CN1499982A - Il-18抑制剂在治疗和/或预防心脏病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及IL－18抑制剂在制备治疗和/或预防心脏病特别是缺血性心脏病的药物中的应用。也考虑了联用IL－18抑制剂和/或TNF拮抗剂来治疗和/或预防心脏病。

Description

IL-18抑制剂在治疗和/或预防心脏病中的应用
技术领域
本发明涉及心血管疾病领域。更具体地说，本发明涉及IL-8抑制剂在治疗和/或预防心脏病特别是缺血性心脏病中的应用。
发明背景
细胞因子白介素18(IL-18)最初被称为干扰素-γ(IFN-γ)诱导因子(Nakamura等人，1989)。它是产生T淋巴细胞辅助细胞1型(TH1)应答反应的早期信号。IL-18与IL-12、IL-2、抗原、有丝分裂原、以及可能还有其它一些因子一起作用诱导了IFN-γ的产生。IL-18也可提高GM-CSF和IL-2的产生，增强抗CD3诱导的T细胞增殖以及增加自然杀伤细胞的Fas介导的杀伤力。
成熟的IL-18由其前体经IL-1β转化酶(ICE，caspase-1)作用而产生。
IL-18受体由在配体结合中协同起作用的至少两种成分组成。在经小鼠IL-12刺激的T细胞中发现了IL-18的高和低亲和力结合位点(Yoshimoto等人，1998)，提示有一种多链受体复合物。迄今为止，已鉴定到两种受体亚基，均属于IL-1受体家族(Parnet等人，1996；Kim等人，2001)。IL-18的信号转导包括NF-κB的激活(DiDonato等人，1997)。IL-18受体复合物由两条受体链组成：一条为配体结合链，称之IL-18Rα链，另一条为信号转导链，称之IL-18Rβ链。IL-18R链最初是作为与放射性标记IL-18结合的细胞表面蛋白质而分离的；纯化了该蛋白质，发现它的氨基酸序列与先前报导被称为IL-1R相关蛋白(IL-1Rrp)的孤独受体相同(Torigoe等人，1997)。
最近，从人尿液分离出对IL-18有高亲和力的可溶性蛋白质，并且克隆了人和小鼠cDNA以及人基因(Novick等人，1999；WO99/09063)。该蛋白被命名为IL-18结合蛋白(IL-18BP)。
IL-18BP不是已知的IL-18受体之一的胞外结构域，而是一种分泌性天然循环蛋白。它属于分泌性蛋白的一个新家族，该家族还包括几种痘病毒编码的蛋白质(Novick等人，1999)。尿和重组IL-18能以高亲和力特异性结合IL-18，并调节IL-18的生物亲和力。
IL-18BP基因位于人染色体11q13上，在8.3Kb的基因组序列中没发现编码跨膜结构域的外显子。迄今为止，已在人类中发现由于交替mRNA剪接产生的IL-18BP的四种剪接变体或同种型。它们被命名为IL-18BPa、b、c和d，它们均有相同的N末端，但C末端不同(Novick等人，1999)。这些同种型与IL-18的结合能力不同。在四种同种型中，已知人IL-18同种型a和c对IL-18具有中和能力。人IL-18同种型a与小鼠IL-18起交叉反应。
心脏病定义为影响心肌或心脏血管的疾病(The Merck Manual Home Edition，www.merck.com)。血管障碍是一种血管问题，如阻塞而致的循环不良。心脏病也称心血管疾病。
缺血性心脏病是心力衰竭的一种常见病因，它是西方社会中最常见的死因。通常由于冠状动脉粥样硬化而引起。心肌损伤包括缺血性纤维化和急性心肌梗塞。正常情况下，冠状动脉内的血流与心肌代谢的需求紧密配合。供血不足时会引发缺血性心脏病，这是因为供血本身受损或心肌肥大对供血的需求增大。正常情况下冠状动脉的血流不取决于主动脉压。有一种有效的自动调节机制控制血液流过冠状动脉血管床。
通常，由于动脉粥样硬化或动脉硬化而发生主冠状动脉闭塞时，最初会保持冠状动脉内的血流，这是因为闭塞远处的外周阻力减少了。当超过75％的管腔闭塞，尤其是如果冠状动脉侧支循环不良时，就会发生缺血。
心肌代谢极其活跃，线粒体占了每根心肌纤维体积的30％以上。因为高能磷酸储存很少，有氧代谢是必然的。当组织的三磷酸腺苷(ATP)水平极低，和厌氧糖酵解实际上停止时，心肌发生死亡。与其它组织一样，死亡的准确原因还不清楚，但心肌的致命损伤与细胞膜破坏和钙突然进入细胞的细胞质内有关。短暂缺血后，可重建(再灌注)心脏的血流。然而，经过一段临界时间后，再灌注即不可能，这可能是毛细血管内皮细胞肿胀的结果。
绝大多数冠状动脉疾病是动脉粥样硬化。缺血性心脏病也可能由冠状动脉低灌注引起。特别是出血所引起的休克是其常见原因。
如上指出，缺血性心脏病是由心肌血流与心肌的代谢需求之间的不平衡所引起。血管痉挛、血栓或导致灌注不足的循环变化等叠加事件可使血流进一步减少。
冠状动脉灌注取决于心门(主动脉舒张压)与冠状动脉窦(右房压)之间的压力差。冠状动脉的血流由于冠状动脉口的文丘里效应以及心室收缩期间肌内动脉压缩在心脏收缩期间减少。使冠状动脉的血流减少的因素包括主动脉舒张压下降、心室内压增大和心肌收缩、冠状动脉狭窄、主动脉瓣狭窄、倒流以及右心房压增大。
通常，采用诸如链激酶或组织纤溶酶原激活因子(TPA)等药剂进行溶栓治疗，以溶解新近形成的血栓。大多数情况下这些溶栓治疗可重建血流。这有助预防心肌严重受损，若在栓塞早期(少于1小时左右)进行，至少可有助减少进一步的损伤。
心绞痛是一种缺血性心脏病的症状性综合症，特点是胸痛突然发性发作，通常是胸骨以下或心前区。它是由不足以诱发梗塞的心肌缺血所引起。心肌可能发生突然死亡，这是心脏病引起的意外死亡，通常发生在心肌栓塞1小时内或无症状发作。每年有300,000-400,000人发病。
心脏病的其它形式包括酒精性心肌病、主动脉瓣脱垂、主动脉瓣狭窄、心律不齐、心源性休克、先天性心脏病、扩张型心肌病、心脏病发作、心力衰竭、心脏肿瘤、心瓣膜肺动脉狭窄、肥厚型心肌病、特发性心肌病、缺血性心脏病、缺血性心肌病、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、围生期心肌病、稳定型心绞痛。
心肌梗塞是缺血性心脏病的另一种形式。致病机理可能包括闭塞性冠状动脉内血栓，即血栓位于溃疡性或裂缝式狭窄斑上。闭塞性冠状动脉内血栓造成90％急性穿壁性心肌梗塞。血管痉挛可能伴有或没有冠状动脉粥样硬化，并可能与血小板聚集有关。心肌梗塞也可能有栓子。
心肌梗塞的整体形态外观可能不同。穿壁性梗塞涉及左心室壁从心内膜到心外膜的全部厚度。心内膜下梗塞涉及限于左心室壁内部1/3-1/2的多灶性坏死区域。心肌梗塞的并发症可包括可能会“突然死亡”的心律不齐和传导缺陷、梗塞延伸、或再次梗塞、充血性心力衰竭(肺水肿)、心源性休克、心包炎、可能有栓塞现象的附壁血栓、可能有心压塞的心肌壁破裂、乳头肌断裂，还可能有瓣膜关闭不全、心室动脉瘤形成。
心肌梗塞定义为通常由于某一区段心肌的冠状动脉血流突然减少而致的缺血性心肌坏死。
在90％以上患有急性心肌梗塞的病人中，急性血栓常伴有斑破裂使供血给受损部位的动脉(因动脉粥样硬化斑先前已有部分阻塞)闭塞。动脉粥样硬化斑内的内皮改变诱导血小板功能改变，估计有利血栓形成。约三分之二病人发生自发性溶栓，所以24小时后只在约30％的病人中发现血栓闭塞。
心肌梗塞有时是由动脉栓塞(例如二尖瓣或主动脉狭窄、感染性心内膜炎及消耗性心内膜炎)引起的。已报道冠状动脉痉挛病人以及甚至冠状动脉正常的病人可出现心肌梗塞。可卡因使冠状动脉痉挛加剧，使用者可能患有由可卡因诱导的心绞痛或心肌梗塞。尸检研究和冠状动脉造影显示，正常冠状动脉可能发生可卡因诱导的冠状动脉血栓，或者与原有的动脉粥样化重叠。
心肌梗塞主要是左心室疾病，但损害可延伸至右心室或心房。右心室梗塞通常是由右冠状动脉或主左旋动脉支闭塞造成，特征为右心室充盈压高、往往有严重的三尖瓣关闭不全及心输出量低。约一半下壁/前壁心肌梗塞的病人发生某种程度的右心室功能障碍，10％至15％血液动力学出现异常。
心脏继续发挥泵功能的能力与心肌受损的程度直接相关。
透壁性梗塞包括从心内膜到心外膜的整个心肌层厚度，其常见特征为心电图(ECG)的Q波异常。非透壁性梗塞或心内膜下梗塞不延伸到心室壁，而且只造成ST段和T波异常。心内膜下梗塞常涉及心肌的内三分之一，此处壁张力最高，心肌血流最易受循环变化的损伤。它们也可发生在血压长期过低之后。因为在临床上不能准确测定坏死的透壁深度，心电图则能较好地将梗塞分为Q波或非Q波。通过胆碱激酶升高的程度及持续时间可估计心肌受破坏的体积。
