CN101374543A - 预防或治疗血流量增加引发的组织损伤的方法 - Google Patents

Abstract

一种治疗或预防在影响与所述组织相联系的血管中的血流增加后出现的组织损伤的方法，通过施用有效量的包含组织损伤减少或预防的多肽的组合物，所述组织损伤减少或预防多肽包括胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的异构体、Tβ4的N端片段、Tβ4的C端片段、Tβ4亚砜、LKKTET多肽、LKKTNT多肽、肌动蛋白隔离肽、肌动蛋白结合肽、肌动蛋白动员肽、肌动蛋白聚合调节肽或其具有减少组织损伤活性的保守变体中的至少一种。该组合物在影响所述血流增加之前、中或后的至少一种情况下被施用至所述的组织。

Description

预防或治疗血流量增加引发的组织损伤的方法

发明背景

相关申请的交叉申请

本申请要求2006年1月17日提交的美国临时申请号60/759,051的权益。

发明领域

本发明涉及治疗或预防由血流增加引发的组织损伤的领域。

背景技术

有许多的药物、设备和治疗手段用于在动脉和其他血管中消除阻塞或增加血流。然而，血管阻塞的消除有时会导致大量的血液携带着氧、自由基和其他化学物质，冲进组织部位，伴随有导致组织损伤的可能。

现有技术仍然有对用于预防或治疗由血流增加导致的组织损伤的方法和组合物的需求。

发明概述

根据本发明，一种预防或治疗影响与所述组织相联系的血管中的血流增加之后出现的组织损伤的方法，该方法包括施用有效量的包含组织损伤减少或预防多肽的组合物，所述多肽包括胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的异构体、Tβ4的N端片段、Tβ4的C端片段、Tβ4亚砜、LKKTET肽、LKKTNT肽、肌动蛋白隔离肽(actin-sequestering peptide)、肌动蛋白结合肽、肌动蛋白动员肽(actin-mobilizing peptide)、肌动蛋白聚合调节肽(actin polymerization-modulating peptide)或它们的具有组织损伤减少活性的保守变体中的至少一种。该组合物在影响所述血流增加发生之前、之中或之后的至少一种情况下施用至所述的组织。

发明详述

本发明基于这样一个发现，如胸腺素β4(Tβ4)和其他例如肌动蛋白隔离肽或包含LKKTET或LKKTNT氨基酸序列或其保守变体的肽片段的肽(下文有时称为“组织损伤预防或减少肽”或“组织损伤减少或预防肽”)，促进了心脏、神经或其他组织的损伤和与血流增加相关的其他改变的治愈或预防。这种组织损伤预防肽包括下述中的至少一种：胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的异构体、Tβ4的N端片段、Tβ4的C端片段、T

β4亚砜、LKKTET多肽、LKKTNT多肽、肌动蛋白隔离肽、肌动蛋白结合肽、肌动蛋白动员肽、肌动蛋白聚合调节肽(actinpolymerization-modulating peptide)或它们的保守变体。所包括的N端或C端片段或变体可以包含或不包含KLKKTET和LKKTETQ。Tβ4被提出是啮齿目动物模型血管再生的一个影响因子。然而，到目前为止，还没有能证明这些特性可以用于治疗由血流增加导致的组织损伤的证据。不受限于任何特定的理论，这些肽可能通过具有诱导末端脱氧核糖核酸转移酶(一种不需要模板指导的DNA聚合酶)，以及降低和调整一种或多种炎性细胞因子或化学因子的水平，以及作为细胞的趋化因子和/或血管生成因子的能力而具备了促进修复、治愈和预防的能力，并因此具备治愈和预防由血流增加导致的组织损伤。

本发明特别可与一些用于在动脉和其他血管中消除阻塞或增加血流的试剂(例如药物、装置或手段)的使用相结合使用。为了预防或治疗在影响与组织相联系的血管中血流增加后出现的组织损伤，组织损伤预防或减少肽可在影响血流量增加之前、之中和/或之后施用。

可用于影响血管中血流增加的试剂包括但不限于阿司匹林、tPA、链球菌激酶(streptokinase)、血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)、抗凝剂、复合纤溶酶链激酶(anistreplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)和/或肝素(或称肝磷脂)。组织损伤预防或减少肽可在血管中的血流增加之前、之中和/或之后联合施用。能有效增加血管中血流的试剂的量在0.001-1000mg范围内。本发明也适用于包含这些血流增加试剂和组织损伤预防或减少肽的组合物。

可以用于影响血管中血流的装置和方案包括但不限于动脉支架(arterial stents)、静脉支架(venous stents)、心脏导管插入术、颈动脉支架(carotid stents)、大动脉支架(aortic stents)、肺支架(pulmonary stents)、血管成形术、旁路移植术和/或神经外科手术。组织损伤预防或减少肽可以在血管中血流增加之前、之中和/或之后联合施用。

有迹象表明，本发明可以适用于包括但不限于由外伤引发的缺血(神经或心脏)、疾病引发的缺血、先天性缺血和/或中风。组织损伤预防或减少肽可以在血管中血流增加之前、之中和/或之后联合施用。

通过对例如磷脂酰肌醇-3-激酶(P13-K)/Akt(蛋白激酶β)通路的代谢和信号酶的上调，此处描述的组织损伤预防或减少肽可以预防和/或限制脑和其他神经血管细胞和组织在缺血、感染、病理、中毒或创伤性损伤后出现的凋亡性死亡。P13-K/Akt和下游的磷酸化Bad和富含脯氨酸Akt存活酶(proline rich Akt survival kinase)的上调保护了缺氧性伤害中的神经细胞。此外，本文所描述的组织损伤预防或减少肽通过其下调如IL-18的炎性细胞因子和如IL-8的趋化因子和如半胱天冬酶(caspace)2、3、8、9的酶的能力保护了神经细胞并有利于神经组织的修复。

在施用本文描述的溶解血栓试剂之前、之中和/或之后立即施用此处所描述的组织损伤预防或减少肽，会通过诱导神经组织进入一种以P13-K/Akt信号通路的调制和神经细胞凋亡的减少，以及降低炎性趋化因子、细胞因子和半胱天冬酶的活性为特征的休眠状态，来限制因为缺氧导致的神经损伤。

