UA80676C2 - Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of cardiomyopathy - Google Patents

Description

Даний винахід відноситься до області серцево-судинних захворювань. Більш конкретно, він відноситься до застосування інгібітору І/-18 для лікування і/або профілактики захворювання серця, зокрема, ішемічної хвороби серця.

Цитокін інтерлейкін-18 (1-18) був спочатку описаний як фактор, що індукує у-інтерферон (ІЕМ-у) (Макатига і співавт., 1989). Він є раннім сигналом розвитку відповідей Т-хелперних лімфоцитів тину 1 (ТНІ).

І--18 діє разом з 1ІІ/-12, І/-2, антигенами, мітогенами і, можливо, з іншими додатковими факторами, які індукують продукцію ІЕМ-у. ІЇ-18 посилює також продукцію (4М-С5Е і 1І-2, потенціює Т-клітинну проліферацію, що індукується анти-СОЗ, та підвищує опосередкований Раз кілінг природних кілерних клітин.

Зрілий ІЇ/-18 продукується зі свого попередника за допомогою ІІ-ІВ-перетворюючого ферменту (ІСЕ, каспаза-1).

Рецептор 1ІІ/-18 складається, щонайменше, з двох компонентів, які взаємодіють при зв'язуванні ліганду.

Сайти зв'язування 1-18 з високою і низькою спорідненістю були виявлені у мишачих Т-клітинах, стимульованих 1І/-12 |МозПпітоїо і співавт., 1998), що дозволяє припустити наявність багатоланцюгового рецепторного комплексу. Поки ідентифіковані дві рецепторні субодиниці, які обидві відносяться до сімейства рецепторів ІІ -1 |Ратеї і співавт., 1996; Кіт і співавт., 2001). Передача сигналу ІІ -18 включає в себе активацію

МЕ-кВ (Оібопай і співавт., 1997). Комплекс рецептора 1І-18 складається з двох рецепторних ланцюгів: ланцюг

І/-18АВа називають ліганд-зв'язувальним ланцюгом, а ланцюг ІЇ/-18АР називають ланцюгом, що передає сигнал. Ланцюг 1І-18А виділили спочатку у вигляді білка клітинної поверхні, що зв'язує радіоактивно мічений

І/-18; даний білок виділили і виявили ідентичність його амінокислотної послідовності з раніше описаним орфановим рецептором, який називається ІІ -ІВ-зв'язаним білком (ІІ--ІАгр), |Тогідоеє і співавт., 1997).

Нещодавно з людської сечі був виділений розчинний білок, який володіє високою спорідненістю проти ЕЇ - 18, і клоновані кКДНК людини і миші, а також людський ген (Моміск і співавт., 1999; У/О 99/090631|. Даний білок одержав назву ІІ -18-зв'язувальний білок (ІІ -188Р).

І/-18ВР не є позаклітинним доменом жодного з відомих рецепторів І/-18, а являє собою природно циркулюючий білок. Він відноситься до нового сімейства білків, що секретуюїься, яке, крім того, включає в себе декілька білків, що кодуються поксвірусом (Моміск і співавт., 1999)! ІІ -188Р з сечі, як і рекомбінантний ІІ - 188Р, з високою спорідненістю специфічно зв'язують ІІ -18 і регулюють біологічну спорідненість ІІ -18.

Ген ІР-18В8Р. локалізований у хромосомі ІІдІЗ людини, і у геномній послідовності довжиною 8,3 т.п.н. не виявляється екзон, який кодус трансмембранний, домен. На сьогоднішній день у людини знайдені чотири варіанти або ізоформи сплайсингу ІІ -18ВР, що утворюються в результаті альтернативного сплайсингу МРНК.

Вони позначені ІІ -18БР а, Б, с і а, причому всі володіють одним і тим же М-кінцем і відрізняються по С-кінцю

ІмМоміск і співавт., 19991. Дані ізоформи варіюють по здатності зв'язувати ІІ -18. Відомо, що з вказаних чотирьох ізоформ, ізоформи а і с МІ-1І8ВР володіють здатністю нейтралізувати І/-18. Ізоформа І/-188Р. людини перехресно реагує з мишачим ІІ -18.

Захворювання серця визначаються як порушення, які впливають на серцевий м'яз або на кровоносні судини серця |Пе Мегок Мапиа! Ноте Едайоп, м/млу. тегок.сот.|. Судинне порушення являє собою порушення діяльності кровоносної судини, наприклад, ослаблення циркуляції крові внаслідок закупорювання.

Захворювання серця називають також серцево-судинними порушеннями.

Ішемічна хвороба серця часто викликає серцеву недостатність і у західному співтоваристві є найчастішою причиною смерті. Вона, як правило, обумовлена атеросклеротичною бляшкою у коронарній артерії-

Пошкодження міокарда включають ішемічний фіброз і гострий інфаркт. У нормальних умовах кровотік у коронарних артеріях сильно залежить від метаболічних потреб серцевого м'яза. Ішемічна хвороба серця розвивається при недостатньому кровопостачанні внаслідок погіршення самого кровопостачання, або при гіпертрофованому міокарді, який потребує підвищеного кровопостачання. Коронарний кровотік у нормі не залежить від аортального тиску. Існує ефективний механізм, що сам регулюється, який контролює кровотік через коронарне судинне ложе.

Якщо відбувається закупорення великої коронарної артерії, звичайно внаслідок атеросклерозу або артеріосклерозу, то спочатку коронарний кровотік зберігається, оскільки периферичний опір непрохідності зменшений. Якщо просвіт судини закупорений більше ніж на 7595, розвивається ішемія, особливо у випадку, якщо коронарний колатеральнийдсровообіг виражений слабо.

Серцевий м'яз надзвичайно метаболічно активний, в окремих його волокнах міститься понад 3095 мітохондрій по об'єму. Кисневий обмін істотний, оскільки резерви високоенергетичних фосфатів дуже незначні. При дуже низькому рівні тканинного аденозинтрифосфату (АТФ) і при фактичній зупинці анаеробного гліколізу серцевий м'яз гине. Як і у випадку з іншими тканинами точна причина загибелі незрозуміла, але летальне ураження серцевого м'яза асоціюється з мембранним пошкодженням і раптовим вкиданням кальцію у цитоплазму клітини. Після короткого проміжку часу ішемії кардіальний кровотік може відновитися (реперфузія). Однак після великого інтервалу часу реперфузія неможлива, очевидно, внаслідок набухання ендотеліальних клітин капілярів.

Атеросклероз відповідальний за величезну кількість випадків ішемічної хвороби серця. Ішемічна хвороба серця може також виникати через незначну перфузію коронарних артерій. Інсульт, особливо геморагічний, часто є причиною її виникнення.

Як вказано вище, ішемічна хвороба серця є результатом дисбалансу між кровопостачанням міокарда і метаболічними потребами міокарда. Крім того, кровотік може зменшитися через накладення таких подій як спазм судин, тромбоз або циркуляторні зміни, які приводять до незначної перфузії.

Перфузія коронарних артерій залежить від різниці тиску між коронарним отвором (аортальний діастолічний тиск) і коронарним синусом (тиск у правому передсерді). Коронарний кровотік зменшується протягом систоли внаслідок ефектів Вентурі у коронарних отворах і стискання внутрішньом'язових артерій під час скорочення шлуночків. Фактори зменшення коронарного кровотоку включають в себе знижений артеріальний діастолічний тиск, підвищений внутрішньоїшгуночковий тиск і скорочення міокарда, стеноз коронарної артерії, стеноз і регургітацію аортального клапана і підвищений тиск у правому передсерді.

Тромболітична терапія за допомогою таких засобів, як стрептокіназа або тканинний активатор плазміногена (ТРА) часто використовують для розчинення тромбу, який нещодавно утворився. Така терапія по розчиненню тромбу може у більшості випадків відновити кровотік. Це допомагає запобігти істотному пошкодженню міокарда, якщо досить рано втрутитися (менш ніж протягом однієї години або близько цього) у даний розвиток подій, і може, щонайменше, допомогти зменшити подальше пошкодження.

Стенокардія є симптомокомплексом ішемічної хвороби серця, що характеризується пароксизмальним нападом болю у грудях, звичайно загруднинного або прекордіального. Це обумовлено ішемією міокарда, що не привела до інфаркту. Може виникнути раптова серцева смерть, яка являє собою раптову смерть серцевої етіології, звичайно протягом однієї години виникнення серцевого етіологічного фактора або без виникнення симптомів. Від неї щорічно помирає 300000-400000 людей.

Інші форми захворювання серця включають в себе алкогольну кардіоміопатію, пролабірування стулок аортального клапана, стеноз аортального клапана, аритмії, кардіогенний шок, природжений порок "серця, дилатаційну кардіоміопатію, серцевий напад, серцеву недостатність, пухлину серця, стеноз легеневого клапана серця, гіпертрофічну кардіоміопатію, ідіопатичну кардіоміопатію, ішемічну хворобу серця, ішемічну кардіоміопатію, регургітацію крові при недостатності мітрального клапана, пролабірування стулок мітрального клапана, кардіоміопатію, зв'язану з родами, стабільну стенокардію.

Інфаркт міокарда являє собою ще одну форму ішемічної хвороби серця. Його патогенез може включати в себе закупорювальний внутрішньокоронарний тромбоз, тобто виникнення тромбу, який покриває укриту виразками або зруйновану бляшку, що стенорує. Закупорювальний внутрішньокоронарний тромб викликає 9095 трансмуральних інфарктів міокарда. Спазм судин може мати місце при коронарному атеросклерозі або за його відсутності і цілюом ймовірно асоціюється з агрегацією тромбоцитів. Емболи можуть також відігравати роль у розвитку інфаркту міокарда.

Загальна морфологічна картина інфаркту міокарда може варіювати. Трансмуральний інфаркт міокарда залучає всю товщину стінки лівого шлуночка від ендокарда до епікарда. При субендокардіальному інфаркті міокарда виникають багатоосередкові ділянки некрозу, обмежені 1/3-1/2 внутрішньої стінки лівого шлуночка.

Ускладнення інфаркту міокарда можуть включати в себе аритмію та дефекти провідності з можливою "раптовою смертю", розширенням зони інфаркту або повторним інфарктом, застійну серцеву недостатність (набряк легень), кардіогенний шок, перикардит, пристінковий тромбоз з можливою емболізацією, розрив стінки міокарда з можливою тампонадою, відрив папілярних м'язів з можливою клапанною недостатністю, утворення аневризми шлуночка.

Інфаркт міокарда (ЇМ) визначають як ішемічний некроз міокарда, що звичайно розвивається внаслідок раптового зменшення коронарного кровотоку на ділянці міокарда.

У більше ніж 9095 хворих гострим ЇМ гострий тромб, часто зв'язаний з руйнуванням бляшки, закупорює дану артерію (раніше частково перекриту атеросклеротичною бляшкою), яка живить пошкоджену ділянку.

Змінена функція тромбоцитів, яка індукується зміною ендотелію в атеросклеротичній бляшці, здійснює основний внесок у тромбогенез. Приблизно у 2/3 пацієнтів відбувається спонтанний тромболіз, так що через 24 години тромботична оклюзія спостерігається лише приблизно у 30905.

Іноді інфаркт міокарда викликаний артеріальною емболізацією (наприклад, при стенозі мітрального клапана або стенозі устя аорти, інфекційному ендокардиті, і токсичному ендокардиті). Повідомлялося про інфаркт міокарда у пацієнтів при коронарному спазмі та при нормальних за іншими показниками коронарних артеріях. Кокаїн викликає сильний спазм коронарних артерій і у його споживачів може розвинутися викликана кокаїном стенокардія або інфаркт міокарда. Вивчення секційного матеріалу і коронарна ангіографія показали, що викликаний кокаїном коронарний тромбоз може виникнути у нормальних коронарних артеріях або внаслідок складання з передіснуючою бляшкою.

Інфаркт міокарда переважно є захворюванням лівого шлуночка, але пошкодження може поширитися і на правий шлуночок (ВУ) або на праве передсердя. Інфаркт правого шлуночка звичайно виникає через оклюзію правої коронарної або основної лівої артерії, що огинає, і характеризується високим тиском при заповненні правого шлуночка, часто з тяжкою регургітацією тристулкового клапана і зниженим серцевим викидом. Деяка дисфункція правого шлуночка зустрічається приблизно у половини хворих нижньо-задніми інфарктами, приводячи до порушення гемодинаміки у 10-1595.