缺血性心肌病是另一种缺血性心脏病。这种情况以前可能有心肌梗塞，但该疾病由冠状动脉严重的粥样硬化造成涉及所有主要分支。这一结果是血管供血不足，导致肌细胞损失。肌细胞损失与间质胶原沉积形成的纤维化一起导致顺应性下降，并伴有心脏扩张，致使其余的肌细胞负荷过重。这个过程一直持续下去，直到肌细胞不断地过度生长作出补偿。甚至通过增生和肥大来补偿，这可解释心脏最后的尺寸很大(是正常心脏尺寸的2至3倍)。最后，心脏无法再补偿，心力衰竭，心律不齐和/或缺血。所以，临床上心力衰竭是缓慢、进行性的，先前有或没有心肌梗塞或心纹痛的病史。缺血性心脏病死亡中高达40％是缺血性心肌病所致。
心脏缺血和再灌注期间产生许多内源性介质，如小分子第二信使，它们影响心肌功能。心肌收缩力在缺血发生数分钟内减少，收缩力的完全恢复主要取决于缺血持续的时间(Daemen等人，1999)。例如，在缺血期间，Ca2+的体内平衡被扰乱，产生氧衍生的游离基，并发生一氧化氮的合成和释放。另外，还局部产生细胞因子，特别是TNFα和IL-1β(Bolli，1990)。在完整的心脏中，这些细胞因子通过诱导可诱导的一氧化氮合成酶(iNOS)(Daemen等人，1999)、环氧合酶-2(COX-2)和磷脂酶A2以及血管黏附分子和几种趋化因子的基因表达，对缺血诱导的心肌功能障碍起作用。因此，小分子信使介导了心肌收缩力的立即下降，随后为细胞因子介导的嗜中性粒细胞浸润，使心肌进一步受损。在血液或血产物不存在的情况下进行的动物心脏研究详细阐明了缺血性攻击期间TNFα(Herskowitz等人，1995)和IL-1β的作用。由于这些内源性细胞因子的作用，心肌细胞也失去了收缩力(Meldrum等人，1998)。
大部分有关TNFα和IL-1β介导的心肌功能障碍实验数据都来自动物研究。然而，已在受控条件如活体外条件下研究了获自经历了选择性心肺旁路手术病人获得的人心肌组织(Gurevitch等人，1996；Cleveland等人，1997)。在此实验模型中，将人心房小梁悬于无血的生理性氧化的缓冲液浴槽中，然后暴露于模拟的缺血发作。在此期间，收缩力显著下降；当组织再次与氧气接触时，收缩力回升，但有所下降(下降60-70％)，通过胆碱激酶(CK)的释放观察到心肌受损的证据(Gurevitch等人，1996；Cleveland等人，1997)。当TNF的生物活性在缺血/再灌注期间被特异性中和时，发现收缩力更大回升，提示内源性心肌TNF活性对缺血所诱导的收缩功能障碍有作用(Cain等人，1999)。
Daemen等人(1999)采用肾缺血小鼠模型研究了缺血随后再灌注所引起的组织损伤。研究显示，缺血后第1日，肾IL-18mRNA上调与caspase-1的活化相一致。缺血后第6日，IFN-γ和IL-12mRNA随后上调。综合起来而不是分开地看，体内中和IFN-γ诱导的细胞因子IL-12和IL-18使依赖于IFN-γ的MHCI和II类上调减少，减少的程度与IFN-γ的中和程度相类似。
然而，迄今为止，IL-18在心脏病所起的作用还没有叙述。
发明概述
本发明的根据是以下发现：IL-18抑制剂在上融合(suprafused)的人心房心肌缺血/再灌注模型中大大改善了心脏的收缩功能。抑制caspase-1(ICE)也能减少缺血和再灌注后收缩力的下降。
此外，给予心肌梗塞小鼠模型IL-8抑制剂导致提高存活率，并显著改善心室功能。
这些研究证明，IL-18抑制剂适合治疗或预防心肌功能障碍。
因此，本发明涉及用IL-18抑制剂来制备治疗和/或预防心脏病，特别是缺血性心脏病和/或心脏衰竭的药物。
为了应用基因疗法将IL-18抑制剂输送到患病组织或细胞，本发明还涉及采用含IL-18抑制剂编码序列的表达载体来治疗和/或预防心脏病。
附图简要说明
图1显示IL-18BP对缺血诱导的心肌收缩功能障碍的影响。
(A)对缺血性损伤的动力学反应。平衡后，在含氧量正常的条件下在实验全过程使对照小梁上融合。使小梁在IL-18BP不存在或存在(5微克/毫升)下经历缺血/再灌注。纵轴表示产生的收缩力与实验开始(时间为0)相比的百分比。数据来自一个病人的小梁，是用来计算90分钟内产生的收缩力的平均变化的典型方法。
(B)用1或5微克/毫升IL-18BP中和IL-18后缺血后产生的收缩力。结果以完成再灌注(90分钟)后产生的收缩力相对于对照的平均百分比变化表示。括号中的数字表示IL-18BP的浓度单位是微克/毫升。N＝6。*表示与缺血/再灌注比较p＜0.01。
图2显示心肌IL-18蛋白质含量。在含氧量正常的条件下(对照)上融合90分钟或缺血30分钟再灌注45分钟(缺血/再灌注)后均质化小梁。使同一受试者的小梁匹配。纵轴表示IL-18水平，浓度单位为皮克/毫升。N＝4。*表示p＜0.01。
图3显示对照和缺血心房组织中稳态IL-18和IL-18BP mRNA水平。IL-18和IL-18BP mRNA水平由RT-PCR技术测定。数据来自两个评估受试者之一。A表示溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，其中PCR产物是分开的，B表示PCR产物含量的定量分析结果，相对于对照(GAPDH)倍数改变。
图4显示ICE的抑制对缺血后产生的收缩力的影响。结果表示为缺血/再灌注后产生的收缩力相对对照的平均百分比变化。括号中的数字表示ICEi的浓度单位是微克/毫升。N＝7。*表示与缺血/再灌注比较p＜0.01。
图5显示组织胆碱激酶(CK)在缺血/再灌注后的活性，以每毫克组织(湿重)的活性单位表示。实验条件显示在横轴下面。对照和缺血/再灌注，N＝6；IL-18BP(5微克/毫升)，N＝5；ICEi(10和20微克/毫升)，各为N＝5；*表示与缺血/再灌注比较p＜0.01。
图6显示产生的收缩力相对于平衡期后产生的收缩力的变化均值，该平衡期是加入TNFα(1纳克/毫升)前先使10微克/毫升小梁培育15分钟，设定为100％(n＝5)。加入TNFα和IL-18BP，直到每个浴槽改变。
图7显示在含氧量正常的条件下人心房小梁对IL-18的短暂反应。将成熟的IL-18(100纳克/毫升)在90分钟实验期间加到心房小梁中。纵轴表示与产生的收缩基线力的百分比变化均值。基线是在平衡期结束时测定的(未示出)。(n＝6)。*表示在相同时间间隔与对照比较p＜0.05，**表示实验期其余时间与对照比较p＜0.001。
图8显示经过缺血/再灌注、与TNFα(1纳克/毫升)和TNFα(10纳克/毫升)+IL-18BP接触后肌细胞组织胆碱激酶活性的保留。胆碱激酶活性以每毫克组织(湿重)的胆碱激酶活性单位表示。
发明详述
本发明的根据是：发现IL-18抑制剂在心脏病特别是缺血性心脏病发挥了有益的作用。如以下实施例所示，几种不同的IL-18抑制剂显示对心肌缺血后产生的收缩力具有显著的有益作用。
另外，在心肌梗塞的体内模型中测试了一种IL-18抑制剂，结果发现存活率提高，心室功能得到显著改善。
因此，本发明涉及用IL-18抑制剂来制造治疗和/或预防心脏病的药物。
本发明的术语“心脏病”包括心脏功能障碍在内的疾病。它们通常也称心血管疾患。
在本发明一优选实施例中，心脏病是缺血性心脏病。
本文所用的术语“缺血性心脏病”包括全部不同类型的缺血性心脏病，包括但不限于在“发明背景”中详细解释的那些缺血性心脏病，以及与缺血性心脏病相关的心血管病或疾患。
本发明的应用很适合长期治疗，故特别适用在与慢性心脏病相关的应用中。所以，在本发明的一优选实施例中，缺血性心脏病是慢性病。心绞痛具有缺血性心脏病长期病史患者最常见的一种临床症状。以前有过一次或多次心肌梗塞后左心室功能受损，可导致左心室衰竭，最终导致充血性心力衰竭。所以，本发明还涉及用IL-18抑制剂来治疗和/或预防心绞痛。
在本发明的又一优选实施例中，缺血性心脏病是急性病，更优选为心肌梗塞。
急性心肌性心脏病或心肌梗塞一般涉及心肌坏死，常见是左心室心肌坏死。它通常是由于冠状动脉粥样硬化与血栓或斑块出血重叠所引起。坏死随后发生炎症浸润、坏死肌肉释放纤维修复酶到血液中以及白细胞增多，这些在诊断上有用。急性心肌梗塞并发症包括心律不齐、心力衰竭、导致心包积血的心肌破裂、导致栓塞的壁血栓及心脏动脉瘤。其他并发症还包括突然死亡、心律不齐、持续疼痛、心绞痛、心力衰竭、二尖瓣关闭不全、心包炎、心脏破裂(心室痛、隔膜或乳突肌肉)、壁血栓形成、心室动脉瘤、德雷斯勒氏综合征(Dressler’s syndrome)(胸痛、发烧、渗出)、肺栓塞。本发明的药物也可用来治疗和/或预防心肌梗塞的这些并发症。
