SK10892003A3 - Použitie IL-18 inhibítorov - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález spadá do oblasti kardiovaskulárnych ochorení. Konkrétnejšie sa týka použitia IL-18 inhibítora na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia, najmä ischemického srdcového ochorenia.

Doterajší stav techniky

Cytokínový interleukín 18 (IL-18) bol najprv opísaný ako faktor indukujúci interferón-γ (IFN-γ) (Nakamura a ďalší, 1989). Je skorým signálom pri vývoji reakcií T-lymfocytových pomocných buniek typu 1 (TH1). IL-18 účinkuje spolu s IL-12, IL2, antigénmi, mitogénmi a možno aj inými faktormi, aby indukoval produkciu IFN-γ. IL-18 tiež zosilňuje produkciu GM-CSF a IL-2 a posilňuje anti-CD3 indukovanú T bunkovú proliferáciu a zvyšuje Fas-sprostredkované usmrcovanie prirodzených zabíjačských buniek.

Zrelý IL-18 sa produkuje zo svojho prekurzora prostredníctvom IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu (ICE, kaspáza-1).

IL-18 receptor pozostáva z najmenej dvoch zložiek, ktoré spolupracujú pri viazaní ligandu. V myšacích T bunkách stimulovaných s IL-12 sa našlo väzobné miesto s vysokou afinitou a väzobné miesto s nízkou afinitou (Yoshimoto a ďalší, 1998), čo naznačuje viacreťazcový receptorový komplex. Doteraz boli identifikované dve receptorové podjednotky, pričom obe patria do IL-1 receptorovej rodiny (Parnet a ďalší, 1996; Kim a ďalší, 2001). Prenos signálu IL-18 zahŕňa aktiváciu NF-kB (DiDonato a ďalší, 1997). IL-18 receptorový komplex pozostáva z dvoch receptorových reťazcov: ligand-viažuceho reťazca označovaného IL-18Ra reťazec a signál prenášajúceho reťazca označovaného IL-Ιδβ reťazec. IL-18R reťazec bol najprv izolovaný ako bunkový povrchový proteín viažuci sa na rádioaktívne značený IL-18; proteín bol purifikovaný a jeho aminokyselinové sekvencia odhalila zhodnosť s predtým zverejneným sirotským receptorom označeným ako proteín súvisiaci s IL1R (iL-1 Rrp) (Torigoe a ďalší, 1997).

-2V súčasnosti sa z ľudského moču izoloval rozpustný proteín majúci vysokú afinitu voči IL-18 a opísali sa myšacie cDNAs (Novick a ďalší, 1999; WO 99/09063). Proteín sa označil ako IL-18 viažuci proteín (IL-18BP).

IL-18BP nie je extracelulárnou doménou jedného zo známych IL-18 receptorov, ale je vylučovaným, prirodzene cirkulujúcim proteínom. Patrí do novej rodiny vylučovaných proteínov. Táto rodina okrem toho zahŕňa niekoľko Poxvírusom kódovaných proteínov, ktoré majú vysokú homológiu s IL-18BP (Novick a ďalší, 1999). Močový ako aj rekombinantný IL-18BP špecificky viažu IL-18 s vysokou afiitou a modulujú biologickú afinitu IL-18.

IL-18BP gén bol lokalizovaný na ľudský chromozóm 11q13 a v 8,3kb genomickej sekvencii sa nenašiel žiadny exón kódujúci transmembránovú doménu. Doteraz boli u ľudí nájdené štyri zostrihové varianty alebo izoformy IL-18BP generované alternatívnym mRNA zostrihom. Boli označené IL-18BP a, b, c a d, všetky zdieľajú rovnaký N-koniec a líšia sa na C-konci (Novic a ďalší, 1999). Tieto izoformy sa líšia v ich schopnosti viazať IL-18. Z týchto štyroch je ohlL-18BP izoformách aac známe, že majú schopnosť neutralizovať IL-18. Ľudská IL-18BP izoforma krížovo reaguje s myšacím IL-18.

Srdcové ochorenia sú definované ako poruchy, ktoré postihujú srdcový sval alebo krvné cievy srdca (The Merck Manual Home Edition, www.merck.com). Cievnou poruchou je problém s krvnou cievou, ako napríklad slabá cirkulácia spôsobená blokádou. Srdcové ochorenia sa nazývajú aj kardiovaskulárne poruchy.

Ischemické srdcové ochorenie je bežnou príčinou zlyhania srdca a je najčastejšou príčinou smrti v západných spoločnostiach. Zvyčajne je spôsobené koronárnym cievnym aterómom. Myokardové lézie zahŕňajú ischemickú fibrózu a akútny infarkt. Za normálnych podmienok je obeh krvi v koronárnych artériách úzko späté s metabolickým požiadavkami srdcového svalu. Ischemické srdcové ochorenie nastáva, keď sa stane dodávanie krvi nedostatočným, buď preto, že samotné dodávanie krvi je poškodené, alebo preto, že myokardium sa stáva hypetrofickým a má väčšiu požiadavku na dodávanie krvi. Obeh koronárnej krvi je normálne nezávislý na aortickom tlaku. Existuje účinný autoregulačný mechanizmus na kontrolu obehu krvi cez koronárne cievne riečište.

-3Ked sa v hlavej koronárnej artérii vytvorí obštrukcia, zvyčajne spôsobená aterosklerózou alebo artériosklerózou, najprv ostáva koronárny obeh krvi zachovaný, pretože sa zníži periférna rezistencia distálu od obštrukcie. Keď sa svetlosť cievy upchá na viac ako 75 %, vyvinie sa ischémia, najmä ak je slabo vyvinutá koronárna kolaterálna cirkulácia.

Srdcový sval je metabolický extrémne aktívny a mitochodrie predstavujú viac ako 30 % objemu jednotlivých vlákien. Aeróbny metabolizmus je esenciálny, keďže v ňom sú veľmi slabé zásoby fosfátov s vysokou energiou. Smrť srdcového svalu nastáva, keď sú tkanivové hladiny adenozín trifosfátu (ATP) veľmi nízke, a keď fakticky zastane anaeróbna glykolýza. Ako aj pri iných tkanivách, presná príčina smrti nie je jasná, ale letálne poškodenie srdcového svalu je spojené s membránovým poškodením a s náhlym vstupom vápnika do bunkovej cytoplazmy. V priebehu krátkeho času je možné obnoviť obeh krvi ischemickým srdcom (reperfúzia). Avšak po kritickom intervale je reperfúzia nemožná, pravdepodobne v dôsledku napuchnutia kapilárnych endoteliálnych buniek.

Ateroskleróza sa podieľa na veľkej väčšine koronárnych cievnych ochorení. Ischemické srdcové ochorenie môže byť spôsobené aj nízkou koronárnou arteriálnou perfúziou. Časťou príčinou tohto je mŕtvica, najmä ako výsledok silného krvácania.

Ako bolo poznamenané vyššie, ischemické srdcové ochorenie je spôsobené nerovnováhou medzi myokardovým krvným obehom a metabolickou požiadavkou myokardia. Krvný obeh môže byť ešte viac redukovaný paralelnými dejmi, ako napríklad vazospazmou, trombózou alebo obehovými zmenami vedúcimi k hypoperfúzii.

Koronárna arteriálna perfúzia závisí na rozdiele tlaku medzi ostiom (aortický diastolický tlak) a koronárnym sínusom (tlak v pravej predsieni). Koronárny krvný obeh je znížený počas systoly v dôsledku Venturiho efektov v ústí ciev a stlačenia intramuskulárych artérii počas kontrakcie komôr. Faktory redukujúce koronárny krvný obeh zahŕňajú znížený aortický diastolický tlak, zvýšený vnútrokomorový tlak a myokardiálnu kontrakciu, koronárnu arteriálnu stenózu, stenózu aortickej chlopne a spätné prúdenie krvi a zvýšený tlak v pravej predsieni.

-4Trombolytická terapia s látkami, akými sú napríklad streptokináza alebo tkanivový plazminogénový aktivátor (TPA) sa často používa na lýzu aktuálne vytvoreného trombusu. Takáto terapia s lýzou trombusu môže vo väčšine prípadov obnoviť krvný obeh. To pomáha predchádzať vážnemu myokardiálnemu poškodeniu, ak sa uskutoční skoro (menej ako hodinu alebo podobne) po nehode, a môže aspoň pomôcť redukovať ďalšie poškodenie.

Angína pectoris je symptómový komplex ischemickej srdcovej choroby, ktorý je charakteristický paroxyzmálnymi záchvatmi bolesti v hrudi, zvyčajne substernálnymi alebo prekordiálnymi. Je to spôsobené myokardiálnou ischémiou, ktorá môže zakrátko privodiť infarkt. Môže nastať náhla srdcová smrť, ktorá je neočakávanou smrťou so srdcovými príčinami, zvyčajne jednu hodinu po srdcovej udalosti alebo bez nástupu symtómov. Postihuje 300 000 až 400 000 osôb ročne.

Iné formy srdcového ochorenia zahŕňajú alkoholovú kardiomyopatiu, pokles aortickej chlopne, stenózu aortickej chlopne, arytmiu, kardiogénny šok, kongenitálne srdcové ochorenie, dilatovanú kardiomyopatiu, srdcový záchvat, zlyhanie srdca, srdcový nádor, srdcovú chlopňovú pľúcnu stenózu, hypertrofickú kardiomyopatiu, idiopatickú kardiomyopatiu, ischemické srdcové ochorenie, ischemickú kardiomyopatiu, mitrálne spätné prúdenie krvi, poklesnutie mitrálnej chlopne, peripartovú kardiomyopatiu, stabilnú angínu.

Infarkt myokardu je ďalšou formou ischemického srdcového ochorenia. Patogenéza môže zahŕňať okluzívny intrakoronárny trombus, tzn. trombus prekrývajúci zjazvený alebo zbrázdený stenotický plak. Okluzívny intrakoronárny trombus spôsobuje 90 % transmurálnych akútnych infarktrov myokardu.

Vazospazma môže byť s alebo bez koronárnej aterosklerózy a môže byť asociovaná s agregáciou krvných doštičiek. Pri infarkte myokardu môže byť prítomná aj embólia.

Hrubý morfologický vzhľad infarktu myokardu sa môže meniť. Transmurálny infarkt zahŕňa celú hrúbku steny ľavej komory od endokardia po epikardium. Subendokardiálny infarkt zahŕňa multifokálne oblasti nekrózy obmedzené na vnútornú 1/3 až 1/2 steny ľavej komory. Komplikácie infarktov myokardu môžu zahŕňať arytmiu a defekty vedenia, s pravdepodobnosťou „náhlej smrti“, rozšírenie infarktu, opätovný infarkt, kongestíve zlyhanie srdca (pľúcny edém), kardiogénny

-5šok, perikarditídu, murálnu trombózu s možnou embolizáciou, pretrhnutie myokardiálnej steny, s možnou tamponádou, papilárne svalové prasknutie, s možnou chlopňovou nedostatočnosťou, vytvorenie komorovej aneuryzmy.

Infarkt myokardu (Ml) je definovaný ako ischemická myokardiálna nekróza zvyčajne spôsobená náhlou redukciou koronárneho krvného obehu na segment myokardia.

U viac ako 90 % pacientov s akútnym Ml, akútny trombus, často asociovaný s prasknutým plakom, uzatvára artériu (predtým čiastočne upchatú aterosklerotickým plakom), ktorá zásobuje poškodenú oblasť. Zmenená funkcia krvných doštičiek indukovaná endoteliálnou zmenou v aterosklerotickom plaku sa pravdepodobne podieľa na trombogenéze. Spontánna trombolýza nastáva u približne 2/3 pacientov, takže o 24 hodín neskôr sa trombotická oklúzia zisťuje len u približne 30 %.