Здатність серця продовжити функціонувати як насос безпосередньо зв'язана із ступенем пошкодження міокарда.

Трансмуральні інфаркти зачіпають міокард по всій його товщині від епікарда до ендокарда і, як правило, характеризуються на ЕКГ аномальними зубцями 0). Нетрансмуральні, або субендокардіальні, інфаркти не поширюються на всю стінку "тплуночка і викликають аномалії лише сегмента 51 і зубця Т. Субендокардіальні інфаркти зачіпають внутрішню 1/3 міокарда, де натяг стінки найбільший, а кровотік у міокарді найбільш чутливий до змін циркуляції. Вони можуть також йти за тривалою гіпотензією. Оскільки трансмуральну глибину некрозу неможливо точно визначити клінічно, інфаркти краще за все класифікувати за допомогою ЕКГ за наявністю і відсутністю зубця С). Об'єм ураженого міокарда можна оцінити за величиною і тривалістю підвищення вмісту СК.

Іншим захворюванням у рамках ішемічної хвороби серця є ішемічна кардіоміопатія. Цьому стану може передувати інфаркт міокарда, але дане захворювання є наслідком тяжкого коронарного атеросклерозу, який вражає всі основні судинні гілки. Результатом є недостатнє кровопостачання, що приводить до загибелі міоцитів. Втрата міоцитів, зв'язана з фіброзом у вигляді інтерстиціального відкладення колагену, приводить до зменшення еластичності, що поряд з розширенням серця приводить до перевантаження міоцитів, які залишилися. Даний процес продовжується, компенсуючись безперервною гіпертрофією міоцитів. Можлива навіть компенсація за допомогою гіперплазії, а також гіпертрофії, що може пояснити величезний розмір (у 2-3- рази більше нормального) серця. Зрештою, таке серце вже не може компенсувати, і у результаті настає серцева недостатність з аритміями і/або ішемічними нападами. Таким чином, клінічно відмічається повільно прогресуюча серцева недостатність, з інфарктом міокарда або стенокардичним болем або без таких в анамнезі. Ішемічна кардіоміопатія відповідальна не менше ніж за 4095 летальних кінців при ішемічній хворобі серця.

Під час ішемії, а також реперфузії серця, секретуються численні ендогенні медіатори, наприклад, такі як низькомолекулярні вторинні месенджери, які впливають на функцію міокарда. У хвилини ішемічного нападу скорочувальна здатність міокарда знижується, а повне відновлення сили скорочень здебільшого сильно залежить від тривалості ішемічного періоду |Оаєтетп і співавт., 1999). Наприклад, під час ішемічного нападу порушується гомеостаз Са?", генеруються активні форми кисню та відбувається синтез і вивільнення оксиду азоту (МО). Крім того, відбувається також місцева продукція цитокінів, зокрема, ТМРа і І -Ір ІВоїїї, 19901. У непошкодженому серці дані цитокіни здійснюють свій внесок у дисфункцію міокарда, викликану ішемією, індукуючи експресію генів МО-синтази (МОБ), що індукується, |(Оаєтеп і співавт., 1999) циклооксигенази-2 (СОХ-2) і фосфоліпази Аг, а також судинних молекул адгезії та деяких хемокінів. У результаті відмічається негайне пригнічення скорочувальної здатності міокарда, опосередковане низькомолекулярними месенджерами з подальшою цитокін-опосередкованою нейтрофільною інфільтрацією, що ще більше ушкоджує серцевий м'яз. Серця тварин, досліджені за відсутності крові або продуктів крові, виробляють протягом індукованої ішемії ТМЕа І|НегеКом/ї2 і співавт., 1995) і ІС-ІВ. Кардіоміоцити також втрачають скорочувальну здатність внаслідок дії цих ендогенних цитокінів |Меїдгит і співавт., 1998).

Більшість експериментальних даних, що стосуються ТМЕа і 1/-ІВ, які опосередковують дисфункцію міокарда, одержані у дослідженнях на тваринах. Разом з тим, тканини людського міокарда, одержані від пацієнтів, які зазнали деякої операції в умовах штучного кровообігу, вивчають у контрольованих ех мімо умовах

ІСигеміїси і співавт., 1996; Сіємеїапа і співавт., 1997). У цій експериментальній моделі трабекули передсердя людини суспендують у безкровному фізіологічно оксигсенованому буфері і потім моделюють напад ішемії.

Протягом цього часу різко зменшується скорочувальна здатність; коли до даної тканини відновлюють доступ кисню, її скорочувальна здатність повертається, хоча і не повністю (60-7090 зниження), та існує свідчення пошкодження міокарда, що спостерігається по вивільненню креатинкінази (СК) (Сигеміїсп і співавт., 1996;

Сіємєїапа і співавт. 1997). Якщо біологічну активність ТМЕ специфічно нейтралізувати під час ішемії/реперфузії (1/А), то спостерігається краще відновлення скорочувальної здатності, що дозволяє принустити, що активність ендогенного ТМЕ міокарда сприяє скорочувальній дисфункції, обумовленій ішемічним нападом (Саїп і співавт., 19991. баєтеп і співавт. (1999) досліджували тканинне пошкодження внаслідок ішемії з подальшою реперфузією, використовуючи мишачу модель ішемії нирки. Вони показали, що позитивна регуляція МРНК 1-18 нирки співпадає на першу добу після ішемії з активацією каспази-ї1. Згодом мРНК ІЕМ-у їі ІЇ/-12 піддавалися позитивній регуляції на 6 добу після ішемії. Об'єднана, а не роздільна, нейтралізація іп мімо цитокінів 1-12 і І - 18, які індукують ІЕМ-у, зменшує залежну від гамма-ІеМ позитивну регуляцію МНС класів І і ІІ, до ступеню, відповідного такому при нейтралізації ІЕМ-у.

Однак досі не повідомлялося про роль ІІ -18 у розвитку захворювань серця.

В основу даного винаходу покладений той факт, що інгібітор І/-18 істотно поліпшує скорочувальну функцію серця в ішемічній/реперфузійній моделі з посиленою перфузією передсердя міокарда людини.

Інгібування каспази-1 (ІСЕ) також ослаблює зниження скорочувальної здатності після ішемії та рецерфузії.

Крім того, введення інгібітору І/-18 у мишачій моделі інфаркту міокарда приводило до підвищення виживаності та істотного поліпшення функції шлуночка.

Дані дослідження свідчать, що інгібітори І/-18 придатні для лікування"або профілактики дисфункції міокарда.

Тому даний винахід відноситься до застосування інгібітору ІІ -18 для приготування лікарського засобу для лікування і/або профілактики хвороби серця, зокрема, ішемічної хвороби серця і/або серцевої недостатності.

Крім того, даний винахід відноситься до використання експресуючого вектора, який містить кодуючу послідовність інгібітору ІІ-18 для лікування і/або профілактики хвороби серця, з тим, щоб застосувати генно- терапевтичний підхід для доставки інгібітору ІІ -18 у хвору тканину або клітину.

Короткий опис креслень

На Фіг.1 показана дія ІІ -188Р на викликану ішемією дисфункцію скоротності міокарда. (А) Кінетична реакція на ішемічне пошкодження. Після зрівноважування (ед), протягом даного експерименту контрольні трабекули піддають посиленій перфузії в умовах нормальної оксигенації. Трабекули піддають ішемії/реперфузії за відсутності або у присутності І/-18ВР. (Змкг/мл). На вертикальній осі вказане виражене у відсотках зусилля, що розвивається, у порівнянні з початком даного експерименту (початок відліку часу). Ці дані одержані для трабекул окремого пацієнта і показові для способів, що використовуються для обчислення середньої зміни зусилля, що розвивається, за 90 хвилин. (В) Постішемічне зусилля, що розвивається, після нейтралізації І/-18 за допомогою 1-5мкг/мл ІІ -188Р.

Результати представлені у вигляді середньої відсоткової зміни зусилля, що розвивається, відносно С (контролю) після завершення реперфузії (90 хвилин). Числа у дужках відповідають І/-18ВР умкг/мл. М-6. т"р«е0,01 у порівнянні з І/А (ішемія/реперфузія).

Ффіг.2: показує вміст у міокарді білка ІІ -18. Трабекули гомогенізують після 90 хвилин посиленої перфузії в умовах нормальної оксигенації (контроль) або через 45 хвилин після 30 хвилин ішемії (1/А). Від одних і тих же суб'єктів зібрані рівноцінні трабекули. Рівні ІІ -18 вказані на вертикальній осі у пкг/мл. М-4. "р«е0,01.

Фіг.3: показує стаціонарні рівні мРНК 1-18 і І -18ВР у контролі та в ішемічній тканині передсердь. Рівні ЇЇ - 18 і /-188Р визначають за»допомогою АТ-РСВ. Дані характеризують одного суб'єкта (з двох). На А показаний забарвлений бромідом етидію агарозний гель, в якому були розділені продукти ПЛР, а на В представлені результати кількісного аналізу РСТ-продукту у вигляді кратної зміни до контролю (ЗАРОН).

Фіг.4: показує вплив ІСЕ-інгібування на постішемічну скоротність, яка утворюється. Результати виражені у вигляді середньої відсоткової зміни зусилля, що розвивається, по відношенню до контролю (СІ) після ішемії/реперфузії (1/2). Числа у дужках вказують концентрацію ІСЕЇї умкг/мл. М-7. "р«0,01 у порівнянні з 1/8.

Ффіг.5: показує активність тканинної креатинкінази (СК) після І/А. СК виражена в одиницях активності на міліграм маси сирої тканини. Дані експериментальні умови вказані під горизонтальною віссю. Сі! та І/А, М-6;

І--18ВР (5мкг/мл), М-5; ІСЕЇ (10 і 20мкг/мл), М-5 кожний; "р«0,05 у порівнянні з 1І/В.

Фіг.6: показує середню зміну зусилля, що розвивається, трабекул, інкубованих по 1О0мкг/мл протягом 15 хв. перед додаванням ТМРа (1 нг/мл), відносно, взятого за 10095 (п-5), зусилля, що розвивається, після періоду зрівноважування. ТМРа і ІІ -18ВР додають у кожну змінювану ванну.

Фіг.7: показує реакцію трабекул передсердь людини у часі в умовах нормальної оксигенації. Зрілий 1-18 (100 нг/мл) додають до трабекул передсердь протягом 90 хв. експериментального часу. На вертикальній осі вказана середня відсоткова зміна від вихідної лінії зусилля, що розвивається. Вихідну лінію визначають у кінці періоду зрівноважування (не показано). (п-б). "Р«0,05, "Р«0,001 у порівнянні з контролем в одному і тому ж інтервалі та протягом експериментального періоду, що залишився. фіг.8: показує збереження креатинкіназної активності м'язової тканини після впливу І/А, ТМРа (1 нг/мл) і

ТМЕРа (10 мг/мл) ж І/-18ВР. Активність СК виражають в одиницях СК-активності на міліграм" маси сирої тканини. (п--б).

В основу даного винаходу покладений той факт, що інгібітори І/-18 здійснюють сприятливий ефект при захворюваннях серця, зокрема, при ішемічній хворобі серця. Як показано нижче у прикладах, декілька різних інгібіторів І/-18 здійснюють істотний сприятливий ефект на створювану постішемічну скоротність серцевого м'яза.

Крім цього, інгібітор І/-18, перевірений на моделі іп мімо інфаркту міокарда, підвищує виживаність та істотно поліпшує функції шлуночка.

Тому даний винахід відноситься до застосування інгібітору ІІ -18 для приготування лікарського засобу для лікування і/або профілактики захворювання серця.

Відповідно до даного винаходу термін "захворювання серця" охоплює захворювання, що включають дисфункцію даного серця. Звичайно їх називають також серцево-судинними захворюваннями.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу захворювання серця являє собою ішемічну хворобу серця.