在本发明的另一优选实施例中，心脏病是心力衰竭。心力衰竭是一种患病状态，在该状态时心脏不能以正常代谢所需的速率供血。几乎所有形式的心力衰竭中心输出量都减少，这导致一定程度的灌注不足，称为动脉充盈不足。机体通过保留液体增加血量来补偿。心力衰竭可以是急性或慢性。心力衰竭的早期临床症状似乎是一侧的，但因为左右心室共享中间的心室隔膜，所以一个心室衰竭，另一个心室不可避免会跟着衰竭。心力衰竭可能由缺血性心脏病引起。它也可能由其它原因引起，如系统性高血压、瓣膜性心脏病或导致充血性心力衰竭的肺病。
心力衰竭可以是充血性心力衰竭，这是一种症状性心肌功能障碍导致特征型式的血液动力学、肾脏和神经激素反应。心力衰竭的临床表现可以是左心室衰竭或右心室衰竭。心力衰竭表现为心脏收缩或舒张性功能障碍，或二者。常见是联合性心脏收缩或心脏舒张异常。
在另一优选实施例中，心脏病是心肌病。心肌病是心室心肌层中任何一种结构或功能异常。
本发明上下文中的术语“预防”，不仅指完全预防某一种作用，也指在发病前或发病早期任何部分的或实质上的预防、减弱、降低、减退或消除这种作用。
本发明上下文中的术语“治疗”，指任何对疾病的进展有益的作用，包括在发病后减弱、降低、减退或消除病理性进展。
本发明上下文中的术语“IL-18抑制剂”，指能以减弱、降低或部分地、实质上或完全地防止或阻断IL-18产生和/或作用的方式，来调节IL-18的产生和/或作用的任何分子。
一种生产的抑制剂可以是任何一种对IL-18合成、加工或成熟有负面影响的分子。本发明考虑的抑制剂可以是，例如，白介素IL-18基因表达的抑制剂、降低或阻止IL-18mRNA转录或导致该mRNA降解的反义mRNA、损害正确折迭或部分或基本上阻止IL-18分泌的蛋白质、IL-18一旦合成后能降解它的蛋白酶、切割前IL-18产生成熟的IL-18的蛋白酶的抑制剂，如Caspase-1抑制剂等。
IL-18作用的抑制剂可以是，例如，IL-18拮抗剂。拮抗剂可以以足够亲和力和特异性结合或隔离IL-18分子本身而部分或基本上中和IL-18负责IL-18与其配体(例如，其受体)结合的IL-18结合位点。拮抗剂也可抑制细胞中IL-18/受体结合时被激活的IL-18信号传递通道。
IL-18作用的抑制剂也可以是可溶性IL-18受体或模拟这些受体的分子，或能封闭IL-18受体的制剂，或IL-18抗体，如多克隆或单克隆抗体，或能阻止IL-18与其靶结合，从而减弱或防止触发IL-18介导的细胞内外反应的其它制剂或分子。
在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂选自Caspase-1(ICE)抑制剂、抗IL-18抗体、抗IL-18受体亚基之一的抗体、IL-18信号传递通道抑制剂、能与IL-18竞争和封闭IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及其能抑制IL-18生物活性的IL-18结合蛋白、同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。
本文所用的术语“IL-18结合蛋白”与“IL-18BP”同义。它包括WO 99/09063或Novick等人(1999)所确定的IL-18结合蛋白，包括Kim等人(2000)所确定的能与IL-18结合的IL-18结合蛋白的剪接变体和/或同种型。具体地说，人IL-18BP同种型a和c可用在本发明中。本发明所用的蛋白质可以糖基化或非糖基化，它们可来自天然来源，如尿液，或者它们最好是重组产生的。可在原核生物表达系统如大肠杆菌，或真核生物最好是在哺乳动物表达系统中进行重组表达。
本文所用的术语“突变蛋白”指IL-18BP的同类物，或病毒性IL-18BP的同类物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代，或缺失，或IL-18BP、病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但所产生的产物的活性与野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比无显著改变。这些突变型蛋白可用已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。
本发明的突变蛋白包括由核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，所述的核酸在严谨条件下能与编码本发明的IL-18BP或病毒性IL-18BP的DNA或RNA杂交。术语“严谨条件”指杂交和随后的洗涤条件，这些条件是本领域普通技术人员常规所指“严谨的”条件。参见上述文献Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及上述引用的文献Sambrook等人。不受限制、严谨条件的例子包括比研究中计算的杂交温度Tm低12-20℃的洗涤条件，在例如以2×SSC和0.5％SDS洗5分钟，以2×SSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃以0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分钟，然后68℃以0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域普通技术人员知道严谨条件还取决于DNA序列的长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合的寡核苷酸探针。如果采用混合的探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。参见上述引用的文献Ausubel。
任何这样一种突变蛋白最好具有一IL-18BP充分复制、或病毒性IL-18BP充分复制的氨基酸序列，从而具有与IL-18BP相当的活性。IL-18BP的活性之一是其能结合IL-18。只要该突变蛋白对IL-18具有基本的结合活性。它就可用于纯化IL-18，如借助亲和层析法，从而认为其具有与IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常规实验方法来确定任何一个给定的突变蛋白是否具有与IL-18BP基本相同的活性，其方法包括对这样一种突变蛋白进行诸如简单的夹心竞争试验(simplesandwich competition assay)来确定它是否能与适当标记的IL-18结合，如放射免疫试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)。
在一优选实施例中，任何这样一种突变蛋白与WO 99/09063所确定的IL-18BP或病毒性编码的IL-18BP同类物的序列具有至少40％相同性或同源性。更优选具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％相同性或同源性。
可用于本发明的IL-18BP多肽突变蛋白或病毒性IL-18BP突变蛋白，或编码它们的核酸，包括一组有限的基本上与取代肽或多核苷酸相应的序列，本领域普通技术人员可根据本文所述和提供的指南用常规方法获得，而无须进行过多实验。
本发明突变蛋白中的优选变化是称为“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一组内的同义氨基酸，其具有足够相似的生理化学特性，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(Grantham，1974)。显然，在上述序列中也可进行氨基酸的插入和缺失而不改变其功能，特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围。
优选的同义氨基酸分组是表1列出的那些组；更优选的同义氨基酸分组是表2列出的那些组；最优选的同义氨基酸分组是表3列出的那些组。
    表1     优选的同义氨基酸分组
   氨基酸       同义组
   Ser          Ser，Thr，Gly，Asn
   Arg          Arg，Gln，Lys，Glu，His
   Leu          Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
   Pro          Gly，Ala，Thr，Pro
   Thr          Pro，Ser，Ala，Gly，Hi s，Gln，Thr
   Ala          Gly，Thr，Pro，Ala