Infarkt myokardu je niekedy spôsobený arteriálnou embóliou (napr. pri mitrálnej alebo aortickej stenóze, infekčnej endokarditíde a marantickej endokarditíde). Infarkt myokardu bol publikovaný u pacientov s koronárnou spazmou a inak normálnymi koronárnymi artériami. Kokaín spôsobuje intenzívny koronárny arteriálny kŕč a užívatelia môžu trpieť kokaínom indukovanou angínou alebo infarktom myokardu. Štúdie autopsie a koronárna angiografia ukázali, že kokaínom indukovaná koronárna trombóza môže nastať v normálnych koronárnych artériách alebo môže byť navrstvená na predtým existujúci ateróm.

Infarkt myokardu je predominantne ochorením ľavej komory, ale poškodenie sa môže rozšíriť na prvú komoru (RV) alebo na predsiene. Infarkt pravej komory je zvyčajne spôsobený upchatím pravej koronárnej alebo dominantnej ľavej cirkumflex artérie a vyznačuje sa vysokým napĺňacím tlakom pravej komory, často so závažným tricuspidovým spätným prúdením krvi a redukovaným srdcovým výstupom. Určitý stupeň dysfunkcie pravej komory nastáva u približne polovice pacientov s inferior-posterior infarktom vytvárajúc hemodynamickú abnormalitu u 10 až 15 %.

Schopnosť srdca kontinuálne fungovať ako pumpa priamo súvisí s rozsahom poškodenia myokardu.

-6Transmurálne infarkty zahŕňajú celú hrúbku myokardu od epikardia po endokardium a zvyčajne sa vyznačujú abnormálnymi Q vlnami na ECG. Netransmuálne alebo subendokardiálne infarkty nezasahujú cez komorovú stenu a spôsobujú len ST segment na T-vlnových abnormalitách. Subendokardiálne infarkty zvyčajne zahŕňajú vnútornú 1/3 myokardia, tam, kde je stenové napätie najvyššie a tam, kde je myokardiálny krvný obeh najnáchylnejší na obehové zmeny. Môže nasledovať aj po pretrvávajúcej hypotenzii. Pretože transmurálna hĺbka nekrózy nemôže byť klinicky presne determinovaná, infarkty sa lepšie klasifikujú prostredníctvom ECG ako Q-vlnové a iné ako Q vlnové. Objem poškodeného myokardia sa môže odhadnúť prostredníctvom rozsahu a trvania CK zvýšenia.

Iným ochorením v rámci ischemických srdcových ochorení je ischemická kardiomyopatia. Tomuto stavu môže predchádzať infarkt myokardu, ale ochorenie môže byť spôsobené ťažkou koronárnou aterosklerózou postihujúcou všetky hlavné vetvy. Strata myocytov spojená s fibrózou vo forme intersticiálnych kolagénových depozitov vedie k zníženiu kvality, ktorá spolu so sprevádzajúcou srdcovou dilatáciou vedie k nadmernému zaťaženiu zvyšných myocytov. Toto udržiava proces v chode s kompenzáciou prostredníctvom pokračujúcej myocytovej hypertrofie. Môže to byť aj kompenzácia prostredníctvom hyperplázie, ako aj hypertrofie, ktorá môže vysvetliť enormnú veľkosť (2 až 3 násobok normálnej veľkosti) výsledného srdca. Eventuálne, srdce už nemôže dalej kompenzovať a nasleduje zlyhanie srdca s arytmiou a/alebo ischemickými javmi. Takže klinicky ide o pomalé, progresívne zlyhávanie srdca s alebo bez predchádzajúceho infarktu myokardu alebo anginálnej bolesti. Ischemická kardiomyopatia je zodpovedná až za 40 % úmrtí pri ischemickom srdcovom ochorení.

V priebehu ischémie, ako aj reperfúzie srdca sa produkuje množstvo endogénnych mediátorov, ako napríklad malých molekulových sekundárnych mediátorov, ktoré ovplyvňujú funkciu myokardu. Do niekoľkých minút po ischemickej epizóde sa znižuje myokardová kontraktilná sila a celkové zotavenie kontraktilnej sily je do veľkej miery závislé na trvaní ischemickej periódy (Daemen a ďalší, 1999). Napríklad, v priebehu ischemickej udalosti sa poruší Ca²⁺ homeostáza, generujú sa bezkyslíkové radikály a uskutočňuje sa syntéza a vylučovanie oxidu dusnatého (NO). Okrem toho, lokálne sa produkujú cytokíny,

-7najmä TNFa a IL-1 β (Bolli, 1990). V neporušenom srdci sa tieto cytokíny podieľajú na ischémiou indukovanej dysfunkcii myokardia prostredníctvom indukcie génovej expresie inducibilnej NO syntézy (iNOS) (Daemen a ďalší, 1999), cyklooxygenázy-2 (COX-2) a fosfolipázy A2, ako aj cievnych adhéznych molekúl a niekoľkých chemokínov. Výsledkom je okamžité zoslabenie myokardiálnej kontraktilnej sily sprostredkovanej mediátormi s malými molekulami, po ktorej nasleduje cytokínmi sprostredkovaná neutrofilová infiltrácia, ktorá ďalej poškodzuje srdcový sval. Srdcia zvierat študované v neprítomnosti krvi alebo krvných produktov produkovali TNFa (Herskowitz a ďalší, 1995) a IL-Ιβ v priebehu ischemickej výzvy. Aj kardiomyocyty strácajú kontraktilnú silu v dôsledku účinku týchto endogénnych cytokínov (Meldrum a ďalší, 1998).

Väčšina experimentálnych údajov týkajúcich sa TNFa a IL-Ιβ sprostredkovanej myokardiálnej dysfunkcie je získaných zo štúdií na zvieratách. Avšak ľudské myokardiálne tkanivá získané od pacientov, ktorý sa podrobili elektívnym srdcovo-pľúcnym bypassovým procedúram, boli študované v kontrolovaných ex vivo podmienkach (Gurevitch a ďalší, 1996; Cleveland a ďalší, 1997). V tomto experimentálnom modeli sa ľudská arteriálna trabekula suspenduje v bezkrvnom, fyziologicky okysličenom tlmivom kúpeli a potom sa vystaví epizóde simulovanej ischémie. V priebehu tohto času sa kontraktilná sila dramaticky zníži; keď sa tkanivo opätovne vystaví kyslíku, kontraktilná sila sa obnoví, ale je znížená (60 až 70% redukcia) a pozoruje sa dôkaz myokardiálneho poškodenia prostredníctvom vylučovania kreatín kinázy (CK) (Gurevitch a ďalší, 1996; Cleveland a ďalší, 1997). Keď sa TNF biologická aktivita špecificky neutralizuje v priebehu ischémie/reperfúzie (l/R), pozoruje sa väčší návrat kontraktilnej sily, čo naznačuje, že endogénna myokardiálna TNF aktivita sa podieľa na kontraktilnej dysfunkcii indukovanej ischemickou udalosťou (Cain a ďalší, 1999).

Daemen a ďalší (1999) študovali tkanivové poškodenie ako následok ischémie nasledovanej reperfúziou, využijúc myšací model obličkovej ischémie.

Ukázali, že nadregulácia obličkovej IL-18 mRNA koinciduje s aktiváciou kaspázy-1 v deň 1 po ischémii. Na 6. deň po ischémii boli následne nadregulované IFN-γ a IL12 mRNA. Kombinovaná, ale nie oddelená, in vivo neutralizácia IFN-γ indukuje

-8cytokíny IL-12 a IL-18, redukuje nadreguláciu IFN-γ závislých MHC triedy I a I v podobnom rozsahu ako IFN-γ neutralizácia.

Avšak doteraz nebolo opísané, že IL-18 hrá úlohu pri srdcových ochoreniach.

Podstata vynálezu

Vynález je založený na zistení, že IL-18 inhibítor podstatne zlepšuje kontraktilnú funkciu srdca v modeli ischémie/reperfúzie suprafuzovaného ľudského predsieňového myokardia. Aj inhibicia kaspázy-1 (ICE) oslabuje zníženie kontraktilnej sily, ktoré nasleduje po ischémii a reperfúzii.

Okrem toho, podávanie IL-18 inhibítora v myšacom modeli infarktu myokardu viedlo k posilneniu prežívania a významnému zlepšeniu funkcie komôr.

Tieto štúdie demonštrujú, že IL-18 inhibítory sú vhodné na liečenie alebo prevenciu myokardiálnej dysfunkcie.

Podstatou vynálezu je preto použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia, najmä ischemického srdcového ochorenia a/alebo zlyhania srdca.

Na aplikovanie génového terapeutického prístupu na dodanie IL-18 inhibítora do chorého tkaniva alebo bunky, sa vynález týka aj použitia expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia.

Predložený vynález je založený na zistení, že IL-18 inhibítory užitočne pôsobia na srdcové ochorenia, najmä na ischemické srdcové ochorenia. Ako je ukázané nižšie v príkladoch, ukázalo sa, že niekoľko rozličných IL-18 inhibítorov vykazuje významný užitočný účinok na post-ischemicky vyvíjanú silu srdcového svalu.

Okrem toho, IL-18 inhibítor sa testoval na in vivo modeli infarktu myokardu a viedol k zvýšenému prežívaniu a významne zlepšenej funkcii komôr.

Vynález sa preto týka použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia.

-9V súlade s predloženým vynálezom výraz „srdcové ochorenie“ zahŕňa ochorenia zahŕňajúce dysfunkciu srdca. Všeobecne sa nazývajú aj kardiovaskulárne ochorenia.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je srdcovým ochorením ischemické srdcové ochorenie.

Výraz „ischemické srdcové ochorenie“, tak ako sa používa tu, zahŕňa všetky rozličné typy ischemického srdcového ochorenia, vrátane, ale bez obmedzenia na ochorenia podrobne vysvetlené v časti „Doterajší stav techniky“, ako aj kardiovaskulárne ochorenia alebo poruchy súvisiace s ischemickou srdcovou chorobou.

Použitie podľa vynálezu je dobre vhodné na dlhotrvajúce liečenie a je preto výnimočne užitočné na použitie v súvislosti s chronickými srdcovými ochoreniami. Preto je vo výhodnom uskutočnení vynálezu ischemické srdcové ochorenie chronické. Angína alebo angína pectoris je jedným z najbežnejších klinických znakov pacientov majúci dlhotrvajúce ischemické srdcové ochorenie. Poškodená funkcia ľavej komory, nasledujúca po jednej alebo viacerých predchádzajúcich epizódach infarktu myokardu môže viesť zlyhaniu ľavej komory a nakoniec ku kongestívnemu zlyhaniu srdca. Vynález sa preto ďalej týka použitia IL-18 inhibítora na liečenie a/alebo prevenciu angíny pectoris.

Akútne myokardické srdcové ochorenie alebo infarkt myokardu zvyčajne zahŕňa nekrózu srdcového svalu, zvyčajne ľavej komory. Často je spôsobený aterómom koronárnej artérie s paralelným trombusom alebo plakovým silným krvácaním. Po nekróze nasleduje zápalová infiltrácia a vylučovanie fibróznych opravných enzýmov z nekrotického svalu do krvi a leukocytóza, ktorá je užitočná diagnosticky. Komplikácie akútneho infarktu myokardu zahŕňajú arytmíu, zlyhanie srdca, prasknutie myokardu vedúce k hemoperikardiu, murálny trombus vedúci k embolizmu a srdcovú aneurizmu. Ďalšie komplikácie zahŕňajú náhlu smrť, arytmiu, pretrvávajúcu bolesť, angínu, zlyhanie srdca, mitrálnu nekompetenciu, perikarditídu, prasknutie srdca (komorová bolesť, septum alebo papilárny sval), murálnu trmobózu, komorovú aneurizmu, Dresslerov syndróm (bolesť v hrudi, horúčka, citové výlevy), pľúcnu embóliu. Liečivo podľa vynálezu môže byť použité aj na liečenie a/alebo prevenciu týchto komplikácií infarktu myokardu.