本文描述的组织损伤预防或减少肽，通过预防谷氨酸诱导的神经中毒而防止因为缺血或外伤创伤引发的脑和脊髓的神经中毒发生。作为一种兴奋神经递质的谷氨酸从损伤的脑和神经组织中的不受控释放，是线粒体机能障碍和可以导致多种炎症反应的细胞中的能量转换机制、营养信号的趋紧性变化和神经细胞与组织的死亡的一个主要调节因素。

如上所提及的，组织损伤预防或减少肽可以在影响与组织相联系的血管中的血流增加发生之前、之中和/或之后被施用。施用途径包括但不限于非肠道给药、口服给药、鼻腔给药、肺部给药、心脏内给药、静脉内给药、透皮给药和/或脂质体给药。

胸腺素β4一开始就被认为是一种在体外内皮细胞迁移和分化过程中的被上调的蛋白。胸腺素β4最初是从胸腺中分离得到的，是一种43个氨基酸、4.9kDa、在多种组织中广泛存在的多肽。归于该蛋白质的几种功能包括在内皮细胞分化和迁移、T细胞的分化、肌动蛋白分离和血管生成等过程中的作用。

根据一个实施方式，本发明是一种用于促进治愈和预防与由血流的增加导致的组织损伤相关的炎症和损伤的治疗方法，包括对需要进行这种治疗的患者施用有效量的组合物，所述组合物包括含有具有组织损伤减少活性的LKKTET或LKKTNT氨基酸序列或其保守变体的组织损伤减少肽，所述肽优选为胸腺素β4、Tβ4的异构体或Tβ4的拮抗剂。本发明也可以使用氧化的Tβ4。

根据本发明，可以使用的组合物包括胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的异构体、氧化的Tβ4、其他任何具备肌动蛋白结合域的肌动蛋白隔离或组装蛋白或者多肽、具备组织损伤减少活性的含有或不含有LKKTET或LKKTNT氨基酸序列及其保守变体或基本上由LKKTET或LKKTNT氨基酸序列及其保守变体组成的肽片段。在此作为参考被并入本文的PCT/US99/17282号国际申请公开了可用于本发明的Tβ4的异构体、LKKTET氨基酸序列及其保守变体。在此作为参考被并入本文的PCT/GB99/00833(WO 99/49883)号国际申请公开了可以应用于本发明的氧化Tβ4。虽然本发明在下文中主要是描述了Tβ4和Tβ4异构体，但是，应当理解为，下面的描述同样可以适用于具有LKKTET、LKKTNT、LKKTETQ或KLKKTET氨基酸序列的肽和含有或主要由LKKTET、LKKTNT、LKKTETQ、KLKKTET、它们的具备组织损伤减少活性的保守变体组成的片段，以及氧化Tβ4和此处所描述的其他组织损伤预防或减少肽。

在一个实施方式中，本发明提供一种通过使有效量的组织损伤减少组合物与患者的组织部位接触用于治愈和预防患者的炎症和损伤的方法，所述组合物包含Tβ4或Tβ4异构体或本文描述的其他损伤预防或减少肽。这种接触可以是直接接触或者系统性接触。与损伤部位接触的例子包括用仅仅包含组织损伤预防或减少肽的组合物，或与至少一种增强渗透性或延迟或降低组织损伤预防或减少肽在治疗区释放的试剂组合的组合物与该部位接触。这种施用可以是直接施用或者系统性施用。施用的例子包括，例如，用含有本文所述组织损伤预防或减少肽的溶液、洗液、药膏、凝胶膏、糊剂、喷雾剂、悬浮液、分散剂、水凝胶、软膏、泡沫、油或固体直接施用、注射或输液。施用可以包括，例如，静脉内、腹腔内、肌肉内或皮下注射，或吸入、透皮吸收或口服施用包含组织损伤预防或减少肽的组合物等方式。患者可以是哺乳动物，优选是人。

组织损伤预防或减少肽可以任何合适的组织损伤减少或预防量被施用。例如，组织损伤预防或减少肽可以0.0001-1,000,000微克，优选0.01-5,000微克，更优选0.1-50微克，最优选大约1-30微克的剂量范围施用。

本发明的组合物可以每天服用、隔天服用等方式施用，每施用当日施用一次或多次，例如每施用当日施用2、3、4或更多次。

已经鉴定出一些Tβ4的异构体，其与已知的Tβ4氨基酸序列有约70％，约75％，或约80％或更高同源性。这些异构体包括，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。与Tβ4相似，Tβ10和Tβ15异构体已经被证实可隔离肌动蛋白。Tβ4，Tβ10和Tβ15，和其他的异构体共有一个氨基酸序列LKKTET或LKKTNT，该序列与肌动蛋白的隔离或连接有关。虽然不希望被任何特定的理论束缚，但Tβ4异构体的活性部分地归因于调控肌动蛋白聚合的能力。β胸腺素显示出通过隔离游离的G肌动蛋白使F肌动蛋白解聚。Tβ4调节肌动蛋白聚合的能力可能是全部或者部分归因于它通过LKKTET或LKKTNT序列与肌动蛋白的结合或分离的能力。因此，正如本文所描述的，与Tβ4一样，其他可结合或隔离肌动蛋白，或调节肌动蛋白聚合的组织损伤预防或减少肽，其中包括具有LKKTET或LKKTNT氨基酸序列的Tβ4异构体，可能会是有效的，不管是单独使用还是与Tβ4组合使用。

因此，可以预见，已知的Tβ4异构体，例如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及还没有被鉴定出来的Tβ4异构体，可用于本发明的方法。这样，Tβ4异构体可用于本发明的方法，包括在患者中实施的方法。因此，本发明进一步提供包含Tβ4、以及Tβ4的异构体Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，和药剂学上可以接受的载体的药物组合物。