Термін "ішемічна хвороба серця", що використовується тут, включає всі можливі види ішемічної хвороби серця, включаючи без обмеження, захворювання, детально описані у розділі "Передумови винаходу", а також серцево-судинні захворювання, зв'язані з ішемічною хворобою серця.

Застосування за даним винаходом дуже підходить для тривалого лікування і, таким чином, особливо застосовне для використання при хронічних захворюваннях серця. Таким чином, у переважному варіанті здійснення даного винаходу ішемічна хвороба серця є хронічною. Стенокардія, або апдіпа ресіогі5, є одним з найбільш звичайних клінічних симптомів у пацієнтів з тривалою історією ішемічної хвороби серця. Ослаблення функції лівого шлуночка після одного або декількох інфарктів міокарда може привести до лівошлуночкової і, у кінцевому результаті, до застійної серцевої недостатності. Тому даний винахід відноситься до застосування інгібітору ІІ -18 для лікування і/або профілактики стенокардії.

У наступному переважному варіанті здійснення даного винаходу ішемічна хвороба серця протікає гостро і, більш переважно, являє собою інфаркт міокарда.

Гострий інфаркт міокарда звичайно включає в себе некроз серцевого м'яза, звичайно лівого шлуночка. Він часто викликаний атеромою коронарної артерії з накладенням тромбу або крововиливом у бляшку. За некрозом йде запальна інфільтрація, вивільнення у кров репаративних ферментів з'єднувальної тканини з некротичного м'яза і лейкоцитоз, які можуть використовуватися для діагностики. Ускладнення гострого інфаркту міокарда включають в себе аритмії, серцеву недостатність, розрив міокарда, що приводить до гемоперикарду, пристінковий тромбоз, який веде до емболії, та аневризму серця. Інші ускладнення включають в себе раптову смерть, аритмії, персистувальний, біль, стенокардію, серцеву недостатність, недостатність мітрального клапана, перикардит, розрив міокарда (шлуночковий біль, відрив міжшлуночкової трабекули або папілярного м'яза), пристінковий тромбоз, аневризму шлуночка, синдром Дреслера (біль у грудях, лихоманка, випоти), емболію легеневої артерії. Лікарський засіб відповідно до даного винаходу можна також використовувати для лікування і/або профілактики цих ускладнень інфаркту міокарда.

В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу захворювання серця являє собою серцеву недостатність. Серцева недостатність являє собою хворобливий стан, при якому серце нездатне перекачувати кров зі швидкістю, необхідною для нормального метаболізму. Майже при всіх формах серцевої недостатності хвилинний серцевий викид знижений, це пов'язано з меншим кровотоком, який називають артеріальним незаповненням. Організм компенсує, утримуючи рідину у збільшеному об'ємі крові. Серцева недостатність може бути гострою або хронічною. На ранніх стадіях клінічні симптоми серцевої недостатності можуть здаватися однобічними, але оскільки міжшлуночкова трабекула (перегородка) є спільною для правого і лівого шлуночка, то неминуче, що недостатність одного шлуночка веде до недостатності іншого. Серцева недостатність може бути зв'язана з ішемічною хворобою серця. Вона може бути обумовлена й іншими причинами, такими як системна гіпертензія, порок клапана серця або легеневе захворювання, яке веде до застійної серцевої недостатності.

Серцева недостатність може бути застійною серцевою недостатністю, яка є симптоматичною дисфункцією міокарда, що приводить до розвитку характерного профілю гемодинамічних, ниркових, і нейрогормональних реакцій. Клінічні виявлення серцевої недостатності можуть бути недостатністю лівого шлуночка або недостатністю правого шлуночка. Серцева недостатність виявляється як систолічна або діастолічна дисфункція або як та й інша. Поєднання систолічної та діастолічної аномалій є звичайним.

Ще в одному переважному варіанті здійснення даного винаходу хвороба серця являє собою кардіоміопатію. Кардіоміопатія являє собою будь-яку структурну або функціональну аномалію шлуночка серцевого м'яза.

Термін "профілактика" у контексті даного винаходу відноситься не тільки до загальної профілактики визначеного ефекту, але також і до будь-якої обмеженої або значної профілактики, до ослаблення, пом'якшення, зниження або зменшення ефекту до його виникнення або на ранніх стадіях.

Термін "лікування" у контексті даного винаходу відноситься до будь-якого сприятливого впливу на перебіг захворювання, включаючи ослаблення, пом'якшення, зниження або зменшення розвитку патологічного стану після виникнення захворювання.

Термін "інгібітор 1/-18" у контексті даного винаходу відноситься до будь-якого тину молекул, які модулюють продукцію ІЇ--18 і/або діють таким чином, що продукція ІЇ/-18 і/або його дія ослаблюється, пом'якшується, або частково, практично, або повністю попереджається або блокується.

Інгібітор продукції може являти собою будь-яку молекулу, яка негативно впливає на синтез, процесинг або дозрівання 1-18. Інгібітори, що розглядаються відповідно до даного винаходу, можуть являти собою, наприклад, |)|зу)гсресррН генної експресії інтерлейкіну ІЇ/-18, антисмислові мРНК, які зменшують або запобігають транскрипції мРНК 1/-18 або приводять до деградації мРНК, білки, що погіршують правильне укладання або частково або істотно запобігають секреції ІІ -18, протеази, які розщеплюють ЇЇ -18, після того як він був синтезований, інгібітори протеаз, що розщеплюють про-І/-18 з одержанням зрілого 1І-18, такі, наприклад, як інгібітори каспази-!1 і т.п.

Інгібітор І/-18 може, наприклад, виступати антагоністом І/-18. Антагоністи можуть або зв'язувати, або секвеструвати саму молекулу І/-18 при достатній спорідненості і специфічності, щоб частково або істотно нейтралізувати ІІ -18 або ділянку(ки) зв'язування ІІ --18, відповідальні за зв'язування ІІ -18 з його лігандами (як, наприклад, з його рецепторами). Антагоніст може також інгібувати сигнальний шлях ІІ -18, який активується у клітинах при зв'язуванні рецептора ІІ -18.

Інгібітори І/-18 можуть також бути розчинними рецепторами І/-18 або молекулами, які імітують такі рецептори, або агентами, що блокують дані рецептори І/-18, або антитілами проти І/-18, такими як поліклональні або моноклональні антитіла, або будь-яким іншим агентом або молекулою, що запобігає зв'язуванню І/-18 з його мішенями, зменшуючи або попереджаючи тим самим запуск внутрішньо- або позаклітинних реакцій, опосередковуваних ЇЇ -18.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу інгібітор ІІЇ-18 вибраний з інгібіторів каспаза-1 (ІСЕ), антитіл проти 1ІІ/-18, антитіл до будь-якої субодиниці рецептора ІІ-18, інгібіторів сигнального шляху ІІ-18, антагоністів І/-18, які конкурують з І/-18 і блокують рецептор ІІ-18, та білків, що зв'язують 1-18, ізоформ, мутеїну, злитих білків, функціональних похідних, активних фракцій або їх кругових переставних похідних, які інгібують біологічну активність ІІ -18.

Термін "білки, що зв'язують 1-18", який використовується тут, синонімічний "білку, що зв'язує 11-18" або "І-18ВР". Маються на увазі білки, що зв'язують ІІ-18, які охарактеризовані у М/О 99/09063 або у Моміск і співавт., 19991, які включають сплайсингові варіанти і/або ізоформи білків, що зв'язують ІІ -18, як вказано у (Кіт і співавт., 2000, які зв'язуються з ІІ -18. Зокрема, застосовними відповідно до даного винаходу є ізоформи а і с

І/-18ВР. людини. Дані білки, застосовні відповідно до даного винаходу, можуть бути глікозильованими або неглікозильованими, вони можуть бути одержані з природних джерел, таких як сеча, або вони можуть бути переважно одержані рекомбінантно. Рекомбінантну експресію можна здійснити у прокаріотичній експресуючій системі, аналогічній Е.соїї, або в еукаріотичній, і переважно - в експресуючих системах ссавців.

Термін "мутеїн", що використовується тут, відноситься до аналогів ІІ-18ВР або до аналогів вірусного ІІ - 188Р, в яких один або декілька амінокислотних залишків природного або вірусного І/-18ВР. замінюються різними амінокислотними залишками або делегуються або ж один або декілька амінокислотних залишків вбудовуються у послідовність нативного І/-18ВР або вірусного І/-18ВР без істотної зміни активності одержуваних продуктів у порівнянні з ІІ -18В8Р дикого типу або вірусного ІІ-18ВР. Дані мутанти одержують за допомогою відомих методик синтезу і/або сайт-направленого мутагенезу або за допомогою будь-якої іншої відомої методики, придатної для цього.

Відповідно до даного винаходу мутеїни включають в себе білки, що кодуються нуклеїновою кислотою, такою як ДНК або РНК, які гібридизуються з ДНК або РНК, що кодують ІІ -188Р або кодують вірусний ІІ -188Р, відповідно до даного винаходу, у жорстких умовах. Термін "жорсткі умови" відноситься до гібридизації і до подальших умов відмивання, які звичайні фахівці у даній області техніки як правило називають "жорсткими".

ІДив. А!изибеї і співавт., Ситепі Ргоїосоі5 іп Моїіесціаг Віоіоду (Сучасні протоколи у молекулярній біології), вище, Іпіегзсіепсе, М.У., 556.3 і 6.4 (1987, 1992 і Батрбгоок і співавт.|, вище. Без обмеження, приклади жорстких умов включають в себе умови відмивання 12-20"С нижче розрахункової Тт даного гібриду при дослідженні, наприклад, в 2х5556 і 0,595 505 протягом 5 хвилин, 2х555 і 0,190 505 протягом 15 хвилин; 0,Іх55С і 0,595 505 при 37"С протягом 30-60 хвилин, а потім - 0,1х550 і 0,595 505 при 68"С протягом 30-60 хвилин. Звичайним фахівцям у даній області техніки очевидно, що жорсткі умови залежать також від довжини ДНК- послідовностей, олігонуклеотидних зондів (таких як 10-40 основ) або змішаних олігонуклеотидних зондів. При використанні змішаних зондів замість 5507 переважно використовувати хлорид тетраметиламонію (ТМАС).

Див.. Аизибеї, вище.

Будь-який такий мутеїн переважно володіє амінокислотною послідовністю, яка у достатній мірі повторює послідовність ІІ -18ВР, або послідовністю, яка у достатній мірі повторює послідовність вірусного ІІ-188Р, такою, що володіє активністю, порівнянною з такою 1ІІ-188Р. Одна активність німого ІЇ/-188Р полягає у його здатності зв'язувати 1-18. Оскільки даний мутеїн володіє істотною зв'язувальною ІІ -18 активністю, він може використовуватися для очищення 1ІІ/-18, як наприклад, за допомогою афінної хроматографії, і, отже, може розглядатися як такий, що володіє істотно подібною активністю до такої ІІ -18ВР. Таким чином, його можна визначити як будь-який даний німий білок, який володіє по суті такою ж активністю, що і ІІ -18ВР, за допомогою звичайного експериментування, яке включає обробку такого німого білка, наприклад, у простому конкурентному " сендвіч-аналізі як наприклад, у радіоїмуцоаналізі або ЕБівВА-аналізі, щоб з'ясувати, зв'язується він з відповідним чином позначеним ЇЇ -18 чи ні.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу будь-який такий мутеїн володіє, щонайменше, 4095-ю ідентичністю або гомологією з послідовністю ІЇ/-18В8Р або з гомологом І/-18ВР, що кодується вірусом, як вказано у ГМО 99/09063|. Більш переважно, він володіє, щонайменше, 5095-ю, щонайменше, 6095-ю,

щонайменше, 7095-ю, щонайменше, 8095-ю, або "найбільш переважно, щонайменше, 9095-ю ідентичністю або гомологією з ним.

Мутеїни поліпептидів І/-18ВР або мутеїни вірусних ІП/-18ВР, які можна використовувати відповідно до даного винаходу, або нуклеїнова кислота, що кодує їх, включає кінцеву множину, істотно відповідних послідовностей, у вигляді заміщених пептидів або полінуклеотидів, які може одержати звичайним способом будь-який звичайний фахівець у даній області техніки без надмірного експериментування, базуючись на представлених тут вказівках і під їх керівництвом.

