)

6. DrDonatao, LA,, Hayakawa, M,, RothwarC D.M., Zandi, E, és Karin, M.: Mkw 2g|, 16514-46517 (1997)

7. Flliott, M.L, Maim', R.N., Feidsnana, M,, Loog-Fox, A,, Charles, R, Bljh H,, és W'oody, J.N., Immár 344, 1125-1127 (1994)

8. Engehnanu, H., Ndviek, D., és Wallacb, D,.,/. .dós/, üáeta. 265, 1531-1536 (1990) rf rfrf rf rf rfrfrf rfrfrfrf rf rf * * rfrf rfrf rf * rfrf rf rf vrf rfrf rf rf rfrfrf rfrf rf rf rfrfrf rfrf rf rf rfrfrf « rfrf

9, Fsmmk fe AX Fsntnk M.W. Hsfefe DX Liviagstoa és CA, Dimrsíio, Béfe 91,2Í18-2125 (1998)

19. Gtwtan, éfenen, 188 862-864 (1874) ) 1. Gursviích, L, Fmlkís, 1., Yttas, Y>, Psz, Υ.» Maisa, Μ.» Mofe M, és Yaktatah, V._?

7. km. GMi. Cfefe B 242452 (1996)

12, llsfeüwfe A., ötöt, fe Ássad, A.A. és Wasseíirtgfa, fe dm. 7 Pata/, ,148 419-42.8 (1998)

IX Medtotar, 9., .Liptai, H. Wagner, K„ FíeSer, és K, fefe, /mmtm. 6§ 35Ö218. 14, Kapta, LX, Hiúm, H,, Bsnfeen, A. és Whíttnan, GX, 7 -tag. fe. 34,31 1-5.

15, Kim S.H., Hseasieis M„ tatakov t,, Famuzzi G„, Nevtók D., Robinsteia M„ Diaareile C,A. tosctarai nfeöwstas of sin natumlly oecadug tatom of fe 11.48 bitang protein to ínhibit B..-18, Aw. MnX taőd. fe, USA fel 190-1193 (200Ö)

16, Kínt S,H. és munkatársai 7. .tomtta .166 148-454 (2601)

17, Knigbt DM, Tdsb H., Le L, Siegel S„ Sbeaiy fe Metassmgb M„ featat B., Moom MA, Vífcek L, Daáortsa F. és maskatatai Cettsirueboa esd laktól eheraetedzaiíon of a mome-fcumaa «intene artti-TNE artírbody. MM. áttwri. 30:16 1443-1453 (1993)

18, Msattas és smmkatársai Moíecnta (imfe: ,4 Xoéíovtóny Atom/, Cold Spdsg Hatbor Laboratory New York (1982)

19, Mekkám, D.fe Cleveland, IC, Jr„ Cta, H.fe 44¾ X. és Harto, A-B, Aon, aw. fen. 6A 439-443 (1998)

26, Msosfe, MM, Gmen, LA,, Cmwtlsa, J.R.E., Jtó X-fe MayaardCmde, F,B„ Yaag, X-fe Ösllo, M.L., Lőnie, DM, Lee, B:V,, Fde&ses, K.,L.,_; Luxra, L, Roy, C.M-N., Abderrahtxrt, H,., Krrshesbatmt, F-, Negaebí, M,« febp 13,61,, Ptrkoshírsa, A,, feles, LF,, M.H., Davis, CG,» Zsebe, K,.M, és íakobevits, A, “Ettsedoaal trasspiaai of megettem kontárt immurtegfctmim tat reeapiialafcs borsa» asdbody rsspesse In attak fefe? fetafe, .15 146456 (1992),

21, Nafcamurs, K,, Oksmsrs, fe Magata K, és T«m, fe .tófeé tom«, 37 399-595 (1989)22, fevtek, .fe Kist. S-H, f ártotta, G._f tamrkov, fe Dmarélte, C„ és Rsbntsto, M, fentafe 16,127-136 (1999)

22, Neviek, D„, Kim, 9Ή, EaetóoL fe, teAv, !l·.,, Dmastao, C. és Rabmstaia, M._s Zmmrmhy .1.6, 127-136 (1999)

23, Femet, F., Garka, KX, Hornért, ’LF., Dew, SX, és Sím®, ,i,.fe J, .fel. fefe. 271,3967-3979 (1996)

24, Pmm, AJ., Farttazt, C és Dtamtkr, CA».Értre AW. tata. fe 6(24 96 2256-2261 (1999)

25, Raebuxn, CD., CM, Calkms, M.A. Ztntmenttaa, Y. Song, L. Α», A. Bamtjee, X Kong és A,H. ifefen, Xfefe IMS 319-325 (21X1)

26, Mnfefev, fel·,.. Kim, S.B., Westeotí, 3.Y,, Eristaaa, I, Famaszi, ö., Nofek, D,, febtatótó, M, és Dtatato, CA., fen. Xfe Anta. fe fel 97 2174-2179 (2999)