此外，例如具备肌动蛋白隔离或结合能力的，或者经合适的隔离、结合、动员或者聚合测定法表明能够动员肌动蛋白或调控肌动蛋白聚合的，或者鉴别存在调控肌动蛋白结合的氨基酸序列LKKTET或LKKTNT等的其他蛋白，可以被类似的应用于本发明的方法。这些蛋白包括例如凝溶胶蛋白(gelsolin)、维生素D结合蛋白(DBP)、抑制蛋白(profilin)、切丝蛋白(cofilin)、微丝切割蛋白(adsevertin)、原肌球蛋白(propomyosin)、fincilin、蚕食蛋白(Depactin)、DNA酶I、绒毛蛋白(vilin)、截断蛋白(fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白(capping protein)、β-肌动蛋白(β-肌动蛋白)和肌动调节蛋白(acumentin)。基于这些在个体上应用的方法，本发明进一步提供包含本文所列凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、抑制蛋白(profilin)、切丝蛋白(cofilin)、蚕食蛋白(Depactin)、DNA酶I、绒毛蛋白(vilin)、截断蛋白(fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和肌动调节蛋白(acumentin)的药物组合物。由此，本发明包括含有LKKTET或LKKTNT氨基酸序列(可能存在于它的初级氨基酸序列中)的组织损伤减少多肽和其保守变体的应用。

正如此处用到的，“保守变体”这个词或其语法上的变种是指一个氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替代。保守变体的例子包括疏水残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸等之间的相互替代；极性残基，如精氨酸对赖氨酸的相互替代，谷氨酸替代天冬氨酸，或者是谷氨酰胺替代天冬酰胺等。

Tβ4已经定位在一些组织和细胞类型中，因此，一些刺激Tβ4或其他组织损伤预防或减少肽生成的试剂可以加入其中或组成组合物来影响组织损伤预防或减少肽从组织和/或细胞中的生成。这些试剂包括生长因子家族的成员，例如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、碱性成纤维原细胞生长因子(bFGF)，胸腺素α1(Tα1)和血管内皮生长因子(VEGF)。更优选地，该试剂为转化生长因子β(TGF-β)或TGF-β超家族的其他成员。通过实现细胞外基质层中结缔组织的生成、细胞迁移和血管生成，本发明的组合物可以减少血流增加引发的组织损伤。

根据一个实施方式，使用刺激本文所定义的组织损伤预防或减少肽在患者体内产生的试剂来治疗患者。

此外，可以将有助于或刺激血流增加引发的组织损伤的治愈的试剂与组织损伤预防或减少肽一起加入组合物。这些试剂包括血管生成试剂、生长因子、指导细胞分化的试剂。例如，但不用于限定，将组织损伤预防或减少肽单独或与以下试剂中的一种或多种组合添加：有效量的VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、胸腺素原α和胸腺素α1。

本发明也包括了一种药物组合物，其包含存在于药学可接受的载体中的治疗有效量的组织损伤预防或减少肽。这些载体包括本文所列载体及其他。

用于由血流增加导致的组织损伤相关的炎症、损伤和退化的治愈或预防的精确剂量、制剂或组合物依赖于很多因素，其中包括患者的身体大小和健康状况。然而，本领域的普通技术人员可以利用在PCT/US99/17282(同上)和本发明引入的参考文献中公开的、描述用于确定临床剂量的方法和技术的教导，来决定合适的使用剂量。

合适的制剂包含组织损伤预防或减少肽的浓度范围为约0.001-50wt％，更优选为约0.01-0.1wt％，最优选为约0.05wt％。

本文所描述的治疗方法涉及包含本发明所述的组织损伤预防或减少化合物的试剂或组合物的多种施用或递送途径，其中包括对患者的常规施用技术。这些应用或包含本发明的组织损伤预防或减少化合物的方法或组合物可以通过与药学可接受的无毒赋形剂或载体混合而制成药物组合物。

本发明包括与组织损伤预防或减少肽或其功能片段相互作用的抗体的应用。提供了这些抗体基本是由具有不同表位特异性的成库单克隆抗体组成的抗体和特定的单克隆抗体制剂。通过本领域技术人员已知的、PCT/US99/17282(同上)所描述的方法，可从包含蛋白片段的抗原制备单克隆抗体。本发明所用的抗体这个名词旨在包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在另一实施方式中，本发明提供了通过施用有效量的介导组织损伤预防或减少肽基因表达的试剂来治疗患者的方法。名词“介导”是指在组织损伤预防或减少肽过表达的时候抑制其表达，而在组织损伤预防或减少肽表达不足的时候诱导其表达。名词“有效量”是指有效介导组织损伤预防或减少肽基因的表达而获得有效治疗的介导试剂的量。介导Tβ4或组织损伤预防或减少肽基因的表达的试剂例如可以是寡核苷酸。该寡核苷酸可以是反义核苷酸、三联体试剂或核酶。例如，可使用指向结构基因区或者Tβ4的启动子区的反义核苷酸。

在另一实施方式中，本发明提供一种利用介导Tβ4或组织损伤预防或减少肽活性的化合物的方法。影响Tβ4或组织损伤预防或减少肽活性的化合物(例如，拮抗剂或激动剂)包括肽、拟肽(peptidomimetics)、多肽、化合物、锌等矿物质和生物试剂。

不被任何特定理论所束缚，本发明通过诱导末端脱氧核糖核酸转移酶(一种非模板指导的DNA聚合酶)来降低一种或多种炎性细胞因子或趋化因子的水平，并作为内皮细胞的趋化因子，进而促进由血流增加或其他退化或环境因子引发的组织损伤的治愈或预防，可以促进与由血流增加导致的组织损伤相关的炎症或损伤的治愈或预防。

实施例1

合成Tβ4和Tβ4的抗体由RegeneRx生物制药公司(RegeneRxBiopharmaceuticals，Inc.，3 Bethesda Metro Center，Suite 700，Bethesda，MD 20814)提供，经胶原蛋白凝胶检测以确定它们对心脏内皮细胞到间充质细胞的转化的影响。已知，心瓣膜和其它心脏组织的发育是通过上皮细胞-间充质细胞的转化形成的，并且，在这个过程中的缺陷可能会导致发育和整个生命过程中的严重心血管的畸形和伤害。在胶原凝胶检测中，生理浓度的Tβ4显著增强了心内细胞到间充质细胞的转化。而且，Tβ4的抗体抑制和阻断这个转化过程。房室内皮细胞到扩散的间质细胞的转化是正常心组织的形成与维持以及心血管的形成中的一个方面。