Переважними змінами мутеїнів відповідно до даного винаходу є ті, які відомі як "консервативні" заміни.

Консервативні амінокислотні заміни у поліпептидах ІІ -18ВР або білках або вірусних ІІ -18ВР, можуть включати синонімічні амінокислоти, у рамках групи, члени якої володіють досить подібними фізико-хімічними властивостями, щоб обмін членів групи зберігав біологічну функцію даної молекули (Сгапіпат, 1974). Ясно, що вставки та делеції амінокислот можна також здійснити у згаданих вище послідовностях без зміни їх функції, особливо, якщо у вставках або делеціях беруть участь лише декілька амінокислот, наприклад, до тридцяти, але переважно до десяти, і не видаляються або не замінюються амінокислоти, які є ключовими для функціональної конформації, наприклад цистеїнові залишки. Білки та мутеїни, одержані за допомогою таких делецій і/або вставок, підпадають під обсяг даного винаходу.

Переважно, синонімічні амінокислотні групи представлені групами, вказаними у Таблиці 1. Більш переважно, синонімічні амінокислотні групи представлені групами, вказаними у Таблиці 2; і найбільш переважно синонімічні амінокислотні групи представлені групами, вказаними у Таблиці 3.

Таблиця 1

Переважні групи синонімічних амінокислот

ТНг ле | Меб Тук, Ріє, Ма), Ге, Не

Рпе

ТУуг

Схіп сі

Таблиця 2

Більш переважні групи синонімічних амінокислот

Таблиця З

Найбільш переважні групи синонімічних амінокислот

Приклади вироблення амінокислотних замін у білках, які можуть використовуватися для одержання мутеїнів поліпептидів ІІ-188Р або мутеїнів вірусних ІІ -188Р, для використання у даному винаході, включають стадії будь-яких відомих способів, які представлені у (патентах США 4959314, 4588585 і 4737462 у Маїк і співавт.; 5116943 у Коїйз і співавт., 4965195 у Матеп і співавт.; 4879111 у Спопа і співавт. і 5017691у 1еє співав.|, а заміни лізину у білках представлені у (патенті США Мо4904584 (Пам і співавт.)|.

Термін "злитий білок" відноситься до поліпептиду, що містить ІІ-188Р або вірусний ІІ -18ВР або мутеїн або його фрагмент, злитий з іншим білком, який, наприклад, володіє тривалим часом циркуляції у рідинах організму. Тому, І-18ВР або вірусний І/-18ВР. можна злити з іншим білком, поліпептидом і т.п., наприклад, імуноглобуліном або його фрагментом.

Термін "функціональні похідні", що використовується тут, включає похідні ІІ -18ВР або вірусного ІІ -188Р, та їх мутеїни або злиті білки, які можна одержати з функціональних груп, що знаходяться у вигляді бічних ланцюгів у залишках, або з використанням відомих у даній області техніки М- або С-кінцевих груп, включених у даний винахід, оскільки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто вони не усувають активність білка, яка практично подібна до активності ІІ/-18ВР, або вірусних І/-148В8Р, і не додають токсичних властивостей композиціям, що містять їх.

Дані похідні можуть, наприклад, включати поліетиленгліколеві бічні ланцюги, які можуть маскувати антигенні ділянки та пролонгувати циркуляцію ІІ -18ВР або вірусного ЛІ-188Р у рідинах організму. Інші похідні включають складні аліфатичні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп внаслідок взаємодії з аміаком або ж з первинними або вторинними амінами, М-ацильними похідними вільних аміногруп амінокислотних залишків, що утворюються 3 ацильними складовими (наприклад, алканоїльні або карбоциклічні ароїльні групи) або О-ацильними похідними вільних гідроксильних груп (наприклад залишками серилу і треоншу), які утворюються з ацильними складовими.

Як "активні фракції" І/-188Р, або вірусного І/-18ВР, мутеїнів або злитих білків даний винахід включає будь-які фрагменти або попередники поліпептидного ланцюга даної білкової молекули, окремо або разом з асоційованими молекулами або залишками, приєднаними до них, наприклад, сахарозними або фосфатними залишками, або з сукупностями білкових молекул або з одними сахарозними залишками, за умови, що вказана фракція володіє практично подібною активністю до ІІ -188Р.

Ще в одному переважному варіанті здійснення даного винаходу інгібітор ІЇ-18 являє собою антитіло проти

І--18 або його рецептора, ІІ-188. Відповідно до даного винаходу можна використовувати антитіла до будь- якої з субодиниць ІІ -188, що називаються ІІ -18Ра і рД.

Відповідно до даного винаходу антитіла можуть бути поліклональними або моноклональними, химерними, гуманізованими, або навіть повністю людськими. Рекомбінантні антитіла та їх фрагменти характеризуються високою спорідненістю до зв'язування з 1ІІ-18 або 1І-188 іп мімо і низькою токсичністю. Антитіла, які можуть використовуватися у даному винаході, характеризують за їх здатністю лікувати пацієнтів протягом часу, достатнього для досягнення хорошої або повної регресії або полегшення хворобливого стану або симптому або групи симптомів, зв'язаних з хворобливим станом, або за їх низькою токсичністю.

Нейтралізуючі антитіла легко одержати у тварин, таких як кролики, вівці або миші шляхом імунізації препаратами ІІ -18 або ІІ -18Ва або вд. Імунізовані миші особливо придатні для створення джерела В-клітин при одержанні гібридом, які, у свою чергу, культивують для одержання великих кількостей моноклональних антитіл проти ІІ -18.

Химерні антитіла являють собою імуноглобулінові молекули, які характеризуються двома або декількома сегментами або частинами, одержаними від різних видів тварин. Як правило, варіабельну ділянку даного химерного антитіла одержують з антитіла відмінного від людини ссавця, такого, наприклад, як, мишаче моноклональне антитіло, а константну ділянку даного імуноглобуліну одержують з молекули імуноглобуліну людини. Переважно, обидві ділянки та їх поєднання володіють низькою імуногенністю, що визначено звичайним способом (БЕПіої і співавт., 1994). Гуманізовані антитіла являють собою імуноглобулінові молекули, створювані генноїінженерними методами, в яких мишачі константні ділянки замінені людськими аналогами константних ділянок, при збереженні мишачих антиген-зв'язувальних ділянок. Одержане химерне «мишаче- людське» антитіло переважно володіє зниженою імуногенністю і поліпшує фармакокінетику у людей ІКпідні і співавт., 19931.

Тому у черговому переважному варіанті здійснення даного винаходу антитіло проти 1І-18 або проти І. -188 є гуманізованим антитілом. Переважні приклади гуманізованих антитіл проти 1-18 викладені, наприклад, в

Європейській Патентній Заявці ЕР 0 974600.

Ще в одному переважному варіанті здійснення даного винаходу дане антитіло є повністю антитілом людини. Техніка одержання людських антитіл детально описана, наприклад, у (МО 00/76310, МО 99/53049,

Патенті США 6162963 або А 53361001.

Перший спосіб одержання повністю людських антитіл складається з "гуманізації" мишачої гуморальної імунної системи, тобто створення ліній мишей, здатних продукувати людський Ід (ксеногенні миші), шляхом введення локусів людського імуноглобуліну (Ід) мишам, у яких дані ендогенні Ід-гени були інактивовані. Ці Ід- локуси є комплексними з точки зору їх фізичної структури і генної перебудови, і процеси експресії необхідні для одночасного одержання широкої імунної відповіді. Спочатку різноманітність антитіл створюється внаслідок комбінаторної перебудови між різними генами, М, О і у, які присутні у цих Ід-локусах. Дані локуси містять також розкидані регуляторні елементи, які контролюють експресію антитіл, алельне виключення, тип переключення та філогенетичну подібність дозрівання. Введення мишам неперебудованих людських Ід- трансгенів показує, що мишачий механізм рекомбінації порівнянний з генами людини. До того ж, гібридоми, які секретують специфічний антиген людських моноклональних антитіл різних ізотипів можна одержати шляхом імунізації антигеном ксеногенних мишей.

Повністю людські антитіла і способи їх створення відомі у даній області техніки (Мепавєз і співавт. (1997);

Виддетапт і співавт. (1991); ТотігикКа і співавт. (2000) Патент УУО 98/248931.

У найбільш переважному варіанті здійснення даного винаходу інгібітор І/-18 являє собою 1ІІ-188Р, або ізоформу, німий білок, злитий білок, функціональне похідне, активну фракцію або її змінене кільцеве похідне.

Дані ізоформи, мутеїни, злиті білки або функціональні похідні зберігають біологічну активність ІІ/-188Р, зокрема, здатність до зв'язування з ІІ-18, і переважно володіють, щонайменше, активністю подібною до ІЇ- 18ВР. Теоретично, такі білки володіють підвищеною біологічною активністю у порівнянні з немодифікованим

І/-188Р.

Переважні активні фракції володіють активністю, яка перевищує активність І -18ВР, або володіють додатковими перевагами, такими як підвищена стабільність або ж знижена токсичність або імуногенність, або їх легше одержати у великих кількостях, або легше виділити.

Послідовності ІЇ-18ВР та їх сплайсовані варіанти/зоформи можна запозичити з (М/О 99/09063 або від

Моміск і співавт., 1999, а також у Кіт і співавт.,2000).

Функціональні похідні І.-188Р можуть бути з'єднані з полімерами з метою поліпшення властивостей білка, таких як стабільність, час напівжиття, біологічна активність, переносимість в організмі людини, або імуногенність. Для досягнення цієї мети І. -18В8Р можна кон'югувати, наприклад, з поліетиленгліколем (РЕС).

Поліетиленгліколізування можна здійснити за допомогою відомих способів, наприклад описаних у (МО 92/13095).

Тому, у переважному варіанті здійснення даного винаходу інгібітори ІІ-18 і, особливо, інгібітори ІІ -188Р, поліетиленгліколізують.

Ще в одному переважному варіанті здійснення даного винаходу інгібітор ІІ -18 включає в себе білок злиття імуноглобуліну, тобто, інгібітор І/-18 являє собою злитий білок, що включає весь або частину білка, який зв'язує ІЇ/-18, що зливається з усім або з частиною імуноглобуліну. Способи створення білків, злитих з імуноглобуліном, добре відомі у даній області техніки, один з них, наприклад, викладений у (МО 01/03737.

Фахівцям у даній області техніки очевидно, що одержання злитого білка даного винаходу зберігає біологічну активність ІІ-18ВР, зокрема, Здатність зв'язування-з І/-18. Злиття може відбуватися безпосередньо або за допомогою короткого лінкерного пептиду, довжина якого може бути дуже короткою у вигляді 1-3 амінокислотних залишків або більше, наприклад, 13-20 амінокислотних залишків у довжину. Вказаний лінкер може являти собою, наприклад, трипептидну послідовність Е-БЕ-М ((с1и-Рпе-Ме), або 13-амінокислотну лінкерну послідовність, що включає Сс1и-Рпе-с1у-АІа-С1у-І еи-МаІ-Геш-спу-с1у-сІп-Рипе-Меї, яка вводиться між послідовністю ІІ-18ВР та імуноглобуліновою послідовністю. Підсумковий злитий білок володіє поліпшеними властивостями, такими як пролонгований час циркуляції у рідинах організму (час напівжиття), підвищена специфічна активність, підвищений рівень експресії, або більш легке виділення очищенням даного злитого білка.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу ІІ-18ВР злитий з константною ділянкою молекули Ід.

Переважно, він злитий з ділянками важкого ланцюга, такими, наприклад, як домени СНО і СНЗ да людини.

Створення специфічних злитих білків, які включають 1ІІ-18ВР і частину імуноглобуліну, описане, зокрема, у прикладі 11 УУО 99/09063. Інші ізоформи молекул Ід також придатні для створення злитих білків відповідно до даного винаходу, такі як Ід: або ІдС4, або інші класи Ід, такі, зокрема, як ІМ або ІдА. Злиті білки можуть бути мономерними або мультимерними, гетеро- або гомомультимерними.