   Val          Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
   Gly          Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
   Ile          Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
   Phe          Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
   Tyr          Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
   Cys          Ser，Thr，Cys
   His          Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
   Gln          Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
   Ash          Gln，Asp，Ser，Asn
   Lys          Glu，Gln，His，Arg，Lys
   Asp          Glu，Asn，Asp
   Glu          Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
   Met          Phe，Ile，Val，Leu，Met
   Trp          Trp
 表2    更优选的同义氨基酸分组
    氨基酸      同义组
    Ser         Ser
    Arg         His，Lys，Arg
    Leu         Leu，Ile，Phe，Met
    Pro         Ala，Pro
    Thr         Thr
    Ala         Pro，Ala
    Val         Val，Met，Ile
    Gly         Gly
    Ile         Ile，Met，Phe，Val，Leu
    Phe         Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
    Tyr         Phe，Tyr
    Cys         Cys，Ser
    His         His，Gln，Arg
    Gln         Glu，Gln，His
    Asn         Asp，Asn
    Lys         Lys，Arg
    Asp         Asp，Asn
    Glu         Glu，Gln
    Met         Met，Phe，Ile，Val，Leu
    Trp         Trp
      表3    最优选的同义氨基酸分组
    氨基酸       同义组
    Ser          Ser
    Arg          Arg
    Leu          Leu，Ile，Met
    Pro          Pro
    Thr          Thr
    Ala          Ala
    Val          Val
    Gly          Gly
    Ile          Ile，Met，Leu
    Phe          Phe
    Tyr          Tyr
    Cys          Cys，Ser
    His          His
    Gln          Gln
    Asn          Asn
    Lys          Lys
    Asp          Asp
    Glu          Glu
    Met          Met，Ile，Leu
    Trp          Met
在蛋白质中产生氨基酸取代的实施例可用来获得本发明中所用的IL-18BP多肽或蛋白质的突变蛋白，或病毒性IL-18BP的突变蛋白，其包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691专利中提出的方法，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代的蛋白质。
术语“融合蛋白”指包含有IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突变蛋白或片段与另一蛋白质(如能延长在体液中停留时间的蛋白质)相融合的多肽。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可与另一蛋白质、多肽等，如免疫球蛋白或其片段相融合。
本文所用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP或病毒性IL-18BP的衍生物及其突变蛋白和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从存在于残基的侧链或N末端或C末端基团上的功能性基团制备。只要它们仍然是药学上可接受的，即只要它们没有破坏该蛋白质与IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的活性，并且不会使含它们的组合物具有毒性，均包括在本发明中。
这些衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，其可遮蔽抗原位点并延长IL-18BP或病毒性IL-18BP在体液中的停留。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
本发明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括单独蛋白分子多肽链的片段或前体，或蛋白分子与相关分子或与其相连的残基，如糖或磷酸根残基一起，或蛋白分子或糖残基自身的聚集物，只要所述部分具有与IL-18BP基本上相似的活性。
在本发明的另一优选实施例中，IL-18抑制剂是抗IL-18抗体或其受体IL-18R的抗体。抗任何IL-18R亚基的抗体称为IL-18Rα和β，可用在本发明中。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆、嵌合、人源化或甚至完全的人抗体。重组抗体及其片段的特征是在体内能与IL-18或IL-18R高亲和力结合，而且毒性低。可用于本发明的抗体应具有的特征是对病人进行足够时间的治疗，它们能够良好至优异地减退或缓解病情或与病情相关的任何一种症状或一组症状，并且毒性低。
通过以IL-18或IL-18Rα或β免疫的动物不难在家兔、山羊或小鼠等动物中产生中和性抗体。免疫小鼠特别适用于提供B细胞来源以制备杂交瘤，进而培养杂交瘤产生大量抗IL-18单克隆抗体。
嵌合抗体是具有衍生自不同种动物的二个或多个节段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗体的可变区来自非人哺乳动物抗体，如小鼠单克隆抗体，而该免疫球蛋白的恒定区来自人免疫球蛋白分子。这两个区及其组合最好如常规方法测定那样具有低免疫原性(Elliott等人，1994)。人源化抗体是用基因工程技术构建的免疫球蛋白分子，其中用人的恒定区置换小鼠恒定区，而保留小鼠抗原结合区。所产生的小鼠-人嵌合抗体宜具有降低的免疫原性，和改善的人体中的药物动力学(Knight等人，1993)。
因此，在另一优选实施例中，IL-18或IL-18R抗体是人源化抗体，例如，欧洲专利申请EP0974600叙述了人源化抗IL-18抗体的优选例子。
在另一优选实施例中，此抗体是完全的人抗体。在WO 00/76310，WO 99/53049，US6,162,963或AU5336100中详细叙述了产生人抗体的技术。