实施例2

参与心脏发育的介导途径可能对心肌细胞的重新程序化有作用，以助于心脏病的修复。在心肌形态形成中所表达基因的研究中，发现胸腺素β4，这个四十三个氨基酸的肽，在心脏发育过程中表达。胸腺素β4有许多功能，最主要涉及G-肌动蛋白单体的隔离以及随后对细胞运动、器官发生和其他细胞生物事件所必须的肌动蛋白-细胞骨架的组装产生影响。最近结构域分析表明，基于它们的C端对肌动蛋白的亲和力，β4-胸腺素能够影响肌动蛋白的组装。此外，除了细胞迁移，胸腺素β4通过影响Rho-依赖基因的表达或由核肌动蛋白介导的染色质重构事件来影响转录事件。

在此，已经证实，胸腺素β4能够刺激心肌细胞和内皮细胞的迁移，并促进心肌细胞的存活。LIM结构域蛋白PINCH和整合素连接激酶(ILK)，都是细胞迁移和存活所必须的，与胸腺素β4组成了一个复合体，导致存活激酶Akt/PKB的磷酸化。Ak磷酸化的抑制逆转胸腺素β4对心肌细胞的影响。在冠状动脉结扎后，用胸腺素β4对成年鼠的治疗导致了心脏中Akt的磷酸化的升高，增强了早期肌细胞在二十四小时内的存活，并改善了心脏的功能。这些结果表明，在心肌形成过程中表达的内源蛋白可以在急性冠状动脉事件的处理中被重新调配，以保护心肌。

结果

胸腺素β4发育过程的表达

与在心脏系统中的表达一样，胸腺素β4在脑发育过程中的表达已经被报道，虽然没有重要的细节。对10.5胚胎日(E)的小鼠胚胎的总RNA原位杂交发现，胸腺素β4在左心室、右心室的外曲部和心脏流出道中表达。原位杂交的放射性表明，胸腺素β4转录产物在被称为心内膜垫的心瓣膜前体的区域被富集。这一区域的细胞衍生自先经历间叶细胞的转化，然后从心内膜迁移出并侵入分离心肌层和心内膜的细胞外基质膨胀中的内皮细胞。除心内细胞之外，一部分的心肌细胞也迁移并聚集于膜垫区，并且这个过程是心腔的分离和重新构建所必须的。通过使用免疫组化发现，在这个垫子中的表达胸腺素β4的细胞也表达心肌肌动蛋白，这表明胸腺素β4存在于侵入心内膜垫的迁移心肌细胞中。最后，在E9.5-E11.5，胸腺素β4转录体和蛋白也表达在心室隔膜和称作致密层的心肌的低分化、高增殖区域，致密层的细胞随着成熟会迁移到小梁区(trabecularregion)。从前心区迁移来的流出道心肌细胞也表达高水平的胸腺素β4蛋白。

分泌的胸腺素β4刺激心肌细胞的迁移和存活

虽然发现胸腺素β4在细胞质、细胞核中并在胞内发挥作用，但我们发现用带myc标签的胸腺素β4转染的Cosl细胞的条件培养基含有可以被Westernblot检测到的胸腺素β4，与先前对胸腺素β4在创伤液中的分泌和存在的报道一致。基于胸腺素β4在胞外加入到胎心外植体(embryonic cardiac explants)中的胞外噬菌体颗粒表面的表达，发现抗噬菌体抗体覆盖在细胞的表面并且最终在细胞质和细胞核中胞内检测到，而在噬菌体对照组不能检测到。用生物素标记的胸腺素β4也得到了相似的观察结果。这些数据表明，分泌的胸腺素β4可被纳入细胞内，虽然还没有确定其进入细胞的机制。

为了测试分泌的胸腺素β4对心肌细胞迁移的影响，使用了经设计一个在三维胶原凝胶上分析细胞迁移和分化事件的胎心外植体体系。在这个体系中，将邻近胚胎心肌层的外植体和来自心脏瓣膜发生区的心内膜与邻近于胶原的心内膜一起放置于胶原蛋白凝胶上。来自心肌细胞(cardiomyocytes)的信号诱导心内细胞迁移，但通常没有显著数量的心肌细胞(myocardialcells)迁移在胶原蛋白上。相反的，一旦向初代外植体中加入胸腺素β4，观察到大量的自发跳动，心脏肌肉肌动蛋白阳性细胞从该外植体中迁移出来。与对照细胞相比，在这些细胞中没有观察到分别基于TUNEL测定法或磷酸-组氨酸H3免疫染色的细胞死亡或增殖率的显著差别。

为了测试出生后心肌细胞的反应，将初级大鼠新生心肌细胞培养于覆盖层粘连蛋白的玻璃上并用磷酸盐缓冲液(PBS)或胸腺素β4进行处理这些细胞。与胚胎心肌细胞相似，与对照组相比，胸腺素β4处理的新生心肌细胞的迁移距离明显增加(p<.05)。除了胸腺素β4对心肌细胞迁移的作用，一在胚心外植体测定法中观察到对内皮细胞迁移中的相似作用。与PBS相比，E11.5的外植体暴露于胸腺素β4产生了增加数量的迁移内皮细胞(p<.01)。

在我们实验室中，当培养在覆盖有层粘连蛋白的玻片上时，新生心肌细胞的初级培养物通常存活大约1-2周，其中一些细胞坚持到两周。令人惊奇的是，一旦暴露于胸腺素β4，新生心肌细胞存活的时间显著更长，并且可见到节奏性收缩的肌细胞最长可存活28天。此外，胸腺素β4处理的新生心肌细胞跳动的速率始终更快(95比50次跳动/分钟，p<.02)，说明细胞间通讯的变化或者更有力的心肌细胞。