-10 V ďalšom výhodnom uskutočnení je srdcovým ochorením kardiatické zlyhanie alebo zlyhanie srdca. Kardiatické zlyhanie je chorobný stav, pri ktorom srdce nie je schopné prečerpávať krv rýchlosťou potrebnou pre normálny metabolizmus. Takmer pri všetkých formách kardiatického zlyhania je redukovaný kardiatický výstup, čo spôsobuje určitý stupeň podperfúzie, ktorá je nazývaná nedostatočné napĺňanie artérií. Telo kompenzuje prostredníctvom zadržiavania tekutiny zvýšený objem krvi. Srdcové zlyhanie môže byť akútne alebo chronické. V skorých štádiách sa klinické známky kardiatického zlyhania môžu zdať jednostranné, ale kvôli medzikomorovému septu, ktoré je zdieľané pravou a ľavou komorou je nevyhnutné, že po zlyhaní jednej komory nasleduje zlyhanie druhej. Srdcové zlyhanie môže byť spôsobené ischemickým srdcovým ochorením. Môže byť spôsobené aj inými príčinami, ako napríklad systémovou hypertenziou, chlopňovým srdcovým ochorením alebo pľúcnym ochorením vedúcim ku kongestívnemu zlyhaniu srdca.

Srdcové zlyhanie môže byť kongestívnym srdcovým zlyhaním, ktoré je symptomatickou myokardiálnou dysfunkciou vedúcou k charakteristickej štruktúre hemodynamickej, obličkovej a neurohormonálnej reakcie. Klinickými manifestáciami srdcového zlyhania môžu byť zlyhanie ľavej komory alebo zlyhanie pravej komory. Zlyhanie srdca je manifestované systolickou alebo diastolickou dysfunkcou alebo oboma. Bežné sú kombinované systolické a diastolické abnormality.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení je srdcovým ochorením kardiomyopatia. Kardiomyopatia je akákoľvek štrukturálna alebo funkčná abnormalita komorového myokardia.

Výraz „prevencia“, v kontexte tohto vynálezu, označuje nie len úplné predchádzanie určitému efektu, ale aj akúkoľvek čiastočnú alebo podstatnú prevenciu, zoslabenie, redukciu, zníženie alebo odstránenie účinku pred alebo skoro po nástupe ochorenia.

Výraz „liečenie“ v kontexte tohto vynálezu označuje akýkoľvek užitočný vplyv na progresiu ochorenia, vrátane oslabenia, redukcie, poklesu alebo odstránenia patologického vývoja po nástupe ochorenia.

Výraz inhibítor IL-18 v kontexte tohto vynálezu označuje akúkoľvek molekulu modulujúcu IL-18 produkciu a/alebo funkciu takým spôsobom, že

-11 produkcia a/alebo funkcia IL-18 je oslabená, redukovaná alebo čiastočne, podstatne alebo úplne zastavená alebo blokovaná.

Inhibítorom produkcie môže byť akákoľvek molekula negatívne ovplyvňujúca syntézu, spracovanie alebo zrenie IL-18. Inhibítormi v súlade s vynálezom môžu byť napríklad supresory génovej expresie interleukínu IL-18, antisense mRNAs redukujúce alebo predchádzajúce transkripcii IL-18 mRNA alebo vedúce k degradácii mRNA, proteíny narušujúce správne poskladanie alebo čiastočne alebo podstatne zabraňujúce vylučovaniu IL-18, proteázy degradujúce IL-18, ktorý sa už nasyntetizoval, inhibítory proteáz štiepiacich pro-IL-18 a tým generujúcich zrelý IL18, ako napríklad inhibítory kaspázy-1, a podobne.

Inhibítorom IL-18 funkcie môže byť napríklad IL-18 agonista. Antagonisty môžu buď viazať, alebo odlúčiť samotnú IL-18 molekulu s dostatočnou afinitou a špecificitou, aby sa čiastočne alebo podstatne neutralizoval IL-18 alebo IL-18 väzobné miesto (miesta) zodpovedné za viazanie IL-18 na jeho ligandy (ako napr. na jeho receptory). Antagonista môže tiež inhibovať IL-18 signalizačnú dráhu, ktorá je aktivovaná vo vnútri buniek prostredníctvom väzby IL-18/receptor.

Inhibítormi funkcie IL-18 môžu byť aj rozpustné IL-18 receptory alebo molekuly napodobujúce receptory, alebo látky blokujúce IL-18 receptory, alebo IL18 protilátky, ako napríklad polyklonálne alebo monoklonálne protilátky, alebo akákoľvek iná látka alebo molekula zabraňujúca viazaniu sa IL-18 na jeho ciele, a tým oslabujúca spúšťanie alebo zabraňujúca spúšťaniu intra- alebo extracelulárnych reakcií sprostredkovaných s IL-18.

Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu je inhibítor IL-18 výhodne vybraný z inhibítorov kaspázy-1 (ICE), protilátok nasmerovaných proti IL-18, protilátok nasmerovaných proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítorov IL-18 signalizačnej dráhy, antagonistov IL-18, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18 receptor a IL-18 viažucich proteínov a ich izoforiem, muteínov, fúzovaných proteínov, funkčných derivátov, aktívnych frakcií alebo cirkulárne permutovaných derivátov, ktoré inhibujú biologickú aktivitu IL-18.

Výraz IL-18 viažuce proteíny sa tu používa synonymne s výrazmi „IL-18 viažuci proteín“ alebo IL18BP. Zahŕňa IL-18 viažuce proteíny ako sú definované vo WO 99/09063 alebo v Novick a ďalší, 1999, vrátane zostrihových variantov

- 12a/alebo izoforiem IL-18 viažucich proteínov, ako sú definované v Kim a ďalší, 2000, ktoré sa viažu na IL-18. V súlade s predloženým vynálezom sú užitočné najmä ľudské IL-18BP izoformy a a c. Proteíny užitočné podľa predloženého vynálezu môžu byť glykozylované alebo neglykozylované, môžu byť získané z prirodzených zdrojov, ako napríklad z moču, alebo sa výhodne môžu produkovať rekombinantne. Rekombinantná expresia sa môže uskutočňovať v prokaryotických expresných systémoch, ako E. coli, alebo v eukaryotických, a výhodne v cicavčích, expresných systémoch.

Tak ako sa používa tu, výraz muteíny označuje analógy IL-18BP alebo analógy vírusového IL-18BP, v ktorých je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov prirodzeného IL-18BP alebo vírusového IL-18BP nahradených odlišnými aminokyselinovými zvyškami, alebo je deletovaný jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov, alebo je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov pridaných do prirodzenej sekvencie IL-18BP alebo do vírusového IL-18BP bez toho, aby sa významne zmenila aktivita výsledných produktov v porovnaní so štandardným IL-18BP alebo vírusovým IL-1PB. Tieto muteíny sa pripravujú známymi technikami syntézy a/alebo miestne špecifickej mutagenézy, alebo akoukoľvek inou vhodnou známou technikou.

Muteíny podľa predloženého vynálezu zahŕňajú proteíny kódované nukleovou kyselinou, ako napríklad DNA alebo RNA, ktorá hybridizuje s DNA alebo RNA, ktorá kóduje IL-18BP alebo ktorá kóduje vírusový IL-18BP podľa predloženého vynálezu, v prísnych podmienkach. Výraz „prísne podmienky“ označuje hybridizačné a následné premývacie podmienky, ktoré priemerný odborník v oblasti bežne označuje ako „prísne“. Pozri Ausubel a ďalší, Current Protocois in Molecular Biology, vyššie, Interscience, N.Y., §§6.3 a 6.4 (1987, 1992) a Sambrook a ďalší, vyššie. Bez obmedzenia, príklady prísnych podmienok zahŕňajú premývacie podmienky pri teplote o 12 až 20 °C nižšej ako je vypočítaná Tm študovaného hybridu v napr. 2xSSC a 0,5% SDS pri 37 °C 30 až 60 minút a potom v 0,1 x SSC a 0,5% SDS pri 68 °C 30 až 60 minút. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že prísne podmienky závisia aj na dĺžke DNA sekvencií, na oligonukleotidových sondách (ako napríklad 10 až 40 báz) alebo zmiešaných oligonukleotidových sondách. Ak sa použijú zmiešané oligonukleotidové sondy, je

-13výhodné použiť tetrametylamóniumchlorid (TMAC) namiesto SSC. Pozri Ausubel, vyššie.

Akýkoľvek takýto muteín má výhodne aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne podobná so sekvenciou IL-18BP alebo je dostatočne podobná so sekvenciou vírusového IL-18BP, tak, aby mala v podstate podobnú aktivitu ako IL18BP. Jednou aktivitou IL-18BP je jeho schopnosť viazať IL-18. Pokiaľ má muteín podstatnú väzobnú aktivitu voči IL-18, môže sa použiť na purifikáciu IL-18, napríklad prostredníctvom afinitnej chromatografie, a tým sa môže považovať za muteín majúci v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP. Takže to, či akýkoľvek daný muteín má v podstate rovnakú aktivitu ako IL-18BP je možné stanoviť prostredníctvom rutinných pokusov zahŕňajúcich podrobenie takéhoto muteínu napr. jednoduchému sendvičovému kompetičnému testu, aby sa stanovilo, či sa viaže, alebo nie na príslušným spôsobom značený IL-18, ako napríklad rádioimunologickým testom alebo ELISA testom.

Vo výhodnom uskutočnení je akýkoľvek takýto muteín najmenej na 40 % zhodný alebo homologický so sekvenciou buď IL-18BP, alebo vírusom kódovaného IL-18BP homológu, ako je definovaný vo WO 99/09063. Výhodnejšie je s nimi najmenej na 50 %, najmenej na 60 %, najmenej na 70 %, najmenej na 80 % alebo najvýhodnejšie najmenej na 90 % zhodný alebo homologický.

Muteíny IL-18BP polypeptidov alebo muteíny vírusových IL-18BPs, ktoré je možné použiť podľa predloženého vynálezu, alebo nukleové kyseliny, ktoré ich kódujú, zahŕňajú konečnú sadu v podstate zodpovedajúcich sekvencií vo forme substitučných peptidov alebo polynukleotidov, ktoré môže priemerný odborník v oblasti získať rutinným spôsobom bez nadmerného experimentovania na základe tu prezentovaných návodov a informácií.

Výhodnými zmenami v muteínoch podľa predloženého vynálezu sú zmeny známe ako konzervatívne substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie IL-18BP polypeptidov alebo proteínov alebo vírusových IL-18BPs môžu zahŕňať synonymné aminokyseliny v skupine, ktorá má dostatočne podobné fyzikálnochemické vlastnosti na to, aby substitúcie v rámci členov skupiny zachovávali biologickú funkciu molekuly (Grantham, 1974). Je zrejmé, že vo vyššie definovaných sekvenciách je možné robiť aj inzercie a delécie aminokyselín bez

-14toho, aby sa zmenila ich funkcia, najmä ak inzercie alebo delécie zahŕňajú len niekoľko aminokyselín, napríklad menej ako tridsať, a výhodne menej ako desať, a neodstraňujú alebo nepremiestňujú aminokyseliny, ktoré sú kritické pre funkčnú konformáciu, napr. cysteínové zvyšky. Proteíny a muteíny produkované prostredníctvom takýchto delécií a/alebo inzercií spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.

Výhodne sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny definované v tabuľke 1. Výhodnejšie sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny definované v tabuľke 2 a najvýhodnejšie sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny definované v tabuľke 3.