Ще в одному варіанті здійснення даного винаходу інгібітор І/-18 використовують у поєднанні з антагоністом ТМЕ. Антагоніст ТМЕ виявляє свою активність декількома способами. По-перше, антагоністи можуть зв'язувати або блокувати власне молекулу ТМЕ з достатньою спорідненістю і специфічністю, щоб частково або практично повністю нейтралізувати епітоп ТМЕ або епітопи, відповідальні за зв'язування рецептора ТМЕ (які називаються далі "антагоністи, що блокують"). Антагоніст, що блокує, може, наприклад, являти собою антитіло проти ТМ.

Альтернативно, антагоністи ТМЕ можуть інгібувати сигнальний шлях ТМЕ, що активується рецептором клітинної поверхні після зв'язування ТМЕ (які називаються далі "сигнальні антагоністи"). Для терапії або профілактики захворювань серця придатними є обидві групи антагоністів, кожна окремо або разом, у поєднанні з інгібітором ІІ -18.

Антагоністи ТМЕ легко! ідентифікувати і охарактеризувати за допомогою стандартного скринінгу кандидатів за їх впливом на активність нативного ТМЕ у чутливих до нього іп міо лініях клітин, наприклад, у лініях В-клітин людини, в яких ТМЕ викликає проліферацію та секрецію імуноглобуліну. Даний аналіз включає композицію ТМЕ з різним розведенням антагоніста-кандидата, наприклад, в 0,1-100 разів від молярної кількості ТМЕ, що використовується у даному аналізі, і контроль без ТМЕ або тільки з антагоністом (Тиссі і співавт., 19921.

Антагоністи, що блокують, є переважними антагоністами ТМЕ, які використовують відповідно до даного винаходу. Серед антагоністів, що блокують, переважними є поліпептиди, які зв'язують ТМЕ з високою спорідненістю і володіють низькою імуногенністю. Молекули розчинного рецептора ТМЕ і нейтралізуючі антитіла до ТМЕ є особливо переважними. Наприклад, у даному винаході використовують розчинні ТМЕ-ВІ і

ТМЕ-ВІЇ. Неповні форми цих рецепторів, що включають позаклітинні домени рецепторів або їх функціональні частини, є особливо переважними антагоністами відповідно до даного винаходу. Неповні розчинні рецептори

ТМЕ тип | і тип ІЇ, описані, наприклад, в (ЕР 9144311.

Неповні форми рецепторів ТМЕ розчинні і детектуються у сечі та сироватці у вигляді ЗО кДа і 40 кДа зв'язувальних білків, що інгібують ТМЕ, які називають, відповідно, ТМРЕЇ ї ТУРІ (Епде!тапп і співавт., 1990).

Спільне, послідовне або роздільне використання інгібітору ІІ-18 та антагоніста ТМЕ є переважним відповідно до даного винаходу.

Ще в одному переважному варіанті здійснення даного винаходу розчинний ТМЕ-ВІ (ТВРІ) людини являє собою антагоніст ТМЕ, який використовують відповідно до даного винаходу. Нативні та рекомбінантні розчинні молекули рецептора ТМЕ і способи їх одержання були описані в |Європейських Патентах ЕР 308378, ЕР 398327 і ЕР 4339001.

Похідні, фрагменти, ділянки і біологічно активні частини рецепторних молекул функціонально подібні до визначених рецепторних молекул, які можна також використовувати у даному винаході. Такий біологічно активний еквівалент або похідне рецепторної молекули відноситься до частини поліпептиду, або до послідовності, що кодує рецепторну молекулу, яка володіє достатнім розміром і здатністю зв'язувати ТМЕ з такою спорідненістю, що взаємодія рецептора ТМЕ, зв'язаного з мембраною, інгібується або блокується.

Інгібітор І.-18 можна використовувати одночасно, послідовно, або роздільно з інгібітором ТМЕ.

Відповідно до даного винаходу даний лікарський засіб може додатково включати відомі агенти, що використовуються при лікуванні захворювань серця, такі як нітрати, наприклад, нітрогліцерин,, діуретики, інгібітори ЕСТ, дигіталіс, бета-блокатори, або блокатори кальцієвих каналів, у поєднанні з інгібітором ІІ -іб. Ці активні компоненти можуть використовуватися одночасно, послідовно, або роздільно.

Ще в одному переважному варіанті здійснення даного винаходу інгібітор ІІ-18 використовують у кількості близько 0,001-100мкг/кг або близько 1-1Омг/кг або 2-5мг/кг.

Відповідно до даного винаходу інгібітор І/-18 переважно вводять системно, і переважно підшкірно або внутрішньом'язово.

Крім того, даний винахід відноситься до використання експресуючого вектора, який включає кодуючу послідовність інгібітору ІІ-18, для одержання лікарського засобу, застосовного для профілактики і лікування захворювання серця. Таким чином, розглядається генотерапевтичний метод по доставці інгібітору ІІ -18 у ділянку, де він необхідний. Для того щоб лікувати і/або попереджувати захворювання серця, генотерапевтичний вектор, що включає послідовність інгібітору І/-18 можна, наприклад, ін'єкувати безпосередньо у дану хвору тканину, уникаючи тим самим труднощів, пов'язаних з системним введенням генотерапевтичних векторів, на зразок розведення цих векторів, що досягають і Жіїішенують клітини-мішені або тканини-мішені, і побічних ефектів.

Використання вектора для стимуляції і/або посилення ендогенного утворення інгібітору ЕЇ -18 у клітині, яка звичайно не експресує інгібітор ІІ-18, або експресує недостатню кількість даного інгібітору, також відповідає меті даного винаходу. Вектор може включати регуляторні послідовності, що функціонують у даній клітині, яка передбачає експресу вати інгібітор або ІІ -18. Такі регуляторні послідовності можуть, наприклад, являти собою промотори або енхансери. Потім дану регуляторну послідовність можна інтродукувати у належний локус даного геному за допомогою гомологічної рекомбінації, приєднуючи таким чином дану регуляторну послідовність до вказаного гена шляхом зшивання, експресію якого необхідно індукувати і посилити. Звичайно дану технологію називають "Активація ендогенного гена" (ЕСА), і вона описана, наприклад, у (ММО 91/09955).

Фахівцям у даній області техніки потрібно мати на увазі, що експресію 1-18 можна повністю зупинити, без використання інгібітору І/-18, за допомогою одного і того ж методу. Щоб зробити це, у генний локус ЦІ-18 можна ввести, наприклад, негативний регуляторний елемент, наприклад, сайленсер, знижуючи таким чином регуляцію або запобігаючи експресії ІЇ-18. Фахівцям у даній області техніки потрібно мати на увазі, що така знижена регуляція або глушіння експресії І/-18 володіє тим же ефектом, що і використання інгібітору 1І-18 з метою профілактики і/або лікування захворювання.

Крім того, даний винахід відноситься до використання клітин, які були генетично модифіковані, для одержання інгібітору 1-18 при виготовленні лікарського засобу, застосовного для лікування і/або профілактики захворювання серця.

Інгібітор 1-18, що використовується відповідно до даного винаходу, можна переважно вводити у вигляді фармацевтичної композиції, необов'язково у поєднанні з терапевтично ефективною кількістю інгібітору ТМЕ.

І-18ВР та його описані вище ізоформи, мутеїни, злиті білки, функціональні похідні, активні фракції або кругові переставні похідні є переважними інгредієнтами фармацевтичних композицій.

Визначення "фармацевтично прийнятний" має на увазі включення будь-якого носія, який не перешкоджає ефективній біологічній діяльності активного компонента, і який не є токсичним для хазяїна, якому він вводиться. Наприклад, для парентерального введення можна приготувати активний(ї) білок(и) у вигляді дозованої одиниці для ін'єкції на основі, наприклад, фізіологічного розчину, сироваткового альбуміну або розчину Рінгера.

Активні інгредієнти даної фармацевтичної композиції, відповідно до даного винаходу, можна ввести індивідуально різними способами. Шляхи введення включають внутрішньошкірний, черезшкірний (наприклад, для повільного вивільнення композицій), внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, пероральний, внутрішньочерепний, епідуральний, місцевий, та інтраназальнщ шляхи. Можна використати будь-який інший ефективний шлях введення, наприклад поглинання через епітеліальну або ендотеліальну тканину або генотерапевтичним шляхом, при якому пацієнту вводять ДНК-молекулу (наприклад, за допомогою вектора), яка кодує даний активний агент, що примушує введений активний агент експресуватися і секретуватися іп мімо. Крім того, відповідно до даного винаходу буюк(и) можна вводити разом з іншими компонентами біологічно активних агентів, таких наприклад, як фармацевтично прийнятні поверхнево-активні речовини, наповнювачі, носії, розріджувачі та засоби доставки.

Для парентерального введення (наприклад, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового) активний білок(и) можна скласти у вигляді розчину, суспензії, емульсії або ліофілізованого порошку з фармацевтично прийнятним парентеральним засобом доставки (наприклад, води, фізіологічного розчину, декстрозного розчину) і з домішками, які підтримують ізотонічність (наприклад, маніт) або хімічну стабільність (наприклад, консерванти і буфери). Складену композицію стерилізують за допомогою методів, які звичайно використовуються.

Відповідно до даного винаходу біодоступність активного білка(йів) можна також поліпшити шляхом використання методів приєднання, за допомогою яких підвищують час напівжиття його молекул в організмі людини, приєднуючи, наприклад, дану молекулу до поліетиленгліколю, як описано у (Патентній Заявці РСТУ/О 92/13095).

Терапевтично активні кількості активного білка(ів) залежать від багатьох змінних, включаючи вид антагоніста, спорідненість антагоніста проти ІЇ/-18, і залишкову цитотоксичну активність, яка виявляється даними антагоністами, шлях введення, клінічний стан пацієнта (у тому числі бажана підтримка нетоксичного рівня ендогенної активності ІІ -18). "Терапевтично ефективна кількість" складає таку кількість, яка вводиться, що при її введенні інгібітор ІІ -18 пригнічує біологічну активність І/-18. Доза, що вводиться, для одноразового або багаторазового прийому індивідом варіює у залежності від різних факторів, включаючи фармакокінетичні властивості інгібітору 11-18, шлях уведення, стан пацієнта і його дані (стать, вік, маса тіла, життєздатність, об'єм), тривалість симптомів, супровідне лікування, частоту лікування та очікуваний ефект. Узгодження і процедура вибору діапазону доз знаходиться у межах можливостей фахівців у даній області техніки, а також способів іп мйго та іп мімо, що визначають ступінь інгібування ІІ -18 для індивіда.

Відповідно до даного винаходу інгібітор ІЇ/-18 використовують у кількості близько 0,001-10Омг/кг або близько 0,1-10мг/кг маси тіла, або близько 0,1-5мг/кг маси тіла, або близько 1-Змг/кг маси тіла, або близько 2мг/кг маси тіла.

Шлях введення, який є переважним відповідно до даного винаходу, являє собою підшкірний шлях введення. Відповідно до даного винаходу переважним є також внутрішньом'язове введення. Для того щоб ввести інгібітор І-18 безпосередньо у визначене місце його дії, його можна також ввести місцево.

В інших додаткових переважних варіантах здійснення даного винаходу інгібітор ІІ-18 вводять щодня або через день.

Щоденні дози звичайно вказують у вигляді розчленованих доз, для уповільненого вивільнення, що є ефективним для одержання бажаних результатів. Друге або наступне введення можна здійснити у тій же дозі, меншій або більшій від початкового або попереднього введення даному індивіду. Друге або наступне введення можна здійснити під час даного захворювання або перед його початком.

Відповідно до даного винаходу інгібітор 1-18 можна вводити індивіду з профілактичною або терапевтичною метою у терапевтично ефективній кількості до, одночасно або після інших терапевтичних схем або агентів (наприклад, множинних лікарських схем), зокрема, разом з інгібітором ТМЕ і/або іншим кардіозахисним агентом. Активні агенти, які вводять одночасно з іншими терапевтичними агентами можна вводити у складі одних і тих же або різних композицій.

Даний винахід відноситься також до способу одержання фармацевтичної композиції, що включає змішування ефективної кількості інгібітору ІІ -18 і/або антагоніста ТМЕ з фармацевтичним прийнятним носієм.