胸腺素β4激活ILK和Ak/蛋白激酶B

为了研究胸腺素β4影响细胞迁移和存活事件的可能机理，寻找与胸腺素β4存在相互作用的蛋白。将胸腺素β4的氨基端融合到亲和胶珠上，导致其碳端暴露于外，从而可以鉴定当前未知的但被阻止了与肌动蛋白的结合的相互作用蛋白。合成E9.5-12.5的鼠心脏T7噬菌体cDNA库并通过噬菌体展示进行筛选，并且富集能与胸腺素β4发生相互作用的克隆并用ELISA进行验证。PINCH，一个LIM结构域蛋白，在此筛选中最一致被分离并且在没有肌动蛋白存在的情况下与胸腺素β4发生相互作用(ELISA)。PINCH和整合素连接激酶(ILK)发生直接的相互作用，并与肌动蛋白细胞骨架间接作用，作为被称为粘着斑复合体(focal adhesioncomplex)的与细胞外基质相互作用有关的大的复合体的一部分。PINCH和ILK是细胞运动和细胞存活所必须的，其部分地通过促进丝氨酸-苏氨酸激酶Akt/蛋白激酶B(存活和生长信号通路中的核心激酶)的磷酸化。在培养的细胞中，将编码胸腺素β4的质粒与或不与PINCH或ILK一起转染，发现胸腺素β4独立地与PINCH或ILK共沉淀。此外，PINCH、ILK和胸腺素β4在一个共同的复合体中发生一致的免疫沉淀，虽然ILK和胸腺素β4的相互作用比与PINCH要弱。PINCH和胸腺素β4的相互作用定位在PINCH的第四和第五LIM结构域，然而，ILK氨基端的ankryin结构域对于其和胸腺素β4的相互作用是足够的。

因为ILK的招募对粘着斑复合体的激活是重要的，所以分析胸腺素β4在ILK的定位和表达中的作用。在用胚胎心脏外植体或者具有合成的胸腺素β4蛋白(10ng/100ul)或胸腺素β4表达质粒的C2C12肌胚细胞处理后，通过免疫细胞化学的ILK检测在细胞边缘显著增强。Western分析显示，ILK蛋白在C2C12细胞中的水平出现适度增加，表明增强的免疫荧光可能部分是因为胸腺素β4引起的定位改变。已经发现，一旦用胸腺素β4处理C2C 12细胞，ILK被功能性激活，证据为用针对Akt的473位丝氨酸的磷酸化特异性抗体证明了其已知底物Akt的磷酸化的升高，但总Akt蛋白没有发生改变。细胞外施用的胸腺素β4和转染的胸腺素β4的相似性作用与以前该肽的纳入观察结果是一致的，表明胸腺素β4在信号转导中的细胞内而不是细胞外作用。因为胸腺素β4隔离G-肌动蛋白单体库，所以测试对ILK的激活的作用依赖于胸腺素β4在调节聚合的F-肌动蛋白和单体的G-肌动蛋白之间平衡中的作用。F-肌动蛋白的聚合可使用C3转移酶来抑制，并且F-肌动蛋白的形成可通过活化的Rho来促进，但是，在用胸腺素β4处理COS1或C2C 12细胞后未观察到影响ILK激活的这两种干预。

为了确定ILK的激活是否对于所观察到的胸腺素β4的作用是必须的，使用一个已详细描述的ILK抑制因子，wortmannin，其抑制ILK上游的激酶，即磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)。使用心肌细胞迁移和跳动频率作为对胸腺素β4活性的分析，按照以上的描述，在存在胸腺素β4并添加或不添加渥蔓青霉素培养胚胎心脏外植体。与ILK调节胸腺素β4的作用相一致，一旦抑制ILK，观察到心肌细胞迁移和跳动频率的明显降低(p<.05)。同时，这些结果支持了胸腺素β4-PINCH-ILK在细胞内的生理学显著相互作用，并且表明，这个复合体可以相对独立于肌动蛋白聚合而调节一些所观察到的胸腺素β4的作用。

胸腺素β4促进细胞在心肌梗死后的存活并改善心脏的功能

因为胸腺素β4对体外培养的心肌细胞的存活和迁移以及Akt的磷酸化的作用，所以测试胸腺素β4是否有助于心肌损伤后的体内心肌治疗。通过冠状动脉结扎的方式在58只成年鼠中造成心肌梗塞，结扎之后立即给一半的鼠全身、心内或全身加心内施用胸腺素β4，而另一半施用PBS。心内注射采用胶原蛋白(对照)或胶原蛋白与胸腺素β4的混合物。在通过心脏收缩多重测量的梗塞发生后2周和4周，用随机-盲法超声诊断(random-blindultrasonagraphy)检查两周后仍存活的所有45只鼠进行心脏功能。在梗塞后4周，对照组鼠的左心室平均短轴缩短率为23.2+/-1.2％(n＝22，95％置信区间)，相反的，用胸腺素β4处理的鼠的平均短轴缩短率为37.2+/-1.8％(n＝23，95％置信区间；p<.0001)。作为心室功能的第二种测量，二维超声心电图表明，冠状动脉结扎之后，从左心室射出血液(射血分数)的平均值，在胸腺素β4处理的鼠中为57.7+/-3.2％(n＝23，95％置信区间；p<.0001)，而对照组为28.2+/-2.5％(n＝22，95％置信区间)。分别在短轴缩短率和射血分数上的大于60％或100％的改善，表明暴露于胸腺素β4引起了一个显著改善，虽然与进行假手术的动物相比，心脏的功能仍然被消弱(～60％短轴缩短率；～75％射血分数)。最后，舒张末期内径(EDD)和收缩末期内径在对照组明显更高，表明胸腺素β4的治疗导致了心肌梗塞后伴随心脏功能改善出现的心脏扩张的降低。明显的，胸腺素β4通过腹腔注射的全身施用和只在心肌梗塞局部施用所引起的改善的程度并没有统计学意义上的差别，表明胸腺素β4的这种有益作用可能是通过对心脏细胞的直接作用而不是通过心外来源而发生的。对照的心脏注射使用相同的胶原蛋白载体进行，不会由该注射的内在反应有助于心脏的康复。