Tabuľka 1

Výhodné skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly lle

Phe

Tyr

Cys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Synonymná skupina

Ser, Thr, Gly, Asn

Arg, Gin, Lys, Glu, His lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Gly, Ala, Thr, Pro

Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr

Gly, Thr, Pro, Ala

Met, Tyr, Phe, lle, Leu, Val

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lle

Trp, Met, Tyr, lle, Val, Leu, Phe

Trp, Met, Phe, lle, Val, Leu, Tyr

Ser, Thr, Cys

Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Gin, Asp, Ser, Asn Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp

-15Glu

Met

Trp

Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu

Phe, Íle, Val, Leu, Met

Trp

Tabuľka 2

Výhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly lle

Phe

Tyr

Cys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Synonymná skupina Ser

His, Lys, Arg Leu, lle, Phe, Met Ala, Pro Thr

Pro, Ala

Val, Met, lle Gly lle, Met, Phe, Val, Leu

Met, Tyr, lle, Leu, Phe

Phe, Tyr

Cys, Ser

His, Gin, Arg

Glu, Gin, His

Asp, Asn

Lys, Arg

Asp, Asn

Glu, Gin

Met, Phe, lle, Val, Leu Trp

Tabuľka 3

Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Íle	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie muteínov IL-18BP polypeptidov alebo proteínov, alebo muteínov vírusových IL-18BPs, na použitie v predloženom vynáleze, zahŕňajú ktorékoľvek známe spôsobové kroky, ako napríklad kroky prezentované v US patentoch RE 33653, 4959314, 4588585 a 4737462 v mene Mark a ďalší; v 5116943 v mene Koths a ďalší, v 4965195 v mene Namen a ďalší; v 4879111 v mene Chong a ďalší; a v 5017691 v mene Lee a ďalší; a lyzínové substituované proteíny prezentované v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).

Výraz fúzovaný proteín označuje polypeptid obsahujúci IL-18BP, alebo vírusový IL-18BP alebo ich muteín alebo fragment, ktorý je fúzovaný s iným

-17proteínom, ktorý je napríklad dlhšie prítomný v telesných tekutinách. IL-18BP alebo vírusový IL-18BP tak môže byť fúzovaný s iným proteinom, polypeptidom alebo podobne, napr. imunoglobulínom alebo jeho fragmentom.

Výraz funkčné deriváty, tak ako sa používa tu, zahŕňa deriváty IL-18BPs alebo vírusového IL-18BP a ich muteíny a fúzované proteíny, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín, ktoré sa vyskytujú ako bočné reťazce na zvyškoch alebo ako N- alebo C-koncové skupiny, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté vynálezom, pokiaľ ostávajú farmaceutický prijateľné, tzn. neničia aktivitu proteínu, ktorá je v podstate rovnaká ako aktivita IL-18BP alebo vírusového IL18BP, a neprepožičiavajú toxické vlastnosti prostriedkom, ktoré ich obsahujú.

Tieto deriváty môžu napríklad obsahovať polyetylénglykolové bočné reťazce, ktoré môžu maskovať antigénne miesta a môžu predlžovať prítomnosť IL-18BP alebo vírusového IL-18BP v telesných tekutinách. Iné deriváty zahŕňajú alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín prostredníctvom reakcie s amoniakom alebo primárnym alebo sekundárnym amínom, A/-acylové deriváty voľných aminoskupín aminokyselinových zvyškov vytvorené s acylovými skupinami (napr. alkanolylovou alebo karbocyklickou aroylovou skupinou) alebo O-acylové deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorené s acylovými skupinami.

Ako aktívne frakcie IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, muteínov a fúzovaných proteínov, zahŕňa predložený vynález akýkoľvek fragment alebo prekurzor polypeptidového reťazca proteínovej molekuly, samotný alebo spolu s asociovanými molekulami alebo zvyškami, ktoré sú naň pripojené, napr. sacharidové alebo fosfátové zvyšky, alebo agregáty samotnej proteínovej molekuly alebo sacharidových zvyškov, s podmienkou, že takáto frakcia má v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je IL-18 inhibítorom protilátka nasmerovaná proti IL-18 alebo jeho receptoru, IL-18R. V súlade s predloženým vynálezom môžu byť použité protilátky nasmerované proti ktorejkoľvek z IL-18R podjednotiek, označovaných IL-18Ra a β.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť polyklonálne alebo monoklonálne, chimérne, humanizované alebo aj úplne humánne. Rekombinantné protilátky a ich

-18fragmenty sa vyznačujú vysoko afinitným viazaním sa na IL-18 alebo IL-18R in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, ktoré sa môžu použiť vo vynáleze, sa vyznačujú schopnosťou liečiť pacientov v priebehu času dostatočne dlhého na dobrú až vynikajúcu regresiu alebo odstránenie patogénneho stavu alebo akéhokoľvek symptómu alebo skupiny symptómov súvisiacich s patogénnym stavom, a nízkou toxicitou.

Neutralizačné protilátky sa jednoducho vyvolávajú v zvieratách, ako napríklad králikoch, kozách alebo myšiach, imunizáciou s IL-18 alebo IL-18Ra alebo β. Imunizované myši sú užitočné najmä na poskytnutie zdrojov B buniek na výrobu hybridómov, ktoré sa zase môžu kultivovať na produkciu veľkých množstiev anti-IL18 monoklonálnych protilátok.

Chimérne protilátky sú imunoglobulínové molekuly charakteristické dvoma alebo viacerými segmentami alebo časťami odvodenými od rozličných živočíšnych druhov. Vo všeobecnosti je variabilná oblasť chimérnej protilátky odvodená od nehumánnej cicavčej protilátky, ako napríklad myšacej monoklonálnej protilátky, a imunoglobulínové konštantná oblasť je odvodená od humánnej imunoglobulínovej molekuly. Výhodne majú tak oblasti, ako aj ich kombinácia, nízku imunogénnosť v súlade s rutinným stanovovaním (Elliott a ďalší, 1994). Humanizované protilátky sú imunoglobulínové molekuly vytvorené technikami génového inžinierstva, v ktorých sú myšacie konštantné oblasti nahradené humánnymi náprotivkami, pričom sa zachovávajú myšacie antigén viažuce oblasti. Výsledná myšaco-humánna chimérna protilátka má výhodne zníženú imunogénnosť a zlepšené farmakokinetiky u ľudí (Knight a ďalší, 1993).

Takže v ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 alebo IL-18R protilátkou humanizované protilátka. Výhodné príklady humanizovaných anti-IL-18 protilátok sú opísané napríklad v európskej prihláške vynálezu EP 0974600.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátka kompletne humánna. Technológia na produkciu humánnych protilátok je podrobne opísaná napr. vo WO 00/76310, WO 99/53049, US 6162963 alebo AU5336100.

Jeden spôsob na prípravu kompletne humánnych protilátok pozostáva z „humanizácie“ myšacieho hormonálne imunitného systému, tzn. produkcie myšacích kmeňov schopných produkovať ľudské lg (Xenomyši) prostredníctvom

-19 zavedenia ľudských imunoglobulínových (Ig) lokusov do myší, v ktorých boli endogénne Ig gény inaktivované. Tak fyzikálna štruktúra, ako aj génové preskupovanie a procesy expresie v Ig lokusoch sú zložité, keďže to je potrebné na to, aby sa nakoniec vytvorila široká imunologická reakcia. Protilátková diverzita sa primárne generuje kombinatoriálnym preskupovaním medzi rôznymi V, D a J génmi prítomnými v Ig lokusoch. Tieto lokusy obsahujú aj vsunuté regulačné elementy, ktoré riadia protilátkovú expresiu, alelické vylučovanie, prepínanie medzi triedami a zretie afinity. Zavedenie nepreusporiadaných ľudských Ig transgénov do myší demonštrovalo, že myšacia rekombinantná mašinéria je kompatibilná s ľudskými génmi. Okrem toho, je možné imunizáciou Xenomyší s antigénom získať hybridómy vylučujúce antigén špecifické hu-mAbs rôznych izotypov.

Kompletne humánne protilátky a spôsoby ich výroby sú v oblasti známe (Mendez a ďalší (1997); Buggemann a ďalší (1991); Tomizuka a ďalší, (2000); patent WO 98/24893).

Vo veľmi výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu je IL-18 inhibítorom IL-18BP, alebo jeho izoforma, muteín, fúzovaný protein, funkčný derivát, aktívna frakcia alebo cirkulárne permutovaný derivát. Tieto izoformy, muteíny, fúzované proteíny alebo funkčné deriváty si zachovávajú biologickú aktivitu IL-18BP, najmä viazanie sa na IL-18, a výhodne majú nevyhnutne aspoň aktivitu podobnú s aktivitou IL-18BP. Ideálne majú takéto proteíny biologickú aktivitu, ktorá je ešte zvýšená v porovnaní s nemodifikovaným IL-18BP. Výhodné aktívne frakcie majú aktivitu, ktorá je lepšia ako aktivita IL-18BP, alebo majú iné výhody, napríklad lepšiu stabilitu alebo nižšiu toxicitu alebo imunogénnosť alebo sa ľahšie produkujú vo väčších množstvách alebo sa jednoduchšie purifikujú.

Sekvencie IL-18BP a jeho zostrihových variantov/izoforiem je možné zobrať z W099/09063 alebo z Novick a ďalší, 1999, ako aj z Kim a ďalší, 2000.

Funkčné deriváty IL-18BP môžu byť konjugované s polymérmi na zlepšenie vlastností proteínu, ako napríklad na zlepšenie stability, polčasu rozpadu, biologickej dostupnosti, tolerancie ľudským telom alebo imunogénnosti. Na dosiahnutie tohto cieľa sa IL-18BP môže spojiť napr. s polyetylénglykolom (PEG). PEGylácia sa môže uskutočňovať známymi spôsobmi, opísanými napríklad vo WO 92/13095.

-20Preto sú IL-18 inhibítory a najmä IL-18BP, vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu PEGylované.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje IL-18 inhibítor imonoglobulínovú fúziu, tzn. IL-18 inhibítor je fúzovaný proteín obsahujúci celý alebo časť IL-18 viažuceho proteínu, ktorý je fúzovaný s celým alebo s časťou imunoglobulínu. Spôsoby výroby imunoglobulínových fúzovaných proteínov sú v oblasti dobre známe, ako napríklad spôsoby opísané vo WO 01/03737. Priemernému odborníkovi v oblasti bude zrejmé, že výsledný fúzovaný proteín si zachováva IL18BP biologickú aktivitu, najmä viazanie sa na IL-18. Fúzia môže byť priama, alebo prostredníctvom krátkeho spojovacieho peptidu, ktorý môže mať 1 až 3 aminokyselinové zvyšky, alebo viac, napríklad 13 až 20 aminokyselinových zvyškov. Uvedeným spojovníkom môže byť napríklad tripeptid so sekvenciou E-F-M (GluPhe-Met), alebo 13-amino-kyselinová spojovníková sekvencia obsahujúca Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met, ktorá je začlenená medzi IL-18BP sekvenciu a imunoglobulínovú sekvenciu. Výsledný fúzovaný proteín má zlepšené vlastnosti, ako napríklad predĺženú prítomnosť v telesných tekutinách (polčas rozpadu), zvýšenú špecifickú aktivitu, zvýšenú úroveň expresie alebo je uľahčená purifikácia fúzovaného proteínu.

Vo výhodnom uskutočnení je IL-18BP fúzovaný s konštantnou oblasťou Ig molekuly. Výhodne je fúzovaný s oblasťami ťažkých reťazcov, ako napríklad CH2 a CH3 doménami ľudského lgG1. Generovanie špecifických fúzovaných proteínov, obsahujúcich IL-18BP a časť imunoglobulínu, je opísané napríklad v príklade 11 vo WO 99/09063. Aj iné izoformy Ig molekúl sú vhodné na generovanie fúzovaných proteínov podľa predloženého vynálezu, ako napríklad izoformy lgG₂ alebo lgG₄, alebo iné Ig triedy, ako napríklad IgM alebo IgA. Fúzované proteíny môžu byť monomérne alebo multimérne, hetero- alebo homomultimérne.

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu sa IL-18 inhibítor používa v kombinácii s TNF antagonistom. Účinky TNF antagonistov pôsobia niekoľkými spôsobmi. Po prvé sa antagonisty môžu viazať na TNF molekulu, alebo môžu sekvestrovať samotnú TNF molekulu s dostatočnou afinitou a špecificitou na to, aby sa čiastočne alebo podstatne neutralizoval TNF epitop alebo epitopy zodpovedné za viazanie sa na TNF receptor (tu ďalej označované ako sekvestračné antagonisty).

-21 Sekvestračným antagonistom môže byť napríklad protilátka nasmerovaná proti TNF.