一种完全的人抗体的制备方法包括小鼠体液免疫系统的“人源化”，即通过将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源性Ig基因已被灭活的小鼠中，产生能够产生人Ig(异种小鼠)的小鼠品系。Ig基因座在其物理结构和基因重排上很复杂，而表达过程要求最终产生宽广的免疫应答。抗体多样性主要由Ig基因座中的不同V、D和J基因之间的组合性重排所产生。这些基因座也含有散布的调节元件，其控制抗体的表达、等位基因排斥、类型的转换和亲和力成熟。将非重排的人Ig转基因引入小鼠证明小鼠重组机制与人基因是相容的。此外，用抗原免疫的异种小鼠可获得分泌各种同型抗原特异性人-小鼠抗体的杂交瘤。
完全的人抗体及其制备方法已为本领域所公知(Mendez等人(1997)；Buggemann等人(1991)；Tomizuka等人，(2000)，专利WO 98/24893)。
在本发明的一个更优选实施例中，IL-18抑制剂是IL-18BP，或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。这些同种型、突变蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性，优选具有至少基本上类似于IL-18BP的活性。理想的，这些蛋白质具有的生物活性比未修饰的IL-18BP更高。优选的活性组分具有的活性比IL-18BP的活性更好或具有其他优点，如稳定性更好，毒性或免疫原性更低，或它们更易大量生产，或更易提纯。
IL-18BP及其剪接变体/同种型的序列可从WO 99/09063或Novick等人(1999)以及Kim等人(2000)获得。
可将IL-18BP的功能性衍生物与多聚物偶联以改进该蛋白质的性能，如稳定性、半衰期、生物利用性、人体耐受性、或免疫原性。为达到此目的，可将IL-18BP与聚乙二醇(PEG)联接。例如，可按WO92/13095所述的已知方法进行聚乙二醇化。
因此，在本发明的一优选实施例中，IL-18抑制剂特别是IL-18BP抑制剂是聚乙二醇化的。
在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂包括免疫球蛋白融合，即IL-18抑制剂是一种融合蛋白，包含IL-18结合蛋白的全部或一部分，其与免疫球蛋白全部或一部分融合。免疫球蛋白融合蛋白的制备方法是本领域所公知的，如WO 01/03737所述的方法。本领域技术人员知道本发明所产生的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性。这种融合可以是直接的，或通过一个短接头肽，长度短至1-3个氨基酸残基或较长，如13到20个氨基酸残基的长度相融合。例如，所述接头可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或13个氨基酸的接头序列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met，将其导入IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之间。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的停留期(半衰期)延长，比活性提高，表达水平增加或有利于该融合蛋白的纯化。
在一优选实施例中，将IL-18BP融合于Ig分子的恒定区。优选融合于重链区，例如，人IgG1的CH2和CH3区。产生的特异性融合蛋白包含有WO 99/09063的实施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它同种型也适合用来产生本发明的融合蛋白，例如，同种型IgG2或IgG4，或其它Ig类，如IgM或IgA。融合蛋白可以是单体或多聚体，异质或同质多聚体。
在本发明另一实施例中，IL-18抑制剂与TNF拮抗剂联合使用。TNF拮抗剂以几种方式发挥其活性。首先，拮抗剂能以足够的亲和力和特异性结合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或负责与TNF受体结合的表位(下文称为“遮蔽性拮抗剂”)。例如，一种遮蔽性拮抗剂可以是抗TNF的抗体。
另一方面，TNF拮抗剂可抑制TNF结合后由细胞表面受体所激活的TNF信号传递通道(以下称为“信号传递拮抗剂”)。这二组拮抗剂可单独或一起，与IL-18抑制剂联合应用来治疗或预防心脏病。
TNF拮抗剂不难鉴定并通过常规筛选方法评价，即在体外敏感细胞系中，例如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B细胞中，筛选候选拮抗剂对天然TNF活性的作用来评价。该试验包括不同稀释度的候选拮抗剂的TNF制剂，例如，试验所用的TNF摩尔量的0.1倍到100倍，对照组无TNF或只有拮抗剂(Tucci等人，1992)。
封蔽拮抗剂是本发明优选使用的TNF拮抗剂。在封蔽拮抗剂中，优选使用那些以高亲和力结合TNF并具有低免疫原性的多肽。特别优选可溶性TNF受体分子和抗TNF的中和抗体。例如，可溶性TNF-RI和TNF-RII可用于本发明中。这些截短型受体是本发明更优选的拮抗剂，其包含该受体的细胞外结构域或其功能性部分，例如，EP914431叙述了截短的可溶性TNF-I型和II型受体。
截短型TNF受体是可溶的并在尿和血清中检测到30kDa和40kDa的TNF抑制性结合蛋白，这两种TNF抑制性结合蛋白分别称为TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根据本发明，IL-18抑制剂与TNF拮抗剂可同时、先后或分开使用。
本发明另一优选实施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本发明采用的TNF拮抗剂。欧洲专利EP 308378、EP 398327和EP 433900叙述了天然和重组的可溶性TNF受体分子及其制备方法。
这些受体分子的衍生物、片段、区段和生物活性部分在功能上类似于受体分子也可用于本发明。该受体分子的这些生物活性等价物或衍生物指该多肽的、或编码该受体分子的序列的一部分，其尺寸足够大，并能以这种亲和力与TNF结合，从而抑制或阻断与膜结合的TNF受体发生相互作用。
IL-18抑制剂可与TNF抑制剂同时、先后或分开使用。
本发明的药物还可含有已知的用来治疗心脏病的药物，例如硝酸盐，象硝化甘油、利尿剂、ACE抑制剂、洋地黄、β-阻断剂或钙阻断剂，与IL-18抑制剂联用。这些活性成分可以同时、先后或分开使用。
在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂的用量大约为0.001-100毫克/千克，或约1-10毫克/千克或2-5毫克/千克。
本发明的IL-18抑制剂宜全身性给药，最好皮下或肌肉内给药。
本发明还涉及采用含有IL-18抑制剂编码序列的表达载体来制备预防和/或治疗心脏病的药物。所以，考虑用基因疗法将IL-18抑制剂输送到需要该抑制剂的部位。为了治疗和/或预防心脏病，可将含有IL-18抑制剂序列的基因治疗载体直接注入患病组织中，从而可以避免例如全身性给予基因治疗载体所涉及的问题，如载体的稀释、到达和靶向靶细胞或组织，及副作用。
本发明还考虑在正常不表达IL-18抑制剂或表达该抑制剂的量不充足的细胞中，使用能诱导和/或增强内源性产生IL-18抑制剂的载体。该载体可包含在需要表达IL-18抑制剂的细胞中起作用的调控序列。例如，这类调控序列可以是启动子或增强子。然后，可通过同源重组将该调控序列导入基因组的正确基因座中，使调控序列与基因作可操作性相连，所需要的基因表达即被诱导或被增强。该技术通常称为“内源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所叙述。
本领域技术人员知道，也可用同一技术直接关闭IL-18的表达，而无需用IL-18抑制剂。要进行上述操作，可导入一个负调节元件，如沉默元件，到IL-18的基因座中，从而导致下调或防止IL-18的表达。本领域技术人员懂得，IL-18表达的这种下调或沉默与使用IL-18抑制剂的效果相同，用于预防和/或治疗疾病。
本发明还涉及使用经过基因修饰的细胞，以产生IL-18抑制剂来制备治疗和/或预防心脏病的药物。
本发明所用的IL-18抑制剂宜作为药物组合物给予，可任选地与治疗有效量的TNF抑制剂联用。
药物组合物的优选活性成分是上述IL-18BP及其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性组分或循环变换衍生物。