为了确定胸腺素β4改善心脏功能的方式，测试用或不用胸腺素β4处理的心脏的多个系列组织切片。在三个水平的切片上的三色染色显示，所有胸腺素β4处理的小鼠中的疤痕的尺寸都缩小了，但是胸腺素β4的全身施用和局部施用之间没有不同，这与上文的超声数据相一致。使用一部分小鼠的左心室的六个水平的切片的疤痕体积的定量表明，胸腺素β4处理的小鼠中，疤痕的体积明显减小(p<.05)。在用PBS或胸腺素β4处理并对冠状动脉结扎3、6、11或14天后，我们没有检测到明显的心肌细胞的增殖或死亡。然而，通过TUNEL分析(绿色)，结扎24小时后，我们在胸腺素β4处理的心肌细胞中发现了细胞死亡的明显降低，这被肌肉—肌动蛋白(红色)双标记所证实。TUNEL阳性的细胞，即肌细胞，在胸腺素β4组中是很少的，但是在对照心脏中很多。与这一观察结果一致，发现心内胸腺素β4处理组在梗塞形成后三天的左心室短轴缩短率为39.2+/-2.34％(n＝4，95％置信区间)，对照组为28.8+/-2.26％(n＝4，95％置信区间)(p<.02)；射血分数分别为64.2+/-6.69％或44.7+/-8.4％，(p<.02)，表明胸腺素β4的早期保护作用。最后，在处理和非处理的心脏中，没有检测到c-kit、Sca-1或Abcg2阳性心肌细胞的任何数量差异，并且，胸腺素β4处理的动物中的心肌细胞的细胞体积与成熟的肌细胞相似，表明胸腺素β4诱导的改善可能不受已知的干细胞招募入心细胞系的影响。这样，胸腺素β4处理的小鼠的疤痕体积的减小和保护功能可能是因为通过胸腺素β4对心肌细胞存活的作用在结扎后的早期心肌层保护。

因为胸腺素β4上调培养细胞中ILK的活性和Akt的磷酸化，所以测试这些激酶在体内的作用。通过western blot发现，与冠状动脉结扎后进行PBS处理的小鼠相比，在冠状动脉结扎后进行胸腺素β4处理的小鼠的心脏裂解物中的ILK蛋白水平升高。相应的，Akt-5473的磷酸特异性的抗体揭示出胸腺素β4处理小鼠中磷酸化Akt-5473数量的升高，这与在前所描述的胸腺素β4对ILK的作用相一致。总Akt蛋白并没有增加。体内的这些观察结果与体外所证实的胸腺素β4对细胞迁移和生存的作用相一致，表明ILK的激活和随后的Akt的刺激可以部分地解释胸腺素β4诱导的增强的心肌细胞存活，尽管胸腺素β4对细胞的所有作用似乎只有一种作用机理。

讨论

本文提供的证据表明预示着胸腺素β4，作为一种与心脏形态发生过程中的细胞迁移和存活有关的蛋白，在心肌梗塞后可能会被重新配置以最小化心肌细胞的损失。考虑到PINCH、ILK和Akt的功能，这些数据与在胸腺素β4对细胞迁移、存活和心脏修复的作用中起到核心作用的这个复合体相一致。胸腺素β4在心肌梗塞后24小时内预防细胞死亡的能力可能导致了在小鼠中观察到的疤痕体积的减小和心室功能的改善。虽然胸腺素β4对ILK的激活可能有很多细胞影响，但Akt的激活可能是主要的机制，胸腺素β4通过这个机制促进细胞的存活。在心脏损伤后施用的鼠骨髓源干细胞中的过表达时，其与Akt对心脏修复的图册作用相一致，虽然这可能以非细胞自治方式发生。

胸腺素β4在保护心脏避免细胞死亡中的早期作用使人想起了能够在“冬眠”的低氧损伤下存活的肌细胞。尽管冬眠状态的心肌的机制仍不清楚，但新陈代谢和能量应用的改变似乎促进细胞的存活。例如胸腺素β4的诱导试剂以与冬眠状态心肌相似的方式改变细胞的特性，可能留取内皮细胞迁移和新血管生成的时间。

本文中，我们表明，G-肌动蛋白隔离肽胸腺素β4促进了胚胎心脏中心肌和内皮细胞的迁移，并在出生后的心肌细胞中保留了这种特性。培养中胚胎和出生后心肌细胞的存活也被胸腺素β4增强。发现胸腺素β4与PINCH和整合素连接激酶(ILK)形成一个功能复合体，导致活化激酶Akt/PKB的激活，这是胸腺素β4对心肌细胞产生作用所必须的。在小鼠冠状动脉结扎后，胸腺素β4处理导致了心脏中ILK和Akt的活性的上调，增强了早期肌细胞的存活，并且改善了心脏的功能。这些发现表明胸腺素β4促进了心肌细胞的迁移、存活和修复，并成为急性心肌损害的处置中的一个新治疗靶点。

方法

RNA的原位杂交

使用从胸腺素β4 cDNA的3’UTR区域合成的、地高辛标记或S标记的反义riboprobe探针，进行E9.5-12.5的小鼠胚胎全部或切片RNA原位杂交。胸腺素β4 cDNA的3’UTR区域与其最相关的胸腺素β10的转录本也不具备同源性。

免疫组化

将胚胎或成年的心脏组织包埋入石蜡并且将切片用于免疫组织化学。将胚胎的心脏切片与不识别胸腺素β10的抗胸腺素β4一起孵育。将成年心脏从底部到顶部以10个相等的水平切片。将系列切片用于三色切片并且与横纹肌a-肌动蛋白c-kit、Sca-1、Abcg2、和BrdU抗体的反应，及用于TUNEL分析(Intergen Company # S7111)。

胶原蛋白凝胶迁移分析

从E11.5的野生型小鼠胚胎中切除外流道并且如上所述放置于胶原蛋白基质中。10小时附着后，将外植体孵育在含30ng/300μl胸腺素β4的PBS、单独的PBS或胸腺素β4和100nM渥曼青霉素中。培养物在37℃、5％ CO₂条件下培养3-9天，并在含4％多聚甲醛的PBS中室温固定十分钟。使用每种内皮细胞迁移条件下的至少三个单独的外植体和对于肌细胞迁移的八个单独的外植体，对细胞计数以对迁移和距离定量。

胶原蛋白凝胶外植体的免疫组化

将多聚甲醛固定的外植体在室温下用透性化溶液(Permeabilizesolution，10mM PIPES pH6.8；50mMNaCl；0.5％ Triton X-100；300mM蔗糖；3mM MgCl₂)透性化十分钟，并用PBS在室温下冲洗2 x 5分钟。在一系列的封闭和冲洗步骤之后，应用检测抗体并且在室温下将外植体用平衡缓冲液(Anti-Fade kit)冲洗和孵育十分钟。将外植体挖出至玻璃显微载玻片上、覆片、并且用荧光显微镜检测。使用推荐的ApopTag PlusFluorescein In Situ Apoptosis检测试剂盒(Intergen Company # S7111)进行TUNEL分析法。