Alternatívne môžu TNF antagonisty inhibovať TNF signalizačnú dráhu aktivovanú bunkovým povrchovým receptorom po naviazaní TNF (tu ďalej označované ako signalizačné antagonisty). Obe skupiny antagonistov sú užitočné, buď samostatne alebo spolu, v kombinácii s IL-18 inhibítorom, na liečenie alebo prevenciu srdcových ochorení.

TNF antagonisty sa dajú jednoducho identifikovať a hodnotiť rutinným skríningom kandidátov z hľadiska ich vplyvu na aktivitu prirodzeného TNF v citlivých bunkových líniách in vitro, napríklad v ľudských B bunkách, v ktorých TNF spôsobuje proliferáciu a vylučovanie imunoglobulínu. Test zahŕňa TNF formuláciu s rôznymi riedeniami kandidátskeho antagonistu. V teste sa napríklad používa od 0,1 do 100 násobného molového množstva TNF a kontroly bez TNF alebo len s antagonistom (Tucci a ďalší, 1992).

Sekvestračné antagonisty sú výhodnými TNF antagonistami na použitie v súlade s predloženým vynálezom. Spomedzi sekvestračných antagonistov sú výhodné tie polypeptidy, ktoré viažu TNF s vysokou afinitou a majú nízku imunogénnosť. Výnimočne výhodné sú rozpustné TNF receptorové molekuly a neutralizačné protilátky proti TNF. V predloženom vynáleze sú užitočné napríklad rozpustné TNF-RI a TNF-RII. Výnimočne výhodnejšími antagonistami podľa predloženého vynálezu sú skrátené formy týchto receptorov, ktoré obsahujú extracelulárne domény receptorov alebo ich funkčné časti. V EP914431 je napríklad opísaný rozpustný TNF receptor typu I a typu II.

Skrátené formy TNF receptorov sú rozpustné a boli detegované v moči a sére ako 30kDa a 40kDa proteíny inhibujúce viazanie TNF, ktoré sa označujú ako TBPI, respektíve TBPII (Engelmann a ďalší, 1990). Podľa vynálezu je výhodné simultánne, postupné alebo oddelené použitie IL-18 inhibítora s TNF antagonistom.

V ďalšom výhodnom uskutočnení je ľudský rozpustný TNF-RI (TBPI) TNF antagonistom na použitie podľa vynálezu. Prirodzené a rekombinantné molekuly rozpustného TNF receptora a spôsoby ich výroby boli opísané v európskych patentoch EP 308378, EP398327 a EP433 900.

-22Aj deriváty, fragmenty, oblasti a biologicky aktívne časti receptorových molekúl, ktoré sa funkčne podobajú receptorovým molekulám môžu byť použité v predloženom vynáleze. Takýto biologicky aktívny ekvivalent alebo derivát receptorovej molekuly označuje časť polypeptidu alebo sekvencie kódujúcej receptorovú molekulu, ktorá má dostatočnú veľkosť a je schopná viazať TNF s takou afinitou, aby sa inhibovala alebo blokovala interakcia s na membránu naviazaným TNF receptorom

IL-18 inhibítor sa môže používať simultánne, postupne alebo oddelene s TNF inhibítorom.

V súlade s predloženým vynálezom môže liek obsahovať aj látky, o ktorých je známe, že sa používajú na liečenie srdcových ochorení, ako napríklad dusičnany, napr. nitroglycerín, diuritetiká, ACE inhibítory, digitalis, beta-blokátory alebo blokátory vápnika, v kombinácii s IL-18 inhibítorom. Účinné zložky sa môžu používať simultánne, postupne alebo oddelene.

V ďalšom výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,001 až 100 mg/kg alebo približne 1 až 10 mg/kg alebo 2 až 5 mg/kg.

Vynález sa ďalej týka použitia expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na výrobu lieku na prevenciu a/alebo liečenie srdcového ochorenia. Génový terapeutický prístup je tak použitý na dodanie IL-18 inhibítora na miesto, kde je to potrebné. Na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia sa génový terapeutický vektor obsahujúci sekvenciu IL-18 inhibítora môže injektovať napríklad priamo do chorého tkaniva, čím je možné vyhnúť sa problémom spojeným so systémovým podaním génových terapeutických vektorov, akými sú napríklad nariedenie vektora, dosiahnutie a zameranie cieľových buniek alebo tkanív a vedľajšie účinky.

Vynález zahŕňa aj použitie vektora na indukciu a/alebo posilnenie endogénnej produkcie IL-18 inhibítora v bunke, ktorá normálne neexprimuje IL-18 inhibítor, alebo ktorá exprimuje také množstvá inhibítora, ktoré nie sú dostatočné. Vektor môže obsahovať regulačné sekvencie funkčné v bunkách, v ktorých je potrebná expresia IL-18 inhibítora. Takýmito regulačnými sekvenciami môžu byť napríklad promótory alebo zosilňovače. Regulačná sekvencia sa potom môže

-23zaviesť do správneho lokusu genómu homologickou rekombináciou, a tým sa regulačná sekvencia operatívne spojí s génom, ktorého expresiu je potrebné indukovať alebo posilniť. Táto technológia sa zvyčajne označuje ako endogénna génová aktivácia (EGA) a je opísaná napr. vo WO 91/09955.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že je použitím rovnakej technológie je možné aj zastaviť expresiu IL-18 priamo. A to prostredníctvom zavedenia negatívneho regulačného elementu, ako napr. stišujúceho elementu, do IL-18 génového lokusu, čo vedie k zníženiu alebo k zastaveniu expresie IL-18. Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že takéto zníženie alebo zastavenie expresie IL-18 má rovnaký účinok ako použitie IL-18 inhibítora na prevenciu a/alebo liečenie ochorenia.

Vynález sa ďalej týka použitia bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná tak, aby produkovala IL-18 inhibítor, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia.

IL-18 inhibítor na použitie podľa predloženého vynálezu môže byť výhodne podávaný ako farmaceutický prostriedok, voliteľne v kombinácii s terapeuticky účinným množstvom TNF inhibítora.

IL-18BP a jeho izoformy, muteíny, fúzované proteiny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty, ako sú opísané vyššie, sú výhodnými účinnými zložkami farmaceutických prostriedkov.

Definícia farmaceutický prijateľný zahŕňa akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity účinnej zložky a nie je toxický pre hostiteľa, ktorému sa podáva. Na parenterálne podávanie môže byť aktívny proteín (proteiny) formulovaný napríklad v dávkovej jednotkovej forme na injekciu vo vehikulách, akými sú napríklad fyziologický roztok, dextrózový roztok sérový albumín a Ringerov roztok.

Účinné zložky farmaceutického prostriedku podľa vynálezu môžu byť jedincovi podávané rôznymi spôsobmi. Spôsoby podávania zahŕňajú intradermálne, transdermálne (napr. formulácie s pomalým uvoľňovaním), intramuskulárne, intraperitoneálne, intravenózne, subkutánne, orálne, epidurálne, topické a intranazálne spôsoby. Použitý môže byť akýkoľvek iný terapeuticky účinný spôsob podania, napríklad absorpcia epiteliálnymi alebo endoteliálnymi tkanivami alebo génová

-24terapia, pri ktorej sa DNA molekula kódujúca aktívnu látku podáva pacientovi (napr. prostredníctvom vektora), čo spôsobuje, že aktívna látka sa exprimuje a vylučuje in vivo. Okrem toho môže byť proteín (proteíny) podľa vynálezu podávaný spolu s inými zložkami biologicky aktívnych látok, ako napríklad farmaceutický prijateľnými povrchovo aktívnymi látkami, excipientami, nosičmi, riedidlami a vehikulami.

Na parenterálne (napr. intravenózne, subkutánne, intramuskulárne) podanie, sa aktívny proteín (proteíny) môže formulovať ako roztok, suspenzia, emulzia alebo lyofilizovaný prášok spolu s farmaceutický prijateľným parenterálnym vehikulom (napr. vodou, fyziologickým roztokom, dextrózovým roztokom) a aditívami, ktoré udržiavajú izotonicitu (napr. manitolom) alebo chemickú stabilitu (napr. konzervačnými látkami a tlmivými roztokmi). Formulácia sa sterilizuje bežne používanými technikami.

Biologická dostupnosť aktívneho proteínu (proteínov) podľa vynálezu sa môže zlepšiť použitím konjugačných postupov, ktoré predlžujú polčas rozpadu molekuly v ľudskom tele, napríklad pripojením molekuly na polyetylénglykol, ako je opísané v PCT prihláške vynálezu WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množstvá aktívneho proteínu (proteínov) budú funkciou mnohých premenných, vrátane typu antagonistu, afinity antagonistu voči IL-18, akejkoľvek zvyškovej cytotoxickej aktivity vykazovanej antagonistami, spôsobu podania, klinického stavu pacienta (vrátane vhodnosti udržiavať netoxickú hladinu endogénnej IL-18 aktivity).

Terapeuticky účinné množstvá sú také množstvá, v ktorých keď sa podá IL18 inhibítor, tak vedú k inhibícii biologickej aktivity IL-18. Dávky podávané jedincovi, ako jednotlivé alebo viacnásobné dávky, sa budú meniť v závislosti na rôznych faktoroch, vrátane farmakokinetických vlastností IL-18 inhibítora, spôsobe podávania, stavov a vlastností pacientov (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravotný stav, veľkosť), rozsahu symptómov, paralelne prebiehajúcich terapií, frekvencie liečby a požadovaného účinku. Do schopností priemerného odborníka v oblasti spadá upravovanie a manipulácia v stanovených dávkových rozsahoch, ako aj in vitro a in vivo spôsoby determinácie inhibície IL-18 u jedinca.

V súlade s vynálezom sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,001 až 100 mg/kg alebo približne 0,01 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne

-250,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 2 mg/kg telesnej hmotnosti.

Výhodným spôsobom podávania podľa predloženého vynálezu je podávanie subkutánnym spôsobom. Ďalej je podľa vynálezu výhodné intramuskulárne podávanie. Na podávanie IL-18 inhibítora priamo do miesta jeho účinku, je výhodné aj topické podávanie.

V ďalších výhodných uskutočneniach sa IL-18 inhibítor podáva denne alebo každý druhý deň.

Denné dávky sa zvyčajne podávajú v rozdelených dávkach alebo vo forme s nepretržitým uvoľňovaním, ktoré sú účinné na získanie požadovaných výsledkov. Druhé alebo následné podávania sa môžu uskutočňovať v dávke, ktorá je rovnaká, menšia alebo väčšia ako počiatočná alebo predchádzajúca dávka podávaná jedincovi. Druhé alebo následné podanie sa môže uskutočňovať v priebehu alebo pred nástupom ochorenia.

V súlade s vynálezom sa IL-18 inhibítor môže jedincovi podávať profylaktický alebo terapeuticky, pred, zároveň alebo postupne s inými terapeutickými režimami alebo látkami (napr. viacnásobné liekové režimy), v terapeuticky účinnom množstve, najmä TNF antagonistom a/alebo inou kardioprotektívnou látkou. Účinné látky, ktoré sa podávajú zároveň s inými terapeutikami, sa môžu podávať v rovnakom prostriedku, alebo v rôznych prostriedkoch.

Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy farmaceutického prostriedku, ktorý zahŕňa miešanie účinného množstva IL-18 inhibítora a/alebo TNF antagonistu s farmaceutický prijateľným nosičom.

Vynález sa ďalej týka spôsobu liečenia srdcového ochorenia, ktorý zahŕňa podávanie farmaceutický účinného množstva IL-18 inhibítora, voliteľne v kombinácii s farmaceutický účinným množstvom TNF antagonistu, pacientovi, ktorý to potrebuje.

Po úplnom opísaní tohto vynálezu bude pre priemerného odborníka v oblasti zrejmé, že to isté je možné uskutočňovať v rámci širokého rozsahu ekvivalentných parametrov, koncentrácií a podmienok bez toho, aby sa vybočilo z ducha a rozsahu vynálezu a bez nadmerného experimentovania.