Даний винахід відноситься також до способу лікування захворювання серця, що включає введення пацієнту, який потребує цього, фармацевтично ефективної кількості інгібітору ІІ -18, необов'язково у поєднанні з фармацевтично ефективною кількістю антагоніста ТЕ.

Тепер, володіючи повним описом даного винаходу, фахівцям у даній області техніки потрібно взяти до уваги, що його можна здійснювати у широкому діапазоні еквівалентних параметрів, вмісту і умов, не виходячи за рамки суті і обсягу даного винаходу і без надмірного експериментування.

Хоча даний винахід описаний у зв'язку зі специфічними варіантами його здійснення, потрібно мати на увазі, що він може бути підданий додатковим модифікаціям. В даній заявці передбачене включення будь-яких змін, призначень або переробок даного винаходу і у тому числі таких відхилень від даної суті винаходу, що знаходяться у межах відомої або звичайної практики, до якої відноситься даний винахід і які можуть бути застосовані до істотних ознак, сформульованих вище, також як і у рамках наведеної нижче формули винаходу.

Всі приведені тут посилання, включаючи журнальні статті і реферати, онубліковані або неонубліковані у патентних заявках США або в іноземних патентних заявках, виданих у США, або в іноземних патентах, або будь-які інші посилання, повністю включені тут шляхом посилання, включаючи всі дані, таблиці, малюнки і текст, представлені у посиланнях, що цитуються. Крім того, повний зміст посилань у рамках посилань, які цитуються тут, також повністю включений шляхом посилання.

Посилання на відомі стадії способу, стадії традиційних способів, на відомі способи або на традиційні способи не є яким-небудь визнанням факту розкриття будь-якого аспекту, опису або варіанту здійснення даного винаходу, повідомленого або підтвердженого у даній області техніки.

Викладений вище опис специфічних варіантів здійснення даного винаходу настільки повно розкриває загальну природу даного винаходу, що інші, застосовуючи знання фахівця у даній області техніки (у тому числі і зміст процитованих тут посилань), можуть легко модифікувати і/або адаптувати різне застосування таких специфічних варіантів здійснення даного винаходу без надмірного експериментування, не виходячи за рамки основної концепції даного винаходу. Тому мається на увазі, що такі адаптації та модифікації є еквівалентами викладених варіантів здійснення даного винаходу, які базуються на представлених тут вказівках і загальній орієнтації. Потрібно мати на увазі, що формулювання, які використовуються тут,/ або термінологія призначені для цілей опису і не обмежуються, так що термінологія або формулювання даного опису можуть інтерпретуватися фахівцями у даній області техніки у світлі представлених тут вказівок і загальної орієнтації та відповідно до знань звичайних фахівців у даній області техніки.

Приклади

Приклад 1: Інгібування ІІ -18 зменшує ішемічну дисфункцію міокарда іп мйго

Матеріал і методи Реагенти

Ізоформу ІІ/-188Р експресують з М-кінцевою міткою (Нів)є в оваріальних клітинах китайського хом'ячка і виділяють очищенням до гомогенності. Здатність ІІ-18ВР-(Ніз)є нейтралізувати І/-18 була описана (Кіт і співавт., 2000). Інгібітор ІСЕ (ІСЕЇї) Ас-Тгу-МаІ-АіІа-Азр-хпорМегайїкКетоОнН (УМА) одержують від Аїехів/

Віоспетіса!з (Зап Оієдо) і розчиняють у ОМ5О до 10 мг/мл. Перед використанням ІСЕЇ розбавляють розчином

Тугоде5. У моноядерних клітинах периферичної крові людини ІСЕі зменшує індуковану ендотоксином секрецію зрілого ІІ -ІВ на 9295, що виміряно в ЕГІБА (Сівігоп Віоїтесппоіоду, Ріпе Вгоок, М).

Виділення трабекул передсердь

Пацієнти, які піддаються операції вибіркового шунтування коронарної артерії, з використанням насоса- оксигенатора, потребують введення канюлі у праве передсердя. У цей момент звичайним способом вирізають і відкладають невеликий сегмент вушка правого передсердя. З цієї відкладеної тканини одержують трабекули.

Тканину передсердь людини поміщають в огксигенований буферний розчин Тугоде5 при 4"С. Модифікований розчин Тугодез готують щодня на деїіонізованій дистильованій воді, що містить 5 моль/літр Ю-глюкози, 2,0 моль/літр Сасі112, 118,0 моль/літр Масі, 4,0 моль/літр КСІ, 1,2 моль/літр Ма5О4-7Н2О, 25 моль/літр Мансо», і ІД моль/літр МанНгРО»х. Вільний від субстрату розчин Тугоде5 містить 7 моль/літр холінхлориду для підтримки осмотичного тиску. Якщо не вказано інакше, хімікалії та реагенти одержують від бідта. Дві-чотири трабекули (4-7мм довжиною і «1,0мм у діаметрі) приєднують до динамометричного датчика і занурюють у нагріту (37"С)

ЗОмл термостатовану ванну з модифікованим- розчином Тугоде5; під час погптохіа пронускають у вигляді бульбашок суміш з 92,595 О2/7,595 СО». Дана газова суміш створює парціальний тиск О22350 мм рт.ст. (іІмм рт.ст.-133Па), парціальний тиск СО» 36-40 мм рт.ст., і рН 7,35-7,45. Кожний параметр контролюють звичайним способом за допомогою автоматичного газового аналізатора крові. В експерименті температуру органу у термостатованій ванні підтримують на рівні 37"С. Під час моделювання ішемії вказану газову суміш перемикають на суміш, що містить 92,595 М2/7,59ою СО». Дана суміш створює парціальний тиск Ог«50мм рт.ст.

Вказаний буферний розчин змінюють кожні 20 хв. за винятком 30 хв. періоду моделювання ішемії.

План експерименту

Трабекули зрівноважують протягом 90хв. для збільшення базової скоротності до 1000мг і одержану скоротність стабілізують. Трабекули, скоротність яких складає трохи більше 250мг, виключають з дослідження.

Під час 9Охв. зрівноважування кардіостимуляцію здійснюють за допомогою платинових електродів (Наадпоїї

СЧав5, Мопгоміа, СА) в області стимуляції. Платинові електроди поміщають на будь-яку сторону трабекул, стимулюють (Стазз 509 віїтшиаюг, Уапгміск, ВІ) бмс імпульсами при напрузі на 2095 вище порогу, і протягом погтохіа задають крок в 1Гц, а протягом ішемії - в ЗГц. Скорочення відстежують за допомогою динамометричних датчиків (Сгазз ЕТО3) і реєструють за допомогою комп'ютеризованого передпідсилювача і цифрового датчика (Масіар Оцай Вгідде, Масіар/ве, АЮ Іпвіпитепів, МіМога, МА) і безперервно відстежують за допомогою комп'ютера фірми Макінтош.

Після зрівноважування трабекули окремого пацієнта досліджують у трьох експериментальних умовах: контрольні умови включають 9Охв. нормальної оксигенації при посиленій перфузії; /А включає ЗОхв. модельовану ішемію з подальшою 45хв. реперфузією; і третя умова включає антицитокіновий вплив. В останньому випадку антицитокін додають у термостатовану ванну з посиленою перфузією якраз перед початком ішемії і він присутній протягом 45хв. реперфузії.

Збереження активності КК трабекул

По закінченню тканинної реперфузії визначають КК-активність, як описано (Каріап і співавт., 1993).

Тканини гомогенізують у 100 об'ємах крижаного ізотонічного буфера для екстракції (СіеємеЇапа і співавт., 1997,

Каріап і співавт., 1993). Даний аналіз здійснюють за допомогою набору для КК (Зідта) з використанням автоматичного спектрофотометра. Результати представлені у вигляді одиниць активності КК на мг (маса сирої тканини).

Виділення РНК і зв'язана ревертазна ПЛР

Свіжовиділені трабекули гомогенізують у Тіі-Веадепі (МоІесшаг Везеагсі Сепіег, Сіпсіппаїй), а тотальну

РНК виділяють за допомогою екстрагування хлороформом і осадження ізопропанолом. Виділену. РНК розчиняють у водному дієтилпірокарбонаті, обробляють ДНКазою і визначають кількісно з використанням

СепеОицапі (Атегепат РІапгтасіа Віоїесі). КкДНК-ові способи описані (Негпіком і співавт., 20001. У кожній ПЛР використовують наступну послідовність операцій: попереднє нагрівання при 95"С протягом 15хв., з подальшими циклами 94"С протягом 40сек., 55"С протягом 45 сек, і 72"С протягом 1 хв., з фазою завершального подовження при 72"С протягом 1О0хв. Оптимальне число циклів визначене у кількості 35.

Приведені праймери для гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (САРОН) і 1-18 людини (Вегпіком і співавт., 20001, а також для ІЇ-18В8Р. людини (Кіт і співавт., 2000Ї1. Одержані продукти ПЛР розділяють у 1,595-ному агарозному гелі, що містить 0,5хТВЕ (50мМ Трис/45мМ борна кислота/0,5мММ ЕДТА, рН 8,3) та етидійбромід у кількості О0,5мг/мл, візуалізують шляхом опромінення УФ, і фотографують. Денситометрію здійснюють по негативному зображенню ((ІМАСЕОШАМТ зопмаге, МоіІесшаг бупатісв), а відносну поглинальну здатність ПЛР- продуктів ІІ -18 і І -18В8Р уточнюють проти поглинання, одержаного для САРНО.

Визначення 1-18

Свіжоодержані трабекули гомогенізують як вказано вище для вимірювання КК. ІЇ/-18 аналізують за допомогою рідкофазової хемілюмінесценції (ЕСІ,, Ідеп. Сайпегзриго, МО). Мишачі антитіла проти ІІ -18 людини (850 Ббувіетв) мітять за допомогою рутенію (Ідеп). Крім того, виділені очищенням по спорідненості козячі антитіла проти 1-18 людини (НУО) мітять біотином (Ідеп). Одержані біотинільовані антитіла розбавляють до кінцевої концентрації 1мкг/мл у РВЗ5 (рН 7,4), що містить 0,2595 В5А, 0,595 Твін-20, і 0,0195 азиду (ЕСІ -буфер).

В аналітичній пробірці при кімнатній температурі преінкубовують 25 мкл біотинільованих антитіл з 25мМкл покритих стрептавідином парамагнітних намистинок (Ббупаї, Сїгеаї Меск, МУ) у концентрації 1 мкг/мкл протягом

ЗОохв. при енергійному струшуванні. Зразки (25мкл), що тестуються, або стандарти вносять у пробірки слідом за 25мкл мічених рутенієм антитіл (кінцева концентрація 1 мкг/мкл, розбавлена ЕСІ-буфером). Потім ці пробірки струшують протягом 24год. Дану реакцію заглушують додаванням 200мкл РВ5 на пробірку і в аналізаторі Огідеп Апаїугег (Ідеп) кількісно визначають хемілюмінесценцію. Межа виявлення для ІІ -18 складає 16бпкг/мл.

Софокальна мікроскопія

Тканину передсердя людини, одержану під час введення канюлі насоса-оксигенатора, поміщають у пластиковий 1 см-вий тримач (МеїЇдгит і співавт., 1998), і заморожують у середовищі для заморожування тканин (Тпапдіє Віотеаіса! Зсіепсе5, Оигпат, МС) в ізопентані, що охолоджується сухим льодом. Заморожені зрізи нарізають у кріостаті Іеіса СМ 1850 (Іеїса, Оєепівій, І). Зрізи на предметних скельцях фіксують протягом 10 хв. у 4956-му параформальдегіді, висушують на повітрі, та інкубують протягом 20 хв. у РВ5 з додаванням 1095 нормальної козячої сироватки крові. Зрізи інкубують у розбавлених 1:100 антитілах проти ІЇ- 18 людини (Рергоїесі, Носку НіїЇЇ, МУ) або неімунних ІдС;: кролика при концентрації 1мкг/мл як негативний контроль. Ці антитіла розбавляють у РВ5, що містить 195 В5А. Після інкубації протягом ночі при 4"С інкубовані зрізи тричі промивають за допомогою 0,5 В5А у РВ5. Потім промиті зрізи інкубують у темряві при кімнатній температурі протягом 60 хв. з кон'югованими з АІеха488 (МоїІесшаг Ргорез) вторинними козячими антитілами проти кролячих антитіл. Ядра забарвлюються бісбензимідом (Зідта) при 1 мкг/100 мл у блакитний колір. Після забарвлювання зрізи промивають і переглядають у співфокусній лазерній системі, що сканує, з подальшим аналізом у комп'ютері з використанням програми 5БІ'ІОЕВООК для комп'ютера Макінтош (ІпіеПдепі Іптадіпд

Іппомайіопз, Оепмег).