27, Torigsw, K., BXfe §:„ Ofeng. T„ Kobnyfebi, 8,, Tatai» M., Knsnkstó, T„, Matatott, T., Saaeu, <X, Kojtsta, fe Feji,. Ml·,, (Mfe T., ikefe M,, ikogsnk, H. és Ktsrimoto, M 7. MM, (fen. .2.22 25737-25742 (1997)

28, Tettatas és murtfetata» fen® AW. Montó fe, 1384 §2 722-727 (2(8)9)

29, Trnet, A., James» 11« CktólfenfenM, fe Bomteíoy, XY., Ösw, LM, és feéfe RJL,

A tamteta. hH 2778-2788 (1992)

36, Yoatoeío, T„ Takada, fe, Taeaka» L, Öbkuse, fe Knslfesostnt, fe Otorrna, B,, Aktra, 8, és Nsksstal, K„X tamtmfe 161 3468-3497 (1998)

Claims (11)

1» 1L-18 inhibitor alkalmazása. srivómmbánntóm kezelésére és/vngy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására, ától az 11.-18 inhibitor a kővetkezők közül van kiválasztva.: kaazpáz-l inhibitor (ÍCB), IX-18 ellem anötestrit, az 11-18 receptor alegységek bármelyike eSms oniitótók és fí.,-18 tótő proteinek vagy ezek Itóbstótó srtoltótó, fasfcivsab potóipjel vagy funkciós származékai, amelyek gátolják az .11.-Iá biológiai hatását,

2. Az 1 > igénypont szerinti alkalmazás, ától az IX- iá áánbtór sgy 1L-18 elleni antitest

3. Az 1 igénypont szerinti alkalmazás, ahol az 11-18 hrhíbhor egy az H-1S receptor « elleni antitest

4. .Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ától az IX- 1.8 íshibifer sgy sz 11-18 receptor β ellem .wltoők

5. Az előző Igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ától sz antitest egy humanizált vagy Inasán naö. Az l, Igésygnto szerinti aMmazás, ától az ICB inhibitor Ao-TyrAXl-Alo-Asp-kiöo'Oőtibketős (YVAÍ3).

'?'. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ától az IL-18 inhibitor egy 11-18 Itotó protein vagy ennek ize&rmja, mutánsa, kondenzált proteiné vagy őmkciós származéka, amely gátolja az IX-18 biológiái hálását

§. Ά igénypont szorhál alkalmazás, ától az It-18 tohlbltor egy vagy iöbb helyen glrtóritew van,

9. A ő, vagy ?. igénypont szerinti alkalmazás, ától a kondenzált protein tartalmaz egy tóodentólt tómaagletólmt (lg).

lö, A $-8. Igénypontok hátmelyika szerinti alkalmazás, ától a funkciós származék tartalmaz togslább sgy, egy vagy több .ftmfceiős csoporthoz kapcsolódó csoportét, amely az ammomtoamredétók egy vagy több okhiláacáa helyezkedik el,

11, A 9. igénypont szerinti alkalmazás, «tói a csoport egy pobeiíiénesogári.

12, Az előző igértypömők bámteíyfe szerinti alkatónzfa ahol a gyógyszer tartalmaz sgy tóttor nekrózis faktor (THE) autggonístát b,

IX AH, igénypont szerinti alkalmazás, ától az 11-IS Inhibitort a INF astagenlaiávai egyidejűleg, tó kővetőm vagy elkőlőaíive alkalmazzuk.

14, A 11, vagy 12, igénypont szerinti alkalmazás, ától a TNF amagonista TBB1 és/vagy T8P1L

15, Az. előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az it-18 inhibitort körhlbőtó Ö₅ÖÖ1-löó org/kg vagy 1-lö mg/kg vagy 2-5 sng/kg koncentrációbanalkalmazzuk, lő. Egy II-IS mhtotóri ltodtól aenkveneiát tartalmazó eapremióa vektor alkalmazása szrvrzombántslom tetoteőre és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyítóét előállítására, ahol az It-IS Inhibitor a követted kozni van kiválasztva: 11-18 elleni antitestek, az'il-IS receptor alegységek bármelyike ellent antitestek és ÖL·tő kőtő ptóelsek vagy ezek rzoformjhi» mutánsai, kondenzált gswisjel, amelyek gátolják az 11-18 biológiai hatását.

17. Egy 11-18 inhibitornak egy sejtben való endogén tortoelődésot kiváltó os/vsgy tóvelő expressxióa vektor alkalmazása tóvtótótóntohsto kezelésére ás/vagy topgelitótóre alkalmas gyógyszer előátóátórs, okol az IX-18 inhibitor a kővetkezők közöl van klvátóstvn; sL-18 kóló proteinek vagy ezek izofrnmjm, ameíyek gátolják ez IX-ió biológiai hálását..