-26Hoci bol vynález opísaný v spojitosti s jeho konkrétnymi uskutočneniami, bude zrejmé, že je možné ho ďalej modifikovať. Táto prihláška je určená na pokrytie akýchkoľvek variantov, použití alebo adaptácií vynálezu, vo všeobecnosti sledujúc princípy vynálezu a zahŕňajúc také vybočenia z predloženého opisu, ktoré spadajú do známej alebo zvyčajnej praxe v oblasti, ktorej sa vynález týka, a ako môže byť aplikovaná na esenciálne znaky uvedené vyššie, sledujúc rozsah pripojených nárokov.

Všetky tu uvedené citácie vrátane článkov alebo abstraktov z časopisov, zverejnených alebo nezverejnených US alebo zahraničných prihlášok vynálezu, vydaných US alebo zahraničných patentov alebo akýchkoľvek iných referencií, sú tu kompletne zahrnuté prostredníctvom ich citácie, vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov a textov prítomných v citovaných publikáciách. Okrem toho sú tu prostredníctvom ich citácie zahrnuté celé obsahy referencií citovaných v tu uvádzaných publikáciách.

Odvolanie sa na známe spôsobové kroky, zvyčajné spôsobové kroky, známe metódy alebo bežné metódy nie je v nijakom prípade možné považovať za pripustenie, že akýkoľvek aspekt, opis alebo uskutočnenie predloženého vynálezu bolo opísané, vysvetlené alebo navrhnuté v relevantnej oblasti.

Predchádzajúci opis konkrétnych uskutočnení tak kompletne objasní všeobecnú povahu vynálezu, ktorú ostatní môžu, prostredníctvom aplikovania vedomostí spadajúcich do rozsahu zručností bežných v oblasti (vrátane obsahov tu citovaných publikácií), jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať na rôzne aplikácie takýchto špecifických uskutočnení bez nadmerného experimentovania, bez vybočenia so všeobecného konceptu predloženého vynálezu. Preto sa takéto adaptácie a modifikácie považujú za spadajúce do rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení, na základe tu prezentovaného vysvetlenia a návodu. Musí byť zrejmé, že tu používaná frazeológia a terminológia je určená na účely opisu a nie na obmedzovanie, takže terminológia a frazeológia podľa predloženého opisu musí byť interpretovaná priemerným odborníkom vo svetle tu prezentovaných vysvetlení a návodu, v kombinácii so znalosťami priemerného odborníka v oblasti.

-27 Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje vplyv IL-18BP na ischémiou indukovanú myokardiálnu kontraktilnú dysfunkciu.

(A) Kinetická reakcia na ischemické poškodenie. Po ekvilibrácii (eq) sa kontrolný (Ctrl) trámec suprafúzoval v normoxických podmienkach v priebehu experimentu. Trámec sa podrobil ischémii/reperfúzii bez prítomnosti alebo v prítomnosti IL-18BP (5 pg/ml). Vertikálna os označuje percento vyvinutej sily v porovnaní so začiatkom experimentu (čas nula). Údaje sú odvodené ztrámca jediného pacienta a reprezentujú spôsoby použité na výpočet priemernej zmeny vo vyvíjanej sile po 90 minútach.

(B) Post-ischemicky vyvíjaná sila po neutralizácii IL-18 s 1 alebo 5 pg/ml IL18BP. Výsledky sú vyjadrené ako priemerné percentuálne zmeny vo vyvíjanej sile v porovnaní s Ctrl po ukončení reperfúzie (90 minút). Čísla v zátvorkách označujú IL-18BP v pg/ml. N=6, * p<0,01 v porovnaní s l/R (ischémia/reperfúzia).

Obrázok 2 znázorňuje obsah IL-18 proteínu v myokarde. Trámce boli homogenizované po 90 minútach suprafúzie v normoxických podmienkach (kontrola) alebo po 45 minútach nasledujúcich po 30 minútach ischémie (l/R). Trámce sa priradili k rovnakým subjektom. Hladiny IL-18 sú uvedené na vertikálnej osi v pg/ml, N=4. *p<0,01.

Obrázok 3 znázorňuje konštantné hladiny IL-18 a IL-18BP mRNA v kontrolnom a ischemickom predsieňovom tkanive. Hladiny IL-18 a IL-18BP mRNA sa determinovali prostredníctvom RT-PCR. Údaje sú z jedného z dvoch hodnotených subjektov. A znázorňuje etidiumbromidom farbený agarózový gél, na ktorom sa separovali PCR produkty, a B znázorňuje výsledky kvantifikácie množstva PCR produktu ako násobok zmeny oproti kontrole (GAPDH).

Obrázok 4 znázorňuje účinok ICE inhibície na post-ischemicky vyvíjanú silu.

Výsledky sú vyjadrené ako priemerné percento zmeny vo vyvíjanej sile v porovnaní s kontrolou (Ctrl) po ischémii/reperfúzii (l/R). Čísla v zátvorkách označujú koncentráciu ICEi v pg/ml. N=7. *p<0,01 v porovnaní s l/R.

-28Obrázok 5 znázorňuje tkanivovú aktivitu kreatín kinázy (CK) po l/R. CK je vyjadrená v jednotkách aktivity na miligram suchej hmotnosti tkaniva. Experimentálne podmienky sú uvedené na horizontálnej osi. Ctrl a l/R, N=6; IL18BP (5 pg/ml), N=5; ICEi (10 a 20 pg/ml), =5 každý; *p<0,05 v porovnaní s l/R.

Obrázok 6 znázorňuje priemernú zmenu vo vyvíjanej sile v porovnaní so silou vyvíjanou po ekvilibračnej perióde, ktorá je daná ako 100 % (n=5), trámcami inkubovanými s 10 μο/ΓηΙ počas 15 minút, prd pridaním TNFa (1 ng/ml). TNFa a IL18BP sa pridávali do každej vzorkovej výmeny.

Obrázok 7 znázorňuje dočasnú reakciu ľudských predsieňových trámcov na IL-18 v normoxických podmienkach. Zrelý IL-18 (100 ng/ml) sa pridával do predsieňových trámcov počas 90 minútovej experimentálnej periódy. Vertikálna os označuje priemernú percentuálnu zmenu oproti základnej úrovni vyvíjanej sily. Základná úroveň sa determinovala na konci ekvilibračnej periódy (nie je znázornená) (n=6). *P<0,05, **P<0,001 v porovnaní s kontrolou v rovnakom intervale a v priebehu zvyšku experimentálnej periódy.

Obrázok 8 znázorňuje ochranu kreatín kinázovej aktivity v myobunkovom tkanive po vystavení l/R, TNFa (1 ng/ml) a TNFa (10 ng/ml) + IL-18BP. CK aktivita je vyjadrená v jednotkách CK aktivity na miligram mokrej tkanivovej hmotnosti. (n=6).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Inhibícia IL-18 znižuje myokardiálnu ischemickú dysfunkciu in vitro

Materiál a metódy

Reakčné činidlá: IL-18Bpa izoforma sa exprimovala s N-koncovým (His)₆ príveskom vo vaječníkových bunkách čínskeho škrečka a purifikovala sa až kým nebola homogénna. Schopnosť IL-18Bpa-(His)₆ neutralizovať IL-18 bola opísaná (Kim a ďalší, 2000). ICE inhibítor (ICEi) Ac-Try-Val-Ala-Asp-chlórmetylketón (YVAD) sa kúpil od Alexis Biochemicals (San Diego) a rozpustil sa v DMSO v koncentrácii 10 mg/ml. ICEi sa nariedil vTyrode roztoky pred tým, ako sa použil. V ľudských

-29periférnych krvných mononukleárnych bunkách ICEi redukuje endotoxínom indukované vylučovanie zrelého IL-1 β o 92 %, ako bolo merané prostredníctvom ELISA (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ).

Izolácia predsieňových trámcov

Pacienti podrobujúci sa elektívnemu koronárnemu arteriálnemu chirurgickému bypassu s čerpadlovým oxygenátorom vyžadujú zavedenie kanyly do pravej predsiene. V tom čase sa rutinne odoberal a odložil malý segment pravého predsieňového prívesku. Trámce sa získali z tohto odobratého tkaniva. Ľudské predsieňové tkanivo sa umiestnilo do okysličeného modifikovaného Tyrodového tlmivého roztoku pri 4 °C. Modifikovaný Tyrodový roztok sa pripravoval denne s deionizovanou destilovanou vodou a obsahoval D-glukózu s koncentráciou 5,0 mmol/liter, CaCI₂ s koncentráciou 2,0 mmol/liter, NaCl s koncentráciou 118,0 mmol/liter, KCl s koncentráciou 4,0 mmol/liter, MgSO4.7H₂O s koncentráciou 1,2 mmol/liter, NaHCO₃ s koncentráciou 25,0 mmol/liter a NaHPO₄ s koncentráciou 1,2 mmol/liter. Bezsubstrátový Tyrodový roztok obsahoval cholínchlorid s koncentráciou 7 mmol/liter na udržiavanie osmolarity. Ak nie je uvedené inak, chemikálie a reakčné činidlá sa získali od firmy Sigma. Dva zo štyroch trámcov (4 až 7 mm dlhé a s priemerom <1,0 mm) sa pripojili na silový transduktor a ponorili sa do vyhrievaného (37 °C) 30ml kúpeľa modifikovaného Tyrodového roztoku; zmes 92,5% O₂/7,5% CO₂ sa prebublávala v priebehu normoxie. Táto plynová zmes poskytovala parciálny tlak O₂ >350 mmHg (1mmHg = 133 Pa), parciálny tlak CO₂ 36 až 40 mmHg a pH 7,35-7,45. Každý parameter sa rutinne kontroloval automatizovaným analyzátorom krvných plynov. Teplota orgánového kúpeľa sa udržiavala na 37 °C v priebehu experimentu. Počas simulovanej ischémie sa plynová zmes zmenila na 92,5% N₂/7,5% CO₂. Táto zmes vyvíjala O₂ parciálny tlak <50 mmHg. Tlmivý roztok sa menil každých 20 minút s výnimkou 30 minútovej periódy simulovanej ischémie.

Dizajn experimentu

Trámce sa ekvilibrovali 90 minút na zvýšenie základnej úrovne napínacej sily na 1000 mg a na umožnenie stabilizácie vyvíjanej sily. Zo štúdie sa vylúčili trámce,

-30ktoré neboli schopné generovať viac ako 250 mg vyvíjanej sily. Počas 90 minút ekvilibrácie sa s platinovými elektródami (Radnoti Glass, Monrovia, CA) uskutočňovalo udávanie rytmu na poľovú stimuláciu. Elektródy sa umiestnili na obe strany trámcov, stimulovali sa (Grass SD9 stimulátor, Warwick, Rl) so 6ms pulzami a napätím o 20% vyšším oproti prahovej hodnote a udávalo sa v nich tempo 1 Hz počas normoxie a 3 Hz počas ischémie. Kontrakcie sa monitorovali silovými transduktormi (Grass FT3) a zaznamenávali sa automatizovaným preamplifikátorom a digitalizátorom (MacLab Quad Bridge, MacLab/Be, AD Instruments, Molford, MA) a kontinuálne sa monitorovali s Macintosh počítačom.

Po ekvilibrácii sa trámce od jedného pacienta študovali v troch experimentálnych podmienkach: Kontrolné podmienky pozostávali z 90 minút normoxickej suprafúzie; l/R pozostávali z 30 minút simulovanej ischémie nasledovaných 45 minútami reperfúzie; a tretie podmienky pozostávali z anticytokínovej intervencie. Pri tretích podmienkach sa pridával anticytokín do suprafúzovacieho kúpeľa tesne pred nástupom ischémie a bol prítomný počas 45 minút reperfúzie.

Zachovaná trámcová CK aktivita

Determinovala sa CK aktivita koncového reperfúzového tkaniva (90 minút) ako je opísané v Kaplan a ďalší, 1993. Tkanivá sa homogenizovali v 100 objemoch ľadovo vychladeného izotonického extrakčného tlmivého roztoku (Cleveland a ďalší, 1997, Kaplan a ďalší, 1993). Test sa uskutočňoval s CK kitom (Sigma) použitím automatizovaného spektrofotometra. Výsledky sú prezentované ako jednotky CK aktivity na mg (mokrá hmotnosť tkaniva).