胚胎T7噬菌体展示cDNA文库

用Straight A’s mRNA Isolation System(Novagen，Madison WI)从E9.5-12.5的小鼠胚胎心脏中分离并纯化相同数量的mRNA。用T7Selectl0-3OrientExpress cDNA随机引物克隆系统(Novagen，Madison WI)合成cDNA。使用T7Selectl0-3载体以在5-15个噬菌体10B壳蛋白分子的C端展示随机起始的cDNA。诱导第二壳蛋白10A的表达。在EcoRl和Hind III消化后，将插入连接到T7 selectl0-3载体(T7选择系统手册，Novagen)上。包装载体并且这个文库的复杂性为10⁷。在0.5L对数生长期BLT5615 E.Coli株培养物中在37℃条件下扩增包装的噬菌体4小时。通过离心去除细胞碎片并且用8％聚乙二醇沉淀噬菌体。用1M NaCl/10mM Tris-HC1 pH8.0/1mM EDTA从团块中提取噬菌体并且用CsCI梯度离心纯化。纯化的噬菌体以PBS透析并储存于-80℃的10％甘油中。

T7噬菌体的生物淘洗

根据操作手册，将300ul的Affi-Gel15(Bio-Rad Laboratories)与12ug的合成胸腺素β4蛋白(RegeneRx)耦联，例如通过氨基末端的赖氨酸残基。在PBS中用3％ BSA封闭1小时后，将凝胶转移到柱子中并用10ml PBS，2ml 1％ SDS/PBS和1ml PBS/0.05％ Tween-20(PBST)x4冲洗。将500ulPBST中的10⁹ pfu’s T7噬菌体胚胎心脏文库(100x复杂度)应用于柱子并孵育5分钟，以完成低严格度的生物淘洗。用50ml PBS冲洗没有结合的噬菌体。用2.0ml 1％ SDS洗提结合的噬菌体。滴定10μl的洗提噬菌体，其余的噬菌体立即在0.5L的对数生长期BLT5615 E.Coli培养物中进行扩增，直至裂解。通过离心除去细胞碎片，滴定裂解产物并将10⁹pfu’s噬菌体用于下一圈的生物淘洗。进行4轮的生物淘洗，并且在第二、第三和第四轮之后的扩增之前挑选30个单克隆，分别进行序列分析。扩增包含10个以上氨基酸的单克隆并用于ELISA验证分析。

ELISA验证分析

将MaxiSorp Nunc-Immuno Plates(Nalgene Nunc International)用1μg/100μl的合成胸腺素β4肽包被过夜，然后用PBS冲洗并用3％BSA封闭。将10⁹pfu’s扩增的单噬菌体克隆加入到PBST中，并分别加入到每一个孔中，并室温孵育1.5小时。T7野生型噬菌体用作阴性对照。通过PBS(x4)清洗而去除未结合的噬菌体，并且通过加入200μl 1％ SDS/PBS到孔中而在室温下洗提结合的噬菌体1小时。

免疫共沉淀

用胸腺素β4、PINCH和/或ILK转染Cos和10T1/2细胞，并且按照前述用针对各自的抗体沉淀裂解产物。用抗-ILK多克隆抗体(Santa Cruz)，抗胸腺素β4多克隆抗体和抗myc或抗FLAG抗体对标记的PINCH进行Western印记。

动物和外科手术方法

通过前述的左前降支结扎在58只16周龄(25-30g)的雄性C57BL/6J小鼠中制造心肌梗塞。29只结扎的小鼠在结扎之后立即进行了胸腺素β4处理，其余的29只被注射了PBS。处理过程是将胸腺素β4(200ng/10ul胶原蛋白)或10ul胶原蛋白心内给药；将胸腺素β4(150μg/300μl PBS)或3000PBS腹腔给药；或通过心内和腹腔注射。每三天进行腹腔注射，直至小鼠被处死。剂量基于之前对胸腺素β4的生物分散的研究。摘除心脏，称重并固定以用于组织切片。以相似的方式进行处理其余的小鼠用于结扎后0.5、1、3、6和11天的研究。

通过超声心动进行心脏功能分析

心脏收缩功能的判断被用在前所述的M-模式和2维测量进行超声心动图以。该测量表示来自至少两个独立的扫描的六个被选心动周期的平均值，所述扫描以随机盲法方式将乳头肌用作扫描水平的一致性的参考点。心脏舒张末期被定义为最大左心室(LV)舒张容积，并且收缩末期被定义为后室壁运动达到最大值。在统计学分析中忽略每组中的离群值。短轴缩短率(FS)，一个心脏收缩功能的代表，用如下算式从LV容积计算出来：FS＝EDD-ESD/EDD x 100％。射血分数(EF)被从二维图像中计算。EDD，心脏舒张末期容积；ESD，心脏收缩末期容积。

疤痕体积计算

类似于在前所述，用穿过每只鼠的心脏的六个切片，使用Openlab 3.03软件(Improvision)计算疤痕体积。在每个切片上，盲式测量胶原沉积的区域百分比并对每只小鼠进行平均。

统计分析

使用具有95％为置信区间变量的标准T检验进行统计计算。

胸腺素β4促进了胚胎心脏中的心肌和内皮细胞的迁移，并且在出生后的心肌细胞中保持了这种特性。培养中存活的或者胚胎和出生后心肌细胞也被胸腺素β4所增强。胸腺素β4与PINCH和整合素连接激酶(ILK)组成了功能复合体，导致了存活激酶Akt(也称为蛋白激酶B)的激活。在小鼠的冠状动脉结扎后，胸腺素β4处理导致了心脏中ILK和Akt的活性的上调，增强了早期肌细胞的存活并改善了心脏的功能。这些发现表明，胸腺素β4促进心肌细胞的迁移、存活和修复，并且它介导的途径成为急性心肌梗塞处置中的一个新的治疗靶点。