定义“药学上可接受的”指包含不干扰活性成分的生物活性作用，并对给予的宿主无毒性的任何运载体。例如，为了肠胃外给药，可将这些活性蛋白以注射用单位剂量形式配制在运载体，如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液中。
本发明药物组合物的活性成分可以以各种途径给予个体。给药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、颅骨内、硬膜外、局部和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径给药，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因疗法将编码活性药物的DNA分子给予病人(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌。此外，可将本发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、运载体、稀释剂和载体剂等，一起给予。
对于肠胃外(如静脉内、皮下、肌肉内)给药，可将活性蛋白质与药学上可接受的肠胃外运载体(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。以常用技术给这些制剂灭菌。
也可用共偶联方法增加本发明的活性蛋白质分子在人体内的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT专利申请WO 92/13095所述那样，将该分子与聚乙二醇联接。
该活性蛋白的有效治疗量是很多变量的函数，包括拮抗剂的类型、拮抗剂对IL-18的亲和力、拮抗剂显示的持续细胞毒活性、给药途径、病人的临床状态(包括维持内源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。
“治疗有效量”是给药时IL-18抑制剂抑制IL-18生物活性的量。给予个体单一剂量或多个剂量的剂量取决于各种因素，包括IL-18抑制剂的药物动力学性能、给药途径、病人的病情和特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状轻重程度、并行治疗、治疗频度和所要求的效果。本领域技术人员都掌握了调整和操作已确定的剂量范围以及在体内外测定个体抑制IL-18的方法。
按照本发明，IL-18抑制剂的用量约为0.001-100毫克/千克体重，或约0.01-10毫克/千克体重，或约0.1-5毫克/千克体重，或约1-3毫克/千克体重，或约2毫克/千克体重。
本发明优选的给药途径是皮下给药途径，本发明更优选的是肌肉内给药。为了将IL-18抑制剂直接给予到其作用部分，最好是局部给予。
在另一优选实施例中，IL-18抑制剂是每天或每隔一天给予。
每日剂量通常分成几剂或以缓释形式给予，以有效获得所希望的结果。第二次或随后给药可以与首次或先前给予该个体的相同剂量、少于或多于此剂量进行。可在发病时或发病前进行第二次或随后给药。
按照本发明，IL-18抑制剂可以以治疗有效量先于、同时或依次与其它治疗方案或药物(如多种药物方案)预防性或治疗性地给予个体，特别是与TNF抑制剂和/或其它心脏保护药物一起。活性药物可在相同或不同的组合物中与其它治疗剂同时给予。
本发明还涉及一种药物组合物的制备方法，所述的药物组合物包括将有效量的IL-18抑制剂和/或TNF拮抗剂与药学上可接受的载体掺合。
本发明还涉及一种治疗心脏病的方法，该方法包括给予需要的病人药学上有效量的IL-18抑制剂，可任选地与药学上有效量的TNF拮抗剂联用。
以上对本发明进行了叙述，本领域技术人员在不脱离本发明的思路和范围内，可以在宽范围的等效参数、浓度和条件内进行相同的工作，而无需作多余的实验。
虽然结合具体实施例对本发明进行了叙述，但应明白，它能够作其它改进。总之，本申请包括遵循本发明的原理而对本发明作出的任何改变、应用或适应性变化，包括那些本发明没有公开的内容，其通过与本发明相关的本领域所公知或常规技术推导出的并可应用于上文所述的在所附权利要求书范围内的基本专题。
本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均纳入本文参考文献中。包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。
总之，参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中公开得到、启发或者暗示。
上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术的常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，根据本文所述和指引，意味着这样一些改变和/或调整在本发明所公开的实施例相等的范围内。需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所述和提供的指引，并结合本领域普通技术人员所知道的常识作出解释。
实施例
实施例1体外抑制IL-18减少了心肌缺血功能障碍
材料和方法
试剂
在中国仓鼠卵巢细胞中用表达带有末端(His)6尾的IL-18BPa同种型，并纯化至均一。有人已叙述了IL-18BPa-(His)6中和IL-18的能力(Kim等人，2000)。从Alexis Biochemicals(San Diego)购买了ICE抑制剂(ICEi)Ac-Try-Val-Ala-Asp-氯甲酮(YVAD)，将它溶于DMSO中，配成10毫克/毫升的浓度。使用前ICE抑制剂用泰洛氏(Tyrode’s)溶液稀释。通过ELISA(Cistron Biotechnology，Pine Brook，NJ)测定，ICEi使内毒素诱导的人外周血单核细胞分泌成熟的IL-1β减少92％。
分离的心房小梁
接受用泵式氧合机进行选择性冠状动脉搭桥手术的病人需要将一根导管插入右心房。那时，常规要切除并弃掉一小段右心耳。从该弃掉的组织获得小梁。4℃将人心房组织置于经过氧合改性的泰洛氏缓冲液中。用去离子蒸馏水每天制备改性的泰洛氏溶液，该溶液含有5.0毫摩尔/升D-葡萄糖、2.0毫摩尔/升氯化钙、118.0毫摩尔/升氯化钠、4.0毫摩尔/升氯化钾、1.2毫摩尔/升硫酸镁7水合物、25.0毫摩尔/升碳酸氢钠和1.2毫摩尔/升磷酸二氢钠。不含底物的泰洛氏溶液含7毫摩尔/升氯化胆碱，以维持渗透压。除非另外指出，这些化学物质和试剂都购自Sigma。将2-4个小梁(长4-7毫米，直径小于1.0毫米)附着在一个力转导感测器上，并浸在30毫升改性的泰洛氏溶液热浴(37℃)中；在含氧量正常期间，92.5％氧气/7.5％二氧化碳混合气体冒泡而出。这种混合气体中的氧分压大于350mmHg(1mmHg＝133Pa)，二氧化碳分压是36-40mmHg，pH值等于7.35-7.45。用自动血液气体分析仪按常规方法检查每个参数。实验全过程有机浴槽的温度保持在37℃。在模拟缺血期间将混合气体改为92.5％氮气/7.5％二氧化碳。这种混合气体产生的氧分压小于50mmHg。除了在30分钟模拟缺血期间，该缓冲液每20分钟更换一次。
实验设计
使小梁平衡90分钟以将基线伸力提高到1000毫克，而且可使产生的收缩力稳定。研究时排除所产生收缩力不超过250毫克的小梁。在90分钟平衡期中，电场刺激用铂电极(Radnoti Glass，Monrovia，CA)进行步测。电极置于小梁每一侧，用6毫秒脉冲刺激(Grass SD9 stimulator，Warwick，RI)，电压高于阈值20％，含氧量正常时步测的频率为1Hz，缺血时的频率为3Hz。通过力转导感测器(GrassFT03)监测收缩情况，用计算机控制的前置放大器和数字转换器(MacLab QuadBridge，MacLab/8e，AD Instruments，Milford，MA)记录，并用Macintosh计算机连续监控。
经过平衡后，在三种实验条件下研究了一个病人的小梁：对照条件是90分钟含氧量正常的上融合；缺血/再灌注为30分钟模拟缺血，然后45分钟再灌注；而第三种条件是抗细胞因子干预。在后一种情况中，将抗细胞因子在缺血发生之前即刻加到上融合浴槽中，45分钟再灌注全过程都存在此抗细胞因子。
保存的小梁胆碱激酶活性
如所述那样(Kaplan等人1993)，测定再灌注组织(90分钟)的胆碱激酶活性。这些组织在100体积的冰冻等渗提取缓冲液中均浆化(Cleveland等人，1997，Kaplan等人，1993)。通过自动分光光度计用胆碱激酶试剂盒(Sigma)进行试验。结果以每毫克(湿重组织)的碱激酶活性单位表示。