Izolácia RA a PCR spojená s reverznou transkripciou

Čerstvé trámce sa homogenizovali vTri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati) a celková RNA sa izolovala chloroformovou extrakciou a izopropanolovou precipitáciou. RNA sa rozpustila vo vode ošetrenej dietylpyrokarbonátom, ošetrila sa DNázou a kvantifikovala sa použitím GeneQuant (Amersham Pharmacia Biotech). cDNA metódy boli opísané (Rezníkov a ďalší, 2000). Pre každú PCR sa použili nasledujúce sekvencie: predhrievanie pri 95 °C 15

-31 minút, potom cykly pri 94 °C 40 sekúnd, pri 55 °C 45 sekúnd a pri 72 °C 1 minútu, s finálnou predlžovacou fázou pri 72 °C počas 10 minút. Optimálny počet cyklov sa determinoval ako 35. Primery pre glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (GAPDH) a ľudský IL-18 (Rezníkov a ďalší, 2000) a pre ľudský IL-18Bpa (Kim a ďalší, 2000) boli publikované. PCR produkty sa separovali na 1,5% agarózovom géli obsahujúcom 0,5x TBE (50mM Tris/45 mM kyselinu bórovú/0,5mM EDTA, pH 8,3) s etídiumbromidom v koncentrácii 0,5 mg/ml, vizualizovali sa prostredníctvom UV žiarenia a odfotili sa. Denzitometria sa uskutočňovala na negatíve (IMAGEQUANT Software, Molecular Dynamics) a relatívna absorbancia IL-18 a IL-18BP PCR produktov sa upravila oproti absorbancii získanej pre GAPDH.

Determinácie IL-18

Čerstvé trámce sa homogenizovali ako bolo opísané vyššie pre CK merania. IL-18 sa analyzoval prostredníctvom elektrochemiluminiscencie na kvapalnej fáze (ECL, Igen, Geithersburg, MD). Myšacia anti-humánna IL-18 mAb (R&D Systems) sa označila ruténiom (Igen). Okrem toho sa afinitne purifikovaná kozia antihumánna IL-18 protilátka (R &D) označila s biotinom (Igen). Biotinylovaná protilátka sa nariedila na konečnú koncentráciu 1 ug/ml v PBS (pH 7,4) obsahujúcom 0,25% BSA, 0,5% Tween-20 a 0,01% azid (Ecl tlmivý roztok). Na jednu testovaciu skúmavku sa predinkubovalo 25 μΙ biotinylovanej protilátky pri laboratórnej teplote s 25 μΙ streptavidínom potiahnutých paramagnetických guľôčok (Dynal, Great Neck, NY) s koncentráciou 1 pg/μΙ 30 minút za silného pretrepávania. Vzorky na testovanie (25 μΙ) alebo štandardy sa pridali do skúmaviek a nasledovalo 25 μΙ ruténiom značenej protilátky (konečná koncentrácia 1 pg/μΙ, nariedená v ECL tlmivom roztoku). Skúmavky sa potom pretrepávali 24 hodín. Reakcia sa zastavila pridaním PBS, 200 μΙ na skúmavku, a množstvo chemiluminiscencie sa determinovalo s Origen Analyzátorom (Igen). Limit detegovateľnosti pre IL-18 je 16 pg/ml.

Konfokálne mikroskopické ľudské predsieňové tkanivo získané počas zasúvania kanyly čerpadlového oxygenátora sa umiestnilo do 1cm plastického držiaka (Meldrum a ďalší, 1998), zabalilo sa a zmrazilo sa v médiu na mražovanie

-32tkanív (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) izopentánom chladeným so suchým ľadom. Zmrazené rezy (5 pm) sa rezali na Leica CM 1850 kryostate (Leica, Deerfield, IL). Rezy sa fixovali 10 minút v 4% paraformaldehyde, vysušili sa na vzduchu a inkubovali sa 20 minút v PBS doplnenom s 10% normálnym kozím sérom. Rezy sa inkubovali v 1:100 riedení králičej anti-humánnej IL-18 protilátky (Peprotech, Rocky Hill, NJ) alebo neimúnneho králičieho IgG v koncentrácii 1 pg/ml, ako negatívnou kontrolou. Protilátky sa nariedili v PBS obsahujúcom 1% BSA. Po inkubovaní pri 4 °C cez noc sa rezy premyli trikrát s 0,5% BSA v PBS. Rezy sa potom inkubovali so sekundárnou kozou anti-králičou protilátkou konjugovanou s Alexa488 (Molecular Probes) 60 minút pri laboratórnej teplote v tme. Jadrá sa farbili modrou s bisbenzimidom (Sigma) s koncentráciou 1 pg/100 ml. Po farbení sa rezy premyli a skúmali sa s Leica DM RXA (Leica) konfokálnym laserovým skenovacím systémom a analyzovali sa SLIDEBOOK softwarom pre Macintosh (Intelligent Imaging Innovations, Denver).

Štatistická analýza

Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Priemerné zmeny vo vyvíjanej sile sa vypočítali vo vzťahu ku kontrolnej hodnote po 90 minútach pre tkanivo každého pacienta. Štatistický význam rozdielov medzi skupinami sa určil faktoriálnou ANOVA s Bonferroni-Dun post hoc analýzou. Štatistická analýza sa uskutočňovala so STAT-VIEW 4.51 softwarom (Abacus Concepts, Calabasas, CA).

Výsledky

Vplyv neutralizácie endogénneho IL-18 s IL-18BP na postischemicky vyvíjanú silu

Obrázok 1A demonštruje kinetickú reakciu trámcov na l/R poškodenie. Znázornených je finálnych 15 minút ekvilibrácie a výsledky sú normalizované oproti 100 % na začiatku experimentálnej periódy. Kontrolné trámce sú suprafúzované v normoxických podmienkach počas celého experimentu. Ako je znázornené, pozoruje sa redukcia (10%) vo vyvíjanej sile v kontrolných trámcoch. Trámce, ktoré sa podrobili ischémii, vykazujú rýchly pokles kontraktilnej funkcie; po reperfúzii sa kontraktilná sila vracia na hodnotu približne 25 % sily vyvíjanej kontrolou. Naproti

-33tomu, trámce vystavené ischémii, ale v prítomnosti IL-18BP, sa vrátili na 55 % sily vyvíjanej kontrolou. Na hodnotenie l/R reakcie srdcových tkanív od niekoľkých pacientov sa úroveň sily vyvíjanej v kontrolných trámcoch po 90 minútach stanovila ako 100 % pre každú vzorku od pacienta a vypočítala sa relatívna percentuálna zmena vo vyvíjanej sile pre experimentálne skupiny.

Ako je znázornené na obrázku 1B, postischemicky vyvíjaná sila v neošetrených trámcoch (l/R) sa znížila na priemerne 35 % kontroly. Avšak v prítomnosti IL-18BP sa táto redukcia oslabila na priemerne 66,2 % kontroly pri koncentrácii 1 pg/ml a 76 % kontroly pri koncentrácii 5 pg/ml. Tieto výsledky naznačujú, že l/R vedie k uvoľňovaniu biologicky aktívneho IL-18 po spracovaní endogénneho prekurzora IL-18 prostredníctvom ICE. Preto sa IL-18 meral v čerstvo získanom predsieňovom tkanive. Ako je znázornené na obrázku 2 bazálny IL-18 bol prítomný v trámcoch získaných pred zavedením čerpadlovej okysličovacej kanyly do pravej predsiene. Po 90 minútach ekvilibrácie, 30 minútach ischémie a 45 minútach opätovného okysličovania sa trámce homogenizovali a stanovili sa hladiny IL-18. Po l/R bol IL-18 v tkanive 4,5-krát zvýšený (obrázok 2).

V týchto tkanivách sa stanovovali aj ustálené mRNA hladiny pre IL-18 a IL18BP. Pozorovali sme bazálnu génovú expresiu pre IL-18 a IL-18BP v čerstvo získaných preischemických predsieňových homogenátoch (obrázky 3 A, B). Podobne ako pri zvyšovaní IL-18 proteínu, l/R indukovala ďalšie zvýšenie ustálených IL-18 mRNA hladín (4,7-násobné zvýšenie). Pozorovala sa aj IL-18BP génová expresia v čerstvo získanom predsieňovom tkanive a táto bola po l/R zvýšená len mierne (1,3-násobne).

Lokalizácia IL-18 v ľudskom myokarde

Pretože sa IL-18 proteín, ako bol meraný prostredníctvom ECL, a IL-18 mRNA nachádzajú v čerstvo získaných myokardiálnych homogenátoch, použilo sa histochemické farbenie na určenie lokalizácie IL-18. Predsieňové tkanivá sa získali tesne pred zavedením čerpadlovej okysličovacej kanyly a okamžite sa zmrazili (nie je znázornené). IL-18 sa pozoroval v rezidenčných myokardových makrofáoch a vo vnútri cievnych endoteliálnych buniek. IL-18 je v makrofágoch a v endoteliálnych bunkách prítomný predtým, ako nastane akákoľvek ischémia súvisiaca s operáciou

-34a je prítomný pri absencii kontaktu s akýmikoľvek cudzími povrchmi. Lokalizácia IL18 v rezidenčných makrofágoch a endoteliálnych bunkách je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami konštitutívneho preformovaného prekurzora IL-18 v čerstvo získaných periférnych monocytoch od zdravých subjektov (Puren a ďalší, 1999). Preto je z toho možné vyvodiť, že preformovaný prekurzor IL-18 existuje v myokarde pacientov plánovaných na koronárny arteriárny bypass kvôli ischemickému srdcovému ochoreniu.

Ochrana bunkovej životaschopnosti

Vnútrobunkové hladiny CK sa použili na stanovenie stupňa bunkovej životaschopnosti po l/R. V tomto teste je tým vyšší počet životaschopných buniek, čím vyššia je CK hodnota. Každá z anticytokínových intervencií viedla k ochrane bunkovej životaschopnosti. Ako je demonštrované na obrázku 5, IL-18BP a IC inhibícia (10 a 20 pg/ml) zvyšovali vnútrobunkové hladiny CK po l/R z 1,399 na 5,921, 5,675, 6,624 a 4,662 jednotiek CK aktivity na mg (mokré tkanivo). Tieto pozorovania naznačujú inhibíciu l/R-indukovanej aktivácie IL-18 a ochraňujú myobunkovú životaschopnosť v tomto ex vivo modeli.

Vplyv neutralizácie myokardiálnej funkcie indukovanej s TNFa

Ako je uvedené na obrázku 6, sila vyvíjaná trámcami (DF) sa znížila o 18 % po ich 90 minútovom vystavení exogénnemu TNFa. Neutralizácia endogénneho IL18, vplývajúceho na kontraktilnú funkciu v ľudskom myokarde vystavenom exogénnemu TNFa, prostredníctvom inkubovania s IL-18BP počas desiatich minút pred pridaním TNFa, znižovala veľkosť poklesu vo vyvíjanej sile (DF), pozri obrázok

6. Po 90 minútach sa sila vyvíjaná v kontrolnej skupine znížila o 18 %, zatiaľ čo v TNFa-exponovaných trámcoch prepadla o 58 % oproti kontrole. Avšak TNFaexponované trámce s IL-18BP vyvíjali silu, ktorá poklesla len o 30 % v porovnaní s kontrolou. Tieto údaje naznačujú, že priame účinky TNFa na myokardovú kontraktilnú depresiu sú aspoň čiastočne sprostredkované biologicky aktívnym endogénnym IL-18.

-35Vplyv exogénneho IL-18 na vyvíjanú silu

Ďalej sa stanovoval priamy vplyv exogénneho IL-18 na myokardovú kontraktilnú funkciu. IL-18 sa pridával k suprafúzovaným trámcom po 90 minútach ekvilibrovania a pri každej výmene kúpeľa. Ako je znázornené na obrázku 7, IL-18 vedie k pomalému, ale progresívnemu, znižovaniu sily vyvíjanej v priebehu experimentálnej periódy. Po 90 minútach kontinuálneho vystavenia IL-18 sa vyvíjaná sila znížila o 42 %. Tieto údaje demonštrujú, že exogénny IL-18, podobne ako TNFa, funguje ako myokardové depresívum.