Статистичний аналіз

Дані представлені у вигляді середніх 5 5ЕМ. Середню зміну для зусилля, що розвивається, розраховують відносно контрольного значення протягом 90 хв. для кожної тканини пацієнта. Статистичну значимість відмінностей між групами визначають за допомогою факторного дисперсійного аналізу АМОМА з подальшим

Вопіеітопі"Оипп-аНа)іїзоМ. Статистичні підрахунки здійснюють за допомогою програми 5ТАТ-МІЕМУ 4,51 (Арбасив Сопсерів, СаІаразав, СА).

Результати

Ефект нейтралізації ендогенного ІІ -18 та ІІ -188Р на створення постішемічної скоротності

На Фіг.1А представлена кінетична відповідь трабекул на І/А-пошкодження. Показано завершальне 15хв. зрівноважування і 100956-а нормалізація на початок експериментального періоду. Під час експерименту в умовах нормальної оксигенації контрольні трабекули піддаються посиленій перфузії. Для контрольних трабекул показане зниження (1095) у скоротності. Трабекули, що піддаються ішемії, швидко погіршують скорочувальну функцію; при реперфузії сила скорочення відновлюється, приблизно, на 25905 від скоротності, що створюється у контролі. Навпаки, трабекула піддана ішемії, але у присутності ІІ-18ВР, відновлюється на 55905 від скоротності, що створюється у контролі. Щоб визначити І/АВ-відповідь тканин серця від декількох пацієнтів, рівень створення скоротності для контрольних трабекул протягом 9Охв. беруть за 10095 для кожного зразка пацієнта і розраховують відносну відсоткову зміну для створення скоротності в експериментальних групах.

Як показано на Фіг.1В постішемічна скоротність, що створюється, для необроблених трабекул (1/8) знижується, у середньому, на 3595 від контролю. Однак у присутності І/-18ВР це зниження зменшується, відповідно, у середньому на 66,295 від контролю при і1мкг/мл, і на 7695 при 5мкг/мл. Дані результати підтверджують, що І/А приводить до вивільнення біологічно активного ІЇ/-18 після процесингу ендогенного попередника І/-18 за допомогою ІСЕ. Тому, І/-18 вимірюють у свіжоодержаній тканині передсердя. Як показано на Ффіг.2 у трабекулах, одержаних перед введенням канюлі насоса-оксигенатора у праве передсердя, представлений базисний ІІ -18. Через 90 хв. зрівноважування, 30 хв. ішемії, і 45 хв. реоксигенації трабекули гомогенізують і визначають рівень ІІ--18. Відмічено 4,5-разове збільшення ІІ -18 у даній тканині після 1/А (Ффіг.2).

У цих тканинах визначають також постійні рівні МРНК для 1-18 і 1 -18ВР. У свіжоодержаних гомогенатах передішемічного передсердя спостерігається основна генна експресія 1І/-18 і І/-18ВР (Фіг.ЗА, В). Поряд з підвищенням рівня ІІ -18-білка І/А індукує також стійке збільшення рівнів мРНК 1-18 (4,7-разове збільшення).

Генна експресія І/-18ВР. спостерігається також у свіжоодержаній тканині передсердя і збільшується лише обмежено після 1/А (у 1,3 рази).

Виявлення ЕЇ -18 м міокарді людини

Оскільки і білок ІІ -18, що виміряно за допомогою ТОЇ, і мРНК 1-18 присутні у свіжоодержаних гомогенатах міокарда, для визначення знаходження /1/-18 використовують гістохімічне забарвлювання. Тканини передсердя одержують безпосередньо перед введенням канюлі насоса-оксигенатора і зразу миттєво заморожують (не показано). ІІ -18 спостерігають в осідлих макрофагах міокарда та у судинних ендотеліальних клітинах. І/-18 у макрофагах і в ендотеліальних клітинах присутній перед будь-яким зв'язаним з ішемією процесом за відсутності контакту з будь-якою нужорідною поверхнею. Дані про локалізацію 1-18 в осідлих макрофагах і в ендотеліальних клітинах узгоджуються з попередніми дослідженнями конститутивного заздалегідь створеного попередника 1-18 у свіжоодержаних периферичних людських моноцитах від здорових пацієнтів (Ригеп і співавт., 1999). Тому можна зробити висновок, що заздалегідь створений попередник ІІ -18 існує у міокарді пацієнта, з ішемічною хворобою серця, якого запланували на коронарне шунтування.

Вплив ІСЕ-інгібування на створювану постішемічну скоротність

Оскільки І/-188Р. ефективно ослаблює викликану ішемією дисфункцію міокарда, автори припускають, що інгібування перетворення заздалегідь сформованого попередника 1-18 у зрілий 1/-18 буде також ослаблювати викликану ішемією дисфункцію міокарда. Тому, специфічний інгібітор ІСЕ МУАО додають у термостатовану ванну з посиленою перфузією до виникнення ішемії. Інгібування ІСЕ здійснюють шляхом безперервного додавання УМАЮО у період ішемії і протягом відновлення кровотоку. УМАЮО-опосередковане інгібування ІСЕ приводить до ослаблення викликаної ішемією дисфункції міокарда, що показано внаслідок поліпшення скорочувальної функції з 3595 у контролі для І/А до 6095 при 1Омкг/мл і 75,895 при 20мкг/мл (Фіг.4).

Ці результати підтверджують, що біологічно активний 1-18 у людському міокарді є результатом розщеплення заздалегідь створеного попередника 1-18 за допомогою ІСЕ. Крім того, дані результати підтверджують, що ішемія міокарда може активувати латентний ІСЕ.

Збереження клітинної життєздатності

Внутрішньоклітинні рівні КК використовують для оцінки ступеня клітинної життєздатності після І/А. У даному аналізі найбільшому значенню КК відповідає більша кількість життєздатних клітин. Кожний вплив антицитокіну зберігає клітинну життєздатність. Як показано на Фіг.5, інгібування І/-188Р- та ІСЕ- (10 і 20мкг/мл) підвищує внутрішньоклітинні рівні КК після І/А з 1,399 до, відповідно, 5,921, 5,675, 6,624, і 4,662 одиниць активності КК на мг (сирої тканини). Ці спостереження підтверджують, що інгібування індукованої І/А активації ІІ -18 зберігає життєздатність клітин міокарда у даній ех мімо-моделі.

Вплив нейтралізації ТМРа-індукованої функції міокарда

Як показано на Фіг.б6, зусилля (ОБ), що розвивається, трабекул було знижено на 1895 після 90 хвилин впливу екзогенного ТМРа. Нейтралізація дії ендогенного 1-18 на скорочувальну функцію людського міокарда, що експонується з екзогенним ТМРа, шляхом інкубації з І -18ВР протягом десяти хвилин перед додаванням

ТМРа, знижує величину ослаблення зусилля (ОБ), що розвивається, див. Фіг.б6. Через 90 хвилин зусилля, що розвивається, у контрольній групі було зменшене на 1895, тоді як для трабекул, експонованих з ТМРа, воно зменшилось на 58595 у порівнянні з контролем. Однак, для трабекул, експонованих з ТМРа і з ІІ -18ВР зусилля, що розвивається, ослабло лише на 3095 у порівнянні з контролем. Ці дані підтверджують, що пряма пригаічувальна дія ТМЕа на скоронувальну здатність міокарда опосередковується, щонайменше частково, біологічно активним ендогенним ІІ--18.

Вплив екзогенного ЕЇ -18 на скоротність, що створюється

Далі визначена пряма дія екзогенного І/-183 на скорочувальну функцію міокарда. ІЇ/-18 додають до трабекул при посиленій перфузії після 90 хвилин зрівноважування і при кожній зміні термостатованої ванни.

Як показано на фіг.7, дія І -18 протягом експериментального періоду веде до повільного, але поступового зниження зусилля, що розвивається. Після 90 хвилин безперервного витримування з ІЇ/-18 зусилля, що розвивається, знижується на 4295. Ці дані свідчать, що екзогенний 1-18, подібно до ТМРа, діє на міокард як депресант.

Цікаво, що 1-18 не є сильним депресантом міокарда як це властиво ТМга.

Збереження клітинної життєздатності

Каспази часто асоціюються з апоптозом. Щоб оцінити життєздатність клітин трабекул, експонованих у

ТМЕРа, вимірюють внутрішньоклітинну КК їх тканини. У даному аналізі високі рівні КК служать ознакою життєздатності клітин. Як зображено на Ффіг.8, контрольні трабекули, які протягом 90 хвилин піддаються посиленій перфузії в умовах нормальної оксигенації, містять 68012276 одиниць активності КК на міліграм маси сирої тканини. На противагу цьому, трабекули, піддані 30/45-хвилинному І/А пошкодженню або 90-хвилинному впливу ТМЕРа виявляють знижені рівні збереженої КК, відповідно, 32463217 одиниць/мг. Трабекули, витримані з

ТМГа у присутності ІІ -188Р, містять 56052212 одиниць/мг тканини. Цікаво зазначити, що трабекули, оброблені

ТМЕа зберігають більш високі рівні КК у порівнянні з І/А-трабекулами. Це було несподіваною знахідкою, оскільки величина зусилля, що розвивається, у кінці експериментального періоду виявилася аналогічною для /вА і тМга.

Приклад 3: 1І/-188Р захищає від інфаркту міокарда І/-18ВР іп мімо Внутрішньом'язове іп умімо- електроперенесення мишачої плазміди, яка експресує ІІ -18.

Мишей С578І/6 одержують з З-тижневим інтервалом, ін'єкують З рази експресуючою плазмідою, яка містить КДНК 1/-188Р. (що називається реДнНК-І.-188Р і описана у (МО 01/85201Ї). Контрольних мишей ін'єкують контрольною пустою плазмідою. Мишачу ізоформу ІІ/-18В8Р. КДНК, виділену як описано (допоміжний номер Ж 0920ОМО) |Кіт і співавт., 2000), субклонують в ЕсоВі/МоїІ-сайт експресуючого вектора, редДНКЗ клітини ссавця під контролем , цитомегаловірусного промотору (Іпмігодеп). Контрольна плазміда була аналогічної конструкції за винятком терапевтичної КкДНК. Контрольна група містила 31 мишу, а експериментальна група, яка одержує ІІ-18ВР, включала 27 мишей.

Контрольну експресійну плазміду, або експресійну плазміду з 1І/-18ВР, (60 мкг), ін'єкують і у великогомілковий, і у черепний м'яз анестезованих мишей, як описано раніше |Маїа;ї і співавт., 1999). Коротко, черезшкірні електричні імнульси (8 прямокутних імнульсів 200 В/см, тривалістю 20мс при 2Гц) видаються за допомогою мультивібратора Р5-15 (Сепеїгопіс, Егапсе) і з використанням двох електродів у вигляді пластин з нержавіючої сталі на відстані одна від одної 4,2-5,3мм з кожної сторони лапки.

Індукція інфаркту у лівому шлуночку

Через двадцять чотири години після введення плазміди ІІ -188Р або нустої плазміди, мишей анестезують за допомогою ІР-ін'єкції ксилазину або кетаміну, підключають до зовнішнього дихання і піддають торакотомії.

Використовуючи 8-0 пролен (довгий) шовний матеріал, надовго перев'язують ліву магістральну коронарну артерію з тим, щоб викликати інфаркт міокарда, після чого закривають грудну клітку і тварин залишають прокинутися від анестезії. Загибель під час операції складає менше 2095. Післяопераційна загибель досягає 4895 у контрольній групі і 2695 - в експериментальній групі, яка трапляється майже виключно через 4-5 днів після перев'язки судини.