RNA的分离和逆转录偶联的PCR
将新鲜小梁在Tri-Reagent试剂(Molecular Research Center，Cincinnati)中均浆化，用氯仿抽提和异丙醇沉淀分离得到总RNA。将RNA溶于经焦碳酸二乙酯处理过的水中，用脱氧核糖核酸酶处理，并用GeneQuant(Amersham PharmaciaBiotech)定量分析。已有人对cDNA方法作了叙述(Reznikov等人，2000)。每次PCR按以下顺序进行：95℃预热15分钟，再94℃ 40秒，55℃ 45秒，72℃ 1分钟循环多轮，最后在72℃延伸10分钟。确定最佳循环次数为35轮。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、人IL-18(Reznikov等人，2000)以及人IL-18BPa(Kim等人，2000)的引物已有报导。PCR产物用0.5毫克/毫升的溴化乙锭在含0.5×TBE(50mMTris/45mM硼酸/0.5mM EDTA，pH8.3)的1.5％琼脂糖凝胶上分离，用紫外线照明显现，并拍照。对负片影像进行密度计量(IMAGEQUANT软件，MolecularDynamics)，修正IL-18和IL-18BP的PCR产物相对于GAPDH吸光值的相对吸光值。
IL-18的测定
如上所述使新鲜的小梁均浆化，以测定胆碱激酶。用液相电化学发光法(ECL，Igen，Gaithersburg，MD)分析IL-18。小鼠抗人IL-18单抗(R & D Systems)用钌(Igen)标记。另外，经亲和纯化的山羊抗人IL-18抗体(R & D Systems)用生物素(Igen)标记。将生物素化的抗体用PBS(pH7.4)稀释至终浓度为1微克/毫升(此PBS溶液含有0.25％BSA、0.5％Tween-20和0.01％叠氮化合物(ECL缓冲液))。每支分析试管装25微升生物素化抗体，室温下与25微升1微克/微升包被链霉亲和素的顺磁珠强烈摇动预培育30分钟。各试管中加入测试样品(25微升)或标准品，再加入25微升经钌化的抗体(终浓度为1微克/微升，用ECL缓冲液稀释)。然后将试管摇动24小时。每支试管加入200微升PBS淬灭反应，用Origen分析仪(Igen)测定化学发光量。IL-18的检测极限是16皮克/微升。
将插入泵式氧合机导管时获得的共聚焦显微镜人心房组织置于一个1厘米长的塑料支架上，包埋并在干冰冷却的异戊烷上在组织冻结培养基(TriangleBiomedical Sciences，Durham，NC)中冻结。在Leica CM 1850深低温箱(Leica，Deerfield，IL)中切成冰冻切片(5微米)。切片在4％多聚甲醛中固定10分钟，风干，在添加有10％正常山羊血清的PBS中培养20分钟。使切片在兔抗人IL-18抗体的1：100稀释液(Peprotch，Rocky Hill，NJ)或1微克/毫升非免疫兔IgG(作为对照)中培养。抗体用含1％BSA的PBS稀释。经过4℃培养过夜后，这些切片用含0.5％BSA的PBS洗三次。然后使切片与偶联于Alexa488(Molecular Probes)的山羊抗兔第二抗体室温暗处培养60分钟。每100毫升胞核用1微克bisbenzimide萤光染剂(Sigma)染上蓝色。染色后，洗涤切片，用Leica DM RXA(Leica)共聚激光扫描系统检查，并以供MacIntosh使用的SLIDEBOOK软件(Intelligent ImagingInnovations，Denver)分析。
统计学分析
数据以平均值±SEM表达。计算每个病人组织在90分钟时产生的收缩力相对于对照值的平均变化。用Bonferroni-Dunn后hoc分析(Bonferroni-Dunn post hocanalysis)经析因(factorial)ANOVA确定了组间差异的统计学意义。用STAT-VIEW4.51软件(Abacus Concepts，Calabasas，CA)进行统计学分析。
结果
用IL-18BP中和内源性IL-18对缺血后产生的收缩力的影响
图1A显示小梁对缺血/再灌注损伤的动力学反应。图中示出平衡的最后15分钟，在实验期开始时标准化为100％。在实验全过程中对照小梁在含氧量正确的条件下上融合。如图所示，对照小梁产生的收缩力有所下降(10％)。经历缺血的小梁的收缩功能显示急速下降；再灌注后，收缩力回升至对照产生的收缩力的约25％。与此相反，经历缺血但在IL-18BP存在下小梁的收缩力回升至对照产生的收缩力的约55％。为了评估多个病人心脏组织的缺血/再灌注反应，将每个病人样品的对照小梁在90分钟时产生的收缩力的水平定为100％，计算出实验各组产生的力的相对百分比变化。
如图1B所示，未经处理的小梁(缺血/再灌注)缺血后产生的力下降到对照组平均值的35％。然而，在1微克/毫升和5微克/毫升IL-18BP存在下，这种下降分别减至对照组平均值的66.2％和76％。这些结果提示，经过ICE加工内源性前体IL-18后，缺血/再灌注导致释放出生物活性IL-18。因此，测定了新鲜获得的心房组织中的IL-18。如图2所示，在泵式氧合机导管插入右心房之前获得小梁，其含有基本的IL-18。经过90分钟平衡、30分钟缺血和45分钟再氧合后，使小梁均浆化，测定IL-18水平。缺血/再灌注后组织中的IL-18上升了4.5倍(图2)。
还测定了这些组织中IL-18和IL-18BP的稳态mRNA水平。我们观察了新鲜得到的缺血前心房组织匀浆中IL-18和IL-18BP的基本基因表达(图3A、B)。与IL-18蛋白质的增加相似，缺血/再灌注诱导了稳态mRNA水平进一步上升(上升4.7倍)。也观察了IL-18BP在新鲜得到的心房组织中的IL-18BP基因表达，其在缺血/再灌注后只有轻微上升(1.3倍)。
IL-18在人心肌层中的定位
因为如ECL测定的那样，新鲜得到的心肌匀浆中含有IL-18蛋白质和IL-18mRNA，所以采用组织化学染色测定了IL-18的定位。在插入泵式氧合机导管之前即刻取得心房组织，并立即速冻(未图示)。结果发现IL-18存在于驻留的心肌巨噬细胞和血管内皮细胞内。巨噬细胞和内皮细胞中在手术相关的缺血发生之前都有IL-18在不与外源性表面接触时IL-18也存在。IL-18在驻留巨噬细胞和血管内皮细胞的位置，与以前在健康受试者新鲜取得的人外周血单核细胞中组成性预先形成的前体(constitutive preformed precursor)IL-18的研究相一致(Puren等人，1999)。所以，可得出结论，是按期进行缺血性心脏病冠状动脉分流术的病人的心肌层中存在预先形成的前体IL-18。
ICE抑制对缺血后产生的收缩力的影响
因为IL-18BP有效地减弱缺血诱导的心肌功能障碍，我们假设抑制预先形成的前体IL-18转变为成熟的IL-18也会减弱缺血诱导的心肌功能障碍。因此，在缺血发病前将特异性ICE抑制剂YVAD加入上融合浴槽中。整个缺血期和再灌注期间加入YVAD持续进行ICE抑制。YVAD介导的ICE抑制导致缓解了缺血诱导的心肌功能障碍，如图所示，在10微克/毫升ICE时缺血/再灌注的收缩功能从对照组的35％上升到60％，在20微克/毫升ICE时上升到75.8％(图4)。这些结果证实了人心肌内的生物活性IL-18是预先形成的前体IL-18被ICE切断的结果。另外，这些结果也提示心肌缺血可激活潜在的ICE。
细胞活力的保存
用细胞内胆碱激酶水平评估在缺血/再灌注后细胞存活的程度。在此试验中，胆碱激酶值越高，存活细胞的数目越大。每次抗细胞因子干预都导致细胞存活力的保存。如图5所示，IL-18BP和ICE抑制(10和20微克/毫升)增加了缺血/再灌注后细胞内胆碱激酶水平，从每毫克(湿组织)胆碱激酶1,399活性单位分别提高到5,921、5,675、6,624和4,662单位。这些结果提示此活体外模型中抑制缺血/再灌注诱导的IL-18活化可保存心肌细胞的活力。
中和TNFα诱导的心肌功能的作用
如图6所示，小梁与外源性TNFcα接触90分钟后，其产生的收缩力(DF)下降了18％。加入TNFα之前，通过与IL-18BP培育10分钟，中和接触外源性TNF的人心肌的内源性IL-18，对所述人心肌的收缩功能使产生的收缩力(DF)下降的数量级减少，参见图6。90分钟后，对照组中产生的收缩力下降了18％，而接触TNFα的小梁中与对照组相比下降了58％。然而，在IL-18存在下接触TNFα的小梁中产生的收缩力与对照组相比仅下降了30％。这些数据提示TNFα对心肌收缩力降低的直接作用至少部分是由生物活性内源性IL-18介导的。