实施例3

合成的Tβ4与Tβ4抗体由RegeneRx生物制药公司提供(3 BethesdaMetro Center，Suite 700，Bethesda，邮编20814)，并在胶原蛋白凝胶测定法中测试，以确定它们对心脏内皮细胞到间充质细胞的转化过程中的作用。已经确定，心脏瓣膜和其它心脏组织的发育是通过上皮-间充质的转化所形成，并且这个过程中的缺陷可能在发育过程和整个生命中引发各种心血管畸形和损伤。生理浓度的Tβ4显著增强了胶原蛋白凝胶测定法中的内皮细胞到间充质细胞的转化。此外，Tβ4的抗体抑制和封闭了这个转化过程。房室心内膜到扩散性的间充质细胞的的转化在正常心脏组织的形成和维持以及心瓣膜的形成中都是很关键的。

实施例4

在血管成形术之后，立即通过心脏插管术施用0.1μg—1μg/kg体重的胸腺素β4，患者随后每天以静脉注射的方式接受600μg—6mg Tβ4/kg体重(BW)2—4次，持续7天。治疗的用量和持续的时间依赖于急性心肌梗塞引发的心脏损伤的程度，心脏损伤的程度在患者入院初期通过超声心动图和血管造影术的核素显像测得。

实施例5

在血管成形术和/或安装支架后，立即通过心脏插管方式施用0.1μg—1μg/kg体重的胸腺素β4。患者随后通过静脉(IV)施用每天2-4次接受600μg—6mg/kg体重，施用7天。用心电图仪测量心肌的保护和术后再狭窄的缩小并通过核素成像或其他诊断方法进行监控。

实施例6

Tβ4以每天1mg—10mg/kg体重的剂量静脉施用30天，以减少由于斑块形成导致的冠状动脉的阻塞。

实施例7

胸腺素β4和本文描述的其他组织损伤预防或减少肽与用于在动脉或其他血管中清除阻塞或增加血流的药物、设备和方法一起应用，其中包括阿司匹林、tPA、链激酶、血浆酶原、抗凝血试剂、复合纤溶酶链激酶、瑞替普酶、替奈普酶、肝磷脂、动脉支架、静脉支架、心脏插管术、颈动脉支架、大动脉支架、肺支架、血管成形术、旁路移植术治疗和/或神经外科。组织损伤减少多肽在通过这些药物、设备和方法导致的血流增加之前、之中和/或之后施用。组织损伤减少多肽减少和/或预防与血流增加相关的组织损伤。

Claims (24)

1.一种治疗或预防在影响与所述组织相联系的血管中的血流增加后而出现的组织损伤的方法，其包括施用有效量的包含组织损伤减少或预防多肽的组合物，所述组织损伤减少或预防多肽包括下述中的至少一种：胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的异构体、Tβ4的N端片段、Tβ4的C端片段、Tβ4亚砜、LKKTET肽、LKKTNT肽、肌动蛋白隔离肽、肌动蛋白结合肽、肌动蛋白动员肽、肌动蛋白聚合调节肽或它们的具有组织损伤减少或预防活性的保守变体，或施用有效量的包含刺激所述组织损伤减少或预防多肽产生的刺激试剂的组合物，所述组合物是在所述血流增加发生之前、之中或之后的至少一种情况下施用至所述的组织。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-末端变体、Tβ4的C-末端变体、Tβ4的异构体或氧化的Tβ4。

3.权利要求1所述的方法，其中所述组合物为全身施用。

4.权利要求1所述的方法，其中所述组合物直接施用于冠状组织。

5.权利要求1所述的方法，其中所述多肽为重组的或合成的。

6.权利要求1所述的方法，其中所述多肽为胸腺素β4。

7.权利要求6所述的方法，其中所述试剂刺激胸腺素β4的生成。

8.权利要求1所述的方法，其中，所述血流的增加由施用阿司匹林、tPA、链激酶、血浆酶原、抗凝血试剂、复合纤溶酶链激酶、瑞替普酶、替奈普酶或肝磷脂中的至少一种所影响。

9.权利要求7所述的方法，其中，所述血流的增加由施用阿司匹林、tPA、链激酶、血浆酶原、抗凝血试剂、复合纤溶酶链激酶、瑞替普酶、替奈普酶或肝磷脂中的至少一种所影响。

10.权利要求1所述的方法，其中，所述血流的增加由动脉支架、静脉支架、心脏插管术、颈动脉支架、大动脉支架、肺支架、血管成形术、旁路移植术治疗或神经外科中的至少一种所影响。

11.权利要求7所述的方法，其中，所述血流的增加由动脉支架、静脉支架、心脏插管术、颈动脉支架、大动脉支架、肺支架、血管成形术、旁路移植术治疗或神经外科中的至少一种所影响。

12.权利要求1所述的方法，其中，所述组织损伤预防或减少肽包括Tβ4、Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14、Tβ15、凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、抑制蛋白、切丝蛋白、微丝切割蛋白、propomyosin、fincilin、蚕食蛋白、DNA酶I、绒毛蛋白、截断蛋白、肌割蛋白、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白或肌动调节蛋白。

13.包含权利要求1所述的具有组织损伤减少或预防活性的组织损伤预防或减少多肽或刺激试剂的药物组合，该组合进一步包括血流增加有效量的血流增加试剂，其中所述多肽和所述试剂可以单独施用或一同施用。

14.权利要求1所述的方法，其中所述组织损伤是神经损伤。

15.权利要求14所述的方法，其中所述损伤是由外伤、疾病、血小板增多症或中风引起的。

16.权利要求14所述的方法，其中所述损伤是由缺血引起的。

17.权利要求15所述的方法，其中所述损伤是由中风引起的。

18.权利要求14所述的方法，进一步包括将所述多肽与增加所述组织血流的血流增加试剂联合施用。

19.权利要求18所述的方法，其中所述血流增加试剂包括阿司匹林、tPA、链激酶、血浆酶原、抗凝血试剂、复合纤溶酶链激酶、瑞替普酶、替奈普酶或肝磷脂。

20.权利要求19所述的方法，其中所述血流增加试剂包括tPA或链激酶。

21.权利要求18所述的方法，其中所述多肽在所述血流增加试剂用于增加血流之前、之中或之后施用。

22.权利要求1所述的方法，其中所述多肽以约0.1-50微克的剂量范围施用。

23.权利要求22所述的方法，其中所述多肽以约1-30微克的剂量范围施用。

24.权利要求23所述的方法，其中所述多肽是胸腺素β4。