Через сім днів після лігування мишей повторно анестезують і за допомогою електрокардіографії визначають об'єм лівого шлуночка (І М) у закритій грудній клітці, використовуючи для цього електрокардіограф

АТІ. НОЇ 5000. Дробне укорочення І М розраховують за вимірюванням поперечника у кінці діастоли та у кінці систоли. По закінченню електрокардіографічного вимірювання серце витягують, фіксують, після чого роблять зрізи. Потім гістологічні зрізи забарвлюють за допомогою сиріусу червоного для визначення розміру інфаркту.

Результати

У мишей, що вижили, діастолічний поперечник лівого шлуночка після семи днів накладення лігатури виявився наступним: 0,53440,01мм (п-20) у мишей, оброблених за допомогою І/-188Р проти 0,5940,01 у контрольних мишей (пя-16), ре0,01.

У мишей, що вижили, систолічний поперечник лівого шлуночка після семи днів накладення лігатури виявився наступним: 0,45--0,02 у мишей, оброблених за допомогою ІІ -18ВР проти 0,52-0,02 у контрольних мишей, р«е0,01.

Дробне укорочення лівого шлуночка: 154-195 у мишей, оброблених за допомогою 1ІІ-18ВР проти 114-195 у контрольних мишей, р«е0,01.

Висновок: 0БІ-188Р знижує смертність серед мишей після інфаркту міокарда, викликаного повним коронарним лігуванням лівого шлуночка, на 5095. Крім цього, функція лівого шлуночка істотно поліпшується, як показано по зменшеному систолічному і діастолічному поперечнику даного лівого шлуночка.

Посилання:

1. Войй, К. (1900) Сію айот 82, 723538. 2, Виддатати і ві. Бе. 4. Ігевштої. 2171323-1328 (1991) 3. Свіп, 8. 8. Майка, О.К. Оіпагово, С. А.. Мепо, К., Вагиківо, А. 2. Найсо, А.

Н. (1898) 3 Змгу пов 76, 11723. 4. Сіемвівий, 4, 0. 3, Мед, В. А. Сей, В. Ва Вапецов, А. В. Нажаг, А. Н.. (1997) Сіпжйавов 96, 29-30. 8. Овемео МА, чаті Мевг С, МОЙ ТО, ві гі: Івсімилівігерегйаіювчітвков ІЕН- ретепа уртеравкх іон ої й. 12 зло ВВ, Збтявиюй, МОБ. 5510, 1999 б. Оідопаю, 7 А, Неувісвни, М, Кобнииї, 0 М, гад, Б алі Копл, М. (1997).

Мекхо ЗОВ, 16514057.

Т. Ей, М, Май, В.М. Рабле, М. Мопоток, А. Сімка, Р., ВИ, Н., алі

Місогіу, З. 1804, (лик МА, 1125-1197. 8. Есвовієтють, М. Момюк, 0. які Мей, 0. 1090, ВКйСіют. 205, 18. 1538.

В. Копімен, 9. Ак 4; Ругалі М.М. Ніко, О. З, СМілрвіст, ті С. А. біпатюйо,

Во є: 2118-25, 1906. 40. Осанна (1974), Єсівпсо, 185 882-504, 14. бадчачйов, 4. оба, М. оба, У. Рог, У. Мови, М. Мобт, К. 8 Уакіочію, У. (1996) 2 Ат Сов Сакбої 28, ЗА7-БО, зе. Нагконе А Сік, 8., Лиман, А. А. З Мевзейскі, 8. (1995) Ага Райо 148, 13, Носійоїеег, 9., 0. В. Црбомі, Н. Мівопег, К. Ріейог, ат К. Ново. Імесі Іптип. 88; 3502

М.Каріал, 1. 3, Віт, Н., Ваподео, А. 8 Мпйтпап, О. 4). (1993)3 богу Мов 54, 31 1-5, 1б.Ків ЗН, Євепвівій М, Кегліком ї, Бопішем (8, Мом 0, Кибілвісій М,

Оіпагено СА. білісфигаі годоігетюгпев ої віх пабжеалу оосигігю ігобогте ої дю П.- 18 Біпейоо реоївіг бо іпйірй Щ.-18, Реос Май Асаі ба У 5 А 200ХХ97:1490-1195.

яв. Ко ЗН єї а. З. Лимтюгю, 2001, 168, ро. 148-- 154.

Я. Ка ОМ, Тип М, Що 3. біоре? 8, Зіовіу 0, М. бсацоп В, Моє

МА, Місек 4, Овбдопеа т, ої ві. Сопвілйов ее (ківі спагосіснтавог ої сійпейс апб-тме апйбову: Мої Ітмтитої 1993 Мом 3016 1443- з 18. Масізйє сі я. Мозсає Сюпіло: А церогакну Мепцеї, Сокі 5ріпо Намхх яВ. Мокілнить Ю. Н., Сіомефтиі, й б. к., Свій, В; З., Мепо, Х. бом, Ас ОН. (1998) Але Трюгос Зимо 85, 4309-43. 20. Момлісл, М.М. Сиве, С. Согувіап, ЗА. да ХС., Меупета-Саців, ЕЖ.,

Уго, МО., айс; МА... боці, С.М... Сев, БМ. Бпсквоп, КА, опа, ж. Коу,

С.мМ-АМ;. Авдетаййт, Но, Кізнапбац, Е., Моди, М. Зп, О.М, Еанійта; до, Най кі Біг, МН: бамія, С... евро, К.Л. яті Закоромуне, А: (1957).

Базнаг; вейбоду гаврогао й пов". Коба Звлейісв, 15 146-658. 21. Макгютика, ЖК, Сиожтніа, Ні; Масава, ма Тантйжо, 7. (1988). досі Мт. 57, 22, Мою. О, Кит, 8-Н, Катіхоєі, З, Кехком. ї. Сіпагейо, С, яті собів, М (1999). іпжпопйу чо, 127-136, 23. Ректмм, Р. бака, К Є. Боплен, Т Р, Соми, 5 К, викі біт, У Б. (1996), 4. Вісі. 24. Бигелп, А... Бапйкхгі, Є. й Оіпшейо, С. А. (1999) Рос. Май. Асеі. Бої; ШВА 96, 2258-2281 25. Касошт, С. 0; С. М Сай, М. А. даєте, у. болю, і. йо, А. Вагове, Х. кою, вий А. Н. Напот. Зитрегу 130: 319-25., 2001. . 26. Незлійом, М. 1. Кіт, 8. Н., Умовісой, 4. ЖЕ Наиват, З. Бамйвегі, С, МоУкК, Ю.,

НКирієєсоів, М. б СМпагейо, С. А. (2000) Рос Май Асаі Бі М 8 А 87, 2174-2179. 27.лойров, Ко МвМмю, 5. Обиа, ї.. Кобаувені, З. Тепіай, М., Кимкаю, Т.,

Мажвіквеві, То; Бапом, О., Койте, Н., ий, М., Ота, Т., кесія, М., Іераті, М. 8

Кий, М.(1097) Вк Спютот2, 25737-25742. 28, Топка зі відо, Русс. Май. Асені Зсі ШВА ВУ: 22-т27 (2000) 29. Тоосі, А. баговв, М. п. Воповісу, ал. Овусе, 124: мій гиїлеє,

К.Н. 1999, зЛпупатої, 148, 2778-2784. 30. Уовпитюко Т, Текойа, К, Тепакка, Т, Опкиви, К, Кавпйжетига, 8, Ока, М.

Акіга, З апі Макапівй, К (1998). 4; йптипої. 161, 3400-3407,

Ак Се)ювена Борей 0 00 ств,

Гол

Ми М! Терно си й їй

К | ці пи М кн. З і п с ; й 25 БІВ) т

Тере бопіканевї в щю- "

Сея ж

Б х

В

Ж з0- І

Е ! .

Во же ся ! | ! і са їв Ш.3яВР 0 пЛіяВе 3 Тез)

Фіг. 354 Ж з. 2251 не тк 820: - 155 а 1о- п ---- ення сін

Сеащгої Ек

Фіг2 й в 8521

БО

Бо | "ун

ЕВ в 8 5043 | Й

Во шо З фо 5-1 |. і. що В, ен цетв ЩАИЕВе САРОМ Н.зВ це. певної Ісспетіа

Фіг.3 - 100 090 й - ЗО

У бо 65 50. - 40

В 20 ! » 10 !

А о ше

Сн! МВ. ІСЕЦІО) Іс

Фіг 4 50003, ж й

ЩО 70003 | ж Ж ще - 6000 4 дн є ! е 5000- | | ! ! !

Б 4000. ! ! - 30005 !

Е т 2000 ре п - 160004 | | о : мові 0гСИСИ9КЯСт й сні 1/8 поїв? СЕНІО) СВО)

Фіг5 оо ко ре? пиши шо

Бе

В »

З со іме

Ах ю го ; - я

Соавнцої Ве ТМЕєсх ПОА1ЯВР

Фіг.6 120 ю | : щі ? клісь й й вч с беж 020 о 5 10 15 20 30 40 50 60 70 80 90

Тло (шіп) Фіг.7

Щ. Ред 1 В , 50001 | Ре00з

Сопної Ії "КВех ТУва п.

Фіг. 8

Claims (17)

1. Застосування інгібітора І--18 для приготування лікарського засобу для лікування і/або профілактики кардіоміопатії, де інгібітор І--18 вибраний з інгібітору каспази-1 (ІСЕ), антитіл проти 1-18, антитіл проти будь-якої субодиниці рецептора ІІ--18 і білків, що зв'язують ІЇІ--18, або їх ізоформ, мутеїнів, злитих білків або функціональних похідних, які інгібують біологічну активність ІІ -18.

2. Застосування за п. 1, де інгібітор І--18 являє собою антитіло до ІІ--18.

3. Застосування за п. 1, де інгібітор І--18 являє собою антитіло до рецептора а 1-18.

4. Застосування за п. 1, де інгібітор І--18 являє собою антитіло до рецептора ВД 1-18.

5. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло є гуманізованим або людським антитілом.

6. Застосування за п. 1, де інгібітор ІСЕ являє собою Ас-Туг-МаІ-АіІа-Азр-хлорметилкетон (УМА).

7. Застосування за п. 1, де даний інгібітор І--18 є білком, що зв'язує І--18, або ізоформою, мутеїном, злитим білком або функціональним похідним, яке інгібує біологічну активність 1І--18.

8. Застосування за п. 6, де інгібітор І--18 гліколізований по одній або декількох ділянках.

9. Застосування за п. 6 або 7, де злитий білок містить у собі білок злиття імуноглобуліну (Ід).

10. Застосування за будь-яким з пп. 6-8, де функціональне похідне включає щонайменше один радикал, зв'язаний з однією або декількома функціональними групами, які представлені у вигляді одного або декількох бічних ланцюгів в амінокислотних залишках.

11. Застосування за п. 10, де вказаний радикал являє собою поліетиленовий радикал.

12. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, в яких лікарський засіб додатково включає антагоніст Фактора Некрозу Пухлини (ТМРЕ).

13. Застосування за п. 11, де вказаний інгібітор І--18 використовують одночасно, послідовно або роздільно з антагоністом ТЕ.

14. Застосування за п. 12 або 13, де антагоніст ТМЕ являє собою ТВРІ і/або ТВРІЇ.

15. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де інгібітор І/-18 використовують у концентрації, що коливається приблизно від 0,001 до 100 мг/кг або приблизно від 1 до 10 мг/кг, або від 2 до 5 мг/кг.

16. Застосування експресуючого вектора, який містить послідовність, що кодує інгібітор І--18, для приготування лікарського засобу для лікування і/або профілактики кардіоміопатії, де інгібітор І--18 вибраний з антитіл проти ІЇ- 18, антитіл проти будь-якої субодиниці рецептора 1-18 і білків, що зв'язують ІІ-18, або їх ізоформ, мутеїнів, злитих білків, які інгібують біологічну активність 1-18.

17. Застосування експресуючого вектора для індукції і/або посилення ендогенного утворення інгібітора 1--18 у клітині для приготування лікарського засобу для лікування і/або профілактики кардіоміопатії, де інгібітор І--18 вибраний з білків, що зв'язують ІІ -18, або їх ізоформ, які інгібують біологічну активність 1І--18.