Ochrana bunkovej životaschopnosti

Casases sú často spojené s apoptózou. Na stanovenie bunkovej životaschopnosti v trámcoch vystavených TNFa sa merala tkanivová vnútrobunková kreatín kináza (CK). V tomto teste vysoké CK hladiny indikujú životaschopné bunky. Ako je znázornené na obrázku 8, kontrolné trámce, ktoré sa podrobili 90 minútam normoxickej superfúzie, obsahovali 6801 ±276 jednotiek CK aktivity na miligram mokrej tkanivovej hmotnosti. Naproti tomu, trámce vystavené 30/45 minútam l/R poškodenia alebo 90 minútam pôsobenia s TNFa vykazovali znížené hladiny zachovanej CK: 1774+181, respektíve 3246±217 jednotiek/mg. Trámce vystavené TNFa v prítomnosti IL-18BP obsahovali 5605±212 jednotiek/mg tkaniva. Je zaujímavé, že trámce ošetrované s TNFa mali vyššie hladiny zachovanej CK ako l/R trámce. Toto bolo neočakávané zistenie, pretože veľkosť vyvíjanej sily na konci experimentálnej periódy bola podobný pre l/R a TNFa.

Príklad 3

IL-18BP chráni pred infarktom myokardu

IL-18BP in vivo spôsob

In vivo vnútrosvalový elektotransfer myšacieho IL-18BP expresného plazmidu

C57BL/6 myši dostávali v 3-týždňových intervaloch 3 injekcie s expresným plazmidom obsahujúcim cDNA pre IL-18BP (označený pcDNA3-IL-18BP, opísaný vo WO 01/85201). Kontrolným myšiam sa injektoval kontrolný prázdny plazmid.

cDNA myšacej IL-18BP izoformy d, ako je opísaná (prístupové číslo Q9ZOM9) (Kim

-36a ďalší, 2000) sa subklonovala do EcoR1/Not1 miest cicavčieho bunkového expresného vektora pcDNA3 pod kontrolu cytomegalovírusového promótora (Invitrogen). Kontrolným plazmidom bol podobný konštrukt bez terapeutickej cDNA. Kontrolná skupina obsahovala 31 myší, experimentálna skupina, ktorej sa podával IL-18BP, obsahovala 27 myší.

IL-18BP alebo kontrolný expresný plazmid (60 pg) sa injektovali do oboch holelných kraniálnych svalov anestetizovanej myši, ako už bolo opísané v Mallat a ďalší, 1999. V stručnosti, transkutánne elektrické impulzy (8 štvorcových vlnových elektrických impulzov s hodnotou 200 V/cm, trvaním 20 ms pri 2 Hz) sa dodávali PS-15 elektropulzátorom (Genetronics, Francúzsko) použitím dvoch nefarbených oceľových platňových elektród umiestnených 4,2 až 5,3 mm od seba, na každej strane nohy.

Indukcia infarktu v ľavej komore

Dvadsaťštyri hodín po podaní IL-18BP plazmidu alebo prázdneho plazmidu sa myši anestetizovali IP injekciou xylazínu a ketamínu, ventilovali sa a podrobili sa torakotómii. Ľavá hlavná koronárna artéria sa potom trvalo spojila použitím 8-0 prolénového stehu, aby sa indukoval infarkt myokardu, potom sa hruď uzavrela a zvieratá sa nechali prebrať z anestézy. Peroperatívna mortalita bola nižšia ako 20 %. Post-operatívna mortalita bola 48 % v kontrolnej skupine a 26 % v experimentálnej skupine, a smrť nastávala takmer výlučne 4 až 5 dní po spojení.

Sedem dní po spojení sa myši znova anestetizovali a stanovili sa rozmery ľavej komory (LV) prostredníctvom echokardiografie pri uzatvorenom hrudníku použitím ATL HDI 5000 echokardiografu. LF frakčné skracovanie sa vypočítalo z nameraných koncových diastolických a koncových systolických priemerov. Na konci echokardiografického merania sa srdce odobralo, fixovalo a neskôr sa porezalo na rezy. Histologické rezy sa potom farbili so sírius červeňou na stanovenie rozsahu infarktu.

Výsledky

-37Diastolický priemer ľavej komory sedem dní po spojení bol v prežívajúcich myšiach nasledovný: 0,53+0,01 mm (n = 20) u myší liečených SÍL-18BP oproti 0,59+0,01 mm u kontrolných myší (n=16), p<0,01.

Systolický priemer ľavej komory sedem dní po spojení bol v prežívajúcich myšiach nasledovný: 0,45+0,02 mm u myší liečených slL-18BP oproti 0,52+0,02 u kontrolných myší, p<0,01.

Frakčné skrátenie ľavej komory: 15+1 % u myší liečených s IL-18BP oproti 11+1 % u kontrolných myší, p<0,01.

Záver: IL-18BP redukuje mortalitu myší po infarkte myokardu indukovanom totálnym koronárnym spojením na ľavej komore o 50 %. Okrem toho, funkcia ľavej komory sa významne zlepšila, ako je vidieť zo zmenšených systolických a diastolických priemerov ľavej komory.

s i

->2Literatúra

1. Bolli, R. (1990) Circulation 82, 723-38.

2. Buggemann a ďalší, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991)

3. Cain, B. S., Meldrum, D, R., Dinarello, C. A., Meng, X., Banerjee, A. & Harken, A. H. (1998) J Surg Res 76, 117-23.

4. Cleveland, J. C. J., Meldrum, D. R., Cain, B. S., Banerjee, A. & Harken, A. H. (1997) Circulation 96, 29-32.

5. Daemen MA, van't Veer C, Wolfs TG, a ďalší: Ischemia/reperfusion-induced IFNgamma up-regulation: involvement of IL- 12 and IL-18. J.Immunol. 162:5506-5510, 1999

6. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E a Karin, M. (1997). Náture 388, 16514-16517.

7. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H. a Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

8. Engelmann, H., Novick, D. a Wallach, D., 1990, J.Biol.Chem. 265, 1531-1536.

9. Fantuzzi, G., A. J. Purenl M. W. Harding, D. J, Livingston a C. A. Dinarello. Blood 91: 2118-25, 1998.

10. Grantham (1974), Science, 185. 862-864.

11. Gurevitch, J., Frolkis, I., Yuhas, Y., Paz, Y., Matsa, M., Mohr, R. & Yakirevich, V. (1996) J Am Coli Cardiol 28, 247-52.

12. Herskowitz, A., Choi, S., Ansari, A. A. & Wesselingh, S. (1995) Am J Pathol 146, 419-28.

13. Hochholzer, 9., G. B. Lipford, H. Wagner, K. Pfeffer a K. Heeg. Infect Immun. 68: 3502

14. Kaplan, L. J., Blum, H., Banerjee, A. & Whitman, G. J. (1993) J Surg Res 54, 31 1-5.

15. Kim SH, Eisenstein M, Rezníkov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding proteín to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

16. Kim SH a ďalší, J. Immuno. 2001, 166, str. 148- 154.

17. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, a ďalší. Construction and initial characterization of a mousehuman chimeric anti-TNF antibody. Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53

18. Maniatis a ďalší, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.

19. Meldrum, D. R., Cleveland, J. C., Jr., Cain, B. S., Meng, X. & Harken, A. H. (1998) Ann Thorac Surg 65, 439-43.

20. Mendez, M.M., Green, L.L., Corvalan, J.R.F., Jia X-C., Maynard-Currie, E.E., Yang, X-D., Gallo, M.L., Louie, D.M., Lee, D.V., Erickson, K.L., Luna, J., Roy, C.M-N., Abderrahim, H., Kirshenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D.M., Fukushima, A., Hales, J.F., Finer, M.H., Davis, C.G., Zsebo, K.M. a Jakobovits, A. (1997). Functional transplant of megabase human ímmunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Náture Genetics, 15 , 146-56.

21. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K a Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590595.

22. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Rezníkov, L, Dinarello, C a Rubinstein, M (1999). ImmunitytO, 127-136.

23. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K a Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271,3967-3970.

24. Puren, A. J. , Fantuzzi, G. & Dinarello, C. A. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2256-2261

25. Raeburn, C. D., C. M' Calkins, M. A. Zimmerman, Y. Song, L Ao, A. Banerjee, X. keng a A. H. Harken. Surgery 130: 319-25., 2001.

26. Rezníkov, L. L., Kim, S. H., Westcott, J. Y., Frishman, J., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M. & Dinarello, C. A. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 2174-2179.

27. Torigoe, K., Ushio, S., Okura, T., Kobayashi, S., Taniai, M., Kunikate, T., Murakami, T., Sanou, O., Kojima, H., Fuji, M., Ohta, T., Ikeda, M., Ikegami, H. & Kurimoto, M. (1997) J Biol Chem272, 25737-25742.

28. Tomizuka a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000)

29. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M. a Zubler, R.H., 1992, J.lmmunol. 148,2778-2784.

Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S a Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161, 3400-3407.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde srdcovým ochorením je ischemické srdcové ochorenie.
3. 3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde srdcové ochorenie je chronické.
4. 4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde srdcovým ochorením je angína pectoris.
5. 5. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde srdcové ochorenie je akútne.
6. 6. Použitie podľa nároku 5, kde srdcovým ochorením je infarkt myokardu.
7. 7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde srdcovým ochorením je zlyhanie srdca.
8. 8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde srdcovým ochorením je kardiomyopatia.
9. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde IL-18 inhibitor je vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje inhibitor kaspázy-1 (ICE), protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 signalizačnej dráhy, antagonisty IL-18, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18 receptor, a IL-18 viažuce proteíny, alebo ich izoformy, muteíny, fúzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty inhibujúce biologickú aktivitu IL-18.
10. 10. Použitie podľa nároku 9, kde IL-18 inhibítorom je protilátka nasmerovaná proti IL-18.
11. 11. Použitie podľa nároku 9, kde IL-18 inhibítorom je protilátka nasmerovaná proti IL-18 receptoru a.
12. 12. Použitie podľa nároku 9, kde IL-18 inhibítorom je protilátka nasmerovaná proti IL-18 receptoru β.
13. 13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 12, kde IL-18 protilátkou je humanizovaná alebo humánna protilátka.
14. 14. Použitie podľa nároku 9, kde IL-18 inhibítorom je IL-18 viažuci proteín alebo jeho izoforma, muteín, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívna frakcia alebo cirkulárne permutovaný derivát, inhibujúci biologickú aktivitu IL-18.
15. 15. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde IL-18 inhibítor je glykozylovaný na jednom alebo viacerých miestach.
16. 16. Použitie podľa nároku 14, kde fúzovaný proteín obsahuje imunoglobulínovú (Ig) fúziu.
17. 17. Použitie podľa nároku 9 alebo 14, kde funkčný derivát obsahuje najmenej jednu časť pripojenú na jednu alebo viacero funkčných skupín, ktoré sa nachádzajú na jednom alebo viacerých bočných reťazcoch aminokyselinových zvyškov.
18. 18. Použitie podľa nároku 17, kde skupinou je polyetylénová skupina.
19. 19. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek obsahuje aj antagonistu nádorového nekrotického faktora (TNF).
20. 20. Použitie podľa nároku 19, kde sa IL-18 inhibítor používa spoločne, následne alebo oddelene s TNF antagonistom.
21. 21. Použitie podľa nároku 19 alebo 20, kde TNF antagonistom je TBPI a/alebo TBPII.
22. 22. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde IL-18 inhibítor je v koncentrácii v rozsahu od približne 0,001 do 100 mg/kg alebo od približne 1 do 10 mg/kg alebo od 2 až 5 mg/kg.
23. 23. Použitie expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia.
24. 24. Použitie expresného vektora na indukciu a/alebo posilnenie endogénnej produkcie IL-18 inhibítora v bunke na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu srdcového ochorenia.