外源性IL-18对产生的收缩力的作用
接着，确定了外源性IL-18对心肌收缩功能的直接作用。经过90分钟平衡并改变每个浴槽后，在上融合的小梁中加入IL-18，。如图7所示，IL-18导致产生的收缩力在实验期间缓慢但渐进式下降。与IL-18连续接触90分钟后，产生的收缩力下降了42％。这些数据证明，外源性IL-18与TNFα相类似，起着心肌抑制剂的作用。
令人感兴趣的是，IL-18的心肌抑制剂作用不如TNFα那样强。
细胞活力的保存
细胞凋亡通常与酪蛋白有关。为了评估与TNFα接触的小梁中细胞的存活力，测定了组织的细胞内胆碱激酶。在此试验中，胆碱激酶水平高表示为活细胞。如图8所示，对照小梁经历90分钟含氧量正常的上融合，每毫克湿重组织所含的胆碱激酶活性为6801±276单位。相比之下，经历30/45分钟缺血/再灌注损伤或与TNFα接触90分钟的小梁显示保存的胆碱激酶水平下降，分别为1774±181和3246±217单位/毫克。在IL-18BP存在下与TNFα接触的小梁所含的胆碱激酶水平为5605±212单位/毫克组织。令人感兴趣的是，用TNFα处理过的小梁与缺血/再灌注小梁相比，其保存的胆碱激酶水平更高。这是一个出乎意外的发现，因为实验结束时产生的收缩力的数量级与缺血/再灌注及TNFα的数量级相似。
实施例3
方法
小鼠IL-18BP表达质粒的体内肌肉内电转移
C57BL/6小鼠每隔3星期注射3次含有IL-18BP cDNA的表达质粒(称为pcDNA3-IL18BP，如WO 01/85201所述)。对照小鼠注射对照空质粒。按所述的方法(查询号是#Q9ZOM9)(Kim等人，2000)分离小鼠IL-18BP同种型d的cDNA，将它亚克隆到在巨细胞病毒启动子(Invitrogen)调控下的哺乳动物细胞表达质粒pcDNA3的EcoR1/Not1位点中。对照质粒是一种不含治疗性cDNA的相似构建物。对照组有31只小鼠，接受注射IL-18BP的实验组有27只小鼠。
按照前述方法(Mallat等人，1999)，在麻醉小鼠的两侧胫骨颅侧肌肉内注射IL-18BP或对照表达质粒(60微克)。简言之，在大腿两侧放置相距4.2至5.3厘米的两块不锈钢电极板，以PS-15电脉冲仪输出透皮电脉冲(200伏/厘米的8方波电脉冲，在2Hz持续20毫秒)。
左心室梗塞的诱导
给予IL-18BP质粒或空质粒24小时后，腹膜内注射甲苯噻嗪(xylazine)和克他命(ketamine)麻醉小鼠，通风条件下接受开胸开术。左主冠状动脉用8-0聚丙烯纺织纤维线永久性结扎，以诱导心肌梗塞，然后，缝合胸部，让动物从麻醉中恢复过来。全手术死亡率不到20％，对照组的术后死亡率是48％，而实验组的术后死亡率是26％，死亡几乎都是在结扎后第4-5天发生。
结扎后第7天，再次麻醉小鼠，利用ATL HDI 5000超声心动描记器在胸缝合状态下以超声心动描记评估左心室尺寸。由测出的舒张末期直径和收缩末期直径计算出左心室部分缩短(Fractional shortening)。超声心动描记测量结束时取出心脏，固定，然后切片。然后，将组织切片用天狼星红染色，以测定梗塞的大小。
结果
存活的小鼠结扎后7天左心室舒张直径如下：
经IL-18BP处理小鼠是0.53+0.01厘米(n＝20)，而对照小鼠是0.59+0.01厘米(n＝16)，p＜0.01。
存活的小鼠结扎后7天左心室收缩直径如下：
经IL-18BP处理小鼠是0.45+0.02厘米，而对照小鼠是0.52+0.02厘米，p＜0.01。
左心室部分缩短：经IL-18BP处理小鼠是15+1％，而对照小鼠是11+1％，p＜0.01。
结论：IL-18BP降低了小鼠在左心室冠状动脉完全结扎诱导的心肌梗塞后的死亡率50％。此外，如左心室的收缩和舒张直径减少所示，左心室的功能也得到显著改善。
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Claims (25)

1.一种IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防心脏病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是缺血性心脏病。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是慢性病。
4.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是心绞痛。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是急性病。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是心肌梗塞。
7.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是心力衰竭。
8.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的心脏病是心肌病。
9.如权利要求1到8中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂选自caspase-1(ICE)抑制剂、抗IL-18抗体、抗任IL-18受体亚基之一的抗体、IL-18信号通道抑制剂、能与IL-18竞争并阻断IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白质，或其能抑制IL-18生物活性的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环性变换衍生物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是抗IL-18抗体。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是抗IL-18受体α的抗体。
12.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是抗IL-18受体β的抗体。
13.如权利要求9至12中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抗体是人源化抗体或人抗体。
14.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是IL-18结合蛋白质，或其能抑制IL-18生物活性的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环性变换衍生物。
15.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂的一个或多个位点是糖基化的。
16.如权利要求14所述的应用，其特征在于：所述的融合蛋白包含一个免疫球蛋白(Ig)融合。
17.如权利要求9或14所述的应用，其特征在于：所述的功能性衍生物包含至少一个连接于作为氨基酸残基的一条或多条侧链存在的一个或多个功能基团的部分。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于：所述的部分是聚乙二醇部分。
19.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包含肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于：IL-18抑制剂与TNF拮抗剂同时、先后或分开使用。
21.如权利要求19或20所述的应用，其特征在于：所述的TNF拮抗剂是TBPI和/或TBPII。
22.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂的使用浓度范围为约0.001-100毫克/千克(体重)，或约1-10毫克/千克，或2-5毫克/千克(体重)。
23.一种含有IL-18抑制剂编码序列的表达载体在制备治疗和/或预防心脏病的药物中的应用。
24.一种能诱导和/或增强细胞中内源性产生IL-18抑制剂的表达载体在制备治疗和/或预防心脏病的药物中的应用。
25.一种心脏病的治疗方法，其特征在于：所述方法包括给予需要的宿主抑制有效量的IL-18抑制剂。
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